RO135386A2 - Procedeu de obţinere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic pentru tratamentul complicaţiilor cardiovasculare ale unor boli metabolice, în special tratamentul valvulopatiei diabetice. Procedeul, conform invenţiei, constă în etapele de:- 1) recoltare a sângelui de la un pacient, de la un donator sau dintr-o colecţie de sânge de la mai mulţi donatori,- 2) separare a monocitelor, prin centrifugare în gradient de densitate sau centrifugare împotriva curgerii utilizând un elutriator,- 3) lizare celulară suplimentară,- 4) izolare celule progenitoare endoteliale (EPC),- 5) identificare EPC,- 6) procese specifice de transfer deliberat de acid nucleic şi- 7) administrarea EPC modificare genetic către subiect prin injectare sau perfuzie intravenoasă într-un regim de dozare personalizat.

Description

OFICIUL DE STAT PENIRU INVENȚII Șl MĂHCfÎ

Cerere de brevet de invenție j

Data depozit ..'.j.j.¾¾... |

PROCEDEU DE OBȚINERE A UNOR CELULE PROGENITOARE ENDOTELIALE MODIFICATE GENETIC

Invenția se referă la un procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic folosite în terapia celulară în contextul complicațiilor cardiovasculare ale unor boli metabolice, în special la tratamentul valvulopatiei diabetice.

Diabetul zaharat este o afecțiune care afectează în prezent 387 de milioane de persoane din întreaga lume iar, până în 2035, se estimează că acest număr va crește la 592 milioane (Guariguata. Whiting și colab. 2014).

Boala afectează 11,6% din populația româneasca (Moța. Popa si colab. 2016). La pacienții cu diabet zaharat se constată o frecvență semnificativ mai mare a tulburărilor cardiovasculare, inclusiv a bolilor valvulare cardiace.

în prezent nu există un tratament medicamentos pentru disfuncțiile valvelor cardiace, singura opțiune fiind repararea sau înlocuirea prin intervenții chirurgicale. Diabetul zaharat (DZ) este un factor de predicție a degenerării structurale/functionale a valvei, factor de prognostic rezervat în boala valvulara cardiacă idiopatică, accelerând degenerarea bioprotezelor de valva aortică implantate (Lorusso, Gelsomino și colab. 2012, Schulte, Simionescu și colab. 2013). Este cunoscut faptul că celulele progenitoare endoteliale (EPC) constituie un sistem endogen important cu rol în menținerea integrității endoteliului și a homeostaziei vasculare (Urbich si Dimmeler 2004). Mobilizarea EPC din măduvă osoasă si recrutarea lor la situsurile lezate sunt mediate de factorul de creștere a endoteliului vascular (VEGF). angiopoietina-1 (Angl), factorul de creștere a fibroblastelor (FGF). factorul de stimulare a coloniilor de granulocite și macroiage (GM-CSF), activitatea metal oproteinazei 9 (MMP-9), factorul derivat din celula stromală-1 (SDF1) și de agenți farmacologici cum ar fi statinele si eritropoietina (EPO) (Carmeliet. Ferreira și colab. 1996. Asahara, Masuda și colab. 1999, Hattori. Heissig și colab. 2001. Szmitko, Wang și colab. 2003).

EPC facilitează neovascularizarea și angiogeneza, iar efectul lor benefic poate fi mediat atât prin înlocuirea directă a celulelor lezate, cât și prin secreția paracrină a factorilor angiogenici si a citokinelor. Există studii care sugerează că la pacienții cu stenoză aortică, regenerarea celulelor endoteliale (CE) valvulare este afectată nu doar de amplificarea senescenței CE valvulare, dar și de reducerea numărului si funcției EPC circulante. Recrutarea celulelor la situsul lezat și integrarea sunt determinate de numărul de EPC circulante (Matsumoto. Adams și colab. 2009), dar și de capacitatea de adeziune a EPC. care suferă modificări în timpul maturării celulelor.

Este cunoscut că integrinele sunt receptori pentru adeziunea celulară care leagă în principal liganzi din matricea extracelulară dar și de la suprafața celulară. La oameni, familia de integrine este compusă din 24 de heterodimeri αβ transmembranari, formați din subunități 18α și 8β (Takada, Ye și colab. 2007), care leagă ținte așa cum sunt motivul RDG al fibroneclinei. vitronectina, fîbrinogenul. epitopul GFOGER al colagenului, laminina, molecula de adeziune a celulelor vasculare 1 (VCAM-1), molecula de adeziune celulara 1,2,3,5 (ICAM-l.-2,-3.-5) și altele (Barczyk, Carracedo și colab. 2010). Integrinele joacă roluri atât în interacțiunea dintre celule și între celule și matricea extracelulară, dar și în modificarea formei celulare, migrare, diferențiere, proliferare și apoptoză, prin semnalizare din interiorul celular spre exterior și din exterior câtre interiorul celular (Miranti și Brugge 2002). Pentru mobilizarea EPC din măduva hematogenă și aderarea la celulele endoteliale activate și matricea extracelulară sunt importante diferite integrine. Astfel, Abplanalp și colab. au arătat în 2016 că fosforilarea integrinei VLA-4 (α4β!) medială de protein kinaza dependentă de c-AMP (PKA) și indusă de hiperglicemie duce la sechestrarea EPC în măduva hematogenă (Abplanalp. Conklin și colab. 2016). Proteina VLA-4 este un heterodimer format dintr-o subunitate integrină a4 și o subunitate integrină βΐ care are ca linte de legare libronectina și molecula VCAM-1 exprimată la suprafața celulelor endoteliale activate.

Dezavantaje ale stadiului tehnicii

1. Valvulopatia diabetică este o boală cronică degenerativă iară metode considerabile de prevenire

2. Singurul tratament disponibil pentru valvulopatia diabetică constă în protezare atunci când valva aortică este afectată sever

3. Bioprotezele de valvă aortică sunt la rândul lor degenerate accelerat în diabet

4. Bioprotezarea necesită deseori tratament cu imunosuprimante pe perioadă nedeterminată.

Problema tehnica pe care o rezolva invenția este obținerea printr-un procedeu a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic care sa permită un tratament mult mai eficient în special la tratamentul valvulopatiei diabetice, care previne necesitatea tehnicilor de protezare sau bioproteze, a unor tratamente imunosuprimante, oferă posibilitatea țintirii mai multor situsuri cu leziuni înainte ca acestea să devină clinic simptomatice, oferă posibilități de tratament care sunt minim invazive și au citotoxicitate mică.

Procedeul de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic rezolva aceste probleme prin aceea ca are o prima etapă de recoltare a sângelui de la pacient, de la un donator, dintr-o colecție de sânge de la mai mulți donatori, urinată de o etapa de separare a monocitelor prin centrifugare, unde densitatea mediului de separare în gradient de densitate este cuprinsă între I și 1,2 g/cm³, cu un optim cuprins între 1.05 și 1.1 g/cm³. Pentru eliminarea suplimentară a posibilelor eritrocite care contaminează celulele mononucleare purificate în aspectele invenției prezentate mai sus este utilizată o etapă de liză celulară, urmată de o etapa de izolare EPC, in care celulele progenitoare endoteliale (EPC) sunt izolate din monocitele sanguine pe baza exprimării la suprafața lor celulară a proteinelor marker de celule progenitoare. CD34, CD133 și a markeri-lor de celule endoteliale, CD31, VEGFR2, urmată de o etapa de identificare EPC, pentru care suni selectati anticorpii utilizați pentru identificarea EPC din categoria anticorpi primari conjugați cu fluorofori, anticorpii specifici care sunt neconjugați, care sunt la rândul lor legați de anticorpi secundari care recunosc izotipul anticorpului primar, urmată de o etapa de procese specifice de transfer deliberat de acid nucleic, unde celulele progenitoare endoteliale (EPC) izolate suni transfectate pentru a supra-exprima proteina VLA-4, un heterodimer alcătuit din subunitățile proteice, integrina a4 (ltga4) și integrina βΐ (Itgβl), acizii nucleici care codifică (Itga4) și (Itgpl) pot fi donați într-un vector, de tip: plasmidă, cosmidă, bacmid, fag, cromozom artificial sau virus, care permite inserarea unui secvențe genetice (ADN), (ARN) pentru a se obține replicarea și translația secvenței atașate. într-o etapă are loc administrarea EPC modificate genetic către pacient prin injectare, perfuzare intravenoasă.

Intr-o primă variantă separarea monocitelor se face prin centrifugare în gradient de densitate, într-un recipient tubuiar pentru o durată cuprinsă între 5-60 minute, utilizând forțe de la 100 la 1000 x g. unde se obține în partea superioară a tubului o bandă de plasma sanguină, o bandă care conține monocite, o bandă unde se găsește mediul de separare în gradient care poate conține celulele poiimorfonucleare, iar în partea de jos o banda a eritrocitelor sedimentate. Pentru prelevarea monocitelor din banda corespunzătoare este necesar a îndepărta banda de plasma de la suprafața benzii de monocite și apoi să fie aspirate monocitele, evitând aspirarea mediului de separare pentru a evita contaminarea cu celule poiimorfonucleare.

Intr-o a doua variantă, separarea monocitelor se face prin centrifugare împotriva curgerii, prin utilizarea principiului de funcționare al unui elutriator, ce constă în stabilirea unui echilibru între forțele centrifuge și de frecare la curgere dintr-o cameră specială, montată într-o centrifugă, care este alimentată cu suspensie celulară. Inițial, celulele sunt menținute prin forța centrifugă în partea camerei cu raza cea mai mare de centrifugare, apoi este crescut debitul soluției în care sunt suspendate celulele iar acestea sunt antrenate astfel către centrul rotorului de centrifugare, nivel la care sunt eluate prin sistemul de tuburi al elutriatorului. Deoarece particulele cu densitate mică pot să părăsească camera la viteze de curgere mai mici decât cele necesare pentru particulele cu densitate mai mare, se poate face separarea diferitelor fracții de celule sanguine, limfocitele și erilrocitele sunt eluate în primele fracții, iar neutroiîlele în fracții mai târzii.

