RO135202A0

RO135202A0 - Procedeu de încapsulare duală a două categorii de principii vegetale bioactive în acelaşi sistem de distribuţie nanostructurat

Info

Publication number: RO135202A0
Application number: RO202100220A
Authority: RO
Inventors: Ioana Lăcătuşu; Maria Nicoleta Badea; Anca Lucia Pop; Teodora-Alexandra Iordache; Teodora- Alexandra Iordache; Coriolan Pop
Original assignee: Ac Helcor S.R.L.
Priority date: 2021-04-29
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2021-09-30
Also published as: RO135202A8

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unor sisteme nanotransportor duale cu aplicaţie în tratamentul afecţiunilor inflamatorii. Procedeul, conform invenţiei, constă în etapele de: formare a unei faze lipidice conţinând un amestec de monostearat de gliceril:palmitat de cetil:ulei de luminiţa nopţii sau ulei de soia, într-un raport în greutate de 1:1:0,85, adăugarea în faza lipidică a unui extract de yam sălbatic (EYS), standardizat în 95% Diosgenina, care asigură un conţinut de 3,3...3,7% principiu bio-activ în sistemul transportor lipidic nanostructurat (NLC) dual, formarea unei faze apoase conţinând un amestec de surfactanţi de tip Tween20:Fosfatidilcolină:Poloxamer 188 într-un raport în greutate de 1:0,21:0,21, adăugarea în faza apoasă a unui extract de lemn dulce (ELD) standardizat în 10% Acid glicirizic,care asigură un conţinut de 3,7...13,2% principiu bio-activ în sistemul NLC dual (NLC-EYS-ELD), omogenizarea pre-emulsiei lipidice şi răcire sub agitare, la temperatura camerei, urmată de liofilizare la temperatura de -55°C, timp de 60 h, din care rezultă sisteme nanotransportor duale care asigură o eliberare susţinută şi constantă a celor două principii active precum şi o amplificare a activităţii antioxidante şi a efectului antiinflamator.

Description

Cu începere de la data publicării cererii de brevet, cererea asigură, în mod provizoriu, solicitantului, protecția conferită potrivit dispozițiilor art.32 din Legea nr. 64/1991, cu excepția cazurilor în care cererea de brevet de invenție a fost respinsă, retrasă sau considerată ca fiind retrasă, întinderea protecției conferite de cererea de brevet de invenție este determinată de revendicările conținute în cererea publicată în conformitate cu art.23 alin.(1) - (3).

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIH

IIIIIIIIIIIIIIIM^

RO 135202 AO iOFICIUl Db 8W Pgtf.W WV'W I* ^^CiI Cerere ds brevet de invenție

Nr. ...^...?^..<..2.^

Data depozit ...Z^.^.'.^ZJ...

PROCEDEU DE ÎNCAPSULARE DUALA A DOUA CATEGORII DE PRINCIPII VEGETALE BIOACTIVE IN ACELAȘI SISTEM DE DISTRIBUȚIE NANOSTRUCTURAT

I. DESCRIERE

Invenția prezentă se referă la un procedeu de co-incapsulare duala a principiilor bio-active vegetale (extract de yam sălbatic si extract de lemn dulce), in sisteme nanotransportor lipidice preparate cu amestecuri de lipide biocompatibile (esteri de glicerol si uleiuri vegetale) si surfactanti ce fac parte din categoria GRAS (Tween 20, fosfatidil colina si poloxamer 188). Procedeul propus in prezenta invenție permite: (i) cuplarea, in același sistem lipidic nanostructurat, a doua categorii de principii active vegetale bioactive, de natura lipofila si hidrofila (extract de yam sălbatic - EYS, standardizat in 95% Diosgenina si extract de lemn dulce - ELD, standardizat in 10% Acid glicirizic); (ii) obținerea unor nanotransportor) lipidici pe baza de ulei de luminița nopții si ulei de soia ce prezintă o biocompatibllitate ridicata si lipsa unui efect citotoxic potențial; (iii) creșterea biodisponibilitatii DSG si a ELD, dovedita prin teste in vitro de digestie; (iv) îmbunătățirea administrării orale a extractelor vegetale, prin asigurarea unei eliberări susținute si constante a celor doua principii bioactive vegetale (EYS si ELD); (v) amplificarea activitatii antioxidante si a efectului antiinflamator. Rezultatele complexe si efectele biologice multiple demonstrate le conferă acestor sisteme lipidice nanotransportor duale un potențial aplicativ in tratamentul afecțiunilor inflamatorii dar si pentru creșterea calitatii vieții populației feminine aflata in perioada menopauzala.

Administrarea orală este calea preferată pentru administrarea unui medicament, datorita convenienței și ușurinței de administrare, deși majoritatea medicamentelor au solubilitate scăzută în apă, instabilitate chimică, absorbție intestinală slabă, dar și metabolizare extinsă. Așadar, exista o serie de factori care limitează eficienta administrărilor orale, respectiv rata și gradul de absorbție al medicamentelor, cei mai reprezentativi fiind: stabilitatea și solubilitatea medicamentului în fluidele gastro-intestinale, timpul de ședere in tractul gastro-intestinal, permeabilitatea membranei și metabolismul presistemic. Majoritatea medicamentelor prezintă probleme de biodisponibilitate (absorbție intestinala) din cauza funcției de barieră a tractului gastro-intestinal și a metabolismului primar. Deoarece viteza și amploarea absorbției sunt adesea controlate de rata de dizolvare a medicamentului în tractul gastro-intestinal, îmbunătățirea caracteristicilor de dizolvare a medicamentelor insolubile continuă să fie o sarcină majoră pentru oamenii de știință.

Pana in prezent au fost adoptate mai multe strategii pentru îmbunătățirea comportamentului de dizolvare a medicamentelor insolubile, care includ: complexare, derivatizarea medicamentelor, creșterea suprafeței de contact (prin micronizare sau canonizare), uscare prin pulverizare și microincapsulare etc. In diferite cercetări se sugerează că biodisponibilitatea orală a medicamentelor lipofile poate fi îmbunătățită atunci când este administrată concomitent cu o masă bogată în grăsimi. Acest concept a făcut să se dezvolte diferitele formulări de sisteme de distribuție coloidale, de natura lipidica, ca mijloc de a îmbunătăți solubilizarea și permeabilitatea medicamentului de-a lungul barierei gastro-intestinale. Dintre diferitele sisteme coloidale de eliberare a medicamentelor, transportorii lipidici nanostructurat! (NLC) conferă avantaje distincte (ex: biocompatibllitate, eliberare controlata a medicamentului, biodisponibilitate avansata, posibilitatea de producere la scara larga etc ). Nanotransportorii lipidici sunt constituiti din lipide biocompatibile și biodegradabile, fiind ideale pentru medicamentele lipofile și slab

RO 135202 AO solubile, sporind astfel absorbția lor orală. în plus, datorită transportului limfatic, metabolismul primar este redus, concomitant cu o creștere a biodisponibilității. Un astfel h de efect pare să se datoreze drenarii nanoparticulelor lipidice direct în circulația sistemică, ¹prin canalul toracic care ocolește circulația portală.

Aceste sisteme lipidice nanostructurate reprezintă o strategie promițătoare pentru a depăși constrângerile menționate, principalul scop urmărit fiind acela de a îmbunătăți administrarea orală a medicamentelor convenționale (de sinteza) si, potrivit ultimelor cercetări din domeniu, a compușilor bioactivi proveniti din diferite surse vegetale. Marele interes în explorarea compușilor bioactivi din plante în scopuri terapeutice este in continua creștere și va fi mai stimulat în viitor. Acest lucru se datorează in principal, efectelor secundare ale medicamentelor de sinteza și provocărilor de toxicitate. Utilizarea medicamentelor sintetice a stârnit o îngrijorare mai mare din cauza costului ridicat al acestora, precum și a unui număr considerabil de efecte secundare. Prin urmare, explorarea unei terapii accesibile și ușor disponibile, cu efecte secundare minime, este de o importanță absolută și indispensabilă pentru gestionarea îmbunătățită a unor boli cronice care provoacă invaliditate la nivel mondial, în ciuda progreselor remarcabile realizate în domeniul terapeuticii de-a lungul anilor. Ca o tendință de creștere, World Health Organisation a raportat faptul ca peste 80% din populația mondiala se bazează pe medicamente pe bază de plante (fitomedicina) pentru un anumit aspect al nevoilor lor primare de îngrijire a sănătății (Parama et al., 2020; Rachmawati et al., 2020).

în ciuda relevanței farmacologice a uleiurilor și a extractelor provenite din diferite surse vegetale, potențialul terapeutic al multor principii active din plante este încă insuficient explorat în domeniul nanotehnologie - sănătate. Având în vedere tendințele actuale la nivel mondial, utilizarea resurselor vegetale pentru furnizarea de principii bioactive care sa manifeste multiple efecte terapeutice si efecte secundare diminuate sau chiar inexistente, deschide noi perspective în domeniul biomedical.

în prezenta cercetare inovativa, am fost interesați de dezvoltarea și demonstrarea eficientei terapeutice a unor nanosisteme lipidice pentru protecția, transportul si distribuția de principii bioactive vegetale (lipofile si hidrofile) pe cale orală. Cele doua principii vegetale de natura lipofila si hidrofila, care vor fi cooptate in același sistem de distribuție lipidic nanostructurat sunt: extractul de yam sălbatic, standardizat in 95% Diosgenina, DSG (principiu vegetal de natura lipofila) si extractul de lemn dulce, standardizat in 10% Acid glicirizic (principiu vegetal hidrofil). Scopul final este asociat cu creșterea biodisponibilitatii principiilor active provenite din cele doua surse vegetale (Diosgenin si Acid glicirizic), protejarea acestora împotriva degradării tractului gastrointestinal, creșterea solubilității lor orale (ceea ce permite o creștere a permeabilității intestinale), evitarea metabolismului primar, concomitant cu obținerea unor efecte antiinflamatoare si antioxidante amplificate. Transportorii lipidici nanostructurati (NLC) descris! in actuala propunere de brevet sunt obținuți în conformitate cu optimizarea unei metode descrisă anterior, de același grup de autori (RO 131955, 30.05.2019).

Diosgenina (DSG, 3p-hidroxi-5-spirosten) este o saponina steroida naturala (Fig. 1), derivata din plante, care se găsește predominant în Yam-ul sălbatic (Dioscorea villosa) si in planta terapeutica denumita Fenugreek (Trigonella foenum greaceum). DSG este cunoscută pentru bioactivitatea sa, pentru proprietățile biocompatibile și netoxice si prin urmare, in ultimii ani s-au efectuat multe studii pentru a explora potențialul acesteia pentru o mare varietate de afecțiuni medicale.

RO 135202 AO

Fig. 1. Principii vegetale bio-active din extractele vegetale: a. Diosgenin din extractul de yam sălbatic/Discorea villosa', b. Acid glicirizic din extractul de lemn cMce/Glycyrrhiza glabra

DSG prezintă o gamă largă de activități farmacologice puse in evidenta in numeroase studii preclinice si clinice. Studiile efectuate au demonstrat că DSG manifesta efecte terapeutice in cazul mai multor tipuri de cancer (incluzând carcinomul mamar, osteosarcomul, carcinomul de colon, leucemia și cancerul de prostată), rol protector în bolile cardiovasculare (cum ar fi tromboza și ateroscieroza), ameliorează diabetul si hiperlipidemia, reglează tulburările neurodegenerative, creste proliferarea celulara in modelele de piele umana si manifesta efecte accentuate in reglarea simptomelor menopauzale. Efectele anticancerigen, protector cardiovascular, anti-diabetic, neuroprotector, imunomodulator, estrogenic și de protecție a pielii, demonstrate prin numeroase studii preclinice, sunt datorate unor fenomene precum inducerea apoptozei, suprimarea transformărilor maligne, imbunatatirea funcției anticoagulante si inhibarea agregării trombocitelor, scăderea stresului oxidativ, prevenirea evenimentelor inflamatorii, promovarea proliferării celulare, reglarea răspunsul imun al celulelor T etc. în plus, DSG îmbunătățește statutul antioxidant și inhibă peroxidarea lipidelor. Este benefică în îmbunătățirea funcției celulelor endoteliale, neurocitelor, celulelor miocardice, celulelor musculare netede vasculare și celulelor epiteliale. Activitatea sa antiinflamatoare se realizează prin inhibarea producerii de citokine pro-inflamatorii, enzime și molecule de adeziune.

Aceste studii preclinice si mecanistice realizate pe Diosgenin oferă o bază reala si ampla pentru valorificarea acestui produs natural bio-activ in farmacoterapia diferitelor boli.

