RO136022A0 - Compoziţie fitoterapeutică pe bază de extract gemoterapic de corylus avellana îmbogăţit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine destinat fibrozei hepatice în diabetul zaharat şi metodă de obţinere aacesteia - Google Patents
Compoziţie fitoterapeutică pe bază de extract gemoterapic de corylus avellana îmbogăţit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine destinat fibrozei hepatice în diabetul zaharat şi metodă de obţinere aacesteia Download PDFInfo
- Publication number
- RO136022A0 RO136022A0 ROA202200328A RO202200328A RO136022A0 RO 136022 A0 RO136022 A0 RO 136022A0 RO A202200328 A ROA202200328 A RO A202200328A RO 202200328 A RO202200328 A RO 202200328A RO 136022 A0 RO136022 A0 RO 136022A0
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- chrysin
- extract
- cyclodextrin
- nanocomplexes
- corylus avellana
- Prior art date
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unei compoziţii farmaceutice pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogăţit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine destinat fibrozei hepatice în diabetul zaharat. Procedeul, conform invenţiei, constă în etapele de: obţinere a extractului gemoterapic de Corylus avellana din muguri de alun în stare proaspătă în solvent amestec de glicerină-alcool etilic 96% vol (1:1), prin extracţia la rece, prin macerare, timp de 20 zile, la un raport 1:20 plantă-solvent, formularea complexelor de incluziune crisină-ciclodextrină, amestecarea extractului gemoterapic de alun cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine şi liofilizarea amestecului, rezultând o compoziţie fitoterapeutică având proprietăţi anti-fibrotice hepatice.
Description
RO 136022 AO
OFICIUL de stat pentru invenții Șl MĂRCI Cerere de_brevet de Invenție
DESCRIEREA INVENȚIEI
Titlul invenției: Compoziție fitoterapeutică pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine destinat fibrozei hepatice în diabetul zaharat si metodă de obținere a acesteia
Domeniul tehnic la care se referă invenția:
Prezența invenție se referă la o nouă compoziție fitoterapeutică pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine destinat fibrozei hepatice în diabetul zaharat si metoda de obținere a acesteia
Stadiul tehnicii:
Ciroza hepatică și diabetul zaharat (DZ) sunt două boli cronice cu impact semnificativ asupra calității vieții. DZ are o prevalență globală estimată de aproximativ 9%, iar până în 2030, la nivel global 300-400 de milioane de oameni vor fi afectați [1], rezultând o încărcătură economică și socială semnificativă [2, 3]. Scăderea toleranței la glucoză este observată la aproximativ 80% dintre pacienții cu ciroză, în timp ce 30-60% dintre pacienții cu ciroză avansată dezvoltă diabet [4], Dovezile cumulate ale rezultatelor cercetărilor efectuate până în prezent sugerează că diabetul [5], rezistența la insulină [6, 7] și nivelul de glucoză din sânge [8] sunt asociate cu progresia fibrozei hepatice la pacienții cu boli hepatice cronice. Puține studii au evidențiat impactul DZ de tip 2 asupra rezultatelor clinice ale cirozei. în mai multe analize retrospective transversale ale pacienților cu ciroză, DZ a conferit un risc mai mare de complicații [9, 10]. Mai mult, studiul Verona, care a înrolat > 7000 de indivizi cu DZ de tip 2, a generat un risc de mortalitate pe 5 ani de 2,52 ori (IC 95%: 1,96-3,2) mai mare raportat la riscul general populațional [11].
Fibroza hepatică este un răspuns cicatricial reversibil la leziunile hepatice și, în cele din urmă, duce la ciroză, asociată cu formarea de noduli și contracție de organ[12]. Formarea cicatricilor fibroase este caracterizată prin acumularea progresivă a unei matrici extracelulare modificate calitativ (ECM) care este îmbogățită excesiv în colagen fibrilar de tip I și III și este ascociată cu scăderea remodelării matricei [13], Acesta modificare a matricii este însoțită de o angiogeneza alterată, ducând în cele din urmă la modificări structurale severe caracteristice cirozei hepatice.
Procesul de fibrogeneză este condus de o populație celulară heterogenă (celule asemănătoare miofibroblastelor) care sunt implicate în patogeneza fibrozei hepatice: celule hepatice stelate, fibroblaste portale, celule stern mezenchimale derivate din măduva osoasă, hepatocite și celule epiteliale biliare, fibrocite. în timpul progresului fibrogenezei, celulele stelate hepatice (HSC), care în stare normală sunt în repaus și stochează vit. A, se activează, urmată de eliberarea de citokine și chemokine, care induce transdiferențierea lor în celule asemănătoare miofibroblastelor [13]. Acest pas este marcat de expresia crescută α-SMA și procolagen-I, ducând în final la o producție crescută și acumulare de componente ale matricei extracelulare, inclusiv colagen. Factorul de creștere transformator-βΐ (TGF-βΙ) produs de celulele Kupffer, celulele endoteliale și hepatocite a fost recunoscut ca un activator cheie al HSC în patogeneza fibrozei hepatice și acționează prin activarea căii de semnalizare Smad [14], în stare normală, matricea poate fi degradată de o varietate de enzime, dar în primul rând de metaloproteinaze de degradare a matricei (MMP). MMP-urile activate sunt inhibarea^de-Qătre inhibitorii extracelulari cheie, inhibitorii tisulari ai metido^^îna^CT^ (TliVn^îhÎij^âÂif sănătos raportul TIMP-MMP este echilibrat, matricea ^xtmcel degiadafă-șiLastfel^hu se acumulează cplagehprovocâhdfibroză. în schimbi ^dup^ hepatică, echilibrul TIMP-MMP este perturbat, iar TIMP-urile sunt supraexprimate, contribuind la depunerea ECM și la dezvoltarea fibrozei [14]. Expresia și secreția TIMP-1 este strâns legată de activarea HSC, în ceea ce privește numărul de celule activate și fibrogeneza, și rămâne la niveluri ridicate în timpul progresiei fibrozei. Expresia TIMP este, de asemenea, reglată de citokine și factori de creștere. Legarea TIMP-urilor de MMP-urile active pare să provoace depunerea ireversibilă a ECM, ceea ce duce la fibroză. Mormone și colab. [15] a rezumat schematic conceptele cheie implicate în patogenia moleculară a fibrozei hepatice (Fig. OVnuMt.
