PT99114B - PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES DIRECTED TO TROMBIN-FORMED COMPLEXES AND TROMBIN INHIBITORS - Google Patents
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Abstract
Description
Ο invento diz respeito a anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina e seus derivados, processos para a sua preparação, linhas celulares de hibridoma secretoras dos referidos anticorpos monoclonais e processos para a preparação das linhas celulares de hibridoma. Ainda, o invento estã relacionado com a utilização dos anticorpos monoclonais e/ou seus derivados para a determinação do complexo trombina/hirudina assim como kits de testes compreendendo os referidos anticorpos monoclonais e/ou seus derivados.The invention concerns monoclonal antibodies that are directed against the thrombin / hirudin complex and its derivatives, processes for their preparation, hybridoma cell lines secreting said monoclonal antibodies and processes for the preparation of hybridoma cell lines. In addition, the invention relates to the use of monoclonal antibodies and / or their derivatives for the determination of the thrombin / hirudin complex as well as test kits comprising said monoclonal antibodies and / or their derivatives.
Fundamento do inventoBackground of the invention
Um sistema hemostãtico que funcione eficazmente é de necessidade vital para o organismo dos mamíferos. Nos organismos saudáveis, os defeitos do sistema vascular sanguíneo, e.g. lesões vasculares, são reparadas num processo de dois passos: a agregação dos trombócitos é seguida da formação de um coágulo de fibrina numa cascada de enzimas com a participação de vários factores de coagulação do sangue. A maior parte destes factores são proteases serina, por exemplo trombina que cataliza a reacção do fibrinogénio para dar fibrina. O sistema de coagulação é contrariado pelo sistema fibrinolítico envolvendo entre outros a protease plasmina que cliva a fibrina. Os sistemas de coagulação e fibrinolítico estão geralmente num equilíbrio dinâmico. No entanto nos casos em que o potencial fibrinolítico do organismo é perturbado ou insuficiente, por exemplo em doentes que sofrem de tromboembolismos ou complicações pós-operatõrias, é indispensável dar ao organismo anticoagulantes para evitar a formação de fibrina e de agentes trombolíticos para dissolver os trombos formados.A hemostatic system that works effectively is a vital necessity for the mammalian organism. In healthy organisms, defects in the blood vascular system, eg vascular lesions, are repaired in a two-step process: aggregation of thrombocytes is followed by the formation of a fibrin clot in an enzyme cascade with the participation of various blood clotting factors . Most of these factors are serine proteases, for example thrombin that catalyzes the reaction of fibrinogen to give fibrin. The coagulation system is counteracted by the fibrinolytic system involving, among others, the plasmin protease that cleaves fibrin. Coagulation and fibrinolytic systems are generally in dynamic balance. However, in cases where the organism's fibrinolytic potential is disturbed or insufficient, for example in patients suffering from thromboembolisms or post-operative complications, it is essential to give the body anticoagulants to prevent the formation of fibrin and thrombolytic agents to dissolve thrombi formed.
A hirudina, um anticoagulante que ocorre naturalmente nas sanguessugas (Hirudi medicinalis), é um inibidor potente e iHirudin, an anticoagulant that occurs naturally in leeches (Hirudi medicinalis), is a potent inhibitor and i
específico da trombina, evitando a clivagem do fibrinogénio e subsequente formação de coágulos de fibrina. A hirudina reage muito rapidamente com a α-trombina para formar um complexo não covalente muito forte (K^« 1-0,01 pM) que é extremamente estável e enzimaticamente totalmente inactivo. Forma descritas várias variantes da hirudina estreitamente relacionadas, cada uma delas contendo 65 ou 66 aminoácidos, por exemplo as variantes designadas hirudina variante 1 (HV1), hirudina variante 2 (HV2), hirudina variante PA (HV3) e des-(Val)2-hirudina. As variantes diferem umas das outras numa série de aminoácidos, mas todas têm em comum uma acumulação de aminoácidos hidrofóbicos no extremo N, uma acumulação de aminoácidos polares no extremo C, um resíduo tirosina (Tir 63) presente como mono-éster de sulfato, três pontes dissulfureto e a actividade anticoagulante. Recentemente, foram clonados cDNAs e genes sintéticos codificadores da hirudina e expressos em hospedeiros microbianos. As variantes de hirudina recombinantes não possuem o grupo monoéster de sulfato em Tir63 e são portanto também referidas como dessulfato-hirudinas. No entanto, elas apresentam propriedades biológicas pelo menos equivalentes às das hirudinas naturais sulfatadas.specific for thrombin, preventing fibrinogen cleavage and subsequent formation of fibrin clots. Hirudin reacts very quickly with α-thrombin to form a very strong non-covalent complex (K ^ «1-0.01 pM) that is extremely stable and enzymatically totally inactive. Several closely related hirudin variants have been described, each containing 65 or 66 amino acids, for example the variants designated hirudin variant 1 (HV1), hirudin variant 2 (HV2), hirudin variant PA (HV3) and des- (Val) 2 -hirudin. The variants differ from one another in a series of amino acids, but all have in common an accumulation of hydrophobic amino acids at the N-terminus, an accumulation of polar amino acids at the C-terminus, a tyrosine residue (Tir 63) present as a sulphate mono-ester, three disulfide bridges and anticoagulant activity. Recently, cDNAs and synthetic genes encoding hirudin have been cloned and expressed in microbial hosts. Recombinant hirudin variants do not have the sulfate monoester group in Tir63 and are therefore also referred to as desulfate-hirudins. However, they have biological properties at least equivalent to those of sulfated natural hirudins.
A hirudina tem um grande potencial para futuro uso terapêutico devido â sua inibição selectiva da trombina conjuntamente com a sua baixa toxicidade e a ausência de efeitos secundários imunológicos. No entanto, a aplicação terapêutica de hirudina com êxito também requere um sistema para controle da actividade assim como do progresso da terapia. Ainda, é desejável poder-se determinar a necessidade real do tratamento com hirudina. Uma solução para estes problemas seria o desenvolvimento de anticorpos contra o complexo formado pela trombina e hirudina que poderão ser empregues para detectar a formação de trombina mesmo em pequenas quantidades.Hirudin has great potential for future therapeutic use due to its selective inhibition of thrombin in conjunction with its low toxicity and the absence of immunological side effects. However, successful therapeutic application of hirudin also requires a system for controlling activity as well as the progress of therapy. Furthermore, it is desirable to be able to determine the real need for treatment with hirudin. A solution to these problems would be the development of antibodies against the complex formed by thrombin and hirudin that can be used to detect the formation of thrombin even in small amounts.