Etapa de izolare este realizată într-o variantă prin separarea prin adsorbție la suprafețe acoperite cu anticorpi CD34, CDl 33, CD31. anti-VEGFR2.

Etapa de izolare intr-o altă variantă este realizată prin sortarea celulară activată de fluorescență a celulelor care au fost puse anterior în contact cu anticorpi solubili CD34, CDl33, CD31, antiVEGFR2.

Intr-o variantă a etapei de identificare EPC, cantitatea de anticorpi utilizată este între 0,001 pg de anticorp/ IO⁶ celule și 100 pg de anticorp/ IO⁶celule, un optim este între 0,1 pg de anticorp/ IO⁶ celule și 1 pg de anticorp/ IO⁶ celule, se poate varia concetrația de celule din timpul etapei de colorare cu anticorpi, concentrația celulelor din timpul etapei de colorare cu anticorpi este între 10 celule/ml și 10^ celule/ml un optim este între 10^s celule/ml și 10⁶ celule/ml.

într-o variantă de sortare celulară activată de fluorescență a celulelor care au fost puse anterior în contact cu anticorpi solubili CD34, CD133, CD31, anti-VEGFR2, sortarea celulară activată de fluorescență este o tehnică adaptata a citometriei în flux, utilizată pentru separarea celulelor dintr-o populație heterogenă de celule pe baza diferențelor de împrăștiere a luminii și de fluorescent. Aceste diferențe de fluorescență pot fi date de colorarea diferențială a celulelor cu anticorpi specifici pentru proteine de la suprafața celulară.

într-o variantă a proceselor specifice, transfecția este făcută cu vectori individuali pentru exprimarea celor două subunități ale VLA-4. respectiv Itga4 și Itgpi.

Pentru reglarea exprimării, vectorul conține un segment promotor activ constitutiv, o secvență promotor inductibil, gene care codifică pentru rezistența la antibiotice pentru selectarea celulelor transfectate, secvențe reglatoare, de exemplu, un situs intern de intrare ribozomală.

Intr-o altă variantă a proceselor specifice, transfecția poate fi făcută cu un singur vector de exprimare care conține ambele integrine membranare Itga4 și Itgpl. Cele două fragmente de acid nucleic sunt unite astfel încât să rămână în cadru, pentru translația celor două proteine, opțional unite cu un linker flexibil, ca un singur produs de translație.

Celule progenitoare endoteliale modificate genetic sunt caracterizate prin aceea că secvența dc acid nucleic care codifică proteina Itga4 cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%. 91%, 92%, 93%, 94%. 95%, 96%, 97%, 98% . 99% , 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:1 și secvența de acid nucleic care codifică proteina ltg|3l cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%, 92%. 93%. 94%, 95%. 96%, 97%, 98% , 99% . 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:2.

Celule progenitoare endoteliale modificate genetic sunt caracterizate prin aceea că secvența de acid nucleic care codifică proteina ltga4 cuprinde o secvență de acid nucleic are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%, 92%, 93%. 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% , 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:3 și secvența de acid nucleic care codifică proteina Itgfil cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% , 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:4.

Principalele avantaje ale invenției

- Procedeul de obținere a unor celule progenitoare endoteliale (EPC) modificate genetic conform invenției oferă o nouă posibilitate de tratament, dar și de prevenire a complicațiilor cardiovasculare ale diferitelor boli metabolice, în particular a valvulopatiilor diabetice.

- Celulele progenitoare endoteliale rezultat al procedeului, oferă posibilitatea țintirii mai multor situsuri cu leziuni înainte ca acestea să devină clinic simptomatice.

- Celulele progenitoare endoteliale rezultat al procedeului, oferă posibilități de tratament care sunt minim invazive și au citotoxicitate mică.

- Celulele progenitoare endoteliale rezultat al procedeului, oferă posibilitatea de a elimina tratamentul cu imunosuprimante.

Se dă în continuare un exemplu de realizare a invenției în legătură cu figurile: 1-6. descrise în continuare.

Figura l : prezintă o diagramă a procedeului de obținere a unor celule progenitoare endotelialc modificate genetic conform invenției;

Figura 2 : prezintă nivelurile proteinei VLA4 la suprafața EPC de la animale martor dislipidemice sau diabetice dislipidemice la doi timpi diferiți de evoluție a patologiei. Diferența statistică semnificativă este prezentată prin *p<0.05, ANOVA one-way, post-testul Bonfen-oni. MFIR ^: mediana intensității fluorescenței raportată la autofluorescență.

Figura 3 : prezintă un vector de donare (PS100001, Origene) exemplificator pentru introducerea secvențelor care codifică Itga4 și, respectiv, Itgp 1.

Figura 4 : prezintă nivelurile ARNm pentru ltga4 și Itgpl din celulele progenitoare endotelialc modificate genetic comparativ cu celulele progenitoare endotelialc native, așa cum a fost măsurat prin RT-PCR.

Figura 5 ; prezintă grafice prin bare care indică valorile medii și deviația standard ale valorilor diametrelor valvelor aortice în sistolă și vitezei de ejecție transvalvulară obținute din măsurători în ziua 11, pe animale din grupurile: (1) șoareci diabetici injectați cu EPC modificate genetic pentru a exprima GFP (diabet-EPC-GFP), (2) șoareci martor injectați cu EPC modificate genetic pentru a exprima GFP (martor-EPC-GFP), (3) șoareci diabetici injectați cu EPC modificate genetic pentru a supraexprima VLA-4 (diabet-EPC-VLA4), (4) șoareci martor injectați cu EPC modificate genetic pentru a supraexprima VLA-4 (martor-EPC-VLA4). Diferența statistică semnificativă este prezentată prin *p<0.05, ***p<0.001 prin ANOVA one-way, post-testul Bonferroni.

Figura 6 : prezintă grafice prin bare care indică valorile medii și deviația standard ale valorilor plasmatice ale ALT, AST și creatininei la animalele din grupurile: (1) șoareci diabetici injectați cu EPC modificate genetic pentru a exprima GFP (diabet-EPC-GFP), (2) șoareci martor injectați cu EPC modificate genetic pentru a exprima GFP (martor-EPC-GFP), (3) șoareci diabetici injectați cu EPC modificate genetic pentru a supraexprima VLA-4 (diabet-EPC-VLA4), (4) șoareci martor injectați cu EPC modificate genetic pentru a supraexprima VLA-4 (martor-EPC-VLA4).

Lista prescurtărilor

Ang1 ...... angiopoietina-1; APC - aloficocianina; ALT ...... alanin-transaminaza; AST aspartattransaminaza; BP - filtru trece-bandă; DZ - diabet zaharat; EPC - celule progenitoare endotelialc; EPO - eritropoietina; c-AMP - adenozin monofosfataza ciclică; CD31 - cluster de diferențiere 31; CD34 - cluster de diferențiere 33; CD133 - cluster de diferențiere 133; CE - celule endotelialc; EDTA - acid etilendiamino tetraacetic ; FBS - ser fetal bovin; FGF - factorul de creștere a fibroblastelor ; GFP - proteina fluorescentă în verde; GM-CSF - factorul de stimulare a coloniilor de granulocite și macrofage; ICAM - molecula de adeziune celulara; Itga4 - integrina alfa 4; Itgpl - integrina beta 1; MFIR - mediana intensității fluorescenței raportată la autofluorescență; MMP-9 metaloproteinaza 9; PBS - soluțiue salină tamponată cu fosfat; PE - ficoeritrină; PKA - protein kinaza dependentă de c-AMP; RT-PCR - Reacția în lanț a polimerazei cu transcriere inversă ; SDF-1 - factorul derivat din celula stromală-1; STZ - streptozotocină; VEGF - factorul de creștere a cndoteliului vascular; VEGFR2 - receptorul 2 pentru factorul de creștere a endoteliului vascular; VCAM-I - molecula de adeziune a celulelor vasculare 1; VLA-4 - antigenul foarte târziu 4 (dimerul dintre Itga4 și ItgȘl)

Descrierea detaliată

Invenția furnizează celule progenitoare endotelialc (EPC) modificate genetic pentru tratamentul complicațiilor cardiovasculare ale unei boli metabolice, hipertensiune, dislipidemie. prediabet și/sau diabet zaharat de tip 1 sau 2.

Conform cu figura 1, procedeul are ca primă etapă recoltarea (1) sângelui. Sângele din care sunt izolate celulele progenitoare endotelialc pentru a fi modificate genetic, este in varianta (la) sânge recoltat de la pacient, iar intr-o varianta alternativa (lb), sângele este obținut de la un donator sau dintr-o colecție de sânge de la mai mulți donatori.

<ξΰ

Urmează o serie de etape de separare a celulelor progenitoare endoteliale. care incep încep cu separarea monocitelor ( 2).

în această etapă de separare (2), monocițele sunt separate de celelalte componente celulare și acelulare ale sângelui prin una din două variante: una prin centrifugare în gradient de densitate (2.1) și alta prin centrifugare împotriva curgerii utilizând un elutriator (2.2)

Pentru varianta (2.1) specialistului în domeniu îi sunt cunoscute mai multe formulări disponibile comercial de medii pentru separarea în gradient de densitate sau acestea pot fi ușor produse în laborator.

Din acest motiv este necesara o alegere optimă a unor parametri pentru separarea în gradient după cum este redat în continuare.

în procedeul propus conform invenției, densitatea mediului de separare în gradient dc densitate este cuprinsă între 1 și 1,2 g/cm³, preferabil între 1,02 și 1,15 g/cm³ și cel mai preferabil între 1,05 și 1,1 g/cm'³.

Centrifugarea se poate face pentru o durată de la 5 minute la 2 ore, preferabil, de la 10 minute la 1,5 ore și cel mai preferabil de la 15 minute la o oră, utilizând forțe de la 100 la 1000 x g. mai preferabil de la 200 la 750 x g și cel mai preferabil de la 250 la 500 x g.

In urma centrifugării într-un recipient în formă de tub, se obține separarea componentelor sângelui în felul următor: în partea superioară a tubului este o bandă (A) de plasma sanguină, apoi o bandă (B) care conține monocite, în a treia bandă (C) se găsește mediul de separare în gradient (C) care poate conține celulele polimorfonucleare. iar în partea de jos, este banda (D) eritrocitelor sedimentate.

