RO132850B1 - Sisteme de cedare multipar- ticulate topice pe bază de biopolimeri cu eliberare controlată a unui medicament antiinflamator, şi procedeu de obţinere a acestora - Google Patents

Description

Invenția se referă la sisteme topice multiparticulate de cedare controlată a medicamentului antiinflamator cu suport biopolimeric, cu utilizări în medicină, în special în leziuni cutanate sau arsuri.

Problema tratamentului arsurilor este de o importanță majoră, deoarece acestea sunt caracterizate printr-o producție imediată și crescută de mediatori specifici proinflamatori, ceea ce determină o întârziere în regenerarea și vindecarea țesutului lezat, precum și apariția unei infecții secundare și afectarea concomitentă, în cascadă și a altor organe (M. Frieri, K. Kumar, An. Boutin, Wounds, burns, trauma, and injury, Wound Medicine, 2016, 13, 12-17, J. A. Farina Jr., M. J. Rosique, R.G. Rosique, Curbing inflammation in burn patients, International Journal of Inflammation, 2013, article ID 715645, 9 pages, K.C. Chang, H. Ma, W.C. Liao et al, The optimal time for early burn wound excision to reduce pro-inflammatory cytokine production in a murine burn injury model, Burns, 2010, 36(7), 1059-1066, A.D. Widgerow, S. Kalaria, Pain mediators and wound healing - establishing the connection, Burns, 2012, 38(7), 951-959). De aceea o primă etapă în îmbunătățirea procesului de vindecare a unei arsuri constă în tratamentul zonei arse inflamate.

Arsurile cutanate reprezintă leziuni acute caracterizate printr-o producție imediată și crescută de mediatori specifici proinflamatori, ceea ce determină o întârziere în regenerarea și vindecarea țesutului lezat.

Antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS) sunt o clasă de medicamente care ușurează răspunsul inflamator post-leziune, reducând cu succes durerea persistentă și temporară, precum și inflamația lângă suprafața lezată, după apariția arsurii (G.D. Krischak, P. Augat, L. Claes et al., The effects of non-steroidal anti-inflammatory drug application on incisional wound healing in rats, Jornal of Wound Care, 2007, 16(2), 76-78, W.H. Su, M.H. Cheng, W.L. Lee. et al., Nonsteroidai anti-inflammatory drugs for wounds: pain relief or excessive scar formation?, Mediators of Inflammation, 2010, article ID 413238). Sistemele de cedare topice cu medicamente antiinflamatoarecu acțiune directă la nivelul leziunii sunt în prezent unul dintre cele mai atractive și în continuă dezvoltare subiecte de interes (M.V Ghica, Elemente fizico-chimice și biofarmaceutice ale sistemelor semisolide cu acțiune topică. Aplicații la hidrogeluri cu indometacin, Editura Printech, București, 2010, M.G. Albu, M. Ferdeș, D.A. Kaya et al, Collagen wound dressings with anti-inflammatory activity, Mol. Cryst. Liq. Cryst., 2012, 555(1), 271-279, Y.C. Chang, J.D. Wang, R.A. Hahn et al., Therapeutic potențial of a non-steroidal bifunctional anti-inflammatory and anti-cholinergic agent against skin injury induced by sulfur mustard, Toxicol. Appl. Pharmacol., 2014, 280(2), 236-244), oferind câteva avantaje comparativ cu calea sistemică de administrare, în principal evitarea toxicității sistemice (sângerări gastro-duodenale) și a efectelor secundare asociate la nivel hepatic și renal, precum și o complianță crescută a pacientului (M. El-Badry, G. Feti, Preparation, charactarization and anti-inflammatory activity of celecoxib chitosan gel formulations, J. Drug Deliv, Sci. Tech, 2011, 21(2), 201-206, C.A. Heyneman, C. Lawless-Liday, G.C. Wall, Oral versus topical NSAIDs in rheumatic diseases: a comparison, Drugs, 2000, 60, 555-574).

În ultimii ani strategia utilizării căii topice de administrare a AINS-urilor în arsuri este bazată pe utilizarea biopolimerilor biodegradabili și nebiodegradabili ca suporturi potențiale pentru sisteme controlate de cedare a medicamentelor (numite și pansamente medicamentoase) (S. Huang, X. Fu, Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration, J. Control. Release,20\0, 142(2), 149-159). O limitare a celor mai multe sisteme de eliberare a medicamentului pentru arsuri constă în aceea că ele 1 sunt pe bază de polimeri nebiodegradabili și necesită înlocuiri frecvente care determină o suferință suplimentară pacientului și o vătămare a noului țesut epitelial format, crescând și 3 riscul unei contaminări secundare (J.J. Elsner, M. Zilberman, Novei antibiotic-eluting wound dressings: An in vitro study and engineering aspects in the dressing's design, 5 J. Tissue Viabil., 2010, 19(2), 54-66). De aceea, polimerii biodegradabili sunt considerați a fi vehicule ideale pentru cedarea medicamentelor. Dintre acești biopolimeri, o atenție 7 considerabilă i se acordă colagenului, datorită proprietăților de biomaterial care-l recomandă în utilizarea ca sistem de transport a medicamentelor, fiind utilizat sub formă de hidrogeluri, 9 membrane, fibre, matrici și materiale compozite, obținute din colagen nedenaturat (F. Puoci, C. Piangiolino, F. Givigliano et al., Ciprofloxacin-collagen conjugate in the wound 11 healing treatment, J. Funct. Biomater., 2012, 3(2), 361-371, M. G. Albu, I. Titorencu, M.

V. Ghica, Collagen-based drug delivery systems for tissue engineering In: 13 Biomaterials applications for nanomedicine, R. Pignatello (Ed.), InTech Open Acces Publisher, Rijeka, Croația, 2011,333-358). Unele dintre cele mai frecvent întâlnite vehicule 15 colagenice de cedare a medicamentelor sunt formele poroase (matrici spongioase) obținute prin liofilizare (uscare prin înghețare urmată de sublimarea apei în vid) a soluțiilor/gelurilor 17 de colagen (M. G. Albu, Collagen gels and matrices for biomedical applications, Lambert Academic Publishing, Saarbrucken, 2011). Acestea sunt foarte utile în tratarea 19 arsurilor cu diferite grade de afectare cutanată deoarece aderă bine la rănile umede, absorb cantități mari de exudat al țesutului, păstrează un mediu umed și susțin formarea noului țesut 21 granular și epitelial la nivelul leziunii (M. G. Albu, Collagen gels and matrices for biomedical applications, Lambert Academic Publishing, Saarbrucken, 2011, M. S. 23 Kumar, S. Kirubanandan, R. Sripriya et al., Triphala incorporated collagen sponge - a smart biomaterial for infected dermal wound healing, J. Surg. Res., 2010, 158(1), 162- 25 170). Astfel, colagenul însuși are un potențial semnificativ în vindecarea rănii cutanate datorată unei arsuri, precum și în regenerarea tisulară, și mai mult decât atât în prezența 27 unui medicament antiinflamator poate preveni apariția ulterioară a altor leziuni tisulare cauzate de procesul inflamator (G.D. Krischak, P. Augat, L. Claes et al., The effects of 29 non-steroidal anti-inflammatory drug application on incisional wound healing in rats, Jornal of Wound Care, 2007, 16(2), 76-78, Y.C. Chang, J.D. Wang, R.A. Hahn et al., 31 Therapeutic potențial of a non-steroidal bifunctional anti-inflammatory and anticholinergic agent against skin injury induced by sulfur mustard, Toxicol. Appl. 33 Pharmacol., 2014, 280(2), 236-244, M.V. Ghica, M.G. Albu Kaya, C.E. Dinu-Pîrvu, D. Lupuleasa, D.I. Udeanu, Development, optimization and in vitro/in vivo 35 characterization of collagen-dextran spongious wound dressings loaded with flufenamic acid, Molecules, 2017, 22(9), El552). Proprietățile mecanice și rezistența la 37 degradarea enzimatică in vivo a suporturilor colagenice poate fi îmbunătățită prin reacții chimice, utilizând diferiți agenți de reticulare (L. Zhang, K. Li, W. Xiao et al., Preparation 39 of collagen-chondroitin sulfate-hyaluronic acid hybrid hydrogel scaffolds and cell compatibility in vitro, Carbohyd. Polym., 2011, 84, 118-125). 41

