RO133952B1 - Procedeu de obţinere a matricilor colagen-polizaha- ridice microporoase cu conţinut de viola- ceină - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unor matrice colagen-polizaharidice microporoase, pentru aplicaţii biomedicale. Procedeul conform invenţiei constă în etapele de: preparare a soluţiilor concentrate ale precursorilor bio§(macro)§moleculari, prepararea formei de înglobare a violaceinei, preparea şi formularea compoziţiilor fluide precursoare ale matricelor, generarea matricelor microporoase solide §(atelo)§colagen-polizaharidice cu conţinut de violaceină, condiţionarea şi post-procesarea fizico-chimică a acestora, asocierea matricelor post-procesate cu sisteme fizice cu rol de ataşare la suprafaţa tegumentelor, ambalarea în pachete şi sterilizarea pachetelor astfel ambalate.

Description

RO 133952 Β1

Invenția se referă la un procedeu pentru obținerea matricilor colagen-polizaharidice microporoase, cu conținut de violaceină, destinate aplicațiilor biomedicale și dermatocosmetice.

Matricile microporoase (atelo)colagenice, precum și cele mixte, (atelo)colagen polizaharidice, au caracteristici de biomaterial și, funcție de morfologia internă și reactivitatea lor fizico-chimică, pot fi utilizate drept substrat sau vector pentru specii de interes biochimic și/sau farmacologic, ori ca sediu bioinvadabil, cito-prietenos. în marea lor majoritate respectivele matrici sunt biodegradabile/bioresorbabile, ori cel puțin biointegrabile. Pentru a putea fi utilizate în aplicații biomedicale și dermato-cosmetice, toate componentele lor trebuie să fie lipsite de cito-toxicitate și de antigenicitate intrinsecă sau rezultate prin asociere ori degradare, fapt care impune restricții severe în selectarea formelor colagenice și a speciilor non-colagenice incluse.

Principalul motiv al utilizării (atelo)colagenului de tip fibrilar (I, II și III) drept componentă a matricilor cu aplicații biomedicale rezidă în prezența în macromoleculele sale a domeniilor de recunoaștere celulară (Davidenko N., Hamais S., Bax D.V., Malcor J.D., Schuster C.F., Gullberg D., Farndale R.W., Best S.M., Cameron R.E., “Selecting the correct cellular model for assessing of the biological response of collagen-based biomaterials”, Acta Biomaterialia, 65,2018, 88-101), fapt care îi asigură o compatibilitate necondiționată cu practic toate tipurile de celule aderente la substrat. Cerințele pentru ca această caracteristică să fie valorificată sunt expunerea sferică favorabilă a secvențelor de aminoacizi complementari integrinelor (GFOGER, GROGER, GLOGER etc.), precum și asigurarea unei „concentrații minimale (relativ ridicată) a acestora pe suprafețele matricii care vin în contact cu celulele, inclusiv în pereții porilor săi.

Incidența clinică a reacțiilor adverse ale țesuturilor (aflate în stare fiziologică sau patologică) la contactul cu forme colagenice derivate de la tipul I, II și III este extrem de redusă (Lynn A.K., Yannas I.V., Bonfieid l/V., “Antigenicity and Immunogenicity of Collagen”, Jornal of Biomedical Materials Research, Part B - Applied Biomaterials, 71(2), 2004, 343-54; Teixeira C, Ferraz R., Prudencio C, Gomes P., “Collagen-like materials fortissue regeneration and repair, in Peptides and Proteins as Biomaterials for Tissue Regeneration and Repair”, Editori: Barbosa M., Martins M.C., Woodhead Publishing, Cambridhe, U.K., 2017, p. 283-307), iar prin modificarea lor fizico-chimică, intenționată sau incidentală, în cursul obținerii și post-procesării tehnologice, imunogenicitatea acestora se estompează mult (DeLustro F., Condell R. A., Nguyen M. A., McPherson J. M., “A comparative study of the biologic and immunologic response to medical devices derived from dermal collagen”, Journal of Biomedical Materials Research, 20(1), 1986, 109-120; Holmes R., Kirk S., Tronci G., Yang X., Wood D., “Influence of telopeptides on the structural and physical properties of polymeric and monomeric acid-solubletypeIcollagen”, Materials Science and Engineering C, 77,2017,823-827).

De regulă, rolul polizaharidelorîn matricile mixte este preponderent structural (de a asigura consolidarea morfologiei interne, microporoase), dar, funcție de tipul și caracteristicile lor, poate fi și unul funcțional, complementar (atelo)colagenului (de nuanțare a comportamentului fizico-chimic și reo-mecanic în mediu umed și/sau apos, ori chiar de inducere a unor efecte biochimice speciale, cum sunt reținerea și eliberarea unor ioni anorganici, ori a unor compuși organici mic-moleculari). Frecvent, mai ales în condițiile mediului fiziologic sau patologic tisular, nativ sau simulat, cele două specii biomacromoleculare ((atelo)colagenul și polizaharidele) devin coloidal incompatibile și co-precipită prin mecanisme ionice sau sferice, fapt care se soldează cu denaturarea parțială a

RO 133952 Β1 scleroproteinei, ori cu mascarea parțială a domeniilor de recunoaștere celulară specifice 1 acesteia, deci cu reducerea șanselor de aderare a celulelor la pereții matricilor mixte. Din acest motiv, prepararea compozițiilor din care se obțin matricile mixte trebuie să prevadă 3 rapoarte de amestecare care să se situeze în apropierea limitei stabilității de fază (Lefter CM., Maier S.S., MaierV., Popa M., Desbrieres J., “Engineeringpreliminaries to obtain 5 reproducible mixtures of atelocollagen andpolysacchahdes”, Materials Science and Engineering C, 33, 2013, 2323-2331), pe care să nu o depășească flagrant. Selectarea 7 tipurilor de polihazaride și a formelor lor de procesare anterioară contactării cu (atelo)colagenul fibrilar (prin hidroliză parțială, functionalizare chimică, reticulare controlată, conjugare 9 cu specii mic-moleculare) se realizează ținând cont de potențialul lor de angajare în interacții favorabile adeziunii și proliferării celulare (Diekjurgena D., Grainger D.W., “Polysaccharide 11 matrices used in 3D in vitro cell culture systems”, Biomaterials, 141, 2017, 96-115) la pereții matricilor. 13

Compozițiile (atelo)colagen - polizaharide aflate în fază lichidă coloidal omogenă sunt capabile ca, înainte de a genera matricile microporoase, să înglobeze diverse specii chimice, 15 mic- sau macro-moleculare, individuale sau agregate, inerte sau active biochimic (Devi N., Sarmah M., Khatun B., Maji T.K., “Encapsulation of active ingredients in 17 polysaccharide-protein complex coacervates”, Advances in Colloid and Interface Science, 239, 2017,136-145). Pentru ca funcționalitatea acestora din urmă să se mențină 19 și în compoziția/structura și aplicațiile matricilor generate ulterior, ele trebuie să fie înglobate pur fizic, fără a li se permite interacții fizico-chimice semnificativ intense cu cele două 21 componente biomacromoleculare. în situația în care acest fapt nu este posibil, precum și atunci când speciile chimice adăugate sunt nemiscibile și tind să separe, acestea trebuie 23 protejate prin includere în sisteme de vehiculare (lipozomi, niozomi, complecși de găzduire, micro-geluri). Mecanismul și forma de protejare se aleg funcție de tehnica prin care se vor 25 genera matricele, pornind de la compozițiile fluide.

