RU1830143C

RU1830143C - Method of agent preparing for blood group identification

Info

Publication number: RU1830143C
Application number: SU853987366A
Authority: RU
Inventors: Жидаи Иожеф; Банкути Розалия; Машек Иштван; Весели Гизелла; Сокол Иожеф
Original assignee: Хуман Жидан Олтоаньагтермеле Еш Кутато Интезет
Priority date: 1984-11-23
Filing date: 1985-11-22
Publication date: 1993-07-23
Also published as: RO92914A; DE3541355A1; HU192513B; GB2167856A; YU45749B; BG46009A3; AT390845B; NL8503186A; BE903684A; ATA339285A; YU182085A; FR2573873B1; GB8528364D0; LU86173A1; RO92914B; CS838385A2; HUT39516A; CS268806B2; FR2573873A1; GB2167856B

Abstract

Использование: медицина, диагностика . Цель: повышение стабильности средства . Сущность изобретени : диагностическое . средство состоит из реагентов а нти-А, анти-В, анти-АВ и, факультативно, анти-D, анти-С и анти-Е, которые фиксированы в полост х, образованных на поверхностно обработанном алюминиевом листе. Средство получают помещением капель указанных реагентов в полости поверхностно обработанного алюминиевого листа и фиксацией их на листе вакуумной сушкой в два этапа. 1 табл,Usage: medicine, diagnosis. Purpose: increasing the stability of the tool. SUMMARY OF THE INVENTION: Diagnostic. the agent consists of reagents a nti-A, anti-B, anti-AB and, optionally, anti-D, anti-C and anti-E, which are fixed in the cavities formed on the surface treated aluminum sheet. The tool is obtained by placing droplets of these reagents in the cavity of a surface-treated aluminum sheet and fixing them on the sheet by vacuum drying in two stages. 1 tab

Description

Изобретение относитс к способам получени средства дл быстрой диагностики группы крови.The invention relates to methods for producing an agent for the rapid diagnosis of a blood group.

Цель изобретени - повышение стабильности средства..The purpose of the invention is to increase the stability of the tool ..

Получаемое по предлагаемому способу средство дл быстрой диагностики группы крови содержит анти-А, анти-В, анти-АВ и факультативно анти-D, анти-С и анти-Е реагенты , которые зафиксированы в полост х, образованных на поверхностно обработанном листе алюмини . Способ получени средства дл быстрой диагностики состоит в том, что помещают реагенты анти-А, анти- В. анти-АВ и факультативно анти-В, анти-С и анти-Е в полости поверхностно обработанного алюминиевого листа и фиксируют реагенты на алюминиевом листе двухэтап- ной вакуумной сушкой.The rapid blood group diagnostic agent of the method of the invention comprises anti-A, anti-B, anti-AB and optionally anti-D, anti-C and anti-E reagents, which are fixed in cavities formed on a surface treated aluminum sheet. A method for preparing a rapid diagnostic agent consists in placing anti-A, anti-B. anti-AB reagents and optionally anti-B, anti-C and anti-E reagents in the cavity of a surface-treated aluminum sheet and fixing the reagents on a two-stage aluminum sheet - vacuum vacuum drying.

В качестве носител средства дл быстрой диагностики в соответствии с изобретением используетс алюминиевый лист толщиной 0,25-0,5 мм, В листе прессованием формуютс полости диаметром 10-30 ммAn aluminum sheet with a thickness of 0.25-0.5 mm is used as a carrier for quick diagnostics in accordance with the invention. Cavities with a diameter of 10-30 mm are formed into a sheet by compression

и глубиной 0,3-0,6 мм. Число формуемых полостей зависит от требуемого количества реагентов, которые необходимо поместить на носитель; требуетс еще одна дополнительна полость дл контрольной пробы. Лист носител , вы л рассованный и обрезанный до соответствующих размеров, подвергаетс поверхностной обработке в ванне двуокиси кали с последующим обильным прополаскиванием теплой и холодной водой и затем спиртом.and a depth of 0.3-0.6 mm. The number of moldable cavities depends on the required amount of reagents that must be placed on the carrier; another additional cavity is required for the control sample. The carrier sheet, pulled out and cut to the appropriate size, is surface-treated in a potassium dioxide bath, followed by extensive rinsing with warm and cold water and then with alcohol.