In ciuda potențialului terapeutic vast al DSG, aplicarea clinică a diosgeninei în terapiile mai sus menționate este limitată din cauza unor caracteristici nedorite, cum ar fi: profil farmacocinetic slab, solubilitate scăzută, lipofilicitate ridicata, timp de înjumătățire relativ scurt, biodisponibilitate scăzută și instabilitate în diferite condiții fiziologice. Rezultatele farmacocinetice au arătat că biodisponibilitatea absolută a DSG la șobolani este de doar 6-7% (Liu et ai., 2017; Okawara et al., 2014). Așadar, terapia orală cu DSG

RO 135202 AO nu poate fi eficientă din cauza disponibilității scăzute a DSG în circulația sistemică (<7%), care se datorează solubilității sale scăzute și metabolismului primar extins. Din cauza acestor deficiente, proiectarea unui sistem de distribuție adecvat pentru DSG reprezintă o problemă majoră.

Pentru a îmbunătăți eficacitatea și biodisponibilitatea dîosgeninei s-au întreprins numeroase abordări, inclusiv prepararea nanocristalelor-DSG (Liu et al., 2017), nanoparticule-DSG polimerice, obținute prin functionalizarea DSG cu acid hialuronic (Quinones et al., 2017), sau prin conjugare cu polimeri hidrofili, de exemplu cu mPEG (Wei et al., 2018: Erdagi et al., 2019). Intensificarea biodisponibilitatii DSG a fost demonstrata si in cazul nano-DSG, utilizând bistraturi de chitosan sau albumina (Pathak et al., 2018) sau a cristalelor lichide cu complecși de incluziune de tip b-ciclodextrine (Okawara et al., 2014). Legarea compușilor naturali proveniti din diferite surse vegetale cu diferiți polimeri (in generai prin legaturi covalenîe) oferă oportunități atât legate de dezvoltarea unor noi formulări biocompatibile cu proprietăți mai bune cât și de a spori eficacitatea substanței bioactive distribuite (Erdagi et al., 2013). Polimerii naturali și sintetici au fost asociați cu mai mulți compuși biologic activi pentru a îmbunătăți permeabilitatea celulara, proprietățile mucoadezive, precum si eliberarea controlată și țintită a medicamentului.

Așa cum s-a raportat în literatură, atât complexele DSG-ciclodextrină, nanoparticulele polimerice cu DSG sau nanocristalele cu DSG au prezentat solubilitate apoasă și o biodisponibilitate orală superioară în comparație cu DSG. Cu toate acestea, aceste metode au o serie de limitări: consumă mult timp, necesită o cantitate mare de excipienți și au o capacitate redusă de încărcare a medicamentelor. Prin urmare, este necesar să se investigheze un sistem alternativ de distribuție pentru DSG care să-i îmbunătățească biodisponibilitatea orală, oferind în același timp o capacitate mare de încărcare, o buna accesibilitate dar si ușurința de producție.

In literatura de specialitate, respectiv in cercetarea brevetelor, nu au fost găsite studii referitoare la nanoformularea acestui principiu bioactiv vegetai, Diosgenina (DSG), in matrici lipidice nanostructurate (NLC). In CN1857287 s-a prezentat prepararea unor nanopulberi de DSG pentru tratarea bolilor vasculare cardiace și cerebrale. Pentru preparare s-a folosit un material lipidic (ex: un amestec de unul sau mai multe dintre următoarele lipide: lecitină din soia, cefalină, vitamina E, ulei de soia, acid stearic, alcool stearilic, monostearat de gliceril, tristearat de gliceril), iar procedeul a constat intr-o etapa intermediara de obținere a nanoemulsiilor de DSG prin tehnica omogenizării la presiune înaltă, urmata de liofilizare, cu obținerea nanopulberilor de DSG. Deasemenea prepararea nanoparticulelor polimerice de DSG, prin conjugarea DSG la PEG, a fost brevetata in CN107137716A.

Extractul de lemn dulce (ELD) este unul dintre cele mai renumite medicamente pe bază de plante din întreaga lume, întâlnit in rădăcinile uscate ale unor specii de gliciriza precum Glycyrrhiza uralensis Fisch., Glycyrrhiza înfiata Bat. și Glycyrrhiza glabra L. Studiile fitochimice au demonstrat că lemnul dulce conține o varietate de compuși chimici, cum ar fi glicozide fiavonice, saponine triterpenoide și polizaharide (Wu et a!., 2017) Componentele chimice cunoscute ale Glycyrrhiza glabra includ: saponine (în principal glicirizină, 13%), flavonoide (1,5%), cumarină, alcaloizi, polizaharide, sitosterol și aminoacizi (Lietal., 2014).

în ultimii 50 de ani, activitatea biologică și terapeutică a extractului de lemn dulce a fost investigată intens în Asia și Europa și s-a confirmat că este netoxică (Selyutina et al., 2019). Lemnul dulce este utilizat pe scară largă în medicina tradițională chineză. Extractul

RO 135202 AO de lemn dulce este recunoscut în farmacopeea chineză pentru a trata diferite boli, cum ar fi astmul, gastrita, hepatita și toxicoza. Notabil este si faptul ca Glycyrrhiza glabra poate completa alte medicamente pentru a reduce toxicitatea și a crește eficacitatea (Li et al., 2014).

Acidul glicirizic (GA) numit și glicirizină, este cel mai important ingredient bioactiv din rădăcina de lemn dulce, fiind si principalul glicozid triterpenic din Glycyrrhiza glabra. GA constă dintr-o moleculă de acid 18-/?-gliciretinic și două molecule de acid glucuronic (acid 18-/?-gliciretinic-3-O-/W-glucuronopiranozil-(1 -»2)-beta-D-glucuronid). Din punct de vedere chimic, GA este o moleculă amfifilă: partea hidrofilă este reprezentată de resturile de acid glucuronic, iar partea hidrofobă este restul de acid gliciretic.

GA posedă o gamă largă de activități farmacologice și biologice (antivirală, antiinflamatorie, anticanceroasă, hepatoprotectoare etc.), fiind frecvent utilizat pentru tratamentul leziunilor hepatice acute și cronice, hepatitei virale, steatozei hepatice, fibrozei hepatice, hepatomului, miocarditei virale și a altor boli precum psoriazisul sau cancerul de prostata (Li et al., 2014). GA cuplat cu acid gliciretinic și acid 18-beta-gliciretic a fost dezvoltat în China sau Japonia ca medicament antiinflamator, antiviral și antialergic pentru boli hepatice (Li et al., 2014).

GA îmbunătățește efectul terapeutic al altor molecule medicamentoase (Selyutina et al., 2019). Una dintre explicațiile diferitelor tipuri de activitate a GA, indiferent dacă este antivirală, antiinflamatorie, hepatoprotectoare sau anticanceroasă, este activitatea de modificare a membranei. Modificările permeabilității membranei, fluidității, formării porilor și modificărilor potențialului trans-membranar de către GA au fost semnalate in cateva studii recente (Selyutina et al., 2019).

Acidul glicirizic prezintă un grad ridicat de biocompatibilitate, fiind aprobat de SUA Food and Drug Administration (FDA) ca îndulcitor alimentar (Omar și colab., 2012); ca atare, este utilizat deasemenea si în industria alimentară ca îndulcitor natural și agent aromatizant (in băuturi, bomboane, produse de cofetărie etc.).

Biodlspombilitatea acidului glicirizic după administrarea orala este redus (Li et al., 2014). După ingestia de lemn-dulce, acidul glicirizic este supus proceselor metabolice, fiind hidrolizat la acid gliciretic de către enzimele microflorei intestinale (Ploegeret al., 2001). Se pare ca efectele farmacologice ale GA sunt în esență aceleași cu cele ale acidului gliciretinic rezultat (Li et al., 2014).

Referitor la valorificarea extractului de lemn dulce in domeniul nanotehnologiei, aceasta a debutat doar in urma cu cativa ani. De exemplu, extractul etanolic din rădăcinile Glycyrrhiza glabra a fost încorporat în lipozomi și hialurozomi pentru a dezvolta formulări topice pentru protejarea pielii (Castangie et a!., 2015). Au fost deasemenea publicate cercetări in care s-au dezvoltat diferite sisteme nanotransportor polimerice (pe baza de chitosan) pentru sporirea activității antiinflamatorii și creșterea solubilității în fluidele biologice (Seema et al., 2018).

In literatura patentelor exista doar o invenție (CN104367483A) in care este abordata încapsularea ELD in sisteme lipidice nanotransportor. Invenția prezintă prepararea de NLC ce incapsuleaza extract de lemn dulce, utilizând omogenizarea la presiune ridicata (10MPa). Problema tehnică rezolvată prin invenție: metodă de obținere care asigura o bună stabilitate, etape simple de preparare și o bună repetabilitate. Nanotransportorul lipidic cu extract de lemn dulce este caracterizat prin aceea că este alcătuit din următoarele componente (in procente de greutate): 1-5% extract de lemn dulce; 8-16% Emulgator; 15 ~ 25% material lipidic, iar restul este apă deionizată.

RO 135202 AO

Utilizarea uleiurilor vegetale pentru producția de NLC a fost semnalata intr-un număr limitat de brevete, care includ si cercetări inovative ale prezentului grup de autori. De exemplu, in RO130098, 29.11.2018 au fost dezvoltate sisteme NLC pe baza de ulei din tarate de orez si ulei din sâmburi de zmeura ce incapsuleaza filtre solare (UV-A si UV-B), cu dezvoltarea de formulări cosmetice cu proprietăți antioxidante si fotoprotective. In RO131547, 27.11.2020 si RO128703, 30.05.2018, au fost preparate sisteme lipidice nanotransportor cu proprietăți antioxidante si antitumorale, unde matricea lipidica a fost formata din diferite tipuri de lipide solide in asociere cu uleiuri vegetale printre care uleiurile din sâmburi de struguri si uleiul de amarant. In patententul US 2012/0128777A1 uleiul de canepa a fost folosit cu scopul obținerii unor micro- si nanoparticule lipidice care sa conducă la acumularea la nivel dermic a particulelor solide. Alte sisteme de distribuție de tip NLCs ce incapsuelaza vitamina C, vitamina A si preparate cu ulei de soia au fost brevetate in US 2013/0017239 A1. Compoziția unor nanocapsule lipidice pe baza de ulei de oregano, cu proprietăți antibacteriene, antifungice si antiparazitice a fost descrisa in US 2014/0045692A1.

NLC-extracte sau ingrediente active de origine vegetala

Deși sunt bine cunoscute beneficiile ambelor entități naturale, uleiuri vegetale și extracte vegetale, există totuși un deficit major în literatura de specialitate cu privire la asocierea ambelor categorii de principii vegetale, in sistemele lipidice nanotransportor. Doar un număr restrâns de cercetări au fost raportate pentru a înlocui total sau parțial nano-încapsularea medicamentelor sintetice cu fitochimicale, cu scopul de a imbunatati efectele terapeutice sau de a furniza proprietăți biologice suplimentare. Cateva exemple vor fi detaliate in cele ce urmeaza. De exemplu, problema tehnică rezolvată in CN102871936A constă în utilizarea combinată a emulsiei multiple (apa/ulei/apa) și a tehnologiei nanoparticulelor lipidice pentru a furniza un nanotransportor lipidic încărcat cu extract de Rhodiola roșea. Pentru prepararea transportorilor nanolipidici s-au folosit procente de greutate ale componentelor de: 0.5-3% extract de Rhodiola; 20-30% solvent; 40-50% emulsifiant; 18-35% material lipidic. Uleiul vegetal folosit in nanoformulare a fost ulei de macadamia și ulei de migdale dulci, iar materialul lipidic solid, stearatul de gliceril și monoglicerida acidului lauric, individuale sau in amestec.

Având în vedere diferitele probleme existente în stadiul tehnicii de preparare, invenția CN105342866A furnizează o metodă de preparare a transportorilor lipidici nanostructurati cu conținut de extract de ceas verde. Formularea conține: extract de ceai verde, lipide, emulgator, co-emulsifiant, stabilizator și apă deionizată, procentul de masă al fiecărui component fiind de: 1-10% Extract de ceai verde, 5-30% Lipide, 5-30% Emulsifiant, 1-10% Co-emulgator, 0,5-5% Stabilizator, apă deionizată (restul, pana la 100%). Un exemplu al invenției cuprinde: transportor lipidic nanostructurat cu extract de ceai verde constând din 1% extract de ceai verde; 26% amestec de trigliceridă caprilica/caprică + monogliceridă acetilată + butii octanol salicilat + butandiol; 17% alcool lauric-23 + stearil eter -21 + hidroxistearat PEG-30 + polisorbat-80; 1% stearat-2-ol; 0,6% butilat hidroxitoluen + EDTA. Asa cum s-a menționat anterior, in CN104367483A extractul de lemn dulce a fost încapsulat in sisteme lipidice nanotransportor, utilizând o metoda de omogenizare la presiune ridicata. Componenta NLC a fost de: 1-5% extract de lemn dulce; 8-16% Emulgator; 15-25% material lipidic, iar restul este apă deionizată.