Din punct de vedere chimic, violaceina este un compus mic-molecular bis-indolic, 27 hidrofob, cu caracteristici de nano-pigment. Ea este biosintetizată de câteva specii de bacterii Gram negativ (Choi S.Y., Yoon K-h, Lee J.I., Mitchell R.J, “Violacein: Properties 29 and production of a versatile bacterial pigment”, BioMed Research International, 2015, Article ID 465056, DO110.1155/2015/465056), poate fi biosintetizată și în sisteme acelulare 31 (Hoshino T., Yamamoto M., “Con vers ion from tryptophan precursor into violacein pigments by a cell-free system from Chromobacterium violaceum”, Bioscience, 33 Biotechnology, and Biochemistry, 61(12), 1997,2134-2136) și poate fi sintetizată pe cale chimică (Ballantine J.A., Beer R.J., Crutchley D.J., Dodd G.M., Palmer D.R., “The 35 chemistry of bacteria. Part VIII, The synthesis of violacein and related compounds”, Journal of the Chemical Society, 1960, part II, 2292-2299; Wille G.T Steglich W., “A 37 short synthesis of the bacterial pigments violacein and deoxyviolacein”, Synthesis, 5,2001, Article ID 1437-210X,E;2001), însă cu randamente scăzute, care fac neinteresantă 39 transpunerea la scară tehnologică. Coeficientul de partiție octanol : apă calculat pentru violaceina utilizând algoritmul XLogP3-AA are, la 25°C, valoarea 1,9. Solubilitatea în soluții 41 apoase fiind foarte scăzută, violaceina separă prin precipitare, mai ales în prezența electroliților, pierzând abilitățile de agent antibacterian, imunomodulator antioxidant și foto- 43 protector pe care le prezintă atunci când este disponibilă ca moleculă independentă. Din acest motiv, pentru a putea fi inclusă în compoziții apoase destinate realizării de matrice cu 45 caracteristici de biomaterial, violaceina trebuie fin dispersată sub formă de emulsie, sau trebuie adăugată sub formă încapsulată ori încărcată în complecși de incluziune. 47

RO 133952 Β1

Din literatura de specialitate și din cea de brevete, este cunoscut faptul că matricile microporoase solide ce includ (atelo)colagen și eventual polizaharide se obțin pornind de la compoziții fluide, formulate suplimentar sau nu, ce se supun uscării prin liofilizare sau prin extracție cu solvenți (Chvapil M., “Collagen sponge: Theory and practice of medical applications”, Journal of Biomedical Materials Research, 11(5), 1977, 721-41; US Pat. No. 3157524/1964; WO 2005/004928; US Pat. No. 9439999/2016; US Pat. No. 9655997/2017; US Pat. No. 9757495/2017). Compozițiile care includ și polizaharide se prepară, uzual, prin reticularea mediată de polizaharidul funcționalizat chimic, pentru a asigura matricei o morfologie internă stabilă și o porozitate adaptată aplicațiilor vizate (Luca A., Maier V., Maier S.S., Butnaru M., Danu M., Ibănescu C, Pinteală M., Popa M., “Biomacromolecular-based ionic-covalent hydrogels for cell encapsulation: The atelocollagen - Oxidizedpolysaccharides couples”, Carbohydrate Polymers, 169,2017, 366-375). în calitate de agent reticulant se pot utiliza, de asemenea, compuși bifuncționali biocompatibili, capabili să lege prin punți covalente (atelo)colagenul și polizaharidele compoziției (Maier V., Lefter CM., Maier S.S., Butnaru M., Danu M., Ibănescu C, Popa M., Desbrieres J., “Property peculiarities of the atelocollagen-hyaluronan conjugates crosslinked with a short Chain di-oxirane compound”, Materials Science and EngineeringC, 42,2014,243-253; US 9872934/2018). Frecvent, compozițiile se formulează prin adaos de antibiotice (US 3823212/1974; RO 128972/2017), specii de interes biochimic (US 9539363/2017; US 9540610/2017), sau fosfați de calciu (Kane R.-J., Weiss-Bilka H.E., Meagher M.J., Liu Y., Gargac J.A., Niebur G.L., Wagner D.R., Roeder R.K., “Hydroxyapatite reinforced collagen scaffoids with improved architecture and mechanical properties”, Acta Biomaterialia, 17,2015,16-25; Sun R.-X., Lv Y., Niu Y.-R., Zhao X.-H., Cao D.-S., Tang J., Sun X.-C, Chen C.-Z., “Physicochemicalandbiological properties of bovine-derived porous hydroxyapatite/collagen composite and its hydroxyapatite powders”, Ceramics International, 43(18), 2017, 16792-16798; US 8435552/2013), funcție de aplicația biomedicală vizată.

Brevetul EP 2517738 B1 se referă un procedeu de producere a unei rețele compozite de colagen/hidroxiapatită (HA) care cuprinde etapele de formare a unei suspensii omogene de colagen și HAÎntr-o soluție acidă, liofilizarea suspensiei până când se atinge temperatura finală de congelare dorită pentru a produce rețeaua compozită și, opțional, reticularea rețelei compozite, în care raportul dintre HA și colagen este de cel puțin 1:10 (g/g). De asemenea, este furnizată o rețea compozită de colagen/hidroxiapatită (HA) care cuprinde o distribuție omogenă a hidroxiapatitei într-o matrice de colagen poroasă, reticulată, în care raportul dintre HA și colagen este de cel puțin 1:10 (g/g). în mod adecvat, rețeaua compozită are o porozitate de cel puțin 99% și o rigiditate la compresiune de cel puțin 0,3 KPa. Rețelele compozite conform invenției pot fi utilizate pentru a furniza implanturi osoase osteoconductoare și implanturi destinate ingineriei tisulare.

Dezavantajul major al procedeelor deja cunoscute derivă din faptul că în compozițiile preparate pentru obținerea matricilor(atelo)colagenice unitare și respectiv mixte, (atelo)colagen-polizaharidice, eventual formulate, precum și în matricile finale obținute pornind de la acestea, se includ și se regăsesc specii chimice cu rol de reticulant. Fie prin ei înșiși ca entități chimice (reacționate sau rămase în produs ca impurități), fie prin intermediul compușilor lor de degradare (bio)chimică în produs (în cursul obținerii, stocării, sau utilizării produsului), agenții de reticulare sunt sau devin cito-toxici ori imunogenic activi, reducând semnificativ valoarea de întrebuințare terapeutică a matricei. în plus, derularea reacțiilor de reticulare în prezența adaosurilor de formulare (cu rol de antibiotic, antioxidant etc.) poate

RO 133952 Β1 duce la inactivarea/mascarea compușilor activi, fapt care diminuează efectele curative 1 scontate. Mai mult decât atât, atunci când adaosurile de formulare farmacologic active sunt hidrofobe, aplicând procedeele cunoscute, ele tind să separe ca fază, ceea ce fie le 3 inactivează, fie le reduce semnificativ biodisponibilitatea și funcționalitatea. De aceea, spre exemplu, utilizând procedeele citate, violaceina nu poate fi inclusă ca nano-pigmentîn astfel 5 de matrice, atunci când acestea sunt destinate aplicațiilor bio-medicale și dermatocosmetice, iar funcționalitatea violaceinei este îndeplinită doar dacă ea se regăsește ca 7 moleculă distinctă/individuală și nu sub formă de precipitat sau de cristal, în produsul final.

