RS52602B - Sredstva i postupci za upravljanje proteinskom interferencijom - Google Patents

Abstract

Molekul koji se ne nalazi u prirodi koji može da podreguliše funkciju nekog proteina, koji ima bar jedan β-agregirajući region koji je izložen okolini i izveden iz pomenutog proteina koji treba da bude podregulisan, pri čemu je navedeni β-agregirajući region fuzionisan s vrstom koja sprečava agregaciju navedenog β-agregirajućeg regiona, naznačen time što se koristi kao medikament, a pomenuti dobij eni molekul sadrži- deo A koji se sastoji od nekog regiona, kao stoje neki peptid, proteinska domena, protein ili agarozna čestica koji sprečava agregaciju dela B, i- deo B koji se sastoji od bar jednog β-agregirajućeg regiona i navedeni region je izveden iz pomenutog proteina koji treba da bude podregulisan.Prijava sadrži još 16 patentnih zahteva.

Description

SREDSTVA I POSTUPCI ZA

UPRAVLJANJE PROTEINSKOM

INTERFERENCIJOM

Oblast ovog pronalaska

Ovaj pronalazak pripada oblasti funkcionalnih proteomika te, konkretnije, oblasti proteinske agregacije. Pronalazak opisuje postupak interferencije s funkcijom ciljanog proteina i koristi veštački molekul koji je formisao korisnik. On je formisan kao interferor, specifičan je za ciljani protein i indukuje agregaciju nakon kontakta s pomenutim ciljanim proteinom. Ovaj pronalazak takođe opisuje takve interferorske molekule i njihovu upotrebu u terapeutskim aplikacijama.

Stanje tehnike ovog pronalaska

Biologija ulazi u uzbudljivo vreme što je posledica povećanog znanja o genomu. Kako sekvenciranje genoma i informacije o funkcionalnoj genomici proizvode sve više i više podataka, istraživači traže nove puteve da iz njih izvuku biološki važne informacije. Konkretno, funkcionalna genomika čini veliki napredak u dodeli biološkog značenja genomskim podacima. Informacija koja je kodirana u genomu uključuje gene, proteinske proizvode koji regulišu većinu funkcija u organizmu, te kontrolne elemente. Za proteine se smatralo da su najvažniji efektori u ćelijama, mada odnedavno se smatra da nekodirajuće RNK takođe imaju značajnu ulogu u regulacijskim procesima.

Nekoliko ključnih bioloških pitanja su u centru interesa da bi se nastavilo genomskim projektima i oni su relevantni za bilo koji ćelijski organizam, od bakterija do čoveka. Jedan izazov je da se razume kako geni koji su kodirani u genomu deluju i reaguju da bi se proizveo kompleksni živi sistem. Srodan izazov je da se odredi funkcija svih sekvencijskih elemenata u genomu. Alati funkcionalne genomike su omogućili nekoliko sistemskih pristupa koji su dali odgovore na nekoliko bazisnih pitanja za većinu gena u genomu, uključujući kada je izvršena ekspresija gena, gde je lokalizovan proizvod, s kojim drugim genskim proizvodima je u interakciji i kakav je fenotip rezultat ako gen mutira. Fenotipska analiza mutanata bila je moćan pristup da se odredi genska funkcija. Genska funkcija može da se promeni putem brisanja gena, insertirajućom mutagenezom i RNK interferencijom (RNKi). RNKi je relativno novi razvoj za redukciju genske ekspresije. On sledi izvešća o ućutkivanju gena kod biljaka i drugih modelnih organizama, te se bazira na opservaciji izC. elegansda dodavanje dvostruko uvijene RNK (dsRNK) ćelijama često interferira s genskom funkcijom na sekvencijski specifičan način. U mnogim slučajevima, nivo funkcionalne redukcije ne može da se adekvatno kontroliše, nekompletan je, nivo specifičnosti nije u celosti predvidiv te u nekim organizmima RNKi ne funkcioniše (npr. u gljivicamaCandida albicans).

Očigledno je daje funkcionalna genomika promenila način funkcionisanja biologije mada je ova oblast još uvek u začetku ako se gleda detaljizovanje kompleksnosti kojima su podvrgnuti biološki sistemi, kao što je kompleksna mreža genetske regulacije, proteinske interakcije i biohemijske reakcije koje sačinjavaju ćeliju. Jasno je da postoji potreba da se razviju inovativne tehnologije, posebno u oblasti funkcionalnih proteomika, da bi se ubrzali pronalasci i da se maksimizira potencijal kojega nude komplementarni postupci u funkcionalnoj genomici. Bilo bi poželjno da se poseduje fleksibilna tehnologija koja može direktno da cilja na biološku funkciju konkretnog ekstracelularnog ili intracelularnog proteina umesto da se cilja na mRNK koja ga prevodi ili manipuliše genom koji ga kodira.

Konverzija normalno rastvorljivih proteina u konformacijsko promenjene nerastvorljive proteine smatralo se da je kauzativni proces u različitim bolestima kao što je na primer pojava amiloidnog beta peptida u Alzheimerovoj bolesti i cerebralnoj amiloidnoj angiopatiji, alfa-sinuklein depoziti u Lewy-jevim telima Parkinsonove bolesti, prioni u Creutzfeldt-Jacobovoj bolesti, superoksid dismutaza u amiotrofnoj lateralnoj sklerozi te tau u neurofibrilarnim čvorićima u frontalnoj temporalnoj demenciji i Pickovoj bolesti. Dosad, agregacija proteina je bila uglavnom istraživana kao nepoželjni fenomen, koji izaziva bolest pa je široko prihvaćeno da se unaksna-beta upravljana agregacija najčešće javlja i daje to biološki relevantan mehanizam agregacije<2.>Unakrsna-beta agregacija je termin koji se koristi da bi se označilo daje nukleacija započeta putem formisanja intermolekularnih beta-listova u kojem svaki molekul u agregatu unosi identičnu nit koja se tipično sastoji od bar tri naporedne aminokiseline. Sada postoje bogati podaci koji pokazuju da su pojedine niti u interakciji formišući intermolekularni beta list i da ova struktura formiše kostur agregata<3>'<4>. Samoasocirajući regioni u ciljanim proteinima mogu da se odrede pomoću kompjuterskih programa, kao što je TANGO<6>, koji je razvijen za predviđanje agregacijske sklonosti peptida i proteina. Jedna specifična forma agregacije, konkretno visoko uređeno amiloidno vlakno, je već bila korišćena u tehnici za potencijalnu upotrebu u materijalnim naukama. Nadalje, patent WO03102187 (Scegen, Pty Ltd) opisuje postupak za pojačavanje aktivnosti molekula fuzionisanjem pomenutog molekula s membranskom translocirajućom sekvencom, pri čemu se nastali himerni molekul samougrađuje u agregat više molekulske težine. Američki patent br. 20050026165 (Arete Associates) opisuje upotrebu konformacionalnih peptida, koji mogu da budu u interakciji s beta-list konformacijom nerastvorljivih proteina kao što su prioni, kao dijagnostičko pomagalo za prionske bolesti.

Prethodna tehnika takođe opisuje antimorfne ili dominantne negativne mutacije proteina. Inhibicija proteinske funkcije pomoću takvih mutacija je takođe bila opisana za terapeutsku namenu. Američki patent br. 2003/0064384 sugeriše blokadu beta-kateninskog delovanja pomoću dominantnih negativnih mutanata ovog proteina koji mogu da se koristi za tretiranje karcinoma. Evropski patent br. 1325930 opisuje antagonizam prolaktinske akcije pomoću N-terminalnih mutanata prolaktinskog receptora, koji može da se koristi za tretiranje tumora. Sellman i saradnici opisuju tretiranje patogena pomoću dominantno-negativnih mutanata, tj. trovanje pomoću antraks toksina koje je izazvano pomoćuBacillus anthracis.Od četiri inhibitorska mutanta tri su tačkasti mutanti i jedan je brišući mutant (Sellman et al., Science 292: 695-697 (2001)).

Rezime ovog pronalaska

Ovaj pronalazak odnosi se na tehnologiju za kontrolisanu i inducirajuću proteinsku agregaciju specifično ciljanih proteina. Pronalazak takođe definišede novoformisane molekule, koje su ovde obeležene kao interferorske molekule, koje sadrže bar jedan agregacijski region iz kojeg se izvodi navedeni agregacijski region iz ciljanog proteina. U poželjnoj realizaciji interferorski molekul obuhvata bar jedan samoasocirajući region koji je fuzionisan za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona. Posle kontakta između odabranog ciljanog proteina i specifično formisanog interferorskog molekula, dolazi do specifične koagregacije između cilja i interferora te kao rezultat do funkcionalnog nokauta ili podregulacije biološke funkcije za pomenuti ciljani protein. Ovaj proteinski nokdaun je uslovni nakon pojave agregata, koji su indukovani pomoću prisutnosti interferorskog molekula. Dodatna prednost je u tome što jačina proteinske interferencije može eksperimentalno da se kontroliše variranjem broja agregacijskih regiona u interferorskom molekulu. Pronalazak ne predstavlja samo efikasni alat za podregulisanje biološke funkcije specifičnog ekstra- ili intracelularnog proteina već ima takođe značajnu terapeutsku, agrikulturnu i dijagnostičku primenu.

Opisislika

Slika 1: Proteinska interferencija uE. colikorišćenjem rekombinantne ekspresije 4 različita interferorska konstrukta koja pogađa specifične enzime koji su uključeni u aminokiselinskoj biosintezi. Deo B svakog interferorskog molekula sastoji se od tri veštačke samoasocirajuće sekvence, koje su odeljene pomoću spojnica dveju aminokiselina i jednog specifičnog samoasocirajućeg regiona koji je izveden iz enzima. Samoasocirajući regioni (veštački i specifični) vezani su za protein NusA koji služi kao vrsta da se spreči agregacija (drugim rečima, deo A interferorskog molekula) samoasocirajućeg regiona.

Slika 2:S. cerevisiaećelije s endogenom kopijom divljeg tipaURA3su transformisane s praznim plazmidom, plazmidom samo s agregatorskom sekvencom ili plazmidom s agregator-Ura3 fuzijskim konstruktom. Ćelije su rasle preko noći u medijumu koji sadrži glukozu, isprane i nanesene na ploču koja sadrži bilo glukozni (levo) ili galaktozni (desno) medijum. 5 ul 10-strukog razblaženja su nanesene na ploče (ODgoo^l kao najveća koncentracija).

Slika 3:C. albicansćelije s dve endogene kopije divljeg tipaTUPIsu transformisane s praznim plazmidom i plazmidom s interferor-Tupl fuzijskim konstruktom. Ćelije su rasle preko noći u medijumu koji sadrži glukozu, isprane su i zatim je 20 kolonija naneseno na ploču bilo na medijum koji sadrži glukozu (levo) ili kazaminsku kiselinu (desno). Gornji panel su one s praznim plazmidom, a donji panel s interferorskim konstruktom ("+ aggreg.-TUPl" znači interferor-TUPl konstrukt). Slike su snimljene posle 4 dana rasta.

Ciljevi i detaljni opis ovog pronalaska

U ovom pronalasku mi smo razvili proces za podregulisanje biološke funkcije nekog proteina korišćenjem interferorskog molekula koji je specifičan za ciljani protein. Posle kontakta s ciljanim proteinom dolazi do koagregacije između interferorskog molekula i mete. Agregacija izdvaja metu iz njene rastvorljive okoline i rezultat je funkcionalni nokaut ciljanog proteina.

Cilj ovog pronalaska je definisan u patentnim zahtevima.

Pronalazak definiše postupak za podregulisanje biološke funkcije nekog proteina pri Čemu ovaj postupak nije vršen u ljudi ili životinja, a uključuje kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi gde je uključen bar jedan samoasocirajući region koji je izolovan iz pomenutog proteina.

U drugoj realizaciji pronalazak definiše postupak za podregulisanje biološke funkcije nekog proteina što uključuje kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi koji se sastoji od bar jednog samoasocirajućeg regiona koji je izolovan iz pomenutog proteina.

Pronalazak takođe definiše postupak za podregulisanje biološke funkcije nekog proteina pri čemu ovaj postupak nije vršen u ljudi ili životinja, a uključuje kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi koji se sastoji od bar jednog samoasocirajućeg regiona koji je izolovan iz pomenutog proteina pri čemu se navedena samoasocirajuća domena fuzioniše za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona.

Pronalazak takođe definiše postupak za podregulisanje biološke funkcije nekog proteina pri čemu ovaj postupak nije vršen u ljudi ili životinja, a uključuje kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi koji se sastoji od bar jednog samoasocirajućeg regiona koji je izolovan iz pomenutog proteina pri čemu se navedena samoasocirajuća domena fuzioniše za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona.

Pronalazak takođe definiše postupak za podregulisanje biološke funkcije nekog proteina pri čemu ovaj postupak nije vršen u ljudi ili životinja, a uključuje kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A je neki peptid, ili neka proteinska domena ili neka agarozna čestica koja sprečava agregaciju dela B i deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koji se sastoji od bar tri naporedne aminokiseline i gde je navedeni region izolovan iz pomenutog proteina čiju

funkciju treba da podreguliše, te gde proizvoljno postoji neka spojnica između delova A i B.

Pronalazak takođe definiše postupak za podregulisanje biološke funkcije nekog proteina pri čemu ovaj postupak nije vršen u ljudi ili životinja, a uključuje kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A je neki peptid, ili neka proteinska domena ili neka agarozna čestica koja sprečava agregaciju dela B tako daje deo B u direktnom kontaktu s rastvaračem u kojemu se nalaze pomenuti molekul i pomenuti protein i deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region pri čemu se navedeni region sastoji od bar tri naporedne aminokiseline i gde je navedeni region izolovan iz pomenutog proteina čiju funkciju treba da podreguliše, te gde proizvoljno postoji neka spojnica između delova A i B.

U drugoj realizaciji deo B molekula koji ne može da se nađe u prirodi sadrži bar dva samoasocirajuća regiona pri čemu je bar jedan od navedenih regiona izveden iz pomenutog proteina s čijom funkcijom treba da interferira.

Termin "koji ne može da se nađe u prirodi" odnosi se na činjenicu daje takav interferorski molekul načinio čovek. Na primer, kada je neki interferorski molekul polipeptid (drugim rečima, i deo A i deo B su peptidi) takav polipeptid je formisan izolovanjem dela B iz ciljanog proteina (drugim rečima, samoasocirajućeg regiona) i vezanjem navedenog dela B za deo A koji može da se izvede (i) iz drugog proteina ili (ii) iz istog ciljanog proteina ali u tom slučaju navedeni deo A se ne nalazi u neposrednom susedstvu dela B. Drugim rečima, samoasocirajući region koji je izveden iz mete koja je fuzionisana za vrstu (kada je interferor neki polipeptid navedena vrsta je takođe neki polipeptid) koja sprečava agregaciju samoasocirajućeg regiona razlikuje se od prirodne fuzije između dela A i B s bar jednom prirodnom aminokiselinom. Tipično, takav interferorski molekul neće da postoji kao naporedni polipeptid u nekom proteinu koji je kodiran pomoću gena u nerekombinantnom genomu.

Treba da bude jasno da interferorske molekule mogu da budu dizajnirane na modularni način, uvođenjem ponavljanja i promenom redosleda delova A i B. Neograničavajući spisak kombinacija je kako sledi: interferor s A-B strukturom, interferor s B-A strukturom, interferor s A-B-A strukturom, interferor s B-A-B strukturom, interferor s A'-B-A" strukturom i interferor s B'-A-B" strukturom pri čemu je neka spojnica (spejser, razmaknica) proizvoljno smeštena između delova A, A', A" i B, B', B". A, A' i A" su različite ili slične vrste (npr. različite peptidne sekvence). B, B' i B" su različite ili slične samoasocirajuće sekvence (npr. Bje neka samoasocirajuća sekvenca izvedena iz ciljanog proteina i B' je neka veštačka samoasocirajuća sekvenca).

Drugim rečima, pronalazak definiše postupak za podregulisanje biološke funkcije nekog proteina pri čemu se ovaj postupak ne primenjuje na ljude ili životinje, a uključuje kontakt pomenutog proteina s molekulom koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koji je izolovan iz pomenutog proteina pri čemu je navedeni samoasocirajući region fuzionisan za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona tako daje pomenuti samoasocirajući region u direktnom kontaktu s rastvaračem u kojemu se nalaze pomenuti molekul i pomenuti protein. Iz gore navedenog treba da bude jasno daje navedena "vrsta" ekvivalentna terminu deo A i deo B je ekvivalentan s frazom "bar jedan samoasocirajući region".

Reči "podregulisanje biološke funkcije nekog proteina" znači daje normalna biološka aktivnost nekog proteina smanjena (inhibiran, podregulisan, smanjen ili prekinut su ovde ekvivalentne reči) ili daje taj protein izuzet iz njegove normalne biološke okoline (npr. neki protein koji se normalno nalazi u endoplazmatskom retikulumu kao rezultat podregulisanja njegove funkcije se tamo više ne nalazi). Tako, primenom ovog postupka ovog pronalaska funkcija nekog proteina je prekinuta putem agregacije pomenutog proteina kontaktom pomenutog proteina s veštačkim molekulom ovog pronalaska. Pomenuti veštački molekul je ovde obeležen kao "interferor" ili "interferorski molekul". Agregacija se odnosi na fakt da se neki protein koji je normalno rastvorljiv menja u nerastvorljivi protein ili agregirani protein u svojoj normalnoj biološkoj okolini putem direktnog kontakta ili vezanja s interferorom. Reči "podregulisanje funkcije nekog proteina" mogu takođe da se zamene rečima "nokautiranje funkcije nekog proteina" ili "negativna interferencija s funkcijom nekog proteina". Podregulisanje funkcije nekog proteina može takođe da znači da se neki protein više ne nalazi u rastvorljivoj formi u ćeliji ili da neki protein više nije u rastvorljivoj formi u svojoj normalnoj biološkoj okolini (npr. (sub)-celularna ili ekstra-celularna lokalizacija). Nadalje, to može takođe da znači da se agregirani protein razgrađuje putem mehanizma prirodnog klirensa ćelije i ne može više da se detektuje u rastvorljivoj ili nerastvorljivoj formi. Nadalje, to može takođe da znači da transmembranski receptorski protein više ne može da veže svoj normalni ligand putem interferorski izazvane agregacije navedenog transmembranskog proteina. Tako podregulisanje funkcije nekog proteina može takođe da znači da neki protein koji se normalno nalazi u npr. mitohondriju više tamo ne nalazi putem ovog postupka proteinske interferencije. U konkretnoj realizaciji "podregulisanje funkcije nekog proteina" ili "negativna interferencija s funkcijom nekog proteina" ili "nokautiranje funkcije nekog proteina" je bar 20%, bar 30%, bar 40%, bar 50%, bar 60%, bar 70%, bar 80%, bar 90%, bar 95% ili čak 100% gubitka funkcije upoređujući s normalnom (100%) funkcijom proteina.

Funkcija nekog proteina ili manjak prisutnosti nekog proteina u njegovoj normalnoj biološkoj okolini (lokalizacija) može zgodno da se odredi pomoću postupaka koji su poznati u tehnici. Na primer, ovisno o ciljanom proteinu od interesa, funkcija može da se odredi merenjem smanjene enzimske aktivnosti. Smanjena prisutnost nekog proteina u njegovoj normalnoj biološkoj lokalizaciji može na primer da se izmeri kao manjak formisanja kompleksa, manjak nalaza ciljanog proteina u subcelularnom odeljku, pojava ciljanog proteina u rastvorljivoj formi, pojava ciljanog proteina u agregiranoj (nerastvorljiva je ovde ekvivalentni termin) formi. Alternativno, efekt podregulisanja ciljanog proteina može da se izmeri celularnom analizom (npr. povećanje ili smanjenje rasta, smanjenje ili povećanje prodora, smanjenje ili povećanje proteolitičke aktivnosti).