In KR20190024397A inventatorii au dezvoltat NLC-Curcumin, capabili să îmbunătățească stabilitatea la căldură a Curcuminei, utilizând o metoda de emulsionare (la temperaturi de 85-95°C) cuplata cu ultrasonarea. Conform invenției, monooleatui de

RO 135202 AO sorbitan și polisorbatul sunt folosiți ca emulgatori, iar uleiul de soia și tristearatul de gliceril sunt utilizati pentru formarea miezului lipidic. In varianta optimizata a prezentei invenții, emulgatorul este conținut într-o cantitate de 15 până la 80% în greutate, pe baza greutății totale a lipidei. Pe aceeași linie științifica este încadrata si cercetarea din CN108309939A. In acest caz extractul de Schisandra a constituit principiul bioactiv încapsulat in NLC, iar metoda de preparare a inclus o emulsionare în topîtura (50-90°C), urmata de o ultrasonare (3-20 min). Poloxamer 188 a fost utilizat ca stabilizator iar amestecul de lipide a fost format din monostearat de gliceril si trigliceride cu lanț mediu.

în completare la invențiile referitoare la sistemele nanotransportor ce încapsulează extractele vegetale, au fost investigate si patentate un număr in continua creștere de cercetări in care diferite ingrediente active de origine naturală care se caracterizează prin solubilitate scăzută în apă, degradare chimică și enzimatică ușoară, biodisponîbilitate scăzută etc. au fost încapsulate in sisteme de tip transportori lipidici nanostructurati, NLC. Exemple de cercetări brevetate asociate cu încapsularea ingredientelor naturale in sisteme lipidîce nanotransportor includ: sîlibinîn-NLC (AU2015329609A1), Naringenin-NLC (CN111228220A), Gambogenic-NLC (CN105596323A), Ferulic acid-NLC (CN109602706A). Psoralen-NLC (CN104013600A), Silibin-NLC (CN101632638A), Quercetln-NLC (CN104172184A).

In ceea ce privește obținerea transportorilor lipidici nanotranstructurati, aceștia pot fi preparati prin diferite metode, reprezentative fiind: metoda microemulsionarii, ultrasonarea, omogenizarea cu grad înalt de forfecare (HSH), difuzia cu solvent si omogenizarea la presiune ridicata (HPH), ultima fiind cea mai utilizata metoda pentru producerea sistemelor NLC. In CN101658493A este descrisa prepararea de NLC ce încapsulează Azitromicin, utilizând metoda omogenizării la presiune ridicata, la o temperatura cuprinsa intre 60-80°C, 3-5 cicluri de omogenizare si o presiune de 600-800 bar. Componentele NLC in formula optimizata (pe baza procentelor lor în greutate), sunt: azitromicină 0,5%; emulgator 30%; material lipidic 5% iar restul este apă. Emulgatorul este un amestec de stearat de polioxîalchil și poloxamer. De preferință, materialul lipidic este selectat dintre următorii compuși: monostearat de gliceril, ulei de ricin, ulei de măsline și triacetat de glicerol. Tot o metoda de omogenizare la presiune a fost patentata si in CN107349116A care se refera la încapsularea de ecrane solare UV-A si UV-B in NLC, insa prin aplicarea unei presiuni mai ridicate (600-1200 bar) si a unui număr mai mare de cicluri de omogenizare (5-12 cicluri), la o temperatura de 80°C. Procesul de obținere a inclus si o etapa de omogenizare cu grad înalt de forfecare (1 min. la 8000 rpm). Emulsifiantii utilizați: cel puțin unul dintre emulgatoriî A165, Tween 80, Tween 20, lecîtînă din soia și poloxamer 188. Lipidele solide din compoziția NLC au inclus: palmitat de cetii, ceara de albine, stearate de gliceril si ceara carnauba, iar lipidul lichid a fost reprezentat de un amestec de trigliceride cu lanț mediu. O combinație a omogenizării cu grad înalt de forfecare (HSH) si a omogenizării la presiune ridicata (HPH) a fost prezentata in CN111249185A pentru încapsularea Idebenonei in transportori nanolipidicî. Pentru etapa HSH, viteza de pre-emulsificare a fost de 5000-15000 rpm, iar timpul de preemulsificare este de 3-10 min. Parametri etapei HPH au fost de 300-800 barî, iar numărul de cicluri de 4-8 ori. în ceea ce privește formularea NLC furnizata de invenție, aceasta include: 1 până la 5% din Idebenon; 10-30% ulei de soia hawaiană, 5-15% ceară de palmier, 1-1,5% Tween 80, Poloxamer 188 și lecîtînă. Procedeul de omogenizare la presiune ridicata a fost folosit deasemenea in US 2016/0022550 A1 pentru obținerea de nanotransportor! lipidic! cu grad alimentar utilizați în distribuția orala si parenterala a ingredientelor active lipofile

RO 135202 AO sau amfifile si in WO 2011116963 A2 pentru sinteza de NLC cu ingrediente active alimentare, cosmetice si farmaceutice.

Invenția WO2018002853A1 descrie activitatea bactericidă specifică a NLC-uriior fără niciun ingredient activ (NLC liber), obtinut din palmitostearat de gliceril (lipidă solid), trigliceridă caprilică/caprică (lipidă lichid) și polisorbat 60 (agent tensioactiv). NLC-urile au fost produse utilizând tehnica de omogenizare la cald și ultrasonicare, parametri fiind: 12000 rpm, 20s si sonicare, timp de 5 min. In literatura patentelor sunt furnizate si alte metode de obținere a NLCs utilizând tehnici precum microemulsionarea (US 2010/0247619 A1; US 761 1733) si difuzia cu solventi (CN 103417481, US 20110038941 A1). De exemplu, tehnica microemulsionarii a fost brevetata in WO 2013105101 Al si US 7611733 B2 pentru încapsularea unei game destul de largi de medicamente de natura hidrofila si amfifila. Tot metoda microemulsionarii este abordata in EP 2037889 B1 pentru sinteza de NLCs din amestec de ghceroli si acid behenîc, utilizând drept surfactanti fosfatidilcolina si taurocolat de sodiu.

Ca o sumarizare a informației prezente in literatura patentelor, se poate afirma ca aceasta este foarte vasta, fiind detaliate diferite metode pentru obținerea sistemelor NLC încărcate cu diferite ingrediente active, sintetice sau de proveniența naturala, insa acestea nu includ cercetări prin care sa se demonstreze adaptabilitatea nanotransportorilor lipidici pentru co-incapsularea extractelor vegetale de polaritati diferite, lipofile si hidrofiie. In anumite studii aceste metode prezintă o serie de dezavantaje care le poate limita aplicabilitatea la scala larga: necesita un consum mare de surfactanti si emulgatori (de exemplu, in patentele in care se utilizează metoda omogenizării la presiune ridicata/HPH, procentele de emulgatori sunt foarte mari: 8-16% amestec de emulgatori in CN 104367483A, 30% emulgator in CN101658493A, sau se utilizează un număr mare de cicluri de omogenizare, la presiuni mai ridicate - 5-12 cicluri, la 600-1200 bar in CN107349116A sau 4-8 cicluri, la 800 bar in CN 111249185A, ceea ce poate conduce la distrugerea proprietăților biologice, dar si la un consum mare de energie). Tehnica ultrasonarii prezintă si ea cateva limitari/deficiente care sunt asociate cu timpul prelungit de ultrasonare (de exemplu 3-20 min. in CN108309939A, 5 min. in WO2018002853A1), existând chiar riscul impurificarii cu metal provenit din sonda. Deși tehnica microemulsionarii permite obținerea unor nanoparticule lipidice de ordinul zecilor de nm, prezintă dezavantajul utilizării unor concentratii mari de surfactanti (in general >15%) care pot ridica probleme majore in ceea ce privește existenta unui risc ridicat de toxicitate. In metoda difuziei cu solventi, emulsiile dezvoltate implica utilizarea solventilor organici si a procentelor ridicate de emulsifianti (ex: in CN102871936A metoda implica un necesar de 40-50% emulsifianti si 20-30% solvent; in CN105342866A formularea de NLC optimizata conține 5-30% emulsifiant), ceea ce limitează utilzarea acestora in industriile asociate sanatatii. Mai mult, aceste ultime doua metode sunt dificil de adaptat la scara industriala.

Alte dezavantaje precum stabilitatea fizica si chimica scăzută (ex: apariția fenomenelor de agregare, oxidare etc.), dificultatea de obținere a unor distribuții relativ înguste de dimensiune a particulelor lipidice, precum si eficienta de încapsulare scăzută a principiilor active hidrofiie, au ca rezultat direct scăderea calitatii formulării farmaceutice/cosmetice si implicit a acțiunii terapeutice a principilui activ încapsulat in sistemele nanotransportor.

Invenția propusa acopera ambele metodologii, procedurale si aplicative, respectiv:

I. Procedeu de obținere a unor sisteme lipidice nanotransportor capabile sa fie gazde ideale pentru doua categorii de principii vegetale care cuprind clase de compuși bioactivi din sfere diferite din punct de vedere chimic/structural (ex: saponina steroida si glicozid triterpenic), si sa asigure repartizări preferențiale in matricea sistemului nanotransportor (funcție de afinitatea fata de miezul lipidic sau învelișul de surfactanti);

II. Strategie cu un potențial terapeutic promițător prin realizarea unei combinații sinergice a mai multor principii bioactive de origine naturala, atat din punct de vedere al înlocuirii dozelor ridicate de medicamente convenționale (de sinteza) cu substanțe bio-active din surse vegetale, cat și pentru dezvoltarea unor formulări orale avansate pentru imbunatatirea stării de sanatate a populației feminine aflate in perioada menopauzala.

In literatura patentelor, singura cercetare care abordeaza incarcarea simultana a doua principii active naturale (Epigallocatechin-3-gallate si Piperin) este prezentata in invenția KR20170041407A. Invenția se refera la prepararea NLC utilizând monostearat de glicerol, acid oleic, lecitina si Tween 80. Pentru preparare s-a folosit o omogenizare primară, la 2800 până la 3200 rpm timp de 3-10 min., urmata de ultrasonare (până la 7 min., în condiții de timp de lucru de la 3-5s si timp de odihnă de 1-3 s) si o omogenizarea secundară (la o presiune de 550-650 MPa).

Referitor la abilitatea sistemelor nanostructurate lipidice de a încapsula si substanțe de natura hidrofila, in ciuda afinitatii lor pentru compuși lipofili, aceasta a fost semnalata in literatura patentelor intr-o singura invenție, US2020222507A1, in care este prezentata incapsualrea cu success a unei proteine de natura hidrofila, respective Exenatida (un derivat al Insulinei) in sisteme de tip NLC. Cooptarea simultana a doua principii active (hidrofiie si iipofile), unul de origine vegetala si unui de proveniența sintetica a fost pentru prima data brevetata in patentele RO131547/27.11.2020 (coincapsularea unui medicament antîtumoral/sintetic - Pemetrexed de sodiu împreuna cu un antioxidant natural - Hesperidin in sisteme NLC preparate cu squalene si ulei de amaranth) si RO 131955/30.05.2019; in ultima invenție un amestec de principii active vegetale (extract de galbenele, cu continui ridicat de carotenoizi) este captat împreuna cu un medicament sintetic - acid azelaic în sisteme lipidice nanotransportor preparate cu ulei de măceșe si ulei de negrilica.

