RO116202B1 - Procedeu de obţinere a proteinelor microbiene prin biotransformarea unor deşeuri vegetale - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a proteinelor microbiene prin biotransformarea unor deşeuri vegetale, care constă în biosinteza complexului de enzime celulolitice, prin cultivarea submersă, în sistem discontinuu, a unei tulpini de Aspergillus niger, în mediu nutritiv conţinând 1...2 % ciocălăi de porumb măcinaţi şi 2...3 % şrot de soia, la pH acid, urmată de obţinerea preparatului enzimatic prin decantarea, centrifugarea sau atomizarea mediului fermentat, hidroliza enzimatică a unui amestec conţinând 2% substrat vegetal pretratat mecanic, termic prin uscare la 90...100°C şi chimic cu 1...2 % NaOH sau HSO, concentraţia enzimei adăugate fiind cuprinsă între 50 şi 100 UC/g substrat, faza a treia constând în fermentaţia produselor de hidroliză prin inocularea amestecului cu o cultură pură sau mixtă de drojdii din genurile Candida şi Saccharomyces, cum ar fi speciile Candida robusta, Candida scotii, Saccharomyces diastaticus, S. cerevisiae şi menţinerea bioprocesului timp de 24...48 h la temperatura de 28...30°C, agitare la 200...400 rpm, aerare 0,3...0,5 1/l min şi presiune 0,3...0,5 at, etapa finală constând în condiţionarea biomasei de drojdie prin centrifugare la 2000...4000 rpm, timp de 20...30 min şi uscare la 100...105°C, timp de 2...4 h.

Description

RO 116202 B invenția se referă la un procedeu de obținere a proteinelor microbiene prin biotransformarea unor deșuri vegetale [agricole și industriale], cu ajutorul unor tulpini de Aspergillus niger și de drojdii din genurile Candida și Saccharomyces.

Domeniile posibile de aplicare a acestui procedeu sunt zootehnia și depoluarea mediului înconjurător.

Până în prezent, pe plan mondial nu a fost elaborat un procedeu eficient de obținere a proteinelor microbiene sau a altor produse biologic active, cu excepția etanolului.

Conform datelor din literatură, conversia deșeurilor vegetale în proteine vegetale reprezintă de fapt, hidroliza acestor deșeuri [și în cea mai mare parte a celulozei pe care o conțin) până la o combinație de substanțe biodegradabile, care servesc apoi ca substrat nutritiv pentru diverse microorganisme fermentative. în cazul apelării la metoda - hidrolizei enzimatice a produselor vegetale, randamentul tehnologiei depinde de mai mulți factori, cum ar fi originea enzimei, compoziția complexului celulolitic, activitatea enzimei și concentrația substratului, metoda de condiționare a preparatului enzimatic etc.

Procedeul de obținere a proteinelor microbiene prin biotransformarea unor deșuri vegetale, conform invenției, constă în biosinteza complexului de enzime celulolitice prin cultivarea submersă, în sistem discontinuu, a unei tulpini de Aspergillus niger în mediu nutritiv conținând 1 ...2 g % ciocălăi de porumb măcinați și 2...3 g % șrot de soia la pH acid, urmată de obținerea preparatului enzimatic prin decantarea, centrifugarea sau atomizarea mediului fermentat, hidroliza enzimatică a unui amestec conținând 2% substrat vegetal pretratat mecanic, termic prin uscare la 9O...1OO°C și chimic cu 1 ...2 % NaOH sau H_aS0₄, activitatea enzimei adăugate fiind cuprinsă între 50... 100 Ucyg substrat, faza a treia constând în fermentația produselor de hidroliza prin inocularea amestecului cu o cultură pură sau mixtă de drojdii din genurile Candida și Saccharomyces cum ar fi speciile Candida robusta. Candida scoții, Saccharomyces diastaticus, S.cerevisiae, și menținerea bioprocesului timp de 24...48 ore la temperatura de 28...3O°C, agitare la 200...400 rpm, aerare 0,3...0,5 l/l min. Și presiune 0,3...0,5 atm., etapa finală constând în condiționarea biomasei de drojdie prin centrifugare la 2000...4000 rpm timp de 20...30 min și uscare la 1OO...1O5°C, timp de 2...4 h.