Pentru prelevarea monocitelor din banda (B) este necesar să fie întâi o etapă pentru a îndepărta banda de plasma (A) de la suprafața benzii de monocite (B) și apoi să fie aspirate monocitele. evitând aspirarea mediului de separare pentru a nu contamina cu celule polimorfonucleare.

Un alt procedeu de separare a monocitelor de celelalte componente celulare și acelulare ale sângelui (2.2), conform invenției, se realizează prin separarea celulară prin centrifugare împotriva curgerii, utilizând un elutriator.

Ehitriația este un proces de separare a particulelor în funcție de mărimea, forma și densitatea acestora, folosind un flux de gaz sau lichid care curge într-o direcție de obicei opusă direcției de sedimentare.

Procedeul de separare a monocitelor în etapa (2.2) utilizează principiul de funcționare al unui elutriator ce constă în stabilirea unui echilibru între forțele centrifuge și de frecare la curgere dintr-o cameră specială, montată într-o centrifugă, care este alimentată cu suspensie celulară. Inițial, celulele sunt menținute prin forța centrifugă în partea camerei cu raza cea mai marc de centrifugare. Apoi este crescut debitul soluției în care sunt suspendate celulele iar acestea sunt antrenate astfel către centrul rotorului de centrifugare, nivel la care sunt eluate prin sistemul de tuburi al elutriatorului.

Deoarece particulele cu densitate mică pot să părăsească camera la viteze de curgere mai mici decât cele necesare pentru particulele cu densitate mai mare, se poate face separarea diferitelor fracții de celule sanguine.

Caracteristic, limfocitele și eritrocitele sunt eluate în primele fracții, iar neutrofilele în fracții mai târzii. Separarea se poate face așa cum este descris de (Stroncek, Fellowes și colab. 2014)

Pentru eliminarea suplimentară a posibilelor eritrocite care contaminează celulele mononucleare purificate în aspectele invenției prezentate mai sus este utilizată o etapă suplimentară (3) de liză celulară.

Specialistului în domeniu îi sunt cunoscute procedeele de lizare a eritrocitelor și acestea includ incubarea în soluții hipotone, în soluții normotone, care conțin dodecil sulfat de sodiu și albumină sau in alta varianta soluții normotone, care conțin clorură de amoniu.

7)9

Astfel de soluții sunt disponibile comercial dar pot fi, de asemenea, preparate ușor în laborator.

O altă etapă esențială a procedeului conform invenției, este de izolare (4) a EPC. In aceasta etapă (4) celulele progenitoare endoteliale (EPC) sunt izolate din monocitelc sanguine pe baza exprimării la suprafața lor celulară a proteinelor marker de celule progenitoare, așa cum sunt CD34 și/sau CD133 și a markeri-lor de celule endoteliale așa cum sunt CD31 și/sau VEGFR2.

Această etapă de izolare (4) este realizată într-o variantă (4a) prin separarea prin adsorbție la suprafețe (așa cum sunt microsfere din latex sau magnetice, plăci de cultură, ș.a.) acoperite cu anticorpi CD34, CD133, CD3l și/sau anti-VEGFR2 sau într-o altă variantă (4b) este realizată prin sortarea celulară activată de fluorescentă a celulelor care au fost puse anterior în contact cu anticorpi solubili CD34, CD133. CD31 și/sau anti-VEGFR2.

După etapa de izolare (4) urmează o etapa (5) de identificare EPC, anticorpii utilizați pentru identificarea EPC sunt aleși într-o variantă (5a) ca anticorpi primari conjugați cu fluorofori.

Sunt disponibili comercial un număr mare de anticorpi conjugați cu fluorofori. iar alegerea acestora pentru o suprapunere spectrală minimă reprezintă un optim al fiecărei situații în parte.

Exista si varianta (5b) alegerii de anticorpii specifici care sunt neconjugați.

Anticorpii utilizați pentru identificarea și separarea EPC pot fi anticorpi primari specifici conjugați cu fluorofori sau anticorpi neconjugați care sunt la rândul lor legați de anticorpi secundari care recunosc izotipul anticorpului primar.

Acești anticorpi utilizați pot avea orice izotip și pot fi crescuți în orice animal, de exemplu șoarece, șobolan, iepure, oaie, capră sau cal. în plus, anticorpii pot fi umani sau umanizați. Identificarea legării anticorpilor neconjugați se poate face apoi prin intermediu! utilizării unor anticorpi secundari care leagă specific regiunea constantă ce corespunde fragmentului Ec (constant, cristalizabil) a anticorpilor primari, unde anticorpii secundari sunt conjugați cu fluorofori.

Așa cum este cunoscut specialistului în domeniu, cantitatea de anticorpi utilizată pentru identificarea prezenței unei proteine la suprafața membranei celulare poate varia în funcție de mai mulți parametri așa cum sunt tipul fluoroforilor utilizați pentru detecție, raportul moleculă de anticorp : număr molecule de fluorofori, legarea nespecifică și altele.

Identificarea cantității de anticorpi care poate fi utilizată este un procedeu în sine cunoscut și este identificată de specialistul în domeniu prin teste de titrare.

într-o varianta a etapei (5), cantitatea de anticorpi utilizată este între 0,001 pg de anticorp/ IO⁶ celule și 100 pg de anticorp/ IO⁶ celule, mai preferabil 0,01 pg de anticorp/ IO⁶ celule și 10 pg de anticorp/ IO⁶ celule și. cel mai preferabil, între 0.1 pg de anticorp/ IO⁶ celule și 1 pg de anticorp/ IO⁶ celule. Se poate varia concetrația de celule din timpul etapei de colorare cu anticorpi. Concentrația celulelor din timpul etapei de colorare cu anticorpi este preferabil între 109 celule/ml .și 105 celule/ml și cel mai preferabil între 10⁸ celule/ml și IO⁶ celule/ml.

în varianta (4b) de sortare celulară activată de fluorescentă a celulelor care au fost puse anterior în contact cu anticorpi solubili CD34, CD133, CD31 și/sau anti-VEGFR2.. sortarea celulară activată de fluorescență este o tehnică standard, adaptare a citometriei în flux, cunoscută specialistului în domeniu.

Această tehnică este utilizată pentru separarea celulelor dintr-o populație heterogenă de celule pe baza diferențelor de împrăștiere a luminii și de fluorescență. Aceste diferențe de fluorescență pol fi date de colorarea diferențială a celulelor cu anticorpi specifici pentru proteine de la suprafața celulară, așa cum este descris mai jos.

Suspensia celulară este aspirată din proba de sortat prin intermediul unei sonde și apoi circulată în sistemul fluidic al citometrului pentru a fi analizate și ulterior sortate. Datorită volumului mare de soluție de antrenare care este adăugat suspensiei de celule în interiorul sistemului fluidic al unui citometru, celulele sunt individualizate iar datorită concentrării hidrodinamice, sunt constrânse să treacă prin centrul fasciculului de curgere la nivelul camerei de interogare. Camera de interogare este punctul de intersecție dintre sistemul fluidic și laserele utilizate de citometru pentru excitarea

-----, ........₃

Μ iluoroforilor și pentru măsurarea împrăștierii luminii de către particule. Fluorescenta emisă de către celulele care trec prin dreptul laserelor este măsurată utilizând fotomultiplicatoare și această măsurătoare va sta la baza deciziei de sortare. Decizia de sortare se referă la aplicarea unor porți logice parametrilor de fluorescentă și împrăștiere a luminii măsurați pentru fiecare celulă pentru a se decide dacă acea celulă este sortată sau este eliminată. A vale de camera de interogare, fasciculul este separat în picături fine prin intermediul vibrațiilor cu frecvență de ordinul kilohertz-ilor (kHz) ale unui dispozitiv piezoelectric. înainte de separarea unei picături, în funcție de decizia de sortare pentru celula calculată a se desprinde în acea picătură, poate fi schimbat potențialul electric al întregului fascicul, astfel încât picătura care se va desprinde să păstreze acest potențial electric (alternativ, în unele aparate este aplicată sarcina specific picăturii, cu ajutorul unui inel metalic încărcat electric plasat la nivelul la care are loc desprinderea picăturilor). Picăturile încărcate electric trec apoi prin dreptul sistemului de deflecție - un sistem care crează un câmp electrostatic constant - iar picăturile sunt direcționale în funcție de sarcina lor către tuburi de colectare sau către sistemul de evacuare.

După separarea celulelor progenitoare endoteliale, acestea vor fi supuse în ultima etapă unor procese specifice (6) de transfer deliberat de acid nucleic în vederea obținerii de celulele progenitoare endoteliale (EPC) modificate genetic.

Prin aceste procese specifice celulele progenitoare endoteliale (EPC) izolate, conform cu etapele anterior descrise, sunt transfectate pentru a supra-exprima proteina VLA-4. un heterodimer alcătuit din subunitățile proteice, integrina a4 (Itga4) și integrina βΐ (ItgPl).

Acizii nucleici care codifică Itga4 (așa cum sunt SEQ ID NR:l pentru secvența marină și SEQ ID NR:3 pentru secvența umană) și ItgȘl (așa cum sunt SEQ ID NR:2 pentru secvența marină și SEQ ID NR:4 pentru secvența umană) pot fi donați într-un vector, așa cum este o plasmidă, cosmidă, bacmid, fag, cromozom artificial sau virus, care permite inserarea unui secvențe genetice (ADN sau ARN) pentru a se obține replicarea si translația secvenței atașate.

într-o varianta a proceselor specifice (6a), transfecția este făcută cu vectori individuali pentru exprimarea celor două subunități ale VLA-4. respectiv Itga4 și ItgȘl. în aceasta varianta (6a) exista doua posibilități de realizare.

