RU1792709C

RU1792709C - Method for selecting raw material to obtain antileptospirosal plasma

Info

Publication number: RU1792709C
Application number: SU904854963A
Authority: RU
Inventors: Лидия Васильевна Назарчук; Елена Васильевна Мельницкая; Виктор Николаевич Кондратенко; Елена Алексеевна Федоровская; Елизавета Петровна Бернасовская
Original assignee: Киевский Научно-Исследовательский Институт Гематологии И Переливания Крови; Киевский Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии И Инфекционных Болезней Им.Л.В.Громашевского
Priority date: 1990-07-27
Filing date: 1990-07-27
Publication date: 1993-02-07

Abstract

Использование: медицина, аллоген- ный препарат, профилактика и лечение лептоспироза. Сущность изобретени : скринируют кровь практически здоровых донороспособных лиц дл вы влени высоких (1:160-1:320) антител к лёптоспирам, в реакции пассивной гемэгглютйнацми с леп- тоспирозным поливалентным эритроцитар- ным диагностикумом повышенной чувствительности. Полученна антилептос- пирозна плазма в л;иофилизированной форме обладает специфической активностью . 2 табл.Usage: medicine, allogeneic drug, prevention and treatment of leptospirosis. SUMMARY OF THE INVENTION: Blood of practically healthy donor-able individuals is screened to detect high (1: 160-1: 320) antibodies to leptospira, in the reaction of a passive hemeglutinase with a leptospirosal polyvalent erythrocytic hypersensitivity diagnostic. The resulting antileptospirosal plasma in l; the iofilized form has specific activity. 2 tab.

Description

: Изобретение относитс к области ме-. дмцины, а именно, к способам получени иммунных препаратов из крови человека, и гложет быть использовано в производствен- н1ой трансфузиологии.: The invention relates to the field of me. Dmcins, namely, to methods for producing immune preparations from human blood, and can be used in industrial transfusiology.

t Лептоспироз вл етс инфекционным заболеванием, характеризующимс т же- л ым течением, летальность при котором в Некоторых регионах мира достигает 48%.t Leptospirosis is an infectious disease characterized by a mild course, with a mortality rate of 48% in some regions of the world.

В комплексном лечении больных леп- тоспирозом примен етс плазма человеческа нормальна и ксеногенный Йммуноглобулин, полученный из крови ги- Мериммунизированных волов.In the complex treatment of patients with leptospirosis, human normal plasma and xenogenic Ymmunoglobulin obtained from the blood of immunized oxen are used.

В основе способов получени этих препаратов лежит либо скринирование исход- йых сывороток крови, либо активна иммунизаци доноров крови соответствующими вакцинами или анатоксинами. Последний способ трудоемок, требует наличи The methods for the preparation of these preparations are based either on screening of the starting blood serum or on active immunization of blood donors with appropriate vaccines or toxoids. The latter method is laborious, requires availability

коммерческих вакцинных препаратов и организации многочисленного контингента доноров-добровольцев дл проведени специфической иммунизации.commercial vaccine preparations; and organizing a large contingent of volunteer donors for specific immunization.

Задачей изобретени вл етс получение аллогенного антилептоспирозного препарата с высокой специфической активностью и стабильностью.An object of the invention is to provide an allogeneic antileptospirosis preparation with high specific activity and stability.

Способ осуществл етс следующим об- разом.The method is carried out as follows.

Готов т лептоспирозный поливалентный эритроцитарный диагностикум повышенной чувствительности, с его помощью провод т скрининг индивидуальных образцов сыворотки крови здоровых лиц в реакции пассивной гемагглютинации дл вы влени антилептоспирозных антител. Кровь доноров, в сыворотке которых вы влены антитела в титрах 1:160 и выше, вл етс источником получени аллогеннойHypersensitivity leptospirosis polyvalent erythrocyte diagnosticum is prepared, and individual individual blood serum samples are screened in a passive hemagglutination reaction to detect antileptospirosis antibodies. Blood donors, in the serum of which antibodies were detected in titers of 1: 160 and above, are a source of allogeneic

ю -ч о юyo-oo

антилептоспирозной. плазмы в жидкой, замороженной илиофилизировэнной формах.antileptospirosis. plasma in liquid, frozen or frozen forms.