Avantajul invenției constă în aceea că se obțin proteine microbiene prin biotransformarea unor deșuri vegetale (agricole și industriale), utilizându-se ca materii prime, aproape în totalitate, numai produse naturale și cu prețuri foarte reduse, fără consum mare de energie (nefiind necesară asigurarea unor valori înalte de presiune și temperatură.

Se prezintă, în continuare, un exemplu de realizare a invenției

a] Biosinteza complexului enzimatic

Se realizează în sistem discontinuu, prin cultivarea submersă a unei tulpini de Aspergillus niger din colecția ICCF, într-un mediu cu șrot de soia și ciocălăi de porumb măcinați, timp de 96..120 h, la temperatura de 3O...32°C, presiune 0,2...0,5 atm, agitare 200...240 rpm, aerare 0,4...0,5 l/l min., realizată treptat în decurs de 24...36 h de la pornire.

Ca antispumant, se utilizează ulei de floarea-soarelui [ulei vegetal) adăugat steril în volume de 100 ml, în una sau două reprize, în decurs de 96...120 h.

RO 116202 B

Inoculul se prepară în condiții de laborator, prin cultivarea tulpinii fungice în baloane Erlenmayer, timp de 24...48 h la 3O...32°C, pH 4,0...5,0 pe agitator rotativ cu 210...240 rpm, mediul de inocul având compoziția identică cu cea a mediului de fermentație. La sfârșitul perioadei de cultivare, mediul are aspectul unei suspensii 50 coloidale cu miceliu lizat, omogen dispersat în masa mediului, care în repaus nu sedimentează.

Pentru realizarea hidrolizei enzimatice a unor deșuri vegetale, complexul celulozolitic se poate utiliza după purificare sau după atomizarea mediului fermentat, sau prin utilizarea integrală a mediului în care s-au biosintetizat celulele, deci în formă de 55 suspensie coloidală.

b] Hidroliza enzimatică a unui amestec de tulpini și frunze de urzică.

Pretratarea substratului vegetal

Substratul măcinat și uscat timp de 8...12 h (la 90. ,.105°C] a fost apoi sitat, pentru îndepărtarea fragmentelor de dimensiuni mai mari și a pufului. 6o

Pretratarea termică (fierbere timp de 1 h) și chimică (cu soluție 40% NaOH] s-a realizat direct în vasul pilot, înainte de începerea hidrolizei enzimatice propriu-zise.

Hidroliza enzimatică s-a realizat în bioreactor cu volum util de 60 I, în următoarele condiții:

- concentrație substrat 2% (1,2 kg urzică uscată, măcinată și sitată + 58,8 I 65 apă);

- fierbere timp de 1 h;

- răcire la 4O...45°C;

- suplimentar cu 300...400 ml NaOH 40%;

- menținere 2 h la 43...45°C, cu agitare continuă; 70

- corectarea pH-ului la 4,5 cu HCI;

- sterilizare 1 h la 125,..13O°C;

- răcire la 43...45°C;

- suplimentare cu preparat celulozic [activit. 100...150 Uc^/g substrat];

- menținerea amestecului de reacție timp de 44.. .48 h la 43.. ,45°C, cu agitare 75 continuă, aerare 0,1...0,2 l/min și suprapresiune 0,2...0,3 atm;

- se prelevează periodic probe pentru determinarea zahărului reducător.

c] Fermentația produselor de hidroliza

Pentru utilizarea hidrolizatelor de urzică drept substrat nutritiv în obținerea biomasei proteice, s-a folosit un amestec de drojdii aparținând genurilor Candida și so Saccharomyces incluse în Colecția de Microorganisme a ICCF.