U konkretnoj realizaciji takva normalna biološka aktivnost (ili normalna funkcija ili normalna lokalizacija) nekog proteina može da se poveže s intracelularnom ili ekstracelularnom. "Intracelularni" se odnosi na lokalizaciju nekog proteina unutar ćelije organizma ili domaćina (npr. citoplazma, mitohondriji, lisozom, vakuola, nukleus, hloroplast, endoplazmatski retikulum (ER), celularna membrana, mitohondrijska membrana, membrana hloroplasta,...). "Ekstracelularni" se ne odnosi samo na lokalizaciju nekog proteina u ekstracelularnom medijumu ćelije već se takođe odnosi na proteine koji su u kontaktu s ekstracelularnim medijumom kao što su membranski-vezani proteini, transmembranski protein itd. Neograničavajući primeri ekstracelularnih proteina su izlučeni proteini (npr. proteaze, antitela i citokini koji su prisutni u krvi ili plazmi) ili proteini koji se nalaze u ekstracelularnoj matrici (npr. matrične metaloproteaze i transmembranski proteini (npr. receptor faktora rasta)).

Ćelije ili domaćini koji mogu biti ciljani postupkom ovog pronalaska uključuju prokariotske i eukariotske ćelije. Neograničavajući primeri su virusi, bakterije, gljivice, gljive, protozoa, biljke i sisari uključujući čoveka.

Treba da bude jasno da ovaj postupak podregulisanja biološke funkcije nekog proteina može da se koristi da interferira s biološkom funkcijom s 1,2, 3, 4, 5 ili čak više proteina istovremeno. Konkretno, budući da deo B sadrži bar jedan samoasocirajući region, deo B može na primer da sadrži različite samoasocirajuće regione pri čemu je svaka specifičan za različiti protein. Interferor koji se koristi za interferenciju s biološkom funkcijom bar jednog ciljanog proteina normalno ne može da se nađe u prirodi i može da se dobije hemijskom sintezom ili putem rekombinantne proteinske ekspresije ili kombinacijom navedenog.

Takav interferorski molekul sadrži bar jedan samoasocirajući region (takav deo B sadrži bar jedan samoasocirajući region). "Samoasocirajući region" je ovde definisan kao naporedna sekvenca aminokiselina koja ima jaku tendenciju da formiše čvrsti molekulski sklop s identičnim ili vrlo srodnim sekvencama. Reči "ima jaku tendenciju da formiše čvrsti molekulski sklop" može takođe da se izreče da "ima jaki afinitet". Afinitet se obično prevodi u vrednosti disocijacije (Kd-vrednosti). Kd-vrednosti između interferora i ciljanih proteina su tipično smeštene između mikromolarnog i nanomolarnog raspona, ali mogu da budu sub-nanomolarne ili supra-mikromolarne. Primeri samoasocirajućih regiona su intermolekulski beta površinski regioni, alfa-spiralni elementi, petlja šnalice za kosu, transmembranske sekvence i signalne sekvence. U konkretnoj realizaciji bar jedan samoasocirajući region se nalazi u delu B. U drugoj konkretnoj realizaciji bar dva samoasocirajuća regiona se nalaze u delu B. U drugoj konkretnoj realizaciji 3, 4, 5, 6 ili više samoasocirajućih regiona se nalazi u delu B. Navedeni samoasocirajući regioni mogu da se međusobno povežu regionalnom spojnicom (npr. razmaknica od oko 2 do oko 4 aminokiseline). Jedan (ili bar jedan) samoasocirajući region koji se nalazi u delu B izveden je iz ciljanog proteina. U konkretnoj realizaciji 2, 3,4, 5, 6 ili više samoasocirajućih regiona u delu B je izvedeno iz ciljanog proteina. U drugoj konkretnoj realizaciji 2,3,4, 5, 6 ili više samoasocirajućih regiona u delu Bje izvedeno iz više od jednog ciljanog proteina. U drugoj konkretnoj realizaciji bar dva samoasocirajuća regiona koji se nalaze u delu B su izvedeni iz istog ciljanog proteina. Ciljani protein je ovde definisan kao protein s kojim je nešto u interferenciji obzirom na njegovu funkciju. Tako, da bi se načinio deo B specifičan za bar jedan protein bar jedan samoasocirajući region u delu B trebalo bi da bude "izveden iz" ciljanog proteina ili bar jedan samoasocirajući region trebalo bi da bude prisutan u navedenom ciljanom proteinu. "Izveden iz" znači da bi bar jedan naporedni samoasocirajući region trebalo da bude identičan ili homologan u aminokiselinskoj sekvenci s naporednim regionom navedenog ciljanog proteina. U poželjnoj realizaciji, navedeni bar jedan samoasocirajući region je bar 60%, bar 65%, bar 70%, bar 75%, bar 80%, bar 85%, bar 90%, bar 95% ili bar 100% identičan samoasocirajućem regionu koji se nalazi u pomenutom ciljanom proteinskom regionu.

Poželjno je da se duljina samoasocirajućeg regiona sastoji od bar 3 naporedne aminokiseline. U poželjnoj realizaciji navedeni region sastoji se od oko 3 do oko 30 aminokiselina. U sledećoj poželjnoj realizaciji navedeni region sastoji se od oko 3 do oko 25 aminokiselina. U osobito poželjnoj realizaciji navedeni region sastoji se od oko 5 do oko 20 aminokiselina.

Samoasocirajući regioni koji se nalaze u delu B interferorskog molekula takođe mogu da se odrede i izoluju od onih proteina koji nisu ciljani protein i navedeni samoasocirajući regioni vežu se s bar jednim samoasocirajućim regionom koji je izveden iz ciljanog proteina, proizvoljno s razmaknicom (ili spojnicom) između navedenih samoasocirajućih regiona. Na primer, samoasocirajući regioni koji mogu da se koriste mogu da se izvedu iz samoasocirajućeg regiona proteina koji se normalno ne nalaze u domaćinu u kojem se vrši podregulisanje biološke funkcije ciljanog proteina (tako neki samoasocirajući regioni u delu B mogu da se uzmu iz nesrodnog organizma). Priroda samoasocirajućeg regiona određuje nivo inhibicije (drugim rečima, jačinu inhibicije) ciljanog proteina putem indukovane agregacije. Više od jednog samoasocirajućeg regiona može da se koristi iz ciljanog proteina u interferorskom molekulu ali takođe mogu da se koriste veštački samoasocirajući regioni ili samoasocirajući regioni koji su izvedeni iz različitog ciljanog proteina u kombinaciji s jednim ili više samoasocirajućih regiona iz ciljanog proteina.

U konkretnoj realizaciji, takvi samoasocirajući regioni sastoje se od neke veštačke sekvence koja nije izvedena iz postojećih proteina i prema tome ne može da se nađe u prirodi. Primeri takvih veštačkih samoasocirajućih regiona su opisani u: Lopez de la Paz M. et al (2002) PNAS 99,25, str. 16053, tabela 1.

Ako bar jedan samoasocirajući region (drugim rečima, deo B interferorskog molekula) ima hidrofobni karakter (zbog osobina koje su povezane s agregacijom) ona je poželjno fuzionisana (ili vezana ili povezana, što su ekvivalentni termini) s vrstom (drugim rečima, delom A interferorskog molekula) koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona i izlaže navedeni samoasocirajući region u direktni kontakt s rastvaračem u kojem se nalazi interferor. Kao takav, u određenim realizacijama deo A ima rastvaračku funkciju da zadrži deo B rastvoru. U takvim realizacijama pomenuti deo A je na primer neki peptid, neka proteinska domena, neki protein (poželjno različit od ciljanog proteina, vidi primer 2), neka glikosilacijska struktura, neka (hidrofilna) hemijska grupa ili ciklodekstrin ili njegov derivat. U određenim drugim realizacijama, pomenuti deo A je neka agarozna čestica, lateks čestica, celulozna čestica, magnetska čestica, kvarcna čestica, poliakrilamidna čestica, mikrosfera, staklena čestica ili bilo koji čvrsti nosač (npr. polistiren, plastika, nitrocelulozna membrana, staklo).

U interferorskim molekulima deo B i deo A mogu da budu proizvoljno vezani (ili povezani) pomoću spojničkog regiona (razmaknica je ekvivalentni termin). Navedeni spojnički region može na primer da bude veštačka spojnica koja je načinjena hemijskom sintezom (npr. neka elastična spojnica kao što je neki hidroksi-supstituisani alkanski lanac, dekstran, polietilen glikol ili spojnica može takođe da se sastoji od aminokiselinskih homologa) ili navedena spojnica može da bude od prirodnih aminokiselina kao što je neki poli(treonin) ili poli(serin). Preferentno, kada spojnica sadrži aminokiseline, dužina navedenog spojničkog regiona je između 3 pa do 15 aminokiselina, poželjnije između 5 do oko 10 aminokiselina. Često može da se izabere elastična spojnica ali je predviđeno da čvrsta spojnica može takođe da funkcioniše. Elastične spojničke sekvence mogu da se nađu u prirodi, a većina takvih regiona povezuje domene u prirodnim proteinima, kao što je spojnica između SH2 i SH3 domena src tirozin kinaze ili spojnica između BRCT domena u BRCA1.

Termin "kontakt(iranje)" se odnosi na proces u kojem su interferor i ciljani protein u interakciji. U jednoj formi interferor se dodaje (npr. interferor se nalazi u određenoj koncentraciji u rastvoru) uzorku koji sadrži ciljani protein. U drugoj formi interferorski molekul se ušpricava u organizam koji sadrži ciljani protein. Kontakt može na primer takođe da se realizuje kroz proces transformacije neke ćelije koja sadrži ciljani protein, npr. neka izolovana ćelija, npr. u kulturi ćelija, neki jednoćelijski mikroorganizam ili neka ćelija ili više ćelija unutar multicelularnog organizma. Transformacija podrazumeva da se interferorski molekul unosi u domaćina (npr. neka ćelija) putem opštepoznatih postupaka transfekcije ili transformacije (npr. pomoću tehnika genskog prenosa uključujući kalcijum fosfat, DEAE-dekstran, elektroporacija, mikroinjekcija, virusni postupak, korišćenje kationskih liposoma (vidi na primer Feigner, P. L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 7413), komercijalno raspoloživih kationskih lipidnih formulacija npr. Tfx 50 (Promega) ili Lipofectamin2000 (Life Technologies), bombardovanje česticama, etc). Interferorski molekul može da bude kodiran pomoću nekog rekombinantnog vektora (npr. plazmid, kozmid, virusni vektor) i može da bude sintetizovan unutar domaćina. U alternativnoj realizaciji interferorski molekul može da se unese u ćeliju putem nosač-upravljanog unosa, npr. pomoću liposomnih nosača ili nano-čestica ili pomoću injekcije. U sledećoj alternativnoj realizaciji interferorski molekul može da uđe u ćeliju pomoću sekvence koja upravlja prodiranjem u ćeliju (ili translokacijom ćelije). U ovom potonjem slučaju interferorski molekul se dalje modifikuje putem rekombinantnog ili veštačkog dodavanja nekoj ćeliji penetracijske sekvence. Tako, interferorski molekul (npr. kao što je neki polipeptid) može da bude nadalje fuzionisan ili hemijski vezan za sekvencu koja olakšava transdukciju fuzijskih ili hemijski vezanih proteina u prokariotske ili eukariotske ćelije. Sekvence koje olakšavaju proteinsku transdukciju su poznate licima koje imaju iskustva u ovoj tehnici te uključuju, ali nisu ograničeni na proteinske transdukcijske domene. Poželjno, pomenuta sekvenca je odabrana iz grupe koju sačinjavaju HIV TAT protein, neka poliargininska sekvenca, penetratinte pep-1. Drugi standardno korišćeni ćelijsko-permeabilni peptidi (i prirodni i veštački peptidi) su opisani u: Joliot A. i Prochiantz A. (2004) Nature Cell Bio. 6 (3) 189-193.

U konkretnoj realizaciji interferor se suštinski sastoji od aminokiselina. U nekim realizacijama sekvence delova A i B iz interferorskog molekula su izvedene iz istog ciljanog proteina. U drugim realizacijama interferor je himerni molekul što znači da su sekvence iz delova A i B izvedene iz različitih proteina, npr. deo A je izveden iz jednog proteina i bar jedan agregacijski region dela Bje izveden iz ciljanog proteina. Pojam "polipeptid" odnosi se na neki polimer u kojem su monomeri aminokiseline i oni su povezani međusobno amidnim vezama, alternativno kao neki peptid. Kada su aminokiseline alfa aminokiseline, može da se koristi bilo L-optički izomer ili D-optički izomer. Zatim, veštačke aminokiseline, na primer, beta-alanin, fenilglicin i homoarginin su takođe uključeni. Standardno korišćene aminokiseline koje nisu gen-kodirane mogu takođe da se koriste u ovom pronalasku. Sve aminokiseline ili jedan njihov deo koji je korišten u interferorima može da bude bilo D- ili L-izomer. Nadalje, drugi peptidomimetici su takođe korisni u ovom pronalasku. Mi se specifično pozivamo na reviju i ovde je uključujemo kao referencu, koja prikazuje razvoj i upotrebu peptidomimetika kao antagonista za protein-protein interakcije iz: Sillerud LO i Larson RS (2005) Curr Protein Pept Sci. 6(2):151-69. Štaviše; D-aminokiseline mogu da se dodaju peptidnoj sekvenci da se stabilizuju karakteristike promena (posebno u slučaju glicina). U drugom pristupu alfa, beta, gama ili delta mimici (kao što su alfa, beta, gama ili delta di-peptidi) mogu da se koriste da oponašaju strukturne motive i karakteristike promena u neki peptid te istovremeno omoguće stabilnost prema proteolizi i poboljšaju druge osobine kao što je, na primer, konformacijska stabilnost i rastvorljivost.

Izolovan je samoasociiacijskog regiona od ciljanog proteina:

Samoasocirajuće sekvence su često hidrofobne ali to nije uvek slučaj. Na primer, samoasocirajući regioni priona gljivica su prilično polarni. Ustvari, unakrsna-beta agregacija aminokiselinskeg regiona koji je izveden iz nekog peptida ili proteina može da se pokrene kada (1) ima veliku hidrofobnost, (2) ima dobru sklonost prema beta-listu, (3) ima maleni neto naboj i (4) izložena je rastvaraču. Tako, samoasocirajući proteinski regioni ("segment" je ekvivalentni termin za "region") su najčešće zaštićeni u presavijenom stanju i nisu izloženi rastvaraču. Ovo poslednje je potvrđeno eksperimentalnim nalazom da u mnogim globularnim proteinima, agregacija se dešava tokom ponovnog presavijanja ili u uslovima u kojima su denaturisana ili delimično presavijena stanja značajno povišena, tj. pri visokoj koncentraciji ili kao rezultat destabilizirajućih uslova ili mutacija.

Bazirano na ovim nalazima, razvijeni su kompjuterski algoritmi koji mogu da predvide samoasocirajuće regione ("p-agregirajući delovi ili segmenti" je ekvivalentna formulacija) u proteinima. Jedan takav algoritam, TANGO, bazira se na algoritmu iz statističke mehanike i on razmatra tri hemijsko-fizička parametra koji su gore opisani ali takođe razmatra kompeticiju između različitih strukturnih konformacija: beta-petlja, alfa-spirala, beta-list agregati i presavijeno stanje (Fernandez-Escamilla, AM et al (2004) Nat. Biotechnol. 22, 1302-1306, posebno sekcija o ovim postupcima na str. 1305 i 1306, stoje ovde specifično obuhvaćeno kao referenca i takođe dodatne napomene 1 i 2 u istom članku za daljnje detalje o ovom postupku i setovima podataka koji se koriste za baždarenje i testiranje TANGO algoritma). Tako, samoasocirajući regioni koji se nalaze u ciljanim proteinima dobijeni su kompjuterskim algoritmima kao što je TANGO. Samoasocirajući regioni su često zaštićeni unutar jezgre ciljanih proteina 10, efektivno štiteći peptid od intermolekulskih asocijacija pomoću energijske barijere što odgovara stabilnosti ciljanih proteina1'. U normalnoj okolini (npr. citoplazma, ekstracelularna matrica) ciljani protein ima pomoć molekulskih pratilja koje pomažu proteinu da zadrži svoju funkcionalnu, monomernu formu I2. Ovaj model koji je korišćen u TANGO algoritmu6 formisan je da predvidi beta-agregaciju u peptidima i proteinima i sastoji se od faznog prostora koji obuhvata slučajno odabrani kalem i nativne konformacije kao i druga glavna konformacijska stanja, dakle beta-petlja, alfa-spirala i beta-agregat. Svaki segment nekog peptida može da se nađe u svakom od ovih stanja u skladu s Boltzmannovom raspodelom. Prema tome, da bi se mogli predvideti samoasocirajući regioni nekog peptida, TANGO jednostavno izračunava particijsku funkciju faznog prostora. Da bi mogla da se proceni sklonost agregaciji za konkretnu aminokiselinsku sekvencu, učinjene su sledeće pretpostavke: (i) u uređenom beta-list agregatu, glavna sekundarna struktura je beta-nit. (ii) regioni koji su uključeni u agregacijski proces su u potpunosti sačuvani, po cenu svih dobitaka i gubitaka na račun solvatacije, pune entropije i optimizovanja potencijala njihovih H-veza (dakle, broj H-veza koji je nastao u agregatu povezan je s brojem donorskih grupa koje su kompenzovane pomoću akceptora. Suvišak donora ili akceptora ostaje nezadovoljen). (iii) komplementarni naboji u odabranom prozoru uspostavljaju povoljne elektrostatske interakcije, te ukupni neto naboj peptida unutar ali takođe i izvan prozora obezvređuje agregaciju. TANGO može da se nađe na internetskoj mreži na adresi hftp:// tango. embI. de/. Zigregatorski algoritam je drugi primer (Pawar AP et al (2005) J. Mol. Biol. 350, 379-392). Ovi algoritmi identifikuju verovatne agregacijske sekvence upoređivanjem skora agregacijske sklonosti za danu aminokiselinsku sekvencu s prosečnom sklonošću koja je izračunata iz seta sekvenci slične duljine.