Дл получени средства дл быстрой диагностики в соответствии с изобретением используютс реагенты анти-А, анти-В, и анти-АВ , принадлежащие к главным группам крови, а также реагенты анти-D, анти-С, анти-Е и т.д.. принадлежащие к резус-системе.To obtain the rapid diagnostic agent according to the invention, anti-A, anti-B, and anti-AB reagents belonging to the main blood groups are used, as well as anti-D, anti-C, anti-E reagents, etc. belonging to the Rhesus system.

Реагенты, принадлежащие к главным группам крови, приготовл ютс таким образом , что сыворотка или плазма, очищенна от фибриногена соответственно крови, принадлежащей к группам крови А (анти-В), (ан- ти-А) и О (анти-АВ), имеющим очень высокую способность поглощать кислород (начинаюсоReagents belonging to the main blood groups are prepared in such a way that the serum or plasma is purified from fibrinogen, respectively, of blood belonging to blood groups A (anti-B), (anti-A) and O (anti-AB), having a very high ability to absorb oxygen (starting

соwith

оabout

ь 00b 00

СлSL

щим агглютинацию через 2-5 с и создающим 4-перекрестную агглютинацию в течение 3 мин), смешиваютс в соответствии с группами крови в асептических услови х, инактивируютс термообработкой, фиксируютс , адъювируютс и фильтруютс в стерильное состо ние.which agglutinate after 2-5 s and create 4-cross agglutination for 3 min), are mixed according to blood groups under aseptic conditions, are inactivated by heat treatment, fixed, adjuvated and filtered to a sterile state.

Инактиваци осуществл етс тепловой обработкой, дл щейс в течение примерно 30 мин при 50-60°С. Прошедшие тепловую обработку реагенты могут фиксироватьс , например, азидом натри . Может быть добавлен в качестве адъювирующего агента лиофилизирующий добавочный (вспомогательный ) материал, например сахароза, в количестве около 3%.Inactivation is carried out by heat treatment, lasting for about 30 minutes at 50-60 ° C. Heat treated reagents can be fixed, for example, with sodium azide. A lyophilizing additive (auxiliary) material, for example sucrose, in an amount of about 3% can be added as an adjuvant.

Реагенты, принадлежащие к резус-системе , приготовл ютс соответственно из сыворотки или плазмы крови анти-В, анти-С, анти-Е и т.д. аналогично:реагентам, принадлежащим к главным группам крови; однако к реагентам добавл ютс также адъювирую- щие агенты, способствующие агглютинации, например фиколль, глицин и метилцеллюло- за.. .На приготовленные листы в асептических услови х нанос тс капли, содержащие по 0,03-0,05 мл реагентов. Помимо реагентов, принадлежащих резус-системе, добавл ютс также капли по 0,03-0,05 мл 1 %-ного раствора папаина, активированного цистином и цистеином дл определени ферментным методом, затем реагенты высушиваютс на носителе двухэтапной вакуумной сушкой. Эта сушка осуществл етс в лиофилизирующем оборудовании (машина) или в установке вакуумной сушки. Первый этап сушки осуществл етс при давлении 100-300 Мм рт.ст,, предпочтительно при давлении 200 мм рт.ст., и при температуре 15-25°С, предпочтительно при 20°С; второй этап сушки осуществл етс при давлении 0,05-0,5 мм рт.ст., предпочтительно при давлении 0,1-0,05 мм рт.ст., и при температуре , предпочтительно при 40°С, Весь период сушки длитс примерно 3-5 ч.Reagents belonging to the Rhesus system are prepared, respectively, from serum or blood plasma anti-B, anti-C, anti-E, etc. similarly: reagents belonging to the main blood groups; however, adjuvants promoting agglutination, such as ficoll, glycine and methylcellulose, are also added to the reagents. Drops containing 0.03-0.05 ml of reagents are applied to the prepared sheets under aseptic conditions. In addition to the reagents belonging to the Rhesus system, drops of 0.03-0.05 ml of a 1% solution of papain activated by cystine and cysteine are also added for determination by enzyme method, then the reagents are dried on a carrier by two-stage vacuum drying. This drying is carried out in a lyophilizing equipment (machine) or in a vacuum drying unit. The first drying step is carried out at a pressure of 100-300 mm Hg, preferably at a pressure of 200 mm Hg, and at a temperature of 15-25 ° C, preferably at 20 ° C; the second drying step is carried out at a pressure of 0.05-0.5 mm Hg, preferably at a pressure of 0.1-0.05 mm Hg, and at a temperature, preferably at 40 ° C. The entire drying period lasts about 3-5 hours