Objectivo do inventoPurpose of the invention
Constitui um objectivo do presente invento produzir anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexotrombina/hirudina. Este objectivo é conseguido usando hirudina acoplada a um veículo adequado ou o complexo trombina/hirudina para imunizar um mamífero adequado e fundido as células secretoras de anticorpos do referido mamífero com células de uma linha celular contínua, produzindo assim células de hibridoma que secretam os anticorpos monoclonais pretendidos. Os anticorpos monoclonais do invento são úteis para uma série de fins de diagnóstico e terapêu ticos, por exemplo para a detecção precoce da formação de trombina e trombose.It is an object of the present invention to produce monoclonal antibodies that are directed against complexothrombin / hirudin. This objective is achieved by using hirudin coupled to a suitable vehicle or the thrombin / hirudin complex to immunize a suitable mammal and fuse the antibody-secreting cells of said mammal with cells from a continuous cell line, thereby producing hybridoma cells that secrete monoclonal antibodies. intended. The monoclonal antibodies of the invention are useful for a number of diagnostic and therapeutic purposes, for example for the early detection of the formation of thrombin and thrombosis.
Descrição do invento invento diz respeito a anticorpos monoclonais dirigidos contra o complexo trombina/hirudina e seus derivados que retêm a especificidade do anticorpo de onde derivam.Description of the invention Invention concerns monoclonal antibodies directed against the thrombin / hirudin complex and its derivatives which retain the specificity of the antibody from which they are derived.
No presente pedido de patente, o termo hirudina, quando não seja de outra forma especificado, destina-se a englobar (1) todas as variantes naturais ou sintéticas e derivados de hirudina, tais como fragmentos da hirudina e (2) toas as variantes de hirudina recombinante (dessulfato-hirudina) e derivados de hirudina recombinante (dessulfato-hirudina), tais como dessulfato-hirudinas encurtadas no extremo C, as quais estão descritas na literatura iu são obtidas por métodos de tecnologia de DNA recombinante.In the present patent application, the term hirudin, when not otherwise specified, is intended to encompass (1) all natural or synthetic variants and derivatives of hirudin, such as fragments of hirudin and (2) all variants of recombinant hirudin (desulfate-hirudin) and recombinant hirudin derivatives (desulfate-hirudin), such as C-shortened desulfate-hirudins, which are described in the literature iu are obtained by recombinant DNA technology methods.
Sao exemplos de tais hirudinas:Examples of such hirudins are:
- χ’ - (a) uma variante da hirudina do tipo HV1 com a fórmula- χ ’- (a) a variant of hirudin type HV1 with the formula
H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly20H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly20
-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn30-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn30
-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu40-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu40
-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val50-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val50
-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser60-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser60
-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(R)-Leu-Gln-OH, (I) em que (dessulfato-hirudina)-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr (R) -Leu-Gln-OH, (I) where (desulfate-hirudin)
- (R) é o grupo hidroxilo fenólico da Tir- (R) is the phenolic hydroxyl group of Tir
- Vali é substituído por Leu e Val2 por Tre- Vali is replaced by Leu and Val2 by Tre
- a molécula completa é encurtada por Gln65 ou ou por Leu64 e Gln65;- the complete molecule is shortened by Gln65 or or by Leu64 and Gln65;
(b) uma variante de hirudina do tipo HV2 com a fórmula(b) a variant of HV2 type hirudin with the formula
H-Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly20H-Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly20
-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn30-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn30
-Val-Cys-Gly-Lys-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu40 (II)-Val-Cys-Gly-Lys-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu40 (II)
-Gly-Ser-Asn-Gly-Lys-Gly-Asn-Gln-Cys-Val50-Gly-Ser-Asn-Gly-Lys-Gly-Asn-Gln-Cys-Val50
-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser60-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser60
-His-Asn-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(R)-Leu-Gln-OH, em que-His-Asn-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr (R) -Leu-Gln-OH, where
- (R) é o grupo hidroxilo fenólico da Tir (dessulfato-hirudina) ou um grupo -O-SO3H, e/ou- (R) is the phenolic hydroxyl group of Tir (desulfate-hirudin) or an -O-SO 3 H group, and / or
- Ilel é substituido por Vai e Tre2 por Vai ou- Ilel is replaced by Vai and Tre2 by Vai or
- Asn47 é substituido por Lis ou Arg ou His ou- Asn47 is replaced by Lis or Arg or His or
- Tir63 é substituido por Glu ou Asp;- Tir63 is replaced by Glu or Asp;
(c) uma variante da hirudina do tipo PA (HV3) com a fórmula ** ι...(c) a variant of hirudin type PA (HV3) with the formula ** ι ...
H-Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly20H-Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly20
-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn30-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn30
-Val-Cys-Gly-Lys-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu40 (ui)-Val-Cys-Gly-Lys-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu40 (wm)
-Gly-Ser-Gln-Gly-Lys-Asp-Asn-Gln-Cys-Val50-Gly-Ser-Gln-Gly-Lys-Asp-Asn-Gln-Cys-Val50
-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser60-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser60
-His-Asn-Gln-Gly-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Asp-Ala-Tyr(R)-Asp-Glu-OH, em que (R) é o grupo hidroxilo fenólico de Tir (dessulfato-hirudina ou um grupo -O-SC>3H, e/ou-His-Asn-Gln-Gly-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Asp-Ala-Tyr (R) -Asp-Glu-OH, where (R) is the phenolic hydroxyl group of Tir (desulfate-hirudin or a group -O-SC> 3 H, and / or
- a cadeia polipeptídica é encurtada no extremo C em 18, 10, 9,- the polypeptide chain is shortened at the C end by 18, 10, 9,
6, 4 ou 2 aminoácidos ou6, 4 or 2 amino acids or
- a cadeia polipeptídica é encurtada no extremo N em 1 ou 2 aminoácidos.- the polypeptide chain is shortened at the N end by 1 or 2 amino acids.
