RU1766072C - Штамм гриба fusarjum sambusjnum fuck как тест-культура для оценки микологической стойкости консервационных смазочных материалов, защищенных противомикробными присадками - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнология, техническая микробиология. Сущность изобретения: предлагается использовать для оценки микологической стойкости консервационных смазочных материалов, защищенных противомикробными присадками, штамм гриба Fusarium sambucinum Fuck BKMF-3186Д, выделенный из консервационного смазочного материала, экспонировавшегося в условиях тропического климата. Штамм гриба Fusarium sambucinum Fusk BKMF 3186Д депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР. 3 табл.

Description

Изобретение относится к технической микологии и касается нового штамма гриба, используемого для оценки микологической стойкости консервационных смазочных материалов, защищенных противомикробными присадками.

Известна группа микроскопических грибов (Aspergillus niger van Tieghem, Penicillium chrysogenum Thom, Penicillium cyclopium Westling, Scopulariopsis Bre-vicaulis (Sacc) Bainier, Paccilomyces varioti Bainier), используемых при лабораторных методах испытаний масел и смазок к воздействию мицелиальных грибов.

Недостатком этой группы микроорганизмов является то, что они не эффективны при определении устойчивости масел и смазок к воздействию микромицетов-деструкторов смазочных материалов в условиях тропиков.

Известен также штамм гриба Fusarium sambucinum BKMF-842, используемый для получения липидов, обладающих хемотоксическим действием.

Недостатком этого штамма является незначительная его активность по отношению к консервационным смазочным материалам.

В качестве прототипа, наиболее близкого к предлагаемому штамму по назначению, является штамм гриба Aspergillus niger van Tieghem BKMF-3080Д, используемый в качестве тест-культуры для определения микологической стойкости технических масел, применяемых в тропическом климате.

Недостатком известного штамма оказалось отсутствие его активности на консервационных смазочных материалах, применяемых в условиях тропиков, защищенных противомикробными присадками.

Цель изобретения получение активного штамма гриба Fusarium sambucinum, использование которого в качестве тест-культуры позволит повысить достоверность оценки при определении грибостойкости консервационных смазочных материалов, защищенных противомикробными присадками, в условиях тропиков.

Для получения штамма Fusarium sambucinum Fuck BKMF-3168Д были исследованы различные консервационные составы, проходившие натурные испытания в различных климатических зонах Республики Куба, на микробиологическую засоренность. Была обнаружена микрофлора в различных консервационных составах, экспонировавшихся на Кубе: МК-8 + 10% Акор-1, КРМ, ВК-4, НГ-203Б, ПВК, АМС-3, АУ + 25% АКОР-1, К-17. В результате исследований в консервационных составах были обнаружены как грибы, так и бактерии. Всего было исследовано 52 образца смазочных материалов. В 38 образцах консервационных смазочных материалов содержались микромицеты вида Fusarium sambucinum. Наиболее жизнеспособным и агрессивным по отношению к консервационным смазочным материалам, защищенным противомикробными присадками, оказался предлагаемый штамм Fusarium sambucinum Fuck N 11.

Штамм Fusarium sambucinum Fuck N 11 выделен из консервационного состава АУ + 25% Акор-1 в июне 1989 года. Этот консервационный состав находился на экспонировании 16 месяцев в условиях морской станции Республики Куба. Выделенный штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБМФ АН СССР под номером BKMF-3186Д.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Штамм гриба через неделю роста на среде БСА (сусло-агар + МПБ в соотношении 1:1) при температуре 30^оС образует колонии размером 9 см в диаметре, т. е. колонии покрывают всю поверхность чашки Петри. Колонии пушистые, беловато-розовые с сиреневым оттенком. Окраска обратной стороны по периферии желтоватая, в центре бледно-брусничного цвета, позднее темнеющая (до охряно-бурого цвета). Макроконидии веретеновидно-сердцевидные, слегка изогнутые, с небольшой ножкой и с 3-5 перегородками (15-40х3 мкм и крупные 60х6 мкм). Имеются микроконидии, переходные по форме и к макроконидиям. На среде Чапека указанный штамм растет плохо.

Физиолого-биохимические свойства.

Температурный оптимум роста 30^оС, минимум 15^оС, максимум 40^оС.

Штамм способен расти на технических консервационных смазочных материалах и своими продуктами метаболизма вызывать коррозию алюминиевых сплавах, на которые наносятся консервационные смазочные материалы.

Штамм гриба хорошо растет на среде БСА, на среде сусло-агар, на консервационных смазочных материалах при широком диапазоне рН от 3 до 11. На различных консервационных материалах в тропических условиях Республики Куба предлагаемый штамм гриба чаще всего развивается вместе с грибами Drechlera rostrata, Neurospora sitophila и бактериями рода Bacillus.