Problema pe care o rezolvă invenția constă în obținerea unei matrici colagen- 9 polizaharidice microporoase cu conținut de violaceină, cu aplicații biomedicale și dermatocosmetice.11

Procedeul de obținere a matricilor colagen-polizaharidice microporoase cu conținut de violaceină, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că constă în 13 următoarele etape:

a) prepararea a soluțiilor concentrate ale precursorilor biomacromoleculari;15

b) prepararea formei de înglobare a violaceinei;

c) prepararea și formularea compozițiilor fluide precursoare ale matricilor;17

d) generarea matricilor microporoase solide (atelo)colagen-polizaharidice cu conținut de violaceină, prin liofilizare având următoarele caracteristici fizico-chimice: densitate 19 aparentă 0,06 ± 0,02 g/cm³, densitate picnometrică 0,32 ± 0,05 g/cm³ și porozitate 84 ± 2% și următoarele caracteristici compoziționale: substanță uscată 85 ± 2%, conținut de viola- 21 ceină 0,30 ± 0,05 % raportat la substanța uscată, conținut total de colagen nativ 87,5 ± 4,5% din conținutul total de colagen; 23

e) condiționarea fizico-chimică a matricilor microporoase solide;

f) post-procesarea fizico-chimică a matricilor microporoase solide;25

g) asocierea matricilor post-procesate cu sisteme fizice cu rol de atașare la suprafața tegumentelor;27

h) ambalarea în pachete și sterilizarea pachetelor astfel ambalate.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:29

- menținerea violaceinei în stare individualizată la nivel molecular;

- generarea și stabilitatea morfologiei interne microporoase a matricilor pornind doar 31 de la (atelo)colagen și polizaharide, fără a utiliza agenți de reticulare ca molecule de sine stătătoare, bi- sau multi-funcționale, ori ca tronsoane moleculare funcționalizate, aparținând 33 unuia dintre cei doi parteneri biomacromoleculari.

Invenția se referă la un procedeu pentru obținerea matricilor colagen-polizaharidice 35 microporoase, cu conținut de violaceină, destinate aplicațiilor biomedicale și dermatocosmetice, caracterizat prin aceea că furnizează substraturi solide poroase sterile, cu 37 hidrofilie controlată, hipo-imunogene și hipo-alergenice, cu rol de pansament sau compresă de unică folosință. Funcționalitatea respectivelor matrice în aplicațiile biomedicale și 39 dermato-cosmetice este asigurată de două dintre componentele lor, respectiv (atelo)colagenul cvasi-nativ hipo-imunogen și violaceină. în virtutea primeia dintre componentele citate, 41 matricile asigură sorbția și stocarea fluidelor locale, dar și rolurile de „substrat de sacrificiu în refacerea tisulară ghidată și de „țintă falsă pentru matrix-metaloproteinazele produse în 43 exces în răni. Cea de-a doua componentă funcțională, violaceina, conferă matricei rol antibacterian cu spectru îngust și induce un efect imunomodulator cu ecou în mecanismele infla- 45 matorii locale. Funcție de natura și fracția polizaharidelor în compoziția și structurarea morfologică a matricilor, acestea din urmă pot dobândi funcționalitate bio-medicală 47 suplimentară.

RO 133952 Β1

Matricile obținute conform procedeului brevetat, divers asociate cu sisteme fizice pentru fixarea lor la suprafața tegumentelor, sunt destinate tratării efectelor stărilor patologice și incidentale localizate la nivelul pielii, sau cu ecou în fiziologia țesuturilor epitelial și conjunctiv al tegumentelor, precum și asistării refacerii post-traumatice a epidermei și dermei. Ele sunt utilizabile, ca atare sau după umidificare/îmbibare, în manevre și tratamente medicale (inducerea hemostazei, refacerea accelerată a rănilor superficiale ori supurante și a arsurilor, asistarea vindecării ulcerațiilor și escarelor, igiena plăgilor chirurgicale), precum și pentru tratamente dermato-cosmetice (refacerea epidermei agresate termic, radiativ, sau chimic, limitarea devierilor microbiotei pielii, asistarea vindecării rănilor cauzate de extragerea neglijentă a comedoanelor etc.).

Problema pe care o rezolvă invenția este legată de obținerea, în condiții de lucru la nivel (semi)industrial, a unor matrici (atelo)colagen-polizaharidice cu conținut de violaceină, în care aceasta din urmă se regăsește dispersată la nivel molecular, vehiculată fiind fie prin intermediul unor micro-emulsii, fie sub forma compușilor de incluziune. Pentru a nu interfera cu violaceina, în recepturile compozițiilor fluide din care se obțin respectivele matrici nu se includ compuși cu rol de reticulare chimică. Prepararea compozițiilor și generarea matricilor microporoase solide se realizează exclusiv apelând la procese fizice, iar morfologia internă și caracteristicile lorfizico-chimice și reo-mecanice sunt reglate prin intermediul raportului de amestecare între cele două componente biomacromoleculare, care se aduc în condiții de coprecipitare prin interacții electrostatice, în regim controlat prin receptură și prin procedură.

Procedeul conform invenției permite obținerea a două tipuri de matrici cu conținut de violaceină, diferite prin caracteristicile lor, respectiv (I) unul destinat utilizării în medii abundent umede, spre exemplu pentru igiena și asistarea vindecării rănilor, arsurilor și ulcerațiilor și (II) unul destinat utilizării în condiții preponderent uscate, spre exemplu pentru tratarea unor afecțiuni cutanate superficiale. în primul tip menționat, violaceina joacă rol de imunomodulator activ pentru controlul inflamațiilor (Verinaud L, Lopes S.C.P., Prado I.C.N., Zanucoli F., Alves da Costa T., Di Gangi R. și alții, “Violacein Treatment Modulates Acute and Chronic Inflammation through the Suppression ofCytokine Production and Induction of Regulatory T Cells”, PLoS ONE, 10(5), 2015: e0125409, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0125409), iar în al doilea ea acționează drept antibiotic, pentru reechilibrarea microbiotei pielii (Dodou H.V., de Morais Batista A.H., Sales G.W.P., de Medeiros S.C., Rodrigues M.L., Nogueira P.C.N., Silveira E.R., Nogueira N.A.P., “Violaceinantimicrobial activity on Staphylococcus epidermidisand synergistic effect on commercially available antibiotics”, Journal of Applied Microbiology, 123(4), 2017, 853-860), dar și ca antioxidant implicat în blocarea peroxidării lipidelorîn zonele în care epiderma a fost agresată fizic (Konzen M., De Marco D., Cordova C.A.S., Vieira T.O., Antonioc R.V., Creczynski-Pasa T.B., “Antioxidant properties of violacein: Possible relation on its biological function”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 14,2006,8307-8313). Pentru a-și îndeplini respectivele roluri, violaceina trebuie să poată difuza dinspre matricea solidă, către substratul aflat în stare fiziologică sau patologică, la solicitarea substratului și în cantități terapeutic active. Asigurarea difuziei se realizează, în cazul primului tip de produs, prin gelifierea/destructurarea/solubilizarea acestuia în zona tratată, iar pentru al doilea, prin contactarea intimă cu țesuturile subiacente, ce dețin propriile materii lipidice în care violaceină se poate solubiliza lent. De aceea, pentru obținerea tipurilor de produse menționate, violaceina se formulează în mod distinct, conform procedeului brevetat.

RO 133952 Β1 în principiu, procedeul pentru obținerea matricilor colagen-polizaharidice solide 1 microporoase, cu conținut de violaceină, destinate aplicațiilor biomedicale și dermato-cosmetice, procedeu care face obiectul prezentei invenții, implică parcurgerea următoarelor 3 etape, proiectate pentru a asigura reproductibilitatea compozițională a produselor finale, derulate toate în condiții de sterilitate și de curățenie conforme reglementărilor 5 corespunzătoare aplicațiilor vizate pentru matricileîn cauză:

I. - prepararea soluțiilor concentrate ale precursorilor biomacromoleculari;7

II. - prepararea formei de înglobare a violaceinei;

III. - prepararea și formularea compozițiilor fluide precursoare ale matricilor;9

IV. - generarea matricilor microporoase solide, (atelo)colagen-polizaharidice, cu conținut de violaceină;11

V. - condiționarea fizico-chimică a matricilor microporoase solide;

VI. - post-procesarea fizico-mecanică a matricilor microporoase solide;13

VII. - asocierea matricilor post-procesate cu sisteme fizice cu rol de atașare la suprafața tegumentelor;15

VIII. - ambalarea și sterilizarea produselor finale.

în continuare se prezintă principiile și detaliile semnificative ale modului de conducere 17 la scară (semi)industrială a etapelor mai sus enumerate, respectiv pe un flux tehnologic prin a cărui parcurgere se asigură obținerea de produse finale destinate aplicațiilor bio-medicale 19 și dermato-cosmetice utilizabile în medii umede și respectiv preponderent uscate.

(I) Conform prezentei invenții, compozițiile fluide (atelo)colagen - polizaharide se 21 prepară prin co-precipitare asociativă prin mecanism mixt, electrostatic și conformațional (cauzat de „încâlcirea reciprocă a biomacromoleculelor prezente în mediul lichid), rezultată 23 ca urmare a amestecării intime a unor soluții coloidale de (atelo)colagen și polizaharid, suficient de concentrate. Acest tip de co-precipitare se soldează cu separare de fază și 25 sinereză, dar faza organică vâscoasă rezultată are compoziție omogenă (nu segregă suplimentarîn componente) și include cei doi parteneri în concentrațiile dictate prin receptura 27 amestecului. Co-precipitarea se controlează prin modificarea pH-ului amestecului în raport cu plaja izoelectrică a speciei scleroproteice, ceea ce conduce la încărcarea electrostatică 29 opusă a celor doi parteneri cu caracter de polielectroliți macromoleculari. Uzual, în soluții apoase, polizaharidele dobândesc încărcare negativă. De aceea, pentru a favoriza co- 31 precipitarea, încărcarea (atelo)colagenului trebuie adusă în domeniul potențialelor zeta pozitive, lucrând la valori ale pH-ului mai coborâte decât pH-ul izoelectric. Rapoartele de 33 amestecare se stabilesc astfel încât limita stabilității coloidale a perechii celor două componente să fie atinsă și minimal depășită. Dacă respectiva limită este încălcată flagrant, 35 se întrunesc condițiile separării segregative, iar amestecul devine neomogen. Pentru a conduce în siguranță co-precipitarea, se impune ca soluțiile celor doi parteneri amestecați 37 să aibă concentrații suficient de ridicate, dar corelate între ele. Deoarece soluția coloidală de (atelo)colagen nu poate fi concentrată peste circa 6-^9 g/L, din cauza creșterii excesive 39 a vâscozității, soluția de polizaharid va fi preparată la aceeași concentrație, sau la una cu până la 30% mai scăzută, atunci când masa moleculară a polizaharidului utilizat este mult 41 mai mare decât masa moleculară a (atelo)colagenului unimer.

(II) Conform prezentei invenții, violaceină se adaugă în compozițiile fluide 43 (atelo)colagen - polizaharide după înglobarea într-un sistem de protejare și vehiculare, la nivel molecular, sistem care poate fi de tipul micro-emulsiilor, lipozomilor, niozomilor (gene- 45 rați utilizând poloxameri, sau cuplul Span/Tween), sau compușilor de incluziune. Natura și componentele sistemului de înglobare se aleg funcție de aplicația finală a matricilor 47 (atelo)colagen-polizaharidice, recurgând la specii chimice biocompatibile și acceptate de

RO 133952 Β1 farmacopee și de Directiva pentru Cosmetică a Uniunii Europene (ca selecție din lista INCI). în prezenta descriere se vor detalia recepturile și procedurile pentru obținerea sistemelor extreme din enumerarea de mai sus, respectiv micro-emulsiile și compușii de incluziune, ele reprezentând cazurile tipice pentru înglobarea violaceinei la nivel de „colecție de molecule și respectiv de molecule individuale.

înglobarea în micro-emulsii recurge la emulgatori cationici sau neionogeni, care să asigure preluarea și omogenizarea emulsiei în volumul compoziției (atelo)colagen polizaharid, la valori apropiate de neutru ale pH-ului (între 5,8 și 7,8). Emulgatorii se aleg astfel încât, individual sau în amestec, să asigure valori ale HLB în plaja 6 + 15. Se preferă fosfolipidele și derivații acestora, esterii sorbitanului nativi și polietoxilați și/sau bloccopolimerii etoxilici, ori glicozidele modificate chimic. Cantitatea de emulgatori se stabilește funcție de forma sub care se prezintă violaceina, respectiv ca soluție în solvent organic volatil, sau ca soluție în fază organică hidrofilă nevolatilă, situându-se între 0,01 și 0,15% m/v în raport cu volumul final al micro-emulsiei (de tip „ulei în apă). Se preferă prepararea unor volume minime de emulsie, care să poată fi omogenizate eficient în soluția coloidală a unuia dintre biomacromoleculele ce vor alcătui compoziția fluidă din care se obțin apoi matricile microporoase. în vederea emulsionării, violaceina se va aduce fie în soluția unui solvent lipsit de cito-toxicitate și non-precipitantfață de (atelo)colagen (dimetil-sulfoxid, acetat de etil etc.), fie în fază organică hidrofilă (PEG 400, PEG 600, glicerină, poliglicerol de puritate farmaceutică etc.).

înglobarea violaceinei în compuși de incluziune asigură vectorizarea moleculelor sale individuale în medii polare, inclusiv apoase și aglomerate supramolecular. Compusul „gazdă apt a include violaceina este β-ciclodextrina, eventual funcționalizată chimic. Conform prezentei invenții, încărcarea β-ciclodextrinei cu violaceina se realizează pornind de la soluții ale acesteia din urmă în fază organică hidrofilă, asigurând un exces de compus „gazdă și durate ale procesului suficient de lungi, impuse de cinetica lentă în mediul de reacție vâscos, tipic fazei organice în cauză.

Indiferent de forma de înglobare a violaceinei, sistemul coloidal obținut se amestecă și se omogenizează, de preferat, în soluția coloidală concentrată a polizaharidului, deoarece aceasta este puțin sensibilă la prezența compușilor străini, mai ales a micro-emulsiilor. Pentru ca micro-emulsiile (dar și lipozomii și niozomii eventual preparați) să nu se destructureze, omogenizarea se conduce la cea mai scăzută temperatură care permite încă amestecarea, fără pierderea fluidității sistemului coloidal. Respectiva valoare a temperaturii depinde semnificativ de natura polizaharidului utilizat și în mai mică măsură de concentrația acestuia.

(III) Compozițiile fluide din care urmează a se obține matricile microporoase solide se prepară amestecând soluția coloidală de (atelo)colagen cu cea de polizaharid formulată (prin adăugarea formei de vehiculare a violaceinei). Deși amestecarea și omogenizarea celor două soluții apoase concentrate ale precursorilor este dificilă, nu se lucrează cu soluții diluate deoarece acestea permit co-precipitarea prematură a celor două specii biomacromoleculare și o sinereză masivă. Pentru ca omogenizarea să fie eficientă, aceasta se realizează în două etape: mai întâi prin malaxare lentă și apoi prin vortexare, în condiții de termostatare la temperaturi de 12 + 25°C. Ambele etape se subîmpartîn „epoci care alternează amestecarea și maturarea statică de scurtă durată, pentru a permite îndepărtarea progresivă a apei ce se separă prin sinereză. La finalul omogenizării, compozițiile fluide pot fi formulate suplimentar, prin adăugarea de specii de interes biochimic și farmacologic, funcție de aplicația finală vizată. Compozițiile astfel rezultate se supun unei maturări finale sub vid moderat, în condiții de termostatare la 25 + 40°C, cu dublul scop de dezaerare și definitivare a sinerezei (îndepărtând apa pe măsură ce aceasta este eliminată, prin scurgere și sorbție).