Pentru a reduce inflamația de la nivelul unei leziuni afectate de arsură, precum și pentru a evita influența unui răspuns inflamator prelungit, este necesară proiectarea unor noi 43 sisteme de cedare controlată a medicamentului care să asigure atât o cedare rapidă a acestuia cât și o eliberare susținută pe parcursul mai multor ore (M. Frieri, K. Kumar, An. 45 Boutin, Wounds, burns, trauma, and injury, Wound Medicine, 2016, 13, 12-17, J. A. Farina Jr., M. J. Rosique, R.G. Rosique, Curbing inflammation in burn patients, 47

International Journal of Inflammation, 2013, article ID 715645, 9 pages, M.G. Albu, M. Ferdeș, D.A. Kaya et al, Collagen wound dressings with anti-inflammatory activity, Mol. Cryst. Liq. Cryst., 2012, 555(1), 271-279, A. A. Salibian, A.T. Del Rosario, L.A.M.Severo, Current concepts on burn wound conversion - A review of recent advances in understanding the secondary progressions of burns, Burns, 2016).

Importanța modelării și controlării cineticii de cedare in vitro a medicamentelor din sisteme cu aplicare topică este evidențiată de studiile recente în acest domeniu (M.V Ghica, Elemente fizico-chimice și biofarmaceutice ale sistemelor semisolide cu acțiune topică. Aplicații la hidrogeluri cu indometacin, Editura Printech, București, 2010, M.V. Ghica, M.G. Albu, L. Popa et al., Response surface methodology and Taguchi approach to assess the combined effect of formulation factors on minocycline delivery from collagen sponges, Pharmazie, 2013, 68(5), 340-348). Astfel, în cazul formelor spongioase cu medicamente antiinflamatoare nesteroidiene, se înregistrează profile de cedare bifazică tipică, cu un pronunțat efect de cedare rapidă a medicamentului, urmată de o cedare lentă, graduală a acestuia care să asigure o concentrație adecvată la locul de administrare (M.G. Albu, M. Ferdeș, D.A. Kaya et al, Collagen wound dressings with anti-inflammatory activity, Mol. Cryst. Liq. Cryst., 2012, 555(1), 271-279, M.V. Ghica, M.G. Albu Kaya, C.E. Dinu-Pîrvu, D. Lupuleasa, D.I. Udeanu, Development, optimization and in vitro/in vivo characterization of collagen-dextran spongious wound dressings loaded with flufenamic acid, Molecules, 2017, 22(9), El552). Deși astfel de profile cinetice sunt de urmărit în cazul vindecării unor leziuni inflamate de intensitate redusă, atunci când se dorește atât o cedare imediată cât și pe termen lung a medicamentului antiinflamator în cazul unor arsuri de severitate medie, o limitare a acestor formulări constă în aceea că efectul de cedare rapidă este prea pronunțat în primele ore, existând riscul ca medicamentul să fie cedat într-o cantitate prea mare înainte ca procesul inflamator să fie controlat (M.G. Albu, M. Ferdeș, D.A. Kaya et al, Collagen wound dressings with anti-inflammatory activity, Mol. Cryst. Liq. Cryst., 2012, 555(1), 271-279, M.V. Ghica, M.G. Albu Kaya, C.E. Dinu-Pîrvu, D. Lupuleasa, D.I. Udeanu, Development, optimization and in vitro/in vivo characterization of collagen-dextran spongious wound dressings loaded with flufenamic acid, Molecules, 2017, 22(9), El552, H. Ferreira, T. Matama, R. Silva et al, Functionalization of gauzes with liposomes entrapping an anti-inflammatory drug: A strategy to improve wound healing, React. Funct. Polym., 2010, 73, 1328-1334, P. Panday, N. Shukla, D. Sisodiya et al., Design and characterization of microsponge loaded controlled release epicutaneous gel of lornoxicam, Applied Medical Research, 2015, 1, 16-21).

În această situație se impune dezvoltarea unor noi sisteme de cedare a medicamentului care să asigure o cedare adecvată a unui medicament antiinflamator din suporturi spongioase colagenice utilizând diferite tehnici ce permit atât o degradare treptată a suportului colagenic cât și o cedare lentă a medicamentului, pe parcursul mai multor zile. În acest sens, sunt propuse sistemele de cedare multiparticulate topice pe bază de biopolimen cu eliberare controlată a unui medicament antiinflamator. Sistemele multiparticulate sunt formulări obținute prin diferite tehnici, medicamentul fiind încapsulat în diverși polimeri, și a căror dimensiune variază de la nm până la mm. Polimerii utilizați pentru prepararea sistemelor multiparticulate sunt de origine naturală, semisintetică sau de sinteză. Prin această tehnică de încapsulare a medicamentului se poate modela și controla viteza de eliberare a acestuia, asigurându-se în acest fel o creștere a eficacității terapeutice și clinice, îmbunătățirea confortului pacientului prin reducerea numărului și frecvenței aplicării, și consecutiv o scădere a costurilor implicate în acordarea asistenței de specialitate.

Până în prezent, au fost dezvoltate diverse sisteme multiparticulate, în special 1 produse cu administrare orală: sisteme multiparticulate pentru eliberarea hemoglobinei (brevet US 2017 224626 (A1), morfinei (brevet ZA 9809463 (B)), milnacipran (brevet 3 WO 2004 067039 (A1)), sare de litiu (US 2006 039997 (A1)), ribavirin (brevet US 2007 173464 (A1)); cu administrare gastrica (brevet NZ 516959 (A)), AU 2015238807 (A1), NZ 5

581267 (A), US 6290989 (B1)), dar nu s-au înregistrat compoziții multiparticulate de uz topic.

Sistemele multiparticulate dezvoltate până în prezent au fost descrise în următoarele 7 brevete: WO 2006091180 (A2) descrie un sistem carrier injectabil obținut prin interacția fucoidanului cu polizaharide, unde fucoidanul este încapsulat în polimer - chitosan. Invenția 9

JP 2016138136 (A) prezintă o metoda de obținere a unei compoziții de medicament multiparticulat cu cel puțin o suprafață de stabilizator și care formează o multitudine de 11 granule cu diametru de cel mult 2 pm. O altă compoziție de medicament multiparticulat descrisă în brevetul NZ 701898 (A) prezintă o multitudine de granule, fiecare conținând un 13 miez inert, un agent de solubilizare în forma de suprafața activă sau un p H modulator situat lângă substratul inert sau între stratul semipermeabil și stratul de medicament. Brevetul 15 IL 151150 (A) prezintă o formă multiparticulată de medicament adecvată pentru eliberarea uniformă a unui agent farmaceutic în intestinul superior și intestinul inferior, conținând cel 17 puțin două forme de granule, A și B, miezul fiecăreia conținând un agent farmaceutic și cu diferite acoperiri polimerice care permit eliberarea agentului la schimbarea p H-ului. Acest 19 sistem multiparticulat funcționează astfel: granula A este rezistentă la sucul gastric, dar se dizolvă rapid la p H 5,5 iar granula B eliberează mai puțin de 20% din agent la p H 6,8 în 6 h, 21 iar la p H 7,2 eliberează peste 50% din medicament în 6 h. Alt sistem multiparticulat descris în US 2005181062 (A1) pentru eliberarea controlată a medicamentelor este alcătuit dintr-un 23 medicament cu structură cristalină, o glicerida cu cel puțin un substituent alchilat cu cel puțin 16 atomi de carbon, și un poloxamer în care intră cel puțin 70% din medicamentul cristalin 25 multiparticulat. Brevetul US 2010068276 (A1) prezintă o compoziție multiparticulată farmaceutică formată dintr-un miez care se topește, un medicament slab solubil în apă și un 27 strat polimeric solid de dispersie amorfă. Brevetul WO 2017192828 (A1) descrie o altă formă farmaceutică eficientă terapeutic și include o multitudine de particule individuale care conțin 29 un miez - o combinație de ingredient activ dintr-o L-carnitină și o substanță nootropă și stratul de acoperire - un polimer de control al eliberării pe miez, care previne substanțial eliberarea 31 ingredienților activi în acidul gastric și permite eliberarea ingredientelor active într-un p H al mediului intestinal. Compoziția poate fi utilizată pentru tratarea stărilor asociate cu o reducere 33 a cantității de L-carnitină în organism și/sau a unei tulburări cognitive.