Stelknv cea
TIMPI
MMPVia
IM RamoțMng
Fibrosis
Figura 1: Concepte cheie implicate în activarea celulelor stelate hepatice și patogeneza fibrozei hepatice [15]
Prin urmare, strategiile terapeutice pentru a furniza agenți anti-fibrotici puternici care să aibă ca țintă citokine specifice sau alte biomolecule implicate în progresia fibrozei, capabile să prevină, să întârzie sau să inverseze progresia fibrozei hepatice înainte de stadiul final al cirozei, sunt o provocare.
Gemoterapia este o ramură a fitoterapiei care folosește țesuturile biologice găsite în muguri, îmbogățite în vitamine, oligoelemente, minerale, acizi nucleici și hormoni de creștere comparativ alte țesuturi vegetale [2216]. în plus, gemoterapia conține și alte substanțe active (cum ar fi giberelinele și auxinele) care se pierd dacă o plantă este lăsată să ajungă la o etapă ulterioară a ciclului său de creștere înainte de recoltare [2317]. Țesutul embrionar proaspăt este prelevat primăvara, în cea mai activă fază a ciclului de creștere, pentru a asigura cea mai mare concentrație de substanțe biologic active. Preparatele gemoterapice sunt produse sub formă de amestec glicero-alcoolice pentru a asigura întregul profil al tuturor ingredientelor bichimice extrase și concentrate. Alcoolul extrage toate principiile active ca alcaloizi, heterocite și glicozide. Glicerina extrage toate uleiurile esențiale, fenolii și flavonoidele.
Corylus avellana (alun comun) este cunoscut a fi bogat în minerale și vitamine, inclusiv alfatocoferol, acid ascorbic, folați, niacină, riboflavină, tiamină și vitamina K sub formă de filochinonă; acizii grași și aminoacizii includ alanina, arginina, acidul aspartic, acidul glutamic și leucina [18, 19]. Uleiul conține acizi grași saturați (7%), acizi grași mono- (78%) și polinesaturați (10%) și fitosteroli (0,1%) [20]. în ulei se găsesc acizi grași oleic, linoleic, linolenic, palmitoleic și steric [18]. Acidul Caffeoylquinic, acidul caffeoyltartaric, acidul coumaroyltartaric, miricetina, quercetina și fenolii kaempferol se găsesc în frunzele de alun [21], Cercetări recente au arătat că Corylus avellana este capabil să producă paclitaxel [21] și taxol [22] și exercită activitate antioxidantă și de captare a radicalilor [23-25]. Rezultatele unui studiu clinic au arătat că suplimentarea dietei cu alune de pădure 1 g/kg greutate corporală/zi a redus lipoproteinele cu densitate mică și colesterolul total și a crescut lipoproteinele cu densitate mare și trigliceridele [26]. Până în prezent, nici un articol științific sau un brevet de invenție era
en xpe nu a raportat vreo activitate biologică a extractului gemoterapic Coryl & Nicoletti [16], în monografia gemoterapia, au menționat beneficiul ge ^ȚȘ^bejile hepatice, cu accent în fibroza hepatică, evidențiată dițf e edjefloțȚÎ w^e, dar trebuie argumentâtă în âonritta rezultate
RO 136022 AO ev
Crisina (5,7-dihidroxiflavona) este componenta activă majoră a mierii, propolisului și multor extracte din plante. Valoarea medicinală a crisinei a fost recunoscută. Prezintă activități antiinflamatorii [27], anticancerigene [28], cardioprotectoare [29] și antioxidante [30],
Expunerea detaliată a invenției:
1. Obținerea extractului gemoterapic de Corylus avellana
1.1. Recoltarea materialului vegetal’. Mugurii de Alun, Corylus avellana L. se recoltează în lunile februarie-martie, când mugurele încă nu s-a deschis, dar este în stadiul de dezvoltare maximă înainte de a se deschide.
1.2. Conservarea materialului vegetal: Masa vegetală se conservă în amestec glicerină - alcool etilic 96 % voi. (1:1). 1 parte de material vegetal mărunții se amestecă cu 1 parte amestec glicerină - alcool etilic 96 % voi. (1:1). Se omogenizează amestecul astfel ca materialul vegetal să fie în contact cât mai bun cu solventul. Acest amestec de material vegetal și solvent se poate păstra la temperatura camerei maxim 6 luni de zile.
1.3. Obținerea maceratului glicerinic.
Extractul din muguri de Alun se obține conform Farmacopeei Franceze respectiv Farmacopeei Europene, monografia 2.1.3, folosind ca și solvent amestec de glicerină - alcool etilic 96 % voi. (1:1). Planta se prelucrează în stare proaspătă, conservată în amestec de solvent. Din planta mărunțită la o consistenă de pastă se prelevează probă pentru determinarea umidității. în funcție de umiditate se calculează raportul de extracție, care este 1:20 partea uscată din plantă - solvent. Extracția se realizează la rece, prin macerare, timp de 20 zile, cu agitări zilnice 2x10 minute. După 20 zile de agitare lichidul se decantează de pe masa de material vegetal, care ulterior se supune presării la 350-400 atm, iar lichidul presat este amestecat cu lichidul decantat. Soluția extractivă astfel obținută este extractul gemoterapic din muguri de Alun (CAG).