U ovom pronalasku mi procenjujemo da neki samoasocirajući region koja je identifikovan unutar ciljanog proteina s TANGO skorom od 5% odgovara riziku agregacijein vitrood 95%<6>. Izračunali smo da 85% proteina iz humanog proteoma koji nisu povezani s bolešću imaju bar jedan region s TANGO skorom koja je iznad eksperimentalno određenog praga od 5%. Ovo pokazuje da mada više od 85% humanih proteina sadrži bar jedan jedini samoasocirajući region te je agregacija sprečena zbog normalne stabilnosti proteina i pomoći iz pratećeg ešalona. Ovaj pronalazak izoluje ove samoasocirajuće regione iz ciljanih proteina za priređivanje interferorskih molekula koji se koriste za specifično indukovanje proteinske agregacije. B-deo interferorskih molekula sadrži bar jedan agregacijski region i bar jedan agregacijski region koji je izvedena iz ciljanog proteina. Moguće je da se kontroliše jačina proteinske interferencije (jačina proteinske interferencije je na primer % gubitka biološke funkcije ciljanog proteina kada su pomenuti protein ili ćelija koja sadrži pomenuti protein u kontaktu sa specifičnim interferorskim molekulom) putem ugrađivanja više od jednog agregacijskog regiona ciljanog proteina u B-delu interferorskog molekula. Stvarno, agregacijski regioni koji su izvedeni iz ciljanog proteina s malenim TANGO skorom (tipično između 5 % do oko 20%) mogu da se ponove u B-delu interferora za 2, 3, 4 ili više agregacijskih regiona. Kao alternativna realizacija 1, 2 ili 3 ili 4 ili više različitih agregacijskih regiona s malenim TANGO skorom koji su izvedeni iz istog proteina mogu da se ugrade u B-deo interferora. Kao druga alternativna realizacija 1, 2, 3, 4 ili više veštačkih agregacijskih regiona (koje nisu izvedeni iz ciljanog proteina) mogu da se kombinuju s 1, 2, 3,4 ili više agregacijskih regiona koji su izvedeni iz ciljanog proteina u B-delu da se pojača podregulisanje ciljanog proteina s malenim TANGO skorom.

Pronalazak definiše molekule koji ne mogu da se nađu u prirodi i koji mogu da agregiraju ciljani protein. U konkretnoj realizaciji, navedeni veštački molekuli su proteinaste prirode. Proteinaste znači da molekul sadrži L-aminokiseline ili D-aminokiseline ili smešu L- i D-aminokiselina ili kombinaciju prirodnih aminokiselina i peptidomimetika.

Pronalazak definiše molekule koji ne mogu da se nađu u prirodi i sadrže bar jedan samoasocirajući region koji je izolovan iz neke proteinske domene koja može da bude rastvorljiva u vodi pri čemu je pomenuti samoasocirajući region fuzionisan s vrstom koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona.

Pronalazak takođe definiše molekule koji ne mogu da se nađu u prirodi i sadrže bar jedan samoasocirajući region koji je izolovan iz neke proteinske domene koja može da bude rastvorljiva u vodi pri čemu je pomenuti samoasocirajući region fuzionisan s vrstom koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona tako daje pomenuti samoasocirajući region u direktnom kontaktu s rastvaračem u kojem se nalazi.

Pronalazak takođe definiše molekule koji ne mogu da se nađu u prirodi i sadrže bar jedan samoasocirajući region koja je izolovan iz neke proteinske domene koja može da bude rastvorljiva u vodi pri čemu je pomenuti samoasocirajući region fuzionisan s vrstom koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona .

Pronalazak takođe definiše molekule koji ne mogu da se nađu u prirodi i sadrže bar jedan samoasocirajući region koji je izolovan iz neke proteinske domene koja može da bude rastvorljiva u vodi pri čemu je pomenuti samoasocirajući region fuzionisan s vrstom koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona tako daje pomenuti samoasocirajući region u direktnom kontaktu s rastvaračem u kojem se nalazi.

U konkretnoj realizaciji takva vrsta je na primer neki peptid, neka agarozna čestica, neka proteinska domena ili neki protein. U drugoj konkretnoj realizaciji pomenuti veštački molekul sadrži bar dva samoasocirajuća regiona od kojih bar jedan samoasocirajući region je izveden iz ciljanog proteina.

Drugim rečima, pronalazak definiše molekul koji ne može da se nađe u prirodi, koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A sadrži neki region, kao što je neki peptid, proteinska domena, protein ili agarozna čestica koja sprečava agregaciju dela B, te deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region pri čemu se navedeni region sastoji od bar tri naporedne aminokiseline i gde je navedeni region izolovan iz pomenutog proteina s čijom funkcijom je u interferenciji, pri čemu neka spojnica proizvoljno može da bude između delova A i B.

Drugim rečima, pronalazak definiše molekul koji ne može da se nađe u prirodi koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A sadrži neki region, kao što je neki peptid, proteinska domena ili agarozna čestica koja sprečava agregaciju dela B, te deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koji se sastoji od bar tri naporedne aminokiseline i gde je bar jedan samoasocirajući region izolovan iz nekog proteina s čijom funkcijom je u interferenciji i gde je navedeni region izolovan iz neke domene iz pomenutog proteina koji može da bude rastvorljiv u vodi, pri čemu neka spojnica proizvoljno može da bude između delova A i B, te gde je deo B u direktnom kontaktu s okolinom u kojoj se nalaze pomenuti molekul i pomenuti protein.

Drugim rečima, pronalazak definiše molekule koje ne mogu da se nađu u prirodi koje sadrže deo A i deo B pri čemu deo i) A sadrži neki region, kao što je neki peptid, proteinska domena ili agarozna čestica koja sprečava agregaciju dela B, te deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koji se sastoji od bar tri naporedne aminokiseline i gde je naveden bar jedan samoasocirajući region izolovan iz nekog proteina s čijom funkcijom je u interferenciji i gde je navedeni region izveden iz neke domene iz pomenutog proteina koji može da bude rastvorljiv u vodi, pri čemu neka spojnica proizvoljno može da bude između delova A i B, a u delu B koji je u direktnom kontaktu s okolinom nalaze se pomenuti molekul i pomenuti protein.

Reči "izolovan iz domene iz pomenutog proteina koji može da bude rastvorljiv u vodi" znači daje samoasocirajući region kontinuirana aminokiselinska sekvenca koja je izolovana iz

rastvorljive domene nekog proteina. Ovo potonje takođe znači da su samoasocirajući regioni koji su izvedeni iz transmembranskih regiona ili samoasocirajući regioni izvedeni iz signalnih sekvenci specifično isključeni u dosegu patentnih zahteva proizvoda interferorskog molekula u takvim realizacijama.

U ovom pronalasku, bar jedna samoasocirajući region interferorskog molekula (drugim rečima, deo B interferorskog molekula) je "u direktnom kontaktu" s okolinom (npr. rastvarač, citosol) u kojoj se nalazi navedeni interferorski molekul. Dalje je objašnjeno zašto je to važno. U globularnim proteinima samoasocirajuće sekvence (takođe obeležene kao "agregacijski nukleacijski regioni") su generalno sačuvane u hidrofobnoj jezgi globularnog proteina i kao takve su zaštićene od rastvarača gustom mrežom kooperativnih interakcija koje stabilizuju nativno stanje. Dakle, u normalnim okolnostima nema "direktnog kontakta" između navedenog samoasocirajućeg regiona i okoline (na primer rastvarača). Samo onda kada je protein nepresavijen, na primer kada je sintetizovan na ribosomu ili destabilizovan mutacijom, promenom temperature, pH ili gubitkom specifične pratnje, dakle kada je favorizovano nepresavijeno stanje, on će izložiti svoje samoasocirajuće regione prema okolini. Samoasocirajući regioni su normalno sačuvani unutar proteina (da bi se sprečila agregacija) i u veštačkom interferorskom molekulu navedeni samoasocirajući regioni su bili izolovani i izloženi okolini vezanjem navedenih regiona za vrstu koja sprečava agregaciju (drugim rečima, deo A interferorskog molekula). Drugim rečima, veštački interferorski molekul se ne savija u globularnu strukturu i prema tome bar jedna samoasocirajući region (drugim rečima, deo B) u veštačkom interferorskom molekulu je u direktnom kontaktu s rastvaračem u kojem se nalazi navedeni interferorski molekul. Dakle, "u direktnom kontaktu" odnosi se na suprotno značenje od "sačuvan i zaštićen od".

U specifičnoj realizaciji interferorskog molekula koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koj i je izveden iz rastvorljive proteinske domene su polipeptidi.

U drugoj specifičnoj realizaciji pronalazak definiše rekombinantni vektor koji sadrži neki polinukleotid koji kodira takve interferorske molekule.

U drugoj specifičnoj realizaciji interferorske molekule ovog pronalaska koriste se kao medikament.

Terapeutske primene interferorskih molekula

Proteini su odgovorni za biološke aktivnosti u rasponu od brojnih enzimskih reakcija, preko transdukcije signala do strukturnih promena. Promene u proteinskoj strukturi, u količini ili aktivnosti je suštinski razlog mnogih bolesti. Mnogi lekovi delovi deluju putem specifične interferencije s jednim ili s ograničenim brojem proteina. Ovaj pronalazak definiše postupak da se razvije nova klasa jedinjenja koji mogu da budu u specifičnoj interakciji s odabranim ciljanim proteinom. Ova nova jedinjenja su obeležena kao interferori.

Tako, u sledećoj realizaciji ovaj pronalazak definiše upotrebu kao medikamenta molekula koji ne može da se nađe u prirodi koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koji je izveden iz neke proteinske domene koja može da bude rastvorljiva u vodi pri čemu je navedeni samoasocirajući region fuzionisan za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona.

U sledećoj realizaciji pronalazak definiše upotrebu kao medikamenta molekula koji ne može da se nađe u prirodi koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koji je izveden iz neke proteinske domene koja može da bude rastvorljiva u vodi pri čemu je navedeni samoasocirajući region fuzionisan za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona tako daje pomenuti samoasocirajući region u direktnom kontaktu s rastvaračem u kojem se nalazi pomenuta molekula.

Drugim rečima, pronalazak definiše upotrebu kao medikamenta interferorskog molekula koji ne može da se nađe u prirodi, koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A sadrži neki region, kao što je neki peptid ili proteinska domena koja sprečava agregaciju dela B, te deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region pri čemu navedeni region sadrži bar tri naporedne aminokiseline koje su izvedene iz ciljanog proteina i gde proizvoljno postoji neka spojnica između delova A i B.

Drugim rečima, pronalazak definiše upotrebu kao medikamenta veštačkog interferorskog molekula, koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A sadrži region, kao što je neki peptid ili proteinska domena koji sprečavaju agregaciju dela B, te deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region pri čemu navedeni region sadrži bar tri naporedne aminokiseline koje su izvedene iz ciljanog proteina i gde je neka spojnica proizvoljno prisutna između delova A i B i deo B je u direktnom kontaktu s rastvorom u kojem se nalazi navedeni interferorski molekul.

Navedene interferorske molekule mogu da se koriste za tretiranje bolesti i/ili u proizvodnji medikamenta za tretiranje bolesti, kao što je karcinom, koje su povezane s pogrešnom ekspresijom bar jednog proteina, kao što je neki onkogeni protein. Termin "pogrešna ekspresija" odnosi se na primer na (pre)ekspresiju nekog onkogenog proteina u slučaju karcinoma, a takođe obuhvata ekspresiju nekog dominantno negativnog proteina, nepoželjnu lokalizaciju određenog proteina ili splajs varijantu određenog proteina, nepoželjnu ekspresiju određene splajs varijante određenog proteina, veću aktivnost mutant proteina ili veću aktivnost određenog proteina.

U konkretnoj realizaciji, "pogrešna ekspresija" odnosi se na neželjenu prisutnost post-translacijski modifikovanog proteina ili na neželjenu prisutnost ne-post-translacijski modifikovanog proteina. Post-translacijske modifikacije menjaju fizičko-hemijske osobine modifikovanih aminokiselina, te kao takve one imaju potencijal menjanja sklonosti agregaciji danog polipeptidnog segmenta što može da se iskoristi da bi se specifično naciljala forma koja ima najveću sklonost agregaciji. Pa tako, ako neka post-translacijska modifikacija značajno smanjuje sklonost agregaciji samoasocirajućeg regiona, onda će interferencija da bude najefikasnija s nemodifikovanim proteinom. Nasuprot tome, u slučaju post-translacijskih modifikacija koje povećavaju sklonost agregaciji samoasocirajućeg regiona, onda će interferencija da bude najefikasnija s modifikovanim proteinom. Bazirano samo na hidrofobnosti, podrazumeva se da će modifikacije kao stoje fosforilacija i glikozilacija smanjiti sklonost agregaciji, dok će dodavanje lipida povećati tendenciju agregaciji.

Ciljani protein prema kojem je usmeren interferorski molekul ovog pronalaska može da bude povezan s patološkim stanjem. Na primer, protein može da bude neki patogen-srodni protein npr. virusni protein, neki tumor-srodni protein ili protein koji je povezan s autoimunom bolešću. U jednom aspektu, ovaj pronalazak formiše neki postupak za tretiranje subjekta koji ima rizik ili je zahvaćen nepoželjnom proliferacijom ćelija, npr. malignom ili nemalignom proliferacijom ćelija. Ovaj postupak uključuje: obezbeđivanje nekog interferorskog molekula, npr. nekog interferora koji ima strukturu koja je ovde opisana, pri čemu navedeni interferorski molekul može da bude u interferenciji s (inhibira funkciju) funkcijom i/ili prisutnoću nekog proteina koji pokreće nepoželjnu proliferaciju ćelija te primenu navedenog interferora subjektu, poželjno čoveku, te na taj način tretirajući subjekt.

U poželjnoj realizaciji, protein je faktor rasta ili receptor faktora rasta, neka kinaza (npr. neka proteinska tirozin, serin ili treonin kinaza), neki adaptorski protein, neki protein iz G protein vezane receptorske super-familije ili neki transkripcijski faktor. U poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s biološkom funkcijom PDGF-beta proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom PDGF-beta ekspresijom, npr. karcinomi testisa i pluća. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferor inhibira (nokautira) funkciju i/ili prisutnost Erb-B proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom Erb-B ekspresijom, npr. karcinom dojke. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferor inhibira funkciju (ili "interferira s funkcijom" što je ekvivalentno) (ili interferira s prisutnošću) Src proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom Src ekspresijom, npr. karcinomi debelog creva. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferor inhibira funkciju i/ili prisutnost CRK proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom CRK ekspresijom, npr. karcinomi debelog creva i pluća. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferor interferira s funkcijom i/ili prisutnošću GRB2 proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom GRB2 ekspresijom, npr. karcinom skvamoznih ćelija. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću RAS gena, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom RAS ekspresijom, npr. karcinomi gušterače, debelog creva i pluća, te hronična leukemija. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću MEKK proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom MEKK ekspresijom, npr. karcinom skvamoznih ćelija, melanom ili leukemija. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću JNK proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom JNK ekspresijom, npr. karcinomi gušterače ili dojke. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću RAF proteina i tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom RAP ekspresijom, npr. karcinom pluća ili leukemija. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću Erkl/2 proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom Erkl/2 ekspresijom, npr. karcinom pluća. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću PCNA (p21) proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom PCNA ekspresijom, npr. karcinom pluća. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću MYB proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom MYB ekspresijom, npr. karcinom debelog creva ili hronična mijeloična leukemija. U poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću c-MYC proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom c-MYC ekspresijom, npr. Burkittov limfom ili neuroblastom. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću JUN proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom JUN ekspresijom, npr. karcinomi jajnika, prostate ili dojke. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću FOS proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom FOS ekspresijom, npr. karcinom kože ili prostate. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul inhibira funkciju i/ili prisutnost BCL-2 proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom BCL-2 ekspresijom, npr. karcinomi pluća ili prostate ili ne-Hodgkin limfom. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću ciklin D proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom ciklin D ekspresijom, npr. karcinomi jednjaka i debelog creva. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću VEGF proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom VEGF ekspresijom, npr. karcinom jednjaka, debelog creva ili patološka angiogeneza. U poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću EGFR proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom EGFR ekspresijom, npr. karcinom dojke. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću ciklin A proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom ciklin A ekspresijom, npr. karcinom pluća ili grlića maternice. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću ciklin E proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom ciklin E ekspresijom, npr. karcinom pluća i dojke. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću WNT-1 proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom WNT-1 ekspresijom, npr. karcinom bazalnih ćelija. U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću beta-katenin proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom beta-katenin ekspresijom, npr. adenokarcinom ili hepatocelularni karcinom. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću c-MET proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom c-MET ekspresijom, npr. hepatocelularni karcinom. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću protein kinaza C (PKC) proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom PKC ekspresijom, npr. karcinom dojke. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću NFKapa-B proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom NFKapa-B ekspresijom, npr. karcinom dojke. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću STAT3 proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom STAT3 ekspresijom, npr. karcinom prostate. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću survivin proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom survivin ekspresijom, npr. karcinomi grlića maternice ili gušterače. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću Her2/Neu proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom Her2/Neu ekspresijom, npr. karcinom dojke. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću topoizomeraza I proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom topoizomeraza I ekspresijom, npr. karcinomi jajnika i debelog creva. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću topoizomeraza II alfa proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom topoizomeraza II ekspresijom, npr. karcinomi dojke i debelog creva.

U sledećem aspektu, pronalazak može da se koristi za tretiranje nekog subjekta, npr. čoveka, koji ima rizik da se razboli ili je zahvaćen bolešću ili poremećajem zbog čega je povoljna inhibicija angiogeneze, npr. karcinom. Ovaj postupak uključuje: obezbeđivanje nekog interferorskog molekula npr. nekog interferorskog molekula koji ima ovde opisanu strukturu, a taj interferorski molekul može da inhibira (ili interferira s njegovom funkcijom) neki protein koji upravlja angiogenezom te primenu interferorskog molekula subjektu, na taj način tretirajući subjekt. U poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću alfa v-integrin proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom alfa v-integrin ekspresijom, npr. tumori mozga ili tumori epitelnih organa. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću Flt-1 receptor proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenim Fit-I receptorima npr. karcinom i reumatoidni artritis. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom i/ili prisutnošću tubulin proteina, te tako može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji pati od poremećaja ili ima rizik za poremećaj koji je karakterizovan neželjenom tubulin ekspresijom, npr. karcinom i neovaskularizacija mrežnjače.

U sledećem aspektu, pronalazak može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji je inficiran virusom ili ima rizik da bude zahvaćen poremećajem ili bolešću koja je povezana s virusnom infekcijom. Ovaj postupak uključuje: obezbeđivanje interferorskog molekula, npr. nekog interferorskog molekula koji ima ovde opisanu strukturu, a navedeni interferorski molekul je homologan prema i može prigušiti virusni protein ili ćelijski protein koji upravlja virusnom funkcijom npr. ulazak ili rast; te primenu pomenutog interferorskog molekula nekom subjektu, poželjno humanom subjektu, tako tretirajući subjekt. Kao takav, pronalazak definiše postupak korišćenja interferora za proizvodnju medikamenta za tretiranje bolesnika koji su inficirani virusima uključujući humani papiloma virus, virus humane imunodeficijencije (HIV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis A virus (HAV), hepatitis C virus (HCV), respiratorni sinktijalni virus (RSV), herpes simpleks virus (HSV), citomegalovirus (CMV), Epstein Barr-virus (EBV), rinovirus, virus Zapadnog Nila, Tick-bome encefalitis virus, virus ospica (MV) ili poliovirus.