Os anticorpos monoclonais do invento foram testados relativamente às propriedades pretendidas, preferencialmente por um radio-imunoensaio ou imunoensaio com enzima. Por exemplo, pode ser realizado um imunoensaio com enzima em que um veículo adequado como seja uma placa de microtitulação é revestida com um anticorpo monoclonal anti-a-trombina, e.g. um anticorpo monoclonal anti-a-trombina, e.g. um anticorpo monoclonal anti-a-trombina que nao interfere com a ligação da hirudina à trombina e o complexo trombina/hirudina. Em seguida adicionou-se um anticorpo monoclonal marcado com enzima do invento e uma solução de substra to e a ligação do anticorpo monoclonal de acordo com o inventofoi detectada por determinação da marca enzimática do complexo imune ligado ao veículo.The monoclonal antibodies of the invention have been tested for desired properties, preferably by radioimmunoassay or enzyme immunoassay. For example, an enzyme immunoassay can be performed in which a suitable vehicle such as a microtiter plate is coated with an anti-a-thrombin monoclonal antibody, eg an anti-a-thrombin monoclonal antibody, eg an anti-a monoclonal antibody -thrombin that does not interfere with the binding of hirudin to thrombin and the thrombin / hirudin complex. Then an enzyme-labeled monoclonal antibody of the invention and a substrate solution and the binding of the monoclonal antibody according to the invention were detected by determining the enzyme label of the immune complex bound to the vehicle.
São preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina variante 1 (HV1) e seus derivados. São igualmente preferidos anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina recombinante (rHV) e seus derivados. São especialmente preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina variante 1 recombinante (rHVl) e seus derivados.Monoclonal antibodies that are directed against the thrombin / hirudin complex in which the hirudin is hirudin variant 1 (HV1) and its derivatives are preferred. Also preferred are monoclonal antibodies that are directed against the thrombin / hirudin complex in which the hirudin is recombinant hirudin (rHV) and its derivatives. Monoclonal antibodies directed against the thrombin / hirudin complex in which the hirudin is recombinant variant 1 hirudin (rHV1) and its derivatives are especially preferred.
Uma vez que o complexo trombina/hirudina contem os dois componentes trombina e hirudina, os anticorpos monoclonais reactivos com o complexo pode reconhecer a fracção da hirudina ou da trombina do complexo ou um determinante que engloba partes de ambas as fracções. Ainda, os anticorpos monoclonais anti-complexo trombina/hirudina pode reconhecer os chamados neo-determinantes específicos do complexo resultes de alterações conformacionais que ocorrem durante a formação do complexo trombina/hirudina.Since the thrombin / hirudin complex contains the two components thrombin and hirudin, monoclonal antibodies reactive with the complex can recognize the hirudin or thrombin fraction of the complex or a determinant comprising parts of both fractions. In addition, monoclonal antibodies to the thrombin / hirudin complex can recognize the so-called specific neo-determinants of the complex resulting from conformational changes that occur during the formation of the thrombin / hirudin complex.
Uma realização preferida do presente invento diz respeito a anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina e que reconhecem determinantes da fracção hirudina e seus derivados. São preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina variante 1 (HV1) e que reconhecem determinantes da fracção HV1 no complexo. São também preferidos anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hírudina em que a hirudina é hirudina recombinante (rHV) e que reconhecem determinantes da fracção rHV no complexo e seus derivados. São particularmente preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina recombinante variante 1 (rHVl) e que reconhece a fracção rHVl no complexo e seus derivados. Neste último grupo de anticorpos monoclonais são preferidos os anticorpos monoclonais que reconhecem determinantes dentro do domínio central N-terminal da fracção rHVl no complexo trombina/rHVl, preferencialmente determinantes compreendendo os resíduos de aminoácidos 1 a 43 da fracção rHVl e seus derivados. Um exemplo de um anticorpo monoclonal particularmente preferido e seus derivados é o anticorpo monoclonal designado MAb 4158-81-7 e seus derivados.A preferred embodiment of the present invention concerns monoclonal antibodies that are directed against the thrombin / hirudin complex and that recognize determinants of the hirudin fraction and its derivatives. Monoclonal antibodies that are directed against the thrombin / hirudin complex in which the hirudin is hirudin variant 1 (HV1) and which recognize determinants of the HV1 fraction in the complex are preferred. Monoclonal antibodies are also preferred which are directed against the thrombin / hírudin complex in which hirudin is recombinant hirudin (rHV) and which recognize determinants of the rHV fraction in the complex and its derivatives. Monoclonal antibodies which are directed against the thrombin / hirudin complex in which the hirudin is recombinant hirudin variant 1 (rHV1) and which recognizes the rHV1 fraction in the complex and its derivatives are particularly preferred. In the latter group of monoclonal antibodies, monoclonal antibodies that recognize determinants within the central N-terminal domain of the rHVl fraction in the thrombin / rHVl complex are preferred, preferably determinants comprising amino acid residues 1 to 43 of the rHVl fraction and its derivatives. An example of a particularly preferred monoclonal antibody and its derivatives is the monoclonal antibody designated MAb 4158-81-7 and its derivatives.
Uma outra realização preferida do presente invento diz respeito a anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina e que reconhecem determinantes da fracção trombina no complexo trombina/hirudina e seus derivados. São preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina variante 1 (HV1) e que reconhece determinantes na fracção trombina no complexo. São também preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina ê hirudina recombinante (rHV) e que reconhecem determinantes da fracção trombina no complexo e seus derivados. São particularmente preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina recombinante variante 1 (rHVl) e que reconhecem a fracção trombina do complexo e seus derivados. Neste último grupo de anticorpos monoclonais são especialmente preferidos os anticorpos monoclonais que reconhecem determinantes da fracção trombina que ficam expostos para ligação ao anticorpo apenas quando a trombina está ligada à hirudina ou a uma superfície sólida mas não reconhecem a trombina livre em solução e seus derivados. Um exemplo de um anticorpo monoclonal particularmente preferido e seus derivados é o anticorpo monoclonal designado MAb 4107-76-1 e seus derivados.Another preferred embodiment of the present invention concerns monoclonal antibodies that are directed against the thrombin / hirudin complex and that recognize determinants of the thrombin fraction in the thrombin / hirudin complex and its derivatives. Monoclonal antibodies which are directed against the thrombin / hirudin complex in which the hirudin is hirudin variant 1 (HV1) and which recognizes determinants in the thrombin fraction in the complex are preferred. Also preferred are monoclonal antibodies that are directed against the thrombin / hirudin complex in which the hirudin is recombinant hirudin (rHV) and which recognize determinants of the thrombin fraction in the complex and its derivatives. Monoclonal antibodies which are directed against the thrombin / hirudin complex in which the hirudin is recombinant hirudin variant 1 (rHV1) and which recognize the thrombin fraction of the complex and its derivatives are particularly preferred. In the latter group of monoclonal antibodies, monoclonal antibodies which recognize determinants of the thrombin fraction are especially preferred and are exposed for binding to the antibody only when thrombin is bound to hirudin or a solid surface but do not recognize free thrombin in solution and its derivatives. An example of a particularly preferred monoclonal antibody and its derivatives is the monoclonal antibody designated MAb 4107-76-1 and its derivatives.
