RO132032A2 - Procedură sonochimică pentru nanoacoperire antibacteriană, aplicată pe suprafaţa unui nou aliaj ternar de titan, cu aplicaţie în implantologia ortopedică - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de nanoacoperire antibacteriană, aplicată pe suprafaţa unui aliaj ternar de titan, cu aplicaţie în implantologia ortopedică. Procedeul conform invenţiei constă în pregătirea suprafeţei prin polizare şi degresare ultrasonică în acetonă pură, timp de 15 min, prepararea soluţiei de acoperire de ZnO 0,05 M, depunerea soluţiei folosind o sursă de ultrasunete cu o frecvenţă de 20 kHz şi o putere de 750 W, cu procesare sonochimică timp de 60 min, după care acoperirea antibacteriană rezultată este condiţionată şi caracterizată.

Description

Invenția se refera ia metoda sonochimica de functionalizare a suprafeței aliajelor prin aplicarea de nanoaeoperire antibacteriana care asigura protecție bacterislatica si bactericida pe durata lunga, pentru implanturi ortopedice.

Prezentarea stadiului cunoscut ai tehnicii din domeniu

Ingineria suprafețelor capabila sa stimuleze formarea si dezvoltarea țesuturilor care inconjoara implantul metalic este in momentul de fata o provocare in domeniul biomaterialelor. Studii recente au aratat ca modificări ale suprafeței 1a nivel nanometric au influenta semnificativa, pozitiva asupra stimulării activitatii celulare, a îmbunătățirii bioactivitatii dar trebuie sa aiba si activitate antibacteriana protejând organismul uman de reacții adverse.

In aplicarea implanturilor metalice ortopedice apar infecții; prevenirea infecțiilor care apar atat la începutul implantării cat si pe parcursul existentei implantului se face foarte eficient prin creșterea abiJitatii antîbacteriene a materialelor implantate; pentru implanturile metalice pe baza de titan si aliajele acestuia se folosesc următoarele metode:

- impregnarea cu antibiotice a cementurilor sau acoperirilor de hidroxiapatită; are dezavantajul ca acestea actioneaza pe termen scurt, sunt toxice si dezvolta rezistenta la stafilococi [H. Gautier, G. Daculsi, C. Merle, Association of vancomycin and ealeium phosphate by dynamic compaclion: In vitro characterization and microbiologica! activity, Biomaterials 22 (2001) 2481];

- acoperiri cu agenți antimicrobieni organici non-antibiotici [A. Kozlovsky, Z. Artzi, O. Moses, N. Kamîn-Belsky, R.B. Greenstein, Interaction of chiorhexîdine with smooth and rough types of titanium surfaces, J. Periodontol. 77 (2006) 1194] au eficienta scăzută;

- acoperiri cu agenți antimicrobieni anorganici pe baza de argint obținute prin depunere in plasma, laser sau metoda chimica [B.S. Necula, L. Apachitei, F.D. Tichelaar, L.E. FratilaApachiîef J. Druszczyk, An electron microscopical study on the growth of TiQ₂-Ag antibacterial coatings on Ti6A17Nb biomedical alloy, Acta Biomater. 7 (2011) 2751; J. Jelinek, T. Kocourek, J. Remsa, M. Weiserowa, K. Jurek, J. Miksovsky, J. Stmad, A. Galandakova, J. Ulrichova, /Antibacterial, cytotoxicity and phisical properties of iaser-Siiver doped hydroxyapatite iayers, Matei·. Sci. Eng. C 33 (2013) 1242; X. Zhang, Z. Li, X. Yuan, Z.

26/01/2016 a 2016 00055

Cui, H. Bao, X. Li, Y. Liu, X. Yang, Cytotoxicity and antibacterial property of titanium alloy coated with silver nanoparticle-containmg polyelectrolyte multilayer, Mater. Sci. Eng. C 33 (2013) 2816];

- sinteza de particole antimicrobiene de oxid de zinc (ZnO) prin metada chimica sau sonochimica incluse in matrice de polistiren si folosite ca medicamente, fara a fi depuse pe suprafețe metalice [M. Cepin, G. Hribar, S, Caserman, Z. Cmjak Orei, Morphological impact of zinc oxide particles on the antibacterial activity and human epithelia toxicity, Mater. Sci. Eng. C 52 (2015) 204; Y.R. Corrales Urena, S.EI. Prado Bettini, P. Riveros Munoz, L. Wittig,

K. Rischka, P.N. Lisboa-Filho, In situ sonochemical synthesis of ZnO particles embaded in a thermoplaslie matrix for biomedical applications, Mater. Sci. Eng. C 49 (2015) 581.