Conform cu prima posibilitate de realizare (6al), secvența de acid nucleic care codifică proteina Itgci4 cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%. 92%. 93%, 94%, 95%, 96%, 97%. 98% sau 99% sau 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:1 , iar secvența de acid nucleic care codifică proteina Itg βΐ cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%, 92%, 93%. 94%, 95%. 96%, 97%. 98% sau 99% sau 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:2

Conform cu a doua posibilitate de realizare (6a2), secvența de acid nucleic care codifică proteina Itga4 cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% sau 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:3, iar secvența de acid nucleic care codifică proteina Itg βΐ cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%, 92%, 93%. 94%. 95%. 96%. 97%, 98% sau 99% sau 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:4.

în Listarea Secvențelor sunt listate, în ordine, secvențele prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Secvențele utilizate în această invenție și detaliate în Listarea Secvențelor

Nume secvență	Proteină codificată Specie de origine	Lungimea în nucleotide
SEQ ID NR. 1	Itga4 M. musculus	3099
SEQ ID NR. 2	Itg βΐ M. musculus	2397
SEQ ID NR. 3	Itga4 H. Sapiens	3099
SEQ ID NR. 4	Itg βΐ H. sapiens	2397
	7

într-o variantă, pentru reglarea exprimării, vectorul conține un segment promotor activ constitutiv (așa cum este, dar nelimitat la CMV, SV40 sau secvențe LTR) sau o secvență promotor inductibil. într-o altă variantă, vectorii de exprimare conform invenției cuprind de asemenea gene care codifică pentru rezistența la antibiotice pentru selectarea celulelor transfectate.

într-o altă variantă vectorii de exprimare conform invenției pot cuprinde suplimentar secvențe reglatoare, de exemplu, un situs intern de intrare ribozomală.

într-o altă variantă a proceselor specifice (6b), transfecția poate fi făcută cu un singur vector de exprimare care conține ambele integrine membranare, Itga4 și Itgpi. așa cum suni descrise mai sus, legate operabil pentru translația celor două proteine, opțional unite cu un linker flexibil, ca un singur produs de translație.

Așa cum este utilizat aici, este intenționat ca termenul legat operabil să însemne că cele două fragmente de acid nucleic sunt unite astfel încât secvențele de aminoacizi codificate de cele două fragmente de acid nucleic rămân în cadru.

Specialistului în domeniu va realiza că există și alte metode pentru inserarea matrialului genetic care codifică o proteină de interes așa cum sunt electroporarea, biolistica (pistolul genic). expunerea la fosfat de calciu, transfecția pe bază de lipozomi, care pot fi utilizate pentru creșterea exprimării unei proteine, iar aceste metode sunt incluse în unele aspecte ale invenției.

Așa cum este utilizat aici, termenul transfecție tranzientă” se referă la transfecția în care materialul genetic inserat în interiorul celulei este prezent intracelular pentru perioade de timp suficiente pentru sinteza proteică dar nu este inserat în genomul celulei gazdă.

Odată ce au fost obținute celulele progenitoare endoteliale (EPC) conform invenției acestea pot fi administrate la subiect pentru tratamentul sau prevenirea unor complicații cardiovasculare ale unei boli metabolice, hipertensiune, dislipidemie, prediabet și/sau diabet zaharat de tip I sau 2.

Modul de utilizare al celulelor EPC modificate genetic.

Intr-o etapa 7 are loc administrarea EPC modificate genetic către subiect este prin injectare ( 7a) sau perfuzare intravenoasă (7b). Regimul de dozare pentru administrarea celulelor progenitoare endoteliale conform invenției poate depinde de subiectul la care acestea sunt administrate, sexul, vârsta și greutatea acestuia cât și de alți factori care țin de afecțiunea de care suferă subiectul și de gravitatea acesteia. Astfel, regimul de dozare va putea varia în funcție de judecata medicului curant. într-un aspect al invenției injectarea poate fi unică sau repetată o dată la o zi. o dată la câteva zile, o dată la o săptămână, o dată la o lună sau mai rar pentru a fi obținute îmbunătățiri ale funcției cardiovasculare sau pentru întârzierea apariției leziunilor cardiovasculare, în următoarele Exemple, invenția este ilustrată prin intermediul unor forme de realizare. Acestea sunt în scop exemplificator și nu trebuie interpretate a limita în nicun fel întinderea invenției.

EXEMPLE

Exemplul 1 : Generarea modelului de șoarece diabetic dislipidemie în toate experimentele au fost utilizați șoareci masculi ApoE-/- din colonia de la Taconic (SUA) cu vârste de la 12 la 14 săptămâni. Toți șoarecii au fost crescuți în biobaza Institutului de Biologie si Patologie Celulara (IBPC) 'Nicolac Simionescu' în cuști cu ventilație, în condiții aseptice pentru patogeni specifici, cu cicluri de luminăiîntuneric de 12:12, în conformitate cu legislațiile naționale și europene referitoare la utilizarea animalelor în cercetarea biomedicală. Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de comisia de etică a IBPC ‘N Simionescu' și de autoritatea națională, ANSVSA. Animalele au avut acces la hrană și apă ad libitum cu excepția privării de hrană timp de 3 ore anterior măsurării glicemiei din sângele venos din vena caudală, cu teste rapide cu slripuri, și anterior injectării intraperitoneale (i.p.) a streptozotocinei (STZ) sau tamponului citrat (CIT), după cum este descris în continuare.

Animalele au fost injectate i.p. zilnic, timp de 5 zile consecutive (zilele 1-5) cu streptozotocină la 55 mg/kg de greutate corporală, dizolvată în soluție tampon citrat, pH 4.5, la o concentrație de 20.7 mM (grup diabetic). Un alt lot de animale a fost injectat cu volumul echivalent de soluție tampon

4/ citrat (grup martor). După ultima injectare i.p., în ambele grupuri experimentale dieta a fost schimbată din peleți standard în dietă hiperlipemiantă (peleți standard la care a fost adăugat colesterol l% și unt 15%) și menținută până în ziua sacrificării. Pentru ambele grupe experimentale au fost testați doi timpi de sacrificiu diferiți, ziua 9 și ziua 12. Animalele au fost sacrificate prin inducerea anesteziei profunde cu un amestec de ketamină și xilazină. iar sângele a fost colectat prin puncție ventriculară pe soluție anticoagulantă de 250mM EDTA (acid etilendiaminotetraacetic).

Exemplul 2: Caracterizarea exprimării integrinelor în EPC circulante în urma sacrificării animalelor așa cum a fost descris în Exemplul 1, a fost obținută fracția dc celule mononucleare din sângele colectat pe EDTA. Pe scurt, sângele total (0,7-1 ml/ animal) a fost pipetat la suprafața mediului de separare Histopaque 1077 (Merck) și s-a centrifugat timp de 40 de minute la 400 x g, cu accelerare lentă și fără frână. După centrifugare, a fost îndepărtată plasma situată în stratul cel mai de sus și s-a recoltat banda de celule mononucleare de la interfața plasmăHistopaque. Monocitele au fost spălate în 10 ml de soluțiue salină tamponată cu fosfat (PBS) cu 2% ser fetal bovin (FBS). Apoi, monocitele au fost incubate timp de 5 minute în 2 ml de soluție tampon de liză ACK (Thermo Fisher Scientific) pentru lizarea eritrocitelor contaminante și apoi resuspendate în 10 ml de PBS și numărate. După o centrifugare timp de 10 minute la 400 x g. monocitele au fost resuspendate în volumul necesar de PBS pentru o concentrație de 2 x 10 celule/ml și alicotate la 100 μΐ/probă. Fiecare probă a fost incubată cu anticorpi anti-CD34 conjugați cu Alexa Fluor 488 (FAB65181G, R&D Systems. SUA) la 5 μΐ/ IO⁶ celule, anticorpi anti-VEGFR2 conjugați cu APC (FAB4432A, R&D Systems) la 10 μΐ/ IO⁶ celule și anti-VLA4 conjugați cu PE (103705. BioLegend, SUA) la 5 μΐ /10⁶ celule, conform instrucțiunilor producătorilor. După incubarea cu anticorpi timp de o oră la temperatura camerei, probele au fost măsurate prin citometrie în flux (Gallios, Beckman Coulter) utilizând următoarele lasere și filtre optice: excitație: 488nm, emisie: 525nm BP pentru Alexa Fluor 488, emisie: 575nm BP pentru PE și excitație: 635nm, emisie: 660nm BP pentru APC. In mod surprinzător, așa cum este arătat în (Figura 2), s-a observat scăderea marcată a nivelului de exprimare a proteinei VLA4 în EPC-urile de la animalele diabetice dislipidemice comparativ cu cele de la animalele dislipidemice chiar și la timpul scurt de 9 zile după prima injectare cu streptozotocină.

Exemplul 3: Obținerea vectorilor de exprimare care codifica integrinele «4 si βΐ murine

Mai întâi, au fost introduse fragmentele de ADN complementar (ADNc) care codifică integrinele Itgu4, ItgP 1 sau, respectiv, GFP ca martor, în regiunea de multiconare a vectorului pCMV6-Entry (PS100001. Origene, ( Figura 3) utilizând enzimele de restricție Sgfl și Mlul (Thermo Fisher Scientific). Apoi, pentru obținerea unei cantități mari de vectori de exprimare au fost utilizate bacterii competente Escherichia Coli DH5ct care au fost transformate cu vectorii pCMV6-Enlry (vector fără insert/martor). pCMV6-Itga4 murin și pCMV6-ItgȘl murin și, respectiv, pCMV6GFP. Pe scurt, bacteriile competente au fost incubate timp de 10 minute la 4°C cu 100 ng din fiecare vector plasmidic. Ulterior, a fost realizată transformarea bacteriană prin șoc termic prin incubarea timp de 45 secunde la 42°C. Bacteriile transformate au fost însămânțate pe placi Petri de cultura care au conținut mediu LB solid (agar) și s-au incubat peste noapte la 37 °C, în atmosfera umedă. Ulterior, coloniile au fost izolate și s-a verificat integrarea corectă a transcripților dc 3096 ph (Itga4) și, respectiv, 2394 de perechi de baze (ItgPl). Clonele pozitive au fost multiplicate si stocate la -80 °C în mediu LB cu 50 % gliceriol până în momentul utilizării.