Ca atare, prezenta invenție are in vedere utilizarea unei metode combinate de omogenizare cu grad înalt de forfecare (HSH) si la presiune ridicata (HPH) pentru dezvoltarea unor sisteme lipidice nanotransportor ce conțin cantitati semnificative de ingrediente naturale provenite din uleiuri si extracte vegetale, ce prezintă avantajul de a fi o gazda eficienta pentru ambele categorii de principii active - atat Iipofile (Diosgenina din extractul de yam sălbatic) cat si hidrofiie (extractul de lemn dulce). Nanotransportorii lipidici dezvoltati prezintă o buna biocompatibilitate, activitate antioxidanta semnificativa si un efect anti-inflamator amplificat, ceea ce le conferă acestora un potențial aplicativ ridicat in tratamentul afecțiunilor inflamatorii.

li. Prezenta invenție rezolva problemele tehnice menționate anterior, prin obținerea unor sisteme de nanotransportor! lipidici pe baza de ulei de luminița nopții si ulei de soia, ce prezintă principalul avantaj al co-incapsularii a doua tipuri de principii active de origine

RO 135202 AO vegetala - Extract de yam sălbatic (EYS, Dioscorea villosa), standardizat intr-o saponina sterioda lipofila (95% Diosgenina) si extract de lemn dulce (ELD, Glycyrrhiza glabra L), standardizat intr-un glicozid triterpenic hidrofil (10% Acid glicirizic). Procedeul de obținere a sistemelor nanotransportor, conform invenției cuprinde:

a) formarea unei faze lipidice fara continui de extract vegetal (EYS), la o temperatură de 73 ... 75°C, ce conține un amestec de lipide solide și lichide, respectiv monostearat de gliceril : palmitat de cetii : ulei vegetal (ulei de soia sau ulei de luminița nopții), într-un raport de greutate de 1 : 1 : 0.85, respectiv formarea unei faze lipidice cu conținut de extract vegetal/EYS, ce asigura o concentrație de 3.8% EYS in formulările solide de NLC-individuale (incarcate cu principiul bio-activ vegetal iipofil - EYS), respectiv intre 3.3% ... 3.7% EYS, in sistemele de NLC-duale (ce conțin EYS si ELD), după etapa de liofilizare;

b) formarea unei faze apoase fara continui de extract vegetal (ELD), la o temperatură de 73 ... 75°C, ce conține un amestec de surfactanți de tip Tween 20 : Fosfatidilcolina : Poloxamer 188 într-un raport de greutate de 1 : 0.21 : 0.21, respectiv formarea unei faze apoase cu conținut de extract vegetal hidrofil/ELD, ce asigura o concentrație de 10.7 ... 13.8% ELD in formulările de NLC-individuale (incarcate cu principiul vegetal hidrofil - ELD), respectiv intre 3.7 ... 13.2% ELD, in sistemele de NLC-duale (ce conțin EYS si ELD), după etapa de liofilizare;

c) formarea unei pre-emulsii lipidice prin contactarea sub agitare energica a celor doua faze, apoasă și lipidică, și menținere la un regim de temperatură de 73 ... 75°C timp de 20 min;

d) obținerea unor dispersii apoase de sisteme nanotransportor ce conțin principii active individuale (EYS sau ELD) respectiv ce co-incapsuleaza principii bio-active duale (NLC-EYS-ELD), prin supunerea pre-emulsiei lipidice inițial la un proces de omogenizare cu grad înalt de forfecare (la 12000 rpm, timp de 1 min), urmat de un proces de omogenizare la presiune ridicata (la 500 bar, timp de 196 sec) si ulterior răcire ușoară la temperatura camerei, sub agitare magnetică;

e) obținerea de formulări solide de nanotransportori lipidici incarcati cu un singur extract vegetal (EYS sau ELD), respectiv NLC-duale, ce co-incapsuleaza EYS si ELD, după o etapa de liofilizare a dispersiilor apoase de nanotransportori lipidicila la 55°C timp de 60 h.

Formulările solide de NLC incarcati cu un singur extract vegetal (EYS sau ELD), respectiv de NLC-duale (ce co-incapsuleaza EYS si ELD), conțin:

a. 3.8% EYS in formulările solide de NLC-individuale (NLC-EYS) respectiv inte 3.3 ... 3.7% EYS in sistemele de NLC-duale (NLC-EYS-ELD);

b. 10.7 ... 13.8% ELD in formulările solide de NLC-individuale (NLC-ELD) respectiv inte 3.7 ... 13.2% ELD in formulările de NLC-duale (NLC-EYS-ELD).

III. invenția prezintă următoarele avantaje:

1) Procedeul descris in prezenta propunere de brevet constituie o metodă eficienta si reproductibiia pentru obținerea unor sisteme nanotransportor ce prezintă abilitatea de a fi gazda ideala pentru doua extracte vegetale bio-active, cu polaritati diferite, lipofile si hidrofile.

2) Nanotransportorii lipidici preparati cu ULN si US prezita particularități structurale unice, favorabile pentru cooptarea eficienta atat a principiului vegetal Iipofil (EYS, standardizat

RO 135202 AO la 95% Diosgenin) cat si a amestecului vegetal hidrofil (ELD, standardizat la 10% acid glicirizic), atat in miezul lipidic hidrofob cat si in învelișul exterior format de surfactanti.

3) Utilizarea celor doua uleiuri vegetale (ULN si US) in procedeul de obținere a NLC poate asigura un rol dublu:

a. participă la formarea unor miezuri lipidice in care sunt prezente diferite nanocompartimente folosite drept “gazde ideale” pentru captarea unor concentratii semnificative de principiu vegetal bioactiv, de natură hidrofobă (ex: DSG din EYS);

b. vine cu proprietăți biologice specifice (ex: antioxidante si antiinflamatoare), prin virtutea compoziției lor bogate in acizi grași polinesaturati, ceea ce imprima un important potențial terapeutic de natura să îmbunătățească sănătatea populației feminine aflate in perioada menopauzala.

4) Procedeul de obținere se desfășoară în mediu apos, nu utilizează condiții de proces care să conducă la denaturarea celor doua principii bio-active vegetale (EYS si ELD), astfel integritatea structurală a EYS si ELD nu este afectata si implicit efectele biologice ale celor doua principii bioactive se mențin la valori optime, chiar amplificate, după procedeul de încapsulare in NLC.

5) Procedeul de obținere se bazeaza pe folosirea unor materii prime biocompatibile, concentrații minime de surfactanti și nu implica utilizarea unor substanțe agresive (ex: solvenți organici sau surfactanți ce pot manifesta un potențial efect toxic asupra organismului).

6) Procedeul propus este simplu și eficient, implică etape preparative distincte și ușor de reprodus, ce pot fi asigurate și la o transpunere de la scara de laborator, la scară pilot.

7) Metoda de omogenizare la presiune ridicata propusa in prezenta cerere de brevet poate fi extinsa pentru obținerea unor sisteme nanotransportor lipidice ce pot deasemenea sa fie adaptate pentru co-incapsularea unei game largi de principii bioactive de origine vegetala, atat de natura lipofila cat si hidrofila.

8) Prin procedeul propus se obțin nanotransportori lipidici cu conținut variabil de principii active de origine vegetala care prezintă proprietăți antioxidante si anti-inflamatoare amplificate (demonstrate prin metode specifice de testare in vitro), ce pot fi conditionate/formulate ulterior sub formă de capsule gelatinoase pentru dezvoltarea de suplimente alimentare ce manifesta multiple beneficii asupra sanatatii.

IV. Procedeul conform invenției constă în aceea că se formează inițial o preemulsie lipidică prin contactarea sub agitare magnetică a două faze, o faza lipidică ce conține 10% amestec de lipide solide (MSG, PC) si uleiuri vegetale (ULN, US), cu sau fara extract vegetal lipofil (EYS) și o fază apoasă ce conține 2,5% amestec de surfactanți cu/fara extract vegetal hidrofil (ELD), la o temperatură de 73 ... 75°C; pre-emulsia lipidică obtinuta este menținută ia o temperatură de 73 ... 75°C, timp de 20 min, este supusă unei etape de omogenizare cu grad înalt de forfecare la 12000 rpm, timp de 1 min, 70 . . 72 °C, ulterior unei etape de omogenizare la presiune ridicata la 500 bar, timp de 196 sec, după care este lăsată să se răcească la temperatura camerei, sub agitare magnetica, etapa care conduce la solidicarea nanotransportorilor lipidici dispersati in apa, iar prin liofilizare la -55°C timp de 60h, se obțin formulările solide de NLC-libere si incarcate cu principii active individuale (EYS sau ELD) sau principii active duale, lipofile si hidrofile (EYS si ELD).

Sumarizand, prin aceasta invenție au fost obținuți:

RO 135202 AO

a. NLC liberi (NLC-ULN/US), fără conținut de extracte vegetale, obținuți prin contactarea celor doua faze apoase si lipidice, si supunerea acestora unor procese de omogenizare conform procedeului descris.

b. NLC incarcati cu unul sau mai multe principii active vegetale (NLC-EYS, NLC-ELD, NLC-EYS-ELD), capabili sa încapsuleze si sa distribuie, atat extracte vegetale lipofile (EYD) cat si extracte vegetale hidrofile (ELD), respectiv ambele categorii de extracte, lipofile si hidrofile (EYS si ELD), obținuți printr-un procedeu similar cu cel aplicat pentru NLC-liberi.

Etapele de obținere a NLC incarcati cu EYS/ELD, respectiv amestec de EYS si ELD constau din:

® formarea unei faze lipidice ce conține amestec de monostearat de gliceril : palmitat de cetii : ulei de luminița nopții sau ulei de soia, într-un raport de greutate de 1 : 1 : 0.85;

« adăugarea în faza lipidică a unor cantitati variabile de extract de natura lipofila (EYS) ce asigura un continui de 3.8% EYS in formulările solide de NLC-individuale (NLCEYS), respectiv de 3.3 ... 3.7% EYS in sistemele de NLC-duale (NLC-EYS-ELD);

* formarea unei faze apoase ce conține un amestec de surfactanți de tip Tween 20 : Fosfatidilcolina : Poloxamer 188 într-un raport de greutate de 1 : 0.21 : 0.21;

® adăugarea în faza apoasa a unor cantitati diferite de extract vegetal de natura hidrofila (ELD), care conduce in final ia un conținut de 10.7 ... 13.8% ELD in formulările solide de NLC-individuale (NLC-ELD), respectiv intre 3.7 ... 13.2% ELD in sistemele de NLCduale (NLC-EYS-ELD).

V. In continuare se dau patru exemple de realizare a procedeului conform invenției, în legătură cu tabelul și figurile care reprezintă:

Tabel 1. Compoziția formulărilor nanotransportor libere, a NLC încărcate cu extract de yam salbatc (EYD) sau extract de lemn dulce (ELD) si a NLC ce co-incapsuleaza ambele tipuri de principii active vegetale (EYD si ELD)

Figura 1. Principii vegetale bio-active din extractele vegetale: a. Diosgenin din extractul de yam sălbatic/Discorea villosa: b. Acid glicirizic din extractul de lemn dulce/Glycyrrhiza glabra

Figura 2. Variația dimensiunii și a indicelui de polidispersitate (Pdl) în funcție de concentrația si tipul de principiu vegetal încapsulat (extract de yam salbatic/EYS și extract de lemn dulce/ELD)

Figura 3. Imaginile TEM ale: a. NLC-ULN-EYS-ELD si b. NLC-ULN-EYS-ELD

Figura 4. Variația potențialului zeta în funcție de concentrația de principiu activ încapsulat (EYD și ELD) si de tipul de ulei vegetal utilizat la prepararea NLC

Figura 5. Curbele DSC ale nanotransportorilor lipidici ce incapsuleaza diferitele principii active (EYS, ELD si EYS + ELD), preparati cu US, comparativ cu NLC fara principiu activ/NLC-US

Figura 6. Curbele DSC ale nanotransportorilor lipidici ce incapsuleaza diferitele principii active (EYS, ELD si EYS + ELD), preparati cu ULN, comparativ cu NLC fara principiu activ/NLC-ULN

Figura 7. Valorile eficientei de încapsulare (EE) ale DSG (din extractul de yam sălbatic, EYS) si ale acidului glicirizic (din extractul de lemn dulce, ELD) încapsulate in NLCULN/US

Figura 8. Variația capacității de inhibiție a radicalului ABTS de către sistemele NLC incarcate cu un singur principiu activ vegetal (EYS sau ELD) versus NLC care coincapsuleaza doua principii bioactive vegetale (EYS si ELD)

Figura 9. Determinarea in vitro a activitatii antioxidante a NLC liberi si incarcati cu concentratii variabile de extract de lemn dulce și extract de yam sălbatic, comparativ cu extractele native si uleiurile vegetale

Figura 10. Profilul de eliberare a DSG (din extractul de yam sălbatic) și a acidului glicirizic (din extractul de lemn dulce), în cazul sistemelor nanotransportor individuale, de tip NLCEYS si NLC-ELD

Figura 11. Profilul de eliberare a DSG (din extractul de yam sălbatic) și a acidului glicirizic (din extractul de lemn dulce), în cazul sistemului nanotransportor dual preparat cu ULN (NLC-ULN-EYS-ELD)

Figura 12. Profilul de eliberare a DSG (din extractul de yam sălbatic) și a acidului glicirizic (din extractul de lemn dulce), în cazul sistemului nanotransportor dual preparat cu US (NLC-US-EYS-ELD)

Figura 13. Efectul sistemelor NLC-individuale si duale, NLC-US/ULN-EYS, NLC-EYSELD, asupra viabilității celulelor normale HUVEC timp de 24h (A) si respectiv 48h (B) Figura 14. Acțiunea citotoxica vs. proliferativa indusa de sistemele NLC-ULN/US libere si incarcate, NLC-ULN/US-EYS, NLC-ULN/US-EYS-ELD asupra celulelor normale HUVEC Figura 15. Evaluarea prin tehnica ELISA a efectului tratamentelor cu sisteme nanotransportor de tip NLC-EYS si NLC-EYS-ELD asupra eliberării citokinelor TNF-α si IL6, de către celulele normale HUVEC

Exemplul 1. Obținerea de sisteme nanotransportor cu doua categorii de uleiuri vegetale, ulei de luminița nopții si ulei de soia (NLC-ULN si NLC-US)

Se formează o fază lipidică prin topirea la o temperatură de 73 ... 75°C a unui amestec de 10% monostearat de gliceril, palmitat de cetii si ulei vegetal (ulei de soia sau ulei de luminița) într-un raport de greutate de 1 : 1 : 0.85. Formarea unei faze apoase la o temperatură de 73 ... 75°C prin utilizarea a 2,5% amestec de surfactanți ce conține Tween 20 : Fosfatidilcolina : Poloxamer 188 într-un raport de greutate de 1 : 0.21 : 0.21. Formarea unei pre-emulsii lipidice, prin contactarea celor doua faze lipidice si apoase, la o temperatură de 73 ... 75°C, care se menține la regim de temperatură constant, timp de 20 min. Pre-emulsia rezultată se supune inițial unei etape de omogenizare cu grad înalt de forfecare, aplicând 12000 rpm timp de 1 minut, la o temperatura de 70 ... 72 °C si ulterior unei etape de omogenizare la presiune ridicata la 500 bar, timp de 196 sec, la o temperatura de 70 ... 72 °C. Nanodispersia calda rezultata este lăsată să se răcească la temperatura camerei, timp de 15 ... 20 min., in vederea solidificarii nanotransportorilor lipidici in masa apoasa. Ulterior disperisia apoasa de nanotransportori lipidici este congelata la -20°C timp de 24h si supusa unui proces de liofilizare la -55°C timp de 60h, cu obținerea formulărilor solide de NLC-liberi (NLC-ULN, respectiv NLC-US).