Până în prezent nu au fost dezvoltate sisteme multiparticulate formate dintr-o 35 multitudine de microcapsule având ca miez un medicament - acidul flufenamic și ca strat de acoperire un amestec de polimeri biodegradabili în mediul fiziologic, încorporate într-o 37 matrice spongioasă polimerică liofilizată cu sau fără conținut de medicament. Acest sistem multiparticulat eliberează medicamentul în 2 etape: (1) după contactul sistemului 39 multiparticulat cu mediul de cedare (exudatul leziunii) are loc pătrunderea acestuia în structura poroasă a matricii spongioase, hidratarea rețelei polimerice, umflarea polimerului 41 relaxat cu eliberarea medicamentului reținut liber în rețeaua colagenică (în cazul în care matricea polimerică liofilizată are conținut de medicament), urmată de (2) difuziunea mai 43 lentă, treptată a medicamentului entrapat în rețeaua polimerică în timpul procesului de liofilizare (în cazul în care matricea polimerică liofilizată are conținut de medicament) și în 45 microcapsule, concomitent cu degradarea lentă a microcapsulelor și a suportului colagenic, asigurându-se astfel o cedare pe parcursul mai multor zile. 47

Au mai fost descrise matrici polimerice spongioase cu eliberare directă de medicament, dar nu sisteme multiparticulate în care medicamentul este încapsulat. Cererea de brevet A 00919/2012 prezintă un sistem de eliberare controlată a unui medicament de tip antiinflamator nesteroidian (acidul flufenamic) încorporat în formă liberă în suporturi de cedare de tip matrice spongioasă pe bază de amestec de colagen și dextran, reticulate și combinate în anumite proporții care să asigure controlul inflamației după producerea unei arsuri de intensitate mai redusă. Spre deosebire de această cerere de brevet, sistemele multiparticulate propuse în prezenta invenție, în care acidul flufenamic este încorporat în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică, asigură cedarea medicamentul antiinflamator pe o perioada mai lungă de timp, de câteva zile, ceea ce are ca efect reducerea durerii locale în primele 3 zile de la apariția arsurii favorizând vindecarea fără a induce reacții adverse topice. De asemenea datorită microîncapsulării medicamentului are loc reducerea cantității de medicament cedată prea rapid în primele ore, fiind astfel eliminat riscul ca acesta să fie cedat într-o cantitate prea mare înainte ca procesul inflamator să fie controlat. În plus aceste sisteme multiparticulate prezintă și eficiență în vindecarea arsurilor de severitate medie induse experimental prin expunerea la agent termic pe o perioadă mai lungă de timp și testate experimental la animalele de experiență.

Problema pe care o rezolvă invenția constă în prezentarea unui sistem topic multiparticulat de cedare controlată a unui medicament antiinflamator utilizat în tratarea arsurilor de severitate medie și a unui procedeu de obținere a acestui sistem.

Sistemul topic multiparticulat de cedare controlată a unui medicament antiinflamator utilizat în tratarea arsurilor de severitate medie, conform invenție înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că este constituit în procente gravimetrice raportate la 100 g de gel de colagen, dintr-un suport polimeric constând dintr-un amestec de colagen fibrilar de tip I având un conținut de 0,8...1,2% colagen substanță uscată, până la 0,6% acid flufenamic și până la 1,2 % dextran, până la 1,2% agent de reticulare de tip glutaraldehida și 15...30% microcapsule alcătuite din 2,50...7,50% gelatină, 0,25...0,75% carboximetilceluloză sodică, 1,60...2,40% acid flufenamic și 0,50...1,50% alginat de sodiu.

Procedeul de obținere al sistemului topic multiparticulat conform invenție înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că se amestecă în prealabil, gelul de colagen cu soluția de acid flufenamic, se adaugă dextran, se ajustează p H-ul la 7,4 cu soluție de hidroxid de sodiu 1M și se adaugă apă distilată până ce compoziția finală a gelului conține între de 0,8...1,2% colagen substanță uscată, în care se imersează 15...30% microcapsule și se adaugă glutaraldehidă sub formă de soluție de concentrație 0,2...0,3% în apă distilată, hidrogelul rezultat se lasă la maturat 24 h la 4°C și apoi se liofilizează 48 h, rezultând un sisteme multiparticulate cu acid flufenamic în formă liberă și respectiv în formă încapsulată, cu cedare controlată bifazică a medicamentului pe o perioadă de 48 de ore.

Prin aplicarea invenție se obțin următoarele avantaje:

- utilizarea unui sistem multiparticulat de cedare topică a unui medicament antiinflamator, pe bază de polimeri biodegradabili, cu compatibilitate tisulară crescută și efecte pozitive în vindecarea arsurilor, care asigură eliberarea medicamentului direct la locul de acțiune, cu menținerea unei concentrații suficiente și eficiente exercitării efectului terapeutic la nivelul leziunii;

- evitarea toxicității sistemice (în special sângerări gastro-duodenale) și a efectelor secundare asociate la nivel hepatic și renal, precum și asigurarea unei complianțe crescute a pacientului;

- utilizarea sistemelor multiparticulate în care acidul flufenamic este încorporat în 1 formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică, având proprietăți fizico-chimice, morfologice, biologice și biofarmaceutice adecvate care permit: (i) 3 atât o cedare bifazică a medicamentului antiinflamator, cu reducerea eliberării rapide în primele ore eliminând riscul ca medicamentul să fie cedat într-o cantitate prea mare înainte 5 ca procesul inflamator să fie controlat, și o eliberare graduală, lentă pe parcursul a 48 h corespunzătoare perioadei critice a unei arsuri, cât și (ii) o degradare treptată a suportului 7 colagenic;

- reducerea durerii locale post-traumatice în primele 3 zile de la apariția unei arsuri 9 de severitate medie, fără a induce reacții adverse topice;

- efect pozitiv asupra evoluției procesului de vindecare din primele zile ale arsurilor 11 de severitate medie induse experimental prin expunerea la agent termic pe o perioadă mai lungă de timp și testate experimental la animalele de experiență; 13

- sistemele multiparticulate în care acidul flufenamic este încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar în formă încapsulată în matricea 15 polimerică, asigură o creștere a eficacității terapeutice și clinice, îmbunătățirea confortului pacientului prin reducerea numărului și frecvenței aplicării, și consecutiv o scădere a 17 costurilor implicate în acordarea asistenței de specialitate.

Se prezintă în continuare invenția în detaliu în legatură cu fig. 1...11 care reprezintă: 19

- fig. 1, prezintă imagini ale microcapsulelor pe bază de gelatină, carboximetilceluloză sodică, acid flufenamic și alginat de sodiu, obținute prin procedeul descris anterior; 21 - fig. 2, prezintă imagini ale sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar în formă încapsulată în 23 matricea polimerică, obținute prin procedeul descris anterior: a) exemplul 1; b) exemplul 2; c) exemplul 3; d) exemplul 4; e) exemplul 5; f) exemplul 6;25

- fig. 3, prezintă imagini obținute prin microscopie optică pentru sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică,27 respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică: a) exemplul 1; b) exemplul 2; c) exemplul 3; d) exemplul 4; e) exemplul 5; f) exemplul 6;29

- fig. 4, prezintă imagini ale formei picăturii înregistrate la determinarea unghiului de contact pentru pentru sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă31 și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică: a) exemplul 1; b) exemplul 2; c) exemplul 3; d) exemplul 4; e) exemplul 5; f) 33 exemplul 6;

- fig. 5, prezintă capacitatea de absorbție înregistrată după 2 ore și 72 ore pentru 35 sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică; 37

- fig. 6, prezintă cedarea cumulativă a acidului flufenamic din sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, 39 respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică;

- fig. 7, prezintă influența cantității de microcapsule asupra procentului de acid 41 flufenamic cedat din sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar în formă încapsulată în matricea 43 polimerică;

- fig. 8, prezintă influența factorilor de formulare (compoziția microcapsulelor și 45 compoziția hidrogelului de colagen) asupra procentului de acid flufenamic cedat din sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în 47 matricea polimerică;

- fig. 9, prezintă influența modului de încorporare a acidului flufenamic asupra procentului de medicament cedat din sistemele multiparticulate;

- fig. 10, prezintă evoluția procesului de vindecare al arsurilor induse experimental la șobolanii Wistar și tratate cu sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică: exemplele 1,2, 3, 4, 5 și 6 comparativ cu lotul martor tratat cu comprese sterile;

- fig. 11, prezintă procesul macroscopic de cicatrizare al leziunilor induse prin arsură la șobolani Wistar în urma tratamentului cu sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică: exemplele 1, 2, 3, 4, 5 și 6 comparativ cu lotul martor tratat cu comprese sterile.