în cazul fiecărei tulpini utilizate, preinocolul de drojdii s-a realizat prin repicarea unei culturi vegetative pe 5...7 tuburi conținând mediu Sabouraud solid înclinat. Incubarea preinocolului s-a desfășurat pe parcursul a 24,..48 h la 29...32°C, static.

Inoculul de drojdii s-a obținut în cultură submersă, în condiții de laborator, în 85 flacoane Erlenmayer conținând mediu Sabouraud lichid, menținute pe agitator rotativ cu 210.. 240 rpm timp de 18...24 h la 28...30°C, atingând în finalul incubării o valoare 0.0.=7,0...8,0. Proporția de inocul utilizată a atins 7.,.9 %, fiind adăugată peste amestecul care conține produsele de hidroliza enzimatică, după răcirea acestui amestec la 28...30°C. 90

Anterior inoculării cu drojdii, mediul de fermentație la nivel pilot s-a suplimentat cu peptonă 0,5.,.1,0 și glucoza 0,5,..1,0%.

Claims (1)

1. RO 116202 B

   Parametrii de biosintezâ s-au stabilit astfel:

   - temperatura - 28...3O°C;

   95 - presiunea 0,4,..0,5 atm;

   - agitare continuă (210...240 rpm);

   - aerare 0,3...0,5 l/l min;

   - se prelevează periodic probe pentru determinări analitice (zahăr reducător, azot total, proteină, greutatea biomasei uscate],

   100 Studiul analitic asupra produsului final de biosinteză a arătat o creștere a substanței uscate de la 1,58% (urzică uscată și măcinată] la 13,3%, deci de cca. 8,5 ori și o creștere a conținutului proteic cu 31,75 %.

   Studiile privind toxicitatea acută (DL₅₀) s-au făcut pe șoareci albi, masculi din linia H, în greutate de 18..,22 g,pe o perioadă de 2 săptămâni, prin administrarea 105 produsului pe cale orală.

   Produsul testat s-a obținut prin centrifugarea mediului fermentat și uscarea sedimentului în etuvă, la 9O...1O5°C. Toxicitatea acută a produsului este de 6,25 g/kg, deci produsul obținut prin bioconversie se încadrează în categoria produselor cu toxicitate slabă.

   110

   Revendicare

   Procedeu de obținere a proteinelor microbiene prin biotransformarea unor deșeuri vegetale, caracterizat prin aceea că, constă în biosintezâ complexului de ii5 enzime celulolitice prin cultivarea submersă, în sistem discontinuu, a unei tulpini de Aspergillus niger în mediu nutritiv conținând 1 ...2 % ciocălăi de porumb măcinați și 2...3 % șrot de soia la pH acid, urmată de abținerea preparatului enzimatic prin decantarea, centrifugarea sau atomizarea mediului fermentat, hidroliza enzimatică a unui amestec conținând 2% substrat vegetal pretratat mecanic, termic, prin uscare 120 la 9O...1OO°C, și chimic, cu 1...2 % NaOH sau Η_Ξ60₄, activitatea enzimei adăugate fiind cuprinsă între 50 și 100 Uc_x/g substrat, faza a treia constând în fermentația produselor de hidroliză prin inocularea amestecului cu o cultură pură sau mixtă de drojdii din genurile Candida și Saccharomyces cum ar fi speciile Candida robusta, Candida scoții, Saccharomyces diastaticus, Sacharomyces cerevisiae și menținerea 12 5 bioprocesului timp de 24...48 h la temperatura de 28,..3O°C, agitare la 200...400 rpm, aerare 0,3...0,5 l/l min. și presiune 0,3...0,5 atm., etapa finală constând în condiționarea biomasei de drojdie prin centrifugare la 2000...4000 rpm timp de 20...30 min și uscare la 10D...105°C, timp de 2...4 h.

   Președintele comisiei de examinare: chim. Hăulică Mariela

   Examinator: biochim. Crețu Adina

   Editare și tehnoredactare computerizată - OSIM

   Tipărit la: Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci