RS67376B1 - Zatvoreni sistem uređaja za krioprezervaciju - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] POZADINA PRONALASKA

[0005] Oblast tehnike

[0007] Ovde opisan i naznačen uređaj potpada pod oblast uređaja za krioprezervaciju bioloških uzoraka.

[0009] Opis problema i stanje tehnike

[0011] Krioprezervacija se primenjuje u prirodnim naukama sa ciljem zaustavljanja biološke aktivnosti u vrednim ćelijama tokom dužeg vremenskog perioda. Među tehnikama koje se koriste za krioprezervaciju je i vitrifikacija.

[0013] [0003] Vitrifikacija podrazumeva transformaciju rastvora koji se sastoji od biološkog uzorka, tj. oocita ili embriona, u staklastu amorfnu čvrstu materiju koja je bez ikakve kristalne strukture, nakon čega sledi izuzetno brzo hlađenje. Jedan od glavnih izazova ove metode je sprečavanje formiranja kristala leda u intracelularnoj tečnosti unutar oocita ili embriona. Shodno tome, prvi korak je dehidracija ćelije ili ćelija koliko god je to moguće korišćenjem tečnosti koje sadrže krioprotektant nazvanih „medijum za vitrifikaciju“. Biološki uzorak se zatim brzo hladi uranjanjem u kriogenu tečnost kao što je, na primer, tečni azot (LN<2>). Uz odgovarajuću kombinaciju brzine hlađenja i koncentracije krioprotektanta, intracelularna voda će dostići čvrsto, bezopasno, staklasto (prozračno) stanje, a ne uređeno, štetno, kristalno stanje leda. Vitrifikacija se može opisati kao brzo povećanje viskoznosti tečnosti kojim se molekuli vode zarobljavaju u slučajnoj orijentaciji. Međutim, medijum za vitrifikaciju može sadržati relativno visoke nivoe krioprotektanta koji mogu biti toksični za ćelije, izuzev kada su u staklastom stanju. Kao rezultat toga, vreme izlaganja ćelija medijumu za vitrifikaciju tokom dehidracije i zagrevanja se mora pažljivo kontrolisati kako bi se izbeglo oštećenje ćelija i, shodno tome, poželjno je da se uzorak što pre ohladi.

[0015] Ovaj podsticaj je doveo do razvoja metode u kojoj se biološki uzorak direktno uranja u kriogen radi postizanja brzog hlađenja. Kriokontejneri koji se koriste u ovoj tehnici klasifikovani su kao „otvoreni“ za upotrebu u „otvorenom sistemu“ jer je biološki uzorak u direktnom kontaktu sa kriogenom, npr. LN<2>. Primeri uključuju rešetke elektronske mikroskopije, otvorene slamčice, Cryoloop™ od Hampton Research Corp., iz Aliso Vijeha, Kalifornija, SAD, i Cryotop<®>koji nudi KitaZato Biopharma Co. Ltd, iz Fudžija, Šizuoka, Japan. Otvoreni nosači takođe omogućavaju brzo zagrevanje biološkog uzorka.

[0017] Međutim, LN<2>nije aseptičan. Može da sadrži bakterijske i gljivične vrste koje su održive i nakon zagrevanja. Štaviše, objavljeno je da vitrifikovane ćelije koje se dugo čuvaju u LN<2>mogu biti inficirane virusnim patogenima veštački smeštenim u pomenuti LN<2>. Stoga postoji mogućnost infekcije bioloških uzoraka vitrifikovanih u otvorenim nosačima. Kao rezultat toga, mnoge zemlje su zabranile otvorene sisteme zbog visokog rizika od kontaminacije uzoraka.

[0019] Potencijal infekcije doveo je do razvoja zatvorenih kriokontejnera gde se biološki uzorak stavlja u kriokontejner i zatvara pre hlađenja u LN<2>. Kriokontejner takođe služi kao uređaj za skladištenje kako bi se izolovao od kriogena tokom dugotrajnog skladištenja. „Zatvoreni“ sistem se odnosi na sistem vitrifikacije koji sprečava direktan kontakt između LN<2>i biološkog materijala. Primeri zatvorenih kriokontejnera uključuju Cryotip<®>koji nudi Irvine Scientific, i „Cryotop<®>SC“ od KitaZato. U oba slučaja su kontejneri termički zaptiveni kako bi se izolovao uzorak.