Exemplul 2. Obținerea unor sisteme nanotransportor ce încapsulează un extract vegetal de natura lipofila (NLC-EYS)

Similar exemplului 1, cu deosebirea că se adaugă în topitura lipidică o cantitate de extract vegetal bioactiv ce asigura o concentrație de 0.5% extract de yam sălbatic (EYS) in formularea de dispersie apoasa (raportat la 100g dispersie apoasa), preparate cu ULN/US. Topitura lipidică obtinuta se menține la 73 ... 75°C timp de 5 min. pentru a se asigura o incorporare uniforma a EYS. Etapele ulterioare corespund celor descrise în cadrul

RO 135202 AO exemplului 1, cu obținerea in final a unor sisteme solide de NLC pe baza de ulei de luminița nopții sau ulei de soia ce încapsulează 3.8% EYS.

Exemplul 3. Obținerea de sisteme nanotransportor ce încapsulează un extract vegetal de natura hîdrofila (NLC-ELD)

Similar exemplului 2, cu deosebirea că in faza apoasa se introduce o cantitate variabila de principii vegetale bioactive ce asigura o concentrație de 0.5 ... 2% extract de lemn dulce (ELD) in cele 100g dispersie apoasa de NLC. Etapele ulterioare corespund celor descrise anterior, cu obținerea formulărilor solide de NLC-ELD (după liofilizare) ce poate încapsula si distribui cantitati variabile de ELD, cuprinse intre 10.7 ... 13.8% ELD.

Exemplul 4. Obținerea unor sisteme nanotransportor duale, ce co-incapsuleaza doua tipuri de extract vegetale, lipofile si hidrofile (NLC-EYS-ELD)

Similar exemplului 3, cu deosebirea că in topitura lipidica se introduce o cantitate de extract vegetal lipofil ce asigura o concentrație de 0.5% EYS in formulările de dispersie apoasa, preparate cu ulei de luminița nopții sau cu ulei de soia, iar în faza apoasă se introduce o cantitate de extract vegetal hidrofil ce asigura o concentrație de 0.5 ... 2% ELD in formulările apoase de NLC. Etapele ulterioare corespund celor descrise anterior, cu obținerea in final a unor nanotransportor! lipidici duaii, ce co-incapsuleaza cantitati variabile de principii bioactive vegetale (EYS si ELD), cuprinse intre 3.3 ... 3.7% EYS si intre 3.7 ... 13.2% ELD in formulările solide de NLC-EYS-ELD (după liofilizare)

1. Determinarea dimensiunii sistemelor nanotransportor individuale (NLC-ELD/EYS) sl duale (NLC-ELD-EYS). Evaluarea diametrelor medii si a polidlspersltatii prin tehnic DLS si caracterizare morfologica (analiza TEM)

O prima etapa preliminară in caracterizarea sistemelor nanotransportor preparate conform procedurii detaliate anterior a fost reprezentata de determinarea comparativa a diametrelor medii a tuturor sistemelor NLC, care prezintă un singur extract vegetal incorporat, NLC-individuale (NLC-EYS, NLC-ELD) si a celor care co-incapsuleaza ambele principii vegetale, hidrofile si lipofile, NLC-duale (NLC-EYS-ELD). Codul sistemelor NLC preparate cu cele doua uleiuri vegetale - ULN/US in amestec cu lipidele solide selectate MSG si PC precum si compoziția fiecărei formulări de NLC dezvoltate in prezenta cercetare, sunt redate in Tabelul 1.

Tabel 1. Compoziția formulărilor nanotransportor libere, a NLC încărcate cu extract de yam salbatc (EYS) sau extract de lemn dulce (ELD) si a NLC ce co-incapsuleaza ambele tipuri de principii active vegetale (EYS si ELD)

RO 135202 AO

Nr.	Cod sistem iipîdîc nanotransportor	Lipide soi MSG	Ide si ui PC	eluri vege ULN	tale (g) US	EYS (g)	ELD (g)
1	NLC-ULN	3.5	3.5	3.0	-	-	-
2	NLC-ULN-0.5% EYS	3.5	3.5	3.0		0.5	-
3	NLC-ULN-1.5% ELD	3.5	3.5	3.0	-	-	1.5
4	NLC-ULN-0.5% EYS-0.5% ELD	3.5	3.5	3.0	-	0.5	0.5
5	NLC-ULN-0.5 % EYS-1% ELD	3.5	3.5	3.0	-	0.5	1
6	NLC-ULN-0.5% EYS-1.5% ELD	3.5	3.5	3.0		0.5	1.5
7	NLC-ULN-0.5% EYS-2% ELD	3.5	3.5	3.0	-	0.5	2

8	NLC-US	3.5	3.5	-	3.0	-	-
9	NLC-US-0.5% EYS	3.5	3.5	-	3.0	0.5	-
10	NLC-US-1.5% ELD	3.5	3.5	-	3.0	-	1.5
11	NLC-US-0.5% EYS-0.5% ELD	3.5	3.5	-	3.0	0.5	0.5
12	NLC-US-0.5% EYS-1% ELD	3.5	3.5	-	3.0	0.5	1
13	NLC-US-0.5% EYS-1.5% ELD	3.5	3.5	-	3.0	0.5	1.5
14	NLC-US-0.5% EYS-2% ELD	3 5	3.5	-	3.0	0.5	2

Conform analizei dimensionale, bazate pe aplicarea metodei de împraștîere dinamică a luminii (DLS), nanotransportorii lipidici obținuți au prezentat dimensiuni < 200 nm, cu o distribuție relativ îngustă a populației particulelor lipidice si indici de polidispersitate cuprinși intre 0.17 si 0.37 (Fig. 2). NLC-urile sintetizate cu ULN au prezentat o medie a diametrelor de 136.7 ± 1.8 nm, iar prin co-încapsularea celor două principii active, dimensiunea a variat intr-un domeniu destul de larg, intre 120 si 190 nm (Fig. 4). Rezultate interesante s-au semnalat la creșterea cantitatii de extract de lemn dulce încapsulat: creșterea conținutului de ELD de la 0.5% la 2% a condus la obținerea unor nanotransportori cu diametere medii semnificativ mai mici (ex: pentru NLC-ULN-0.5% EYS-0.5% ELD, Zave = 188.4 ± 0.764 versus 122 ± 0.7905 nm, pentru NLC-ULN-0.5% EYS-2% ELD). Acest aspect poate fi corelat cu rolul de surfactant al acidului giîcirîzic si al celorlate componente din extractul de lemn dulce, care completeza proprietățile superficiale ale Tween 20 si ale fosfatidilcolinei. In completare, obținerea unor indici de polidispersitate <0.2 (ex: Pdl ~ 0.183 ± 0.008 pentru NLC-0.5% EYS-1.5% ELD preparat cu ULN si respectiv 0.225 ± 0.029, pentru același sistem, insa preparat cu US) Întăresc observația obținerii unor sisteme relativ monodisperse, cu o distribuție îngusta de dimensiune.

O analiza comparativa a celor doua categorii de NLC preparate cu US respectiv ULN, arata diferențe nesemnificative între acestea, ambele uleiuri vegetale fiind pretabile pentru obținerea unor nanotransportori care sa prezinte caracteristici optime de coincapsulare a amestecurilor vegetale selectate in cercetare.

RO 135202 AO

Fig. 2. Variația dimensiunii și a indicelui de polidispersitate (Pdl) în funcție de concentrația si tipul de principiu vegetal încapsulat (extract de yam salbatic/EYS și extract de lemn dulce/ELD)

In completarea analizei DLS, confirmări ulterioare ale diametrelor nanosferelor lipidice incarcate cu EYS si ELD, precum si aspecte legate de morfologia si structura acestora, au fost oferite de microscopia electronica de transmisie (TEM). Prin vizualizarea sistemelor NLC în micrografiile cu contrast de fază ZC (Fig. 3), s-au observat diferite aspecte morfologice, funcție de tipul de ulei vegetal folosit la prepararea nanotransportorilor lipidici. De exemplu, daca in cazul nanotranspororilor preparati cu US/NLC-US-EYS-ELD s-a observat prezenta unor nanoparticule sferice cu diametre care variaza de la 50 pana la 180 nm (Fig. 3a) si nu au fost decelate alte forme structurale interne, in cazul NLC-ULN ce co-incapsuieaza EYS si ELD au putut fi ușor observate incluziuni nanosferice de dimensiuni foarte mici, < 5 nm (Fig. 3b). Aceste incluziuni de tipul nanopicaturi uniform dispersate in miezul lipidic, vizualizate cu ajutorul micrografiei cu contrast de fază ZC, pot fi atribuite existentei principiilor active vegetale captate in diferitele nanocompartimente create de uleiul vegetal - US/ULN sau in imperfecțiunile generate de lanțurile hidrocarbonate ale acizilor grași din amestecul lipidic solid.

RO 135202 AO

b. Imagini TEM a NLC-ULN-EYS-ELD

Fig. 3. Imaginile TEM ale: a. NLC-ULN-EYS-ELD si b. NLC-ULN-EYS-ELD

2. Atribuirea stabilitatii fizice a NLC liberi si a celor incarcati cu principii active vegetale

Evaluarea stabilității fizice a NLC s-a determinat prin măsurarea potențialului electrocinetic, pe baza mobilității electroforetice. Determinarea potențialului electrocinetic a scos în evidență obținerea unor sisteme NLC ce prezintă o buna stabilitatate fizica, cu valori cuprinse intre -39 mV și -56 mV pentru NLC preparate cu ulei de luminița nopții si de -35mV și -48 mV pentru NLC preparate cu ulei de soia (Fig. 4). Valorile puternic electronegative ale potențialului electrocinetic demonstrează existența unor fenomene de repulsie între particulele lipidice aflate în suspensie apoasă, favorabile pentru prevenirea agregării nanotransportorilor lipidici ce co-incapsulează cele două principii active vegetale EYS si ELD.

Observația de interes care se desprinde in urma evaluării valorilor potențialului zeta se refera la stabilitate mas buna/superioara a nanotransportorilor preparati cu ULN, comparativ cu cei preparati cu US (Fig. 4). Deasemenea, este notabila si modificarea semnificativa a valorilor potențialului electrocinetic, care are loc pe măsură ce concentrația de ELD creste: ξ = -46 ± 0.586 mV (pentru 0.5% ELD in NLC preparat cu ULN) versus -39 ± 3.18 mV (pentru 1.5% ELD in NLC preparat cu ULN). Aceeași tendința a fost determinata si in cazul NLC-US (ex: -48.7 ± 1.14 mV versus -35 ± 2.3 mV). Aceste rezultate conduc la concluzia ca stabilitatea fizica a NLC preparate este influențată de % de extract hidrofil încapsulat, care cel mai probabil ramane la exteriorul miezului lipidic/in invelisul de surfactanti si participa activ la modificarea si redistribuirea sarcinilor de suprafața.

RO 135202 AO

Fig. 4. Variația potențialului zeta în funcție de concentrația de principiu activ încapsulat (EYS și ELD) si de tipul de ulei vegetal utilizat la prepararea NLC

3. Evaluarea modificărilor structurale a transportorilor lipidici, după încapsularea si co-incapsularea de principii active vegetale

Dezvoltarea formulărilor de tip nanotransportori lipidici vizează in primul rând obținerea unor variatii relativ mici în dimensiunea particulelor si a valorilor potențialului electrocinetic, dar șî o stare cristalină sau amorfa a miezului lipidic adecvata pentru eliberarea controlata,/susținuta a celor doua principii active (DSG si acid glicirizic) prezente in concentratii variabile in cele 2 extracte vegetale - EYS si ELD, cooptate împreuna in același sitem lipidic nanotransportor. Prin urmare, este esențial sâ se demonstreze starea solidă a NLC preparate și să se compare cu amestecul de lipide pure utilizate pentru construirea matricei interne a nanotransportorului.