П р и м е р 1. Готов т лептоспирозный поливалентный эритроцитарный диагности- кум повышенной чувствительности из р да штаммов лептоспир, обладающих подвижностью , типичной морфологией, хорошим ростом на питательной среде, агглютинирующихс тмпоспецифической иммунной сывороткой до титра не менее чем 1:10000.Example 1. A leptospirosis polyvalent erythrocyte diagnostic test is prepared for hypersensitivity from a number of leptospira strains with motility, typical morphology, good growth on a nutrient medium, agglutinating with a specific immune serum to a titer of at least 1: 10000.

Дл получени бактериальной массы маточную культуру каждого штамма засевают во флаконы со средой Терских в соотношении 1:10 и выращивают при в течении 10-14 дней. Примеси белка питательной среды удал ют центрифугированием через четырехслойный марлевый фильтр. Взвесь бактерий центрифугируют.при 6000 об/мин в течении 40 мин при 80 ± 2°С. Биомассу ресуспендируют в 0,9% растворе натри хлорида до конечной концентрации 50 ± 10 мг/мл. Рабочую взвесь клеток каждого штамма в объеме 50 мл дл выделени антигена озвучивают в аппарате УЗДН-1 в следующем режиме: частота 44 -кГц, сила тока 0,7-0,8 Ма, продолжительность озвучивани 3 ± Т мин, температура 15 ± 3°С. После озвучивани взвесь центрифугируют при 6000 об/мин в течении 40 мин при 8 ±2°С. Из раствора .каждого моноантигена отбирают пробу в объеме 3 мл дл определени сенсибилизирующей активности.In order to obtain the bacterial mass, the uterine culture of each strain is seeded in bottles with Tersky medium in a ratio of 1:10 and grown for 10-14 days. Nutrient protein impurities were removed by centrifugation through a four layer gauze filter. A suspension of bacteria is centrifuged. At 6000 rpm for 40 min at 80 ± 2 ° C. The biomass is resuspended in a 0.9% sodium chloride solution to a final concentration of 50 ± 10 mg / ml. A working suspension of cells of each strain in a volume of 50 ml for antigen isolation is voiced in the UZDN-1 apparatus in the following mode: frequency 44 kHz, current strength 0.7-0.8 Ma, duration of sounding 3 ± T min, temperature 15 ± 3 ° WITH. After sonication, the suspension is centrifuged at 6000 rpm for 40 minutes at 8 ± 2 ° C. From a solution of each monoantigen, a 3 ml sample was taken to determine the sensitizing activity.

Сенсибилизирующую активность антигена провер ют в дозах 0,01 мг/мл - 0,05 мг/мл путем сенсибилизации ими та- низированных формалинизированных эритроцитов барана. Антиген считают годным, если сенсибилизирующа активность .не превышает 0,05 мг/мл взвеси 2,5 % эритро- . цитов.The sensitizing activity of the antigen is checked at doses of 0.01 mg / ml - 0.05 mg / ml by sensitizing them with tannin formalized ram sheep erythrocytes. An antigen is considered suitable if the sensitizing activity does not exceed 0.05 mg / ml of a suspension of 2.5% erythro. citations.

, Моноантигены штаммов объедин ют в пблиантиген в объемах обратно пропорциональных их гомосенсибилизирующей активности , Общий объем в дальнейшем именуемый серией должен быть не менее 100мл.: .Monoantigens of strains are combined into pblantigen in volumes inversely proportional to their homosensitizing activity. The total volume hereinafter referred to as the series should be at least 100 ml.:.

Серию поливалентного антигена разливают в стерильные пробирки по 5 мл, закры-. вают резиновыми пробками и сохран ют Т1ри -20°С. Срок хранени антигена - б мес цев .A series of polyvalent antigen is poured into sterile 5 ml tubes, closed. cork with rubber stoppers and retain T1ri -20 ° C. Shelf life of antigen is 6 months.

Необходимое дл приготовлени диаг- ностикума количество формалинизированных 10% эритроцитов барана отбирают в пробирки по 2 мл. Осаждают и отмывают 4-кратным центрифугированием при 1000 об/мин в течении 15 мин от остатков формалина раствором нормальной кроличьей сыворотки 1:250 в 0,9% растворе натри хлорида рН. 6,8 ± 0,05. Эритроциты развод т до концентрации 2,5% взвеси 0,9% раствором натри хлорида рН 6,8 ± 0,05, прогретым при 37°С.The amount of formalinized 10% ram erythrocytes necessary for the preparation of a diagnostic test is collected in 2 ml tubes. Precipitated and washed by centrifugation 4 times at 1000 rpm for 15 minutes from formalin residues with a solution of normal rabbit serum 1: 250 in a 0.9% solution of sodium chloride pH. 6.8 ± 0.05. The red blood cells are diluted to a concentration of 2.5% suspension with 0.9% sodium chloride solution, pH 6.8 ± 0.05, heated at 37 ° C.