[0021] [0007] Još jedan primer kriokontejnera za upotrebu kao zatvoren sistem, američki patent br. 7.316.896 podnosioca Kuwayami i drugih pod nazivom „Alat i postupak za zamrzavanje i skladištenje jajnih ćelija“, opisuje zatvoreni kriokontejner za vitrifikaciju. Ovaj uređaj se sastoji od fine plastične cevi (nominalno spoljašnjeg prečnika 0,25 mm i debljine zida 0,02 mm). Tipičan biološki uzorak će sadržati humani oocit sa spoljašnjim prečnikom od 0,125 mm. Dehidrira se medijumom za vitrifikaciju, a zatim se uvlači u cev. Zatim se oba kraja cevi termički zatvaraju uređajem za termičko zaptivanje kako bi se stvorio aseptični kontejner. Pošto je jedan od termičkih zaptivača formiran veoma blizu biološkog uzorka, postoji zabrinutost da će toplota oštetiti ćeliju.

[0023] Slično tome, američki patent br. 8.372.633 pod nazivom „Komplet za pakovanje unapred određene zapremine supstance koja se konzervira kriogenom vitrifikacijom“ podnosioca Clairaz i drugih, opisuje koncept zatvorenog kriokontejnera tipa „cev unutar cevi“. Obe cevi su izrađene od plastike. Unutrašnja cev je modifikovana tako da se na jednom kraju stvara kanal na koji se postavlja biološki uzorak. Napunjena unutrašnja cev se zatim postavlja unutar spoljašnje cevi. Spoljašnja cev se zatim termički zatvara na kraju za punjenje kako bi se stvorio aseptični kriokontejner. Međutim, termičko zaptivanje zahteva skup uređaj za zaptivanje koji može da spoji plastiku kriokontejnera za vitrifikaciju. Takođe dodaje još jedan korak u postupku koji zahteva brzinu zarad bezbednog izvođenja.

[0025] Kako bi se rešio ovaj nedostatak, u američkoj prijavi patenta br.20090123996 podnosioca Chin, predstavljen je uređaj sa zatvorenim sistemom kontejnera pod nazivom „Uređaj za vitrifikaciju sa zaptivkom memorisanog oblika“. Opisano je da uređaj sadrži cev za sakupljanje uzorka na čijem je jednom kraju postavljen graničnik. Cev za sakupljanje, sa uzorkom, ubacuje se u cevasti omotač dok se graničnik ne spregne sa omotačem. Zatim se umesto termičkog zaptivanja na zatvoreni omotač postavlja poseban uređaj za zatvaranje. Uređaj za zatvaranje sadrži čep koji se povlači nadole na graničnik pomoću memorijskog materijala oblikovanog da se skuplja kada je izložen niskim temperaturama, kao što je slučaj kada je uronjen u LN<2>. Problem sa ovim pristupom je što povećava složenost uređaja sa kriokontejnerom, a pošto su komponente izrađene od različitih materijala od kojih svaka ima svoj koeficijent termičkog širenja, one se šire ili skupljaju različitim brzinama, što takođe može poremetiti zaptivanje.

