RO128750A2

RO128750A2 - Tulpină de scenedesmus opoliensis şi procedeu de obţinere a uleiului algal prin cultivarea acesteia

Info

Publication number: RO128750A2
Application number: ROA201101373A
Authority: RO
Inventors: Sanda Velea; Camelia Rovinaru; Daniela Lelieana Stilpeanu; Simona Bianca Ghimis; Nicolae Dragoş; Adriana Bica; Florin Oancea
Original assignee: Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Pentru Chimie Şi Petrochimie - Icechim
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2013-08-30
Also published as: RO128750B1

Abstract

Invenţia se referă la o tulpină deşi la un procedeu de cultivare a acesteia, pentru obţinerea uleiului algal.Tulpina deAICB 141, cu număr de depozit la Culture Collection of Algae and Protozoa CCPA 276/24 acumulează, într-un timp scurt, cantităţi mari de lipide care conţin resturi de acizi graşi într-o cantitate adecvată, pentru transformarea în combustibil biodiesel, diesel şi pentru aviaţie. Procedeul conform invenţiei constă în prepararea unui mediu de cultură BBM modificat, inocularea acestuia cu un mediu cu suspensie de alge, cultivarea microalgelor timp de 10...12 zile, la o temperatură de 28...30°C, electroflocularea suspensiei, filtrarea biomasei după perioada de cultivare, extracţia ultrasonică a uleiului, evaporarea solventului şirecuperarea cu randamente ridicate a uleiului algal, având o densitate, la 20°C, de 0,916...0,930g/cmc, un indice de aciditate de 0,31 mg/KOH/g şi un indice de saponificare de 184...196 mg KOH/100 g.

Description

ULEIULUI ALGAL PRIN CULTIVAREA ACESTEIA.

Prezentul brevet de invenție se referă la o tulpină de Scenedesmus opoliensis, destinată producerii de biomasă algală cu conținut ridicat de lipide prin sechestrarea bioxidului de carbon din emisii industriale, și la un procedeu de obținere a uleiului algal din biomasa de alge.

Sunt cunoscute tulpini de Scenedesmus destinate diferitelor utilizări practice. Cererea de brevet SUA 2009/0117223 descrie o tulpină aparținând unei noi specii, Scenedesmus almerensis, depozitată la Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) cu numărul de depozit CCAP 276/24. Tulpina acumulează până la 0,5% luteină în biomasa uscată și este caracterizată printr-o rată de creștere de 0,8 g / litru mediu / zi, atunci când este cultivată la temperatura de 30°C și pH 8,0, pe un mediu suplimentat cu vitamine. Din această tulpină s-a revendicat obținerea unui ulei algal bogat în acizi grași polinesaturați și în luteină, prin procedee chimice uzuale de extracție.

Cererea de brevet SUA 2011/0076749 prezintă o tulpină de Scenedesmus producto-capitatus, depozitată sub numărul KCTC 11336BP la Korean Collection for Type Culture (KCTC). Tulpina a fost cultivată pe mediu BG-11, barbotată cu amestecuri de gaze cu un conținut de până la 10% CO₂, și cu gaze de ardere cu 10% CO2, în ciclu 12 ore lumină / 12 ore întuneric. In cazul barbotării cu amestec de gaze conținând peste 5% bioxid de carbon autorii cererii de brevet SUA 2011/0076749 au constat ne-exprimarea carbonic arihidrazei, enzima care catalizează reacția dintre bioxidul de carbon și apă, cu formarea ionilor carbonat/ bicarbonat utilizabili în fotosinteza algală. întrucât concentrațiile de peste 5% bioxid de carbon în amestecul de gaze barbotat prin mediul BG-11 represează exprimarea carbonic anhidrazei, autorii au considerat necesară suplimentarea mediului BG-11 cu lizat de rriicroalge Scenedesmus producto-capitatus, cultivate pe medii aerate cu un conținut mai redus de bioxid de carbon, care să reprezinte o sursă de carbonic anhidrază. Tulpina a prezentat o rată a fixării bioxidului de carbon de 0,091 ...