Os derivados de um anticorpo monoclonal do invento retêm a especificidade do anticorpo do qual derivam, i.e. eles retêm o padrão de ligação característico do anticorpo parental. Exemplos de tais derivados são conjugados dos anticorpos monoclonais com uma enzima, uma marca fluorescente, uma marca quimioluminescente, um quelato de metais, partículas paramagnéticas, avidina, biotina ou similares ou anticorpos monoclonais marcados radioactivamente ou fragmentos de anticorpos monoclonais.Derivatives of a monoclonal antibody of the invention retain the specificity of the antibody from which they are derived, i.e. they retain the binding pattern characteristic of the parental antibody. Examples of such derivatives are conjugates of monoclonal antibodies to an enzyme, a fluorescent tag, a chemiluminescent tag, a metal chelate, paramagnetic particles, avidin, biotin or the like or radiolabeled monoclonal antibodies or fragments of monoclonal antibodies.
As enzimas usadas para conjugados de anticorpos do invento são, por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-D-galactosidase, glucose-oxidase, glucoamilase, anidrase carbónica, acetilcolinesterase, lisozima, malato-desidro genase ou glucose-6-fosfato-desidrogenase.Enzymes used for antibody conjugates of the invention are, for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose-oxidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate-dehydro-genase or glucose-6- phosphate dehydrogenase.
As marcas fluorescentes conjugadas com anticorpos do invento podem ser fluoresceína, fluorocromo, rodamina e similaresFluorescent tags conjugated to antibodies of the invention can be fluorescein, fluorochrome, rhodamine and the like
As marcas quimioluminescentes são moléculas orgânicas que emitem luz quando da modificação da estrutura química, e.g. luminol, isoluminol, pirogalol, luciferina e similares.Chemiluminescent tags are organic molecules that emit light upon modification of the chemical structure, e.g. luminol, isoluminol, pyrogallol, luciferin and the like.
São exemplos de quelatos de metais o ácido etilenodiami natetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA), 1,4,8,11-tetrazatetradecano, ácidoExamples of metal chelates are ethylenediamine natetracetic acid (EDTA), diethylene triaminopentacetic acid (DPTA), 1,4,8,11-tetrazatetradecane,
1,4,8,11-tetrazatetradecano-l,4,8,11-tetracético, ãcido 1-oxa-4,7,12,15-tetraza-heptadecano-4,7,12,15-tetracético ou similares1,4,8,11-tetrazatetradecane-1, 4,8,11-tetracetic, 1-oxa-4,7,12,15-tetraza-heptadecan-4,7,12,15-tetracetic acid or similar
Em tais conjugados o anticorpo é ligado ao parceiro de conjugação directamente ou por meio um grupo espaçador ou ligante.In such conjugates the antibody is linked to the conjugation partner directly or by means of a spacer or linker group.
Os anticorpos marcados radioactivamente do invento contêm e.g. iodo radioactivo (123I, 125I, 131I), tritio (3H),The radioactively labeled antibodies of the invention contain eg radioactive iodine ( 123 I, 125 I, 131 I), tritium ( 3 H),
35 . 90 . 99m carbono ( C), enxofre ( S), ítrio ( Y), tecnecio ( Tc) ou similares.35. 90. 99m carbon (C), sulfur (S), yttrium (Y), technecium (Tc) or similar.
Os fragmentos de anticorpos do invento são por exemplo os fragmentos Fab, Fab' ou F(ab')2·The antibody fragments of the invention are for example Fab, Fab 'or F (ab') 2 fragments
Os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são obtidos por processos conhecidos per se em gue as células de uma linha celular de hibridoma secretoras dos anticorpos monoclonais pretendidos são multiplicadas in vitro ou in vivo e, quando necessário, os anticorpos monoclonais obtidos são isolados e/ou convertidos nos seus derivados.The monoclonal antibodies of the invention and their derivatives are obtained by procedures known per se in which cells of a hybridoma cell line secreting the desired monoclonal antibodies are multiplied in vitro or in vivo and, when necessary, the obtained monoclonal antibodies are isolated and / or converted into its derivatives.
A multiplicação in vitro é realizada em meio de cultura adequados, os quais são os meios de cultura convencionais, por exemplo Meio de Eagle Modificação de Dulbecco (DMEM) ou meio RPMI 1640, facultativamente suplementado com um soro de mamífero, e.g. soro fetal de vitela ou micronutrientes e suplementos que mantêm o crescimento, e.g. células de suporte tais como células do exsudado peritoneal de murganho, células do baço, macrõfagos da medula óssea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina, lipoptroteína de baixa densidade, ãcido oleico ou similares.In vitro multiplication is performed in suitable culture media, which are the conventional culture media, for example Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) or RPMI 1640 medium, optionally supplemented with a mammalian serum, eg fetal calf serum or micronutrients and supplements that maintain growth, eg support cells such as mouse peritoneal exudate cells, spleen cells, bone marrow macrophages, 2-aminoethanol, insulin, transferrin, low density lipoptrotein, oleic acid or the like.
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Α produção in vitro proporciona preparações de anticorpos relativamente puras e permite aumentar a escala para dar quantidades maiores dos anticorpos pretendidos. São conhecidas as técnicas para a cultura de células de mamífero em condições de cultura de tecidos e incluem a cultura em suspensão homogénia, e.g. num reactor com entrada de ar ou num reactor com agitação contínua ou cultura de células imobilizada ou aprisionadas, e.g. em fibras ocas, microcápsulas, em microsferas de agarose ou cassetes de cerâmica.In vitro production provides relatively pure antibody preparations and allows scaling to give larger amounts of the desired antibodies. Techniques for culturing mammalian cells under tissue culture conditions are known and include homogeneous suspension culture, eg in a reactor with air inlet or a reactor with continuous agitation or immobilized or trapped cell culture, eg in hollow fibers , microcapsules, in agarose microspheres or ceramic cassettes.