Metoda sonochimica a fost folosita pentru obținerea de particole antimicrobiene de Ag [C. He, L. Liu, Z. Fang, J. Li, J. Guo, J. Wei, Formation and characterization of silver nanoparticles in aqueous solution via ultrasonic irradiation, Ultrasonics Sonochemistry, 21 (2014) 542] sau ZnO [Y.R. Corrales Urena, S.H. Prado Bettini, P, Riveros Munoz, L. Wittig, K. Rischka, P.N. Lisboa-Filho, In situ sonochemical synthesis of ZnO particles embaded in a thermoplastic matrix for biomedical applications, Mater. Sci. Eng. C 49 (2015) 58] fara a fi aplicate pe suprafețe metalice.

Metoda sonochimica dezvoltata in cadrul acestei propuneri de brevet consta in aplicarea de ZnO netoxic pentru corpul uman dar cu acțiune antibacteriana demonstrata. Eîndele sonice de înalta intensitate sau cele ultrasonice produc fenomene de cavitatie si sinteza in soluție de nanoparticole de zinc, si prin coliziune introduc in substratul metalic nanoparticole antibacteriene; coliziunea dintre nanoparticole si substrat produce modificări ale morfologiei, compoziției si reactivitatii suprafeței; se asigura in același timp un ancoraj puternic ia suprafața a nanoparticolelor bacteristatice.

Prezentarea problemei tehnice pe care o rezolva invenția

Aceasta invenție rezolva problema depunerii de nanoparticole antibacteriene pe suprafețe metalice prin metoda sonochimica. Aceasta metoda nu a fost aplicata pana in prezent pe suprafața noului aliaj Ti-15Nb-5Zr.

Expunerea invenției

S-a demonstrat ca datorita proprietăților speciale ale metodei sonochimice, nanoparticolele antibacteriene au fost adsorbite permanent pe substrat, asigurând in acest mod o proiecție antibacteriana de lunga durata. Realizarea acoperirii antibacteriene s-a făcut prin metoda chimica verde (compoziție originala) cu consum redus de substanța antibacteriana a 2016 00055

26/01/2016 solubila in apa. Nanoacoperirea antibacîeriana are atat rezistenta la coroziune, biocompatibiiitate cat si activitate bacteristatiea si bactericidă.

Conceptul propus este nou si nu exista la scara comerciala; s-a realizat la nivel de laborator si se bazeaza pe un proces sonochimic intr-o singura etapa producând nanoparticole si impregnandu-le ca factori antibacterieni pe suprafața metalica.

Prezentarea avantajelor invenției in raport cn stadiul tehnicii

- Prin metoda sonochimica se asigura activitate antibacîeriana continua, pe termen lung, fara a afecta aderenta si multiplicarea celulelor osoase pe suprafața implantului metalic.

- Nanoacoperirea antibacîeriana asigura proiecție anticorozivă a suprafeței.

- Soluția de lucru este apoasa, netoxica.

- Durata necesara obținerii acoperirii antibacteriene este scurta.

- Consumul de energie este foarte scăzut.

- Costul total al acoperirii este redus.

Prezentarea io detaliu a ouai mod de realizare a invenției revendicate

Etapele metodei sonochimice pentru aplicarea proiecției antibacteriene rezistenta pe termen lung pe suprafața aliajului Ti-15Nb-5Zr sunt:

- Pregătirea suprafeței probelor prin polizare mecanica pana la suprafața tip oglinda;

- degresare ultrasomca in acetona pura timp de 15 minute.

- Pregătirea soluției de depunere de ZnO cu concentrația de 0.05 M folosind reactivi de puritate chimica analitica.

- Depunerea acoperirii antibacteriene folosind sursa de ultrasunete cu o frecventă de 20 kHz și o putere de 750W.