0,454 mmol / litru mediu cultură / hr, fără diferențe semnificative în cazul aerării cu amestecuri sintetice de gaze îmbogățite în CO₂ sau cu gaze de ardere cu conținut de NO_X și SO_X. Autorii au interpretat rezultatele ca demonstrând rezistența tulpinii la NO_X și SO_xși revendică această rezistență pentru tulpina KCTC 11336BP.

Nu s-au descris până în prezent tulpini de Scenedesmus care să acumuleze cantități ridicate de lipide, în perioade relativ scurte de timp. Astfel de tulpini ar fi deosebit de uțile pentru conversia bioxidului de carbon din emisiile industriale în biocombusțibili. Pentru ăștfel de aplicații ar fi de dorit și o structură a resturilor de

Μ·' ί	\

//- P >·.
fo- 'X+fo.h
v/, Ρ.,,.Μ	2 /
.....

(X- 2 Ο 1 1 - 0 1 3 7 5 - Ο 9 -12- 2011

acizi grași în uleiul algal care să permită randamente ridicate la transformarea în biodiesel, diesel regenerabil, combustibil pentru motoarele de aviație.

Pentru exprimarea potențialului de acumulare de lipide adecvate transformării în biocombustibil este necesară dezvoltarea unui procedeu de cultivare a tulpinii algale, de recoltare a biomasei de microalge din mediul de cultură și de extragere a uleiului algal, adaptat tulpinii de Scenedesmus. Cererea de brevet SUA 2011/0138682 se referă la un procedeu de cultivare a tulpinilor de Scenedesmus, pentru obținerea de lipide / ulei algal și / sau fitonutrieriți ca astaxantina și beta-carotenul. Acest procedeu implică cultivarea în bazine deschise, în care pH-ul se menține la valori de peste 8,5, iar temperatura mai mare de 33°C. Astfel de condiții sunt dificil de realizat în zonele din Europa, inclusiv în cele din România.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția este referitoare la o tulpină de Scenedesmus care acumulează cantități ridicate de lipide într-un timp scurt, și la dezvoltarea unui procedeu de obținere a uleiului algal prin cultivarea acestei tulpini.

Tulpina de Scenedesmus opoliensis AICB 141, depozitată la Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) cu numărul de depozit CCAP 276/24, acumulează 43...45% lipide în biomasă, cu un conținut de 87... 89% esteri ai acizilor grași C16, C18 și C18:1, la o viteză de creștere de 0,6...0,7 g biomasă / litru mediu / zi, corespunzător unei acumulări de lipide de 250...315 mg / litru mediu / zi, cu o rată de fixare a bioxidului de carbon de 1 ...1,1 mmoli CO₂/ litru mediu / oră și cu un timp de dublare de 2,027 zile.

Procedeul de obținere a uleiului algal prin cultivarea tulpinii S. opoliensis AICB 141 este alcătuit din următoarele etape:

prepararea unui mediu de cultură BBM, modificat prin suplimentare cu bicarbonat de sodiu până la 2 g/l și azotit de sodiu până la 2 g/l;

inocularea mediului cu suspensie algală în mediu BBM suplimentat cu bicarbonat de sodiu, 10⁶ufc/ml, în raport de 1 parte inocul la 9 părți mediu axenic;

cultivarea micro-algelor timp de 10..12 zile, la o temperatură de lucru: 28 30°C, la o intensitatea radiației fotosintetice de 240 peinsteini / m² /s și prin barbotarea unui amestec sintetic de gaze conținând 7% CO₂, la un debit de 20 ml/min;

electroflocularea suspensiei algale prin aplicarea unei tensiuni continue de

V, la o intensitate a curentului de 0,85A, pe un catod de cărbune polarizat față de un anod din aliaj de fier (oțel-carbon);

jffltfareâljiorriasei algale floculate pentru înlăturarea suplimentară a apei;

C\~2 O ⁴ < - 0 i 5 7 3 - i! :i -12- 2011 extracția ultrasonică, timp de 15 min la 35 kHz, a uleiului algal cu un amestec cloroform : metanol (1:2), aplicat în raport 22,5 părți biomasă uscată la 15 părți solvent;

evaporarea și recuperarea solventului și separarea uleiului algal.