RO 133952 Β1 (IV) Generarea matricilor microporoase solide se realizează supunând liofilizării 1 compozițiile fluide anterior preparate, turnate în casete din oțel inoxidabil (aliajul 316L). Pentru a obține matrice cu caracteristici reproductibile, liofilizarea se conduce conform unui 3 program de subrăcire, congelare, sublimare sub vid și uscare secundară adaptat compozițiilor procesate. în principiu, subrăcirea se realizează în congelator separat, la tempe- 5 râturi ușor negative, atinse și menținute în compoziție fără a permite inițierea semnificativă a cristalizării apei. Tăvile cu compoziția subrăcită se introduc rapid în liofilizatorul subrăcit 7 în prealabil la temperaturi cu 2 + 10°C mai coborâte decât cele atinse în compoziție. După o scurtă etapă de menținere sub vid moderat (pentru eliminarea condensului), se inițiază 9 congelarea compoziției la valoarea minimă a temperaturii permisă de utilaj, atinsă cu cea mai abruptă pantă posibilă. Uscarea primară se conduce sub vid înaintat, iar uscarea secundară 11 sub vid moderat și temperaturi crescânde, care (doar) la final pot atinge 40 + 48°C.

(V) Condiționarea fizico-chimică a matricilor poroase rezultate după liofilizare are 13 drept scop modificarea în limite sensibile a caracteristicilor de biomaterial ale produsului și se poate realiza prin menținere în atmosferă cu umiditate, compoziție și temperatură 15 controlate și/sau prin reticulare dehidrotermică, funcție de forma de înglobare a violaceinei. Dacă aceasta a fost înglobată în niozomi sau în β-ciclodextrină, reticularea dehidrotermică 17 este permisă, cu condiția conducerii operației sub vid moderat, menținut dinamic (în flux minimal de aer steril). Urmare reticulării dehidrotermice, capacitatea de gonflare/gelifiere/ 19 solubilizare a matricei scade, iar rigiditatea sa mecanică crește.

(VI) Post-procesarea fizico-mecanică a matricilor poroase este opțională și vizează 21 formarea lor spațială și ajustarea dimensiunilor lor funcție de gama de utilizare a produsului finit. Se realizează prin aplatizare și decupare, eventual prin stivuirea straturilor aplatizate 23 cu alte matrici sau (bio)materiale plane, cu grosimi reduse.

(VII) Asocierea matricilor divers post-procesate cu sisteme fizice care au rol de 25 atașare sau fixare la sau pe suprafața tegumentelor (eventual în zone afectate de răni, ulcerații etc.) este și ea opțională și dependentă de aplicația vizată. Se realizează prin mon- 27 tarea matricilor/ansamblurilor pe suprafața acoperită cu adezivi a unor folii sau filme polimerice, ori a unor materiale textile. Suporturile adezive se decupează după contururi adec- 29 vate aplicației, fie înaintea montării, fie după ce montarea s-a efectuat.

(VIII) Ambalarea în condiții de curățenie de nivel ISO 6 și sterilizarea produselorfinale 31 sunt obligatorii. Sterilizarea se realizează prin expunere la radiație gamma, la dozele minim necesare, pentru a evita degradarea formelor de înglobare a violaceinei. 33

Procedeul pentru obținerea matricilor colagen-polizaharidice microporoase, cu conținut de violaceină, destinate aplicațiilor biomedicale și dermato-cosmetice, conform 35 prezentei invenții, prezintă următoarele caracteristici:

- asigură menținerea violaceinei în stare individualizată la nivel molecular, înglobată 37 fiind în sisteme de vehiculare de tipul micro-emulsiilor, lipozomilor, niozomilor, sau compușilor de incluziune, ce se regăsesc în matrici, la final; 39

- asigură generarea și stabilitatea morfologiei interne microporoase a matricilor pornind doar de la (atelo)colagen și polizaharide, fără a utiliza agenți de reticulare ca 41 molecule de sine stătătoare, bi- sau multi-funcționale, ori ca tronsoane moleculare funcționalizate, aparținând unuia dintre cei doi parteneri biomacromoleculari; 43

- asigură matricilor obținute următoarele caracteristici fizico-chimice, înainte de aplatizare (această operație modificându-le semnificativ, definitiv și variabil): 45

- densitatea aparentă: 0,06 ± 0,02 g/cm³;

- densitatea reală (picnometrică; 2-propanol 99,8 %): 0,32 ± 0,05 g/cm³; 47 porozitatea: 84 ± 2%;

RO 133952 Β1

- asigură matricilor obținute următoarele caracteristici compoziționale:

- substanță uscată: 85 ± 2%, în atmosferă cu umiditatea relativă de 50 ± 4%, la temperatura de 23 ± 3°C;

- conținut de violaceină: 0,30 ± 0,05%, raportat la substanța uscată;

- pentru matricile obținute din amestecuri cu raportul masic 1,5:1 între (atelo)colagen și polizaharid:

- conținut total de colagen (prin conținutul de hidroxiprolină):

± 3,3%;

- conținut de colagen nativ (prin metoda cu Sirius Red F3B):

± 1,2%, respectiv 87,5 ± 4,5% din conținutul total de colagen;

- conținutul de materii grase (prin metoda Weibull-Stoldt): sub 0,6%, pentru matricile în care violaceina este înglobată în β-ciclodextrină.

- asigură potențiale de eliberare a violaceinei, la 37°C, (în procente masice) de:

- peste 70% în medii umede, în cazul colapsării/solubilizării matricilor încărcate cu compuși de incluziune, după 30 min de la contactare (determinare prin îmbibare cu soluție Ringer, static și centrifugare);

- peste 55% în contact cu medii parțial hidrofobe, în cazul matricilor încărcate cu micro-emulsii, după 90 min de la contactare (determinare prin îmbibare cu 1-butanol (HLB 7), static și centrifugare);

- permite formularea compoziției, funcție de natura aplicațiilor vizate, din sfera biomedicală și a dermato-cosmeticii;

- asigură menținerea caracteristicilor produsului final pentru durate de stocare de 18 luni, la temperatura ambiantă (10-^ 28°C), în ambalaje închise ermetic și supuse sterilizării cu radiație gamma.

în continuare se prezintă 8 exemple de realizare în care se descriu etapele și operațiile de obținere și post-procesare a matricilor colagen-polizaharidice microporoase cu conținut de violaceină, conform invenției. Descrierile de mai jos au titlul exemplificativ din următoarele puncte de vedere:

- tipul, originea și forma de prezentare a (atelo)colagenului utilizat drept precursor;

- tipul, originea și forma de prezentare a polizaharidelor utilizate drept precursor;

- tipul, compoziția și modul de preparare a formelor de înglobare a violaceinei;

- natura și concentrațiile compușilor (bio)chimici mic-moleculari, oligomeri sau macromoleculari utilizați în oricare dintre operațiile procesului;

- rapoartele de amestecare și diluare utilizate în oricare dintre operațiile de obținere, formulare și post-procesare a matricilor (atelo)colagen-polizaharidice;

- parametrii fizico-chimici de lucru și compozițiile chimice implicate în oricare dintre etapele procesului;

- natura, numărul și succesiunea operațiilor unitare din cadrul etapelor generice ale procesului;

- echipamentele, instalațiile și dispozitivele utilizate pentru obținerea, formularea și post-procesarea matricilor, în oricare dintre etapele procesului;

- natura și concentrațiile speciilor chimice adjuvante și a materialelor implicate în formularea compozițiilor precursoare, precum și în condiționarea matricilor;

- natura și concentrațiile speciilor chimice de interes cosmetic utilizate în formularea compozițiilor și pentru condiționarea matricilor post-procesate;

- tipul, natura și dimensiunile sistemelor fizice destinate fixării matricilor postprocesate pe suprafața tegumentelor;

RO 133952 Β1

- modul de asociere a matricilor obținute conform invenției, cu sistemele fizice 1 destinate fixării lor pe suprafața tegumentelor;

- denumirile atribuite etapelor, operațiilor și proceselor descrise în invenție. 3

Acolo unde nu se specifică în mod expres, operațiile se efectuează la temperatura ambientală, care nu va depăși însă plaja 15-^ 28°C. Apa utilizată pentru prepararea soluțiilor 5 și a compozițiilor apoase de tratare este dublu distilată sau deionizată până la conductivități de cel mult 1 pS (ISO 3696:1987), sterilă și liberă de pirogeni (conform Farmacopeei 7 Europene, sortimentul „Apă pentru preparate injectabile).Toate soluțiile și toți reactivii lichizi se supun sterilizării prin filtrare, cu excepția celor care se pot steriliza în autoclavă și a celor 9 potențial ne-infectabili.