- Procesarea sonochimica s-a aplicat pentru 60 min.. Nanoparticolele antibacteriene s-au depus prin iradierea sonochimica a soluției pe suprafața aliajului.

- Condiționarea acoperirii prin spalare cu apa distilata si etanol si uscarea la temperatura camerei;

- Verificarea morfologiei si compoziției acoperirii obținute cu metoda SEM.

Caracterizarea suprafeței procesate prin metoda sonochimica cu soluție pe baza de oxid de zinc

Caracterizarea nanostratuiui antibacterian obtinut a constat in măsurători de microscopie electronica de baleiaj (SEM), spectroscopie de infraroșu (ΕΓ-IR) și spectroscopie de fotoelectroni de raze X (XPS) pentru determinarea compoziției acoperirii, dimensiunii de particoie, morfologiei, etc. S-a observat depunerea uniforma (Fig. la) de nanoparticole a

26/01/2016 antibacteriene de ZnO (confirmata de analiza spectrala XPS - Fig. î.b si FT-FR - Fig. Ic) cu dimensiuni tipice 10-20 nm.

Fie. 1. Micrografie SEM (a), spectre XPS (b) si FT-IR (c) ale suprafeței aliajului după depunere antibacteriana de nanoparticole de zinc

Evaluarea metodei sonochimice pentru acoperire antibacteriana

Evaluarea nanoacoperirii antibacteriene pe bază de ZnO s-a făcut prin monitorizarea pe termen lung (500 ore de imersie in soluțiile Rînger) a morfologiei, structurii si a rezistentei la coroziune in condiții de funcționare severe (pH = 3,21; pH ^:= 7,58 și pH = 8,91),

Variația in timp a morfologiei si structurii acoperirii antibacteriene Variația in timp a morfologiei si structurii acoperirii antibacteriene s-a efectuat cu tehnica microscopiei electronice de baleiaj (SEM) si a spectroscopiei de energie dispersiva de raze X (EDX) analîzandu-se periodic atat morfologia si microstructura depunerii cat si compoziția acesteia.

Inițial (Fig. 2a) s-a observat o acoperire uniforma cu nanoparticole de ZnO de dimensiuni 20-30 nm repartizata uniform pe intraga suprafața. Spectrul EDX (Fig. 2b) releva atat exJstenîa elementului Zn in concentrație destul de mare, cat si elementele componente ale filmului de pe suprafața aliajului Ti-15Zr-5Nb: Ti, Zr, Nb, O.

a) b)

Fig. 2. Micrografie SEM (a) si spectrul EDX (b) pentru acoperirea inițiala, antibacteriana de

ZnO depusa sonochimic pe suprafața aliajului Ti-15Zr-5Nb

26/01/2016

După 300 ore de expunere in soluții Ringer de pil 7,58 si 8,91 a probelor acoperite cu ZnO prin metoda sonochimica, observațiile SEM au aratat ca suprafața a avut o microstructura stabila in timp, cu nanoparticole de ZnO cu mărimi sub 30 nm, vizibile in imaginile SEM de inaltaă rezoluție (Fig. 3a). Spectrul EDX (Fig. 3b) a detectat prezenta liniilor elementului Zn, precum si a elementelor constitutive ale stratului pasiv: Ti, Zr, Nb, O. Liniile specifice zincului au intensitate mai mica in comparație cu cele de la acoperirea inițiala, care semnifica scăderea concentrației nanoparticolelor de ZnO aratand ca o mica parte din acoperirea de ZnO s-a dizolvzat indepiinandu-si astfel rolul de protecție antibacteriaa.

(a) (b)

Fig. 3. Micrografie SEM (a) si spectrul EDX (b) pentru acoperirea antibacteriana de ZnO depusa sonochimic pe suprafața aliajului Ti-15Zr-5Nb după 300 ore de imersie in soluție

Ringer de pH = 7,58, ia 37°C

După 500 ore de expunere in soluții Ringer de pH 7,58 si 8,91 imaginile SEM (Fig. 4a) au aratat aceeași microstructura stabila, cu nanoparticole de ZnO cu mărimi sub 30 nm. Spectrul EDX (Fig. 4b) a detectat prezenta liniilor elementului Zn, cu intensități mai mici decât cele inițiale si cele de la 300 ore de imersie, adica aceste nanoparticole s-au dizolvat in continuare in soluțiile fiziologice acționând ca factor antibacterian.