2. Obținerea si caracterizarea nanocomplexelor de crisina/ciclodextrine
2.1. Prepararea complexelor crisină-ciclodextrine. Crisina a fost formulată cu două βciclodextrine diferite pentru a forma complexe de incluziune cu hidroxipropil- (HPBCD) și ramdomly metilat (RAMEB) β-ciclodextrine la raporturi molare 1:1.
2.2. Testul de solubilitate. Complexele au fost testate pentru solubilizare în apă. Complexele au fost dizolvate în apă timp de 24 de ore și spectrele de absorbție au fost înregistrate cu spectrofotometru UV.
Tabelul 1. Valorile concentrației și creșterea solubilității crisinei în apă prin complexarea ciclodextrinei (n.d. — nedeterminat) (n = 3). CD: -ciclodextrină, HPBCD: hidroxipropil ciclodextrină, RAMEB: - ciclodextrină metilată aleator (ramdomly)
Crisina in H2O | Crisina:RAMEB | Crisina:HPBCD | |
Raport molar complexe | - | 1:1 | 1:1 |
Concentrația de crisina (ug/ml) | 1,01 | 7,48 0,15 | 5,72 0,28 |
Creșterea solubilității | 1 | 7,41 | 5,22 |
2.3. Testul de solubilitate de fază a fost efectuat prin adăugarea unei cantjtăț cunoscute d^putbdreȚdc crisină. Au fost realizate concentrații crescâtoar ciclodextroie
*BCD (5-80 mM).,Tubtțr^ timp
pentru a obține dispersii bine amestecate (temeratura camerei, întuneric). După 72 de ore, fiecare probă a fost centrifugată la 15.000 rpm timp de 10 minute.
Probele au fost preluate din supematantul clar, iar conținutul de crisină al probelor a fost analizat prin spectrofotometrie (Shimadzu UV-1900). Profilurile de solubilitate de fază ale crisinei au fost realizate de trasând solubilitatea crisinei față de concentrația ciclodextrinelor. Constanta de stabilitate (Ks) ale complexelor crisină-CD au fost calculate din diagrame de solubilitate de fază conform următoarei ecuații:
slope %(l-slope)
S0 — Solubilitatea crisinei în apă
Eficiența complexării (CE) și raportul molar medicament:ciclodextrina (D: CD) au fost calculate după cum urmează:
< r -ȘL, 11 slope i
D:CD 1 : (U
Figura 1. prezintă profilurile de solubilitate ale crisinei în prezența RAMEB și HPBCD. Datorită solubilității limitate în apă a CD, cea mai mare concentrație aplicată a fost de 8 mM. Fiecare derivat de ciclodextrină a reușit să îmbunătățească solubilitatea în apă a crisinei în complexe de ciclodextrină, în mod dependent de concentrație.
CD concentrabon (mM)
Figura 1. Diagramele de solubilitate de fază ale crisinei cu (A) RAMEB, (B) HPBCD Constantele de stabilitate (Ks) ale complexelor crisină-ciclodextrină au fost calculate din datele de solubilitate de fază (tabelul 2).
Tabelul 2. Eficiența complexării (CE), constantele de stabilitate (Ks) și raportul molar medicament: ciclodextrină (D: CD) a complexelor crisină - ciclodextrină (n = 3).
Cyclodextrins | Ks (M-1) CE D:CD |
RAMEB | 1200 0.0048 ± 6.9 x 105 1:209 ±3 |
HPBCD | 760 0.003 ± 7 x 10-5 1:332 ±2 |
2.4. Microscopie electronică scanning (SEM)
Morfologia particulelor solide de ciclodextrine, crisină și complexe crisină-ciclodextrină a fost investigată prin SEM (Hitachi S-4300 CFE).
Morfologia crisinei pure si a complexelor de crisină-ciclodextrine au fost examinate prin SEM (Figura 23). Crisină brută a prezentat particule agregate cu diferite forme și cu un spectru larg al dimensiunii particulelor. Particulele HPBCD au prezentat o formă sferică, în timp ce imaginili crisinaQ' de cqffirf (JVțEB au arătat că majoritatea particulelor sferice au fost sparte. Co ^D^u^isină-RAMEB au prezentat o morfologie complet diferită. Dugă'pț^^Î ^oăraailele originale de ciclodextriii^ și crisțnă au fost neidentificab/ to&țg gatew’care conțin particule ^niorfe njaî 'duceau dezvăluit interacțiunea
d. C
crisină și ciclodextrine. Noua structură formată contribuie la o solubilitate mai mare și la biodisponibilitatea îmbunătățită a crisinei (vezi Anexa Desene si Planșe - Planșa 1).
3. Obținerea compoziției fitoterapeutice pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine și evaluarea profilului fitochimic al acestuia
3.1. Metodă de obținere si de analiză pentru evaluarea conținutului de polifenoli
Extractul de gemmoterapic de Coryllus avelana a fost amestecat atât cu complexe RAMEB-, cât și cu HPBCD-crisină și a fost supus liofilizării. S-au testat diferite rapoarte de extractcomplex pentru stabilizarea amestecului prin liofilizare. Cantitatea exces de ciclodextrină a fost, de asemenea, testată pentru stabilizare.