Exemplul 4: Separarea EPC și modificarea genetică

Pentru a verifica dacă restabilirea nivelurilor proteinei VLA4 în EPC-urile animalelor diabetice dislipidemice duce la îmbunătățiri ale funcției cardiovasculare, am recoltat mai întâi sângele total de la animale diabetice dislipidemice la 9 zile de la prima injectare cu streptozotocină, așa cum este descris în Exemplul 1. Apoi, a urmat o etapă de pre-purificare a celulelor mononucleare prin centrifugare în gradient de densitate, așa cum este descris în Exemplul 2. După spălarea finală a monoeitelor, acestea au fost resuspendate în PBS la concentrația de 107 celule/ml și incubate cu anticorpi anti-CD34 conjugațUu^lexa Fluor 488 (FAB65181G, R&D Systems) la 5 μΐ/ IO⁶, celule și anticorpi anti-VEGFR2 conjugați cu APC (FAB4432A, R&D Systems) la IO μΙ/ IO⁶ celule. Celulele dublu-pozitive CD34+/VEGFR2+ au fost apoi sortate utilizând sorter-ul MoFIo Astrios (Beckman Coulter) utilizând excitația la 488 nm și emisia la 513/ BP 26 pentru Alexa Fluor 488 și excitația la 640 nm și emisia la 671/ BP 30 pentru APC.

EPC sortate astfel au fost transfectate tranzient să exprime VLA4 utilizând plasmidele pCMV6ltga4 și, respectiv pCMVâ-ItgȘl așa cum sunt descrise în Exemplul 3. Ca martor au fost utilizate plasmide pCMV6-GFP. Pe scurt, a fost amestecat un volum inițial de 90μ1 de soluție tampon cu plasmidele pCMV6-ltga4 și pCMV6-ItgPl suspendate la o concentrație de 11 ng/μΐ cu 10 μΙ dc agent de transfecție Viromer RED (Origene) dizolvat în soluție tampon, conform instrucțiunilor producătorului. Amestecul de plasmide și agent de transfecție a fost lăsat să complexeze timp de 15 minute și a fost adăugat apoi în 200μ1 de suspensie celulară cu concentrație de 2,5 x 105 celule/ ml. Celulele au fost apoi incubate timp dc 3 zile la 37°C. 5% CO2, intr-un agitator de tuburi endover-end” la viteza de aproximativ 6 rotații pe minut pentru a se evita aderarea EPC la plastic. Transfectia a fost verificata prin cuantificarea nivelurilor de ARNm pentru Itga4 și ItgfSl din EPC utilizad tehnica RT-PCR (vezi Figura 4).

Exemplul 5: Evaluarea funcției valvei aortice prin ecocardiografie

Pentru a evalua funcția valvei aortice au fost urmăriți parametrii ecocardiografici ai animalelor diabetice dislipidemice sau doar dislipidemice ca martor care au fost injectate cu celule progenitoare endoteliale (EPC) modificate genetic să exprime GFP sau VLA-4. In acest scop au fost alcătuite patru grupuri a câte 3 animale; 1.) șoareci diabetici injectați cu EPC modificate genetic pentru a exprima GFP, 2) șoareci martor injectați cu EPC modificate genetic pentru a exprima GFP. 3) șoareci diabetici injectați cu EPC modificate genetic pentru a supraexprima VLA4, 4) șoareci martor injectați cu EPC modificate genetic pentru a supraexprima VLA-4. La aceste animale diabetul și dislipidemia au fost induse după cum este descris în Exemplul I iar măsurătorile ecocardiografice au fost făcute în ziua 11 de la inițierea injectărilor intraperitoneale cu streptozotocină sau tampon citrat utilizând un ecograf pentru animale mici de laborator (Vevo2100). Pentru fiecare animal au fost urmărite valorile vitezei transvalvulare la nivelul valvei aortice și diametrul valvei aortice în sistolă, iar valorile medii pe grupuri sunt prezentate în (Figura 6). In mod surprinzător, s-a observat o creștere semnificativă a diametrului în sistolă al valvei aortice a animalelor diabetice dislipidemice injectate cu celule progenitoare endoteliale modificate genetic pentru a supraexprima VLA-4 comparativ cu cel al animalelor diabetice dislipidemice injectate cu celule progenitoare endoteliale martor, modificate genetic cu GFP. De asemenea, surprinzător, s-a remarcat o scădere marcată a vitezei transvalvulare la grupurile de animale diabetice dislipidemice sau doar dislipidemice injectate cu celule progenitoare endoteliale modificate genetic pentru a supraexprima VLA-4 comparativ cu cea de la grupurile de animale diabetice dislipidemice sau doar dislipidemice injectate cu celule progenitoare endoteliale martor, modificate genetic pentru a exprima GFP. Aceste modificări sunt înalt sugestive pentru efectul terapeutic al celulelor progenitoare endoteliale modificate genetic pentru a supraexprima VLA-4 de a preveni și/sau trata valvulopatia asociată dislipidemiei și diabetului.

Exemplul 6: Evaluarea citotoxicității tratamentului cu EPC modificate

Pentru a evalua citotoxicitatea tratamentului cu celule progenitoare endoteliale modificate genetic conform invenției, au fost verificate valorile plasmatice ale transaminazelor TGO (AST) și TGP (ALT) și ale creatininei, ca markeri ai afectării hepatice și, respectiv, renale, la animalele injectate cu celule progenitoare endoteliale transfectate prezentate în Exemplul 5. Așa cum este observat în (Figura 5), la nici unul dintre grupurile de animale injectate cu celule progenitoare endoteliale modificate să supraexprime VLA-4 nu au fost observate valori indicatoare de hepato- sau renotoxicilate.

7/

LISTAREA SECVENȚELOR < l l0> Institutul de Biologie si Patologie Celulara < I2O> PROCEDEU DE OBȚINERE A UNOR CELULE PROGENITOARE ENDOTELIALE

MODIFICATE GEN ETIC <130>NA < I60> 4 < l70> Patentln version 3.5 < 2IO> l < 211 > 3099 < 212> DNA < 213> Mus musculus < 400> 1 atggctgcgg aagcgaggtg cagaccgagg tcccgaggga tcgccctccg ggaagcggtg60 atgctgttgt tgtacttcgg ggtgccaacc gggcactcct acaacctgga cccggagaat120 gcactgctgt accagggccc ctccggcacg ctgtttggct actcggtggt gctgcacagc180 cacgggtcga agcgctggct catcgtgggg gctcccactg ccagctggct ctctaatgcc240 tcagtggtca atcctggggc gatttacaga tgcgggatca gaaagaatcc aaaccagacc300 tgcgaacagc tccagctggg tagccccagt ggagagcctt gtgggaagac atgcctggag36Θ gagagggata accagtggct gggggtcacc ctttccagac agcctggaga aaatggctct42Θ atcgtgactt gtgggcacag gtggaaaaat attttttaca tgaagagcga taacaaactc480 cccactggca tttgctacgt catgccttct gatttgcgga cagaactgag taaaaggatg540 gccccgtgtt acaaagatta tacgagaaaa tttggagaaa attttgcatc atgtcaagct600 ggaatatcta gtttttacac acaggattta attgtgatgg gggccccggg atcatcgtac660 tggactggca ccgtctttgt ctacaatata actacaaacc aatacaaagc atttgtagac720

RO 135386 Α2

agacagaacc	aagtaaaatt	tggaagctac	ttaggctact	cagttggagc	tggacatttt	78Θ
cgaagtccac	atactaccga	agtcgtggga	ggagcccctc	aacacgaaca	gataggaaaa	840
gcatatatat	ttagcattga	tgaaaacgaa	ctgaacatcg	tatatgaaat	gaaaggtaaa	900
aagcttggct	catactttgg	agcttctgtc	tgcgctgtgg	acctcaatgc	agatggcttc	960
tcagatctcc	ttgttggagc	tcccatgcag	agcaccatca	gggaggaagg	aagagtattc	1020
gtgtacatca	actctggcat	gggagctgtg	atggttgaaa	tggaaagggt	ccttgtcgga	1080
agtgacaaat	atgctgcaag	atttggggag	tctatagcga	atcttggcga	cattgacaat	1140
gacggctttg	aagatattgc	tattggtgca	ccacaagaag	acgacttgag	aggtgctgtc	1200
tacatttaca	atggccgagt	cgatggaatc	tcctccacct	actcacagag	aattgaagga	1260
cagcaaatca	gcaaatcatt	aaggatgttt	ggacaatcta	tctcaggaca	aattgatgca	1320
gacaacaatg	gatatgttga	tgtagccgtt	ggtgcatttc	aatctgattc	tgcagtgttg	1380
ctaaggacaa	ggcctgtagt	gattgttgaa	gcatctttaa	gccatcctga	gtctgtaaat	1440
aggacaaagt	ttgactgtac	tgaaaatgga	cttccatctg	tgtgcatgca	tcttacactg	1500
tgtttctcat	ataaaggcaa	agaggtccca	ggctacatcg	ttttgtttta	caatgtgagc	1560
ttggatgtgc	acaggaaggc	agagtctccg	tcaagatttt	atttcttctc	taatgggact	1620
tctgacgtga	ttacaggaag	catacgagtt	tcaagcagtg	gagagaaatg	taggacacac	1680
caggcattca	tgcggaaaga	cgtgcgagac	atccttaccc	ccattcatgt	agaggccaca	1740
taccaccttg	ggcatcatgt	gatcaccaaa	cgaaacactg	aggaatttcc	accactccag	1800
ccgatccttc	agcagaagaa	agaaaaagac	gttattagaa	aaatgataaa	ctttgcaagg	186Θ
ttttgtgcct	atgaaaattg	ctctgctgat	ctccaagttt	ctgcaaaagt	tggatttttg	1920
aagccatatg	aaaataaaac	ctatcttgct	gttgggagca	tgaagaccat	aatgctaaac	1980
gtgtccttgt	tcaacgctgg	cgatgatgct	tacgaaacca	ctctgaatgt	ccaactcccc	2040
acaggccttt	atttcattaa	gatcttagac	ctggaagaga	aacaaataaa	ctgcgaagtg	2100
actgagagct	caggcatagt	gaagcttgcc	tgcagcctag	gttacatata	tgtggatcgc	2160
ctctcaagga	tagacattag	ctttctcctg	gatgtgagct	cactcagcag	ggcacatgag	2220
gacctcagca	tcagtgtgca	tgcctcctgt	gaaaacgagg	gcgaattgga	ccaagtgagg	2280
gacaacagag	tgaccttaac	gatacctcta	aggtatgagg	ttatgctgac	tgttcatggg	2340
A >