U sledećem aspektu, pronalazak može da se koristi za tretiranje nekog subjekta koji je inficiran patogenim organizmom, npr. bakterijom, amebom, parazitom ili gljivičnim patogenim organizmom. Ovaj postupak uključuje: obezbeđivanje interferorskog molekula, npr. nekog interferorskog molekula koji ima ovde opisanu strukturu, pri čemu navedeni interferorski molekul može da bude u interferenciji s funkcijom patogenog proteina koji je izveden iz navedenog patogena te primenu navedenog interferorskog molekula subjektu, poželjno čoveku, tako tretirajući subjekt. Ciljani protein iz patogenog može da bude onaj koji je uključen u rast, sintezu ćelijske membrane, sintezu proteina, transkripciju, energijski metabolizam (npr. Krebsov ciklus) ili proizvodnju toksina. Tako, ovaj pronalazak definiše postupak za tretiranje bolesnika koji je zaražen npr. s infektimaPlasmodium falciparum,

Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae,

Staphyloeoccus aureus, Streptococcns pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Chlamydia

pneumoniaeiliMycoplasma pneumoniae.

U sledećem aspektu, pronalazak može da se koristi za tretiranje nekog subjekta, npr. čoveka, koji ima rizik ili je zahvaćen bolešću ili poremećajem za koje je karakterističan nepoželjni imunološki odgovor, npr. nekom upalnom bolešću ili poremećajem ili nekom autoimunom bolešću ili poremećajem. Ovaj postupak uključuje: obezbeđivanje interferorskog molekula, npr. nekog interferorskog molekula koji ima ovde opisanu strukturu, a navedeni interferorski molekul može da inhibira (podreguliše) funkciju i/ili prisutnost nekog proteina koji upravlja nepoželjnim imunološkim odgovorom, te primenu navedenog interferorskog molekula subjektu, na taj način tretirajući subjekt. U poželjnoj realizaciji, bolest ili poremećaj je ishemija ili reperfuzijska ozleda, npr. reperfuzija ishemije ili ozleda povezana s akutnim infarktom miokarda, nestabilna angina, srčanoplućni bajpas, hirurška intervencija (npr. angioplastika, kao što je perkutana transluminalna koronarna angioplastika), odgovor na transplantirani organ ili tkivo (npr. transplantirano srčano ili vaskularno tkivo) ili tromboliza. U sledećoj poželjnoj realizaciji, bolest ili poremećaj je restenoza, npr. restenoza koja je povezana s hirurškom intervencijom (npr. angioplastika, kao što je perkutana transluminalna koronarna angioplastika). U sledećoj poželjnoj realizaciji, bolest ili poremećaj je upalna bolest stomaka, npr. Crohnova bolest ili ulcerativni kolitis. U sledećoj poželjnoj realizaciji, bolest ili poremećaj je upala povezana s infekcijom ili ozledom. U sledećoj poželjnoj realizaciji, bolest ili poremećaj je astma, lupus, multipla skleroza, dijabetes, npr. dijabetes tipa II, artritis, npr. reumatoidni ili psorijatični. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom integrina ili njegova koliganda, npr. VLA4, VCAM, ICAM. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom selektina ili njegova koliganda, npr. P-selektin, E-selektin (ELAM), L-selektin ili P-selektin glikoprotein-(PSGL1). U sledećoj poželjnoj realizaciji interferorski molekul interferira s funkcijom komponente komplementnog sistema, npr. C3, C5, C3aR, C5aR, C3 konvertaza, C5 konvertaza. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom njegova hemokina ili njegova receptora npr. TNF-a, IL-la, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-8; TNFRI, TNFRII, IgE, SCYA11 ili CCR3.

U sledećem aspektu, pronalazak može da se koristi za tretiranje nekog subjekta, npr. čoveka, koji ima rizik ili je zahvaćen akutnom ili hroničnom boli. Ovaj postupak uključuje: obezbeđivanje interferorskog molekula, npr. nekog interferorskog molekula koji ima ovde opisanu strukturu, a navedeni interferorski molekul može da interferira s nekim proteinom koji upravlja obradom boli te primenu navedenog interferorskog molekula nekom subjektu, na taj način tretirajući subjekt. U sledećoj poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom komponente jonskog kanala. U drugoj konkretno poželjnoj realizaciji, interferorski molekul interferira s funkcijom naurotransmiterskog receptora ili liganda.

U sledećem aspektu, pronalazak može da se koristi za tretiranje nekog subjekta npr. čoveka, koji ima rizik ili je zahvaćen neurološkom bolešću ili poremećajem. Ovaj postupak uključuje: obezbeđivanje interferorskog molekula, npr. nekog interferorskog molekula koji ima ovde opisanu strukturu, a navedeni interferorski molekul može da interferira s nekim proteinom koji upravlja neurološkom bolešću ili poremećajem te primenu navedenog interferorskog molekula nekom subjektu, na taj način tretirajući subjekt. U određenim realizacijama navedene bolesti (ili poremećaji) koji mogu da se tretiraju uključuju Alzheimerovu bolest (u ovom slučaju interferorski molekul interferira s funkcijom sekretaze što vodi do obrade APP npr. neki protein koji je uključen u kompleksu gama-sekretaze (npr. presenilin protein 1 ili 2, Aphl protein, nikastrin, BACE1 ili BACE2). Interferor inhibira obradu APP i sprečava nastajanje nerastvorljivog amiloida beta. Ista strategija može da se koristi da se spreče i/ili da se tretiraju druge neurodegenerativne bolesti kao što je Huntingtonova bolest, te spinocerebelarna ataksija (npr. SCA1, SCA2, SCA3 (Machado-Josephova bolest), SCA7 ili SCA8).

Tako u jednom aspektu, pronalazak definiše neki postupak za dobijanje ili proizvodnju medikamenta ili farmaceutske smeše koja sadrži bar jedan interferorski molekul i dalje mešanje navedenog interferorskog molekula s farmaceutski prihvatljivim nosačem. U poželjnoj realizaciji, interferorski molekul je neki polipeptid i može da se dobije sintetski ili kao neki rekombinantni protein. Rekombinantni protein može da bude proizveden korišćenjem rekombinantnih ekspresijskih sistema koji uključuju bakterijske ćelije, ćelije gljivica, životinjske ćelije, ćelije insekata, biljne ćelije ili transgene životinje ili biljke. Rekombinantni protein može da bude pročišćen bilo kojom standardnom procedurom za pročišćavanje proteina skoro do homogenosti i/ili da se pomeša s aditivima.

Primena farmaceutskih smeša koje sadrže interferorski molekul može da bude putem oralne, inhalirane, transdermalne ili parenteralne (uključujući intravensku, intratumorsku,

intraperitonealnu, intramuskularnu, intrakavitarnu, te supkutanu) primene. Aktivno jedinjenje može da se primeni samo ili poželjno formulisano kao farmaceutska smeša. Jedinična doza će normalno da sadrži 0.01 do 500 mg, na primer 0.01 do 50 mg, ili 0.01 do 10 mg, ili 0.05 do 2 mg jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Jedinične doze će normalno da se

primene jednom ili više puta dnevno, na primer 2, 3 ili 4 puta dnevno, uobičajeno 1 do 3 puta dnevno, tako daje ukupna dnevna doza normalno u opsegu od 0.0001 do 10 mg/kg; tako da je podesna dnevna doza za odraslo lice od 70 kg 0.01 do 700 mg, na primer 0.01 do 100 mg, ili 0.01 do 10 mg ili uobičajeno 0.05 do 10 mg.

Poželjno je da se jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol primenjuju u formi smeše za jedinično doziranje, kao što je jedinična doza za oralnu, parenteralnu, transdermalnu ili inhaliranu smešu. Takve smeše se priređuju mešanjem i podesno su prilagođene za oralnu, inahliranu, transdermalnu ili parenteralnu primenu, te kao takve mogu da budu u formi tableta, kapsula, oralnih tečnih preparata, prašaka, granula, lozenga, prašaka za rekonstituciju, rastvora za injekcije ili infuziju ili suspenzija ili supozitorija ili aerosoli. Tablete i kapsule za oralnu primenu se obično prezentovane u jediničnoj dozi, te sadrže konvencionalne ekscipijente kao što su agensi za vezivanje, punila, razblaživači, agensi za tabletiranje, lubrikanti, sredstva za razgradivanje, za poboljšanje boje ili okusa, te sredstva koja pospešuju vlažnost. Tablete mogu da budu s prevlakom prema dobro poznatim postupcima koji se primenjuju u tehnici. Podesna punila za upotrebu su celuloza, manitol, laktoza i drugi slični agensi. Podesna sredstva za razgrađivanje su škrob, polivinilpirolidon i škrobni derivati kao što je natrijum škrob glikolat. Podesni lubrikanti uključuju, na primer, magnezijum stearat. Podesni farmaceutski prihvatljivi agensi za poboljšanje vlažnosti uključuju natrijum lauril sulfat. Ove čvrste oralne smeše mogu da budu priređene konvencionalnim postupcima mešanja, punjenja, tabletiranja i slično. Ponovljene operacije mešanja mogu da se koriste da bi se raspodelio aktivni agens u onim smešama koje sadrže velike količine punila. Takve operacije su, naravno, konvencionalne u tehnici.

Oralni tečni preparati mogu da budu u formi, na primer, vodenih ili uljnih suspenzija, rastvora, emulzija, sirupa ili eliksira, ili mogu da budu prezentovani kao suvi proizvod za rekonstituciju s vodom ili drugim podesnim nosačem pre upotrebe. Takvi tečni preparati mogu da sadrže konvencionalne aditive kao što su agensi za suspendovanje, na primer sorbitol, sirup, metil celuloza, želatina, hidroksietilceluloza, karboksimetil celuloza, aluminijum stearat gel ili hidrogenirane jestive masti, agensi za stvaranje emulzije, na primer lecitin, sorbitan monooleat ili akacija; nevodeni nosači (koji mogu da uključuju jestive masti), na primer bademovo ulje, frakcionisano kokosovo ulje, uljaste estere kao što su esteri glicerina, propilen glikol ili etilni alkohol; prezervativi, na primer metil ili propil p-hidroksibenzoat ili sorbinska kiselina, te ako se želi konvencionalni agensi za poboljšanje okusa ili boje. Oralne formulacije takođe uključuju konvencionalne formulacije za produljeno otpuštanje, kao što su tablete ili granule s enteričkom prevlakom.

Poželjno, smeše za inhaliranje prezentovane su za primenu u respiratorni trakt kao materija za ušmrkavanje ili aerosol ili rastvor za nebulizator, ili kao mikrofini prašak za uduvavanje, bilo sam ili u kombinaciji s inertnim nosačem kao stoje laktoza. U takvom slučaju čestice aktivnog jedinjenja podesno imaju prečnik manji od 50 mikrona, poželjno manje od 10 mikrona, na primer između 1 i 5 mikrona, kao što je između 2 i 5 mikrona. Alternativno, mogu da se koriste prevučene nanočestice, s veličinom čestica između 30 i 500 nm. Poželjna udahnuta doza bit će u opsegu od 0.05 do 2 mg, na primer 0.05 do 0.5 mg, 0.1 do 1 mg ili 0.5 do 2 mg.

Za parenteralnu primenu, tečne forme jedinične doze su priređene i sadrže neko jedinjenje ovog pronalaska i sterilni nosač. Aktivno jedinjenje, ovisno o nosaču i koncentraciji, može da bude suspendovano ili rastvoreno. Parenteralni rastvori se normalno prirede rastvaranjem jedinjenja u nosaču te sterilišu filterski pre punjenja u flašice ili ampule i zatvaranja. Poželjno, adjuvanti kao što je neki lokalni anestetik, konzervansi i puferski agensi su takođe rastvoreni u nosaču. Da se pojača stabilnost, smeša može da bude zamrznuta nakon punjenja u fiašicu i voda može da bude uklonjena pod vakumom. Parenteralne suspenzije mogu da se prirede na suštinski jednak način sem što je jedinjenje suspendovano u nosaču umesto da bude rastvoreno i sterilizovano izlaganjem etilen oksidu pre suspendovanja u sterilnom nosaču. Poželjno, površinski aktivna materija ili agens za vlaženje može da se uključi u smešu da se olakša uniformna raspodela aktivnog jedinjenja. Kada je to podesno, može da se uključi malena količina bronhodilatatora, na primer simpatomimetičkih amina kao što je izoprenalin, izoetarin, salbutamol, fenilefrin i efedrin; ksantinski derivati kao što je teofilin i aminofilin te kortikosteroidi kao što je prednisolon i nadbubrežni stimulansi kao što je

ACTH.

Kao uobičajena praksa, smeše će obično da budu popraćene napisanim ili odštampanim uputama za primenu u određenom medicinskom tretmanu.

U poželjnoj realizaciji, interferorski molekul nadalje obuhvata neku proteinsku transdukcijsku domenu. Pokazalo se da serija malenih proteinskih domena, terminirane proteinske transdukcijske domene (PTD-ovi), prolaze kroz biološke membrane efikasno i neovisno od transportera ili specifičnih receptora, te pomažu unosu peptida i proteina u ćelije. Na primer, TAT protein iz humanog imunodeficijentnog virusa (HIV-1) može da unese biološki aktivne proteinein vivo.Slično, treća alfa-spiralaod Antennapediahomeodomene, te VP22 protein iz virusa herpes simpleks mogu da pospeše unos kovalentno vezanih peptida ili proteina u ćelije (revijski prikaz u: Ford KG et al (2001) Gene Ther. 8, 1-4). Proteinski unos koji se bazira na kratkom amfipatičkom peptidnom nosaču, pep-1, efikasan je za unos različitih peptida i proteina u nekoliko ćelijskih linija u potpuno biološki aktivnoj formi, bez potrebe za prethodno hemijski kovalentno vezanje (Morris MC et al, (2001) Nat. Biotechnol. 19, 1173-1176). Kapacitet VP22 himernih proteina da se šire iz primarno transduciranih ćelija u okolne ćelije može da poboljša gensku terapiju (Zender L et al (2002) Cancer Gene Ther. 9, 489-496). Sekvence koje olakšavaju proteinsku transdukciju poznate su onima koji se bave ovom tehnikom te obuhvataju, ali nisu ograničene na proteinske transdukcijske domene. Poželjno, pomenuta sekvenca je odabrana iz grupe koju sačinjavaju HIV TAT protein, neka poliargininska sekvenca, penetratin i pep-1. Neki drugi standardno korišćeni ćelijsko permeabilni peptidi (i prirodni i veštački peptidi) su opisani u: Joliot A. and Prochiantz A. (2004) Nature Cell Biol. 6 (3) 189-193.

Drugi aspekt farmaceutske smeše je upotreba nukleotidne sekvence koja kodira interferorske molekule. Ako se koristi interferorski molekul koji kodira sekvencu nukleinske kiseline, navedeni medikament je poželjno namenjen za unos navedene nukleinske kiseline u ćeliju, u nekom tretmanu genskom terapijom. Poznat je veliki broj postupaka za unos onima koji poznaju ovu tehniku. Poželjno, nukleinske kiseline primenjuju se zain vivoiliex vivogensku terapiju. Nevirusni vektorski sistemi za unos uključuju DNK plazmide, golu nukleinsku kiselinu, te nukleinsku kiselinu koja je kompleksirana s nosačem unosa kao stoje neki liposom. Virusni vektorski sistemi za unos uključuju DNK i RNK viruse, koji imaju bilo episomne ili integrisane genome nakon unosa u ćeliju. Postupci nevirusnog unosa nukleinskih kiselina uključuju lipofekciju, mikroinjekciju, biolistike, virosome, liposome, imunoliposome, polikaciju ili konjugate lipid:nukleinska kiselina, golu DNK, veštačke virione, te agent-pojačani aptejk DNK. Lipofekcija je opisana u, npr. američkom patentu br. 5,049,386, američkom patentu br. 4,946,787; te američkom patentu br. 4,897,355 te se lipofekcijski reagensi prodaju komercijalno (npr. Transfectam™ i Lipofectin™). Kationski i neutralni lipidi koji su podesni za efikasnu receptor-prepoznajuću lipofekciju polinukleotida uključuju one Flegner-a, patenti WO 91/17424, WO 91/16024. Unošenje može da bude u ćelije( ex vivoprimena) ili u ciljano tkivo( in vivoprimena). Priređivanje kompleksa lipid: nukleinska kiselina, uključujući ciljane liposome kao što su imunolipidni kompleksi, dobro je poznata onima koji imaju iskustva u ovoj oblasti tehnike (vidi, npr. Crvstal, 1995; Blaese et al., 1995; Behr, 1994; Remy et al., 1994; Gao i Huang, 1995; američki patenti br. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, te 4,946,787).

Upotreba virusnih sistema koji se baziraju na RNK ili DNK za unošenje nukleinskih kiselina pokazuje prednosti visoko razvijenih procesa za pogađanje virusa u specifičnoj ćeliji u telu i usmeravanje virusnog opterećenja prema nukleusu. Virusni vektori mogu da se primene direktno pacijentima( in vivo)ili mogu da se koriste za tretiranje ćelijein vitropa se modifikovane ćelije primenjuju pacijentima( ex vivo).Konvencionalni virusno bazirani sistemi za unošenje nukleinskih kiselina uključuju između ostalih retrovirusne, lentivirusne, adenovirusne, adeno-srodne i herpes simpleks virusne vektore za genski prenos. Virusni vektori su momentalno najefikasniji i najpogodniji postupak za genski prenos u ciljane ćelije i tkiva. Integracija u genom domaćina je moguća s retrovirusnim, lentivirusnim, te adeno-srodnim postupcima prenosa virusnog gena, što često rezultira dugotrajnom ekspresijom ubačenog transgena. Zatim, uočene su visoke transdukcijske efikasnosti za mnoge različite tipove ćelija i ciljanih tkiva. U slučajevima kada je poželjna prelazna ekspresija nukleinske kiseline, mogu da se koriste adenovirusno bazirani sistemi, uključujući replikacijski deficijentne adenovirusne vektore. Adenovirusno bazirani vektori mogu da poseduju vrlo visoku transdukcijsku efikasnost u mnogim tipovima ćelija i ne zahtevaju delenje ćelije. S takvim vektorima, dobijeni su visoki titri i visoki nivo ekspresije. Ovaj vektor može da se proizvede u velikim količinama u razmerno jednostavnom sistemu. Adeno-asocirani virusni ("AAV") vektori, uključujući rekombinantne adeno-asocirane virusne vektore, koriste se takođe da transduciraju ćelije s ciljanim nukleinskim kiselinama, npr. uin vitroprodukciji nukleinskih kiselina i peptida, te zain vivoiex vivoprocedure genske terapije (vidi, npr. američki patent br. 4,797,368; patent WO 93/24641; Kotin, 1994. Konstrukcija rekombinantnih AAV vektora opisana je u određenom broju publikacija, uključujući američki patent br. 5,173,414; Hermonat & Muzvczka, 1984; Samulskiet al,1989).

Genski terapijski vektori mogu da se unesuin vivoprimenom pojedinom pacijentu, tipično sistemskom primenom (npr. intravenska, intraperitonealna, intramuskularna, intratrahealna, subdermalna ili intrakranijalna infuzija) ili lokalnom primenom. U konkretnoj realizaciji, pronalazak takođe predviđa upotrebu hidrodinamičkog genskog terapeutskog postupka. Hidrodinamička genska terapija opisana je u američkom patentu br. 6627616 (Mirus Corporation, Madison) i zaključeno je da intravaskularno unošenje nevirusnih nukleinskih kiselina kodira interferor pri čemu se povećava permeabilnost suda putem npr. primene povećanog pritiska unutar navedenog suda ili putem ko-primene jedinjenja koja povećavaju permeabilnost suda kao što je npr. papaverin.