Analiza LC/MS se realizează cu un sistem cromatografic Shimadzu Nexera I LC/MS - 8045 (Kyoto, Japan), care este un system UHPLC echipat cu pompă cuatemară și un spectrometru de masa cu cvadrupoli și ionizare prin pulverizare electronica (ESI).
Seprarea se realizează pe o coloană Luna CI 8 cu fază inversă (150 mm x 4.6 mm x 3 fm, 100 Â), de la Phenomenex (Torrance, CA, USA). Temperatura de operare a coloanei trebuie să fie de 40°C.
Pentru separarea a cât mai mulți polifenoli se folosește un gradient de fază mobilă (tabel 1), folosind methanol (Merck, Darmstadt, Germania), apă ultrapurificată preparată cu un sistem Simplicity Ultra Pure Water Purification System (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) și acid formic, ca și modificator organic (Merck, Darmstadt, Germania). Solvenții folosiți au fost de puritate LC/MS. Faza mobilă trebuie să fie trecută prin coloana cromatografică cu o viteză de 0,5 ml/min, iar timpul total de analiză a fost de 35 minute.
Tabel 3
Timp, min | Metanol | Apă ultrapurificată | acid formic 2 % în apă ultrapurificată |
0.00 | 5 | 90 | 5 |
3.00 | 15 | 70 | 15 |
6.00 | 15 | 70 | 15 |
9.00 | 21 | 58 | 21 |
13.00 | 21 | 58 | 21 |
18.00 | 30 | 41 | 29 |
22.00 | 30 | 41 | 29 |
26.00 | 50 | 0 | 50 |
29.00 | 50 | 0 | 50 |
29.01 | 5 | 90 | 5 |
35.00 | 5 | 90 | 5 |
Detecția componentelor se realizează cu un spectrometru de masă cu cvadrupoli având sursa de ioni cu electrospray (ESI). Pentru monitorizarea reacțiilor multiple (MRM), pentru detectarea cu sensibilitate maximă, se folosește atât modul negativ cât și modul pozitiv de detectare. Temperatura interfeței a fost de 300°C, gazul de uscare a fost azotul la 35 psi, 10 1/min, iar potențialul de capilar a fost setat la +3000 V.
Ca și standarde se folosesc polifenolii din tabelul 5. în cazul fiecărui standard, la fiecare concentrație s-au injectat câte 1 Π1. Identificarea s-a realizat prin compararea timpilor de retenție, a spectrelor de masa respectiv a tranzițiilor principale din aceste spectre a substa
standard cu cele ale compușilor separați din probele/analizate. Determinările cantiț realizat curbelor de calibrare a fiecărei substanțe standard, la nivel princj de
it șens pentru fiecare standard s-a detprtt^ de detecție re ^|^abelul 3 sunt date detaliile din spectrele de'smasă.
Extractele de Corylus avellana MG și cele îmbogățite cu crizină pe ciclodextrină s-au diluat cu metanol, identic cu cel folosit la analiza LC/MS, în raport 1 la 10. Soluțiile diluate s-au trecut prin microfilter de 0,45 Dm (Merck Millipore, Billerica, MA, USA).
Tabel 4
Standardul și originea sa | Intervalul de concentrații mg/ml | Ecuația curbei de calibrare | Factorul de corelație | Limita de detecție, □ g/ml | Limita de cuantificare, □ g/ml |
Acid clorogenic (Phytolab, V estenbergsgreuth, Germania) | 0.13- 1.30 | Are a = 2*108*conc[mg/ml] 269699 | 0.9997 | 5.00 | 8.00 |
Acid galic (Phytolab, Vestenbergsgreuth, Germania) | 0.107-1.070 | Area = 8 * 106*conc[mg/ml] -37131 | 0.9999 | 1.90 | 2.80 |
Acid salicilic (Merck, Darmstadt, Germania) | 0.16-1.60 | Area = 4* 107*conc[mg/ml] + 44120 | 0.9997 | 1.50 | 2.00 |
Apigenină (Phytolab, Vestenbergsgreuth, Germania) | 0.10-0.98 | Area = 2 * 108 * conc [mg/ml] + 15916 | 0.9999 | 0.20 | 0.30 |
Catechinâ (Merck, Darmstadt, Germania) | 0.101 - 1.010 | Area = 5 * 106* conc [mg/ml] - 1706 | 0.9984 | 1.00 | 2.00 |
Crizină (Merck, Darmstadt, Germania) | 0.10-1.00 | Area = 1 * 108*conc[mg/ml] - 82818 | 0.9997 | 3.00 | 5.00 |
Cvercetină (Phytolab, Vestenbergsgreuth, Germania) | 0.09-0.91 | Area = 5*107*conc[mg/ml] -9556 | 0.9964 | 0.80 | 1.10 |
Hiperozidă (Phytolab, V estenbergsgreuth, Germania) | 0.012-0.107 | Area = 4*108*conc[mg/ml] -567182 | 0.9986 | 0.60 | 0.90 |
Luteolin-7-Οglucozidă (Phytolab, V estenbergsgreuth, Germania) | 0.07 - 0.70 | Area = 1 * 109*conc[mg/ml] -700317 | 0.9990 | 3.00 | 4.00 |
Naringenină (Phytolab, Vestenbergsgreuth, Germania) | 0.16-1.60 | Area = 3 * 108* conc [mg/ml] -43443 | 0.9999 | 0.60 | 0.90 |
Rutozidă (Phytolab, Vestenbergsgreuth, Germania) | 0.17-1.70 | Area = 2* 108*conc[mg/ml] - 191937 | 0.9996 | 4.00 | 6.00 |
Tabel 5
Standardul | Timp de retenție, min | m/z, și tranziția principală | MRM | Alte tranziții |
Acid clorogenic | 12.0 | 3530191.0 | Negativ | |
Acid galic | 7.0 | 168.9>125.0 | Negativ | |
Acid salicilic | 23.5 | 137093.0 | Negativ | 137075.0 137065.0 |
