RU1812498C - Способ определени фентанила в водных растворах - Google Patents
Способ определени фентанила в водных растворахInfo
- Publication number
- RU1812498C RU1812498C SU4898136A RU1812498C RU 1812498 C RU1812498 C RU 1812498C SU 4898136 A SU4898136 A SU 4898136A RU 1812498 C RU1812498 C RU 1812498C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fentanyl
- reaction
- conjugate
- mixed anhydrides
- mmol
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Использование: в иммунологии, в частности относитс к иммунохимическому анализу , и может быть использовано дл определени фентанила. Сущность изобретени : дл иммуноферментного определе; ни фенталина кроличьи антитела к коныогату бычьего сывороточного альбумина и карбоксифентанила, полученному в реакции смешанных ангидридов и имеющему эпитопную плотность 12, взаимодействующие с твердофазнымтест-антигеном, в качестве которого используют с коньюгат гамма-глобулина лошади с карбоксифента- нилом, полученный в реакции смешанных ангидридов и имеющий эпитопную плотность 29. Способ позвол ет проводить определение фентанила с чувствительностью 2,5-10 ммол в пробе. 1 табл.
Description
у
Ё
Изобретение относитс к иммунохимии и может быть использовано в клинической медицине дл количественного определени фентанила.
Одним из наиболее высокочувствительных методов определени фентанила вл етс его радиоиммуноанализ с чувствительностью 1 пмоль (336 пг).
Цель изобретени - повышение чувствительности определени фентанила.
Цель достигаетс .использованием дл иммунизации конъюгированного антигена, синтез которого, в отличие от описанного дл прототипа осуществл ют не при помощи водорастворимого карбодиимида, а взаимодействием смешанного ангидрида карбоксифен.танила и изобутилхлорфор- миата с бычьим сывороточным альбумином. Применение дл иммунизации такого антигена позволило получить антитела, минимальное ингибирование св зывани которых в твердофазком иммуноферментном анализе имело место при добавлении в пробу 2,5 10 ммол свободного фентанила, что и определило чувствительность способа.
Пример. Синтез ran гена гемисукци- ната М-фенил-М-4-{1-(2-фенил-этил)пипери- дина карбоксифентанила). 1,2 г (0,043 моль) М-фенил-М-4- 2-фенилэтил)пиперидина раствор ли в 20 мл толуола, прибавл ли 0,45 г (0,045 моль) нтарного ангидрида в 30 мл толуола и нагревали под аргоном в течение 20 часов. Выпавший осадок отфильтровывали , промывали эфиром и перекристалли- эовыэели из смеси бензол: гексан (3 : 2). Выход 1 г (61,3%). Т.п 188,3°С, Элементный анализ. Найдено: С 72,16 Н 6,9 N 6.78
00
ю
ё
00
С2зН28№Оз. Вычислено: С 72,61 Н 7,39 N 7,42. ИК 1720, 1640(С 0)
Синтез иммуногена. К раствору 0,17 г (0,0456 ммоль) карбоксифентанила в 1,5 мл диметилформамида, охлажденного 0 - 2°С, добавл ли 50 мкл (0,456 ммоль) М-метилмор- фолина и при перемешивании на магнитной мешалке прикалывали 59 мкл (0,456 ммоль) изобутилхлорформиата. Реакционную смесь перемешивали 30 мин и затем постепенно добавл ли к охлажденному до 0-2°С раствору 0,50 г (0,075 ммоль) бычьего сывороточного альбумина в 50 мл борно-борат- ного буфера рН 9. После перемешивани в течение 1 ч при 0-2°С и 18-20 ч при 8°С реакционную смесь центрифугировали (7000 об, 15 мин). Белковую фракцию отдел ли от низкомолекул рных компонентов гель-фильтрацией на колонке с сефадексом Г-25 (5 х 30 см), уравновешенном 0,01 М натрий-фосфатным буфером рН 8, содержащим 0,15 М хлористого натри , концентрировали до объема 10мл вульт- рафильтрационной чейке Амикон с фильтром ХМ-50, промывали несколько раз дистиллированной водой и лиофильно высушивали . Получали 0,50 г (100% по белку) иммуногена, содержащего 12 молей гаптена на. моль белка. Мол рную нагрузку (зпитоп- ную плотность) определ ли спектрофото- метрически (А 340 нм, Егапт 458, Оконьюг 0,34 при С 2,67 мг/мл).
Синтез тест-антигена. Из 0,071 г (0,19 ммоль) карбоксифентанила в 0,5 мл диметилформамида , 21 мкл (0.1S Ммоль) N-ме- тилморфолина, 24 мкл (0,19 ммоль) изобутилхлорформиата и 0,50 г гаммаглобу- лина лошади в 50 мл борно-боратного буфера рН 9 по описанной выше методике получали 0,60 г образца, содержащего 16% солей с эпитопной плотностью 29 (А 340 нм, Оконъюг 0,17 при С « 2,89 мг/мл). Выход по белку составил 99%.
Антисыворотку получали из крови кроликов , иммунизированных конъюгатом бычий сывороточный альбумин - карбок- сифентанил в количестве 5 мг на животное в полном адъюванте Фрейнда в 20-30 точек области спины подкожно и через кажды.е 3-4 недели по 10 мг в физиологическом растворе, также в 20-30 точек области спины. Через 7 дней после каждого введени иммуногена, начина со второго , у животных брали кровь, отдел ли сыворотку, которую использовали в имму- ноферментном анализе в количествах, обеспечивающих оптическую плотность субстратной смеси 0,5-1,6, Титр антисыворотки составил 1 : 1024000.