Tulpina de Scenedesmus opoliensis AICB 141 are următoarele avantaje:

Rezistență la contaminare în cazul cultivării industriale pe mediu BBM suplimentat cu bicarbonat de sodiu datorită timpului scurt de dublare;

Capacitate ridicată de a sechestra cantități semnificative de CO₂ cu acumulare de lipide;

Conversie fotosintetică ridicată a bioxidului de carbon în esteri ai acizilor grași C16, C18 și C18:1 încorporați în lipide, într-o proporție convenabilă transformării în biodiesel (prin transesterificare), diesel din surse regenerabile (prin hidroliza grăsimilor, separarea și decarboxilarea acizilor grași și hidrogenarea amestecului de hidrocarburi rezultat) și combustibili pentru aviație (prin hidroprocesarea acizilor grași pentru producerea kerosenului parafinic sintetic).

Procedeul de obținere a uleiului algal prin cultivarea tulpinii S. opoliensis AICB 141 prezintă următoarele avantaje:

Facilitarea fixării bioxidului de carbon datorită suplimentării mediului BBM cu bicarbonat de sodiu, care accelerează reacția bioxidului de carbon cu apa și formarea anionilor de carbonat / bicarbonat, utilizați de microalge în procesul de fotosinteză;

Reducerea consumului de energie prin optimizarea recoltării biomasei algale datorită utilizării procedeului de electrofloculare a suspensiei algale;

Extracția cu randamente ridicate a uleiului algal din biomasa umedă, prin utilizarea unor solvenți cu polaritate ridicată, amestec de cloroform: metanol (1:2) și a extracției ultrasonice.

Prezenta invenție se ilustrează prin următorul exemplu.

Exemplu. Tulpina de Scenedesmus opoliensis AICB 141 a fost izolată din apă dulce, Lacul Știucii, jud. Cluj. Tulpina AICB 141 este organizată cenobial, cenobiile mature, plane, fiind formate din 2-4 celule, mai rar 8 celule. Cenobiul tipic constă din 4 celule alipite prin straturile interne ale peretelui celulelor componente. Frecvența cenobiilor tetradesmoide sau a celor didesmoide este variabilă, în funcție de condițiile de creștere. în culturile suplimentate cu dioxid de carbon și cu limitare nutrițională prin sursele de N și P, cenobiile didesmoide sunt mai frecvente, însoțite și de forme monodesmoide. în condiții normale de creștere nu formează înveliș mucilaginos. Stratul extern subțire al peretelui celular, vizibil în microscopie optică,

< î toate celulele cenobiului și poate fi observat cu ușurință ι :inere. Celulele cenobiilor didesmoide precum și celulele

6\ 201 1-01575-0 9 -12- 2011

externe (terminale) ale celor tetradesmoide sunt prevăzute cu câte o pereche de spini polari drepți, uneori mai mult sau mai puțin curbați, care pot depăși ca lungime jumătatea cenobiilor tetradesmoide. Grosimea spinilor este variabilă, frecvent mai groși la celulele îmbătrânite. La acestea din urmă spinii se pot rupe, partea distală fiind eliberată în mediul de creștere. Celulele interne ale cenobiilor tetradesmoide sunt cilindrice, cu polii rotunjiți. Dimensiunile celulelor sunt variabile: 18,4-(20,2)25,9 pm lungine, respectiv 5,5-(6,8)-9 pm lățime. Celulele pot prezenta ornamentații suplimentare, denumite rozete, câte 2-4 pe fiecare celulă. Stratul extern al peretelui celular, care învelește lax întregul cenobiu, are o structură fină de rețea formată din subunități hexagonale, vizibile în microscopia electronică de baleiaj / scanning (SEM). Cloroplastul unic este dispus parietal în fiecare celulă, cu câte un pirenoid foarte vizibil în microscopia optică. Tulpina se reproduce prin formarea de autospori rezultați în urma a 2 diviziuni succesive.

Tulpina AICB a fost cultivată inițial pe mediu BBM, a cărei formulă este prezentată în tab.1.