Μ

cttgtgaacc	caacttcatt	tgtgtatgga	tctagcgaag	aaaacgagcc	agaaacatgc	2400
atggccgaga	agctgaacct	cactttccat	gttataaaca	ctgggattag	catggctcca	2460
aatgttagtg	tgaaaataat	ggtaccaaat	tcttttctcc	ctcaagatga	taagttgttc	252Θ
aacgttttgg	atgtccagac	aactacaggg	caatgccatt	ttaaacacta	tggaagagag	258Θ
tgtacatttg	cacagcaaaa	aggcatagcg	gggacgttga	ccgatatagt	caaattccta	2640
tcaaagactg	ataagagact	cctgtattgc	atgaaagctg	atcaacactg	tttagatttc	27ΘΘ
ttatgcaatt	tcggaaaaat	ggaaagtggg	aaggaagcca	gcgttcatat	tcagctggag	2760
ggcaggccat	ccatcttgga	aatggatgag	acctcatcac	tcaagtttga	aataaaagca	2820
acagcttttc	cagagccaca	cccaaaagtt	attgaactaa	ataaagatga	gaacgtggcc	2880
catgttttct	tggaagggct	ccatcatcaa	agacccaaac	gacatttcac	catcattatt	294Θ
attaccatca	gcttgctact	tggacttatt	gtacttttat	taatttcatg	tgttatgtgg	3000
aaggctggat	tctttaaaag	acagtacaaa	tctatcctac	aagaagaaaa	caggagagac	3060
agctggagtt	atgtcaacag	caaaagcaat	gatgactga			3099

ί210> 2 î2H> 2,397

212> DNA '213> Mus musculus

î400> 2
atgaatttgc	aactggtttc	ctggattgga	ttgatcagtt	tgatttgttc	tgtatttggc	60
caaacagata	aaaatagatg	tttaaaagca	aatgccaaat	cttgcggaga	atgtatacaa	120
gcagggccaa	attgtgggtg	gtgtacaaat	acgacatttt	tgcaagaagg	aatgcctact	180
tctgcacgat	gtgatgattt	agaagctttg	aaaaagaagg	gttgccagcc	aagtgacata	240
gagaatccca	gaggctctca	aactataaag	aaaaataaaa	atgtcaccaa	tcgcagcaaa	300

x c~î-i>

Μ

gggatggcag	agaagctccg	gccagaagac	attactcaga	tccaaccaca	acagctgctt	360
ctaaaattga	gatcaggaga	accacagaag	tttacattaa	aattcaagag	ggctgaagat	420
taccctattg	atctctacta	ccttatggat	ctctcctact	ctatgaaaga	tgatctggag	480
aatgtgaaaa	gtcttggaac	ggatttgatg	aatgaaatga	ggaggattac	ttcagacttc	540
cgcattggct	ttggctcatt	tgtggagaaa	actgtgatgc	cgtatattag	cacaacccca	600
gcaaagctaa	gaaatccttg	tacaagtgaa	caaaactgca	ccagcccatt	tagctacaaa	6 6 0
aatgtgctta	gtcttactga	cagaggagag	tttttcaatg	aacttgttgg	tcagcaacgc	720
atatctggaa	acttggattc	tccagaaggt	ggctttgatg	caatcatgca	ggttgcggtt	780
tgtggatcgc	tgattggctg	gaggaatgta	acacgactgc	tggtgttttc	cacggatgct	840
gggtttcact	ttgctggaga	tgggaaactt	ggtggtattg	ttttacccaa	tgatggacaa	900
tgtcacctgg	aaaataatgt	atatacaa+g	agccattact	atgattatcc	ttcaattgct	960
caccttgttc	agaaactaag	tgaaaataat	attcagacga	tttttgcagt	tactgaagag	1020
ttccaacctg	tttacaagga	attgaagaat	ttgattccta	agtcagcagt	gggcacactg	108Θ
tctggaaact	ctagtaatgt	gatccagcta	atcatcgatg	cctacaactc	tctttcttca	1140
gaagtcattc	tggaaaatag	caaattgcca	gacggagtaa	caataaatta	caaatcctat	1200
tgcaagaatg	gggtgaatgg	gacaggagaa	aatggacgaa	agtgttccaa	catttctatt	126Θ
ggagatgagg	ttcaatttga	aattagcata	actgctaata	aatgtccaaa	taaggagtct	132Θ
gaaaccatta	aaattaaacc	tctgggcttc	actgaagaag	tagaggtcgt	tcttcagttc	1380
atctgtaagt	gcaattgtca	aagccatggc	atcccagcca	gtcccaagtg	ccatgaggga	1440
aatgggacat	ttgagtgtgg	agcctgcagg	tgcaatgagg	ggcgtgttgg	gaggcactgt	1500
gaatgtagca	cagatgaagt	gaacagtgaa	gacatggacg	cttactgcag	gaaagagaac	1560
agttcggaaa	tctgcagtaa	caatggagaa	tgtgtctgtg	gacagtgtgt	gtgtaggaag	1620
agagataata	caaatgaaat	ttactctgga	aaattctgcg	agtgtgataa	cttcaactgt	1680
gataggtcta	atggcttaat	ttgtggaggc	aatggcgtgt	gcaggtgtcg	tgtttgtgaa	1740
tgctatccca	attacactgg	cagtgcatgt	gactgttctt	tggacactgg	tccatgtcta	1800
gcgtcaaatg	gtcagatctg	caatggccgg	ggtatttgtg	aatgtggtgc	ttgtaagtgc	186Θ
acagatccca	agtttcaagg	gccaacttgt	gagacatgtc	agacctgcct	tggcgtctgt	1920

acagatccca agtttcaagg gccaacttgt gagacatgtc agacctgcct tggcgtctgt1920 gcagagcata aagaatgtgt tcagtgcaga gccttcaata aaggagaaaa gaaagacacg1980 tgtgcacagg agtgctccca cttcaatctc accaaagtag aaagcaggga gaagttgccc2040 cagccggtgc aggtcgatcc tgtgacccat tgcaaggaga aggacattga tgactgctgg2100 ttctatttca cctattcagt gaatggcaac aatgaagcta tcgtgcatgt tgtggagact2160 ccagactgtc ctactggtcc cgacatcatc ccaattgtag caggcgtggt tgctggaatt2220 gttcttattg gccttgcctt gctgctgatt tggaaacttt taatgataat tcatgacaga2280 agggaatttg ctaaatttga aaaggagaaa atgaatgcca agtgggacac gggtgaaaat234Θ cctatttaca agagtgccgt gacaactgtg gtcaatccga agtatgaggg aaaatga2397 <210>3 <211> 3099 <212>DNA <213> Homo sapiens <400>3 atggcttggg aagcgaggcg cgaacccggc ccccgaaggg ccgccgtccg ggagacggtg60 atgctgttgc tgtgcctggg ggtcccgacc ggccgcccct acaacgtgga cactgagagc120 gcgctgcttt accagggccc ccacaacacg ctgttcggct actcggtcgt gctgcacagc180 cacggggcga accgatggct cctagtgggt gcgcccactg ccaactggct cgccaacgct240 tcagtgatca atcccggggc gatttacaga tgcaggatcg gaaagaatcc cggccagacg30Θ tgcgaacagc tccagctggg tagccctaat ggagaacctt gtggaaagac ttgtttggaa360 gagagagaca atcagtggtt gggggtcaca ctttccagac agccaggaga aaatggatcc420 atcgtgactt gtgggcatag atggaaaaat atattttaca taaagaatga aaataagctc480 cccactggtg gttgctatgg agtgccccct gatttacgaa cagaactgag taaaagaata540

G?

gctccgtgtt atcaagatta tgtgaaaaaa tttggagaaa attttgcatc atgtcaagct 600 ggaatatcca gtttttacac aaaggattta attgtgatgg gggccccagg atcatcttac 66Θ tggactggct ctctttttgt ctacaatata actacaaata aatacaaggc ttttttagac '720 aaacaaaatc aagtaaaatt tggaagttat ttaggatatt cagtcggagc tggtcatttt 780 cggagccagc atactaccga agtagtcgga ggagctcctc aacatgagca gattggtaag 840 gcatatatat tcagcattga tgaaaaagaa ctaaatatct tacatgaaat gaaaggtaaa 900 aagcttggat cgtactttgg agcttctgtc tgtgctgtgg acctcaatgc agatggcttc 960 tcagatctgc tcgtgggagc acccatgcag agcaccatca gagaggaagg aagagtgttt 1020 gtgtacatca actctggctc gggagcagta atgaatgcaa tggaaacaaa cctcgttgga 1Θ80 agtgacaaat atgctgcaag atttggggaa tctatagtta atcttggcga cattgacaat 114Θ gatggctttg aagatgttgc tatcggagct ccacaagaag atgacttgca aggtgctatt 12ΘΘ tatatttaca atggccgtgc agatgggatc tcgtcaacct tctcacagag aattgaagga 1260 cttcagatca gcaaatcgtt aagtatgttt ggacagtcta tatcaggaca aattgatgca .1320 gataataatg gctatgtaga tgtagcagtt ggtgcttttc ggtctgattc tgctgtcttg 1380 ctaaggacaa gacctgtagt aattgttgac gcttctttaa gccaccctga gtcagtaaat 144Θ agaacgaaat ttgactgtgt tgaaaatgga tggccttctg tgtgcataga tctaacactt 15Θ0 tgtttctcat ataagggcaa ggaagttcca ggttacattg ttttgtttta taacatgagt 156Θ ttggatgtga acagaaaggc agagtctcca ccaagattct atttctcttc taatggaact 1620 tctgacgtga ttacaggaag catacaggtg tccagcagag aagctaactg tagaacacat 1680 caagcattta tgcggaaaga tgtgcgggac atcctcaccc caattcagat tgaagctgct 1740 taccaccttg gtcctcatgt catcagtaaa cgaagtacag aggaattccc accacttcag 1800 ccaattcttc agcagaagaa agaaaaagac ataatgaaaa aaacaataaa ctttgcaagg 1860 ttttgtgccc atgaaaattg ttctgctgat ttacaggttt ctgcaaagat tgggtttttg 192Θ aagccccatg aaaataaaac atatcttgct gttgggagta tgaagacatt gatgttgaat 1980 gtgtccttgt ttaatgctgg agatgatgca tatgaaacga ctctacatgt caaactaccc 2040 gtgggtcttt atttcattaa gattttagag ctggaagaga agcaaataaa ctgtgaagtc 21Θ0 acagataact ctggcgtggt acaacttgac tgcagtattg gctatatata tgtagatcat 2160