Exemplul 1 - Prepararea soluțiilor concentrate ale precursorilor 11

Soluțiile celor doi precursori biomacromoleculari se prepară și se aduc la vâscozități cât mai apropiate și la concentrații (exprimate în procente substanță uscată) corelate cu 13 diferența între masele lor moleculare (masa moleculară a atelocolagenului cavsi-nativ, M_w, este de 273 ± 0,8 kDa). Drept (exo)polizaharide, se preferă utilizarea gellanului cu grad de 15 acilare ridicat (M_w 5000 + 7000 kDa), pullulanului (M_w 600 + 800 kDa), sau dextranului de biosinteză (Leuconostoc mesenteroides, M_w 1500 + 1800 kDa), dar se pot utilza și alginatul 17 (M_w 120 - 150 kDa), xantanul (M_w 6000 - 8000 kDa), sau levanul (M_w 2000 - 4500 kDa). Soluțiile de (exo)polizaharide se formulează în mod individualizat, cel puțin prin adăugarea 19 unui agent de ampastare (de regulă glicerina, care joacă și rolurile de mediator de amestecare cu (atelo)colagenul și de regulator al rigidității matricei finale) și a unui agent 21 fluidifiant (cu acțiune chelatantă, împotriva gelifierii mediate de ionii de Ca²⁺ și Mg²⁺).

Exemplul 1.1. - Concentrarea soluției de atelocolagen hipoimunogen 23

Drept precursor scleroproteic se utilizează soluțiile coloidale de atelocolagen biologicactiv, de înaltă puritate, de tip I, obținute conform brevetului R0126403/2015, exemplul 3.2, 25 condiționate în vederea utilizării în ingineria tisulară. Din formula agenților de condiționare se exceptează modulatorii metabolismului celular. După verificarea conținutului total de 27 colagen și a conținutului de colagen nativ, soluția se termostatează la 5 ± 1°C, iar apoi se concentrează până la 6 + 9 g/L colagen total, prin ultrafiltrare prin membrane ceramice cu 29 limita de trecere de 50 kDa (tip SterliTech, cu strat activ de ZrO₂), sub o presiune de 1,8-^2,6 bari. La final, soluția concentrată se maturează static, timp de 12 +18 h, la 5 ± 1 °C, 31 sub vid moderat (10-^25 mbar), în incintă umidificată, sterilă.

Exemplul 1.2. - Prepararea soluției coloidale concentrate de gellan 33

Soluția coloidală de gellan cu concentrația de 4 + 7 g/L se prepară ampastând mai întâi pulberea de polizaharid cu o soluție de 0,8 + 2,4% glicerina anhidră, la rece. După 35 completa umectare, peste pastă se adaugă o soluție fierbinte (85 + 90°C) de 0,05 + 0,2% citrat trisodic în tampon citrat 0,1 M, cupH 5,0, sub agitare eficientă. Gelul rezultat se aduce 37 și se menține la 90 + 95°C, timp de 20 + 60 min, sub agitare eficientă, în vas închis, pentru completa lichefiere. La final, se adaugă apă distilată fierbinte, în volumul necesar pentru a 39 corecta concentrația soluției de gelan la valoarea impusă prin receptură. Soluția se răcește progresiv, sub continuă agitare, până la 25 + 30°C, valoare la care se poate utiliza pentru 41 amestecarea cu soluția de atelocolagen.

Exemplul 2 - Prepararea formei de înglobare a violaceinei 43

Se pornește de la soluții de violaceină în solvenți organici biocompatibili (hidrofili:

alcool etilic, alcool izopropilic, alcool butilic, tetrahidrofuran, dimetilsulfoxid etc., sau hidrofobi: 45 1-octanol, cloroform, acetat de etil), sau în fază organică hidrofilă (PEG 400 sau 600, ori glicerină), funcție de tehnica de înglobare. Pentru aplicații ale matricilor finale în medii 47

RO 133952 Β1 umede/apoase, înglobarea se realizează în β-ciclodextrină, sau în derivați ai acesteia modificați chimic. Pentru matricile utilizabile în condiții preponderent uscate, înglobarea se realizează în (micro)emulsii.

Exemplul 2.1 - înglobarea violaceinei în compuși de incluziune

Solubilitatea în apă a β-ciclodextrinei este relativ mică, de circa 1,8 % m/v, la 25°C. Pentru a-i spori solubilitatea, în soluțiile apoase se adaugă adjuvanți (uree, săruri metalice etc.) sau cosolvenți (alcoolii metilic, etilic, sau izopropilic, dimetil-sulfoxid, tetrahidrofuran, acetonitril etc.). Atunci când randamentele de înglobare sunt critice, indiferent de natura fazei în care se află violaceina, se preferă utilizarea β-ciclodextrinei funcționalizată (de exemplu sulfo-butil-eter derivatul acesteia, Captisol®; CyDex Inc.).

A. înglobarea violaceinei în β-ciclodextrină nemodificată chimic β-ciclodextrina se dizolvă în soluțiile apoase ale cosolvenților, la 40°C, astfel: 2 g în 100 mL soluție de 30% alcool etilic, sau 12 g în 100 mL soluție 25% 2-propanol, sau 12 g in 100 mL soluție 60% DMSO. Amestecul ternar β-ciclodextrină:apă:cosolvent se adaugă, sub agitare eficientă, peste soluția de violaceină în fază organică (PEG 400 sau glicerină) anterior încălzită la 40 70°C, astfel încât să se asigure o concentrație molară a β-ciclodextrinei egală sau dublă în raport cu concentrația molară a violaceinei în faza organică. Lichidul rezultat se menține sub agitare, la reflux, timp de 72 + 90 h, la temperatura de 40 + 70°C, funcție de natura cosolventului organic. La final, lichidul se răcește brusc la 4 + 10°C și se maturează static, 12 h, la 2 + 5°C. în continuare, lichidul încă rece se centrifughează la 1200 3600 g, timp de 10 + 30 min, reținând supernatantul. Acesta din urmă se supune eliminării cosolventului și concentrării prin evaporare sub vid, în echipament rotativ, sub o presiune de 72 mbar, la 40 - 42 °C, până la reducerea semnificativă a conținutului de apă.

B. înglobarea violaceinei în β-ciclodextrină funcționalizată chimic

O soluție de 3 + 8% Captisol® în apă distilată se încălzește la 30 + 50°C, iar apoi, sub agitare eficientă, în ea se adaugă soluția de violaceină în fază organică (PEG 400 sau glicerină) anterior încălzită la aceeași temperatură, astfel încât să se asigure o concentrație molară a Captisol-ului egală sau dublă în raport cu concentrația molară a violaceinei în faza organică. Amestecul se menține sub agitare, în vas închis, timp de 12 + 36 h, la temperatura de 25 30°C. La final, lichidul se răcește brusc la 4 + 10°C și se maturează static, 12 h, la 2 5°C. în continuare, lichidul încă rece se centrifughează la 1200 + 3600 g, timp de 10-^30 min, reținând supernatantul. Acesta din urmă se supune concentrării prin evaporare sub vid, în echipament rotativ, sub o presiune de 72 mbar, la 40 + 42°C, până la eliminarea sau reducerea semnificativă a conținutului de apă.