Apigenină | 28.2 | 269.0>l 17.0 | Negativ | |
Catechină | 10.3 | 2890202.9 | Negativ | |
Crizină | 29.7 | 2530143.0 | Negativ | 2530119.0X1' 253O107/0.xl |
CvercetinăX'f; a . | 25.7 | 3000151.0 | \ Negativ | 3000121() |
Hiperozj4ă+/X- .. | 20.3 | ; 463.1 >300.0 . | ) Negativ | 463.1>3fbl< |
Luteolin- 7-O-glucozidă | 19.9 | 447.0>284.9 | Negativ | |
Naringenină | 26.3 | 271.0>l 19.0 | Negativ | 271.0>107.0 |
Rutozidă | 20.3 | 609.0>300.0 | Negativ | 609.0>301.0 609.0>271.0 |
Codificarea probelor:
EGMA_02.2019 = Corylus avellana MG seria din februarie 2019
EGMA_03.2019 = Corylus avellana MG seria din martie 2019
EGMA_01.2020 = Corylus avellana MG seria din ianuarie 2020
EGMA 02.2020 = Corylus avellana MG seria din februarie 2020
CARAMEBCHRPEG = Corylus avellana MG + RAMEB + CHR-RAMEB complex + Polietilen-glicol
CA_HPBCD_CHR_PEG = Corylus avellana MG + HPBCD + CHR-HPBCD complex + Polietilen-glicol
CA_RAMEB_CHR = Corylus avellana MG + RAMEB + CHR-RAMEB complex
CA_HPBCD_CHR = Corylus avellana MG + HPBCD + CHR-HPBCD complex în Planșele 2, 3 și 4a si 4b sunt prezentate cromatogramele LC/MS, spectrele de masă și curbele de calibrare obținute pentru standarde (vezi Anexa Desene si Planșe - Planșa 2-4).
în Planșele 5-12 sunt prezentate cromatogramele LC/MS ale probelor studiate (vezi Anexa
Desene si Planșe - Planșa 5-12).
In Planșele 13 - 20 spectrele de masa ale polifenolilor identificați și cuantificați (vezi Anexa Desene si Planșe - Planșa 13-20).
Rezultatele datelor determinărilor cantitative sunt prezentate în Tabelul 6.___________________
Standard | Proba (mg/ml) | |||||||
EGMA 02.2019 | EGMA 03.2019 | EGMA 01.2020 | EGMA_02.2020 | CARĂMEB CHRPEG | CAHPBCDCHRPEG | CARAMEBCHR | CAHPBCDCHR | |
Acid clorogenic | 0,360 ±0,0111 | 0,360 ±0,0178 | 0,430 ±0,0354 | 0,340 ±0,0327 | 0,041 ±0,0041 | 0,021 ±0,0042 | 0,064 ±0,0045 | 0,016 ±0,0041 |
Acid galic | 0,080 ±0,0054 | 0,070 ±0,0082 | 0,070 ±0,0082 | 0,080 ±0,0082 | ||||
Acid salicilic | 0,040 ±0,0111 | 0,070 ±0,0082 | 0,060 ±0,0082 | 0,011 ±0,0026 | ||||
Apigenină | 0,003 ±0,0005 | 0,002 ±0,0005 | ||||||
Catechină | 0,160 ±0,0227 | 0,100 ±0,0041 | 0,190 ±0,0327 | 0,130 ±0,0205 | 0,016 ±0,0033 | 0,014 ±0,0041 | 0,025 ±0,0073 | |
Crizină | 0,100 ±0,0041 | 0,090 ±0,0041 | 0,090 ±0,0041 | 0,090 ±0,0041 | 5,775 ±0,1310 | 5,273 ±0,1219 | 5,830 ±0,0942 | 5,948 ±0,2796 |
Cvercetină | 0,020 ±0,0037 | 0,080 ±0,0094 | 0,110 ±0,0178 | 0,070 ±0,0082 | ||||
Hiperozidă | 2,000 ±0,0653 | 2,000 ±0,0653 | 2,270 ±0,0425 | 2,030 ±0,0525 | 0,295 ±0,0525 | 0,145 ±0,0262 | 0,505 ±0,0374 | |
Luteolin-7O-glucozidă | 0,070 ±0,0056 | 0,070 ±0,0082 | 0,070 ±0,0082 | 0,070 ^0,0082 | 0,007 ±0,0005 | 0,007 ±0,0008 . | 0,007 | |
Naringenină | 0,020 | 0,020 >H>,0041 | 0,020 ±0,0041 | 0,030 . ±-0,0047 | 0,002 ±0,0005 | 0,001Z' ±0,0p05/< | <1MO3 ^,0Q05 |
Rutozidă | 0,580 ±0,0535 | 0,600 ±0,0455 | 0,570 ±0,0785 | 0,580 ±0,0838 | 0,082 ±0,0049 | 0,044 ±0,0056 | 0,145 ±0,0241 |
4. Testarea in vitro a proprietăților antifibrotice ale compoziției fitoterapeutice pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine
Evaluarea in vitro a activității anti-fibrotice a complexelor extract gemoterapic de alun crisină/RAMEB și extract gemoterapic de alun -crisină/HPBCD, prin analiza expresiei markerului pro-fibrotic TGF-βΙ, atât la nivel genic, cât și proteic. A fost analizată expresia markerului fibrotic TGF-βΙ in celule hepatice stelate (HSC) din linia celulară LX2. în HSC latente, expresia TGF-βΙ a fost redusă la nivel proteic (Fig la) și genic (Fig 1b), însă în urma activării prin stimulare cu TGF-βΙ, expresia acestui marker a fost crescută (Fig 1B). Tratamentul cu ambele complexele investigate, CAG-CHR/Cyclo, a redus semnificativ expresia TGF-βΙ față de controlul activat, ceea ce indică eficiența complexelor de a inhiba calea de semnalizare ΤΟΕ-βΙ/ΞΜΑϋ și implicit, activarea HSC. Complexul CAG-CHR/RAMEB sa dovedit a fi mai eficient decât CAG-CHR/HPBCD în a induce reversia celulelor HSC activate către o stare de latență. Rezultatele au fost confirmate și la nivelul expresiei genice TGF-βΙ. în urma administrării celor două tipuri de complexe, nivelul expresiei a fost statistic semnificativ redusă față de controlul activat, cu un nivel de semnificație statistică mai mare în cazul complexului cu RAMEB (p<0.01) față de HPBCD (p<0.05). {Planșa 21).