ctctcaagga tagatattag	ctttctcctg	gatgtgagct	cactcagcag	agcggaagag	222Θ
gacctcagta tcacagtgca	tgctacctgt	gaaaatgaag	aggaaatgga	caatctaaag	228Θ
cacagcagag tgactgtagc	aataccttta	aaatatgagg	ttaagctgac	tgttcatggg	2340
tttgtaaacc caacttcatt	tgtgtatgga	tcaaatgatg	aaaatgagcc	tgaaacgtgc	2400
atggtggaga aaatgaactt	aactttccat	gttatcaaca	ctggcaatag	tatggctccc	246Θ
aatgttagtg tggaaataat	ggtaccaaat	tcttttagcc	cccaaactga	taagctgttc	2520
aacattttgg atgtccagac	tactactgga	gaatgccact	ttgaaaatta	tcaaagagtg	2580
tgtgcattag agcagcaaaa	gagtgcaatg	cagaccttga	aaggcatagt	ccggttcttg	2640
tccaagactg ataagaggct	attgtactgc	ataaaagctg	atccacattg	tttaaatttc	2700
ttgtgtaatt ttgggaaaat	ggaaagtgga	aaagaagcca	gtgttcatat	ccaactggaa	2760
ggccggccat ccattttaga	aatggatgag	acttcagcac	tcaagtttga	aataagagca	2.820
acaggttttc cagagccaaa	tccaagagta	attgaactaa	acaaggatga	gaatgttgcg	2880
catgttctac tggaaggact	acatcatcaa	agacccaaac	gttatttcac	catagtgatt	294Θ
atttcaagta gcttgctact	tggacttatt	gtacttctat	tgatctcata	tgttatgtgg	30ΘΘ
aaggctggct tctttaaaag	acaatacaaa	tctatcctac	aagaagaaaa	cagaagagac	3060
agttggagtt atatcaacag	taaaagcaat	gatgattaa			3Θ9 9

<210>4 <211> 2397 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4

atgaatttac	aaccaatttt	ctggattgga	ctgatcagtt	cagtttgctg	tgtgtttgct	60
caaacagatg	aaaatagatg	tttaaaagca	aatgccaaat	catgtggaga	atgtatacaa	'120
gcagggccaa	attgtgggtg	gtgcacaaat	tcaacatttt	tacaggaagg	aatgcctact	180
tctgcacgat	gtgatgattt	agaagcctta	aaaaagaagg	gttgccctcc	agatgacata	24Θ
gaaaatccca	gaggctccaa	agatataaag	aaaaataaaa	atgtaaccaa	ccgtagcaaa	300
ggaacagcag	agaagctcaa	gccagaggat	attactcaga	tccaaccaca	gcagttggtt	360
ttgcgattaa	gatcagggga	gccacagaca	tttacattaa	aattcaagag	agctgaagac	420
tatcccattg	acctctacta	ccttatggac	ctgtcttact	caatgaaaga	cgatttggag	480
aatgtaaaaa	gtcttggaac	agatctgatg	aatgaaatga	ggaggattac	ttcggacttc	540
agaattggat	ttggctcatt	tgtggaaaag	actgtgatgc	cttacattag	cacaacacca	6 0 0
gctaagctca	ggaacccttg	cacaagtgaa	cagaactgca	ccagcccatt	tagctacaaa	66Θ
aatgtgctca	gtcttactaa	taaaggagaa	gtatttaatg	aacttgttgg	aaaacagcgc	720
atatctggaa	atttggattc	tccagaaggt	ggtttcgatg	ccatcatgca	agttgcagtt	780
tgtggatcac	tgattggctg	gaggaatgtt	acacggctgc	tggtgttttc	cacagatgcc	840
gggtttcact	ttgctggaga	tgggaaactt	ggtggcattg	ttttaccaaa	tgatggacaa	900
tgtcacctgg	aaaataatat	gtacacaatg	agccattatt	atgattatcc	ttctattgct	9 60
caccttgtcc	agaaactgag	tgaaaataat	attcagacaa	tttttgcagt	tactgaagaa	1020
tttcagcctg	tttacaagga	gctgaaaaac	ttgatcccta	agtcagcagt	aggaacatta	1080
tctgcaaatt	ctagcaatgt	aattcagttg	atcattgatg	catacaattc	cctttcctca	1.140
gaagtcattt	tggaaaacgg	caaattgtca	gaaggcgtaa	caataagtta	caaatcttac	1200
tgcaagaacg	gggtgaatgg	aacaggggaa	aatggaagaa	aatgttccaa	tatttccatt	1260
ggagatgagg	ttcaatttga	aattagcata	acttcaaata	agtgtccaaa	aaaggattct	1320
gacagcttta	aaattaggcc	tctgggcttt	acggaggaag	tagaggttat	tcttcagtac	1 380
atctgtgaat	gtgaatgcca	aagcgaaggc	atccctgaaa	gtcccaagtg	tcatgaagga	144Θ
aatgggacat	ttgagtgtgg	cgcgtgcagg	tgcaatgaag	ggcgtgttgg	tagacattgt	1500
gaatgcagca	cagatgaagt	taacagtgaa	gacatggatg	cttactgcag	gaaagaaaac	156Θ
agttcagaaa	tctgcagtaa	caatggagag	tgcgtctgcg	gacagtgtgt	ttgtaggaag	1620

agggataata	caaatgaaat	ttattctggc	aaattctgcg	agtgtgataa	tttcaactgt	16 8 0
gatagatcca	atggcttaat	ttgtggagga	aatggtgttt	gcaagtgtcg	tgtgtgtgag	1740
tgcaacccca	actacactgg	cagtgcatgt	gactgttctt	tggatactag	tacttgtgaa	1800
gccagcaacg	gacagatctg	caatggccgg	ggcatctgcg	agtgtggtgt	ctgtaagtgt	1860
acagatccga	agtttcaagg	gcaaacgtgt	gagatgtgtc	agacctgcct	tggtgtctgt	1920
gctgagcata	aagaatgtgt	tcagtgcaga	gccttcaata	aaggagaaaa	gaaagacaca	198Θ
tgcacacagg	aatgttccta	ttttaacatt	accaaggtag	aaagtcggga	caaattaccc	2040
cagccggtcc	aacctgatcc	tgtgtcccat	tgtaaggaga	aggatgttga	cgactgttgg	21Θ0
ttctatttta	cgtattcagt	gaatgggaac	aacgaggtca	tggttcatgt	tgtggagaat	2160
ccagagtgtc	ccactggtcc	agacatcatt	ccaattgtag	ctggtgtggt	tgctggaatt	222Θ
gttcttattg	gccttgcatt	actgctgata	tggaagcttt	taatgataat	tcatgacaga	228Θ
agggagtttg	ctaaatttga	aaaggagaaa	atgaatgcca	aatgggacac	gggtgaaaat	2340
cctatttata	agagtgccgt	aacaactgtg	gtcaatccga	agtatgaggg	aaaatga	2397

' ............ ,>·.;

Bibliografie

Abplanalp, W. T., D. J. Conklin, J. M. Cantor, Μ. H. Ginsberg, M. Wysoczynski. A. Bhatnagar and T. E. O'Toole (2016). Enhanced Integrin alpha4betal-Mediated Adhesion Contributes to a Mobilization Defect of Endothelial Progenitor Cells in Diabetes. Diabetes 65(11): 3505-351 5.

Asahara, T,, H. Masuda, T. Takahashi, C. Kalka, C. Pastore, M. Silver. M. Kearne, M. Magner and .1. M. Isner (1999). Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization, Circ Res 85(3): 221-228.

Barczyk, M., S. Carracedo and D. Gullberg (2010). Integrins. Cell Tissue Res 339(1): 269-280. Carmeliet, P., V. Ferreira, G. Breier, S. Pollefeyt. L. Kieckens, M. Gertsenstein. M. Fahrig. A. Vandenhoeck, K. Harpal, C. Eberhardt, C. Declercq, J. Pawling, L. Moons, D. Collen, W. Risau and A. Nagy (1996). Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele. Nature 380(6573): 435-439.

Guariguata, L., D. R. Whiting, I. Hambleton, J. Beagley, U. Linnenkamp and J. E. Shaw (2014). Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract 103(2): 137-149.

Haltori. K.. B. Heissig, K. Tashiro, T. Honjo, M. Tateno, J. H. Shieh, N. R. Hackett. M. S. Quitoriano, R. G. CrystaL S. Rafii and M. A. Moore (2001). Plasma elevation of stromal cellderived factor-1 induces mobilization of mature and immature hematopoietic progenitor and stern cells. Blood 97(11): 3354-3360.

Lorusso, R., S. Gelsomino, F. Luca, G. De Cicco, G. Bille, R. Carella, E. Villa, G. Troi.se. M. Vigano, C. Banfi, C. Gazzaruso, P. Gagliardotto, L. Menicanti, F. Formica, G. Paolini, S. Benussi. O. Alfieri. M. Pastore, S. Ferrarese, G. Mariscalco, G. Di Credico, C. Leva, C. Rtisso, A. Cannala, R. Trevisan, U. Livi, R. Scrofani, C. Antona. A. Sala, G. F. Gensini, J. Maessen and A. Giustina (2012). Type 2 diabetes mellitus is associated with faster degeneration of bioprosthetic valve: results from a propensity score-matched Italian multicenter study. Circulation 125(4): 604-614.