a 2016 00055

26/01/2016

a) b)

Fig. 4. Micrografie SEM (a) si spectrul EDX (b) pentru acoperirea antibaeteriana de ZnO depusa sonochimic pe suprafața aliajului Ti-15Zr-5Nb după 500 ore de imersie in soluție Ringer de pH - 7,58, la 37°'C

Evaluarea activita iii antibacteriene a nanopartieolelor de zinc

Capacitatea de inhibiție a activitatii bacteriilor se determina fie prin metoda „prin difuzie,, care poate da doar o estimare calitativa vizuala a eficientei antibacteriene, fie prin metoda estimării turbiditatii care consta in masurarea absorbantei la 600 nm a unui mediu nutritiv lichid inoculat eu microorganismul ales, atat in prezenta agentului potențial antibacterian cat si in absenta acestuia, fata de mediul steril, si calcularea indicelui de inhibiție. Datele obținute pentru stafilococul auriu arata o inhibiție foarte buna de 61.55%.

Determinarea biocompatibilității in vitro a suprafeței procesate sonochimic Testarea biocompatibilitatii suportului Ti-15Zr-5Nb netratat si tratat sonochimic a fost realizata din studii in contact direct. S-au efectuat studii de proliferare, adeziune, viabilitate, diferențiere, mineralizare a celulelor pre-osteoblaste MC3T3-E1 precum si citotoxicitate a suportului metalic.

Nici aliajul netratat, nici cei tratat antibacterian nu au exercitat efecte citotoxice. Testul MTT (Fig, 5) arata o creștere a valorilor absorbantei formazanului la intervalele de 2 si 4 zile de cultura, remarcandu-se valori aproximativ egale pentru viabilitatea si proliferarea osteoblastelor cultivate atat pe aliajul protejat antibacterian cat si pe cel neprotejat. Atașarea, raspandirea si morfologia celulara au fost asemanatoare pentru cele doua probe si evidențiază organizarea actinei ciîoscheietice in fibre de stres. Mineralizarea matricei extracelulare este considerată un punct critic de evaluare pe termen lung a diferențierii celulare. Analizele calitative si cantitative au evidențiat o creștere semnificativă a mineralizării matricei a 2016 00055

26/01/2016 extracelulare pe probele supuse tratamentului sonoehimic, atat la 3 cat si la 6 saptamani. A rezultat ca aliajul tratat sonoehimic prezintă o mai buna biocompatibilitate in comparație cu cei netratat.

MTT

4 ζίίθ

Fig.5. Rata de proliferare a celulelor MC3T3-E1 crescute in contact cu aliajul Ti-15Zr-5Nb netratat si tratat antibacterian

Monitorizarea rezistentei la coroziune si a activitatii antibacteriene a acoperirii bacteriostatice

Monitorizarea rezistentei la coroziune a acoperirii antibacteriene pe baza de ZnO in soluții Ringer de diferite valori de pH (3,21; 7,48; 8,91) s-a făcut prin metoda polarizării lineare care a precizat principalii parametri de coroziune si variația acestora in timp: i_cor densitatea curentului de coroziune; V_cor - viteza de coroziune; R_p - rezistenta de polarizare. Monitorizarea activitatii antibacteiene s-a apreciat din cantitatea totala de ioni eliberați in soluție - Ion release.