Gelul de colagen fibrilar tip I obținut din piele bovină, având o concentrație de colagen de 0,8 până la 1,2% (g/g) este utilizat în această invenție. Gelul trebuie sa aibă o anumită puritate, să nu conțină grăsimi și cenușă. p H-ul gelului trebuie sa fie acid: 2,2 până la 3,5.

Gelatina utilizată în această invenție este obținută prin hidroliza gelului de colagen, având o concentrație de 2,50...7,50% în obținerea microcapsulelor.

Dextranul din Leuconostoc ssp. utilizat în această invenție în procent de 0 până la 1,2%, este o polizaharidă comercială cu masa moleculară de aproximativ 500000 Da. Se poate utiliza și dextran cu mase moleculare mai mici. Prezintă biocompatibilate tisulară crescută și are capacitatea de a crește stabilitatea in vitro a colagenului și a scădea imunogenicitatea acestuia. Are un potențial crescut în stimularea vindecării unei leziuni cutanate.

Carboximetilceluloza sodică este sarea de sodiu a eterului poli (O-carboximetilic) al celulozei.

Este un polimer formator de gel, biocompatibil, biodegradabil și care favorizează reepitelizarea. Este utilizată în această invenție în obținerea microcapsulelor în procent de 0,25...0,75%.

Alginatul de sodiu este un polimer ușor solubil în apă, cu o biocomaptibiliate tisulară crescută și efecte benefice în vindecarea unei leziuni cutanate. In prezenta invenție este utilizat în concentrație de 0,50...1,50% pentru obținerea microcapsulelor.

Acidul flufenamic este din punct de vedere chimic un derivat de acid antranilic și anume acidul 2-{[3-(Trifluorometil) fenil]amino}benzoic. Acidul flufenamic utilizat în această invenție este o substanță medicamentoasă comercială, care se prezintă sub formă de pulbere cristalină, slab gălbuie, fără miros sau cu miros foarte slab și cu gust foarte slab amar. Valoarea constantei de disociere pKa este 3,9, iar coeficientul de partiție log P (octanol/apă) este 5,2. Acidul flufenamic inhibă ambele forme ale ciclooxigenazei implicate în biosinteza prostaglandinelor. Și-a demostrat efectul antiinflamator și analgezic în diferite formulări topice destinate afecțiunilor reumatice. Mai pot fi utilizate și alte medicamente antiinflamatoare nesteroidiene cu ar fi: acidul niflumic, acidul mefenamic, acidul tolfenamic, acidul meclofenamic, diclofenacul, aceclofenac, indometacinul, ibuprofenul, naproxenul, flurbiprofenul, ketoprofenul, fenilbutazona, piroxicamul, tenoxicamul, meloxicamul, nimesulidul în procent de 0,1...1%.

Agentul de reticulare este glutaraldehida care trebuie să fie în concentrație de 0...1,5% raportată la conținutul de colagen. Glutaraldehida selectată ca agent de reticulare scade imunogenicitatea colagenului și îi crește rezistența la degradare enzimatică.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în realizarea unui sistem 1 multiparticulat de eliberare controlată a medicamentului, în două etape - o cedare mai rapidă în primele ore urmată de o cedare lentă în următoarele 2 zile așa cum este prezentat în 3 descrierea stadiului actual, selectarea unui suport polimeric adecvat, un amestec de colagen și dextran, și a unui medicament antiinflamator nesteroidian, acidul flufenamic, încorporat în 5 microcapsule și în suportul polimeric spongios, sau doar în microcapsule, și combinate în anumite proporții astfel încât, medicamentul eliberat să asigure controlul răspunsului 7 inflamator post-leziune.

Sistemele multiparticulate de cedare controlată a medicamentelor conform invenției 9 înlătură dezavantajele menționate prin aceea că sunt constituite din 2 componente de bază, microcapsule cu medicament încorporate într-o matrice spongioasă, descrise după cum 11 urmează:

1. Microcapsulele au fost obținute în prealabil dintr-un gel constituit din următoarele 13 componente, exprimate în procente raportate la 100% gel: a) un polimer natural, gelatină, 2,50...7,50%, obținută din derma pielii de vițel, cu un conținut de 0,5...10% substanță uscată, 15

b) 0,25...0,75% carboximetilceluloză sodică (CMCNa), c) 1,60...2,40% acid flufenamic și d) 0,50...1,50% alginat de sodiu. Procedeul de obținere al gelului pentru realizarea 17 (micro)capsulelor, conform invenției, constă în aceea că, în prealabil, alginatul de sodiu și carboximetilceluloză sodică sunt solubilizate în apă distilată și acidul flufenamic în soluție de 19

NaOH 1M, iar apoi au fost adăugate peste gelatină și întreaga compoziție a fost omogenizată. Gelul obținut a fost picurat cu ajutorul unei seringi în soluție de CaCl₂ 1M 21 pentru reticulare și formare de capsule cu formă sferică. Întreg procedeul de obținere a fost realizat la temperatura camerei. 23

În fig. 1, sunt prezentate în imagini exemple de microcapsule (denumite „mc) optime obținute prin procedeul descris anterior și care vor fi utilizate ca exemple în obținerea 25 sistemelor multiparticulate care fac obiectul prezentei invenții.

Din punct de vedere al morfologiei, microcapsulele au prezentat următoarele 27 particularități: (i) o cantitate mai mare de alginat de sodiu a condus la formarea unor microcapsule, mai stabile, omogene și individuale după preparare; (ii) prezența unei cantități 29 mai mare de CMCNa în formulare determină un grad de transparență mai crescut al mc.

În continuare microcapsulele cu acid flufenamic, pe bază de gelatină, carboximetil- 31 celuloză sodică și alginat de sodiu sunt caracterizate din punct de vedere al gradului de entrapare al medicamentului, al diametrului și al rezistenței la degradare enzimatică. 33

Determinarea gradului de entrapare al microcapsulelor a fost evaluat prin metoda diferenței, ținându-se seama de cantitatea inițială de acid flufenamic din gelul folosit la prepararea 35 microcapsulelor și cantitatea de acid flufenamic din soluția de CaCb, după îndepărtarea microcapsulelor formate. Cantitatea de acid flufenamic a fost evaluată spectrofotometric, la 37

X = 288 nm corespunzând maximului de absorbție, utilizând curba de etalonare (A1% = 534). Observație: randamentul de obținere al microcapsulelor din geluri a fost peste 39 98% în toate cazurile și s-a ținut seama și de acesta în determinarea gradului de entrapare a acidului flufenamic în microcapsule. Gradul de entrapare a acidului flufenamic a variat între 41 74,32 și 89,57%. Diametrul microcapsulelor a fost determinat utilizând un șubler cu afișaj digital cu 5 cifre, comutabil în mm sau inch. Diametrul a variat între 2,34 și 3,41 mm. 43

Degradarea enzimatică a microcasulelor a fost realizată prin monitorizarea pierderii de masă în funcție de timpul de expunere la soluția de colagenază, pentru a simula condițiile 45 fiziologice. Microcapsulele au fost cântărite cu precizie, plasate în soluția de colagenază și incubate la 37°C. La intervale regulate de timp, cuprinse între 5 min și 72 h, microcapsulele au fost îndepărtate din soluția de degradare și au fost cântărite. Pierderea de masa a fost determinată folosind ecuația (1):

W - W

Pierdere de masa % =------- x 100 (1)

W unde W_i - greutatea inițială a microcapsulelor, iar W_t - greutatea înregistrată la timpul t.

