RU1440029C - Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбоиона человека, используемый в качестве тест-системы для определения антивирусной активности интерферонов человека и размножения вирусов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления препаратов человеческих интерферонов и накопления вирусной биомассы. Целью изобретения является получение штамма диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, чувствительного к интерферонам человека и широкому спектру вирусов. Штамм получают путем шадящей трипсинизации измельченных кожно-мышечных лоскутов 10-недельного эмбриона человека и обозначают М-21. Для клеток штамма М-21 2n = 46 процент диплоидных клеток колеблется от 92,4 до 90,2, процент полиплоидных - от 1 до 3,8. Жизненный цикл штамма 56± 2 пассажа, среда культивирования - среда Игла МЕМ с 10% СКРС. Титры α - интерферона на клетках М-21 колеблются от 512 до 3200 ед; b - интерферона от 32 до 1280 ед.; g - интерферона от 64 до 1280 ед. Штамм М-21 используют для выращивания вирусов полиомиелита, Коксаки, ЕСНО, риновирусов и аденовирусов.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления препаратов человеческих интерферонов и накопления вирусной биомассы.

Целью изобретения является получение штамма диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, чувствительного к интерферонам человека и широкому спектру вирусов.

Штамм получают следующим образом. Первичную культуру клеток готовят с помощью метода щадящей трипсинизации измельченных кожно-мышечных лоскутов 10-недельного эмбриона человека.

Клетки ресуспендируют в среде Игла МЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) и эксплантируют в 12 полуторалитровых матрасов с концентрацией клеток 7˙10⁴/мл. Сосуды с клетками инкубируют при 37^оС. В первичной культуре монослой формируется на 6 сут. Затем проводят первое субкультивирование, а все последующие - по четкому графику - два раза в неделю, так что интервал между пересевами клеток постоянно составляет 3-4 сут. Используют среду того же состава. Отделение клеток от стекла осуществляют 0,25% -ным раствором трипсина при кратковременном контакте их с ферментом (не более 3 мин). Кратность рассева клеток в фазе активного роста составляет 1:2, 1:3. Полученный штамм обозначают М-21. Он хранится во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур Института медицинской генетики АМН СССР, депонирован на уровне 9 пассажа с паспортом и регистрационным номером Д-2 (15/2/7). Банк отконтролированных посевных клеток на уровне 9 пассажа в количестве более 1,5 млрд.кл., а также криоконсервированные клетки на уровне 2 пассажа в количестве 460 млн, 3-120 млн, 5-180 млн хранятся в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.

Штамм М-21 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Первичная культура состоит из фибробластоподобных и эпителиоподобных клеток с преобладанием первых. По завершении первой фазы роста эпителиоподобные клетки исчезают и под малым увеличением микроскопа можно увидеть мономорфную культуру с характерным для фибробластов ориентированным расположением клеток. Такой вид сохраняется до 3 фазы роста.

При изучении фиксированных и окрашенных гематоксилином и эозином препаратов на уровне 11, 14, 16, 20, 25, 30 и 34 пассажей установлено, что клеточный монослой состоит из ориентированных однородных веретеновидных клеток с овальными ядрами, содержащими 1-3 ядрышка и мелкие глыбки хроматина. Высокая митотическая активность на ранних сроках культивирования клеток снижается по мере формирования монослоя к 48 ч до 8%, причем единичные митозы встречаются только в местах более редкого расположения клеток, что свидетельствует о выраженной контактной ингибиции, характерной для нормальных, не обладающих онкогенными потенциями клеток. На гистологических препаратах клеток штамма М-21 отмечено обычное содержание и локализация ДНК, РНК, кислой и щелочной фосфатаз и мелких глыбок гликогена.

На 34 пассаже культуры отмечено появление клеток с увеличенными ядрами, усиление распластанности цитоплазмы отдельных клеток, укрупнение глыбок гликогена до образования отдельных крупных скоплений (изменение, характерное для начала 3 фазы роста).

Кариологические признаки.

Кариологический анализ проводят на уровне 10, 20, 29, 44 пассажей по 1000 метафоз. Всего изучают 4000 метафоз. Для клеток штамма 2n=46/ХУ/ процент диплоидных клеток в пассажах колеблется от 92,4 до 90,2, процент полиплоидных - от 1 до 3,8.

Иммуногенетические признаки.