При использовании реагенты раствор ютс одной каплей водопроводной воды (кахкдый из них), а капл контрольного образца помещаетс в предназначенную дл него полость. Определение группы крови может осуществл тьс с использованием образцов крови, вз тых непосредственно из пальцевой подушечки и получающихс из коагулированной крови или из крови, содержащей преп тствующий коагул ции агент. Контрольный образец приводитс в контакт с реагентами при помощи соответствующего приспособлени , например, путем смешивани с полистироловыми грануламиIn use, the reagents are dissolved with one drop of tap water (one of them), and a drop of the control sample is placed in its intended cavity. Blood type determination can be carried out using blood samples taken directly from the finger pad and obtained from coagulated blood or from blood containing an anti-coagulation agent. The control sample is brought into contact with the reagents using an appropriate device, for example, by mixing with polystyrene granules

вместе с диагностикой. Лист затем несколько раз наклон етс , а затем помещаетс на горизонтальную поверхность и оцениваетс спуст 3 мин.along with diagnostics. The sheet is then tilted several times, and then placed on a horizontal surface and evaluated after 3 minutes.

Преимущества средства дл быстройBenefits of Quick

диагностики в соответствии с изобретением состо т в следующем. В сравнении с известным способом средство более стабильно (срок годности - минимум 3 года, по прототипу - 2 года максимально). Носителем вл етс поверхностно обработанный алюминиевый лист, делающий обильной любую пропитку, специальное покрытие или изолирующий слой. Нанесение реаген5 топ и определение группы крови облегчаютс благодар выполненными в листе полост м. Адгези (прилипание) реагентов к поверхности алюминиевого листа стабильна; при использовании реагенты раствори0 мы врдопроводной водой и растворение - происходит немедленно... Реакци очень хорошо заметна на алюминиевом листе. Средство быстрой диагностики в соответствии с изобретением содержит также реагент ан5 ти-АВ, поэтому возможности ошибок уменьшены и определение группы крови может осуществл тьс безошибочно. Определе- , ние группы крови, реализуемое таким образом , эквивалентно определению группыDiagnostics in accordance with the invention are as follows. In comparison with the known method, the tool is more stable (shelf life is at least 3 years, according to the prototype - 2 years maximum). The carrier is a surface treated aluminum sheet, abundant in any impregnation, special coating or insulating layer. Application of the reagent 5 top and determination of the blood group is facilitated by the cavities made in the sheet. Adhesion (adhesion) of the reagents to the surface of the aluminum sheet is stable; when using reagents, we dissolve it with tap water and dissolution takes place immediately ... The reaction is very clearly visible on the aluminum sheet. The quick diagnostic tool according to the invention also contains an anti-AB-reagent, therefore the possibilities of errors are reduced and the determination of the blood group can be carried out without error. The definition of a blood group, implemented in this way, is equivalent to the definition of a group

