RU1352941C

RU1352941C - Strain of hybrid cultured mouse cells mus musculus used for preparing of monoclonal antibodies to the group-specific antigen in human erythrocytes

Info

Publication number: RU1352941C
Authority: RU
Inventors: Е.И. Дерюгина; Н.И. Дризе; Л.Н. Леменева; Г.А. Удалов; И.Л. Чертков; Е.М. Макарова; И.М. Гуртовой
Original assignee: Чертков Иосиф Львович
Priority date: 1986-02-03
Filing date: 1986-02-03
Publication date: 1994-10-15

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: strain is prepared by hybridization of spleen cells of mouse Balb/c immunized with human erythrocytes of group B (III) with myeloma cells RZ-X63-Ag 8.653. Productive clones are designated as D2. Strain is stored in Collection of transplanted cell lines in Institute of Hematology and Blood Transfusion at number B-1/85. Cells of strain grow as stationary suspension on the medium RPMI-1640 or DMEM with 20% fetal calf serum, modal chromosome number is 85, cells have two metacentric chromosomes and a single acrocentric chromosome. Titer of monoclonal antibodies in cultural and ascitic fluid is 1:128-1:1024 and 1:512000, respectively. Antibodies defect antigen B in erythrocytes of blood groups B (III) and AB (IV). Activity of antibodies to cultural fluid is 6-10 s. EFFECT: preparing of strain indicated above. 1 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения группы крови человека системы АВО. The invention relates to biotechnology and can be used to determine the human blood group of the ABO system.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, продуцирующих моноклональные антитела к группоспецифическому антигену В эритроцитов человека, обладающего большей продуктивностью по сравнению с известным. The aim of the invention is to obtain a strain of hybrid cultured mouse Mus musculus cells producing monoclonal antibodies to the group-specific antigen B of human erythrocytes, which has greater productivity compared to the known one.

Штамм получают следующим образом. Клетки селезенки мышей Balb/с, иммунизированных эритроцитами человека группы В (III), гибридизуют с клетками миеломы Р3-Х63-Ag 8,653 с помощью полиэтиленгликоля (мол.м. 1500). Эффективность слияния составляет 78%. Клонирование осуществляют методом лимитирующих разведений, эффективность клонирования составляет 60%. В массовую культуру штамм выводят после двух клонирований дающих 100% положительных клонов и обозначают D2. Штамм D2 хранится в коллекции перевиваемых гибридных клеточных линий ЦНИИГПК под номером В-1/85 и характеризуется следующими признаками. The strain is obtained as follows. The spleen cells of Balb / c mice immunized with human group B (III) red blood cells hybridize with P3-X63-Ag 8.653 myeloma cells using polyethylene glycol (mol.m. 1500). The merger efficiency is 78%. Cloning is carried out by the method of limiting dilutions, the cloning efficiency is 60%. In mass culture, the strain is removed after two cloning giving 100% positive clones and denote D2. Strain D2 is stored in the collection of transplantable hybrid cell lines TsNIIGPK under the number B-1/85 and is characterized by the following features.

Морфологические признаки. Morphological signs.

Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату клеток с обычной для гибридных антителопродуцирующих клеток морфологией. The culture consists of cells that weakly adhere to the substrate with the usual morphology for hybrid antibody-producing cells.

Кариологические признаки. Karyological signs.

Кариотип соответствует Mus musculus. Модальное число хромосом 85 с интервалом варьирования 81-92. С помощью С-окрашивания выявляются две метацентрические хромосомы и одна большая акроцентрическая. The karyotype corresponds to Mus musculus. The modal number of chromosomes is 85 with an interval of variation of 81-92. Using C-staining, two metacentric chromosomes and one large acrocentric chromosome are detected.

Культуральные признаки. Cultural signs.

Среда для культивирования RPMI-1640 или ДМЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 1% пирувата натрия, 1-2% Неpes-буфера, 5·10^-5 2-меркаптоэтанола, 50 ед/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия - встряхивание или снятие резиновым "полисменом". Частота пассирования - через 2-3 cут. Кратность рассева 1:3-1:4.Culture medium for RPMI-1640 or DMEM with 20% fetal calf serum, 4 mM L-glutamine, 1% sodium pyruvate, 1-2% non-buffer, 5 · 10 ^-5 2-mercaptoethanol, 50 units / ml penicillin and 25 μg / ml streptomycin. The nature of the growth is a stationary suspension. Method of removal - shaking or removing the rubber "cop". Passaging frequency - after 2-3 days. Multiplicity of sieving 1: 3-1: 4.