Alternativno, vektori mogu da se unesu ćelijamaex vivo,kao što su ćelije eksplantirane iz individualnog pacijenta (npr. limfociti, aspirati koštane srži, biopsija tkiva) ili univerzalnih donorskih hematopoetskih matičnih ćelija, nakon čega sledi reimplantacija ćelije into u bolesnika, obično posle odabiranja ćelije koja ima ugrađeni vektor.Ex vivoćelijska transfekcija za dijagnostiku, istraživanje ili za gensku terapiju (npr. putem ponovne infuzije transficiranih ćelija u organizam domaćin) je dobro poznata onima koji imaju iskustva u tehnici. U poželjnoj realizaciji, ćelije su izolovane sa subjektnog organizma, transficirane s nukleinskom kiselinom (gen ili cDNK), te ponovo unesene infuzijom u subjektni organizam (npr. bolesnik). Različiti tipovi ćelijskih tipova koji je podesan zaex vivotransfekciju su dobro poznati onima koji imaju iskustva u ovoj oblasti tehnike (vidi, npr. Freshnev et al., 1994 i reference koje su tamo citirane za diskusiju kako da se izoluju i uzgoje ćelije iz bolesnika).

U sledećoj realizaciji, ovaj postupak proteinske interferencije ovog pronalaska može da bude korišćena za određivanje funkcije nekog proteina u ćeliji ili organizmu koji može da upravlja proteinskom interferencijom. Ćelija može da bude neka prokariotska ćelija ili može da bude eukariotska ćelija ili to može da bude ćelijska linija, npr. biljnih ćelija ili životinjskih ćelija, kao što je ćelija sisara, npr. neka ćelija zametka, pluripotentna matična ćelija, tumorska ćelija, ćelija teratokarcinoma ili virus-inficirana ćelija. Organizam je poželjno neki eukariotski organizam, npr. neka biljka ili životinja, kao što je neki sisar, konkretno čovek.

Ciljani protein prema kojem se usmerava interferorski molekul ovog pronalaska može da bude povezan s patološkim stanjem. Na primer, protein može da bude neki patogeno-srodni protein, npr. neki virusni protein, neki tumor-srodni protein ili neki protein srodan s autoimunom bolešću. Ciljani protein može takođe da bude neki heterologni gen s ekspresijom u nekoj rekombinantnoj ćeliji ili genetički promenjenom organizmu. Inhibiranjem funkcije nekog takvog proteina mogu da se dobiju vredne informacije i terapijski doprinos na agrikultumom području ili području medicine ili veterinarske medicine. U osobito poželjnoj realizaciji postupka ovog pronalaska koristi se s nekom eukariotskom ćelijom ili nekim eukariotskim ne-humanim organizmom koji pokazuje specifični nokaut fenotip nekog ciljanog proteina koji sadrži neku bar delimično deficijentnu ekspresiju bar jednog endogenog ciljanog proteina pri čemu je navedena ćelija ili organizam u kontaktu s bar jednim interferorski m molekulom koji može da inhibira funkciju bar jednog endogenog ciljanog proteina ili s nekim vektorom koji kodira bar interferorski molekul koji može da interferira s funkcijom i/ili prisutnošću bar jednog endogenog proteina. Treba naglasiti da ovaj pronalazak takođe omogućuje ciljano specifični nokaut nekoliko različitih endogenih proteina zbog specifičnosti interferorskog molekula.

Protein-specifični nokaut fenotipovi ćelija ili ne-humanih organizama, konkretno ćelije čoveka ili ne-humanih sisara mogu da se koriste u analitičkim postupcima, npr. u funkcionalnoj i/ili fenotipskoj analizi kompleksa fizioloških procesa kao što je analiza proteoma. Na primer, mogu da se prirede nokaut fenotipovi humanih proteina u uzgojenim ćelijama za koje se podrazumeva da su regulatori alternativnih procesa srastanja. Među ovim proteinima, važni su članovi SR familije faktora srastanja, npr. ASF/SF2, SC35, SRp20, SRp40 ili SRp55. Nadalje, može da se analizuje efekt SR proteina na mRNK profil ili unapred određene alternativno spjene gene kao što je CD44.

Korištenjem proteinski baziranih nokaut tehnologija koje su ovde opisane, može da bude inhibirana ekspresija endogenog ciljanog proteina u ciljanoj ćeliji ili ciljanom organizmu. Endogeni protein može da bude komplementiran pomoću neke egzogene ciljane nukleinske kiseline koja je kodirana za ciljani protein ili varijantu ili imitiranu formu ciljanog proteina, npr. neki gen ili neku cDNK, koja može proizvoljno da se fuzioniše do daljnje sekvence nukleinske kiseline koja kodira detektibilni peptid ili polipeptid, npr. afinitetni tag, konkretno multipli afinitetni tag. Varijante ili mutirane forme ciljanog proteina razlikuju se od endogenog ciljanog proteina time što se razlikuju od endogenog proteina aminokiselinskim supstitucijama, ubačenim delovima i/ili obrisanim delovima u jednoj ili više aminokiselina. Varijante ili mutirane forme mogu da imaju istu biološku aktivnost kao endogeni ciljani protein. S druge strane, varijanta ili mutirani ciljani protein mogu takođe da poseduju neku biološku aktivnost, koja se razlikuje od biološke aktivnosti endogenog ciljanog proteina, npr. delimično uklonjenu aktivnost, potpuno uklonjenu aktivnost, pojačanu aktivnost itd. Komplementacija može da bude popraćena ko-ekspresijom polipeptida koji kodira egzogenu nukleinsku kiselinu, npr. nekog fuzijskog proteina koji sadrži ciljani protein i afinitetni tag te interferorski molekul za izbacivanje endogenog proteina u ciljanoj ćeliji. Ova ko-ekspresija može da se izvrši korišćenjem podesnog ekspresijskog vektora koji vrši ekspresiju i polipeptida koji je kodiran pomoću egzogene nukleinske kiseline, npr. tag-modifikovan ciljani protein i interferorske molekule ili korišćenjem neke kombinacije ekspresijskih vektora ili alternativno interferorski molekul može da bude u kontaktu s ciljanom ćelijom iz okoline ćelije. Proteini i proteinski kompleksi koji su sintetizovanide novou ciljanoj ćeliji će da sadrže egzogeni protein, npr. modifikovani fuzijski protein. Da bi se izbegla supresija funkcije egzogenog proteina s interferorskim molekulom, egzogeni protein mora da poseduje dovoljno aminokiselinskih razlika u agregacijskom regionu koji je odabran za dizajn interferorskog molekula. Alternativno, endogeni ciljani protein može da bude dopunjen odgovarajućim proteinima iz drugih specija, ili endogeni ciljani protein može da bude komplementiran pomoću splajs forme navedenog ciljanog proteina. Kombinacija nokauta nekog endogenog proteina i oporavljanja korišćenjem mutirane, npr. delimično brisane egzogene mete ima prednost upoređujući je s upotrebom nokaut ćelije. Nadalje, ovaj postupak je osobito podesan za identifikaciju funkcionalnih domena ciljanog proteina.

U sledećoj poželjnoj realizaciji izvršeno je upoređivanje, npr. genskih ekspresijskih profila i/ili proteoma i/ili fenotipskih karakteristika bar dviju ćelija ili organizama. Ovi organizmi su odabrani između: (i) neke kontrolne ćelije ili kontrolnog organizma bez inhibicije ciljanog proteina, (ii) neke ćelije ili organizma s inhibicijom ciljanog proteina i (iii) neke ćelije ili organizma s inhibicijom ciljanog proteina plus komplementacija ciljanog proteina pomoću neke egzogene ciljane nukleinske kiseline koja kodira navedeni ciljani protein.

Opisani postupci ovog pronalaska su takođe podesni u proceduri za identifikaciju i/ili karakterizaciju farmakoloških agensa, npr. identifikaciju novih farmakoloških agensa iz kolekcije ispitivanih supstanci i/ili karakterizaciju mehanizama delovanja i/ili nuspojava novih farmakoloških agensa. Tako, ovaj se pronalazak takođe odnosi na sistem za identifikaciju i/ili karakteriziranje farmakoloških agensa koji deluju na bar jedan ciljani protein, koji sadrži: (a) neku eukariotsku ćeliju ili eukariotski ne-humani organizam koji može da vrši ekspresiju bar jednog endogenog ciljanog gena koji je kodiran za navedeni ciljani protein, (b) bar jedan interferorski molekul koji može da vrši inhibiciju ekspresije navedenog bar jednog endogenog ciljanog gena, te (c) neku testnu supstancu ili kolekciju testnih supstanci pri čemu treba da se identifikuju i/ili karakteriziraju farmakološke osobine navedene testne supstance ili navedene kolekcije. Nadalje, sistem koji je gore opisan poželjno sadrži: (đ) bar jednu egzogenu ciljanu nukleinsku kiselinu koja je kodirana za ciljani protein ili varijantu ili mutiranu formu ili splajs formu ciljanog proteina pri čemu se navedeni egzogeni ciljani protein razlikuje od endogenog ciljanog proteina na aminokiselinskom nivou agregacijskih regiona tako daje funkcija egzogenog proteina značajno manje inhibirana pomoću interferorskog molekula nego ekspresija endogenog proteina.

Nadalje, pronalazak takođe obuhvata ćelije i organizme koji sadrže neki interferorski molekul. Takav organizam može npr. da bude neka transgena biljka koja nosi genetsku informaciju koja kodira neki interferor. Takva transgena biljka je u poželjnoj realizaciji prigušena biljka (drugim rečima, ona u kojoj je neki konkretni ciljani protein podregulisan zbog prisutnosti nekog specifičnog interferora u podskupu ćelija ili organa ili se nalazi u svim ćelijama i organima navedene biljke). Ćelije koje sadrže neki interferor mogu da se proizvedu kontaktom navedene ćelije ili elektroporacijom navedene ćelije s nekim konkretnim interferorskim molekulom. U konkretnoj realizaciji, ćelije koje sadrže neki molekul su generisane kroz transfekciju (ili tranformaciju), pri čemu je interferor kodiran pomoću rekombinantnog ekspresijskog vektora kao što je neki plazmid ili neki virusni vektor.

IZOLOVANJE: SEPARACIJA i DETEKCIJA

U drugoj realizaciji, pronalazak definiše neki postupak da se izoluje neki protein iz uzorka što uključuje kontakt navedenog uzorka s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi i koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koji se nalazi u pomenutom proteinu, te izoluje dobijeni kompleks koagregirani molekul-protein iz navedenog uzorka.

U sledećoj realizaciji, pronalazak definiše neki postupak da se izoluje neki protein iz uzorka što uključuje kontakt navedenog uzorka s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi i koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koji je izolovan iz pomenutog proteina pri čemu je navedeni samoasocirajući region fuzionisan za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona, te izoluje dobijeni kompleks koagregirani molekul-protein iz navedenog uzorka.

U sledećoj realizaciji, pronalazak definiše neki postupak da se izoluje neki protein iz uzorka što uključuje kontakt navedenog uzorka s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi i koji sadrži bar jedan samoasocirajući region koji je izolovan iz pomenutog proteina pri čemu je navedeni samoasocirajući region fuzionisan za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog samoasocirajućeg regiona tako daje pomenuti samoasocirajući region u direktnom kontaktu s rastvaračem u kojem su prisutni navedeni samoasocirajući region fuzionisan za navedenu vrstu i pomenuti protein, te izoluje dobijeni kompleks koagregirani molekul-protein iz navedenog uzorka.

Drugim rečima, pronalazak definiše neki postupak za izolovanje nekog proteina iz uzorka koji uključuje: • kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A sadrži neki peptid, proteinsku domenu ili agaroznu česticu, koji sprečava agregaciju dela B, te deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region pri čemu navedeni region sadrži bar tri naporedne aminokiseline i gde je navedeni region izolovan iz pomenutog proteina i gde se neka spojnica proizvoljno nalazi između delova A i B, te • izolovanje dobijenog kompleksa ko-agregirani molekul-protein iz navedenog uzorka. Drugim rečima, pronalazak definiše neki postupak za izolovanje nekog proteina iz uzorka koji uključuje: • kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A sadrži neki peptid, proteinsku domenu ili agaroznu česticu, koji sprečava agregaciju dela B, te deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region pri čemu navedeni region sadrži bar tri naporedne aminokiseline i gde je navedeni region izolovan iz pomenutog proteina i gde se neka spojnica proizvoljno nalazi između delova A i B, te gde je deo B u direktnom kontaktu s okolinom u kojoj se nalaze pomenuti molekul i protein, te • izolovanje dobijenog kompleksa ko-agregirani molekul-protein iz navedenog uzorka. Drugim rečima, pronalazak definiše neki postupak za izolovanje nekog proteina iz uzorka koji uključuje: • kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A sadrži neki peptid, proteinsku domenu ili agaroznu česticu, koji sprečava agregaciju dela B, te deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region pri čemu navedeni region sadrži bar tri naporedne aminokiseline i gde je navedeni region izolovan iz pomenutog proteina i gde se neka spojnica proizvoljno nalazi između delova A i B, te gde je deo B u direktnom kontaktu s okolinom u kojoj se nalaze pomenuti molekul i protein, te • izolovanje dobijenog kompleksa ko-agregirani molekul-protein iz navedenog uzorka. Drugim rečima, pronalazak definiše neki postupak za izolovanje nekog proteina iz uzorka koji uključuje: • kontakt pomenutog proteina s molekulom koji ne može da se nađe u prirodi koji sadrži deo A i deo B pri čemu deo i) A sadrži neki peptid, proteinsku domenu ili agaroznu česticu, koji sprečava agregaciju dela B, te deo ii) B koji sadrži bar jedan samoasocirajući region pri čemu navedeni region sadrži bar tri naporedne aminokiseline i gde je navedeni region izolovan iz pomenutog proteina i gde se neka spojnica proizvoljno nalazi između delova A i B, te • izolovanje dobijenog kompleksa ko-agregirani molekul-protein iz navedenog uzorka.

SEPARACIJA

U sledećoj realizaciji ovaj postupak za izolovanje bar jednog proteina takođe uključuje separaciju bar jednog proteina iz uzorka.

Jedna primena separacije bar jednog proteina iz uzorka je uklanjanje (ili brisanje) jako zastupljenih proteina iz uzorka. Ustvari, glavni izazov u otkrivanju i validaciji ciljanog proteina je kako specifično raščlaniti kompleksne proteinske uzorke (npr. plazma, urin, cerebrospinalna tečnost) i meriti proteine u tragovima. Jako zastupljeni proteini su često 6-10 redova veličine jače koncentrovani od onih manje zastupljenih. Tako, jako zastupljeni proteini moraju da se uklone da bismo mogli da izvršimo detekciju i merenje proteina u tragovima koji su od medicinske važnosti. Budući da albumin, IgG, antitripsin, IgA, transferin i haptoglobin čine približno 90% ukupne količine proteina u humanom serumu, postoji kritična potreba za dijagnostičkim alatima da bi se brzo uklonili ovi neželjeni zastupljeni proteini i skinula maska s onih proteinskih biomarkera koji su manje zastupljeni i manje molekulske težine. Nekoliko postupaka se već koristi u tehnici: 1) imunoglobulin G (IgG) kao afinitetni reagens da se uhvate i separiraju zastupljene proteinske mete, 2) imunoglobulin iz žumanceta (IgY) su IgG-slična antitela koja su izolovana iz žumanceta jaja imunizovanih ptica, 3) pre-frakcionacija se koristi za razdvajanje smeše proteina u različite frakcije da bi mogli da se uklone proteini u originalnoj smeši, te 4) protein A i protein G su proteini membrane u bakterijskoj ćeliji sa specifičnošću prema IgG antitelima, dakle protein A i G afmitetnim smolama da se postigne uklanjanje IgG i 5) IgG- i IgY-mikročestice su korišćene za detekciju proteina.

DETEKCIJA

U drugoj specifičnoj realizaciji ovaj postupak za izolovanje bar jednog proteina nadalje obuhvata detekciju bar jednog proteina u pomenutom kompleksu molekul-protein.

Detekcija može da se izvrši razdvajanjem kompleksa interferorski molekul-ciljani protein, npr. elektroforezom, hromatografijom na koloni, filtracijom, elektrostatskim privlačenjem, magnetskim ili paramagnetskim privlačenjem, masenom spektroskopijom i slično.

Najšire korišćene biološke detekcijske tehnologije baziraju se na upotrebi antitela. Antitela prepoznaju druge molekule i vežu se za njih bazirano na njihovoj formi i fizičkohemijskim osobinama. Antitela su osobito podesna za detekciju malenih količina ciljanih proteina u prisutnosti kompleksnih smeša proteina. Ovaj pronalazak pokazuje daje upotreba interferorskih molekula (deo B ima specifičnost i prepoznaje bar jedan specifični protein) alternativa upotrebi antitela (kao element prepoznavanja) za specifično hvatanje ciljanih proteina. Zaista, interferorske molekule mogu da se koriste u brojnim primenama u kojima se tipično koriste antitela. Da bismo imenom naveli njih nekoliko, primene su vezane za dijagnozu, mikroanalitiku, forenziku i za specifičnu detekciju patogena.

Za detekcijske i separacijske primene ovog pronalaska poželjno je da deo B interferorskog molekula bude vezan za nosač koji je ovde označen kao deo A. Nosač može da bude ravna površina kao što je plastika ili nitroceluloza ili hromatografska kolona ali je poželjno da to bude neka čestica kao stoje mikrosferna čestica. Generalna diskusija o različitim tipovima čestica i mikrosfera, koji služe tome da budu deo A interferorskih molekula se može naći na str. 9 i 10 američkog patenta br. 6682940 i ovde je specifično uključena kao referenca.

U konkretnoj realizaciji deo A interferorskog molekula je nosač tipa ugljenog hidrata, npr. celuloza ili agaroza. Deo B može da bude kovalentno vezan za navedeni ugljeni hidrat putem agensa za unakrsno vezanje kao što je glutaraldehid.

U drugoj konkretnoj realizaciji deo A je nosač kao što je celuloza, staklo ili neki veštački polimer. Kovalentno povezivanje između dela A i dela B može da se izvrši pomoću aminokiselinskih rezidua dela B i nekog azida, karbodiimida, izocijanata ili drugih hemijskih derivata prisutnih na delu A.

U sledećoj konkretnoj realizaciji deo A je porozna silanizovana staklena mikročestica. Deo B može da se kovalentno poveže s delom A pomoću njegovih peptidnih aminskih grupa (Schiff-ovom reakcijom, nakon čega sledi redukcija s natrijum borhidridom) za aldehidne grupe koje su nastale perjodatnom oksidacijom glicidoksipropilsilanskih grupa koje su hemijski vezane za atome silicijuma (ovo vezanje je opisano u: Sportsman i Wilson (1980) Anal. Chem. 52, 2013-2018).

U specifičnoj realizaciji deo nosača A prekriven je nekim proteinastim filmom za kojega je deo A unakrsno vezan (vidi patentne zahteve 1-50 i primere koji se odnose na nosač u američkom patentu br. 4478946).

U drugoj specifičnoj realizaciji deo A je fluorescentna čestica kao što je fluorescentna lateks čestica. Američki patent br. 4550017, te posebno str 4 u njemu, opisuje fluorescentna jedinjenja koji mogu da se koriste za proizvodnju fluorescentnih čestica.

U drugoj specifičnoj realizaciji čestice, deo A, varira u veličini i može takođe da sadrži ili da bude impregniran s fluorescentnim bojama. Zbog varirajuće veličine i boje čestica multipli proteini mogu da se detektuju i kvantifikuju u jednoj reakciji. Procedure za razvoj takvih čestica su opisane u američkom patentu br. 6159748.