0 крови, осуществл емому в лабораторных услови х . Вследствие этого теплопроводность алюминиевого листа, содержание воды в реагентах могут быть сведены к минимуму сушкой в вакууме, поэтому диагностическое0 blood carried out under laboratory conditions. As a result, the thermal conductivity of the aluminum sheet, the water content in the reagents can be minimized by drying in vacuum, therefore, the diagnostic

5 средство может хранитьс даже при комнатной температуре без изменений его качества в течение сравнительно длительного времени (от 2 до 5 дет), 5, the product can be stored even at room temperature without changing its quality for a relatively long time (from 2 to 5 children),

Пример, Получение реагентов, при0 надлежащих к основным группам крови.Example, Preparation of reagents suitable for major blood groups.

Сыворотки крови с титром не менее 1,64 анти-А, анти-В или не менее 1:32 анти-АВ соответственно, имеющие хорошую способность поглощени кислорода {начинаетBlood serum with a titer of at least 1.64 anti-A, anti-B or at least 1:32 anti-AB, respectively, having good oxygen absorption capacity {starts

5 свертывание через 2-5 с и создает 4-перекрестную агглютинацию через 3 мин), смешивают в соответствии.с каждой из групп крови в асептических услови х, фиксируют добавлением 0,1% азида натри и после до0 баолени 3% сахарозы инактивируюттепло- вой обработкой при 56°С в течение 30 мин, а затем фильтруют через очищенный и стерилизующий фильтр.5 coagulation after 2-5 s and creates 4-cross agglutination after 3 min), mixed according to each blood group under aseptic conditions, fixed by addition of 0.1% sodium azide and after inactivation of 3% sucrose, inactivate thermal treatment at 56 ° C for 30 minutes, and then filtered through a cleaned and sterilizing filter.

Плазмы крови с титром не менее 1:128Blood plasma with a titer of at least 1: 128

5 анти-А, анти-В или не менее 1:64 анти-АВ соответственно, имеющие хорошую способность поглощени кислорода, смешиваютс в соответствии с каждой из групп крови в антисептических услови х, фиксируютс добавлением 0,1 % азида натри и освобождаютс от фибриногена добавлением левули- ната кальци или дигидрата хлорида кальци , затем обрабатываютс так же, как и сыворотки.5 anti-A, anti-B, or at least 1:64 anti-AB, respectively, having good oxygen absorption capacity, mixed in accordance with each blood group under antiseptic conditions, fixed by the addition of 0.1% sodium azide and freed from fibrinogen by adding calcium levulinate or calcium chloride dihydrate, then are treated in the same way as the serum.

Получение реагентов. принадлежаа1их резус-системе.Getting reagents. belonging to the rhesus system.

Сыворотки крови с титром не менее 1:128 анти-D, анти-С, анти-Е и т.д. фиксируют добавлением 0,1 % азида натри , смешивают соответственно с каждой из групп крови в антисептических услови х и инакти- вируют при 56°С в течение 60 мин. Затем нерегул рные агглютинины удал ют абсорбцией , добавл ютЗ% сахарозы, 2% глицина и, дл ускорени свертывани , 0,3-0,5% фи- колла, а также 0,01-0.02% метилцеллюлозы и фильтруют в стерильное состо ние.Blood serum with a titer of at least 1: 128 anti-D, anti-C, anti-E, etc. they are fixed by adding 0.1% sodium azide, mixed with each of the blood groups under antiseptic conditions, respectively, and inactivated at 56 ° C for 60 minutes. Then, irregular agglutinins are removed by absorption, 3% sucrose, 2% glycine and 0.3-0.5% phyclic, as well as 0.01-0.02% methylcellulose are added and filtered to a sterile state to accelerate coagulation.

Плазмы фиксируют аналогичным образом добавлением 0,1 % азида натри , освобождают их от фибриногенов добавлением дигидрата хлорида кальци или тромбина, а затем обрабатывают так же, как и сыворотки .Plasma is fixed in a similar manner by the addition of 0.1% sodium azide, liberated from fibrinogen by the addition of calcium chloride dihydrate or thrombin, and then treated in the same way as the serum.