[0027] [0010] US 2014/157798 A1 opisuje kriogeni uređaj za skladištenje, kao što je na primer kriokupka, za krioprezervaciju i/ili vitrifikaciju biološkog uzorka u medijumu za zamrzavanje. Takođe je opisana bočica koja se može koristiti sa kriogenim uređajem za skladištenje, a koja sadrži element za zatvaranje koji se može odvojivo prihvatiti od strane otvorenog kraja bočice. Element za zatvaranje može da sadrži deformabilni zaptivni element koji obezbeđuje oblikovani muški konus koji se čvrsto i pouzdano spreže sa odgovarajućim ženskim konusom unutrašnjeg zida lumena bočice, na prime putem trenja, kako bi se time obezbedilo nepropusno zaptivanje. Drugim rečima, unutar lumena bočice se može stvoriti i održavati „zatvoreni sistem“ za zaptiveno skladištenje uzorka u različitim okruženjima i temperaturnim opsezima, uključujući i tokom vitrifikacije i skladištenja u tečnom azotu, bez potrebe za obezbeđivanjem dodatnih ili dopunskih mera zaptivanja radi zaštite uzoraka tokom skladištenja i/ili sprečavanja prodiranja tečnog azota u komoru u kojoj se drži uzorak u bočici. Bočica i zatvarač su poželjno napravljeni od istog materijala kako bi se osigurala ista svojstva termičke kontrakcije respektivnih materijala.

[0029] Uspešna primena Cryolock uređaja za krioprezervaciju oskudnih ljudskih ejakulata i testikularnih spermatozoida je opisana u časopisu Andrology, 2015, 3, str.

[0030] 220-224 ( A. Stein i drugi).

[0032] KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0034] Predmetni uređaj je opisan uz pozivanje na prateće slike. Na slikama slične pozivne oznake označavaju identične ili funkcionalno slične elemente.

[0036] Slika 1 je bočni prikaz jednog primernog izvođenja opisanog uređaja za krioprezervaciju;

[0037] Slika 2A ilustruje štapić;

[0038] Slika 2B ilustruje zatvarač prema izvođenju prikazanom na slici 1;

[0039] Slika 3A je detaljan prikaz jednog kraja štapića;

[0040] Slika 3B je detaljan prikaz kraja štapića sa slike 3A, sa štapićem rotiranim za 90° oko dužinske ose;

[0041] Slika 4 je detaljan, fragmentiran prikaz koji ilustruje zatvarač pričvršćen za štapić; i

[0042] Slike 5A do 5D prikazuju različite primerne oblike koji mogu činiti upravni poprečni presek uređaja.

[0044] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0045] Predmetni pronalazak stoga pruža uređaj za krioprezervaciju u zatvorenom sistemu kako je navedeno u zahtevu 1, gde su poželjna izvođenja navedena u zavisnim zahtevima. Različita izvođenja uređaja za skladištenje krioprezerviranog uzorka u zatvorenom sistemu opisana su u nastavku, a njihove prednosti se najbolje razumeju pozivanjem na slike 1 do 5D nacrta. Elementi sa slika nisu nužno u razmeri, već je naglasak stavljen na jasno ilustrovanje novih karakteristika i principa rada. Kroz slike se koriste slične pozivne oznake za označavanje sličnih i odgovarajućih elemenata na različitim slikama.

[0047] Štaviše, pozivanje u specifikaciji na „izvođenje“, „jedno izvođenje“, „različita izvođenja“ ili bilo koju njihovu varijantu znači da je određena karakteristika ili aspekt opisan u vezi sa određenim izvođenjem sadržan u najmanje jednom izvođenju. Zbog toga pojavljivanje fraza „prema jednom izvođenju“, „prema drugom izvođenju“ ili njihovih varijacija na različitim mestima u specifikaciji se ne odnosi nužno na njegovo respektivno izvođenje.

[0049] Pozivajući se na slike 1, 2A i 2B, uređaj 100 za krioprezervaciju u zatvorenom sistemu sadrži izduženi štapić 101 i zatvarač 102. Štapić sadrži telo 108 koje je uopšteno uniformnog poprečnog preseka sa naglim prelazom u prošireni deo 103 u obliku zarubljenog konusa negde otprilike na sredini dužine štapića 101. Rame 115 sa uopšteno ravnom površinom orijentisanom ugrubo upravno na dužu osu štapića 101 formirano je na prelazu iz tela 108 u proširenje 103. Vrh 104 za sakupljanje uzorka se pruža od užeg kraja proširenja 103. Zatvarač 102 sadrži otvoreni kraj 116 sa uopšteno ravnom površinom u kojoj je formiran kružni otvor 117. Otvor 117 je u komunikaciji sa izduženom šupljom komorom 105 formiranom duž duže ose zatvarača 102 i dimenzionisanom tako da primi vrh 104 i proširenje 103. Zatvarač 102 poželjno ima isti oblik poprečnog preseka kao i štapić 101, npr. šestougaoni (slika 5A), trougaoni (slika 5B), kvadratni (slika 5C), kružni (slika 5D) ili slično i poprečni presek mu je približno jednakih dimenzija. Pored toga, opciona, povoljna strukturna karakteristika je obodni žljeb 118a, b respektivno izveden u blizini krajeva štapića 101 i zatvarača 102 pomoću kojeg se uređaj 100 može stegnuti pincetom, što olakšava držanje uređaja 100.