Отношение к источникам углерода: хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, маннит, сорбит, крахмал, целлюлозу, минеральные масла, хуже усваивает глицерин.

Отношение к источникам азота: хорошо усваивает азотнокислый натрий и DL-лейцин, совсем плохо L-аспарагин, DL-аспарагиновую кислоту, DL-а-аланин, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, мочевину, азотнокислый аммоний, сернокислый аммоний.

Антагонистические свойства по отношению к другим культурам деструкторам технических смазочных материалов в условиях тропиков отсутствуют.

Хранить штамм гриба можно в лиофильно высушенном состоянии в стерильных ампулах. Можно также этот штамм хранить в пробирках на скошенных агаризованных питательных средах сусло-агар или БСА в холодильнике с периодическими пересевами 1 раз в 3 месяца. Штамм сохраняет свою активность в пробирках с минеральной средой (состава, г/л: KH₂PO₄ 1,0; MgSO₄ 0,5; NaNO₃ 3,0; KCl 2,0; вода водопроводная остальное) с минеральным маслом МК-8 в соотношении: минеральная среда масло 3:2.

Предлагаемый штамм не патогенен.

Активность штамма Fusarium sambucinum Fuck BKMF-3186Д оценивали в сравнении со штаммом гриба Aspergillus niger van Tieghem BKMF-3080Д по следующим показателям:
устойчивость к фунгицидам;
интенсивность роста на консервационных смазочных материалах, защищенных противомикробными присадками;
потеря массы металлических пластин, защищенных консервационными смазочными материалами с противомикробными присадками.

Эти три показателя в значительной степени характеризуют активность культур сравниваемых штаммов грибов.

Устойчивость грибных культур к фунгицидам определяли с помощью дисков фильтровальной бумаги, пропитанных растворами фунгицидов определенной концентрации. Пропитанные фунгицидами диски помещали с помощью пинцета в чашки Петри на поверхность среды сусло-агар, предварительно засеянной штаммами исследуемых (сравниваемых) грибов. Затем чашки Петри термостатировали при температуре 30 ±2^оС в течение заданного времени. По диаметру зоны подавления роста грибов вокруг дисков определяли устойчивость культуры к фунгицидам. Результаты исследований представлены в табл.1.

Данные табл. 1 показывают, что для штамма Fusarium sambucinum Fuck BKMF-3186Д характерна меньшая зона подавления его роста фунгицидами, чем для штамма Aspergillus niger vam Tieghem BKMF-3080Д. Это говорит о том, что предлагаемый штамм гриба более устойчив к фунгицидам, чем ранее известный штамм BKMF-3080Д.

Интенсивность роста сравниваемых культур микромицетов на консервационных смазочных материалах, защищенных противомикробными присадками, оценивали по способности исследуемых штаммов зарастать эти материалы по 4-балльной системе:
0 полное отсутствие роста микроорганизмов на образце;
1 зарастает 25% поверхности образца;
2 зарастает 50% поверхности образца;
3 зарастает 100% поверхности образца.

Испытания проводили на консервационном масле К-17 и смазке ПВК по ГОСТ 9.052-88. Сущность испытаний заключалась в выдерживании в течение заданного времени консервационных материалов с противомикробными присадками в лунках (просверленных стерильным полым сверлом) минерального агара, засеянных суспензией микромицетов с концентрацией ≈10⁶ клеток в 1 мл суспензии, в чашках Петри. Чашки Петри с содержимым термостатировали при температуре 30^оС в эксикаторах с влажностью 96.98% Концентрация присадок в смазочных материалах была выбрана 1% (исходили из литературных данных). В качестве контроля использовали консервационные материалы с противомикробными присадками, не засеянные суспензиями микромицетов.

Потерю массы металлических пластин, защищенных консервационными смазочными материалами с противомикробными присадками при развитии на них микроскопических грибов определяли после испытания металлических пластин с нанесенными на них материалами, на поверхности газона грибов в чашках Петри, термостатированных при температуре 30^оС в течение 6 месяцев. После испытания проводили стерилизацию содержимого в чашках Петри, удаляли с металлических образцов консервационные материалы промывкой в бензине, а затем продукты коррозии снимали в растворе состава: кислота соля- ная (1,19) 500 см³/дм³; ингибитор ПБ-5 10 г/дм³; температура 18-25^оС время 15 мин После удаления продуктов коррозии металлические пластины промывали в воде, сразу же высушивали, затем промывали в ацетоне и высушивали. Потерю массы образцов определяли по формуле
K

· 100 где Δ m потеря массы испытуемого образца, г;
Δ m m_o m, где m_о масса образца до испытаний, г;
m масса образца после испытаний и удаления продуктов коррозии, г. В качестве контроля использовали металлические образцы, защищенные консервационными материалами с противомикроб- ными присадками, расположенные на поверхности стерильной питательной среды в чашках Петри.