Pierderea de masă a variat între 7,69 și 24,68% la 5 min, între 30,76 și 64,01% la 80 min, între 35,71 și 65,57% la 24 h, între 45,35 și 79,96% la 48 h, respectiv 54,09 și 85,71% Ia 72 h.

Microcapsulele optime obținute au fost încorporate într-un gel cu acid flufenamic și dextran care după reticulare și liofilizare a avut ca rezultat o matrice spongioasă cu microcapsule încorporate.

2. Sistem multiparticulat alcătuit din următoarele componente, exprimate în procente gravimetrice raportate la 100 grame de gel de colagen: a) un polimer natural, colagen fibrilar tip I, obținut din dermă bovină, sub formă de gel, cu structură de triplu helix, cu un conținut de 0,8...1,2% colagen substanță uscată, b) 0,4...0,6% acid flufenamic, solubilizat în prealabil în soluție de hidroxid de sodiu 1M, se adaugă în gelul de colagen, c) dextranul, o polizaharidă, în concentrație de 0...1,2%, d) 15...30% microcapsulele al căror procedeu de obținere a fost prezentat anterior, și e) 0...1,2% agent de reticulare, glutaraldehida ce se amestecă în compoziția finală sub formă de soluție 0,2...0,3% în apă distilată.

Procedeul de obținere a sistemelor multiparticulate constă în aceea că, în prealabil gelul de colagen se amestecă cu soluția de acid flufenamic cu concentrația de 0,4...0,6%. Ulterior se adaugă dextranul cu o concentrație variind între 0...1,2%, se omogenizează, se ajustează p H-ul la 7,4 cu soluție de hidroxid de sodiu 1M și se adaugă apă distilată până ce compoziția finală a gelului conține între de 0,8...1,2% colagen substanță uscată. În compozițiile obținute sub formă de gel colagen-acid flufenamic-dextran se imersează 15...30% microcapsule. Ulterior se adaugă agentul de reticulare glutaraldehida în concentrații cuprinse între 0...1,2%, ce se amestecă în compoziția finală sub formă de soluție 0,2...0,3% în apă distilată. Hidrogelul rezultat se lasă la maturat 24 h la 4°C și apoi se liofilizează 48 h.

Se obțin astfel sisteme multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea spongioasă.

În fig. 2, sunt prezentate câteva imagini ale sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea spongioasă polimerică, respectiv doar încapsulată, obținute prin procedeul descris anterior.

În continuare sistemele multiparticulate pe bază de acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată sunt caracterizate din punct de vedere structural și morfologic, al capacității de umectare, absorbției, degradării enzimatice, cedării medicamentului.

Analiza structurală, dar și morfologică a sistemelor multiparticulate a fost investigată prin studii de microscopie optică, utilizând microscopul optic (LEICA, Model S8AP0, putere mărire: 20-160x). Probele vizualizate prin lumina transmisă au fost analizate cu ajutorul accesoriului destinat luminii polarizate, ce are și opțiunea de a filtra lumina cu ajutorul mai multor tipuri de lentile.

În fig. 3, sunt prezentate imagini obținute prin microscopie optică pentru sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată în matricea spongioasă.

Microscopia optică relevă faptul că sistemele multiparticulate au prezentat o structură poroasă cu porii interconectați, mai compactă cu creșterea cantității de microcapsuie. Toate sistemele multiparticulate prezintă structură cu caracteristici favorabile creșterii celulare.

Pentru determinarea capacității de umectare a sistemelor multiparticulate, exprimată prin valoarea unghiului de contact (CA), s-a utilizat aparatul de determinări fizico-chimice KSV.

Scientific Instruments prevăzut cu o cameră video pentru capturarea imaginilor și CAM 101 software pentru achiziția datelor. S-a utilizat metoda picăturii suspendate. După dispensarea picăturii de apă distilată din seringa Hamilton pe suprafața buretelui, imaginile picăturii au fost automat analizate, înregistrându-se unghiul de contact. Pentru evaluarea unghiului de contact (unghiul format de tangenta la suprafața lichid/gaz și suprafața liberă a solidului, în punctul de intersecție al celor trei faze) s-a aplicat ecuația Young care descrie din punct de vedere matematic forma picăturii. Unghiul de contact se exprimă în grade, în fig. 4, sunt prezentate imagini ale formei picăturii obținute la determinarea unghiului de contact pentru pentru sistemele multiparticulatecu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată în matricea spongioasă. Unghiul de contact reprezintă un indicator util și rapid pentru determinarea gradului de umectare al suprafeței de către fluidele biologice, precum și o modalitate eficientă pentru studiul influenței compoziției asupra hidrofiliei suporturilor de cedare a medicamentului. Astfel, se observă că cele mai mari valori ale unghiului de contact sunt înregistrate pentru suporturile de cedare în care acidul flufenamic este încorporat atât în formă liberă cât și încapsulată în matricea spongioasă (exemplele 1, 2, 3, 5 și 6). De asemenea, cu creșterea conținutului de microcapsule în suporul spongios, scade capacitatea de umectare a suprafeței (exemplul 1 comparativ cu exemplul 2, respectiv exemplul 5 comparativ cu exemplul 6). Se constată și valori mai scăzute ale unghiului de contact pentru suporturile de cedare din exemplele 5 și 6 datorită compoziției gelului de colagen care este nereticulat, respectiv pentru cele din exemplele 1 și 2 care prezintă un conținut minim de colagen (1%), comparativ cu suportul de cedare corespunzător exemplului 3 care are o concentrație maximă de colagen și aldehidă glutarică. Valorile înregistrate pentru unghiul de contact indică o capacitate de umectare adecvată a sistemelor multiparticulatecu medicament încorporat în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică. Capacitatea de absorbție asistemelor multiparticulatea fost determinată printr-o metodă gravimetrică, la 37°C, utilizând ca mediu de absorbție o soluție de tampon fosfat p H 7,4 pentru simularea condițiilor fiziologice. Sistemele multiparticulate au fost cântărite în condiții uscate (W₀) și au fost apoi imersate în mediul de absorbție. La anumite intervale de timp, pe o perioadă de 72 h, matricile spongioase polimerice au fost extrase din mediul de absorbție, ținute timp de un minut până când nu se mai formau picături de apă și apoi cântărite (W_t). Capacitatea de absorbție a fost determinată conform ec. (1):

Capacitate de absorbție (g / g) =

Wt

Wo

Wo

Capacitatea de absorbție a sistemelor multiparticulateeste un parametru important ce trebuie luat în considerare în formularea suporturilor medicamentoase destinate utilizării în arsuri.

Acest parametru critic în vindecarea unei arsuri este influențat atât de proprietățile biologice ale leziunii, cât și compoziția fizico-chimică a matricii spongioase. Absorbția fluidului a început după imersia buretelui în mediul de absorbție. Cantitatea crescută de fluid reținută în structura poroasă a sistemelor multiparticulate ar putea fi atribuită pe de-o parte legării mediului de absorbție de colagen, iar pe de altă parte hidrofiliei crescute a acestuia. Abilitatea de a absorbi o cantitate importantă de fluid favorizează și formarea unui strat de gel după contactul buretelui cu leziunea, asigurând astfel un mediu umed adecvat.

În fig. 5 este redată capacitatea de absorbție (gradul de gonflare) înregistrat după 2 h și 72 h pentru sistemele multiparticulatecu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică.

După cum se observă în fig. 5, sistemele multiparticulate prezintă capacitate de absorbție bună, demonstrând abilitatea acestora de a absorbi exudat la nivelul unei leziuni cutanate, de a adera la o leziune umedă și de a favoriza formarea unui nou țesut regenerat.