К 2,5% взвеси отмытых формализированных эритроцитов, посто нно помешива , добавл ют равный объем танинаAn equal volume of tannin is added to 2.5% of the suspension of washed formalized red blood cells, stirring constantly

1:20000, предварительно подогрев его до1: 20,000, preheating it to

37°С. Танизацию провод т при 37°С ± 1°С37 ° C. Tanization is carried out at 37 ° С ± 1 ° С

.в течении 15 минут. По окончании таниза- ции взвесь эритроцитов трехкратно отмывают забуференным 0,9% раствором натри хлорида рН 6,4 ±0,05, центрифугиру по 10 мин, при 1000 об/мин. Осадок после центрифугировани развод т этим же забуференным раствором до 2,5% концентрации эритроцитов.. within 15 minutes. At the end of the tanization, the suspension of red blood cells is washed three times with a buffered 0.9% sodium chloride solution, pH 6.4 ± 0.05, centrifuged for 10 minutes, at 1000 rpm. The precipitate after centrifugation was diluted with the same buffered solution to a 2.5% concentration of red blood cells.

К 2,5% взвеси танизированных эритроцитов при перемешивании добавл ют равный объем раствора лептоспирозного антигена в оптимальной сенсибилизирующей дозе, выдерживают при 45° ± 1 ° 60 мин на вод ной бане.To 2.5% suspension of tanized erythrocytes with stirring, an equal volume of leptospirosis antigen solution is added in an optimal sensitizing dose, kept at 45 ° ± 1 ° 60 min in a water bath.

К смеси формалинизированных эритроцитов с сенситином дл более прочного св зывани лептоспирозногр антигена с рецепторами эритроцитов добавл ют формалин до 1,0% конечной концентрации за 15 мин до конца сенсибилизации.Formalin is added to a mixture of formalin erythrocytes with sensitin to more strongly bind the leptospirosis antigen to erythrocyte receptors 15 minutes before the end of sensitization.

Взвесь сенсибилизированных эритроцитов осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 15 мин. Остатки сен- ситина, не св зывающегос с рецепторами эритроцитов, удал ют 4-кратным отмыванием на центрифуге в том же режиме рас: твбром нормальной кроличьей сыворотки из расчета 25-кратного объема к осадку эритроцитов .A suspension of sensitized red blood cells is precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 15 minutes. Remains of sencitin not binding to erythrocyte receptors are removed by 4-fold washing in a centrifuge in the same racial mode: normal rabbit serum bromine at the rate of 25-fold volume to the erythrocyte sediment.

Осадок сенсибилизированных эритроцитов после отмывани развод т до 5,0% концентрации эритроцитов раствором нормальной кроличьей сыворотки в разведении 1:250. Готовый жидкий диагностикум консервируют добавлением формалина до конечной концентрации 2,0%.After washing, the sensitized erythrocyte sediment was diluted to a 5.0% concentration of red blood cells with a solution of normal rabbit serum at a dilution of 1: 250. Ready liquid diagnosticum canned by the addition of formalin to a final concentration of 2.0%.

Образец плазмы крови донора исследуют на наличие антилептоспирозных антител в реакции пассивной гемагглютинации. Титр вы вленных в образце плазмы антилептоспирозных антител составл ет 1:160. В реакции с цистеином установлено, что аитилептоспирйзныё антитела относ тс к иммуноглобулинам класса G. Плазму крови данного донора подвергают лиофильному высушиванию.A blood plasma sample of the donor is examined for the presence of antileptospirosis antibodies in the passive hemagglutination reaction. The titer of antileptospirosis antibodies detected in the plasma sample is 1: 160. In the reaction with cysteine, it was found that aityleptospiral antibodies belong to class G immunoglobulins. The blood plasma of this donor is subjected to freeze drying.