Datele din Tabelul 1 arata o Îmbunătățire a valorilor tuturor parametrilor de coroziune pentru aliajul procesat antibacterian ca urmare a efectului acoperirii antibacteriene de ZnO de a inhiba coroziunea aliajului prin reducerea efectiva a ariilor active de pe suprafața aliajului, prin acțiunea de strat pasiv eficace [N. Padmavathy, R. Vijayaraghavan, Enhanced bioactivity of ZnO nanoparticles-an antimicrobial study, Sci. Technol. Adv. Mater. 9, 2008, 035004; S. Sutha, G. Karunakaran, V. Rajendran, Enhanced of antimicrobial and long-term biostability of the zinc-incorporated hydroxyapatite coated 316L stainless Steel implant for biomedical application, Ceram Int. 39, 2013, 5205], De asemenea, comportarea in timp a aliajului procesat antibacterian este diferita de cea a aliajului neprocesat si anume: aliajul procesat a prezentat o scădere a curentului de coroziune, i_cor, a vitezei de coroziune, V_cor, a Ion release si o creștere a rezistentei de polarizare, R_p, ceea ce indica o creștere a rezistentei la coroziune in timp; pentru aliajul neprocesag i_cor, V_cor, si Ion release au crescut in timp iar R_p a scăzut ca urmare a unei ușoare susceptibilități la coroziune, adica a unei scăderi a rezistentei la coroziune [S.I.. Assis, I. Costa, Eieetrochemical evaluation of Ti-13Nb-13Zr, TÎ-6A1-4V and

26/01/2016

Ti-6Al-7Nb alloys for biomedical application by long-term immersion tests, Mater, Corros. 58 (2007) 329; S. Tamilselvi, V, Raman, N. Rajendran, Corrosion behaviour of Ti-6Al-7Nb and TL6A1-4V ELI alloys in simulated fluid solution by electrochemical impedance spectroscopy, Electrochim. Acta 52 (2006) 839; M.A. Baker, S.L. Assis, R. Grilli, I. Costa, Investigation of the electrochemical behaviour and surface chemistry of a Ti-13Nb-13Zr alloy exposed in MEM cell culture media with and without the addition of H2O2, Surf. Interface Anal. 40 (2008) 220],

Tabel 1. Principalii parametri de coroziune pentru aliajul Ti-15Zr-5Nb neproeesat si procesat antibacterian cu ZnO, după imersie in soluții Ringer la 37°C

Material	Timp (h)	*eor (uA/cm2)	vcor (pm/an)	Clasa de rezistenta	Ion release	RP (Q.cm2)
		Ringer pH = 3,21
	24	0,081	0,751	PS	76,3o	330
Neprocesat	100	0,084	0,773	PS	78,54	315
200	0,089	0,819	PS	83,21	300
	500	0,095	0,874	PS	88,79	290
Procesat antibacterian cu ZnO	24	0,061	0,561	PS	56,99	375
100	0,059	0,543	PS	55,17	392
200	0,057	0,524:	PS	53,24	427
500	0,054	0,497	PS	50,49	450
		Ringer pH = 7,48
	24	0,039	0,358	PS	36,70	397
Neprocesat	100	0,043	0,396	PS	40,23	380
200	0,046	0,423	PS	42,98	370
	500	0,051	0,469	PS	47,65	365
Procesat antibacterian cu ZnO	24	0,022	0,202	PS	20,52	454
100	0,020	0,184	PS	18,64	477
200	0,018	0,166	PS	16,86	498
500	0,015	0,138	PS	14,02	512
		Ringer pH = 8,91
	24	0,071	0,657	PS	66,75	305
Neprocesat	100	0,074	0,681	PS	69,19	295
200	0,078	0,718	PS	72,95	281
	500	0,085	0,782	PS	79,45	270
Procesat antibacterian eu ZnO	24	0,058	0,534	PS	54,25	369
100	0,056	0,515	PS	52,32	388
200	0,053	0,488	PS	49,58	425
500	0,050	0,460	PS	46,74	467

PS - Perfect Stabil

Din studiile efectuate rezulta ca nanoacoperirea antibacteriana cu zinc asigura buna protecție antibacteriana si Împotriva coroziunii precum si buna biocompatibilitate.

Claims (1)

1. REVENDICĂRI

   Procedura sonochimica pentru nanoacoperire antibacteriana aplicata pe suprafața unui nou aliaj ternar de titan eu aplicație in impiantologia ortopedica

   Depunerea de nanoparticoie antibacteriene pe suprafețe metalice prin metoda sonochimica se aplica pentru activitate antibacteriana de iunga durata a implanturilor ortopedice.

   Procedura de obținere nanoacoperire antibacteriana aplicata pe suprafața unui nou aliaj ternar de titan, Ti-15Nb-5Zr caracterizata prin aceea ca utilizează metoda sonochimica de impregnare cu nanoparticoie de zinc (din soluție apoasa, ecologica) a suprafeței aliajului.