U sledećoj konkretnoj realizaciji vezanje između dela A (čestica) i dela B je putem nekog poli(treonina), poli(serina), dekstrana ili poli(etilen glikola). Primeri 6, 7, 8 i 9 u američkom patentu br. 6399317 ilustruju kako može da se izvrši ovo vezanje.

U sledećoj konkretnoj realizaciji deo A je magnetska čestica. Magnetske čestice, vezanje između magnetskih čestica i nekog proteinskog agensa te njihova upotreba su opisani na str.

8 američke patentne prijave br. 6489092.

Definicije

Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju standardno značenje koje se normalno podrazumeva od onih koji imaju normalno iskustvo u području tehnike kojemu pripada ovaj pronalazak. Mada bilo koji postupak i sredstva koji su slični ili ekvivalentni ovde opisanima mogu da se koriste u realizaciji ili testiranju ovog pronalaska, opisani su poželjni postupci i sredstva. Za potrebe ovog pronalaska, niže su defmisani sledeći termini.

Neodređeni gramatički član "neki" koji se ovde koristi se odnosi na jedan ili više od jednog (tj. bar na jedan) gramatičkog objekta člana. Kao primer, "neki ciljani protein" označuje jedan ciljani protein ili više od jednog ciljanog proteina.

Kako se ovde koristi, termin "oko" odnosi se na neku količinu, nivo, vrednost, dimenziju, veličinu ili količinu koja varira čak do 30%, poželjno čak do 20%, te poželjnije do 10% referentne količine, nivoa, dimenzije, veličine ili količine.

"Bifunkcionalni unakrsno vezujući reagens" označuje reagens koji sadrži dve reaktivne grupe, pa reagens zbog toga ima sposobnost da kovalentno poveže dva elementa kao što je

deo A i deo B interferorskog molekula. Reaktivne grupe u unakrsno vezujućem reagensu tipično pripadaju klasama funkcionalnih grupa uključujući sukcinimidil estere, maleimide i haloacetamide kao što su jodoacetamidi. U ovoj patentnoj specifikaciji, sve dok kontekst ne zahteva drugačije, reči "sadrži", "obuhvata" i "uključuje" podrazumeva se da uključuje navedenog stepena ili elementa ili grupe stepena ili elemenata ali ne isključuje bilo koji drugi stepen ili element ili grupu stepena ili elemenata.

Pod "ekspresijski vektor" ili "rekombinantni vektor" se podrazumeva bilo koji autonomni genetski element koji može da usmerava sintezu interferorskog molekula koji je kodiran pomoću vektora. Takvi ekspresijski vektori su poznati praktičarima u ovoj oblasti tehnike.

Pod "derivat" se podrazumeva neki interferorski molekul koji je izveden iz bazične sekvencije modifikacijom, na primer konjugacijom ili kompleksiranjem s drugim hemijskim vrstama (npr. pegilacija) ili pomoću post-translacijskih modifikacijskih tehnika kao što se podrazumeva u tehnici. Termin "derivat" takođe uključuje unutar svojega dosega promene koje su bile načinjene matičnoj sekvenci uključujući dodavanja ili brisanja da se dobiju funkcionalno ekvivalentni molekuli.

Pod "efektivna količina", u kontekstu modulisanja aktivnosti ili tretiranja ili prevencije stanja se podrazumeva primena one količine nekog interferorskog molekula nekoj individui kojoj je potrebna takva modulacija, treatman ili profilaksa, bilo kao jedna doza ili kao deo serije, koja je efikasna za modulaciju takvog efekta ili za tretman ili profilaksu toga stanja. Efektivna količina će da varira ovisno o zdravlju i fizičkoj kondiciji individue koja se tretira, taksonomskoj grupi individue koja se tretira, formulaciji smeše, proceni medicinske situacije te drugim relevantnim faktorima. Očekuje se da će očekivana količina biti u relativno uskom rasponu koji može da se odredi putem rutinskih eksperimenata.

Pod "izolovan" se podrazumeva materijal koji je značajno ili suštinski slobodan od komponenti koje ga normalno prate u njegovom prirodnom stanju. Na primer, "izolovan polipeptid", kako se ovde koristi, odnosi se na neki polipeptid, koji je pročišćen od sekvenci koje ga prate u njegovom prirodnom stanju, npr. neka samoasocirajuća sekvenca koja je bila uklonjena od sekvenci koje je normalno prate. Neka samoasocirajuća sekvenca (proizvoljno vezana za vrstu koja sprečava agregaciju) može da se generiše pomoću aminokiselinske hemijske sinteze ili može da se generiše rekombinantnom produkcijom.

Termin "oligonukleotid" kako se ovde koristi odnosi se na neki polimer koji je sastavljen od određenog broja nukleotidnih jedinica (deoksiribonukleotida ili ribonukleotida, ili srodnih strukturnih varijanti ili njegovih sintetskih analoga) koje su povezane putem fosfodiesterskih veza (ili srodnih strukturnih varijanti ili njegovih sintetskih analoga). Neki oligonukleotid je tipično prilično kratak, obično od 10 do 30 nukleotida, ali termin može da se odnosi na molekul bilo koje duljine, mada se termin "polinukleotid" ili "nukleinska kiselina" tipično koristi za velike oligonukleotide. Termin "polinukleotid" ili "nukleinska kiselina" kako se ovde koristi označuje mRNK, RNK, cRNK, cDNK ili DNK. Termin se tipično odnosi na oligonukleotiode koji su veći od 30 nukleotida u nizu.

Termin "rekombinantni polinukleotid" kako se ovde koristi odnosi se na neki polinukleotid koji je nastajein vitromanipulisanjem s nukleinskom kiselinom u formu kakva se normalno ne nalazi u prirodi. Na primer, rekombinantni polinukleotid može da bude u formi nekog ekspresijskog vektora. Generalno, takvi ekspresijski vektori uključuju transkripcijske i translacijske regulatorne nukleinske kiseline koje su operabilno vezane za nukleotidnu sekvencu.

Pod "operabilno povezan" se podrazumeva da su transkripcijske i translacijske regulatorne nukleinske kiseline pozicionirane relativno prema nekom polipeptiđ-kodirajućem polinukleotidu na takav način da se polinukleotid transkribira i polipeptid se translatira.

Termini "subjekt" ili "individua" ili "pacijent", ovde su međusobno izmenjivi, a odnose se na bilo koji subjekt, konkretno na nekog kičmenjaka, te konkretnije na nekog sisara, za kojega je poželjna terapija ili profilaksa. Podesne životinje kičmenjaci koje padaju unutar dosega ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na primate, ptice, ribe, vodozemce, domaće životinje (npr. ovce, krave, konje, magarce, svinje), laboratorijske životinje (npr. kuniće, miševe, pacove, zamorce, hrčke), kućne ljubimce (npr. mačke, pse) i divlje životinje (npr. lisice, jelene, prerijski pse). Međutim, podrazumeva se da gore navedeni uslovi ne uključuju da su simptomi prisutni.

Pod "farmaceutski prihvatljivi nosač" se podrazumeva čvrsto ili tečno punilo, razblaživač ili enkapsulirajuća supstanca koja može da se sigurno koristi za lokalnu ili sistemsku primenu bolesniku.

"Polipeptid", "peptid" i "protein" se ovde koriste kao međusobno zamenjivi i odnose se na neki polimer aminokiselinskih rezidua i na njihove varijante i veštačke analoge. Tako, ovi termini se primenjuju na aminokiselinske polimere u kojima je jedna ili više aminokisleinskih rezidua neka veštačka aminokiselina koja ne može da se nađe u prirodi, kao i na prirodne aminokiselinske polimere.

Pod "rekombinantni polipeptid" se podrazumeva neki polipeptid koji je načinjen korišćenjem rekombinantnih tehnika, tj. kroz ekspresiju rekombinantnog ili sintetskog polinukleotida. Kada se himerni polipeptid ili njegov biološki aktivni deo rekombinantno proizvode, takođe je poželjno suštinski osloboditi medijum kulture, tj. medijum kulture predstavlja manje od oko 20%, poželjnije manje od oko 10%, te najpoželjnije manje od oko 5% (zapremine) proteinskog preparata.

Termin "identičnost sekvence" kako se ovde koristi odnosi se na doseg do kojega su sekvence identične prema nukleotid-do-nukleotida bazi ili na aminokiselina-do-aminokiseline bazi putem poređenja prozora. Tako, "procenat identičnosti sekvence" je izračunat poređenjem dve optimalno poravnate sekvencije preko prozora za poređenje, određivanjem broja pozicija za koje su identične baze nukleinskih kiselina (npr. A, T, C, G, I) ili identične aminokiselinske rezidue (npr. Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys i Met) nađene u obe sekvence da se dobije broj podudarnih pozicija, delenjem broja podudarnih pozicija s ukupnim brojem pozicija u prozoru za poređenje (tj. veličini prozora), te množenjem rezultata sa 100 da se dobije procenat identičnosti sekvence. Za potrebe ovog pronalaska, "identičnost sekvence" podrazumeva se da označuje "procenat podudarnosti" koji je izračunat pomoću DNASIS kompjuterskog programa (verzija 2.5 za Windows; dostupan od Hitachi Softvvare Engineering Co., Ltd., South San Francisco, Calif., USA) korišćenjem standardnih postavki kao što su one koje se koriste u referentnom priručniku koji je isporučen uz softver. "Sličnost" se odnosi na procenat broja aminokiselina koje su identične ili sačinjavaju konzervativne supstitucije. Sličnost može da bude određena korišćenjem programa za poređenje sekvencija kao što je GAP (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). Na taj način, sekvence koje su slične ili posve različite duljine od onih koje su ovde citirane mogu da se porede ubacivanjem praznina u podudarnost, a takve praznine mogu da se odrede, na primer, algoritmom poređenja kojega koristi GAP.

Termin "transformacija" označuje promenu genotipa nekog organizma, na primer bakterije, gljivice ili biljke, uvođenjem strane ili endogene nukleinske kiseline. Vektori za transformaciju uključuju plazmide, retroviruse i druge životinjske viruse, YAC-ove (kvašćevi veštački hromosomi), BAC-ove (bakterijski veštački hromosomi) i slično. Pod "vektor" se podrazumeva neki polinukleotidni molekul, poželjno neki izvedeni DNK molekul, na primer, iz plazmida, bakteriofaga, gljivice ili virusa, u koju može da se ubaci ili klonira neki polinukleotid. Vektor poželjno sadrži jedno ili više jedinstvenih restrikcijskih mesta i može da sudeluje u autonomnoj replikaciji u defmisanoj ćeliji domaćina uključujući neku ciljanu ćeliju ili tkivo ili progenitorsku ćeliju ili njeno tkivo, ili može da se integriše s genomom đefinisanog domaćina tako daje klonirana sekvenca reproducibilna. Prema tome, vektor može biti neki autonomno replicirajući vektor, tj. neki vektor koji postoji kao neki ekstrahromosomski entitet, a njegova replikacija je neovisna o hromosomskoj replikaciji, npr. neki linearni ili zatvoreni kružni plazmid, neki ekstrahromosomski element, te minihromosom ili neki veštački hromosom. Vektor može da sadrži neki sklop za osiguranje samo-replikacije. Alternativno, vektor može da bude jedan koji je, kada se uvede u ćeliju domaćina, integrisan u genom i repliciran zajedno s hromosomom/hromosomima u kojega je integrisan. Vektorski sistem može da sadrži jedan vektor ili plazmid, dva ili više vektora ili plazmida, koji zajedno sadrže totalnu DNK koja treba da se unese u genom ćelije domaćina, ili neki transposon. Izbor vektora će tipično da ovisi o kompatibilnosti vektora s ćelijom domaćina u koju treba da se uvede vektor. U poželjnoj realizaciji, vektor je poželjno neki virusni ili virusno-izvedeni vektor, koji je operabilno funkcionalan u životinjskoj ćeliji i poželjno ćeliji sisara. Vektor može takođe da sadrži selekcijski marker kao što je neki antibiotički rezistencijski gen koji može da se koristi za selekciju podesnih transformanata. Primeri takvih rezistencijskih gena su poznati onima koji poznaju ovu tehniku i uključuju nptll gen koji dodaje rezistenciju antibioticima kanamicinu i G418 (Geneticin®) te hph gen koji dodaje rezistenciju antibiotiku higromicinu B.

Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kakvo se standardno podrazumeva od lica koja poznaju oblast tehnike kojemu pripada ovaj pronalazak. Mada sredstva i postupci koji su slični ili ekvivalentni ovde opisanima mogu da se koriste u praksi ili za testiranje ovog pronalaska, korisni postupci i sredstva su niže opisani. Sredstva, postupci i primeri su samo ilustracija i nije predviđeno da budu ograničenje. Druge osobine i prednosti ovog pronalaska bit će jasni iz detaljnog opisa i iz patentnih zahteva.

Primeri

1. Dizajn interferorskog molekula nekogveštačkogpeptida

Konstruisali smo interferorski molekul koji se u delu B sastoji od tri veštačka samoasocirajuća regiona s kratkim spojnicama dviju aminokiselina (STLIVL-QN-STVIFE-QN-STVIFE) koje međusobno spajaju samoasocirajuće regione. Pomenuta tri samoasocirajuća regiona su heksapeptidi koji imaju jaku sklonost agregaciji, vidi si. 1 za dizajn interferorskog molekula. Pazi: u tekstu ovog pronalaska sve aminokiselinske sekvence su prikazane polazeći od amino-terminalnog dela i čitaju se u smeru karboksi-terminalnog dela - tako, "STLIVL" se čita se "NH2-STLIVL-COOH"). Deo B sintetskog interferorskog molekula je N-terminalno fuzionisan za vrstu (deo A) koja sprečava agregaciju i dovodi samoasocirajuće regione u direktni kontakt s okolinom (ovde citosolE. coli).(SI. 1 prikazuje strukturu dizajna sintetskog interferora). Navedena vrsta je NusA protein, koji se često koristi kao tag rastvorljivosti u produkciji rekombinatnog proteina<13>. Dobijeni sintetski interferorski molekul (A-B struktura) može da se načini i pročisti na rekombinantni način uE. coli.

Pokazali smo đa preekspresija sintetskog interferorskog molekula (bez bilo kakve specifične samoasocijacjske sekvence koja je specifična za konkretniE. coliprotein) ne sprečava bakterijski rast. Prema tome, BL21E. colićelije su transformisane s veštačkim interferorskim konstruktom koji se nalazi u pETM60 plazmidu (poklonjeno od G. Stier, EMBL). U ovom potonjem plazmidni interferori su pod kontrolom himernog T7 promotora (vidi sekciju sredstva i postupci). Rekombinanti su rasli do gustoće od 0.6 OD, vršena je ekspresija interferora nakon dodavanja 0.5 uM IPTG tokom 3 časa na 37°C i bakterijska suspenzija je nanesena na agar ploče. Ploče su pregledane posle 12 h inkubacije na 37°C i pokazale su bogati bakterijski rast.

U sledećem stepenu neka elastična spojnica sekvence ("KPGAAKG" - koja je opisana kao "spojnica" na slici 1) vezana je za COOH-terminal veštačkog interferorskog konstrukta da se omogući fuzija samoasocirajućih sekvenci koje su izvedene iz ciljanog proteina.

2.Proteinskainterferencija u prokariotima

U ovom primeru za podregulisanje izabrani suE. coliproteini prema čemu funkcionalna proteinska interferencija poređuje odabranu osobinu. Ciljani proteini izE. coliproteoma izabrani su s citosolnom lokalizacijom i prisutnog nekog agregacijskog regiona s podesnim visokim TANGO skorom. Budući da uslovna auksotrofija za jednu aminokiselinu može da se zgodno testira korišćenjem medijuma za rast s kontrolisanim sastavom, izabrali smo četiri kandidatska enzima koji su uključeni u sintezi izoleucina (UniProt<15>ulaz: ILVI ECOLI), metionin (UniProt<15>ulaz: METEECOLI i METKECOLI) i leucin (UniProt15ulaz: LEU1ECOLI). Samoasocirajuće sekvence bazirane na TANGO predikcijskom skoru četiri ciljana proteina bile su za ILVI_ECOLI: "GVVLVTSG", TANGO skor: 44, za

METE ECOLI: "LLLTTYF", TANGO skor: 32 , METK ECOLI: ""LTLLV", TANGO

skor: 20 i LEUl_ECOLI: "LAFIG", TANGO skor: 15. Genetska informacija za veštački interferorski molekul primera 1 fuzionisana je za DNK-sekvencu koja kodira odgovarajuće samoasocirajuće regione četiri biosintetska enzima što rezultira s četiri specifične interferorske molekule. Da se pokažein vivoproteinska interferencija (koja je suštinski ko-agregacija između specifičnog interferora (za biosintetski enzim) i samog biosintetskog enzima) mi smo radili na sledeći način.E. colibila je transformisana s plazmidom koji sadrži odgovarajuće interferorske konstrukte u bogatom medijumu sve do početka eksponencijalne faze rasta, kada se interferorska proteinska ekspresija uvodi s IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozid). Proteinska ekspresija je ostavljena da se dešava na 37°C, ćelije su sakupljene, isprane sa rastvorom soli da se ukloni suvišak IPTG i bogati medijum pa nanesene na agarske ploče koje sadrže minimalni M9 medijum koji je kompletiran s dvadeset prirodnih aminokiselina (što je nazvano M9 kompletni medijum) te na minimalni M9 medijum sa svim aminokiselinama sem one čija se auksotrofija testira (što je nazvano M9 selekt). Pokazalo se da se za tri od četiri ciljana enzima može da postigne kompletni funkcionalni nokaut, tj. nađeni su uslovi u kojima bakterije formišu kolonije na M9 kompletno ali ne na M9 selekt agar pločama. Ekspresija interferorskih konstrukta i njihova ekskluzivna prisutnost u nerastvorljivoj fazi ćelijskog lizata potvrđena je western blot postupkom. Za četiri enzima koji su ovde testirani, uočena je jasna veza između njihove osetljivosti za ko-agregacijski pristup i njihove procenjene agregacijske sklonosti prema TANGO algoritmu, što dodatno potvrđuje kvalitetu TANGO procena kao i njihovu značajnost u funkcionalnom ćelijskom kontekstu. ILVI protein, koji ima najveći TANGO skor, bio je gotovo kompletno izbačen pomoću "probijene" ekspresije iz T7 promotora u odsutnosti bilo kakvog IPTG, te jedan čas posle indukovane preekspresije dovodi do potpunog funkcionalnog nokauta. METE i METK enzimi pokazuju neki srednji TANGO skor i na njih nije delovao jedan čas preekspresije interferora. Međutim, posle tri časa IPTG indukcije funkcija je potpuno izgubljena i nije moglo da se detektuje nikakvo formisanje kolonija. Najslabiji agregacijski skor bio je uočen za LEU1 enzim i preekspresija je u ovom slučaju proizvela samo umereno podregulisanje njegove aktivnosti. Značajno je daje funkcionalni nokaut ciljanih enzima reverzibilan. Kada su ćelije koje su napunjene s visokim nivoom pre-ekspresiranog interferorskog materijala nanesene na ploče LB agara, one su

pokazale normalni rast kolonije. Kada su ove kolonije kopirane na M9 selekt, ponovo je uočen normalni rast. To pokazuje da su tokom rasta kolonije agregati bili izgubljeni, što znači daje mreža ćelija dovedena u normalu.