Методом иммунного цитолиза с использованием 120 специфических иммунных сывороток штамм М-21 тестирован на содержание антигенов гистосовместимости (НLА). Установлено, что клетки этого штамма содержат три основных стабильно воспроизводимых антигена-HLA-A: 2, HL AB:5,40. Опыты ставят на клетках 11, 14, 16, 20 и 25 пассажей. Учитываются данные НLA фенотипа, полностью повторяющиеся в двух титрованиях. В результате проведенного тестирования показано высокое соответствие HLA фенотипа штамма М-21 в различные сроки культивирования и на разных пассажах. Полученные стабильные характеристики НLA фенотипа могут быть использованы для индивидуальной идентификации данного штамма. В настоящее время такая характеристика является единственной при дифференциации штаммов диплоидных клеток, особенно при совпадении пола.

Изучение изоферментов в клетках штамма М-21 выявил энзимограмму человека и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу медленного типа.

Культуральные признаки.

Жизненный цикл штамма 56-2 пассажа.

Фазы роста: становление 1-3 пассажа, активный рост 4-44, старение от 45 до 54-58 пассажей.

Кратность рассева в первых двух фазах 1:3, реже 1:2, в третьей 1:1,5, 1: 2, на уровнях последних пассажей 1:1. Посевная доза 76-100˙10³ в 1 мл среды Игла МЕМ с 10% СКРС. Отделение клеток от стекла проводят 0,25%-ным раствором трипсина. В многочисленных опытах установлено, что количество клеток в монослое 1,5 л матраса 35-45 млн. Среднее число удвоений популяции между пассажами в фазе активного роста 1,76, время удвоения популяции около 46 ч, общее число популяционных удвоений около 79.

Положительным свойством штамма является его высокая пролиферативная активность и способность сохраняться на стекле в виде монослоя без смены среды не менее 2 недель.

Чувствительность к вирусам.

Изучена чувствительность штамма М-21 к 17 вирусам.

К первичному заражению без адаптации культура чувствительна к вакцинным штаммам Сэбина полиовируса трех типов: Коксаки А-7, В 1-6, ЕСНО 11, энтеровирусам 70, 71, риновирусу, аденовирусам 3, 5, 16.

На фиксированных окрашенных препаратах при заражении каждым из перечисленных вирусов развиваются характерные цитопатические изменения (ЦПД).

Чувствительность к противовирусному действию интерферонов.

Для работы с интерферонами человека используют штамм М-21 на уровне 13-39 пассажей (исследованний диапазон). Установлено, что уровень пассажа не коррелирует с чувствительностью клеток к интерферонам. С удлинением срока инкубации клеток в платах для титрования до 4-6 сут (против обычных 1-3) возрастает чувствительность клеток к интерферонам всех трех типов. По мере увеличения срока инкубирования клеток в платах до титрования регистрируют увеличение титров используемых препаратов интерферонов до 20 раз. На величину активности интерферона оказывает влияние состояние клеток, обусловленное качеством среды и сывороток, а также условиями культивирования. Например, титры альфа-интерферона при использовании культуры одного уровня пассажа, но с разным качеством монослоя колеблются от 640 до 3840 ед.

В качестве вирусов-индикаторов при определении противовирусной активности интерферонов в данной тест-системе используют вирусы везикулярного стоматита и вирус энцефаломиокардита мышей. Противовирусную активность интерферонов определяют по методу подавления ЦПД вируса-индикатора. Возможно применение макрометода (пробирки) и микрометода (платы). Результат оценивают по дегенерации культур, наблюдаемой под микроскопом или визуально с использованием витального красителя.

При титровании лабораторных стандартов интерферонов человека в 16 опытах титры альфа-интерферона колеблются от 512 до 3200 ед, титры бета-интерферона - от 32 до 1280 ед, титры гамма-интерферона - от 64 до 1280 ед.

Контроль штамма М-21 на посторонние контаминанты.

При обследовании клеток штамма М-21 на стерильность (наличие грибов, бактерий, микоплазм) получают отрицательные результаты на уровне 1-55 пассажей.

При обследовании культуральной жидкости и самих клеток на уровне 10, 20, 30 и 40 пассажей в чувствительных клеточных системах, а также в реакциях гемадсорбции вирусы-контаминанты не выявлены. При обследовании штамма М-21 на тех же уровнях пассажей в опытах на взрослых и новорожденных белых мышах, кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах и иммунодепрессированных мышах линии СВА посторонних агентов, в том числе и онкогенных, не обнаружено. При изучении фиксированных и окрашенных препаратов культуры штамма М-21 патологических изменений также не выявлено.

Криоконсервирование.