Para isolamento dos anticorpos monoclonais, as imunoglobulinas nos sobrenadantes de cultura são primeiro concentradas e.g. por precipitação com sulfato de amónio, diálise contra material higroscópico como seja polietilenoglicol (PEG), filtração através de membranas selectivas ou similares. Caso seja necessário e/ou pretendido, os anticorpos concentrados são purificados por métodos de cromatografia convencionais·, por exemplo filtração em gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia em DEAE-celulose ou em Proteína A ou cromatografia de imunoafinidade.For isolation of monoclonal antibodies, immunoglobulins in culture supernatants are first concentrated e.g. by precipitation with ammonium sulfate, dialysis against hygroscopic material such as polyethylene glycol (PEG), filtration through selective membranes or the like. If necessary and / or desired, the concentrated antibodies are purified by conventional chromatography methods ·, for example gel filtration, ion exchange chromatography, DEAE-cellulose or Protein A chromatography or immunoaffinity chromatography.
Também podem ser obtidas grandes quantidades dos anticorpos monoclonais pretendidos por multiplicação das células in vivo. Para este fim as células de hibridoma produtoras dos anticorpos pretendidos são injectadas em mamíferos histocompatíveis de forma a provocar o crescimento de tumores produtores de anticorpos. Facultativamente os animais são sensibilizados com um hidrocarboneto, especialmente óleos minerais tais como pristano (tetrametilpentadecano), antes da injecção. Após uma a três semanas os anticorpos são isolados a partir dos fluídos do corpo daqueles mamíferos. Por exemplo, as células de hibridoma derivadas de murganhos Balb/c que produzem os anticorpos monoclonais pretendidos são injectadas intraperitonealmente em murganhosLarge amounts of the desired monoclonal antibodies can also be obtained by multiplying the cells in vivo. To this end, hybridoma cells producing the desired antibodies are injected into histocompatible mammals in order to cause the growth of antibody-producing tumors. Optionally, animals are sensitized with a hydrocarbon, especially mineral oils such as pristane (tetramethylpentadecane), before injection. After one to three weeks, antibodies are isolated from the fluids of those mammals' bodies. For example, hybridoma cells derived from Balb / c mice that produce the desired monoclonal antibodies are injected intraperitoneally into mice
Balb/c facultativamente previamente tratados com pristano e após uma a duas semanas o fluido ascítico é retirado dos animais.Balb / c optionally previously treated with pristane and after one to two weeks the ascitic fluid is removed from the animals.
Os conjugados de anticorpos monoclonais do invento são preparados por métodos conhecidos, e.g. por reacção de um anticor po preparado como descrito atras na presença de um agente de acoplagem, e.g. glutaraldeído , periodato, N,N'-o-fenoilenodimaleimida, N-(m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-[2'-piridilditio]-propionoxi)-succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou similares. Os conjugados com biotina são preparados e.g. por reacção de anticorpos com um éster activado de biotina como seja o éster de N-hidroxi-succinimida. Os conjugados com marcadores fluorescentes ou guimioluminescentes são preparados na presença de um agente de acoplagem, preferencialmente isotiocianato de fluoresceína.The monoclonal antibody conjugates of the invention are prepared by known methods, eg by reaction of an antibody prepared as described above in the presence of a coupling agent, eg glutaraldehyde, periodate, N, N'-o-phenylenedimleimide, N- (m -maleimidobenzoyloxy) -succinimide, N- (3- [2'-pyridyldithio] -propionoxy) -succinimide, N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide or the like. Biotin conjugates are prepared e.g. by reacting antibodies with an activated biotin ester such as the N-hydroxy succinimide ester. Conjugates with fluorescent or guimioluminescent labels are prepared in the presence of a coupling agent, preferably fluorescein isothiocyanate.
Os anticorpos monoclonais marcados radioactivamente com iodo ( I, I, I) foram obtidos a partir dos anticorpos do invento por iodinação conhecida per se, por exemplo com iodeto de sódio ou de potássio radioactivo e um agente químico oxidante, como seja hipoclorito de sódio, cloramina T ou similares ou um agente enzimático de oxidação, como seja lactoperoxidase ou glucose-oxidase e glucose. Os anticorpos de acordo com o invento são marcados com ítrio ( Y) por exemplo por quelatação com o ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA). Os anticorpos marcados com tecnécio-99m são preparados por processos de permuta de ligandos, por exemplo por redução de tertecnato (TcO4 ) com solução de ião estanhoso, quelatação do tecnécio reduzido numa coluna de Sephadex e aplicação dos anticorpos nesta coluna ou por técnicas de marcação directa, e.g. por incubação de pertecnato, um agente redutor como seja SnCl2, uma solução tampão como seja solução de ftalato de sódio e potássio e os anticorpos.Iodine (I, I, I) radiolabeled monoclonal antibodies were obtained from the antibodies of the invention by iodination known per se, for example with radioactive sodium or potassium iodide and an oxidizing chemical such as sodium hypochlorite, chloramine T or the like or an oxidizing enzyme agent, such as lactoperoxidase or glucose oxidase and glucose. The antibodies according to the invention are labeled with yttrium (Y) for example by chelation with diethylenetriaminepentacetic acid (DPTA). Antibodies labeled with technetium-99m are prepared by ligand exchange processes, for example by reducing tertechnate (TcO 4 ) with stannous ion solution, chelating the reduced technetium in a Sephadex column and applying the antibodies to this column or by direct labeling, eg by pertechnate incubation, a reducing agent such as SnCl 2 , a buffer solution such as sodium and potassium phthalate solution and antibodies.
Fragmentos dos anticorpos monoclonais de acordo com o invento, por exemplo Fab, Fab' ou F(ab')2 podem ser obtidos a partir dos anticorpos monoclonais preparados como descrito atrás por métodos conhecidos per se, e.g. por digestão com enzimas tais como papaína ou pepsina e/ou clivagem de ligações dissulfureto por redução química.Fragments of the monoclonal antibodies according to the invention, for example Fab, Fab 'or F (ab') 2 can be obtained from monoclonal antibodies prepared as described above by methods known per se, eg by digestion with enzymes such as papain or pepsin and / or cleavage of disulfide bonds by chemical reduction.
invento diz ainda respeitoa linhas celulares de hibridoma que secretam os anticorpos monoclonais do invento, em particular as linhas celulares de hibridoma que secretam os anticorpos monoclonais dirigidos contra o complexo trombina/HVl ou contra o complexo trombina/rHVl, preferencialmente contra o complexo trombina/rHVl.The invention also relates to hybridoma cell lines that secrete the monoclonal antibodies of the invention, in particular hybridoma cell lines that secrete monoclonal antibodies directed against the thrombin / HVl complex or against the thrombin / rHVl complex, preferably against the thrombin / rHVl complex. .