5. Testarea in vivo a proprietăților antifibrotice ale compoziției fitoterapeutice pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine un conținut de crisină
Protocolul experimental a fost aprobat de Comitetul de Etică a Cercetării din Universitatea de Vest Vasile Goldis (152/02.10.2019).
Pentru experiment au fost utilizați șoareci masculi CD 1 din biobaza Universității de Vest Vasile Goldiș din Arad. Șoarecii au fost injectați, ip, cu o singură doză de streptozotocină (STZ; 65 mg kg-1 greutate corporală), solubilizată în tampon citrat (50 mM, pH 4,5) pentru a induce diabetul zaharat. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate după 4 ore de inaniție, folosind un glucometru. După administrarea STZ, șoarecii cu un nivel de glucoză din sânge mai mare de 2,5 gl-1 timp de două săptămâni consecutive au fost considerați șoareci cu diabet de tip 2 și incluși în studiu. Animalele cu diabet confirmat au fost tratați intraperitoneal (ip) cu CCI4 dizolvat în ulei de măsline (20% v/v, 2 ml/kg), de două ori pe săptămână, timp de 7 săptămâni, și sacrificați la șaptezeci și două de ore după ultima injecție pentru confirmarea fibrozei hepatice (Lotul 2). Rezoluția spontană a fibrozei hepatice a fost investigată la animalele diabetice tratate cu CCI4 după două săptămâni de recuperare (Lotul 3). Pentru a evalua efectul antifibrotic al produsului combinat extract gemmoterapic Coryllus ave/ana-nanocomplex CHR/cyclo, tratamentul a început la sfârșitul celor 7 săptămâni de tratament cu CCI4, utilizând administrarea prin gavaj zilnic timp de 14 zile consecutive a următoarelor: extract gemoterapic Coryllus ave/ana-crisina/ciclodextrine (CAG-CHR/Cyclo - Lotul 4), extract gemmoterapic Coryllus avelana (CAG - Lotul 5), nanocomplex de crisină/ciclodextrină (CHR/Cyclo - Lotul 6) și crisină pură (CHR - Lotul 7). Toate produsele conțin 100 mg/kg de crisină. Șoarecii aparținând lotului 1 (martor -a.sanatos, b.diabetic), 2 (șoareci fibrotici) și 3 (rezoluția de novo a fibrozei) li s-au administrat vehiculele grupelor tratate. Animalele au fost sacrificate la 24 de ore sub anestezie după ultima doză administrată (loturile 1, 3, 4, 5, 6, 7).
Analiza histologică a ficatului lotului martor a indicat o arhitectură lobulară normală cu vena centrolobulară și cordoane de hepatocite radiare, fără o proliferare a țesutului intralobular (Plansa22-Vla) si o ușoară dilatare a capilarelor sinusoide (Planxa^ÎVÎb^ \ Probele de ficat din lotul CCI4 au prezentat modificări severe ale morfologiei, evide^iie^^^î \ de colșgeny-ftyrnarea de pseudolobuli și infiltrarea fie celule inflamatorii în zonele i hepafjc^^&^fehrenea, se observă numeroase hepatocitecu steatoză micro- și Ϊ j itu \U\TsrlZ / 8·^^ /— ϋ\' și congestia capilarelor sinusoide (Planșa 22-V2). Se remarcă prezența „hepatocitelor spumoase” (foamy) perivenulare hipertrofiate cu acumulare masivă de grăsime microveziculară. După două săptămâni de recuperare de novo, în lipsa unui tratament de recuperare, se observă prezența semnificativă a țesutului fibros și a pseudo-lobulilor, acompaniate de infiltrate de celule inflamatorii, comparativ cu grupul CCk (Fig.8-V3). Hepatocitele hipertrofiate cu citoplasmă spumoasă sunt prezente. In cazul grupului de șoareci tratați timp de 2 săptămâni cu extract gemmoterapie Coryllus avelana (Planșa 22-V5), nanocomplex de crisină/ciclodextrină (Planșa 22-V6), după instalarea fibrozei, ariile fibrotice au fost reduse (insulare), comparativ cu cele înregistrate în cazul grupului CCI4. Infiltrate inflamatorii în ariile perivasculare se păstrează si de asemenea si congestia sinusoidelor. Microsteatoza hepatică este prezentă la aceste loturi. Șoarecii cărora li s-a administrat extract gemoterapic Coryllus ave/awa-crisina/ciclodextrine au prezentat o histo-arhitectură apropiată de cea a martorului si peste grupul VIb - control diabetic (Planșa 22-V4). Cea mai slaba recuperare structurală s-a înregistrat pentru șoarecii cărora li s-a administrat doar crisină pură (Planșa 22-V7). Formarea septelor fibrotice perilobulare si pseudolobulilor a fost confirmată în colorație tricromică pentru lotul V2 (Planșa 23-V2) și în egală măsură la lotul de reversie de novo a fibrozei (Fig.9-V3). Colagen insular se mai evidențiază la administrarea CHR pur (fig.9V7), mai puțin la CHR/Cyclo (Planșa 23-V4), a CAG (Planșa 23-V5) unde septele sunt întrerupte iar colagenul apare mai mult pericentrolobular, si sporadic la grupul tratat cu CAGCHR/Cyclo, comparabil cu martorii sănătos si diabetic (Plansa-V6).