Analiza degradării enzimatice a sistemelor multiparticulatea fost realizată prin monitorizarea pierderii de masă în funcție de timpul de expunere la soluția de colagenază, în mod similar metodei descrise pentru caracterizarea microcapsulelor. Cuantificarea rezistenței la degradare enzimatică s-a realizat cu ajutorul ec. (1).

Controlul vitezei de degradare este un aspect important în vindecarea unei arsuri deoarece resobția in vivo influențează capacitatea de regenerare tisulară. Astfel, o viteză de degradare mare determină o cedare foarte rapidă a medicamentului din cauza distrugerii suportului de cedare având ca rezultat scăderea eficienței tratamentului, în timp ce o viteză mică de degradare conduce la o întârziere a vindecării țesutului afectat.

Degradarea enzimatică a sistemelor multiparticulate depinde și este determinată de integritatea stucturii triplu helicoidale a acestuia și de gradul de reticulare, precum și de prezența microcapsulelor în formulare. Rezistența la degradare enzimatică a sistemelor multiparticulate a fost după 48 h cuprinsă între 84,02% și 100%.

Pentru studiul cedării acidului flufenamic din sistemele multiparticulate cu medicamentul încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar în formă încapsulată s-a utilizat un echipament de dizolvare prevăzut cu palete (Esadissolver). Sistemele multiparticulateavând formă circulară și diametru de 3 cm au fost plasate pe suprafața unui dispozitiv de tip sandwich transdermic care a fost apoi imersat în vasul aparatului de dizolvare. Determinările au fost efectuate la temperatura de 37°C, la o viteză de rotație de 50 rpm. Mediul de cedare utilizat a fost reprezentat de o soluție de tampon fosfat p H 7,4. La diferite intervale de timp, probe de 5 mL au fost extrase din vasul de cedare și înlocuite cu același volum de tampon fosfat, proaspăt și preîncălzit, pentru menținerea unui volum constant în vasul de cedare. Concentrația de acid flufenamic din fiecare probă a fost determinată spectrofotometric.

A fost studiată influența factorilor de formulare și a modului de încorporare a acidului flufenamic în sistemele multiparticulate asupra profilelor de cedare a medicamentului. Cinetica de cedare in vitro a acidului flufenamic din sistemele multiparticulate cu acid flufenamic încorporat în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică, este prezentatăcomparativ în profîlele cinetice cumulate, ilustrate în fig. 6 ca procent de medicament cedat în funcție de timp.

În fig. 7, este prezentată spre exemplificare influența cantității de microcapsule asupra procentului de acid flufenamic cedat din sistemele multiparticulate cu medicament încorporat în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică. În fig. 8 este prezentată spre exemplificare influența factorilor de formulare (compoziția microcapsulelor și compoziția hidrogelului de colagen) asupra procentului de acid flufenamic cedat din sistemele multiparticulate cu medicament încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică.

În fig. 9, este prezentată spre exemplificare influența modului de încorporare (în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată) a acidului flufenamic asupra procentului de medicament cedat din sistemele multiparticulate.

Din analiza fig. 6...9 se constată alura similară a profilelor cinetice, cedarea 1 medicamentului având loc în două etape. Într-o primă etapă, în primele 60 min, acidul flufenamic este cedat mai rapid, într-un procent cuprins între 14,53% (exemplul 1) și 21,06% 3 (exemplul 6). Această comportare cunoscută ca efect „burst release (mult mai redusă însă comparativ cu eliberarea medicamentului din matrici spongioase în care acesta este 5 încorporat doar în formă liberă) este urmată de o cedare progresivă, graduală a medicamentului antiinflamator pe o perioadă de 48 h. Procentul cumulat de acid flufenamic cedat 7 variază după 48 h între 84,85% (exemplul 4) și 96,05% (exemplul 5). Aceste profile cinetice ce implică două etape de eliberare a medicamentului sunt de dorit pentru controlul local al 9 inflamației și al durerii asociate unei arsuri cutanate. Efectul de cedare rapidă determină reducerea senzației de durere și a cascadei de mediatori proinflamatori cedați la locul 11 leziunii. Cedarea lentă, treptată pe parcursul următoarelor ore oferă un efect antiinflamator și analgezic pentru o perioadă mai lungă de timp necesară vindecării arsurii. Astfel de profile 13 de eliberare a medicamentului sunt de urmărit pentru tratamentul unei arsuri deoarece primele 12...48 h sunt critice în vindecarea acesteia. 15

Din examinarea profilelor înregistrate în fig. 6...9 se constată că eliberarea din sistemele multiparticulate în care acidul flufenamic este încorporat doar în formă încapsulată 17 înregistrează o scădere a procentului de medicament cedat. În schimb, prezența acidului flufenamic atât în formă liberă cât și încapsulată determină o creștere a procentului de 19 medicament cedat după 48 h, dar și o cedare mai rapidă a medicamentului în primele 60 min datorită acidului flufenamic liber. 21

Încorporarea acidului flufenamic în microcapsuleconduce la o eliberare a medicamentului pe o perioadă mai îndelungată de timp, fapt datorat și proprietăților fizico-chimic,23 morfologice și biologice ale acestora. Cedarea medicamentului din sistemele multiparticulate în care acesta este încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv25 doar în formă încapsulată este mai lentă, întrucât microcapsulele sunt entrapate în rețeaua buretelui colagenic.27

Pentru evaluarea mecanismului ce caracterizează cedarea acidului flufenamic din sistemele multiparticulate au fost aplicate datelor experimentale diferite modele cinetice: 29 modelul Legii puterii (ecuația (3)) și Higuchi (ecuația (4)).

m = k · tⁿ (3) m„33 mt ₌ , 0,5 m «35 unde m_t - cantitatea de substanță medicamentoasă cedată în timp; m^ - conținutul total de 37 substanță medicamentoasă din matricile colagenice; m/m^ - fracția de substanță medicamentoasă cedată la timpul t; n - exponentul de cedare care indică mecanismul de 39 cedare al medicamentului; k - constantă de viteză de cedare a procesului cinetic, în tabelul următor sunt prezentate coeficientul de corelație corespunzător cedării acidului flufenamic 41 din sistemele multiparticulate, determinat prin aplicarea modelelelor Legii puteriiși Higuchi, parametrii cinetici specifici modelului Legii puterii, precum și procentul de medicament cedat. 43

Matrice spongioasă	Model Higuchi	Model Lege putere	Exponent de cedare	Constantă cinetică (1/min)	Procent medicament cedat (%)
Exemplul 1	0,9621	0,9784	0,39	0,048	95,01
Exemplul 2	0,9525	0,9772	0,36	0,059	91,39
Exemplul 3	0,9590	0,9747	0,39	0,044	89,23
Exemplul 4	0,9841	0,9915	0,41	0,033	84,85
Exemplul 5	0,9417	0,9760	0,33	0,075	96,05
Exemplul 6	0,9559	0,9831	0,35	0,064	92,49

După cum se observă în tabelul anterior, valorile înregistrate pentru coeficientul de corelație sunt mai mari pentru modelul Legii puterii (R > 0,97) comparativ cu modelul Higuchi, indicând un mecanism cinetic non-Fickian de eliberare al acidului flufenamic din sistemele multiparticulate în care medicamentul este încorporat în formă liberă și încapsulată, respectiv doar în formă încapsulată în matricea polimerică.

Mecanismul cinetic pentru aceste formulări depinde de mai multe procese. Inițial, la nivelul leziunii de tip arsură se găsește o cantitate importantă de exudat care udă suprafața buretelui, fluidul este apoi absorbit și penetrează structura poroasă a sistemului multiparticulat. La conctactul sistemului multiparticulat cu leziunea se formează un strat de gel ce favorizează difuzia medicamentului reținut liber la și aproape de suprafață (în cazul sistemelor multiparticulate în care acidul flufenamic este încorporat în formă liberă și încapsulată). Pentru sistemele multiparticulate care conțin acid flufenamic doar sub formă încapsulată, această etapă inițială de cedare a medicamentului este mai lentă. Procesul de absorbție este urmat de hidratarea rețelei polimerice, urmată de gonflarea polimerului relaxat, și respectiv difuziunea mai lentă, graduală a medicamentului din microcapsule, respectiv din forma liberă, entrapate în rețeaua polimerică în timpul procesului de liofilizare, concomitent cu procesul de degradare a suportului de cedare. Prin aceste procese fizicochimice complexe se explică abaterea de la modelul Higuchi, caracterizat prin aceea că viteza de difuziune a medicamentului este mai mică decât viteza de relaxare a polimerului.