[0051] [0016] Kada se uzorak (oocit ili embrion) vitrifikuje, on se sakuplja i obrađuje prema, na primer, gore opisanom protokolu, a zatim se postavlja na vrh 104 za sakupljanje uzorka. Vrh 104 se zatim ubacuje u izduženu komoru 105 kroz otvor 117 i zatvarač 102 se pritiskom postavlja na mesto, dok se ravna površina otvorenog kraja 116 ne nasloni na ravnu površinu ramena 115. U skladu sa tim se podrazumeva da jedna ravna površina treba da bude suštinski paralelna sa suprotnom ravnom površinom.

[0053] Slike 3A i 3B su detaljni prikazi dela štapića 101 sa proširenjem 103 i vrhom 104, jedan rotiran za 90° u odnosu na drugi. Proširenje 103 poseduje prvi spoljašnji prečnik 106 (UP) u osnovi zarubljenog dela neposredno do ramena 115 i drugi spoljašnji prečnik 107 na daljem kraju proširenja 103.

[0055] Pozivajući se sada na sliku 4, zatvarač 102 je prikazan kako naleže na rame 115 štapića 101 tako da su vrh 104 i proširenje 103 smešteni unutar šuplje komore 105. Naglašava se da su proporcije koje su ilustrovane na ovom prikazu preuveličane i da nisu u razmeri kako bi se jasno pokazale dimenzione karakteristike zatvarača 102 i proširenja 103 kao i međusobno spajanje dva dela. U skladu sa tim proporcije ili dimenzije koje mogu biti predložene na slici 4 ne treba tumačiti kao ograničavajuće po pitanju bilo koje dimenzije na neku određenu vrednost, izuzev ukoliko u tekstu nije izričito tako definisano.

[0057] Kao što je prikazano, proširenje 103 ima prvi spoljašnji prečnik 106 koji je veći od drugog spoljašnjeg prečnika 107, pri čemu se prečnik proširenja sužava od prvog spoljašnjeg prečnika 106 do drugog spoljašnjeg prečnika 107 pod uglom 114A. Šuplja komora 105 sadrži prvi deo formiran od otvorenog kraja 116 zatvarača 102, koji je konfigurisan sa prvim unutrašnjim prečnikom 111 (UP) koji se nalazi na otvoru 117 i drugim unutrašnjim prečnikom 112, tako da je prvi unutrašnji prečnik 111 veći od drugog unutrašnjeg prečnika 112 smanjujući se pod uglom 1114B. Drugi deo komore 105 sadrži izduženi deo sa trećim unutrašnjim prečnikom 113 koji je dimenzionisan tako da primi vrh 104. Stoga unutrašnja površina prvog dela šuplje komore 105 formira prostor u obliku zarubljenog konusa.