Em particular o invento diz respeito a linhas celulares de hibridoma que secretam os anticorpos pretendidos os quais são híbridos de células de mieloma e de linfocitos B de um mammífero imunizado com hirudina acoplado a um veículo adequado ou com o complexo trombina/hirudina. São mamíferos e veículos adequados os descritos detalhadamente abaixo. São preferidas as linhas celulares de hibridoma de acordo com o invento as quais são híbridos de células de mieloma de murganho e linfocitos Bde um murganho imunizado com hirudina recombinante variante l(rHVl) acoplado a um veículo adequado ou ao complexo trombina/rHVl.In particular, the invention relates to hybridoma cell lines that secrete the desired antibodies which are hybrids of myeloma cells and B lymphocytes from a mammal immunized with hirudin coupled to a suitable vehicle or with the thrombin / hirudin complex. Suitable mammals and vehicles are those described in detail below. Hybridoma cell lines according to the invention which are hybrids of mouse myeloma cells and B lymphocytes of a mouse immunized with recombinant hirudin variant 1 (rHV1) coupled to a suitable vehicle or to the thrombin / rHV1 complex are preferred.
São particularmente preferidas as linhas celulares de hibridoma designadas 4158-81-7 e 4107-76-1 que forma depositadas na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wilts. SP4 OJG, U.K., com o número de depósito 90061405 e 90061404, respectivamente em 14 de Junho de 1990.Hybridoma cell lines designated 4158-81-7 and 4107-76-1 which are deposited with the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Center for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wilts are particularly preferred. SP4 OJG, U.K., with deposit number 90061405 and 90061404, respectively on June 14, 1990.
As linhas celulares de hibridoma do invento são estáveis geneticamente, secretam os anticorpos monoclonais do invento com especificidade constante e podem ser mantidos em culturas congeladas e podem ser reactivados por descongelação e facultativamente reclonagem.The hybridoma cell lines of the invention are genetically stable, secrete the monoclonal antibodies of the invention with constant specificity and can be maintained in frozen cultures and can be reactivated by thawing and optionally recloning.
' O invento também diz respeito a um processo para a preparação de linhas celulares de hibridoma que secretam os anticorpos monoclonais do invento em que um animal adequado é imunizado com hirudina acoplada a um veiculo adequado ou com o complexo trombina/hirudina, as células produtoras de anticorpos do murganho são fundidas com células de uma linha celular continua, as células híbridas obtidas na fusão são clonadas e selelccionados os clones celulares que secretam os anticorpos monoclonais pretendidos.The invention also relates to a process for the preparation of hybridoma cell lines that secrete the monoclonal antibodies of the invention in which a suitable animal is immunized with hirudin coupled to a suitable vehicle or with the thrombin / hirudin complex, the cell-producing cells. mouse antibodies are fused with cells from a continuous cell line, the hybrid cells obtained in the fusion are cloned and the cell clones that secrete the desired monoclonal antibodies are selected.
imunogénio usado para induzir os anticorpos monoclonais do invento é um conjugado imunogénico da hirudina, em particular da hirudina variante HV1, da hirudina recombinante (rHV) ou preferencialmente da hirudina recombinante HV1 (rHVl) ou do complexo trombina/hirudina, em particular o complexo trombina/HVl ou o complexo trombina/rHVl, ou preferencialmente o complexo trombina/rHVl.The immunogen used to induce the monoclonal antibodies of the invention is an immunogenic conjugate of hirudin, in particular hirudin variant HV1, recombinant hirudin (rHV) or preferably recombinant hirudin HV1 (rHVl) or the thrombin / hirudin complex, in particular the thrombin complex / HV1 or the thrombin / rHV1 complex, or preferably the thrombin / rHV1 complex.
A acoplagem da hirudina a um veículo para formar um conjugado imunogénico de hirudina é necessário para aumentar a imunogenicidade da hirudina que é apenas fracamente imunogénica por si sõ.Coupling of hirudin to a vehicle to form an immunogenic hirudin conjugate is necessary to increase the immunogenicity of hirudin which is only weakly immunogenic in itself.
Moléculas veículo adequadas são por exemplo proteínas ricas em lisina com grupos amina livres disponíveis para acoplagem, especialmente proteínas de alto peso molecular como seja albumina sérica bovina (BSA; PM 66200) alfa-amilase derivada deSuitable carrier molecules are, for example, lysine-rich proteins with free amine groups available for coupling, especially high molecular weight proteins such as bovine serum albumin (BSA; PM 66200) alpha-amylase derived from
Bacillus subtilis (PM 58000) ou hemocianina de lapa (KLH; PM >1000000) que podem ser adquiridas comerclalmente em grandes quantidades. Podem ser também usados como veículos tiroglobulina porcina, toxinas tais como as toxinas do tétano, cólera ou difteria, albumina sérica humana (HSA), beta-2 microglobulina e similares podem ser igualmente usados como veículos. A fracção de IgG de coelho purificada contra IgG(H+L) (Kawamura & Berzofsky,Bacillus subtilis (PM 58000) or keyhole limpet hemocyanin (KLH; PM> 1000000) that can be purchased commercially in large quantities. Porcine thyroglobulin, toxins such as tetanus, cholera or diphtheria toxins, human serum albumin (HSA), beta-2 microglobulin and the like can also be used as vehicles. The fraction of rabbit IgG purified against IgG (H + L) (Kawamura & Berzofsky,
J. Immunol. 136, 58, 1986) pode também ser empregue como veículo. Outras moléculas veículo possíveis incluem polissacáridos, lipopolissacãridos naturais ou sintéticos, polipeptídeos sintéticos tais como polilisina, membranas activadas, partículas de latex, bactérias tais como Salmonella e similares.J. Immunol. 136, 58, 1986) can also be employed as a vehicle. Other possible carrier molecules include polysaccharides, natural or synthetic lipopolysaccharides, synthetic polypeptides such as polylysine, activated membranes, latex particles, bacteria such as Salmonella and the like.
É preferido um conjugado imunogénico de hirudina, particularmente hirudina variante HV1, estã acoplada a hemocianina de lapa (KLH). É particularmente preferido um conjugado imunogénico de hirudina em que a hirudina recombinante, particularmente hirudina recombinante variante HV1 (rHVl) estã acoplada a KHL.An immunogenic hirudin conjugate, particularly hirudin variant HV1, is coupled with keyhole limpet hemocyanin (KLH). Particularly preferred is an immunogenic hirudin conjugate in which the recombinant hirudin, particularly HV1 variant recombinant hirudin (rHV1) is coupled to KHL.