3. Proteinska interferencija meta koje sadrže samoasocirajuće regione s malenim

samoasocirajućim skorom

Samoasocirajući regioni često su opterećeni ili sadrže nabijene rezidue kao što su R, K, D i E ali takođe P i G (tzv. portirske aminokiselinske rezidue) (vidi Rousseau, Serrano & Schymkowitz (2006), How Evolutionary Pressure Against Protein Aggregation Shaped Chaperone Specificity, J Mol Biol, doi: 10.1016/j.jmb.2005.11.035). Ove portirske rezidue smanjuju sklonost samoasocijaciji sekvenci s kojima su povezane. Da bi se optimizovala osetljivost B-dela nekog interferorskog molekula prema ko-agregatu s danim ciljanim proteinom, samoasocirajući region ciljanog proteina koja je sadržana u B-delu interferora može da bude mutirana tako da su gore navedene rezidue zamenjene reziduama koje pomažu agregaciji kao što su L, V, I, F, W, Y ali takođe mogu da se uključe i druge rezidue koje mogu da povećaju sklonost samoasocijaciji samoasocirajućeg regiona. Mutirani samoasocirajući region (izveden iz ciljanog proteina) koji je sadržan u B-delu interferorskog molekula ima sekvencijsku homologiju od bar 60%, poželjno bar 70%, poželjnije bar 80% i najpoželjnije bar 90%, sa samoagregirajućim regionom ciljanog proteina. Nadalje, neke aminokiseline su neutralne obzirom na agregaciju, te će zamena pomenutih aminokiselina s aminokiselinama koje favorizuju agregaciju takođe povećati tendenciju samoasocijaciji regiona (na primer S, T, C ali takođe Q, N, H, M mogu da se zamene agregacijski sklonim reziduama kao što su L, V, I, F, W, Y. Ove optimizovane integratorske molekule povećavaju proteinsku interferenciju meta s nekim predviđeno malenim agregacijskim skorom. U primeru 2 pokazali smo da proteinska je interferencija LEU1 enzima E.colimanje efikasna. U ovom primeru mi optimizujemo interferorski molekul sa specifičnošću za LEU1 enzim. Identifikovana samoasocirajuća sekvenca u LEU1 je "LAFIG". Ova potonja sekvenca je opterećena portirskim reziduama "...DYDLEALAFIGKQQEE..." prema tome da bismo mutacijski pojačali ciljanu sekvencu mi smo koristili strategiju koja se bazira na degenerisanom pcr kako sledi: komplementarne vodeće sekvence koje su dizajnirane tako da se preklapaju 20-25 bp na svakoj strani kodona bit će mutirane da se omogući efikasno otpuštanje vodećih sekvenci šablone. Degenerativni kodon je uveden ugrađivanjem ekvimolarnog odnosa Četiri baze tokom sinteze vodeće sekvence (neki tzv. NNS kodon). Upotrebom Quickchange PCR protokola s ovom degenerisanom vodećom sekvencom, dobijena je biblioteka koja sadrži 20 tačkastih mutacija bočnih pozicija. Ova biblioteka je pojačana u ToplO (Invitrogen) i plazmidna DNK je pročišćena korišćenjem miniPrep kita (Qiagen). Da se ispita da li je povećana nokaut efikasnost, mutantni interferori (dizajn je izvršen kao u primeru 2) za LEU1 metu su tranformisani u BL21 ćelije (Invitrogen) i naneseni na LB agar ploče. Na ploči s 96 bunarića 96 koji sadrže 0.2 mL LB + antibiotik po bunariću, svaki bunarić je inokulisan doticanjem pojedinih kolonija. Ploče su inkubirane na na 37°C sve dok nije postignut OD od 0.6, kada je ekspresija mutantnih interferora pokrenuta dodavanjem 0.5 uM IPTG tokom 3 časa na 37°C. Kompletna je sadržinaSvakog bunarića, sem što je 1 uL nanesen na ploče selektivnog minimalnog medijuma koji sadrži sve aminokiseline sem leucina. Za klonove koji pokazuju različite gradacije oštećenja rasta na odabranim pločama, TempliPhi reagens (GE Health Science) je dodan za DNK pojačanje i ploča je prenesena do uređaja za sekvenciranje. Sekvencijska informacija definiše nam puni spektar optimizovanih LEU1 mutiranih interferorskih molekula.

4. Upotreba interferorskih molekula za uklanjanje imunoglobulinaG izseruma

U ovom eksperimentu brisanja agarozna čestica je odabrana kao vrsta (deo A) za koju se fuzionišu samoasocirajući regioni koji su izvedeni iz ciljanog proteina putem amino reaktivnog hemijskog vezanja. Takvi agarozni materijali su komercijalno raspoloživi, kao što je NHS-aktivirana Sepharose™ 4 Fast Flow iz firme GE healthcare. Humani imunoglobulin G ima dva jaka tango regiona (I) IIVAVVIATAVAAIVAAVVALIY i II) LTVLLLLASA) koji mogu da se koriste kao samoasocirajući regioni. Budući daje cena peptida raste s brojem aminokiselina, peptidi su dizajnirani s 10 aminokselinskih frakcija iz prvog ciljanog regiona. Ciljanim sekvencama (samoasocirajući regioni) prethodi spojnička sekvenca ADPRGAAEGA i sinteza je izvršena s nezaštićenim krajevima da se sačuva reaktivna N-terminalna amino grupa. Dizajnirane sekvence su a) ADPRGAAEGAIIVAVVIATA, b) ADPRG AAEG A V VI AT A VA Al, c) ADPRGAAEGAIVAAVVALIY (a), b) i c) sadrže dekapeptide koji su izvedeni iz jakog tango regiona I) i d) ADPRGAAEGALTVLLLLASA sadrži tango region II). Za brisanje, 10 ml seruma je inkubirano s 1 mg imobilizovanog peptida na 25, 30, 37 i 45°C tokom 1 čas. Agarozne čestice su sakupljene centrifugiranjem i serum je uklonjen, agarozne čestice su isprane u PBS puferu da bi se uklonila preostala nečistoća. Čestice su posle toga prenesene u SDS pufer i inkubirane na 95°C tokom 10 minuta i snažno vorteksirane. Prisutnost IgG je ispitana pomoću SDS-PAGE. Identitet mete je potvrđena pomoću masene spektroskopije.

5. Upotreba interferorskih molekula za detekciju

Interferorske molekule su dizajnirane za specifičnu detekciju 3 komercijalno raspoloživa rekombinantna proteina (citrat sintaza iz srca svinje (Roche), beta-galaktosidaza odE. coli(Sigma) i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza odLeuconostoc mesenteroides(Sigma). U prvom stepenu samoasocirajući regioni su određeni s TANGO algoritmom iz sledećih ciljanih proteina:

1. a) citrat sintaza (CISY_P1G): "ALFWLLVT" (TANGO skor 60),

2. b) beta-galaktosidaza (BGAL ECOLI): "AVIIWSLGN" (TANGO skor 30) i "ALAVVLQ" (TANGO skor 42), i 3. c) glukoza-6-fosfat dehidrogenaza (G6PD LEUME): "AFVDAISAVTTA" (TANGO skor 41).

U sledećem stepenu biotin je amin-terminalno vezan za 4 različita samoasocirajuća regiona što rezultira s 4 različite interferorske molekule: i) biotin-ALFWLLVT sa specifičnošću za citrat sintazu, ii) biotin-AVIIWSLGN i biotin-ALAVVLQ sa specifičnošću za beta-galaktosidazu te iii) biotin-AFVDAISAVYTA sa specifičnošću za glukoza-6-fosfat dehidrogenazu. Biotinilirani peptidi su zahtevani od Jerine Peptide Technologies. Pazi na interferorski dizajn: biotin - samoasocirajući region odgovara A-B strukturi gde biotin (deo A) sprečava agregaciju samoasocirajućeg regiona (deo B) i dovodi samoasocirajući region u direktni kontakt s rastvaračem (PBST) u kojem se nalazi biotin-samoasocirajući region.

Pojedine tačkaste mrlje (dotblot) su priređene tačkastim nanošenjem 0.3 mg svakog ciljanog proteina na nitroceluloznu membranu, pa zatim sušenjem na zraku i inkubacijom preko noći u 1% BSA-PBST (PBS s 0.1% Tween-20) da se blokiraju nespecifična vezujuća mesta. Membrana je zatim uronjena u 10 mM rastvor biotiniliranog detekcijskog peptida i inkubirana tokom 3 časa na sobnoj temperaturi uz mešanje. Nakon ponovljenog ispiranja s puferom, vezanje peptida za protein je potvrđeno vizualizacijom biotinske vrste korišćenjem streptaviđin-HRP (peroksidaza rena, Pierce) i detektovanjem hemiluminescencije pomoću CCD sistema kamera.

6. Upotreba interferorskih molekula za mišji VEGF za tretiranje patološke angiogeneze

mrežnjače

Neovaskularizacija mrežnjače je glavni uzrok slepoće u svetu i patološka angiogeneza mrežnjače je konačni zajednički put koji vodi do gubitka vida u bolestima kao što je retinopatija prerane zrelosti (ROP), dijabetičke retinopatije i staračke makularne degeneracije. Poznato je daje vaskularni endotelijski faktor rasta (VEGF) jedan od ključnih učesnika u razvoju patološke angiogeneze. Mi smo istraživali efekt interferorskih molekula prema VEGF u mišjim modelima indukovane retinopatije. U prvom modelu neonatalni miševi (s nesazrelom vaskulaturom mrežnjače) su izloženi hiperoksiji, što rezultira obliteracijom razvoja krvnih sudova koji dovode kiseonik do mrežnjače. Kada se miševi vrate u normoksiju, mrežnjača, distalno prema okludovanim sudovima, postaje ishemična, što izaziva VEGF produkciju i konačno rezultira reproducibilnom i kvantificirajućom neovaskularizacijom mrežnjače (ovaj model je detaljno opisan u: Pierce EA et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92(3)905-9, vidi eksperimentalne procedure na str. 905 - mišji model). Ukratko, mišji mladi od 7 dana (P7) zajedno s majkama koje ih neguju, su izloženi hiperoksiji (75% kiseonik) u specijalno dizajniranim kiseonik komorama tokom 5 dana, bez otvaranja kaveza. Na P12, životinje su vraćene na sobni vazduh sve do Pl 7, kada su mrežnjače procenjene za maksimalni neovaskularni odgovor. NaP12 polovina životinja je tretirana s interferorskim molekulom za VEGF i polovica je ostala netretirana. Polovica tretiranih miševa primila je VEGF interferor putem injekcijom u očni staklasti deo dok je druga polovica tretirane grupe primila VEGF interferor putem periokularne injekcije (obe ove injekcije su izvršene na način kao što je opisano u: Shen J et al (2006) Gene Therapv, online publikacija od 29. septembra). Tri različita interferorska molekula su korišćeni prema mišjoj VEGF 165 izoformi u koncentracijskom opsegu 1-100 p.g/ml.

a) REAG- FLLSWVHWTLALLLYLHH-GGEERAG; ovaj interferorski molekul ima A-B-A' strukturu interferorskog molekula. Samoasocijacijski region koji je izveden iz

mišjeg VEGF 165 (podvučeno) je opterećen rastvorljivim regionima A (REAG i GGEERAG), ili drugim rečima regioni A i A' sprečavaju agregaciju samoasocirajućeg regiona (B-deo interferorskog molekula).

b) STVHE-GGAG-NHVTLS-GGAGQ- FLLSWVHWTLALLLYLHH-G£^G; ovaj

interferorski molekul ima B-A strukturu interferorskog molekula. Rastvorljivi deo A

(GERAG) je prikazan kurzivom. B-deo ima sledeću strukturu: STVIIE (=sintetski samoasocirajući region) - GGAG (=spojnica) - NHVTLS(=sintetski samoasocirajući region) - GGAGQ (^spojnica) - FLLSWVHWTLALLLYLHHG (=samoasocirajući region izveden iz mišjeg VEGF165).

c) STVIIE-GGAG- FLLSWVHWTLALLLYLHH-G™G: ovaj interferorski molekul ima B-A strukturu interferorskog molekula. Rastvorljivi deo A (GERAG) je prikazan

kurzivom. B-deo ima sledeću strukturu: STVIIE (^sintetski samoasocirajući region) - GGAG (=spojnica između samoasocirajućih regiona) - FLLSWVHWTLALLLYLHH (=samoasocirajući region izveden iz mišjeg VEGF 165).

Na P17 anesteziranim miševima izvršena je perfuzija kroz levi ventrikl s 1 ml fiziološkog rastvora s fosfatnim puferom koji sadrži 50 mg fluorescein-dekstrana molekulske težine 2xl0<6>. Oči su izvađene i fiksirane u 4% paraformaldehidu tokom 3 (desno oko) ili 24 (levo oko) časa. Na desnim očima, sočivo je uklonjeno i periferna mrežnjača rezana da se omogući postavljanje na ravnu podlogu s glicerol-želatinom. Na ravno postavljene mrežnjače su analizirane pomoću fluorescentne mikroskopije. Leve oči su uronjene u parafin i serijski rezovi od 6 \ im su rezani sagitalno kroz rožnjaču, paralelno s optičkim živcem, te su obojani s hematoksilin-eozinom. Proliferacijski neovaskularni odgovor je kvantifikovan merenjem broja novih sudova (^pramenova) i broja endotelijalnih ćelija koje se pružaju od unutrašnje ograničavajuće membrane mrežnjače u vitreum na obojanim sagitalnim poprečnim presecima. Angiografska tehnika korišćenjem fluorescein-dekstran perfuzije je primenjena zajedno s ovim postupkom brojanja za brzo skeniranje mrežnjača ili za neki alternativni sistem gradacije za kvantitativnu evaluaciju. U drugom modelu naovaskularizacija mrežnjače je simulirana laserski izazvanom venskom trombozom mrežnjače. Ovaj model opisan je u: Saito Y et al (1997) Curr. Eye Res. 16(1): 26-33. Chi-Chun Lai et al (2005) Acta Ophtalmologica Scandinavica 83:590-594, opisom u sekciji sredstava i postupaka na str. 591-592 ovaj model može da se kvantifikuje. Primena VEGF interferorskih molekula je izvršena kao što je ovde pre opisano.

7. Proteinska interferencija u humanoj ćelijskoj liniji

Modulacija apoptoze (indukcija ili supresija) može lako da se prati u ćelijskom sistemu. Poznato je da staurosporin indukuje apoptozu na način koji ovisi o p53. Tako, podregulisanje p53 ili podregulisanje proteina koji pojačavaju funkciju p53 (npr. ASPP1) vrši supresiju staurosporin indukovane apoptoze u životinjskim (npr. humanim) ćelijskim linijama. Rekombinantni ekspresijski vektori, koji kodiraju interferorske molekule, konstruisani su bazirano na dizajnu sintetskog interferorskog molekula koji je opisan u primeru 1, sem što je A deo, NusA protein, promenjen u zeleni fluorescentni protein (GFP) i što je promotor konstitutivni promotor sisara kao što je aktin ili CMV promotor. Samoasocirajuća sekvenca za p53 je ILTIITLE (koji ima tango skor 72) i ova sekvenca je zatim sadržana u B-delu sintetskog interferora što dovodi do interferorskog molekula sa specifičnošću za p53. Samoasocirajuća sekvenca za ASPP1 je MILTVFLSN (koji ima tango skor 63) i ova sekvenca je zatim sadržana u B-delu sintetskog interferorskog molekula sa specifičnošću za ASPP1. HeLa ćelije su uzgojene, te transficirane s rekombinantnim vektorima. GFP (A-deo) omogućuje vizualizaciju interferorskih molekula s pre-ekspresijom. Dodatak 1 uM staurosporina transficiranim i netransficiranim kontrolnim ćelijama izaziva diferencijalni apoptotiČki odgovor.

8. Proteinska interferencija vaskularnog endoteliiskog faktora rasta ( VEGF) u modelu

zebra- ribe

Razvijene su interferorske molekule koje su usmerene prema zebra-ribinom VEGF. Specifična inaktivacija (kroz agregaciju) izlučenog VEGF može da se prati putem disturbancije vaskularnog razvoja zametaka zebra-ribe.

U prvom stepenu samoasocirajući regioni koji se nalaze u VEGF proteinu zebra-ribe su određeni s TANGO algoritmom. Agregacijsku region s najvećim TANGO-skorom je NH2-FLAALLHLSA-COOH. Bazirano na ovoj samoasocirajućoj sekvenci mi smo razvili četiri veštačke interferorske molekule:

Interferor A: NH?-RLFLAALLR FLAALLHLSAR-COOH

Interferor B: NH7-R FLAALLHLSARLFLAALLR-COOH

Interferor C: NH?-RYLAILAGIRL FLAALLR-COOH

Interferor D: NH?-RYLAILAGI RFLAALLHLSAR-COOH

Interferor E (NH2-EALVVYLIQLAGR-COOH) služi kao kontrolna sekvenca i

izveden je iz sekvence izvan ovog jakog TANGO regiona

Obratite pažnju da interferori A, B i D sadrže celu TANGO-region dok interferor C sadrži samo deo TANGO-regiona. Sekvence izvedene iz TANGO-regiona su podvučene.

Ove transferorske molekule su dodane medijumu transgenihTg( f! il:EGFP/'zebra-riba zametaka u različitim koncentracijama. TransgeničniTgtflil:EGFP/'zebra-ribe vrši ekspresiju pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (GFP) u njihovim endotelijskim ćelijama, a navedene ribe koje su opisane u: Lawson ND i Weinstein BM (2002) Dev. Biol. 248, 307-318), su dobijene pomoću Zebrafish International Resource Center (Universitv of Oregon) te su negovane kao što je opisano u zebra-riba knjizi, vodič za laboratorijsku upotrebu zebra-ribe (Danio rerio), Univ. Oregon Press, Eugene, 1994).

Zametci od 20 časova posle fertilizacije (hpf) su složeni na ploče s 24 bunarića (10 zametaka/bunarić) i izloženi su za nekoliko koncentracija odabranim interferorskim molekulama (počevši od 50 jaM) tokom 24 časa. Živi zametci su analizirani za 28 i 48 hpf (časova posle fertilizacije) konfokalnim slikama koje su snimljene pomoću Zeiss laser-skenirajućeg mikroskopa LSM510.

Mada se prati razvoj različitih vaskularnih struktura, obratili smo posebnu pažnju na (i) strukturu dorzalne aorte (DA), posteriornu glavnu venu (PCV), (ii) klijanje intersomitičkih sudova (ISV) i formisanje vaskularnih pleksusa (PV) u posterirnom regionu trupa. Rezime dozno-ovisnog eksperimenta prikazanje u tabeli 1. Jasno je da da interferori A i C indukuju jasne vaskularne defekte u razvoju larvi zebra-ribe. Iznenađujuća je činjenica da su interferorske molekule preuzete od strane larvi zebra-ribe kroz kožu i daje injiciranje interferora nepotrebno. Interferori B i D treba da budu primenjeni pri još nižoj koncentraciji da bi mogli da se prate specifični vaskularni defekti.