Примеры практического выполнения.

П р и м е р 1. Лабораторные испытания грибостойкости консервационных смазочных материалов, защищенных противомикробными присадками, в лунках минеральной среды в чашках Петри.

В консервационную жидкую смазку К-17 вводили при перемешивании 1% биоцидной присадки Афотас. Подготовленную с антимикробной присадкой смазку размещали в 5 лунках, сделанных стерильным металлическим полым сверлом, минерального агара (состава, NaNO₃ 0,3; KCl 0,2; KH₂PO₄ 0,1; 0,05 MgSO₄ ˙7H₂O, вода остальное, голодного агара 3; рН 6).

Смазку, расположенную в лунках минерального агара в чашках Петри, заражали в одной партии суспензией спор штамма Fusarium sambucinum BKMF-3186Д, а в другой партии (прототип) суспензией спор штамма Aspergillus niger van Tieghem BKMF-3080Д. Суспензии спор мицелиальных грибов готовили следующим образом. Культуры грибов для исследований выращивали в пробирках на косяках твердой питательной среды сусло-агар 10 сут при температуре 30^оС. Выращенный косяк с культурой гриба заливали 10 мл стерильной водопроводной воды и суспендировали выросший на косяке мицелий гриба. Полученную грибную суспензию фильтровали для отделения спор гриба от мицелия через 4 слоя стерильной марли. Полученной споровой суспензией грибов заражали консервационное масло К-17 в лунках минерального агара в чашках Петри. При этом способе мицелиальные грибы в качестве источника углерода используют только консервационное масло, расположенное в лунках минеральной агаризованной среды. Подготовленные к исследованиям чашки Петри помещали в эксикаторы для поддержания влажности 96.98% и располагали в термостатной комнате при температуре 30^оС. Аналогичные исследования проводили с консервационной смазкой ПВК. Интенсивность роста сравниваемых грибов, поражающих материалы, с биоцидной добавкой Афотас и с другими добавками через 30 сут испытания приведена в табл.2.

Из приведенных в табл.2 данных следует, что степень поражения консервационных смазочных материалов, защищенных противомикробными присадками, штаммом гриба BKMF-3186Д в 2 или 3 раза превышает степень поражения консервационных смазочных материалов, защищенных противомикробными присадками, известным штаммов BMKF-3080Д.

П р и м е р 2. Испытание стали 3, защищенной консервационными смазочными материалами с антимикробными присадками, на грибостойкость.

Способ введения биоцидной добавки в консервационные смазочные материалы аналогичен примеру 1.

Образцы из стали 3 размером 10х20х2 мм обезжиривали бензином Б-70 и ацетоном, взвешивали на весах, заворачивали в бумагу, затем стерилизовали в сушильном шкафу 2 ч. На каждый вариант испытания использовали 5 образцов.

После стерилизации на образцы из ст.3 тонким слоем наносили консервационный смазочный материал (К-17 или ПВК), защищенный противомикробными присадками.

Образцы из ст.3 с нанесенным консервационным материалом с биоцидной добавкой располагали на поверхности газона соответствующего штамма гриба, выросшего на среде сусло-агар в чашке Петри при температуре 30^оС. Чашки с содержимым ставили в эксикатор с влажностью 96.98% который помещали в термостатную комнату при температуре 30^оС. Через 6 месяцев испытаний удаляли консервационный смазочный материал, продукты коррозии, взвешивали образцы из ст.3 и по потере массы металла судили о коррозионной активности сравниваемых штаммов грибов после воздействия консервационным смазочным материалом с биоцидной добавкой. Результаты исследований представлены в табл.3.

Из табл. 3 видно, что предлагаемый штамм гриба в 3 и более раз увеличивает потерю массы металла, защищенного консервационными смазочными материалами с антимикробными присадками, по сравнению со штаммом прототипом.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что с помощью штамма Fusarium sambucium Fuck BKMF-3186Д, используемого в качестве тест-культуры, повышается достоверность оценки микробиологической стойкости консервационных смазочных материалов, защищенных противомикробными присадками.

Claims (1)

1. Штамм гриба Fusarium sambucinum Fuck BKMF-3186Д как тест-культура для оценки микологической стойкости консервационных смазочных материалов, защищенных противомикробными присадками.

Images