BIBLIOGRAFIE
[1] Sudharsanan N. et al., 1990-2008. PopulationHealthMetrics, 2015,13(1 ):33; [2] GBD2015 The lancet, 2016, 388:1459-1544; [3] NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). The Lancet, 2016, 387(10027): 1513-1530; [4] Garcia-Compeăn D. et al. Ann Hepatol, 2012, 11:240-248; [5] Musso G. et al. JAMA Internai Medicine, 2017, 177(5):633-640; [6] Petta S. et al. Am J Gastroenterol, 2008, 103(5):1136-1144; [7] D’Souza R. et al. Insulin resistance plays a significant role in liver fibrosis in chronic hepatitis C and in the response to antiviral therapy. Am J Gastroenterol, 2005, 100(7): 1509-1515; [8] Ratziu V. et al. J Hepatol, 2003, 39(6): 1049-55; [9] Harrison S. A. J Clin Gastroenterol, 2006, 40(1 ):68-76; [10] Li X. et al. BioMed Res Int, 2019:5308308; [11] Trombetta M. et al. Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 2005, 22(2):24-27; [12] Friedman S.L. Toxicology, 2008, 254(3): 120-129; [13] Mallat A., Lotersztajn S. Am JPhysiol Cell Physiol, 2013, 305:C789-C799; [14] Iredale J.P. et al. Biochim. Biophys. Acta, 2013, 1832(7):876-883; [15] Mormone E. et al. Chemicobiological interactions, 2011, 193(3):225-231; [16] Pitera Di Clima F.P., Nicoletti M., Gemmoterapia - Fondamenti scientifici della moderna meristemoterapia, Ed. Nova Ipsa, Ed.2, 2016-2018, ISBN 978-88-7676-693-0; [17] D. Surcel, S. Soescu, N. Olah, M. Ciumașu-Rimbu, Acta gemmotherapeutica, voi. 1, Editura Napoca Star, Cluj-Napoca, 2012, ISBN: 978-973-647880-2, 16/286 pg; [18] Crews C. etal. JAgric Food Chem, 2005, 53:4843-4852; [19] Alasalvar C. et al. J Agric Food Chem, 2003, 51:3790-3796; [20] Amarai J.S. et al. J Agric Food Chem, 2006, 54:449-456; [21] Salehi M. et al. New synergistic co-culture of Corylus avellana cells and Epicoccum nigrum for paclitaxel production. Journal of Industrial microbiology & Biotechnology, 2019, 46(5):613-623; [22] Bemani E. et al. Journal of Natural Medicine, 2013, 67(3):446-451; [23] Alberti A. et al. Natural Product Communications, 2016, 11(4):469-474; [24] Oliveira I. et al. Food Chemistry, 2007, 105(3): 1018-1025; [25] Reithmuller E.et al. Nat Prod Commun, 2016, 11 (5):641 -644; [26] Durak I. et al. Clin Chim Acta, 1999, 284:113-115^ [27] Shin E.K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2009, 381:502-507; [28] Khan al. Tox^plfj'AțțpI Pharmacol., 2011, 251:85—94; [29] Anghel N. et al. Histology HistDpal/p^ , 30(12): 1465-1475; DOJTushțjavălli G. et al. Eur. J. Pharmacol/,
Claims (6)
- REVENDICĂRI1. Procedeu de obținere a unei noi compoziții fitoterapeutice pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine, caracterizat prin aceea că este constitutit din următoarele faze:a. Obținerea extractului gemoterapic de Corylus avellana include recoltarea și conservarea materialului vegetal, obținerea maceratului glicerinicb. Obținerea și caracterizarea nanocomplexelor de crisină/ciclodextrine include prepararea compexelor crisină/ciclodextrine și testul de solubilitatec. Obținerea compoziției fitoterapeutice pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine și evaluarea profilului fitochimic al acestuia prin analiză LC/MS pentru determinarea profilului polifenolic
- 2. Procedeu, conform revendicării nr.l, caracterizat prin aceea că solubilitatea crisinei în apă prin complexarea cu ciclodextrine, la un raport molar de 1:1, a crescut de 7,41 ori în cazul complexelor crisină/RAMEB, respectiv de 5,22 în cazul complexelor crisină/HPBCD
- 3. Procedeu, conform revendicării nr.l, caracterizat prin aceea că preparatul gemoterapic de Corylus avellana se obține folosind ca și solvent amestec de glicerină alcool etilic 96 % voi. (1:1) din muguri de alun în stare proaspătă. Extracția se realizează la rece, prin macerare, timp de 20 zile, la un raport de 1:20 planta-solvent.