Studiul comporatmentului DSC al NLC-urilor incarcate cu diferitele principii active selectate in cercetare s-a efectuat in paralel cu sistemele nanotransportor libere (fara principiu activ încapsulat, NLC-US/ULN) si cu cele doua amestecuri fizice de lipide (PC + MSG + US/ULN). Studiul celor doua amestecuri fizice oferă informații despre influența uleiului asupra comportamentului de topire și schimbarea cristalinității, precum si despre incluziunea uleiului în lipidele solide. Punctele de topire ale lipidelor prezente in cele doua amestecuri fizice au apărut ca vârfuri endoterme la aprox. 48°C, 55°C și respectiv 62°C. Potrivit literaturii, MSG are un p.t. cuprins intre 57-65°C, iar PC se topește la 55-56°C. Dezvoltarea celor 3 vârfuri endoterme in amestecurile fizice cumulate cu modificările ușor sesizabile ale p.t. (in lipidele pure), sugerează complexitatea matricei lipidice precum si influenta acizilor grași nesaturati din compoziția celor doua uleiuri vegetale, US/ULN. Aceste vârfuri endoterme din amestecurile fizice au fost regăsite in lipidele aduse la scala

RO 135202 AO nanometrica (in formulările de NLC), sub forma unui domeniu mai larg de topire, cuprins intre 42 si 60°C. Lărgirea vârfului este cauzată de o structură mai complexă, mai dezordonata și mai distorsionată a rețelei. Aplatizarea degradării temperaturii de debut poate deasemenea indica faptul că se atinge o solubilitate maximă a principiilor active lipofile (EYS) în amestecul de lipide. Este cunoscut faptul ca pricipiile active de natura lipofila au o solubilitate apreciabilă în lipidele topite.

Endotermele minore apărute la temperaturi mai scăzute (39-43°C) pof fi datorate topirii domeniilor ulei vegetal (si/sau co-surfactant), urmate de endotermele majore corespunzătoare topirii lipidelor majoritare din amestec.

Topirea lipidelor din NLC a avut loc la o temperatură ușor mai scăzută comparativ cu lipidele pure, datorită dimensiunilor mai mici aie particulelor. Rezultate similare ale scăderii punctului de topire al lipidelor datorită miscorarii dimensiunilor, după aducerea la scala nanometrica, sunt larg raportate în literatura de specialitate ei af, Acest lucru poate fi explicat conform termodinamicii clasice, în care este de așteaptat ca punctul de topire al soluției solide să scadă datorită entropiei crescute a amestecului (Kuweî a/., 2G20). Deasemenea, raportul mai mare dintre suprafața specifică și volumul particulelor cu o dimensiune mai mica, comparativ cu materialul brut (fenomen descris de efectul Gibbs - Thompson), are ca rezultat o scădere a punctului de topire.

Temperatura °C

Fig. 5. Curbele DSC ale nanotransportorilor lipidici ce incapsuleaza diferitele principii active (EYS, ELD si EYS + ELD), preparati cu US, comparativ cu NLC fara principiu activ/NLC-US

RO 135202 AO

Fig. 6. Curbele DSC ale nanotransportorilor Hpidicî ce încapsulează diferitele principii active (EYS, ELD si EYS + ELD), preparati cu ULN, comparativ cu NLC fara principiu activ/NLC-ULN

In ambele categorii de nanotransportori preparati cu ULN si US, incarcatî cu EYS si EYS + ELD, se observa o lărgire evidenta a domeniului de topire comparativ cu NLCUS/ULN (liberi), ceea ce sugerează o perturbare evidenta a rețelei formata de amestecul de lipide, ca urmare a acomodării principiilor active de origine vegetala. Nu același lucru se observa pentru NLC-US/ULN ce încapsulează doar ELD, unde s-a evidențiat o alura endoterma ușor mai ascuțita, fapt ce confirma o prezenta mai mare a ELD hidrofil in învelișul de surfactanti, si implicit o perturbare nesemnificativa a miezului lîpidic (Fig. 5 si 6). Cea mai accentuata aplatizare a endotermelor DSC a fost înregistrata in cazul sistemelor duale care co-incapsuleaza ambele principii active - EYS si ELD.

4. Determinarea eficienței de încapsulare a principiilor active individuale, dar si a celor duale captate in sistemele nanotransportor pe baza de US, respectiv ULN

Rezultatele cantitative obținute in urma analizei de cromatografie de lichide la presiune ridicata (HPLC), au pus in evidenta abilitatea remarcabila a NLC-US/ULN de a capta ambele categorii de principii active ce prezintă polarîtatî diferite, respectiv afinitati preferențiale pentru miezul lipidic lipofîl (cazul extractului de yam sălbatic, standardizat la

RO 135202 AO

95% DSG) sau pentru învelișul realizat de amestecul de surfactant si co-surfactanti (cazul extractului de lemn dulce, standardizat la 10% acid glicirizic). Caracterul puternic hidrofil al extractului de lemn dulce nu a constituit un impediment pentru captarea cu randamente apropape maxime de încapsulare ale principalului component din ELD, respectiv ale acidului glicirizic (ex: 96.5% ± 0.57 ELD si 95.8% ± 0.54 ELD, pentru sistemele NLC preparate cu ULN, respectiv NLC-US ce au încapsulat o cantitate inițiala de 2% extract de lemn dulce). In schimb, in cazul probelor duale, care co-încapsuleaza ELD si EYS in același sistem nanotransportor, pe măsură ce cantitatea de ELD teoretica încapsulata a crescut de la 0.5 la 2%, eficienta de încapsulare a suferit ușoare scăderi (Fig. 7), insa acestea au ramas intr-un domeniu destul de ridicat, EE variind de la 87.6% la 85.4% pentru sistemele nanotransportor preparate cu ulei de luminița nopții. Un comportament similar a fost decelabil si pentru cele 3 sisteme de NLC preparate cu ulei de soia, EE fiind cuprins in acest caz intre 83 si 89.5%.

In ceea ce privește extractul de yam sălbatic, se poate remarca afinitatea mai ridicata a acesteia pentru amestecul lipîdic format de cele doua lipide solide cu uleiul de luminița nopții, comparativ cu amestecul ce conține uleiul de soia (ex: EEnlc-uln-eyd 89.5% ± 2.55 versus EEnlc-us-eyd = 85.7% ± 3.38). O explicație potențiala in acest caz poate fi atribuita solubilîtatii mai bune a DSG (din EYS) în ULN care prezintă un profil lipîdic bogat in acizi grași nesaturati, cei mai abundenți fiind acidul linoleic (~74%), acidul y-linolenic (9%) si acidul oleic (7%) OWonfeerfM-rfe /a Fw et a/.. 2074.1 De regulă, solubilitatea unui ingredient activ/medicament este mai slaba in lipide solide, decât în uleiuri șî aceasta s-ar atribui in principal prezenței lanțului hidrocarbonat lung din grăsimile solide. Datorită diferențelor structurale între lipidele solide si cele lichide, moleculele lipidice nu pot fî aranjate într-o structură cristalină perfectă in timpul solîdîfîcarîr Astfel, uniformitatea structurii cristaline în matricea lipidică a NLC este întreruptă. Ca atare, prezenta imperfecțiunilor în structura cristalina este direct responsabila de valorile ridicate precum si de imbunatatirea eficientei de încapsulare.

Fig. 7. Valorile eficientei de încapsulare (EE) ale DSG (din extractul de yam sălbatic, EYS) si ale acidului glicirizic (din extractul de lemn dulce, ELD) încapsulate in NLC-ULN/US

RO 135202 AO

Referitor la sistemele nanotransportor duale, care au cooptat cantitati variabile de ELD si constante de EYS, s-a constatat o ușoara diminuare a eficientei de încapsulare, insa aceasta modificare poate fi considerata nesemnificativa, avand in vedere valorile destul de mari ale eficientelor de încapsulare determinate, cuprinse intre 80.9 si 84% EYS, respectiv intre 83.6 si 87.6% ELD (pentru sistemele preparate cu ULN, NLC-ULN-EYSELD). Si sistemele NLC preparate cu US (cu o singura excepție, pentru NLC ce au încapsulat o cantitate inițiala de 1.5% ELD si 0.5% EYS) au prezentat o buna capacitate de a capta ambele categorii de principii vegetale, hidrofile si lipofile (EE% determinate pentru EYS au variant intre 80 si 83.5% EYS, iar pentru ELD intre 81.2 si 89.5% ELD).

5. Determinarea in vitro a activitatil antioxidante a NLC ce co-incapsuleaza diferite principii active vegetale

Pentru screening-ul activității antioxidante a NLC-extract lipofil (extract de yam salbatic)-extract hidrofil (extract de lemn dulce), s-a utilizat metoda TEAC, aplicabilă atât în cazul antioxidanților de natura lipofîla cât șî hidrofila. Prin aplicarea acestei metode se determina capacitatea antioxidanților de a elimina cationul radical stabil ABTS*⁺ format in urma reacției dintre ABTS și persulfatul de potasiu. In figura 8 este prezentata capacitatea de inhibare a radicalului ABTS” de către soluțiile de NLC libere și încărcate cu extracte vegetale individuale sau aflate in amestec (ELD si EYS), prin comparare cu activitatea de eliminare a ABTS” manifestata de soluțiile native de uleiuri vegetale (US/ULN) si extracte vegetale (ELD, EYS). O evaluare a comportamentului sistemelor nano versus soluțiile de aceeași concentrație de principii active vegetale arata o dependenta a activitatil antioxidante de cantitatea de extract de lemn dulce și deasemenea o influențată a tipului de ulei vegetal utilizat la sinteza nanotransportorilor lipidici. Astfel, s-a constatat o relație de proportionalitate directa intre %ELD încapsulat si capacitatea de inhibare a ABTS‘⁺: pentru formulările de nanotransportor! hpidics ce încapsulează 1.5% ELD si 2% ELD a fost identificata o capacitate de captare a radicalului ABTS’⁺ cuprinsa între 60.2 și 64.2% (pentru sistemele NLC preparate cu ULN) și între 52.7-60.0% pentru sistemele NLC preparate cu US.

Activitatea antioxidantă nativa a extractului de lemn dulce (14.5 36.5%) poate fi explicată pe baza compoziției chimice complexe a acestuia. Extractul de lemn dulce are în compoziție în afară de acid glicirizic (prezent în ELD in cantitate de 10%), flavonoide și izoflavonoide, cumarine și alți peste 40 de constituenți fenolici (Zhou co/ao, 20? 9/. Deși acidul glicirizic prezintă proprietăți antiradicalice extrem de slabe, în domeniu de concentrație 0.1-100 μΜ fSesAtoa ș/ co/ah, 2024y prezența flavonelor șî a celorlaltor compuși fenolici din Glycyrrhiza giabra L sunt responsabile de apariția proprietăților antioxidante; mai mult, încapsularea ELD în NLC a determinat o amplificare a capacitatii antioxidante, datorită efectului de nanodimensiune.

Un aspect notabil se refera la o capacitate destul de scăzută a DSG din extractul de yam sălbatic de a anihila radicalii de viata lunga. Extractul nativ/EYS prezintă o capacitate scăzută de captare a radicalului ABTS‘⁺ (-8.2%), iar prin încapsulare în sistemul nanotransportor pe bază de ulei de luminița nopții capacitatea crește ușor, insa se menține la valori modeste, de -13,4%; această capacitate moderata poate fi atribuita si concentrației de EYS încapsulat, de 77 pg/mL (corespunzătoare 0.5% EYS).

Evaluarea comparativa a % de inhibare a ABTS” in cazul celor doua sisteme individulale si duale NLC-1.5% ELD (62.5%) si NLC-0.5% EYS-1.5% ELD (54%) poate sugera o «ingradire« a reacției compușilor antioxidant! din ELD cu radicalii liberi, respectiv

RO 135202 AO o scădere a abilitatii de a transfera (prin ruperea homolitică a legăturii O-H) un atom de hidrogen (din structurile polifenolice prezente in ELD), radicalilor liberi de tip ABTS prezenti in sistem.

Fig. 8. Variația capacității de inhibiție a radicalului ABTS'⁺de către sistemele NLC incarcate cu un singur principiu activ vegetal (EYS sau ELD) versus NLC care coincapsuleaza doua principii bioactive vegetale (EYS si ELD)

In ciuda proprietăților modeste ale EYS, rezultate foarte bune au fost obținute in cazul sistemelor duale care au cooptat concentratii mari de ELD (1.5% si 2%) si 0.5% EYS. Cuplarea celor doua principii bio-active in același sistem lipidic nanotransportor și aducerea la scara nanometrica, a condus in mod evident la o amplificare a acestei proprietăți. Amplificarea evidenta s-a produs in cazul NLC preparat cu ULN care ce coincapsuleaza 0.5% EYS si 2% ELD, pentru care s-a determinat o capacitate de inhibare a radicalului ABTS‘⁺de 63.4% (Fig. 8). Acest comportament poate fi explicat prin avantajele pe care le prezintă acizii grași omega din componenta uleiului de luminița nopții, cuplate cu cele ale extractului de lemn dulce si nu in ultimul rând prin captarea ambelor principii active de origine vegetala in același sistem nanotransportor.