Exemplul 2.2 - înglobarea violaceinei în (micro)emulsii tip ulei în apă în vederea înglobării violaceinei (logP = 1,9) în emulsii apoase se pornește de la soluția acesteia într-un solvent organic volatil, biocompatibil sau cel puțin biotolerabil, de preferință 1-octanol (logP = 2,339; HLB = 5,1), 1-butanol (logP = 0,779; HLB = 7,0), 2propanol (LogP = 0,389; HLB = 7,48), etanol (LogP = -0,31; HLB = 7,9). Emulsionarea se realizează cu un amestec de emulgatori al cărui HLB are o valoare cel puțin egală cu valoarea HLB a solventului în care a fost adusă violaceină. Deoarece HLB este o mărime liniar aditivă, există o largă plajă de amestecuri de emulgatori capabile să emulsioneze stabil soluțiile de violaceină în solvenți organici. Concentrația solventului organic în interiorul picăturilor de emulsie (C_o) în raport cu cea în faza dispersantă a emulsiei (C_w), respectiv apetența pentru emulsionare, se calculează pornind de la relația HLB - 7 = 0,36 · ln(C_w/C₀). Aplicând-o, rezultă că stabilitatea emulsiilor scade în seria 1-octanol > 1-butanol; în cazul 2propanolului se pot obține doar emulsii grosiere, pentru a căror stabilizare este nevoie de amestecuri de emulgatori cu HLB mult mai mare decât 7,48 (de preferință dublu), iar în cazul

RO 133952 Β1 alcoolului etilic, acesta se va solubiliza imediat în faza apoasă, transferând în întregime 1 violaceinei apetența de emulsionare. De aceea, atunci când se pornește de la soluții de violaceină în alcool etilic, emulsia non-apoasă se formează adăugând surfactanții direct în 3 aceasta, urmând ca faza apoasă să fie furnizată de soluția coloidală concentrată de polizaharid, care va prelua practic în întregime, dar lent, alcoolul din picăturile de emulsie non- 5 apoasă.

Prezentul exemplu descrie emulsionarea unei soluții de violaceină în 1-butanol, 7 deoarece acest solvent se plasează la limita apetenței de a forma micro-emulsii. S-a ales 1butanolul și din considerente aplicative, acesta fiind non-comedogenic. 9 într-o soluție de 0,6 + 1,8 g/L glucoză în apă distilată încălzită la 40 + 65°C, se adaugă 0,3 + 0,5 g/L amestec de emulgatori cu HLB 9,6 (spre exemplu cantități egale de 11 Spân 80 și Tween 80), sub agitare lentă, evitând spumarea. în paralel, într-o soluție de 0,6 0,8 g/L violaceină în 1-butanol, încălzită la 50 + 70°C, se adaugă 0,3 + 0,8 g/L amestec 13 de emulgatori cu HLB 5,9 (spre exemplu 85 părți Spân 80 și 15 părți Tween 80), sub agitare lentă. Ambele soluții se maturează apoi, la temperatura de preparare, timp de 30-^180 min. 15 Peste soluția de violaceină în 1-butanol astfel aditivată se adaugă, în fir subțire, sub agitare eficientă, un volum egal de soluție apoasă cu amestec de emulgatori. Vasul de amestecare 17 se închide apoi ermetic, iar lichidul se supune agitării energice, la 360 + 1000 rotații/minut, timp de 10-^40 min, funcție de geometria vasului. La final, lichidul se răcește la temperatura 19 ambiantă, iar apoi se supune vortexării la 8000 + 12000 rotații/minut, timp de 10 + 30 min. După spargerea spumei formate, lichidul se preia într-un evaporator rotativ și se supune con- 21 centrării, la presiunea de 72 mbar, și temperatura de 40 + 45°C. în etapa de vortexare, emulsia se poate formula suplimentar, prin adăugare de odorant (spre exemplu 0,01 + 0,05 g/L 23 cinamat de butii) și de antioxidant (spre exemplu 0,03 + 0,09 g/L vitamina A propionat), iar în etapa de concentrare i se poate adăuga un stabilizator (spre exemplu 0,1 + 0,3 g/L oleat 25 de trietanolamină (logP = 4,374, HLB = 12), dizolvat în etanol, sau 0,08 + 0,12 g/L Tween 60 (logP = 2,48, HLB = 14,9)). Emulsia finală se poate stoca, la temperatura ambiantă, cel 27 mult 12 h. Pentru durate mai lungi de stocare, vortexarea se repetă periodic.

Exemplul 3 - Prepararea și formularea compozițiilor precursoare 29

Cele două soluții coloidale ale precursorilor se amestecă în proporții dependente de masa moleculară a polizaharidului utilizat. în cazul gellanului, spre exemplu, raportul de 31 amestecare (calculat considerând conținutul de substanță uscată al precursorilor) este de 3:1 în favoarea atelocolagenului. Atunci când vâscozitatea uneia dintre soluțiile precursorilor 33 este excesivă, aceasta se diluează, iar raportul de amestecare se recalculează, astfel încât amestecarea să devină posibilă. 35

Soluția coloidală de polizaharid se introduce într-un malaxor orbital prevăzut cu manta pentru termostatare și se aduce la 20°C. Sub malaxare lentă dar eficientă, peste ea 37 se adaugă, în fir subțire soluția sau emulsia care conține violaceină. în continuare se adaugă soluția de (atelo)colagen, în trei rate egale, în fir subțire, sub malaxare, intercalând timpi de 39 maturare statică de 10 + 30 min, pentru a permite separarea și scurgerea soluției apoase rezultate ca urmare a sinerezei. La final, masa fluidă rezultată se supune maturării statice, 41 la 6 10°C, timp de 12 h, scurgând eventuala soluție rezultată prin sinereză. Masa fluidă se supune apoi vortexării (sau unei agitări energice), în trei etape intercalate cu timpi de odihnă 43 de 10 30 min pentru fiecare 3-^5 min de vortexare efectuată la 8000 +12000 rotații/minut. Pe durata acestor operații se verifică temperatura masei fluide și se peîntâmpină depășirea 45 valorii de 40°C. în cursul ultimei epoci de vortexare, care nu mai este urmată de scurgerea soluției separate prin sinereză, în compoziția fluidă se pot doza adjuvanți hidrofili, cum ar fi 47 0,03 0,12 g/kg pantotenat de calciu (vitamina B5, ca promotor de (re-)epitelializare și

RO 133952 Β1 antioxidant), și/sau 0,03 + 0,06 g/kg acid nicotinic (vitamina PP, cu rol de vasodilatator local). La final, masa fluidă se supune dezaerării și maturării statice, în incintă sterilă umidificată, la temperatura ambiantă, timp de 12 h, sub vid moderat (10 + 25 mbar). Eventualul lichid separat prin sinereză nu se îndepărtează, ci se reînglobează prin malaxare.