9. Proteinska interferencija u gljivicamaSaccharomvces cerevisiae

Koristili smo nokaut kvašćevog Ura3 enzima da se pokaže da proteinska interferencija koja funkcioniše u eukariotima zbog ciljane inaktivacije (putem agregacije) Ura3 proteina daje lako očitanje.S. cerevisiaeUra3 enzim je bitan enzim koji je uključen u biosintetski put uracila. Dakle,S. cerevisiaemutanti kojima nedostaje URA3 gen nisu u mogućnosti da rastu na medijumu bez uracila ali rast može da se obnovi dodavanjem uracila u medijum. U prvom stepenu samoasocijacijski regioni koji se nalaze u Ura3 proteinu su određeni s TANGO algoritmom. Samoasocirajući region (ili agregacijsku region) s najboljim TANGO-skorom je NH2-VIGFIAQ-COOH (TANGO-skor: 74). Ova peptidna sekvenca korištena je za generaciju interferorskog ekspresijskog konstrukta. Da se klonira samoasocijacijska sekvenca koja kodira ovaj peptid u okviru sa sintetskim interferorskim konstruktom (vidi primer 1) koristili smo sledeća dva oligonukleotida:

XbaliSalirestrikcijska mesta su podvučena linijom. Startni kodon NusA proteina je naglašen podebljano. Stop kodon je prikazan kurzivom i sekvencija koja kodira sedam Ura3 aminokiselina je prikazana podebljano.

Kao šablona za PCR mi smo koristili pETM60 plazmid (poklonjeno od G. Stier, EMBL) koji sadrži NusA protein koji je vezan za sintetski interferor/spojnica konstrukt (vidi primer 1). Ovaj vektor sadrži T7 promotor, omogućuje kanamicin rezistenciju i definiše određeni N-terminalni ekspresijski tag od šest histidina. Dobijeni PCR proizvod je podkloniran u pBEVY/GT vektor (Miller CA 3rd, Martinat MA i Hyman LE (1988) Nucleic Acids Res. 26: 3577-3583) korišćenjem Xbal iSalirestrikcijskih mesta. U ovom vektoru "NusA-sintetski interferor-spojnica-Ura3 samoasocirajuća sekvenca" - ekspresijska kaseta je pod kontrolomS. cerevisiaeGALI/10 promotora. Selekcijski marker ovog vektora jeTRPIgen.

Sekvencijski provereni konstrukti sa i bez DNK koja kodira sedam Ura3 aminokiselina (izvedeni iz samoasocirajućeg regiona) su uneseni uS. cerevisiaesoj PVD2 pomoću transformacije te je selekcija transformanata bazirana natrp]komplementaciji. PVD2 soj je izveden iz W303-l A soja (Thomas BJ i Rothstein R. (1989) Cell 56,619-630) ali PVD2 soj je tranformisan s alelima divljeg tipa i HIS3 iURA3.PVD2 soj je još auksotrofični za leucin( LEU2),triptofan( TRPI)i adenin( ADE2).Transformanti su odabrani na SDglu-Trp medijumu (minimalni kvašćev medij s 2% glukoze ali bez triptofana). Kolonije su ponovo iscrtane na svežim SDglu-Trp pločama za pojedinačne kolonije. Dve neovisne kolonije su rasle preko noći u tečnom SDglu-Trp medijumu. OD^ookulture koje su zatim adjustirane na 1 i 5 mikrolitara 10-strukog serijskog razblaženja su spot nanesene na SDglu-Ura-Trp (SD-medijum s 2% glukozom ali bez uracila i bez triptofana) ili SDgal-Ura-Trp (SD-medijum s 2% galaktoza ali bez uracila i bez triptofana) ploče. Rezultati ovog eksperimenta pokazani su na si. 2. Ovaj eksperiment je ponovljen tri puta sa sličnim rezultatima. Ekspresija praznog pBEVY/GT vektora ili vektora koji vrši ekspresiju samo NusA-sintetski interferor konstrukta (bez neke samoasocirajuće sekvence od ura3) ne pokazuje bilo kakvo inhibiranje rasta na medijumu bez uracila. Ekspresija konstrukta NusA-sintetski interferor-Ura3 asocijacijskeg regiona, međutim, jako inhibira rast na medijumu bez uracila (kada je uracil dodan medijumu za rast nije bilo defekta u rastu), što pokazuje daje endogeni Ura3 protein specifično inaktiviran proteinskom interferencijom.

10. Proteinska interferencija u gljivicamaCandida albicans

Candida albicansizaziva 40% gljivičnih infekcija u ljudi. Ona poseduje određen broj virulentnih faktora. Bez obzira na njenu sposobnost da se zalepi za sve vrste plastike (glavni problem u jedinicama intenzivne nege) ili na proizvodnju lipaza i proteinaza, ono što je najcelovitije istraženo je njena sposobnost da se prilagodi različitim morfologijama budući da je to jedan od glavnih faktora virulencije. Mnogi transkripcijski faktori mogu da izazovu prelaz iz ćelija koje su poput kvasca u tip ćelija hvphae ili pseudohvphae. Drugi transkripcijski faktori su potrebni da se ćelija zadrži u kvašćevoj formi. Jedan primer takvog represora za hvphal formisanje je Tupi. Kao primer proteinske interferencije uCandida albicanskoristili smo Tupi protein kao metu. Podregulisanje biološke funkcije Tupi trebalo bi da izazove hvphal formisanje. U prvom stepenu samoasocijacijski region koje se nalazi u Tupi proteinu određenje s TANGO algoritmom. Samoasocirajući region (ili agregacijski region) s najboljim TANGO skorom (TANGO-skor: 30) je NH2-VISVAVSL-COOH. Ovaj peptid je korišćen da se generiše interferorski ekspresijski konstrukt. Da se klonira samoasocijacijska sekvenca koja kodira ovaj peptid u okviru sa sintetskim interferorskim konstruktom primera 1, koristili smo sledeća dva oligonukleotida:

BsrGliNhelmesta su podvučena linijom. Stop kodon je prikazan kurzivom dok je reverzna sekvenca koja kodira ciljani peptid prikazana podebljano.

Koristili smo pETM60 plazmid koji sadrži NusA-sintetski interferorski konstrukt (iz primera 1) kao šablon za PCR. Dobijeni PCR proizvod je subkloniran u pPCKl-GFP plazmid (Barelle CJ, Manson CL, MacCallum DM, Odds F, Gow NAR, Brown AJP. Yeast 21:333-340, 2004) korišćenjem BsrGI iNhelrestrikcijskih mesta. U ovom vektoru interferorski konstrukt bio je kloniran u okviru s GFP genom koji se nalazi na vektoru i rezultirajuća interferorska ekspresijska kazeta "GFP-sintetski interferor-spojnica-'Tupl samoasocirajući region") je pod kontrolomPCK1promotora. U ovom potonjem konstruktu zeleni fluorescentni protein (GFP) je zamenjen pomoću NusA i GFP služi kao deo A interferorskog molekula.PCK1promotor je snažno inđukovan u medijumu koji sadrži kasamino kiseline i s represijom u medijumu koji sadrži glukozu (Leuker CE, Sonneborn A, Delbruck S, Ernst JF. Gene 192:235-240, 1997). Sekvencijski provereni plazmidi su zatim transformisani uC. albicanssoj CAI4 (Fonzi WA, Irwin MY. Genetics 134:717-728, 1993). Transformanti su selektirani na SDglu-ura (kvašćev minimalni medijum koji sadrži 2% glukozu ali bez uracila). Transformanti su rasli preko noći u minimalnom medijumu koji sadrži glukozu, ćelije su razblažene da se dobije cea 20 ćelija/100 mikrolitara i ova zapremina je nanesena na ploče SDglu-ura ili SDkasamino kiselina-ura agar. Morfologija kolonije je ocenjena skorom posle 4 i 6 dana rasta (vidi si. 3). Kao što može da se vidi na si. 3, podregulisanje Tupi dešava se u medijumu s kasamino kiselinom i hvphal formisanje je jasno vidljivo na ivicama kolonija. Hvphal formisanje nije vidljivo u kontrolnim transformantima ((pPCKl-GFP plazmid bez interferorske ekspresijske kasete)) niti na medijumu koji sadrži glukozu. Ovaj primer pokazuje daje endogeni Tupi specifično inaktiviran pomoću proteinske interferencije.

11. Primena proteinske interferencije u biljaka

Mi smo demonstrirali proteinsku interferenciju u duvanskim BY2-ćelijama korišćenjem već transformisanih BY2-ćelija s nekoliko GFP-fuzijskih gena (navedeni geni su prikazani u tabeli 2). Lista navedenihArabidopsis thalianagena zajedno s njihovim odgovarajućim identifikovanim samoasocirajućim regionima i tango skorovima je prikazana u tabeli 2.

Specifične interferorske molekule za svaki od ciljeva u tabeli 2 su dizajnirane bazirano na veštačkom interferorskom molekulu koji je opisan u primeru 1, sem što je NusA protein promenjen pomoću crvenog fluorescentnog proteina (RFP) i što B-deo zatim sadrži specifične samoasocirajuće regione ciljeva koji su prikazani u tabeli 2.

Konstrukti koji kodiraju navedene specifične interferorske molekule su uvedeni u odgovarajuće vektore za pre-ekspresiju pomoću Gateway™ tehnologije (InVitrogen Life Technologies). Da se to postigne, razvijen je komplet Gateway kompatibilnih binarnih vektora za biljnu transformaciju. Za pre-ekspresiju korišćen je vektor pK7WGD2 u kojem je gen stavljen pod kontrolu p35S promotora. Za transformaciju biljnih ćelija primenjen je ternarni vektorski sistem. Kao ternarni verktor korišćen je plazmid pBBRlMCS-5.virGN54D. Binarni plazmid je uveden uAgrobacterium tumefacienssoj LBA4404 koji već nosi ternarni plazmid pomoću elektro-transformacije. Sveža BY-2 kultura je načinjena pre transformacije s konkretnim konstruktom. Pet dana stari BY-2 je inokuliran s 1:10 i rastao je tri dana (28°C, 130 rpm, tama). Tečna kulturaAgrobacterium tumefacienstransformisana je s pK7WGD2-GUS (kontrolni vektor), pK7WGD2-interferor 1 (npr. specifičan za aurora 1, pK7WGD2-interferor 2 (npr. specifičan za aurora 2) itd. je definisana dva dana pre tranformacije BY-2. Petljasta bakterija iz čvrstog medijuma je inokulisana u 5 ml tečnog LB medijuma s antibioticima (rifampicin, gentamicin, streptomicin i spektinomicin). Kultura je uzgajana dva dana (28°C, 130 rpm). Transformacija BY-2 je izvršena u praznom petri sudu (0 4,6 cm) s ko-kultivacijskim postupkom. Tri dana stari BY-2 (3 ml) je pipetiran na ploču pa je dodano bilo 50 ili 200 ul bakterijske suspenzije. Ploče su nežno promešane i ostavljene da stoje u komori s laminarnim tokom, u tami, tokom tri dana. Posle ko-kultivacije ćelije su nanesene na ploču na čvrsti BY-2 -medijum sa selekcijama (50 (ig/ml kanamicin, te 500 |ig/ml vankomicin i 500 ug/ml karbenicilin da se ubije višak bakterija). Ploče su zatvorene s Millipore trakom i inkubirane na 28°C u tami tokom aproksimativno dve sedmice posle čega kali postanu vidljivi. Efektivnost proteinske interferencije (ovde agregacija između GFP-konstrukta i RFP-konstrukta) je vizualizovana proverom ekspresije GFP, RFP i ko-lokalizacije GFP i RFP pod flourescentnim mikroskopom.

Sredstva i postupci koji se odnose naprimere 1 i 2

Konstrukti, ćelije i mediji

Interferorske molekule su klonirane u vektor pETM60 (poklonjeno od G. Stier, EMBL). Ovaj vektor je pod kontrolom RNK polimeraze T7 (T7 RNK polimeraza je pod kontrolom regulatornog elementa izE. colilac operona), omogućuje kanamicin rezistenciju i definiše neki N-terminalni ekspresijski tag od šest histidina nakon čega sledi NusA. Korišćena je serija preklapajućih oligoa koji kodiraju sekvencu interferorskog dela B da nastane određeni "veštački gen" pomoću PCR. Ovaj gen je ligiran u pETM60 putem Ncol i BamHl restrikcijskih mesta. Interferorski geni nastali su pomoću PCR od interferorskog dela B, korišćenjem dugačkog, anti-kodirajućeg oligo da se uključi sekvenca za fleksibilnu spojnicu i protein specifični samoasocirajući region ("mamac") na C-terminalu. Oni su ligirani u pETM60 putem Ncol i BamHl restrikcijskih mesta. Svi oligo nabavljeni su od Sigma-Genosvs, svi restrikcijski enzimi od Fermentas, a ligacije su izvršene korišćenjem Quick Ligation Kit firme Roche.

Hemijski kompetentne BL21 (DE3) ćelije su proizvedene u kućnoj proizvodnji i transformisane pomoću standardnih protokola. Priređene su standardne LB-agar ploče, te su sve agar ploče sadržavale 50 ug/mL kanamicina. Komplet M9 ploče su priređene dodavanjem standardnog M9 medijuma sa svih 20 aminokiselina (50 p.g/mL) i nukleotida adenina, guanina, uracila i ksantina (20 ug/mL). M9 odabrane ploče su bile identične M9 kompletima u svim sem jednoj aminokiselini. Da se izvrši kontrola na moguću aminokiselinsku degradaciju zbog skladištenja, ploče su priređene jedan dan pre upotrebe. LB je priređen tako da su se sledili standardni protokoli i kanamicin je uključen s 50 ug/mL. Sve aminokiseline su nabavljene od Sigma, kanamicin i IPTG od firme Duchefa.

Protokoli

BL21 (DE3) ćelije su transformisane s ekspresijskim konstruktima, nanesene na ploče LB-agar plus kanamicin i inkubirane na 37°C preko noći. Jedna kolonija je korišćena da se inokulira 10 mL LB plus kanamicin i ona je rasla preko noći na 37 °C, uz mućkanje. Sledećeg dana ova kultura je korišćena da se inokulira 10 mL LB plus kanamicin 1:100 i ostavljeno je da raste sve dok nije dobijen OD600 od 0.6. Kulture su podcijene na dvoje; IPTG (50 uM) je dodan jednoj kulturi da se indukuje interferorska ekspresija, te su obe kulture dalje inkubirane na 37°C tokom poželjnog vremena ekspresije. Ćelije su zatim sakupljene centrifugiranjem i isprane dva puta (resuspenzija i centrifugiranje) s rastvorom soli (0.85% w/v NaCl). Ćelije su zatim ponovo suspendovane u rastvoru soli da se dobije završni OD600 od 0.05, te je 200 uL ove suspenzije ćelija naneseno na agar ploče. Agar ploče su inkubirane na 37°C preko noći i rast kolonije je zabeležen sledećeg dana. Ako je bilo nužno, kolonije su bile ubodene sterilnom čačkalicom na svežim agar pločama.

Claims (17)

1. Molekul koji se ne nalazi u prirodi koji može da podreguliše funkciju nekog proteina, koji ima bar jedan P-agregirajući region koji je izložen okolini i izveden iz pomenutog proteina koji treba da bude podregulisan, pri čemu je navedeni P-agregirajući region fuzionisan s vrstom koja sprečava agregaciju navedenog p-agregirajućeg regiona,naznačen timešto se koristi kao medikament, a pomenuti dobijeni molekul sadrži - deo A koji se sastoji od nekog regiona, kao što je neki peptid, proteinska domena, protein ili agarozna čestica koji sprečava agregaciju dela B, i - deo B koji se sastoji od bar jednog P-agregirajućeg regiona i navedeni region je izveden iz pomenutog proteina koji treba da bude podregulisan.

2. Molekul za upotrebu prema patentnom zahtevu 1,naznačen timešto je navedena vrsta neki peptid, neka proteinska domena ili neka agarozna čestica.

3. Molekul za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2,naznačen timešto se navedeni P-agregirajući region sastoji od bar 5 naporednih aminokiselina.

4. Molekul za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 3,naznačen timešto se neka spojnica nalazi između navedenog P-agregirajućeg regiona i navedene vrste.

5. Molekul za upotrebu prema patentnom zahtevu 4,naznačen timešto je navedena spojnica neki polipeptid ili je ne-polipeptidne prirode.

6. Molekul za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 5,naznačen timešto je pomenuti molekul neki polipeptid koji je kodiran nukleotidnom sekvencom koja se nalazi u rekombinantnom vektoru i koja, nakon transformacije u ćeliju ili organizam, proizvodi navedeni polipeptid u navedenoj ćeliji ili organizmu.

7. Molekul za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 6,naznačen timešto se koristi za tretiranje karcinoma.

8. Molekul za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 6,naznačen timešto se koristi za tretiranje infekcije s patogenima.

9. Molekul koji se ne nalazi u prirodi,naznačen timešto sadrži bar jedan P-agregirajući region koji je izolovan iz neke proteinske domene koja je rastvorljiva u vodi pri čemu je navedeni P-agregirajući region izložen okolini i fuzionisan za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog beta-agregirajućeg regiona, a pomenuti molekul sadrži: - deo A koji se sastoji od nekog regiona, kao što je neki peptid, proteinska domena, protein ili agarozna čestica koji sprečava agregaciju dela B, i - deo B koji sadrži bar jedan P-agregirajući region i navedeni region je izveden iz nekog proteina s čijom funkcijom je u interferenciji.

10. Molekul prema patentnom zahtevu 9,naznačen timešto je navedena vrsta neki peptid, neka proteinska domena ili neka agarozna čestica.

11. Molekul prema patentnom zahtevu 9 ili 10,naznačen timešto su p-agregirajući region i vrsta koja sprečava agregaciju iz drugog proteina ili od istog proteina ali nisu u neposrednoj blizini u tome proteinu.

12. Rekombinantni vektor,naznačen timešto sadrži neki polinukleotid koji kodira neki polipeptid prema bilo kojem od zahteva 9 do 11.

13. Molekul ili vektor, prema bilo kojem od zahteva 9 do 12,naznačeni timešto se koriste kao medikament.

14. Postupak koji služi da se izoluje neki protein iz uzorka,naznačen timešto uključuje kontakt navedenog uzorka s nekim molekulom koji sadrži bar jedan p-agregirajući region koji je izložen okolini i izolovan iz pomenutog proteina, pri čemu je navedeni p-agregirajući region fuzionisan za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog p-agregirajućeg regiona, te izolovanje dobijenog kompleksa ko-agregirani molekul-protein iz navedenog uzorka, a dobijeni molekul sadrži: - deo A koji sadrži neki region, kao što je neki peptid, proteinska domena, protein ili agarozna čestica koji sprečavaju agregaciju dela B, i - deo B koji sadrži bar jedan P-agregirajući region pri čemu je navedeni region izveden iz pomenutog proteina koji treba da bude izolovan.

15. Postupak prema patentnom zahtevu 14,naznačen timešto je navedena vrsta neki peptid, neka proteinska domena ili neka agarozna čestica.

16. Postupak prema patentnom zahtevu 14 ili 15,naznačen timešto takođe uključuje otkrivanje nekog proteina u navedenom uzorku.

17. Postupak za podregulisanje biološke funkcije nekog proteina koji uključuje kontakt pomenutog proteina s molekulom koji se ne nalazi u prirodi koji sadrži bar jedan p-agregirajući region koji je izložen okolini, nalazi se u pomenutom proteinu i fuzionisan je za vrstu koja sprečava agregaciju navedenog beta-agregirajućeg regiona,naznačen timešto se ne vrši u ljudi ili životinja, a pomenuti molekul sadrži: - deo A koji sadrži neki region, kao što je neki peptid, proteinska domena, protein ili agarozna čestica koji sprečavaju agregaciju dela B, i - deo B koji sadrži bar jedan p-agregirajući region pri čemu je navedeni region izveden iz pomenutog proteina koji treba da bude podregulisan.