При введении мышам Balb/c, предварительно обработанных пристаном, 2-5·10⁶ клеток асцит образуется через 9-18 дней. Стабильная продукция антител наблюдается в течение 5 пассажей на мышах, титр антител в асцитной жидкости составляет 1:512000, в культуральной 1:128-1:1024.When Balb / c mice were pretreated with a pier, 2-5 · 10 ⁶ cells of ascites were formed after 9-18 days. Stable antibody production is observed for 5 passages in mice, the titer of antibodies in ascites fluid is 1: 512000, in culture 1: 128-1: 1024.

Характеристика моноклональных антител. Characterization of monoclonal antibodies.

Моноклональные антитела (МА), продуцируемые штаммом D2, выявляют антиген В в эритроцитах как группы В (III), так и АВ (IV). Авидность антител в культуральной жидкости составляет 6-10 c. Monoclonal antibodies (MA) produced by strain D2 reveal antigen B in erythrocytes of both group B (III) and AB (IV). The avidity of antibodies in the culture fluid is 6-10 c.

Консервация клеток. Cell preservation.

Клетки штамма D2 замораживают после 2-го и 3-го клонирования на 10, 12 и 35 пассажах в культуре и после роста в виде асцитной опухоли в мышах. Криозащитная среда: 50% ростовой среды, 40% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида. The cells of strain D2 are frozen after the 2nd and 3rd cloning at 10, 12 and 35 passages in culture and after growth in the form of an ascites tumor in mice. Cryoprotective medium: 50% growth medium, 40% fetal calf serum and 10% dimethyl sulfoxide.

Режим замораживания: клетки в криозащитной среде помещают на сутки в холодильник при -70^oC в пенопластовом контейнере, после чего переносят в жидкий азот. Выживаемость клеток при размораживании составляет 70-85%.Freezing mode: cells in a cryoprotective medium are placed for a day in a refrigerator at -70 ^o C in a foam container, after which they are transferred to liquid nitrogen. Cell survival during thawing is 70-85%.

Сведения о контаминантах линии. Information about line contaminants.

Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазма не обнаружены. Bacteria, fungi, yeast and mycoplasma were not detected.

Использование штамма D2 иллюстрируется следующим примером. The use of strain D2 is illustrated by the following example.

Образцы индуцированной клетками штамма D2 культуральной и асцитной жидкостей мышей исследуют по общепринятым методам со стандартными эритроцитами в солевой среде в 96-луночных платах (титр антител) и в реакции агглютинации на плоскости (авидность антител). Под авидностью антител подразумевается средство излучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реакции агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр). Samples of the culture-induced and ascitic fluid of mice induced by the D2 strain cells of mice were examined using standard methods with standard red blood cells in saline in 96-well plates (antibody titer) and in the agglutination reaction on the plane (antibody avidity). Avidity of antibodies means a means of emitted antibodies to standard human red blood cells, estimated by the time of the appearance of the first agglutinates (first parameter), the time of the onset of a clear agglutination reaction (second parameter) and the time of appearance of large agglutinates (third parameter).

Результаты исследования активности и авидности моноклональных антител приведены в таблице. The results of a study of the activity and avidity of monoclonal antibodies are shown in the table.

Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о высокой специфичности и авидности моноклональных антител, продуцируемых штаммом D2. Моноклональные антитела, получаемые при использовании известного штамма, реагируют в специфических реакциях в меньших титрах. The results shown in the table indicate the high specificity and avidity of monoclonal antibodies produced by strain D2. Monoclonal antibodies obtained using a known strain react in specific reactions in lower titers.

Claims

The strain of hybrid cultured mouse cells of mus musculus N B-1/85 (Collection of transplantable hybrid cell lines of the Central Research Institute for Hematology and Blood Transfusion) used to obtain monoclonal antibodies to the group-specific human erythrocyte B antigen.