Matsumoto, Y., V. Adams. C. Walther, C. Kleinecke, P. Brugger, A. Linke, T. Walther, F. W. Mohr and G. Schuler (2009). Reduced number and function of endothelial progenitor cells in patients with aortic valve stenosis: a novei concept for valvular endothelial cell repair. Eur Licări .1 30(3): 346-355.

Miranti, C. K. and J. S. Brugge (2002). Sensing the environment: a historical perspective on integrin signal transduction. Nat Cell Biol 4(4): E83-90.

Moța, M., S. G. Popa, E. Moța, A. Mitrea, D. Catrinoiu, D. M. Cheta, C. Guja, N. Hancu, C. lonescu-Tirgoviste, R. Lichiardopol, B. M. Mihai, A. R. Popa. C. Zetu, C. G. Bala, G. Roman, C. Serafinceanu, V. Serbau, R. Timar, I. A. Veresiu and A. R. Vlad (2016). Prevalence of diabetes mellitus and prediabetes in the adult Romanian population: PREDATORR study. J Diabetes 8(3): 336-344.

Schulte. J. B., A. Simionescu and D. T. Simionescu (2013). The acellular myocardia! Hap: a novei exlracellular matrix scaffold enriched with patent microvascular networks and biocompatible cell niches. Tissue Eng Part C Methods 19(7): 518-530.

Stroncek. D. F., V. Fellowes, C. Pham. H. Khuu, D. H. Fowler, L. V. Wood and M. Sabatino (2014). Counter-fiow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. J Transl Med 12: 241.

Szmitko, P. E., C. ÎL Wang, R. D. Weisel, J. R. de Almeida, T. J. Anderson and S. Verma (2003). New markers of inflammation and endothelial cell activation: Part I. Circulation 108(16): 19171923. Takada, Y., X. Ye and S. Simon (2007). The integrins. Genome Biol 8(5): 215.

Urbich, C. and S. Dimmeler (2004). Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ Res 95(4): 343-353.

Claims (12)

1. REVENDICĂRI:

   1. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic caracterizat prin aceea ca, o prima etapă (1) este de recoltare a sângelui de la pacient, de la un donator ( la), dintr-o colecție de sânge de la mai mulți donatori (1b), urmată de o etapa (2) de separare a monocitelor prin centrifugare, unde densitatea mediului de separare în gradient de densitate este cuprinsă între 1 și 1,2 g/cnr’, cu un optim cuprins între 1,05 și 1,1 g/cm³; pentru eliminarea suplimentară a posibilelor eritrocite care contaminează celulele mononucleare purificate in aspectele invenției prezentate mai sus este utilizată o etapă (3) de liză celulară, urmată de o etapa (4) de izolare EPC, in care celulele progenitoare endoteliale (EPC) sunt izolate din monocitele sanguine pe baza exprimării la suprafața lor celulară a proteinelor marker de celule progenitoare. CD34. CD133 și a markeri-lor de celule endoteliale CD31, VEGFR2, urmată de o etapă (5) de identificare EPC, pentru care sunt selectați anticorpii utilizați pentru identificarea EPC din categoria anticorpilor specifici conjugați cu lluorofori (5a), anticorpilor primari specifici care sunt neconjugați (5b), care sunt la rândul lor legați de anticorpi secundari care recunosc izotipul anticorpului primar, urmată de o etapă (6) de procese specifice de transfer deliberat de acid nucleic, unde celulele progenitoare endoteliale (EPC) izolate sunt transfectate pentru a supraexprima proteina VLA-4, un heterodimer alcătuit din subunitățile proteice, integrină «4 (Itga4) și integrină βΐ (ItgPl), acizii nucleici care codifică (Itga4) și (Itgβl) pot fi donați într-un vector, de tip: plasmidă. cosmidă. bacmid. fag, cromozom artificial sau virus, care permite inserarea unui secvențe genetice (AND, ARN) pentru a se obține replicarea si translația secvenței atașate; într-o etapă (7) are loc administrarea EPC modificate genetic către pacient prin injectare (7a), perfuzare intravenoasă (7b).
2. 2. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic, conform cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că, într-o primă variantă (2.1) separarea monocitelor se face prin centrifugare în gradient de densitate, într-un recipient tubular pentru o durată cuprinsă între 5-60 minute, utilizând forțe de la 100 la 1000 x g, unde se obține în partea superioară a tubului o bandă (A) de plasma sanguină, o bandă (B) care conține monocite, o bandă (C) unde se găsește mediul de separare în gradient (C) care poate conține celulele polimorfonucleare. iar in partea de jos o banda (D) a eritrocitelor sedimentate, pentru prelevarea monocitelor din banda (B) este necesar a se îndepărta banda de plasmă (A) de la suprafața benzii de monocite (B) și apoi să fie aspirate monocitele, evitând aspirarea mediului de separare pentru a evita contaminarea cu celule polimorfonucleare.
3. 3. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic, conform cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea ca, intr-o a doua variantă (2.2) separarea monocitelor se face prin centrifugare împotriva curgerii si se utilizează principiul de funcționare al unui elutriator ce constă în stabilirea unui echilibru între forțele centrifuge și de frecare la curgere dintr-o cameră specială, montată într-o centrifugă, care este alimentată cu suspensie celulară, inițial, celulele sunt menținute prin forța centrifugă în partea camerei cu raza cea mai mare de centrifugare, apoi este crescut debitul soluției în care sunt suspendate celulele iar acestea sunt antrenate astfel către centrul rotorului de centrifugare, nivel la care sunt eluate prin sistemul de tuburi al elutriatorului. deoarece particulele cu densitate mică pot să părăsească camera la viteze de curgere mai mici decât cele necesare pentru particulele cu densitate mai mare, se poate face separarea diferitelor fracții dc celule sanguine, limfocitele și eritrocitele fiind eluate în primele fracții, iar neutrofilele în fracții mai târzii.
4. 4. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic, conform cu revendicarea 1-3, caracterizat prin aceea ca, etapa de izolare (4) este realizată într-o variantă (4a) prin separarea prin adsorbție la suprafețe acoperite cu anticorpi CD34, CD133, CD31. antiVEGFR2.
5. 5. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic, conform cu revendicarea 1-3, caracterizat prin aceea ca, etapa de izolare (4) intr-o altă variantă (4b) este realizată prin sortarea celulară activată de fluorescență a celulelor care au fost puse anterior în contact cu anticorpi solubili CD34, CD 133, CD31, anti-VEGFR2.
6. 6. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic conform cu revendicarea 1 -5. caracterizat prin aceea ca, într-o variantă a etapei (5), cantitatea de anticorpi utilizată este între 0,001 pg de anticorp/ IO⁶ celule și 100 pg de anticorp/ 10⁶ celule, un optim este între 0,1 pg de anticorp/ IO⁶ celule și 1 pg de anticorp/ IO⁶ celule, se poate varia concetrația de celule din timpul etapei de colorare cu anticorpi, concentrația celulelor din timpul etapei de colorare cu anticorpi este între IO⁹ celule/ml și 10’ celule/ml, un optim este între 10⁸ celule/ml și IO⁶ celule/ml.
7. 7. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic conform cu revendicarea 1 si 5, caracterizat prin aceea că, în varianta (4b) de sortare celulară activată de fluorescență a celulelor care au fost puse anterior în contact cu anticorpi solubili CD34, GDI33. CD31, anti-VEGFR2, sortarea celulară activată de fluorescență este o tehnică adaptata a citometriei în flux, utilizată pentru separarea celulelor dintr-o populație heterogenă de celule pe baza diferențelor de împrăștiere a luminii și de fluorescență, aceste diferențe de fluorescentă pot li dale de colorarea diferențială a celulelor cu anticorpi specifici pentru proteine de la suprafața celulară.
8. 8. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic conform cu revendicarea 1-7, caracterizat prin aceea că, într-o variantă (6a) a proceselor specifice (6). transfecția este tăcută cu vectori individuali pentru exprimarea celor două subunități ale VLA-4. respectiv ltga4 și ItgȘl in doua posibilități de realizare,
9. 9. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic conform cu revendicarea 1-8, caracterizat prin aceea că. pentru reglarea exprimării, vectorul conține un segment promotor activ constitutiv, o secvență promotor inductibil, gene care codifică pentru rezistența la antibiotice pentru selectarea celulelor transfectate, secvențe reglatoare, de exemplu, un situs intern de intrare ribozomală.
10. 10. Procedeu de obținere a unor celule progenitoare endoteliale modificate genetic conform cu revendicarea 1-8, caracterizat prin aceea că, într-o altă variantă (6b) a proceselor specifice (6). transfecția poate fi făcută cu un singur vector de exprimare care conține ambele integrine membranare Itga4 și ItgPl, cele două fragmente de acid nucleic sunt unite astfel încât secvențele de aminoacizi codificate de cele două fragmente de acid nucleic rămân în cadru pentru translația celor două proteine, opțional unite cu un linker flexibil, ca un singur produs de translație.
11. 11. Celule progenitoare endoteliale modificate genetic conform revendicării 1-10, caracterizate prin aceea că, secvența de acid nucleic care codifică proteina ltga4 cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%. 97%. 98% , 99% , 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:1 și secvența de acid nucleic care codifică proteina ItgȘl cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,’ 96%, 97%, 98% , 99% . 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:2.
12. 12. Celule progenitoare endoteliale modificate genetic conform revendicării 1-10, caracterizate prin aceea că, secvența de acid nucleic care codifică proteina ltga4 cuprinde o secvență de acid nucleic are o identitate a secvenței de cel puțin 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%. 98% , 99%, 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:3 și secvența de acid nucleic care codifică proteina Itgpl cuprinde o secvență de acid nucleic care are o identitate a secvenței de cel puțin 90%. 91%, 92%, 93%. 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% , 100% cu secvența de acid nucleic din SEQ ID NR:4. ,