Profilele de cedare ale acidului flufenamic din sistemele multiparticulate cu medicamentul încorporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar încapsulată în matricea polimerică, precum și mecanismul cinetic sunt influențate de factorii de formulare (compoziția microcapsulelor și a hidrogelului de colagen), de cantitatea de microcapsule încorporate, precum și de modul de încorporare a acidului flufenamic în sistemele multiparticulate. Prin modularea acestor parametri poate fi controlată cantitatea cedată de medicament, pentru obținerea unor sisteme de cedare cu eliberare optimă a medicamentului la locul de administrare și în funcție de indicația terapeutică.

Sistemele multiparticulate cu medicamentul încoporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar încapsulată în matricea polimerică, au fost testate pe animale de experiență, și anume 35 șobolani masculi, rasa Wistar, în greutate de aproximativ 180 g procurați de la Biobaza U.M.F. „Carol Davila, București. Animalele ținute în condiții standard de laborator, au primit hrană de 2 ori pe zi și apă ad libitum. Experimentele s-au desfășurat conform Directivei 2010/63/UE a Consiliului European privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice și a Legii nr. 43, adoptată de Parlamentul României la data de 11/04/2014.

Animalele au fost distribuite în 7 loturi a câte 5 animale, după cum urmează: lot 1 - exemplu 1 1, lot 2 - exemplu 2, lot 3 - exemplu 3, lot 4 - exemplu 4, lot 5 - exemplu 5, lot 6 - exemplu 6, lot 7 - control netratat. 3

Model experimental de leziune cutanată indusă prin arsură

Animalele au fost epilate pe zona dorsală și s-a indus o arsură menținând timp de 5 15 sec un dispozitiv special cu diametrul de 10 mm încălzit în ser fiziologic la 100°C. Sistemele multiparticulate au fost aplicate direct pe arsură și au fost fixate cu o bandă 7 adezivă de mătase.

Lotului martor i s-a aplicat un pansament steril pe leziune fixat cu o bandă adezivă 9 de mătase. Starea animalelor și aspectul leziunii au fost evaluate zilnic. Leziunile au fost evaluate macroscopic și fotografiate cu un aparat Olympus. După inducerea experimentală 11 a arsurii la animalele de experiență, leziunea capătă aspectul unei escare albe care evoluează spre o leziune roșiatică datorită declanșării procesului inflamator post-traumatic 13 cu extravazarea eritrocitelor și activarea sistemului imun de apărare. Evoluția diametrului rănii a fost măsurată în zilele 1 (inițial), 3, 5, 7, 10, 12, 14 și 17, iar procesul de vindecare al 15 rănilor a fost urmărit comparativ cu lotul netratat.

Procesul de cicatrizare al arsurilor a fost determinat cu ajutorul ecuației (5):17 (diametrul inițial al leziunii t = 0) - (Diametrul leziunii la timpul t)

Cicatrizare % =--------------------_;-------------> >>-----------7----------------- (5)19

Diametrul initial al leziunii t = 0

Prelucrarea statistică a datelor a fost făcută cu ajutorul softului GraphPad Prism 6 21 (www.graphpad.com). Semnificația statistică a datelor a fost stabilită cu ajutorul testelor ANOVA și testul t-student raportate la lotul de control. Rezultatele au fost considerate 23 semnificative statistic la valori ale p < 0,05 și nesemnificative statistic pentru p > 0,05. În tabelul următor este prezentată evoluția diametrului leziunii (mm) induse experimental prin 25 arsură la șobolanii Wistar în urma tratamentului cu suporturi colagenice cu sistemele multiparticulate cu medicamentul încoporat în formă liberă și încapsulată în matricea 27 polimerică, respectiv doar încapsulată în matricea polimerică, respectiv lotului martor tratat clasic cu comprese sterile. 29

	ZI 1 Media ±SD	ZI 3 Media ±SD	ZI 5 Media ±SD	ZI 7 Media ±SD	ZI 10 Media ±SD	ZI 12 Media ±SD	ZI 14 Media ±SD	ZI 17 Media ±SD
Exemplul 1	10±0	9±0,1***	6±0,6***	5,25±1,2**	3,75±1,1*	1,7±0,8***	1±1,1	0±0
Exemplul 2	10±0	9,25±0,1***	7±0,6**	6±1,2	5,25±1,1	0,7±0,8	0,5±1,1	0±0
Exemplul 3	10±0	9,8±0,4***	7±2,2**	5,3±1,0*	3,1±1,9	1,7±1,7	0,3±0,5	0±0
Exemplul 4	10±0	9±0***	7,5±0,6**	7±1,2	4,7±0,5*	2,7±1,9***	0,75±1,5	0±0
Exemplul 5	10±0	8,5±1,0***	7,5*1,3**	5,5±1,3*	5±1,2	2,5±1,0*	0,5±1	0±0
Exemplul 6	10±0	9±0***	7,7±0,5*	6,7±1,0	5±1,2	2,2±2,2	0,75±1,5	0±0
Control	10±0	11,75±0,4***	10,7±0,4*	8,7±1,2	7,8±1,1	5,5±0,5	2±2,0	1±1,4
ANOVA (P)	NS	P<0,0001	P<0,0001	0,0012	P<0,0001	P=0,0043	NS	NS

SD = deviația standard, NS = nesemnificativ statistic. Testul t-student ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05

În fig. 10, este prezentată evoluția procesului de vindecare al arsurilor induse 43 experimental la șobolanii Wistar și tratate cu sistemele multiparticulate cu medicamentul încoporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimerică, respectiv doar încapsulată 45 în matricea polimerică (exemplele 1...6) comparativ cu lotul martor tratat cu comprese sterile.

În fig. 11, este prezentat procesul macroscopic de cicatrizare al leziunilor induse prin arsură la șobolani Wistar în urma tratamentului cu sistemele multiparticulate cu medicament încorporat în diferite variante (exemplele 1...6) comparativ cu lotul martor tratat cu comprese sterile.

Din tabelul anterior și fig. 10 și 11, se observă faptul că aplicarea sistemele multiparticulate a avut un efect mult mai favorabil în vindecarea leziunilor comparativ cu lotul martor căruia i-a fost aplicat tratamentul clasic cu comprese sterile.

Astfel, tratamentul cu sistemele multiparticulate au avut un efect benefic asupra procesului inflamator post-traumatic, influențând pozitiv procesul de vindecare în zilele 3, 5 și 7, perioadă considerată critică în evoluția procesului de cicatrizare.

În cazul aplicării sistemului multiparticulat exemplul 5, diametrul leziunii scade în primele 3 zile cu aproximativ 15%, fiind cea mai favorabilă evoluție a procesului de vindecare din toate tratamentele aplicate pentru această perioada de timp. Scăderi semnificative statistic se obțin și în cazul tratamentului cu sistemele multiparticulate exemplul 1, exemplu 4 și exemplul 6 cu un proces de cicatrizare de 10% față de inițial.

După 5 zile de la inducerea leziunii, se observă cea mai mare scădere a diametrului leziunii dintre toate loturile tratate în cazul sistemului multiparticulat exemplul 1 de 40% față de inițial. O scădere semnificativă (p < 0,01) se observă și în cazul tratamentului cu sistemele multiparticulate exemplul 2 și exemplul 3 de 30%, precum și în cazul exemplelor 4 și 5 de 25% (p < 0,05) după 5 zile.