- 4. Procedeu, conform revendicării nr.l, caracterizat prin aceea că noua compoziție fitoterapeutică pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine obținut prin liofilizare se analizează în ceea ce privește conținutul chimic cantitativ de polifenoli prin analiză LC/MS, rezultând un conținut de crisină de 5,830 ±0,0942 pentru compoziția cu crisină/RAMEB, respectiv 5,948 ±0,2796 pentru compoziția cu crisină/HPBCD, comparativ cu 0,100 ±0,004 în extractul gemoterapic de Corylus avellana
- 5. Procedeu de testare in vitro a activității anti-fibrotice a noii compoziții fitoterapeutice pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine pe celule hepatice stelate (HSC) din linia celulară LX2, caracterizat prin aceea că expresia genică și proteică a markerului pro-fibrotic TGFβΐ a fost statistic semnificativ redusă față de controlul activat, cu un nivel de semnificație statistică mai mare în cazul complexului cu RAMEB (p<0.01) față de HPBCD (p<0.05).
- 6. Procedeu de testare in vitro a activității anti-fibrotice a noii compoziții fitoterapeutice pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine, caracterizat prin aceea că aspectul histologic al ficatului la șoarecii cu fibroză hepatică indusă experimental (septe fibroas si pseudolobuli, „hepatocitelor spumoase” foamy perivenulare hipertrofiate cu acumulare masivă de grăsime microveziculară), a fost semnificativ îmbunătățit după tratamentul oral cu compoziții fitoterapeutice pe bază de extract gemoterapic de Corylus avellana îmbogățit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ROA202200328A RO136022A0 (ro) | 2022-06-14 | 2022-06-14 | Compoziţie fitoterapeutică pe bază de extract gemoterapic de corylus avellana îmbogăţit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine destinat fibrozei hepatice în diabetul zaharat şi metodă de obţinere aacesteia |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ROA202200328A RO136022A0 (ro) | 2022-06-14 | 2022-06-14 | Compoziţie fitoterapeutică pe bază de extract gemoterapic de corylus avellana îmbogăţit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine destinat fibrozei hepatice în diabetul zaharat şi metodă de obţinere aacesteia |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RO136022A0 true RO136022A0 (ro) | 2022-10-28 |
Family
ID=83804290
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ROA202200328A RO136022A0 (ro) | 2022-06-14 | 2022-06-14 | Compoziţie fitoterapeutică pe bază de extract gemoterapic de corylus avellana îmbogăţit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine destinat fibrozei hepatice în diabetul zaharat şi metodă de obţinere aacesteia |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RO (1) | RO136022A0 (ro) |
-
2022
- 2022-06-14 RO ROA202200328A patent/RO136022A0/ro unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | Effect of Anoectochilus roxburghii flavonoids extract on H2O2-Induced oxidative stress in LO2 cells and D-gal induced aging mice model | |
US20140010903A1 (en) | Curcuminoid composition with enhanced bioavailability and a process for its preparation | |
KR101915952B1 (ko) | 어성초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항염증용 및 피부 재생용 조성물 | |
JP7490557B2 (ja) | ベルベリンを含む組成物 | |
Manconi et al. | Chemical characterization of Citrus limon var. pompia and incorporation in phospholipid vesicles for skin delivery | |
Nematallah et al. | Polyphenols LC-MS2 profile of Ajwa date fruit (Phoenix dactylifera L.) and their microemulsion: Potential impact on hepatic fibrosis | |
Liu et al. | Protective effect of detoxified Rhus verniciflua stokes on human keratinocytes and dermal fibroblasts against oxidative stress and identification of the bioactive phenolics | |
Kenny et al. | Antioxidant properties and quantitative UPLC-MS/MS analysis of phenolic compounds in dandelion (Taraxacum officinale) root extracts | |
Afsheen et al. | Cardioprotective and metabolomic profiling of selected medicinal plants against oxidative stress | |
EP1446135A1 (en) | Standardized extracts of scutellaria lateriflora | |
TW201601711A (zh) | 羥基酪醇、其衍生物的體內吸收促進劑及其利用 | |
Bonacci et al. | Peracetylation as a strategy to improve oleuropein stability and its affinity to fatty foods | |
Habbu et al. | Preparation and evaluation of antidiabetic activity of Allium cepa-phospholipid complex (phytosome) in streptozotocin induced diabetic rats | |
KR101843750B1 (ko) | 산삼 농축액을 포함하는 구취제거용 구강붕해필름 및 그 제조방법 | |
Atlabachew et al. | Isolation and in vitro permeation of phenylpropylamino alkaloids from Khat (Catha edulis) across oral and intestinal mucosal tissues | |
KR101831981B1 (ko) | 상동나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 | |
RO136022A0 (ro) | Compoziţie fitoterapeutică pe bază de extract gemoterapic de corylus avellana îmbogăţit cu nanocomplexe de crisină/ciclodextrine destinat fibrozei hepatice în diabetul zaharat şi metodă de obţinere aacesteia | |
Ninfali et al. | Improvement in botanical standardization of commercial freeze-dried herbal extracts by using the combination of antioxidant capacity and constituent marker concentrations | |
KR20100028202A (ko) | 밀몽화 추출물을 포함하는 피부미백 활성을 갖는 조성물 | |
US11541093B2 (en) | Pharmacological use of Cimicifuga extract | |
KR101616853B1 (ko) | 유비데카레논에 기반한 조성물 | |
EP3551170B1 (en) | Powder solid compositions comprising flavonoids, process for their preparation, formulations and use thereof | |
Li et al. | Formation of Amadori compounds in LIGAO (concentrated pear juice) processing and the effects of Fru-Asp on cough relief and lung moisturization in mice | |
Cho et al. | Quantitation of phenolic compounds related to antioxidant and antiosteoporosis activities in ripe and unripe maesil (Prunus mume) | |
KR101918384B1 (ko) | 녹차잎 및 대추잎 블렌딩 말차의 제조방법 |