При криоконсервировании применяют 80% среды Игла, 10% СКРС, в качестве криопротектора используют 10% глицерина при концентрации клеток (2-3)˙10⁶ кл/мл. Жизнеспособными после восстановления остаются 75±5% клеток.

Использование штамма М-21 иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. В культуральный сосуд со штаммом клеток на уровне 20 пассажа вводят смесь растворов 0,25% трипсина и 0,02% версена (1:2), подогретого до 37^оС. Монослой ополаскивают и жидкость удаляют. Сосуд с культурой оставляют до отслоения клеток от стекла при 37^оС. Затем в него вводят среду роста - Игла МЕМ с 10% СКРС до концентрации 120 тыс. кл/мл и засевают по 0,2 мл на лунку в микроплаты. Клетки инкубируют в термостате с 5% СО₂ при 37^оС в течение 3 суток до формирования монослоя.

Среду роста из плат удаляют стряхиванием. Культуру заливают свежей средой по 0,1 мл на лунку. Испытуемый образец интерферона вносят в первую лунку платы в объеме 0,1 мл и делают последовательные двукратные разведения с помощью автоматической микропипетки. Содержимое первой лунки пипетируют 3-4 раза и 0,1 смеси переносят во вторую лунку, содержимое второй лунки пипетируют 3-4 раза и 0,1 мл смеси переносят в третью лунку и так далее до конечного разведения. Аналогично проводят раститровку лабораторного стандарта.

Для предварительного определения активности используемого в титровании вируса-индикатора - вируса везикулярного стоматита (штамм Индиана) в пенициллиновых флаконах делают последовательные 10-кратные разведения вируса от 1 до 6 lg. Среда разведения та же, что и для титрования интерферона. Соответствующие разведения вируса вносят по 0,1 мл на лунку из расчета по 4 лунки для каждого разведения. Плату инкубируют в термостате в течение 1 сут и определяют титр вируса. Готовят рабочее разведение вируса, содержащего 100 ЦПД/мл. При данном титре вируса, равном 4 lg, рабочее разведение получают в результате двух последовательных 10-кратных разведений. Для контроля дозы вируса испытывают 3 последовательных 10-кратных разведения ее.

В лунки платы с разведением интерферона вносят по 0,1 мл рабочего разведения вируса. Для контроля культуры оставляют 4 лунки с клетками, содержащими одну питательную среду.

Плату инкубируют в течение 2 сут в термостате с 5% СО₂ при 37^оС, после чего учитывают результаты титрования с помощью инвертированного микроскопа, сравнивая состояние монослоя опытных лунок с контрольными. За титр интерферона принимают величину, обратную значению наибольшего разведения препарата, который вызывает 50% -ную защиту клеточного монослоя вируса. Титр α-интерферона составляет 3200 ед, β-интерферона 128 ед, γ -интерферона 1280 ед.

П р и м е р 2. В культуральный сосуд с диплоидными клетками кожи и мышц эмбриона человека М-21 на уровне 26 пассажа вводят 0,25%-ный раствор трипсина, подогретого до 37^оС. Через 5-7 с раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37^оС на 2-3 мин. Затем вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхиванием заканчивают процесс отделения клеток от стекла. После этого в клеточную взвесь добавляют среду роста - Игла МЕМ с 10% СКРС - и разливают на 2 сосуда. Эти культуры 27 пассажа инкубируют при 37^оС в течение 3 сут до момента формирования плотного монослоя.

При заражении вирусом среду из культуральных сосудов сливают, клетки однократно промывают рабочим раствором Эрла и вводят вирусосодержащую среду из расчета 1 БОЕ на клетку. В качестве поддерживающей среды используют 0,5% -ный гидролизат лактальбумина (рН 7,6). Культуру инкубируют при 37^оС. Сбор вируса проводят на 3 сут. Вирусосодержащую жидкость хранят при -20^оС. Титр вируса определяют по методу образования бляшек при заражении первичной культуры клеток почек африканских зеленых мартышек. Титр вируса полиомиелита штамма Сэбина типа I составляет 7,67 lg БОЕ/мл, типа II 7,48 lg БОЕ/мл, типа III 7,64 lg БОЕ/мл, вируса ЕСНО 11 6,50 lg ТЦД₅₀/мл, риновируса 7,58 lg ТЦД₅₀/мл, энтеровируса 70 4,60 lg ТЦД₅₀/мл.

Claims (1)

1. Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека ВСКК(НБЧ) ND-2/15/2/7/, используемый в качестве тест-системы для определения антивирусной активности интерферонов человека и размножения вирусов.