Un proces evolutiv accelerat comparativ cu martorul se observă în următoarele 7 zile pentru sistemele multiparticulate luate în studiu, în ordine descrescătoare după cum urmează: exemplul 1, exemplul 3, exemplul 5, exemplul 2, exemplul 6 și exemplul 4. În cazul loturilor tratate cu sistemele multiparticulate căderea crustei a fost observată la animale începând cu ziua 12 de tratament comparativ cu lotul de control. Majoritatea animalelor din cadrul seriilor tratate sunt complet vindecate după 2 săptămâni. În cazul lotului de control, procesul de vindecare a fost întârziat depășind 17 zile de la inducerea leziunii. Administrarea sistemelor multiparticulate cu medicamentul încoporat în formă liberă și încapsulată în matricea polimericăa avut un efect benefic asupra vindecării arsurilor, biopolimerii oferind un suport de refacere tisulară locală. Prezența în sistemele multiparticulate a medicamentului antiinflamator are un efect de reducere a durerii locale post-traumatice și a demonstrat un efect pozitiv asupra evoluției procesului de vindecare din primele zile fără efecte secundare asupra sistemului imun din prima barieră de apărare la nivel topic.

Invenția va fi explicată mai în detaliu prin următoarele exemple:

Exemplul 1

În această invenție microcapsulele au fost constituite din următoarele componente, exprimate în procente raportate la 100%) gel: a) un polimer natural, gelatină, 2,5% obținută din derma pielii de vițel, b) 0,25% carboximetilceluloză sodică (CMCNa), c) 2,4%o acid flufenamic și d) 1 % alginat de sodiu.

Procedeul de obținere al gelului pentru realizarea (micro)capsulelor, conform invenției, constă în aceea că, în prealabil, alginatul de sodiu și carboximetilceluloză sodică sunt solubilizate în apă distilată și acidul flufenamic în soluție de NaOH 1M, iar apoi au fost adăugate peste gelatină și întreaga compoziție a fost omogenizată. Gelul obținut a fost picurat cu ajutorul unei seringi în soluție de CaCl₂ 1M pentru reticulare și formare de capsule cu formă sferică întreg. Procedeul de obținere a fost realizat la temperatura camerei.

Sistemele multiparticulate cu acid flufenamic, dextran și microcapsule sunt alcătuite din următoarele componente, exprimate în procente gravimetrice raportate la 100 g de gel de colagen: a) un polimer natural, colagen fibrilar tip I, obținut din dermă bovină, sub forma de gel, cu structurăde triplu helix, cu un conținut de 0,8% colagen substanță uscată; b) 0,4% 1 acid flufenamic, solubilizat în prealabil în soluție de hidroxid de sodiu 1M, se adaugă în colagenul gel; c) dextranul, o polizaharidă, în concentrație de 0,96%; d) 30% microcapsulele 3 al căror procedeu de obținere a fost prezentat anterior; și e) 0,48% agent de reticulare, glutaraldehida care ce se amestecă în compoziția finală sub formă de soluție 0,25% în apă 5 distilată.

Procedeul de obținere a sistemelor multiparticulate cu acid flufenamic, dextran și 7 microcapsule constă în aceea că, în prealabil gelul de colagen se amestecă cu soluția de acid flufenamic, se omogenizează, se ajustează p H-ul la 7,4 cu hidroxid de sodiu 1M și se 9 adaugă apă distilată până ce compoziția finală a gelului conține 0,8% colagen substanță uscată. Ulterior se adaugă dextranul. În compozițiile obținute sub formă de gel colagen-acid 11 flufenamic-dextran se imersează microcapsulele în diferite proporții. Ulterior se adaugă agentul de reticulare. Hidrogelul rezultat se lasă la maturat 24 la 4°C și apoi se liofilizează 13

h. Se obțin sisteme microparticulate sub formă de matrici spongioase din colagen-dextran cu microcapsule din gelatină-alginat-CMCNa și acid flufenamic încorporate în aceasta. 15

Exemplul 2

Microcapsulele au fost obținute prin procesul descris în exemplul 1, exceptând faptul 17 că au fost încorporate în proporție de 15% în matricile spongioase. Sistemele multiparticulate au fost obținute prin procedeul descris în exemplul 1, cu un conținut mai mic de medicament. 19

Exemplul 3

Microcapsulele au fost obținute prin procesul descris în exemplul 1 exceptând 21 cantitățile de gelatină, CMCNa și acid flufenamic care au fost de 7,5%, 0,75% și respectiv 2%, alginatul de sodiu fiind în același procent de 1% și au fost încorporate în proporție de 23

15% în matricile spongioase. Sistemele multiparticulate au fost obținute prin procedeul descris în exemplul 1, exceptând compoziția care conține 1,2% colagen, 0,72% dextran, 25 0,6% acid flufenamic și reticulate cu 0,144% glutaraldehida.

Exemplul 4 27

Microcapsulele au fost obținute prin procesul descris în exemplul 1 exceptând cantitățile tuturor componentelor, care au fost de 7,5% gelatină, 0,5% CMCNa, 2% acid flufena- 29 mic și 1,5% alginat de sodiu și au fost încorporate în proporție de 30% în sistemul multiparticulat. 31

Sistemele multiparticulate au fost obținute prin procedeul descris în exemplul 1, exceptând compoziția care conține 1% colagen, 1,2% dextran, nu conține acid flufenamic 33 și nu este reticulată (0% glutaraldehidă).

Exemplul 5 35

Microcapsulele au fost obținute prin procesul descris în exemplul 4 și au fost încorporate în proporție de 30% în sistemul multiparticulat. Sistemele multiparticulate au fost 37 obținute prin procedeul descris în exemplul 4, exceptând compoziția care conține 0,5% acid flufenamic. 39

Exemplul 6

Microcapsulele au fost obținute prin procesul descris în Exemplul 5 exceptând faptul 41 că au fost introduse în proporție de 15% în sistemul multiparticulat.

Sisteme multiparticulate de cedare controlată a acidului flufenamic din matricile 43 colagen-dextran în care a fost încorporat pe de-o parte în formă liberă și pe de altă parte în formă încapsulată în microcapsulele dintr-un amestec polimeric gelatină-CMCNa-alginat de 45 sodiu, respectiv doar în formă încapsulată în microcapsulele dintr-un amestec polimeric gelatină-CMCNa-alginat de sodiu, au fost obținute și demonstrată capacitatea de eliberare 47 controlată bifazică a medicamentului, precum și un efect pozitiv asupra evoluției procesului de vindecare al unei arsuri de severitate medie induse experimental prin expunerea la agent 49 termic pe o perioadă mai lungă de timp și testate experimental la animalele de experiență.

Revendicări

Claims (2)

Revendicări

1. Sistem topic multiparticulat de eliberare controlată a unui medicament antiinflamator pentru tratarea arsurilor de severitate medie, caracterizat prin aceea că, este constituit în procente gravimetrice raportate la 100 g de gel de colagen, dintr-un suport polimeric constând dintr-un amestec de colagen fibrilar de tip I având un conținut de 0,8...1,2% colagen substanță uscată, până la 0,6% acid flufenamic și până la 1,2 % dextran, până la 1,2% agent de reticulare de tip glutaraldehidă și 15...30% microcapsule alcătuite din 2,50...7,50% gelatină, 0,25...0,75% carboximetilceluloză sodică, 1,60...2,40% acid flufenamic și 0,50...1,50% alginat de sodiu.

2. Procedeul de obținere al sistemului topic multiparticulat definit în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că, se amestecă în prealabil, gelul de colagen cu soluția de acid flufenamic, se adaugă dextran, se ajustează p H-ul la 7,4 cu soluție de hidroxid de sodiu 1M și se adaugă apă distilată până ce compoziția finală a gelului conține între de 0,8...1,2% colagen substanță uscată, în care se imersează 15...30% microcapsule și se adaugă glutaraldehidă sub formă de soluție de concentrație 0,2...0,3% în apă distilată, hidrogelul rezultat se lasă la maturat 24 h la 4°C și apoi se liofilizează 48 h, rezultând un sisteme multiparticulate cu acid flufenamic în formă liberă și respectiv în formă încapsulată, cu cedare controlată bifazică a medicamentului pe o perioadă de 48 de ore.