Pentru testarea in vitro a capacității de captare a radicalilor de viață scurtă ai oxigenului, de către antioxidante prezenti in sistemele NLC, in completare la metoda TEAC s-a folosit analiza chemiluminescentei, utilizată pentru evaluarea în special a capacitatii de stingere a speciilor reactive de oxigen (ROS) derivate din peroxid de hidrogen. Astfel, au fost analizate diferite soluții etanolice de ulei vegetal (ULN/US), soluții de extract de lemn dulce (ELD) și extract de yam sălbatic (EYS), in aceeași concentrație prezenta în NLC-urile ce încapsulează ELD sau EYS, respectiv in cele duale (NLC-EYSELD). In scop comparativ au fost evaluate si sistemele de NLC-ULN/US libere, in ideea de a urmări influnta celor doua uleiuri asupra eficientei de a capta radicalii liberi oxigenati.

O prima referința importanta care reiese din compararea rezultatelor asupra sistemelor evaluate in cercetare este faptul ca, atat extractul de yam sălbatic cat si

RO 135202 AO extractul de lemn dulce prezintă eficienta împotriva radicalilor liberi oxigenati generati in sistemul de chemiluminescenta, comparativ cu situația prezentata anterior (al radicalilor de viata lunga, ABTS'⁺).

Deși încapsularea doar a extractului de yam sălbatic in NLC-ULN/US nu produce un efect antioxidant semnificativ, NLC-urile in care a fost încapsulat 0.5% EYS (respectiv 3.85% EYS in formulările liofilizate) prezintă o capacitate de captare a radicalilor ROS cuprinsă între 54.7 si 56.3%, totuși asocierea EYS cu ELD conduce la rezultate net superioare (Fig. 9). Diferente evidente ale procentelor de captare a radicalilor liberi au fost înregistrate intre NLC-US/ULN liberi si NLC-EYS (57 * 59%) versus NLC-ELD si NLCEYS-ELD (91 96%, cu o singura excepție, semnalata doar in cazul NLC ce coincapsuleaza cantitati minime de 0.5% ELD si 0.5% EYS). In acest caz, tipul de ulei vegetal nu a influențat abilitatea NLC de a capta radicalii ROS. Această activitate antioxidanta amplificată, manifestata asupra ROS dîn sistemul chemiluminescent, poate fi asociata cu:

® efectul sinergie produs de structurile complexe ale principalilor compuși bîoactivi din cele doua extracte, ELD si EYS, dar sî de compoziția bogata in acizii grași a uleiurilor vegetale:

« efectul de nanodimensiune obținut prin cooptarea ambelor extracte lipofile si hidrofile în același sistem de distribuție, nanostructuri care conduc la generarea/crearea mai multor centri de reacție pentru captarea radicalilor liberi.

Fig. 9. Determinarea in vitro a activitatii antioxidante a NLC liberi si incarcati cu concentratii variabile de extract de lemn dulce șî extract de yam sălbatic, comparativ cu extractele native si uleiurile vegetale (metoda chemiluminescentei)

6. Teste in vitro de evaluare a eliberării controlate a EYS si ELD din sistemele lipidice nanotransportor

Dispersiile apoase de NLC-indîvidual ce încapsulează EYS sau ELD, respectiv sistemele NLC-duale au fost supuse studiilor in vitro de eliberare, utilizând metoda sacilor de dializa (folosind un mediu extern/receptor de tipul etanol:apa - 70:30, la temperatura controlată de 37°C). Metoda a implicat recoltarea din mediul receptor, la anumite intervale de timp (cuprinse intre 1 si 24h) a 1 mL de probă si respectiv completarea cu același volum de amestec receptor. Cantitatea eliberată de acid glicirizic (din ELD) si DSG (din EYS) a fost determinată cantitativ prin metoda cromatografica, HPLC.

In cazul sistemelor NLC-individuale, eliberarea extractului de lemn dulce (ELD) din cele două tipuri de nanotransportori lipidici (preparati cu ulei de luminița nopții și ulei de soia) este identica (Fig. 10), nefiind influențată de tipul de ulei vegetal (US sau ULN). Asa cum poate fi observat in fig. 10, în prima oră a studiului de eliberare s-a determinat -19% acid glicirizic pentru ambele sisteme NLC-ULN/US-2% ELD, iar o eliberare totala a ELD produs după 5h (Fig. 10). O potențiala explicație pentru acest comportament poate fi asociata cu repartizarea preferențiala a acidului glicirizic (din ELD) ia suprafața NLC unde, datorita caracterului sau puternic hidrofil formează legaturi salbe (legaturi de hidrogen) cu surfactantii ce învelesc miezul lipidic.

Fig. 10. Profilul de eliberare a DSG (din extractul de yam sălbatic) și a acidului glicirizic (din extractul de lemn dulce), în cazul sistemelor nanotransportor individuale, de tip NLCEYS si NLC-ELD

Asa cum era de așteptat, un comportament de eliberare diferit l-a manifestat extractul de yam sălbatic (standardizat la 95% DSG) încapsulat în sistemele nanotransportor preparate cu ULN/US. Deși mediul receptor a favorizat eliberarea intr-un timp relativ rapid a ambelor componente bioactive, totuși in cazul EYS s-a decelat o comportare ușor diferita, in sensul ca in primele 5h ale studiului de eliberare, EYS a fost eliberat in proporție de 50%, comparativ cu 100% ELD (detectat pentru sistemele NLCUS/ULN-ELD). In prima oră s-a constatatat o eliberare de 4.3% EYS pentru sistemul NLCUS-EYS și de 5.2% în cazul sistemului NLC-ULN-EYS, ambele fiind încărcate cu o cantitate inițiala de 0.5% EYS. Eliberarea mai lenta a EYS din NLC-ULN/US este direct influențată de captarea EYS in nanocompaertimentele din miezul nanosferelor lipidice (asa cum a putut fi vizualizat din micrografiile TEM). Ieșirea din aceste nanopicaturi si parcurgerea rețelelor complexe formate de lanțurile hidrocarbonate din structura lipidelor,

RO 135202 AO a făcut ca rata de dizolvare in acest caz sa fie semnificativ diminuata si implicit DSG sa manifeste o eliberare mai lenta. De asemenea, caracter lipofil al DSG din EYS si solubilitatea scăzută în mediul receptor reprezintă deasemenea factori determinati in comportamentul eliberării sale din NLC.

Asa cum era de așteptat, un comportament de eliberare diferit l-a manifestat extractul de yam sălbatic (standardizat la 95% DSG) încapsulat in sistemele nanotransportor preparate cu ULN/US. Deși mediul receptor a favorizat eliberarea intr-un timp relativ rapid a ambelor componente bioactive, totuși in cazul EYS s-a decelat o comportare ușor diferita, in sensul ca in primele 5h ale studiului de eliberare, EYS a fost eliberat in proporție de 50%, comparativ cu 100% ELD (detectat pentru sistemele NLCUS/'ULN-ELD). In prima oră s-a constatatat o eliberare de 4.3% EYS pentru sistemul NLCUS-EYS și de 5.2% în cazul sistemului NLC-ULN-EYS, ambele fiind încărcate cu o cantitate inițiala de 0.5% EYS. Eliberarea mai lenta a EYS din NLC-ULN/US este direct influențată de captarea EYS in nanocompaertimentele din miezul nanosferelor lipidice (asa cum a putut fi vizualizat din micrografiile TEM). Ieșirea din aceste nanopicaturi si parcurgerea rețelelor complexe formate de lanțurile hidrocarbonate din structura lipidelor, a făcut ca rata de dizolvare in acest caz sa fie semnificativ diminuata si implicit DSG sa manifeste o eliberare mai lenta. De asemenea, caracter lipofil al DSG din EYS si solubilitatea scăzută în mediul receptor reprezintă deasemenea factori determinati in comportamentul eliberării sale din NLC.

—···«··· y.o

...y

1 2 3 4 5 6 7

Fig. 11. Profilul de eliberare a DSG (din extractul de yam sălbatic) și a acidului glîcirizic (din extractul de lemn dulce), în cazul sistemului nanotransportor dual preparat cu ULN (NLC-ULN-EYS-ELD)

Este demn de remarcat faptul ca, in cazul sistemelor NLC-duale se constată o eliberare mai lentă a ambilor componenti bioactivi lipofili și hidrofili, mai accentuata in cazul extractului hidrofil/ELD, comparativ cu sistemele NLC incarcate doar cu unul dintre cele doua extracte vegetale. De exemplu, sistemele nanotransportor individuale au eliberat ~ 81% ELD după 4h de experimente, in timp ce din NLC-duale s-a eliberat 39% ELD (in NLC-US-EYS-ELD, Fig. 12), respectiv 61% (in NLC-ULN-EYS-ELD, Fig. 11).

Aiura eliberării componentei lipofile este similara in cazul ambelor sisteme preparate cu ULN/US, după 4h de eliberare fiind determinate cantitati relativ egale de DSG in mediul receptor, de -30% DSG. Aceasta uniformizare de eliberare a DSG poate fi atribuita miezului lipide format din lipidele solide cu cele 2 uleiuri vegetale. In schimb, eliberarea ELD din sistemele NLC fost intarziata semnificativ in cazul NLC-US (Fig. 11) comparativ cu NLC-ULN (Fig. 12).

^;*·· .-4

6 7 8 9

Fig. 12. Profilul de eliberare a DSG (din extractul de yam sălbatic) și a acidului glicirizic (din extractul de lemn dulce), în cazul sistemului nanotransportor dual preparat cu US (NLC-US-EYS-ELD)

7. Evaluarea in vitro a profilului toxicologic

Evaluarea caracterului citotoxic al sistemelor NLC s-a realizat int-o prima etapa prin metoda colorimetrica cu MTS. Aceasta metoda spectrofotometrica este frecvent utilizata pentru determinarea numărului celulelor viabile in teste de proliferare sau citotoxicitate. Pentru fiecare tip celular exista o relație lineara intre numărul de celule si absorbanta, ceea ce permite determinarea cu exactitate a proliferării celulare. Pentru evaluarea caracterului citotoxic/proliferativ al sistemelor nanotransportor studiate, culturile de celule normale HUVEC au fost tratate cu concentratii scalare de NLC (intre 200 si 3.125 pg/ml) si incubate in continuare la 37°C si 5% CO₂, in atmosfera umeda, timp de 24h.

RO 135202 AO

Rezultatele studiului de citotoxicitate arata ca viabilitatea celulelor endoteliale HUVEC este influențată de concentrațiile sistemelor de NLC, aceasta fiind semnificativ afectata atunci când celulele sunt supuse concentrațiilor mai mari de 100 pg/ml NLC (Fig. 13). Pentru celelalte concentratii, cuprinse intre 3.125 si 50 mg/mL, viabilitatea celulara determinata s-a menținut la valori >65% (cu cateva excepții), ceea ce indica o citotoxicitate foarte scăzută (aflata in limita metodei), indusa de tratamentul cu sistemele NLC-US/ULNEYS-ELD, timp de 24h (Fig. 13A), Conform rezultatelor obținute, cele mai eficiente sisteme nanotransportor sunt sistemele NLC-duale preparate cu ulei de soia, pentru care in urma unui tratament cu 50 pg/ml valoarea viabilității celulare a fost de 81.9% pentru NLC-USEYS-ELD. In cazul sistemeleor preparate cu ULN, un tratament cu concentratii de 50 mg/ml a condus la o viabilitate a celulelor HUVEC ușor mai moderata (79.7% pentru NLCULN-EYS-ELD).

A.

s 200 pg/mî sa 100 pg/mi fii 50 pg/ml a 25 pg/mi

012.5 pțj/mî

S6.25 pg/mî % 3.125 pg/m!

100.0

90.0

80.0 _ 70.0 £ 60.0 £ ^{50 0}e 40.0 > 30.0

20.0

10.0 0.0

B.

S 200 pg/ml « 100 pg/ml «50 pg/ml ss 25 pg/ml s 12.5 pg/mi «6.25 pg/ml

S 3.125 pg/mi

Fig. 13. Efectul sistemelor NLC-individuale si duale, NLC-US/ULN-EYS, NLC-EYS-ELD, asupra viabilității celulelor normale HUVEC timp de 24h (A) si respectiv 48h (B)

Un tratament prelungit asupra celulelor endoteliale HUVEC, realizat pe o perioada de 48h, a condus la o contrabalansare a viabilității celulare comparativ cu rezultatele obținute după 24h de tratament (Fig. 13 A si B). Astfel, la un tratament de 48h, s-a constatat apariția unor fenomene de refacere/proliferare celulara, in acest caz determinandu-se valori ale viabilității celulelor endoteliale >85%, in domeniul de concentratii 50-25 μg/ml (Fig. 13B).