Tab. 1. Compoziția mediului nutritiv BBM

Componente	Concentrația (g/l)
NaNO₃	0,250
KH₂PO₄	0,175
K2HPO4	0,075
MgSO₄ ·7H₂O	0,075
CaCI₂ · 2H₂O	0,025
NaCI	0,025
KOH 85%	0,031
Soluție de microelemente	1 ml
Soluție de Fe chelatat	1 ml
Componente soluție stoc microelemente	Concentrația (g/l)
H₃BO₃	2,860
MnSO₄ ·4H₂O	2,030
ZnSO₄ ·7H2O	0,222
MoO₃ (85%)	0,018
CuSO₄ 5H₂O	0,079

Creșterea tulpinii s-a realizat apoi în serii experimentale cu concentrații crescătoare de NaHCO3 între 3-10 g/L adăugate în mediul standard BBM. Rezultatele experimentului au fost comparate cu cele obținute în condițiile creșterii pe mediul standard BBM, nemodificat. Condițiile experimentale de lucru au fost: temperatura de lucru 28°C, intensitatea luminii albe 240 pE/m²s. Datele experim istrate pe parcursul creșterii tulpinii Scenedesmus opoliensis tate în tab. 2.

ICECHV

București

C\- 2 Ο 1 1 - Ο 1 3 7 5 - Ο 9 -12- 2011

Tab. 2. Creșterea tulpinii Scenedesmus opoliensis AICB 141 în mediu nutritiv

BBM suplimentat cu NaHCO₃

Ziua	BBM + 0,25 g/l NaHCO₃	BBM + 3 g/l NaH	CO₃	BBM + 7 g/l NaH	CO₃	BBM + 10 g/l NaHCO₃
OD	PH	T	OD	PH	T	OD	PH	T	OD	PH	T
0	0,17	7,01	27,8	0,20	8,23	28,0	0,12	8,27	28,0	0,18	8,80	28,2
1	0,18	6,15	27,5	0,24	7,63	27,9	0,17	8,00	28,0	0,07	8,21	28,5
2	0,22	5,77	27,9	0,46	7,53	27,7	0,36	8,07	28,0	0,05	8,15	27,7
3	0,34	6,06	28,2	0,76	7,57	28,2	0,65	7,96	28,0	0,08	8,13	27,5
4	0,45	6,40	28,5	0,97	7,62	27,9	0,88	7,97	27,8	0,13	8,12	27,7
5	0,65	6,30	28,0	1,21	7,79	27,6	1,10	7,96	27,8	0,29	8,11	28,0
6	0,88	6,39	27,7	1,47	7,69	27,8	1,39	7,97	27,9	0,35	8,10	28,2
7	1,12	6,43	27,2	1,61	7,64	28,0	1,73	7,96	27.9	0,37	8,10	28,5
8	1,22	6.40	27,6	1,75	7,61	28,1	1,94	7,91	27,8	0,36	8,10	28,3
9	1,35	6,39	28,0	1,93	7,54	28,2	2,22	7,89	28,0	-	-
10	1,46	6.38	28,2	1,98	7,66	27.9	2,21	7,88	28,0	-	-
11	1,54	6,38	28,5	2,00	7,59	27,8	2,23	7,89	27,8	-	-
12	1,55	6,30	28,0	1,99	7,64	28,0	2,23	7,88	27,9	-	-
13	1,54	6,38	28,3	1,98	7,60	28,0	2,21	7,88	28,2	-	-
14	1,53	6,36	28,1	1,98	7,60	27,9	2,20	7,88	28,1			-

OD-densitatea optica; T-temperatura

Datele din tab. 2 demonstrează că se obține o creștere progresivă a ratei de dezvoltare a algelor, exprimată prin Alog₂ OD, direct proporțională cu concentrația de NaHCO₃, în domeniul tolerat de concentrație al NaHCO₃ de la 0,25 g/l până la 7 g/l. Peste această concentrație a NaHCO₃, de 7 g/l, are loc o inhibare puternică a creșterii algelor și moartea celulelor algale (care a fost observată la microscopie optică).