[0059] [0020] Prema ovom izvođenju uglovi 114A i 114B su približno jednaki, poželjno unutar tolerancije od 0,1%. Stepen konusnosti treba da bude relativno mali, ne veći od oko 1,5°, a poželjno oko ,50°. Stoga je prvi unutrašnji prečnik 111 veći od prvog spoljašnjeg prečnika 106, a drugi unutrašnji prečnik 112 je veći od drugog spoljašnjeg prečnika 107, u oba slučaja za ne više od oko 0,1%. Shodno tome prostor u obliku zarubljenog konusa definisan unutrašnjom površinom šuplje komore 105 odgovara zapremini zarubljenog konusnog proširenja 103 tako da kada je zatvarač 102 postavljen na telo 108, vrh 104 za sakupljanje uzorka je zatvoren unutar drugog dela šuplje komore 105 i suštinski cela unutrašnja površina zarubljenog konusnog dela komore 105 je u kontaktu sa spoljašnjom površinom proširenja 103. Na ovaj način je šuplja komora 105 zaptivena od prodora LN<2>kada je zatvarač 102 pravilno postavljen bez potrebe za preduzimanjem dodatnog koraka termičkog zaptivanja uređaja.

[0061] Štaviše, nema potrebe ni za postojanjem zaptivke. Tipično, takve zaptivke su izrađene od fleksibilnog, elastičnog materijala koji je pogodan za upotrebu sa LN<2>, kao što je na primer silicijum. Međutim, silicijum poseduje koeficijent termičkog širenja koji je različit od koeficijenta krutog materijala koji se koristi za formiranje tela i zatvarača.

[0063] S druge strane, štapić 101 i zatvarač 102 su izrađeni od istog krutog materijala koji je pogodan za uranjanje u kriogene supstance, tako da oba dela ispoljavaju isti koeficijent termičkog širenja. Mogu se koristiti različiti polimeri: poliester (polietilen tereftalat, polibutilen tereftalat, na primer); poliolefin (polietilen, polietilen ultra-visoke molekularne težine, polipropilen, etilen-propilen kopolimer, etilen-vinil acetat kopolimer, na primer), stirenska smola ( polistiren, metakrilat-stiren kopolimer, metakrilat-butilen-stiren kopolimer, na primer); i poliamid (najlon 6, najlon 66, na primer). Poželjno je da i štapić 101 i zatvarač 102 budu izrađeni od polistirenskog kristala medicinskog kvaliteta. Dakle, zapremine oba dela se šire ili skupljaju u zavisnosti od temperature istom brzinom, osiguravajući da unutrašnja površina zarubljenog konusnog dela šuplje komore ostane u suštinski punom kontaktu sa spoljašnjom površinom proširenja 103, održavajući tako zaptivanje koje obezbeđuje zatvarač. Dakle, uređaj održava podjednako sigurno zaptivanje i na sobnoj temperaturi i na niskim kriogenim temperaturama, omogućavajući suštinski ravnomerno provođenje temperature kroz celu zapreminu uređaja.

[0065] Kao što je opisano iznad i prikazano na pripadajućim slikama, predmetni pronalazak obuhvata uređaj za krioprezervaciju u zatvorenom sistemu. Iako su opisani određeni primeri izvođenja, podrazumeva se da predmetni pronalazak nije isključivo ograničen na njih jer stručnjaci iz predmetne oblasti tehnike mogu napraviti modifikacije u okviru priloženih zahteva, posebno u svetlu gore navedenog opisa.

Claims (6)

1. PATENTNI ZAHTEVI

1. Uređaj (100) za krioprezervaciju u zatvorenom sistemu namenjen za vitrifikaciju bioloških uzoraka, gde navedeni uređaj (100) za krioprezervaciju sadrži:

izduženo telo (108) sa prvom dužom osom i upravnim oblikom poprečnog preseka;

proširenje (103) u obliku zarubljenog konusa sa spoljašnjom površinom koje se pruža od prvog kraja navedenog izduženog tela (108), pri čemu je na prelazu navedenog tela (108) u navedeno proširenje (103) formirano rame (115) sa prvom ravnom površinom orijentisanom upravno na navedenu prvu dužu osu;