Evaluarea citotoxlcitatii vs. proliferarea celulelor normale HUVEC prin analiza celulara in timp real

In scopul comparării in timp real a capacitatii proliferative vs. citotoxice a sistemelor NLC-iibere si incarcate cu cele doua principii active vegetale (EYS si ELD) asupra celulelor HUVEC, s-a efectuat testul RTCA. Aceasta analiza permite masurarea in orice moment a indexului celular, precum si indicarea pentru orice timp de tratament a concentrației compușilor care determina o viabilitate/citotoxicitate de 50% (IC50). Rezultatele obținute prin RTCA pe celulele endoteliale HUVEC confirma datele obținute prin tehnica colorimetrică MTS. In urma evaluării citotoxicitatii celulelor endoteliale HUVEC, tratate cu concentratii diferite de NLC, de la 400 pg/ml pana la 25 pg/ml, se poate observa o siguranța de utilizare a NLC la concentrații cuprinse intre 25 si 100 μg/ml, asociata unor viabilități celulare crescute (comparabile cu cele ale martorului celular netratat/control, reprezentat prin curba roșie, Fig. 14)

In schimb, la concentratii mari, de 400 si 200 pg/ml, viabilitatea celulara scade semnificativ, indicând apariția la aceste concentratii a unui efect citotoxic manifestat de sistemele NLC. Interesant de notat este faptul ca prin creșterea timpilor de tratament, cu cateva excepții, se ajunge la valori comparabile cu cele ale celulelor netratate, ceea ce indica o lipsa a efectelor citotoxice, pe acel domeniu de concentrație (Fig. 14).

RO 135202 AO

CTRL 400 pg/ml -......200 pg/ml........... CTRL 400 pg/ml........ 200 pg/ml........... 100 pg/ml 50 pg/ml 25 pg/mi -- - 100 pg/ml 50 pg/ml 25 pg/ml ——

CTRL - 400 pg/ml 200 pg/ml — _: CTRL -....... 400 pg/ml .......200 pg/ml....... 100 pg/ml —— 50 pg/ml -.....- 25 pg/ml > 100 pg/ml 50 pg/ml 25 pg/ml..........

Fig. 14. Acțiunea citotoxica vs. proliferativa indusa de sistemele NLC-ULN/US libere si încărcate, NLC-ULN/US-EYS, NLC-ULN/US-EYS-ELD asupra celulelor normale HUVEC

Ca urmare a rezultatelor obținute prin analizele MTS si RTCA, pentru testele de evaluare in vitro a activitatii anti-înflamatoare s-au ales concentrațiile de 50 si 100 pg/ml NLC.

8. Atribuirea in vitro a proprietăților anti-inflamatorii

Rezultatele in vitro obținute în urma analizei ELISA, care evalueaza expresia cîtokinelor pro-înflamatoriî TNF-α si IL-6, după tratarea celulelor normale HUVEC cu sistemele NLC-libere si cu conținut de EYS, respectiv amestec de EYS si ELD, a evidențiat apariția unui efect puternic antiinflamator, efect care a fost dependent atat de doza de NLC aplicata, cat si de tipul de ulei vegetal folosit la prepararea nanotransportorilor lipidici. Prin tratarea celulelor HUVEC cu sistemele NLC, producția de citokine pro-inflamatorii TNF-aîpha si IL-6 a fost semnificativ inhibată (Fig. 15).

Din punct de vedere al dozei aplicate la tratamentul celulelor endoteliale, s-a constatat faptul ca tratamentele cu 200 pg/ml NLC au dus la o scădere a nivelurilor markerîlor inflamatori TNF-α si IL-6, respectiv la un grad de inhibare mai scăzut, comparativ cu doza de 50 pg/ml, unde a fost înregistrata o creștere semnificativa a % de inhibare a ambelor categorii de citokine proinflamatorii eliberate in urma tratamentului. Aceasta contracarare mai eficienta a dozei mai mici de NLC, respectiv de 50 pg/ml, comparativ cu tratamentul cu o concentrație mai mare, 200 pg/ml, poate fi corelata si explicata pe baza rezultatelor anterioare ale analizelor MTS si RTCA care au demonstrat o scădere a viabilității celulare la concentrații de 200 pg/ml. Acest efect conduce implicit la denaturarea si moartea unor celule, care au ca rezultat direct o scădere a % de inhibare a cîtokinelor TNF-α si IL-6.

Prin compararea efectului anti-inflamator al NLC asupra eliberării citokineî TNF-a versus nivelul interleukinei 6 (IL-6), s-a detectat o diferența semnificativa intre procentele de IL-6 si TNF- a, mult mai eficienta fiind inhibarea eliberării TNF-α (valori de peste 70%) in cazul NLC încărcate cu principii vegetale. Aceste rezultate pot fi asociate si cu acțiunea

RO 135202 AO agentului oxidant (H2O2) aplicat asupra celulelor HUVEC. Acțiunea H2O2 a determinat o eliberare mai mare de TNF-alpha fata de celulele netratate, in comparație cu IL-6.

Trebuie remarcat faptul ca sistemele nanotransportor libere, NLC-US/ULN pentru care s-a analizat acțiunea antiinflamatoare in scop comparativ, au prezentat ele insele o buna abilitate de a inhiba eliberarea citokinelor pro-inflamatorii. Astfel, la concentratii de 50 pg/ml, % de inhibare a IL-6 a fost >50% pentru ambele categorii de NLC, iar in cazul inhibării citokinei TNF-a, aceasta inhibare a depășit 85% (Fig. 15). Aceste rezultate sugeraza impactul evident al uleiului de luminița nopții (ULN) si al uleiului de soia (US) asupra acțiunii antiinflamatoare detectate.

100.0

90.0

80.0

70.0

60.0

50.0

40.0

30.0

20.0

10.0

0.0

&IL-6 «TNF-a

Fig. 15. Evaluarea prin tehnica ELISA a efectului tratamentelor cu sisteme nanotransportor de tip NLC-EYS si NLC-EYS-ELD asupra eliberării citokinelor TNF-α si IL-6, de către celulele normale HUVEC

O privire comparativa a NLC-ULN libere versus NLC-ULN-EYS-ELD arata o amplificare ușoara a acțiunii antiinflamatoare in cazul ultimului sistem nanotransportor (ex: pentru NLC-ULN s-a detectat o inhibare a IL-6 de 53.9% versus 62% in cazul NLC-ULNEYS-ELD), In cazul TNF-α s-a determinat un grad de inhibare mai pronunțat al NLC, de 89.8% pentru NLC-ULN versus 96.9% pentru NLC-ULN-EYS-ELD (Fig. 15).

NLC preparate cu US au asigurat o inhibare comparabila a IL-6 si TNF-α: pentru NLC-US s-a detectat o inhibare a IL-6 de 52.8% versus 62.5% in NLC-US-EYS-ELD. Pentru inhibarea TNF-α procentul de inhibare a fost de 90.6% (NLC-US) versus 97.9% (NLC-US-EYS-ELD, Fig. 15).

Claims

REVENDICĂRI

1. Procedeu de obținere a unor nanotransportori lipidici pe baza de ulei de luminița nopții si ulei de soia, care prezintă avantajul de a co-incapsula si distribui simultan doua categorii de principii active vegetale, lipofile si hidrofile, caracterizat prin aceea ca, cuprinde:

a. formarea unei pre-emulsii lipidice libere și incarnate cu amestecuri de principii active vegetale (EYS sau ELD, respectiv EYS si ELD) obținute prin contactarea, sub agitare magnetică, a unei faze lipidice și a unei faze apoase, la o temperatură de 73...75°C, și menținere la temperatură constantă, timp de 20 min;

b. supunerea pre-emulsiei lipidice la un proces inițial de omogenizare cu grad înalt de forfecare (12 000 rpm, timp de 1 min, la o temperatura de 70 ... 72 °C) si ulterior la un proces de omogenizare la presiune ridicata (la 500 bar, timp de 196 sec, temperatura de 70 ... 72 °C);

c. obținerea unor dispersii apoase de NLC liberi și încărcați cu cele doua categorii de principii bio-actlve vegetale, prin răcire ușoară a nanoemulsiilor, sub agitare magnetică, la temperatura camerei;

d. obținerea de formulări solide de NLC prin supunerea dispersiilor apoase de nanotransportori lipidici liberi și încărcați cu EYS/ELD, respectiv EYS si ELD la un proces de liofilizare, la -55°C timp de 60h.
2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, faza lipidică este formată la o temperatură de 73 ... 75°C dintr-un amestec de lipide solide și lichide, respectiv monostearat de gliceril : palmitat de cetii : ulei de luminița nopții sau ulei de soia, într-un raport de 1 : 1 : 0.85.
3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, faza apoasă este formată la o temperatură de 73 ... 75°C dintr-un amestec de surfactanți ce conține Tween 20 : Fosfatidilcolina : Poloxamer 188 într-un raport de greutate de 1 : 0.21 : 0.21.
4. Procedeu conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că, în faza lipidicăse adauga o cantitate de 0.5g extract lipofil de yam sălbatic (in 100g dispersie apoasade

NLCs).
5. Procedeu conform revendicării 3, caracterizat prin aceea că, în faza apoasăse adauga o cantitate de 0,5 ... 2g extract hidrofil de lemn dulce (in 100g dispersie apoasa de NLC).
6. Procedeu conform revendicărilor 2 si 3, caracterizat prin aceea că, pre-emulsia lipidică conține 10% amestec de lipide solide si uleiuri vegetale și 2,5% amestec de surfactanți.
7. NLC in stare solida, încarcati cu EYS sau ELD, respectiv amestec de EYS si ELD, obținuți prin procedeul definit în revendicările de la 1 la 6, caracterizati prin aceea că aceștia conțin:

a. 10.7 ... 13.8% ELD in formulările de NLC-individuale (NLC-ELD), procentele fiind exprimate în greutate.

b. 3.8% EYS in formulările de NLC-individuale (NLC-EYS), procentele fiind exprimate în greutate.

c. 3.3 ... 3.7% EYS si 3.7 ... 13.2% ELD in formulările de NLC-duale (NLC-EYSELD), procentele fiind exprimate în greutate.

RO 135202 AO
8. NLC conform revendicării 7 obținuți prin procedeul definit în revendicările de la 1 la 6 caracterizati prin aceea că sunt de formă sferică și au diametre medii cuprinse între 50 si 200 nm.
9. NLC conform revendicării 7 obținuți prin procedeul definit în revendicările de la 1 la 6 caracterizati prin aceea că prezintă valori ale potențialului electrocinetic ce variază între -38.6 + -56.4 mV, determinate pentru NLC-individuale (NLC-EYS/ELD) și între -35 - -48,7 mV, determinate pentru NLC-duale (NLC-EYS-ELD).
10. NLC conform revendicării 7 obținuți prin procedeul definit în revendicările de la 1 la 6 caracterizati prin aceea că prezintă valori ale eficientei de încapsulare cuprinse între 95.8 + 96.5% ELD sî între 85.8 * 89.5% EYS, pentru cazul sistemelor NLC-individuale (NLC-EYS/ELD), respectiv cuprinse intre 83 - 89.5% ELD si intre 70 - 83.9% EYS, pentru cazul sistemelor NLC-duale (NLC-EYS-ELD).
11. NLC conform revendicării 7 obținuți prin procedeul definit în revendicările de la 1 la 6, caracterizati prin aceea că manifesta o activitate puternica de a capta radicalii de viata scurta ai oxigenului (ROS), generati intr-un sistem de chemiluminescenta, cu valori cuprinse intre 81 - 95% de a capta ROS pentru NLC-duali preparati cu US, respectiv de 84 - 96% de a capta ROS pentru NLC-duali preparati cu ULN.
12. NLC conform revendicării 7 obținuți prin procedeul definit în revendicările de la 1 la 6 caracterizati prin aceea că prezintă o capacitate ridicata de inhibare a radicalilor cationici de viata lunga (ABTS'⁺) de către sistemele NLC încărcate cu cele doua principii bioactive vegetal (EYS si ELD), care ating procente de 65%.
13. NLC conform revendicării 7 obținuți prin procedeul definit în revendicările de la 1 la 6, caracterizati prin aceea că aceștia nu prezintă un efect cîtotoxic la un tratament al celulelor endoteliale HUVEC, pe un interval de concentratii cuprins intre 50 si 3.125 ug/ml, viabilitatea celulara fiind >80%.
14. NLC conform revendicării 7 obținuți prin procedeul definit în revendicările de la 1 la 6, caracterizati prin aceea că un tratament cu 50 pg/mL NLC conduce la apariția unui efect anti-inflamator (pentru NLC preparate cu US % de inhibare a citokinelor proînflamatorîi, IL-6 si TNF-α, a fost de: 62.5% pentru cîtokina IL-6 si de 97.9% pentru citokina TNF-a).