Mediul BBM a fost suplimentat și cu NaNO3, întrucât studiile efectuate au demonstrat dependența ratei de acumulare de biomasă de sursa de azot disponibilă. S-a lucrat cu mediu BBM modificat prin suplimentare cu bicarbonat de sodiu până la 2 g/l și azotit de sodiu până la 2 g/l.

Tulpina S. opoliensis AICB 141 a fost multiplicată în mediu BBM modificat, prin utilizarea unui fotobioreactor Fotobiostat PBR - 2S Sartorius, Germania, care a fost umplut axenic cu mediu BBM suplimentat, steril și inoculat cu inocul realizat pe mediu nutritiv BBM modificat, obținut prin cultivare în pahare Erlenmeyer aerate prin agitare la temperatura ambiantă.

Condițiile de creștere asigurate în fotobioreactor au fost: a) volumul suspensiei algale: 3 I; b) temperatura de lucru: 25 - 30°C; c) radiația activă 30-700 nm; d) fluxul luminos: 500-1000 Im; e) : 120 - 240 μΕ / m²s; f) barbotarea de amestec sintetic CO₂, 14% O₂ și 79% N₂ la un debit de 20 ml/min.

fotosinteti

: 7%

Ο 9 -12- ZOII

Fotobioreactorul s-a utilizat în sistem semicontinuu turbidostat. Operarea fotobioreactorului a avut loc după următorul program: (/) s-a pornit fotobioreactorul în sistemului “șarjă” și s-au continuat toate operațiile standard până când suspensia de biomasă a ajuns la finele fazei exponențiale; (ii) s-a trecut fotobioreactorul în regimul de operare turbidostat, ceea ce înseamnă că turbiditatea (OD) a devenit parametru de referință menținut la o valoare constantă prin programul fotobioreactorului, care comanda pornirea / oprirea pompei de alimentare a fotobioreactorului cu mediu nutritiv proaspăt, respectiv pompa de ieșire, care comandă scoaterea de suspensie algală din fotobioreactor. Astfel, în regimul turbidostat fotobioreactorul funcționează ca un reactor continuu cu agitare în regim staționar. Media zilnică a suspensiei microalgale extrase din turbidostat a fost de 300 ml. In suspensia de alge s-au determinat lipidele prin analiză termogravimetrică.

In aceste condiții de lucru s-a determinat o viteză exponențială de creștere: de 0,342 zile ’¹, un timp de dublare 2,027 zile, 43...45% lipide în biomasă, la o viteză de creștere de 0,6...0,7 g biomasă / litru mediu / zi, corespunzător unei acumulări de lipide de 250...315 mg / litru mediu / zi, cu o rată de fixare a bioxidului de carbon de 1 ...1,1 mmoli CO2/litru mediu/oră.

Rezultatele obținute demonstrează faptul că tulpina de Scenedesmus opoliensis AICB 141 prezintă caracteristici superioare față de cele revendicate pentru alte tulpini. Tulpina Scenedesmus producto-capitatus, depozitată sub numărul KCTC 11336BP, și protejată prin cererea de brevet SUA 2011/0076749 prezintă o rată a fixării bioxidului de carbon de 0,091 ... 0,454 mmol / litru mediu cultură / hr. Cererea de brevet SUA 2011/0091945 se referă la un procedeu prin care se stimulează acumularea de lipide în celulele unor tulpini algale, de la 13,4 mg/l până la 58,4 mg/l.

Algele s-au recoltat din mediul de cultură prin electrofloculare. Aceasta s-a realizat prin aplicarea unei tensiuni continue de 19 V, la o intensitate a curentului de 0,85A, pe un catod de cărbune polarizat față de un anod din aliaj de fier (oțelcarbon), amplasat într-o coloană de suspensie. Ionii de Fe rezultați prin electroliză, ca și bulele de oxigen format pe suprafața anodului au determinat separarea biomasei algale. înlăturarea suplimentară a apei s-a realizat prin filtrarea biomasei algale. Din biomasa umedă uleiul algal a fost extras ultrasonic timp de 15 min la 35 kHz, cu un amestec cloroform : metanol (1:2), aplicat în raport 22,5 părți biomasă uscată la 15 părți solvent. In final s-a procedat la evaporarea și recuperarea solventului și la separarea uleiului algal.