vrh (104) za sakupljanje uzorka koji se pruža od navedenog proširenja (103); i

izduženi zatvarač (102) za zaptivno zatvaranje vrha (104) za sakupljanje uzorka, gde navedeni zatvarač (102) sadrži drugu dužu osu i upravni oblik poprečnog preseka, gde navedeni zatvarač (102) poseduje prvi kraj (116) sa drugom ravnom površinom orijentisanom upravno na navedenu drugu dužu osu, otvor (117) formiran u navedenoj drugoj ravnoj površini, gde je otvor (117) u komunikaciji sa izduženom šupljom komorom (105) koja se pruža duž navedene druge duže ose i ima dužinu koja je dovoljna da prihvati navedeni vrh (104) i navedeno proširenje (103), gde navedena šuplja komora (105) sadrži prvi deo i drugi deo, pri čemu je prvi deo formiran od prvog kraja (116) zatvarača (102) i konfigurisan sa prvim unutrašnjim prečnikom (111) koji se nalazi na otvoru (117) prvog kraja (116) i drugim unutrašnjim prečnikom (112) na suprotnom kraju prvog dela, gde je prvi unutrašnji prečnik (111) veći od drugog unutrašnjeg prečnika (112), gde navedeni drugi deo odgovara navedenom vrhu (104) za sakupljanje uzorka, gde drugi deo sadrži izduženi deo sa trećim unutrašnjim prečnikom (113) koji je dimenzionisan da prihvati navedeni vrh (104) za sakupljanje uzorka,

pri čemu navedena šuplja komora (105) sadrži unutrašnju površinu u obliku zarubljenog konusa u navedenom prvom delu koja formira prostor u vidu zarubljenog konusa sa zapreminom koja odgovara navedenom proširenju (103) u vidu zarubljenog konusa, tako da kada se navedeno proširenje (103) umetne u navedenu šuplju komoru (105), navedeno proširenje (103) ispunjava suštinski čitav prostor u vidu zarubljenog konusa navedenog prvog dela navedene šuplje komore (105) kada navedena druga ravna površina naleže uz navedenu prvu ravnu površinu i suštinski cela navedena unutrašnja površina je u kontaktu sa navedenom spoljašnjom površinom navedenog proširenja (103), pri čemu navedeno proširenje (103) u obliku zarubljenog konusa sadrži spoljašnji prečnik (106, 107) i navedeni prostor u vidu zarubljenog konusa sadrži unutrašnji prečnik (111, 112, 113), i pri čemu je u svim tačkama navedeni unutrašnji prečnik (111, 112, 113) veći od navedenog spoljašnjeg prečnika (106, 107) ali za ne više od oko 0,1%; pri čemu navedeni uređaj (100) sadrži suštinski uniforman koeficijent termičkog širenja;

pri čemu uređaj (100) dalje sadrži prvi ugao (114A) definisan smanjenjem prečnika (106, 107) navedenog zarubljenog konusnog proširenja (103) i drugi ugao (114B) definisan smanjenjem prečnika (111, 112, 113) navedenog zarubljenog konusnog prostora, pri čemu su navedeni prvi i drugi ugao (114A, 114B) suštinski jednaki, i pri čemu navedeni prvi i drugi ugao (114A, 114B) nisu veći od oko 1,5°.

2. Uređaj (100) za krioprezervaciju u zatvorenom sistemu prema zahtevu 1, koji dodatno sadrži najmanje jedan obodni žljeb (118a, 118b) formiran ili u navedenom telu (108) ili u navedenom zatvaraču (102).

3. Uređaj (100) za krioprezervaciju u zatvorenom sistemu prema zahtevu 1, pri čemu je oblik poprečnog preseka navedenog tela (108) jedan od kružnog, pravougaonog, trougaonog ili šestougaonog oblika.

4. Uređaj (100) za krioprezervaciju u zatvorenom sistemu prema zahtevu 1, pri čemu telo (108) i zatvarač (102) sadrže isti materijal.

5. Uređaj (100) za krioprezervaciju u zatvorenom sistemu prema zahtevu 4, pri čemu i štapić (101) koji sadrži izduženo telo (108), proširenje (103) u obliku zarubljenog konusa i vrh (104) za sakupljanje uzorka, i zatvarač (102) sadrže kristalni polistiren.

6. Uređaj (100) za krioprezervaciju u zatvorenom sistemu prema zahtevu 1, pri čemu su navedeni prvi i drugi ugao (114A, 114B) oko 0,5°.