Exemplul 4 - Generarea matricilor solide poroase, prin liofilizare

Masa fluidă precursoare se toarnă în casete din oțel inoxidabil (aliaj 316L) cu înălțimea de 15 mm și arii adaptate aplicațiilor vizate, anterior curățate, sanitarizate și clătite cu apă deionizată sterilă. înălțimea de turnare nu va depăși 12 mm. în momentul turnării casetele vor fi umede. în continuare, compoziția repartizată în casete se supune subrăcirii, la temperaturi care evită cristalizarea fazei apoase, în plaja +2 + -8°C, timp de 3 + 8 h, într-un congelator separat. în paralel, incinta liofilizatorului se aduce la o temperatură cu 5 + 15°C sub cea la care s-a răcit compoziția fluidă. După încărcarea rapidă a casetelor în liofilizator, incinta acestuia se aduce la 30 + 50 mbar și se inițiază etapa de congelare, coborând temperatura până la -40 + -60°C, cu o pantă de 1 + 3°C/min. După atingerea temperaturii prescrise, congelarea se continuă pentru încă 6 MO h, timp în care presiunea se scade progresiv, în trei etape, până la 5 MO mbar. în continuare, se inițiază etapa de sublimare controlată a cristalelor de apă înghețată, coborând presiunea în liofilizator până la 0,10 + 0,15 mbar și menținând-o, în condiții izoterme, timp de 2 + 6 h. Apoi, în condiții izobare, temperatura în interiorul solidului poros în formare se crește cu o pantă de 1°C/h, până la temperatura ambiantă. Etapa uscării secundare a matricei poroase se conduce izobar, ridicând temperatura în incinta liofilizatorului până la +40°C, cu o pantă de 1,5 + 3,0°C/oră. După încheierea ultimei etape a liofilizării, incinta utilajului se inundă treptat cu azot gazos uscat, în condiții izoterme, până la o ușoară suprapresiune față de presiunea atmosferică.

Exemplul 5 - Condiționarea fizico-chimică a matricilor solide poroase

Casetele cu matricea solidă poroasă se scot din liofilizator și se supun maturării într-o cameră climatizată, menținându-se timp de 12 h, la temperatura de 25 ± 1°C și umiditatea relativă a aerului de 55 ± 3%, sub un flux de aer recirculat de 5 + 8 m³/h pentru fiecare metru cub al volumului incintei, funcție de gradul de încărcare și de modul de amplasare al casetelor pe rafturi. La finalul maturării, înainte de preluarea casetelor din incintă, aceasta se ventilează timp de 20 + 40 min, cu un flux de aer steril de 15 -MO m³/h pentru fiecare metru cub al volumului incintei, în vederea eliminării volatilelor, în cazul matricilor în care violaceina a fost înglobată altfel decât sub forma emulsiilor, precum și al celor în care nu s-au adăugat adjuvanți hidrofili, solidul poros condiționat se poate supune reticulării dehidrotermice. în acest scop, casetele cu matricea solidă poroasă se introduc într-un uscător sub vid, în care presiunea este adusă la 30 + 50 mbar, inițial la temperatura ambiantă. Apoi, în condiții izobare, temperatura se ridică în trei etape: mai întâi la 40 + 45°C, pentru 3 h, apoi la 75 90°C, pentru alte 3 h, iar în final la 110 + 150°C timp de 18 h, funcție de natura și stabilitatea termică a compușilor de înglobare a violaceinei. în continuare, temperatura în uscător se coboară la 60 + 80°C, cu o pantă de 8 + 10°C/h, prin trecerea la vid moderat (10-^25 mbar) menținut dinamic prin aflux de aer steril. La final, incinta uscătorului se aduce lent la presiunea atmosferică și la temperatura ambiantă. Casetele se preiau din uscător după 2 5 h de la echilibrarea parametrilor în incintă, în raport cu cele ambientale.

Manevrele se efectuează sub baldachin cu circulație verticală a aerului steril.

Exemplul 6 - Post-procesarea fizico-mecanică a matricilor solide poroase

Funcție de aplicația vizată, matricile solide poroase se compactează diferențiat, prin aplatizare. Când se aplică matricilor individuale, operația se efectuează prin presare la rece între două folii din Mylar® tip A (polietilen tereftalat extrudat) transparent, cu grosimea de 500 microni. Se recurge la o presă hidraulică dotată cu plăci din oțel inoxidabil, a cărei

RO 133952 Β1 închidere se limitează la 0,8 + 2,2 mm, pentru un timp de menținere de 5 + 15 secunde. 1 Aplatizarea se poate aplica și unei stive alcătuită din matricea produsă conform descrierilor de mai sus și mai multe substraturi poroase, identice sau diferite, din atelocolagen, 3 polizaharide, sau polimeri de (semi)sinteză. Stiva se include între folii din Mylar® tip A, iar închiderea presei și durata de menținere se reglează corespunzător grosimii stivei și 5 caracteristicilor materialelor care o alcătuiesc. Una sau ambele folii din Mylar® se pot înlocui cu un alt material (poliuretan, hârtie parafinată, hârtie plasticată, polimeri metalizați, material 7 polimeric sau textil cu peliculă adezivă etc). După aplatizare, structura compactată se menține flancată între folii, timp de 60 + 90 min, pentru stabilizarea grosimii finale. în 9 continuare, structura compactată, încă flancată de folii, se decupează după diverse contururi, prin ștanțare în presă hidraulică, sau sub un valț profilat. Decuparea se poate face pe 11 întreaga grosime a ansamblului matrice - folii, sau menținând una dintre folii intactă, ori doar perforând-o. 13

Exemplul 7 - Asocierea matricilor compactate cu sisteme fizice cu rol de atașare la suprafața tegumentelor 15

Opțional, funcție de aplicația vizată, matricile sau stivele post-procesate fizicomecanic se detașează de cel puțin una dintre foliile de flancare din Mylar®, se pulverizează 17 superficial cu o compoziție de îmbibare (ce conține unul sau mai mulți dintre următorii adjuvanți: 1-butanol, soluție 8 +12% lactat de butii în 2-propanol, 0,2-^0,6 mg/mLpantotenat 19 de calciu, 0,1 + 0,5 mg/mL acid nicotinic etc.), se zvântă în flux de aer steril și se montează pe suprafața unor materiale polimerice sau textile acoperite cu peliculă adezivă. După 21 aplicarea unui strat de protecție definitiv sau temporar, structura rezultată se decupează după contururi adecvate. Toate operațiile se efectuează sub baldachin cu circulație verticală 23 a aerului steril.

Exemplul 8 - Ambalarea și sterilizarea produselor finale 25

Piesele obținute conform descrierii din exemplul 7 se sortează dimensional și calitativ, se selectează numeric și se poziționează, iar apoi se includ în pachete sau în cutii etanșe 27 și se ambalează corespunzător aplicației vizate. Pachetele ambalate se supun sterilizării cu radiație gamma, la doze administrate/absorbite minim necesare asigurării sterilității, dar și 29 corelat cu degradabilitatea componentelor matricilor (inclusiv a adjuvanților). 31

Claims (9)

1. RO 133952 Β1

   1 Revendicare
2. 3 Procedeu pentru obținerea matricilor colagen-polizaharide microporoase cu conținut de violaceină, caracterizat prin aceea că, în următoarele etape:
3. 5 a) prepararea soluțiilor concentrate ale precursorilor biomacromoleculari;

   b) prepararea formei de înglobare a violaceinei;
4. 7 c) prepararea și formularea compozițiilor fluide precursoare ale matricilor;

   d) generarea matricilor microporoase solide (atelo)colagen-polizaharidice cu conținut
5. 9 de violaceină, prin liofilizare având următoarele caracteristici fizico-chimice: densitate aparentă 0,06 ± 0,02 g/cm³, densitate picnometrică 0,32 ± 0,05 g/cm³ și porozitate 84 ± 2%
6. 11 și următoarele caracteristici compoziționale: substanță uscată 85 ± 2%, conținut de violaceină 0,30 ± 0,05% raportat la substanța uscată, conținut total de colagen nativ 87,5 ± 4,5%
7. 13 din conținutul total de colagen;

   e) condiționarea fizico-chimică a matricilor microporoase solide;
8. 15 f) post-procesarea fizico-chimică a matricilor microporoase solide;

   g) asocierea matricilor post-procesate cu sisteme fizice cu rol de atașare la suprafața
9. 17 tegumentelor;

   h) ambalarea în pachete și sterilizarea pachetelor astfel ambalate.

   Editare și tehnoredactare computerizată - OSIM Tipărit la Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci sub comanda nr. 157/2025