П р и м е р 2, Готов т лептоспирозный эритроцитарный диагностикум повышенной чувствительности способом, описанным в примере 1. Образец плазмы кровиPRI me R 2, Prepare leptospirosis erythrocyte diagnosticum hypersensitivity by the method described in example 1. A sample of blood plasma

4онорд исследуют на наличие антилептос- Нирозных антител в реакции пассивной ге- Дагглютинации.4onord is examined for the presence of antileptosyrosis antibodies in the passive he-Dagglutination reaction.

I Титр вы вленных антилептоспирозных Антител составл ет 1:256. Плазму крови данного донора лиофильно высушивают.The titer of the detected antileptospirosis Antibodies is 1: 256. The blood plasma of this donor is freeze-dried.

I. П р и м е р 3. Лептоспирозный эрит- р оцитарный диагностикум повышенной Чувствительности и вы вление антилептос- Нирозных антител провод т аналогично Примерам 1 и 2. Титр вы вленных антилеп- тЬспирозных антител составл ет 1:320. Плазму крови данного донора лиофильно вУсушивают.I. EXAMPLE 3. Leptospirosis erythrocyte hypersensitivity diagnosticum and detection of antileptosyrosis antibodies are carried out similarly to Examples 1 and 2. The titer of the detected antileptic spirose antibodies is 1: 320. The blood plasma of this donor is lyophilized. Dry.

I Протективное действие антилептоспи- ршной плазмы исследовали in vivo на мор- с ких свинках (табл.1), массой 190-200 г, которых предварительно заражали внутри- б рюшинно культурой лептоспир в дозе 21 108 клеток, относ щейс к серогруппеI The protective effect of antileptospira plasma was studied in vivo in guinea pigs (Table 1), weighing 190–200 g, which were previously infected intraperitoneally with a leptospira culture at a dose of 21 108 cells belonging to the serogroup

ibterohaemorrhagiae.ibterohaemorrhagiae.

В результате проведенных исследований оказалось, что наибольшей про- т активной активностью обладала суха ловеческа антилептоспирозна плазма.As a result of the studies, it turned out that the dry-trapping antileptospiral plasma had the highest active activity.

00

Плазма крови с титром 1:160-1:320 ан- тилептоспирозных антител вы вл етс у здоровых лиц в 6% случаев. Плазма крови с титрами антилептоспирозных антител, уровень которых ниже, чем 1:160 не может считатьс антилептоспирозной, т.к. она обладает низкой специфической активностью . Плазма крови с титром антилептоспирозных антител, превышающим 1:320, встречаетс крайне редко, поэтому ее отбор в качестве специфического препарата нереален .Blood plasma with a titer of 1: 160-1: 320 antileptospirosis antibodies is detected in healthy individuals in 6% of cases. Blood plasma with titers of antileptospirosis antibodies whose level is lower than 1: 160 cannot be considered antileptospirosis, because it has low specific activity. Blood plasma with an antileptospirosis antibody titer exceeding 1: 320 is extremely rare, therefore, its selection as a specific preparation is unrealistic.

За вл емый способ позволил впервые получить аллогенную антилептоспирозную плазму в жидкой,замороженной и лиофили- зированной формах, характеризующихс уровнем титров антилептоспирозных антител 1:160-1:320, относ щихс к иммуногло- булинам класса G, стабильно сохран ющую специфическую активность в жидкой форме- 72 часа при температуре 6-2°С; в замороженной форме - 6 мес цев при температуре -25 ± 5°С; в лиофилизированной форме - 2 года при температуре 20-2°С (табл.2).The claimed method made it possible for the first time to obtain allogeneic antileptospirosis plasma in liquid, frozen and lyophilized forms, characterized by a titer level of antileptospirosis antibodies of 1: 160-1: 320, which belong to class G immunoglobulins, stably preserving specific activity in liquid form - 72 hours at a temperature of 6-2 ° C; in frozen form - 6 months at a temperature of -25 ± 5 ° С; in lyophilized form - 2 years at a temperature of 20-2 ° C (table 2).

Claims

SUMMARY OF THE INVENTION A process for the selection of raw materials for obtaining anti-plethospirosis plasma by screening human blood, which is also different, which, in order to increase the activity and stability of the target product,

Protective efficacy of antileptospirosis plasma

blood screening of healthy individuals using leptospirosis polyvalent erythrocyte diagnosticum and plasma samples with a titer of antileptospirosis antibodies 1: 160-1: 320 are taken. Class G immunoglobulins

Table 1

TABLE 2 Specific activity of dry antileptospirosis plasma during storage