Os conjugados de hirudina são preparados por métodos conhecidos per se, quer por adsorção da hirudina ao veículo quer por acoplagem usando periodato, glutaraldeído, carbodimidas, e.g.Hirudin conjugates are prepared by methods known per se, either by adsorption of hirudin to the vehicle or by coupling using periodate, glutaraldehyde, carbodimides, e.g.
φ N,N'-o-fenilenodimaleimida, N-(m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-[2'-piridilditio]-propionoxi)-succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou similares. Caso se pretenda acoplagem via grupos carboxilo, os grupos amina da hirudina podem ser primeiro protegidos, e.g. por acilação, por exemplo com ' grupos acetilo ou butoxicarbonilo terciários.φ N, N'-o-phenylenediimaleimide, N- (m-maleimidobenzoyloxy) -succinimide, N- (3- [2'-pyridyldithio] -propionoxy) -succinimide, N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) - carbodiimide or the like. If coupling via carboxyl groups is desired, the amine groups of the hirudin can be protected first, e.g. by acylation, for example with tertiary acetyl or butoxycarbonyl groups.
complexo trombina/hirudina usado para imunização foi preparado misturando hirudina com trombina, em particular misturando um excesso de hirudina com trombina. O complexo trombina/hirudina pode ser separado da hirudina livre por exemplo através de filtração em gel por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).thrombin / hirudin complex used for immunization was prepared by mixing hirudin with thrombin, in particular by mixing an excess of hirudin with thrombin. The thrombin / hirudin complex can be separated from free hirudin for example by gel filtration by high pressure liquid chromatography (HPLC).
conjugado imunogénico de hirudina ou o complexo trombina/hirudina podem ser misturados com adjuvantes, i.e. agentes que vão aumentar mais a resposta imune, para o processo de imunização. São possíveis adjuvantes o adjuvante completo de Freund (emulsão de ãgua e óleo apenas), géis minerais, e.g. géis de hidróxido de alumínio, substâncias tensoactivas tais como lisolecitina, polianiões, peptídeos, BCG (Bacillus Calmette-Guerin), etc.,immunogenic hirudin conjugate or the thrombin / hirudin complex can be mixed with adjuvants, i.e. agents that will further enhance the immune response, for the immunization process. Adjuvants possible are Freund's complete adjuvant (water and oil emulsion only), mineral gels, e.g. aluminum hydroxide gels, surfactants such as lysolecithin, polyanions, peptides, BCG (Bacillus Calmette-Guerin), etc.,
Os imunogénios são usados para imunizar mamíferos adequados que os reconhecem como moléculas estranhas, por exemplo murganhos, ratos, coelhos, burros, cabras, carneiros, cavalos, porcos ou chimpanzés, especialmente murganhos ou ratos, preferencialmente murganhos. São particularmente preferidos os murganhos Balb/c.Immunogens are used to immunize suitable mammals that recognize them as foreign molecules, for example mice, rats, rabbits, donkeys, goats, sheep, horses, pigs or chimpanzees, especially mice or rats, preferably mice. Balb / c mice are particularly preferred.
As vias de imunização incluem, entre outras injecção intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravascular e intracranial.Uma vez que se pretende títulos elevados de anticorpos normalmente dã-se uma série de injecções. A imunização é realizada por exemplo por injecção do conjugado imunogénico de hirudina, facultativamente misturado com adjuvante incompleto ou completo de Freund, três a oito vezes parenteralmen te, e.g. intraperitonealmente e/ou subcutâneamente, em quantidades de 10-50 /ig em murganhos Balb/c em intervalos de 1-3 semanas, seguido de uma injecção de reforço de aproximadamente 50-500 /ig 1-3 meses após a última imunização.The immunization pathways include, among other intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intravascular and intracranial injections. Since high antibody titers are desired, a series of injections are usually given. Immunization is carried out, for example, by injection of the immunogenic hirudin conjugate, optionally mixed with Freund's incomplete or complete adjuvant, three to eight times parenterally, eg intraperitoneally and / or subcutaneously, in amounts of 10-50 / ig in Balb / mice. c at intervals of 1-3 weeks, followed by a booster injection of approximately 50-500 / ig 1-3 months after the last immunization.
As células produtoras de anticorpos dos murganhos imunizados, preferencialmente células linfóides tais como linfócitos do baço, retirados por exemplo um a cinco dias após a injecção fianl, são fundidas com as células de uma linha celular contínua, i.e. um clone celular que se replica continuamente o qual confere esta capacidade de replicação às células híbridas resultantes da fusão. Um exemplo para tal linha celular é a linha de células tumorais (mieloma) que por si só não produz imunoglobulinas ou seus fragmentos mas que tem o potencial de produzir e secretar grandes quantidades de anticorpo e que é portador de uma marca genética de forma a que as células híbridas possam ser seleccionadas contra células parentais não fundidasSão conhecidas várias linhas celulares de mieloma adequadas. São preferidas as linhas celulares de mieloma sem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT) ou a enzima timidina-cinase (TK), que portanto não sobrevivem num meio de cultura selectivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). São particularmente preferidas as células de mieloma e linhas celulares derivadas qque não sobrevivem em meio HAT e que não secretam imunoglobulinas ou seus fragmentos, particularmente as linhas celulares de mieloma de murganho Sp2/O-Agl4 (Shulman et al., Nature 276, 269, 1978) ou X63-Ag8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123. 1548, 1979) que podem ser adquiridos comercialmente (Flow) ou a linha celular de mieloma de murganho PAI (Stocker et al., Research Disclosure 21713, 1982).The antibody-producing cells of the immunized mice, preferably lymphoid cells such as spleen lymphocytes, removed for example one to five days after the fianl injection, are fused with the cells of a continuous cell line, ie a cell clone that replicates continuously. which gives this ability to replicate the hybrid cells resulting from the fusion. An example for such a cell line is the tumor cell line (myeloma) which by itself does not produce immunoglobulins or their fragments but which has the potential to produce and secrete large amounts of antibody and which carries a genetic marker so that hybrid cells can be selected against unfused parental cells. Several suitable myeloma cell lines are known. Myeloma cell lines without the enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) or the enzyme thymidine kinase (TK) are preferred, which therefore do not survive in a selective culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium). Particularly preferred are myeloma cells and derived cell lines that do not survive in HAT medium and do not secrete immunoglobulins or their fragments, particularly Sp2 / O-Agl4 mouse myeloma cell lines (Shulman et al., Nature 276, 269, 1978) or X63-Ag8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123. 1548, 1979) that can be purchased commercially (Flow) or the PAI mouse myeloma cell line (Stocker et al., Research Disclosure 21713 , 1982).