Проведение анализа. В каждую из 96 чеек полистироловой пластины внос т 0,01 мкг коньюгата гамма-глобулин лошади - карбоксифентанил в 0,2 мл 0,05 М карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,5, После инкубации в течение 18 ч при 4°С плату отмывали 0,15 М раствором хлористого натри , содержащего 0,05% твин-20. В чейки заливали 0,1 мл раствора фентанила в диапазоне концентраций от до ммоль в пробе и затем по 0,1 мл антисыворотки в количестве 0,4 мкг по белку, то есть, разведенную в 150000 раз. Контрольными вл лись чейки плат, в которые фентанил на
5 добавл ли. После часовой инкубации во влажной камере при комнатной температуре платы отмывали и в чейки помещали 0,2 мл коньюгата ослиных антикроличьих антител с пероксидазой хрена (производство Ин0 ститута эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи) при тех же услови х инку- бировани . Через час чейки отмывали и заполн ли субстратной смесью, содержащей 8 мг о-фенилендиамина и 7 мкл 33%
5 перекиси водорода в 20 мл 0,2 М цитрат- фосфатного буфера рН 5, Через час в каждой чейке измер ли поглощение при 490 нм. Ошибка метода, как правило, составл ла не более 5-6%. Результаты выражали в про0 центах по отношению к контролю, прин тому .за 100%.
На основании полученных результатов строилась калибровочна крива определени фентакила, имеюща S-образный ха5 рактер с линейным участком в диапазоне от 10% до 90% св зывани антител с твердой фазой. Согласно полученной кривой, минимально значимое изменение св зывани антител к карбоксифентанилу с твердофаз0 ным гаптеном имело место при добавлении в пробу фентанила в количестве 2,510 ммол (0,84 пг), что и определило чувствительность способа.
Предлагаемый способ обладает боль5 шей чувствительностью по сравнению с прототипом и превосходит его в 400 раз, позвол ет осуществл ть сотни определений одновременно в более короткие сроки (врем анализа 4 ч, а дл прототипа - сутки),
0 более прост в исполнении, не требует дл реализации высококвалифицированного персонала и дорогосто щего, труднодоступного оборудовани и реактивов, не св зан с радиационной опасностью и проблемой
Claims (1)
- 5 утилизации радиоактивных отходов. Формула изобретени Способ определени фентанила в водных растворах, включающий проведение иммуноанализа, о т, л имеющийс тем, что, с целью повышени чувствительностиспособа, при проведении иммуноанализа используют кроличьи антитела к конюгату бычьего сывороточного альбумина и кар- боксифентанила, взаимодействующие с твердофазным тест-антигеном, при этом коньюгат с эпитопной плотностью 12 получают в реакции смешанных ангидридов, а в качестве тест-антигена используют конъю- гат гамма-глобулина лошади с карбоксифен- танилом с эпитопной плотностью 29, который получают в реакции смешанных ангидридов .
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4898136 RU1812498C (ru) | 1991-01-02 | 1991-01-02 | Способ определени фентанила в водных растворах |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4898136 RU1812498C (ru) | 1991-01-02 | 1991-01-02 | Способ определени фентанила в водных растворах |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1812498C true RU1812498C (ru) | 1993-04-30 |
Family
ID=21553060
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4898136 RU1812498C (ru) | 1991-01-02 | 1991-01-02 | Способ определени фентанила в водных растворах |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU1812498C (ru) |
-
1991
- 1991-01-02 RU SU4898136 patent/RU1812498C/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Meth Enzymol, 1982, v. 84, p. 526. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4399121A (en) | Iodothyronine immunogens and antibodies | |
US4946958A (en) | Chemiluminescent acridinium labelling compounds | |
US4828985A (en) | Antibodies against the complex of a small molecule and its binding protein, their preparation and their use in diagnostic methods | |
US4434227A (en) | Immunoassay for class specific immunoglobulin antibodies | |
EP0019620B1 (en) | Insolubilized methylated albumin conjugates for autoimmune disease fluoroimmunoassays | |
Fuchs et al. | Immunological studies of plant hormones: detection and estimation by immunological assays | |
JPH0588421B2 (ru) | ||
JPH09329601A (ja) | 生物マトリックス中の胆汁酸の選択的免疫学的測定用抗体 | |
HOSODA et al. | Effect of bridge heterologous combination on sensitivity in enzyme immunoassay for cortisol | |
US4078049A (en) | Acetylcholine assay | |
EP0313244B1 (en) | Method for increasing the sensitivity of assays for mucin | |
EP0363041A1 (en) | Monoclonal antibody to morphine, preparation of monoclonal antibody, assaying kit and assaying method of morphine | |
JPH0780913B2 (ja) | 完全無傷なプラコラーゲンペプチド(▲iii▼型)およびプロコラーゲン(▲iii▼型)の選択的な免疫学的測定法 | |
RU1812498C (ru) | Способ определени фентанила в водных растворах | |
US4358604A (en) | N-Aminoalkyl iodothyronine derivatives | |
EP0161107A2 (en) | Immunometric method for the determination of a hapten | |
US5662911A (en) | Benzodiazepine protein conjugates | |
US5639627A (en) | Method for assaying specific antibody | |
US6414152B1 (en) | Luminescent labelling material and procedures | |
JP2968910B2 (ja) | 1α,25(OH)2ビタミンD3に対する抗体及びその用途 | |
US6509462B2 (en) | Estradiol derivative and immunoassy using the same | |
US6756043B2 (en) | Compositions and methods for detecting adult Taenia solium | |
Trivers et al. | [27] Development and use of ultrasensitive enzyme immunoassays | |
JP3712133B2 (ja) | 抗菌化合物の免疫学的測定法 | |
Rowley et al. | Determination of THC and its metabolites by EMIT homogeneous enzyme immunoassay: a summary report |