Способность к поглощению кислорода у реагента удовлетворительна , когда реакци начинаетс в пределах 1 мин. и увели- чийаетс до максимальной в пределах 3 мин.The oxygen uptake ability of the reagent is satisfactory when the reaction begins within 1 minute. and increases to a maximum within 3 minutes.

Дл определени неполной гемагглюти- НИ.ННОСТИ требуетс также растворе 1% па- паина, который приготовл ют при помощи фосфатного буфера 1 (15 моль) л, активированного добавлением гидрохлорида 1-цис- тина и 1-цистеина, и который содержит 0,0125% метилцеллюлозы. . Получение носител .In order to determine incomplete hemagglutininity, a solution of 1% papain is also required, which is prepared using phosphate buffer 1 (15 mol) L, activated by the addition of 1-cystine hydrochloride and 1-cysteine, and which contains 0.0125 % methyl cellulose. . Receiving media.

При использовании анти-А, анти-В, ан- ти-АВ и анти-D формуетс п ть полостей прессованием на. алюминиевом листе толщиной 0,25-0,5 мм. Глубина этих полостей составл ет 0.3-0,6 мм. Четыре полости имеют диаметр 15 мм, а п та полость должна быть больше и имеет диаметр, например, 30 мм. После прессовани и вырезани листы выдерживаютс в 20%-ном растворе гидроокиси кали при 90°С в течение 3 мин. а затем обильно споласкиваютс теплой и холодной водой и затем спиртом.When using anti-A, anti-B, anti-AB and anti-D, five cavities are formed by compression on. aluminum sheet 0.25-0.5 mm thick. The depth of these cavities is 0.3-0.6 mm. Four cavities have a diameter of 15 mm, and the fifth cavity should be larger and has a diameter of, for example, 30 mm. After pressing and cutting, the sheets were held in a 20% potassium hydroxide solution at 90 ° C for 3 minutes. and then rinsed liberally with warm and cold water and then with alcohol.

Получение диагностического средства.Getting a diagnostic tool.

0,03 мл реагентов анти-А, анти-В и ан- ти-АВ капл ми помещают в три малых полости приготовленного и поверхностно обработанного листа. Четвертую малую полость оставл ют пустой дл образца крови. В большую полость капают 0.3 мл реагента анти-В. а немного позже 0.05 мл активного раствора пзпаина. Реагент, принадлежащий к резус-системе, может быть также нанесен на другой лист.0.03 ml of anti-A, anti-B and anti-AB reagents are placed dropwise into three small cavities of the prepared and surface treated sheet. The fourth small cavity is left empty for the blood sample. 0.3 ml of anti-B reagent is dripped into a large cavity. and a little later, 0.05 ml of the active solution of pzpain. The reagent belonging to the Rhesus system can also be applied to another sheet.

После этого листы помещают в лиофи- лизирующую установку и начинают двух- этапную вакуумную сушку. На первом этапе вакуум неглубок (около 200 мм рт.ст.) и температура низка (20РС), на втором этапе вакуум глубок (0,1-0,05 мм рт.ст.) и температура вы- ше(40°С).After that, the sheets are placed in a lyophilization apparatus and two-stage vacuum drying is started. At the first stage, the vacuum is shallow (about 200 mmHg) and the temperature is low (20RS), at the second stage the vacuum is deep (0.1-0.05 mmHg) and the temperature is higher (40 ° C) .

Дополнительные примеры на средние и граничные значени даны в таблице.Additional examples of mean and boundary values are given in the table.

При использовании этого способа вещество высушивают при сравнительно низкой температуре даже без замораживани , поэтому можно избежать изменений структуры белка и, как следствие, снижени активности из-за замораживани .Using this method, the substance is dried at a relatively low temperature even without freezing, therefore, changes in the structure of the protein and, as a consequence, a decrease in activity due to freezing can be avoided.