Caracteristicile fizico-chimice ale uleiului algal de S. opoliensis AICB 141

OV 2 Ο 1 1 - Ο 1 3 7 5 - Ο 9 -12- 2011

Tab. 3. Caracteristicile fizico-chimice ale uleiului algal de Scenedesmus opoliensis AICB 141.

Nr. crt.	Caracteristici fizico chimice	U.M.	Valoare
1.	Aspect, la 20°C	-	lichid limpede, fara sedimente
2.	Densitatea la 15°C	g/cm³	0,916-0,930
3.	Indice de aciditate	mg KOH/g	0,31
4.	Conținut de cenușa	%	0,054
5.	Conținut de apa	%	0,12
6	Indice de iod	g 1/1 OOg	112-120
7	Indice de saponificare	mgKOH/100g	184-196

In uleiul algal s-a determinat compoziția de acizi grași prin analiza gazcromatografică a esterilor metilici. In tab. 4 este prezentată compoziția de acizi grași din uleiului de S. opoliensis AICB 141.

Tab. 4. Compoziția acizilor grași din uleiului de S. opoliensis AICB 141

Denumire acid	Concentrație %
C16:0	35,71
C16: 1 trans	1,02
C16:1 cis	0,34
C18:0	6,32
C18:1 trans	0
C18:1 cis	45,42
C18:2 cis	0
C18:2 trans	2,97
C18:3n6	0,08
C18:3n3	0,35
C18:3n4	0,32

Proporția de peste 87% acizi grași C16, C18 și C18:1 este convenabilă transformării în biodiesel (prin transesterificare), diesel din surse regenerabile (prin hidroliza grăsimilor, separarea și decarboxilarea acizilor grași și hidrogenarea amestecului de hidrocarburi rezultat) și combustibili pentru aviație - prin hidroprocesarea acizilor grași pentru producerea kerosenului parafinic sintetic.

Claims

Revendicări

1. Tulpina de Scenedesmus opoliensis AICB 141 caracterizată prin aceea că este depozitată la Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) cu numărul de depozit CCAP 276/24, acumulează 43...45% lipide în biomasă, cu un conținut de

87.. . 89% esteri ai acizilor grași C16, C18 și C18:1, la o viteză de creștere de 0,6...0,7 g biomasă / litru mediu / zi, corespunzător unei acumulări de lipide de

250.. .315 mg / litru mediu / zi, cu o rată de fixare a bioxidului de carbon de 1 ...1,1 mmoli CO₂/ litru mediu / oră și cu un timp de dublare de 2,027 zile.
2. Procedeul de obținere a uleiului algal prin cultivarea tulpinii S. opoliensis AICB 141 CCAP 276/24 caracterizat prin aceea că este alcătuit din următoarele etape: prepararea unui mediu de cultură BBM, modificat prin suplimentare cu bicarbonat de sodiu până la 2 g/l și azotit de sodiu până la 2 g/l; inocularea mediului cu suspensie algală în mediu BBM suplimentat cu bicarbonat de sodiu, 10⁶ufc/rnl, în raport de 1 parte inocul la 9 părți mediu axenic; cultivarea micro-algelor timp de

10.. 12 zile, la o temperatură de lucru: 28 - 30°C, la o intensitatea radiației fotosintetice de 240 peinsteini / m² /s și prin barbotarea unui amestec sintetic de gaze conținând 7% CO₂, la un debit de 20 ml/min; electroflocularea suspensiei algale prin aplicarea unei tensiuni continue de 19 V, la o intensitate a curentului de 0,85A, pe un catod de cărbune polarizat față de un anod din aliaj de fier; filtrarea biomasei algale floculate pentru înlăturarea suplimentară a apei; extracția ultrasonică, timp de 15 min la 35 kHz, a uleiului algal cu un amestec cloroform : metanol, 2:1, aplicat în raport 22,5 părți biomasă uscată la 15 părți solvent; evaporarea și recuperarea solventului și separarea uleiului algal.