Приготовленное таким образом диагностическое средство упаковывают вместе с полистироловыми гранулами в мешочки из алюминиевой фольги и герметично закрывают .The diagnostic tool thus prepared is packaged with polystyrene granules in aluminum foil bags and sealed.

Определение групп крови осуществл ют при комнатной температуре. На алюминиевой пластине наход тс четыре углублени (выемки), из которых первые триBlood groups were determined at room temperature. There are four recesses (recesses) on the aluminum plate, of which the first three

содержат реактивы (анти-АВ, анти-В, анти- А. тест-сыворотки), в четвертое капают каплю определ емой крови.contain reagents (anti-AB, anti-B, anti-A. test serum), in the fourth drop of a certain blood drop.

Тест-сыворотки раствор ют, использу по капле (примерно 30 мкл) водопроводнойTest sera are dissolved using dropwise (approximately 30 μl) tap

воды. Тест-сыворотки раствор ютс в несколько секунд.water. Test sera dissolve in a few seconds.

Каплю определ емой кроеи (свернутой или лишенной возможности свертыватьс ) помещают в четвертое углубление. Определение также можно осуществл ть с помощью получаемой из кончика пальца крови, когда кровь пр мо из кончика пальца капает в углубление. Определ емую кровь с помощью палочек, которые упакованы нар ду с пластиной, тотчас перенос т далее, конец палочки окунают в кровь и прилипшую к палочке кровь хорошо смешивают с тест-. сывороткой. Другой конец палочки используют дл смешени крови со второйA drop of a defined cut (rolled up or unable to curl) is placed in the fourth recess. The determination can also be carried out using blood obtained from the fingertip, when blood directly from the fingertip drips into the recess. The test blood is transferred using sticks, which are packed along with the plate, immediately transferred further, the tip of the stick is dipped into the blood and the blood adhering to the stick is mixed well with the test. serum. The other end of the stick is used to mix blood with the second

тест-сывороткой. Таким образом, достаточно двух палочек дл смещени крови с трем тест-сыворотками.test serum. Thus, two rods are sufficient to displace blood with three test sera.

Пластину в течение Нескольких секунд неоднократно покачивают, затем став т наThe plate is repeatedly shaken for a few seconds, then placed on

ровное место. Спуст 3 мин пластину покачивают туда и обратно под углом примерно 30° и результаты считывают невооруженным глазом.flat place. After 3 minutes, the plate is shaken back and forth at an angle of about 30 ° and the results are read with the naked eye.

Форму л а изобретени SUMMARY OF THE INVENTION

Способ получени средства дл диагностики группы крови путем нанесени на носитель реагентов анти-А, анти-В и анти-D. отличающийс тем, что, с целью повышени стабильности средства, дополнительно используют в качестве реагентов антисыворотки антигАВ, анти-С и антиг-Е, в качестве носител - алюминиевый лист, антисыворотки перед закреплением на носителе обрабатывают азидом натри , полученный реагент каждой антисыворбткиA method for producing a blood group diagnostic agent by applying anti-A, anti-B and anti-D reagents to a carrier. characterized in that, in order to increase the stability of the agent, they additionally use anti-ABA, anti-C and anti-E antisera as reagents, an aluminum sheet as a carrier, and antisera are treated with sodium azide before being fixed on the carrier, and the resulting reagent of each antiserum

помещают по одной капле в полости алюминиевого листа и закрепл ют сушкой в вакууме , которую провод т в два этапа, причем на первом этапе при 15-25°С и 100-300 мм рт.ст., а на втором - при 30-50°С и 0,05-0,5 мм рт;ст.placed one drop in the cavity of the aluminum sheet and fixed by drying in vacuum, which is carried out in two stages, the first stage at 15-25 ° C and 100-300 mm Hg, and the second at 30-50 ° C and 0.05-0.5 mm RT; Art.