A fusão é realizada na presença de um promotor de fusão, por exemplo vírus Sendai ou outros paramixovírus, facultativamente na forma inactivada por UV ou agentes de fusão químicos tais como iões cálcio, lipidos tensioactivos, e.g. lisolecitina ou polietilenoglicol (PEG) ou por electrofusão, Preferencialmente, as células de mieloma são fundidas com um excesso de três a vinte vezes de células do baço derivadas de mamíferos imunizados numa solução contendo cerca de 30% a cerca de 60% de polietilenoglicol de um peso molecular entre 1000 e 4000.The fusion is carried out in the presence of a fusion promoter, for example Sendai virus or other paramyxoviruses, optionally in the form inactivated by UV or chemical fusion agents such as calcium ions, surfactant lipids, eg lysolecithin or polyethylene glycol (PEG) or by electrofusion, Preferably, myeloma cells are fused with a three to twenty-fold excess of spleen cells derived from immunized mammals in a solution containing about 30% to about 60% polyethylene glycol of a molecular weight between 1000 and 4000.
Após a fusão as células foram ressuspensas e cultivadas num meio selectivo escolhido dependendo da marca de selecção genética, por exemplo meio HAT. Neste meio, apenas sobreviverão as células de hibridoma, pois estas combinam a cpacidade de crescer e replicar in vitro herdada das células de mieloma parentais e a ausência dos genes HGPRT ou TK essencial à sobrevivência em meio HAT herdada das células do baço produtoras de anticorpos derivadas dos mamíferos imunizados.After fusion, the cells were resuspended and cultured in a selective medium chosen depending on the genetic selection marker, for example HAT medium. In this medium, only hybridoma cells will survive, as they combine the ability to grow and replicate in vitro inherited from parental myeloma cells and the absence of the HGPRT or TK genes essential to survival in HAT medium inherited from derived antibody-producing spleen cells. immunized mammals.
Meios de cultura adequados para a expansão de células de hibridoma são os meiso de cultura convencionais, tais como Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM), meio mínimo essencial, RPMI 1640 e similares, facultativamente suplementado com um soro de mamífero, e.g. 10 a 15% de soro fetal de vitela. Preferencialmente, são adicionadas células de suporte, e.g. células de exsudato peritoneal de murganho normal, células do baço, macrófagos da medula óssea ou similares, no início do crescimento celular imediatamente após o passo de fusão para alimentar as células de hibridoma e suportar o seu crescimento, especialmente sempre que as densidades celulares sejam baixas, proporcionando factores de crescimento e similares. Se se usar células fagocitãrias tais como macrofagos ou monócitos, elas podem desempenhar um serviço útil na limpza dos detritos das células de mieloma mortas sempre encontradas após tratamento com aminopterina. Os meios de cultura são suplementados com meio selectivo para evitar que as células de mieloma cresçam mais do que as células de hibridoma.Suitable culture media for the expansion of hybridoma cells are conventional culture media, such as Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), minimal essential medium, RPMI 1640 and the like, optionally supplemented with a mammalian serum, eg 10 to 15% of fetal calf serum. Preferably, support cells, eg normal mouse peritoneal exudate cells, spleen cells, bone marrow macrophages or the like, are added at the beginning of cell growth immediately after the fusion step to feed the hybridoma cells and support their growth , especially whenever cell densities are low, providing growth factors and the like. If phagocytic cells such as macrophages or monocytes are used, they can play a useful role in cleaning up the debris from dead myeloma cells that are always found after treatment with aminopterin. The culture media are supplemented with selective media to prevent myeloma cells from growing more than hybridoma cells.
Os sobrenadantes das culturas de células de hibridoma são testados relativamente aos anticorpos monoclonais pretendidos com um imunoensaio, preferencialmente um radio-imunoensaio ou imuno-ensaio com enzimas. Por exemplo, um veículo adequado como seja uma placa de microtitulação é revestido com o complexo trombina/hirudina e incubado com o sobrenadante de hibridoma a ser testado. Em seguida, são adicionados os anticorpos marcados com enzima que reconhecem os anticorpos ligados ao complexo trombina/hirudina no veículo e uma solução de substrato e os anticorpos marcados ligados ao complexo anticorpo/trombina/hirudina são detectados por determinação da marca enzimática ligada ao veículo.Supernatants from hybridoma cell cultures are tested for the desired monoclonal antibodies with an immunoassay, preferably a radioimmunoassay or enzyme immunoassay. For example, a suitable vehicle such as a microtiter plate is coated with the thrombin / hirudin complex and incubated with the hybridoma supernatant to be tested. Then, enzyme-labeled antibodies that recognize the antibodies bound to the thrombin / hirudin complex in the vehicle are added and a substrate solution and the labeled antibodies bound to the antibody / thrombin / hirudin complex are detected by determining the enzyme tag attached to the vehicle.
As células de hibridoma positivas foram clonadas, e.g. por diluição limite ou em agar mole, peferencialmente duas ou mais vezes. Facultativamente, as células de hibridoma são passadas em animais, e.g. murganhos, por injecção intraperitoneal e colheita de ascistes, o que estabiliza os hibridomas e melhora as caracteristicas do crescimento. As linhas de células clonadas podem ser congeladas de forma convencional.The positive hybridoma cells were cloned, e.g. by limit dilution or on soft agar, preferably two or more times. Optionally, the hybridoma cells are passed on animals, e.g. mice, by intraperitoneal injection and collection of ascites, which stabilizes hybridomas and improves growth characteristics. The cloned cell lines can be frozen in a conventional manner.
Os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são úteis para uma série de fins médicos in vitro e in vivo, todos eles baseados na determinação qualitativa e/ou qantitativa do complexo trombina/hirudina. E particular, os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados podem ser empregues no diagnóstico precoce de trombose, especialmente em grupos de alto risco e pacientes com perturbações trombóticas. Isto é conseguido através da detecção de pequenas quantidades de trombina gerada espontaneamente através da injecção de hirudina como marca seguido da medição do complexo formado, determinando assim o momento em que é necessário o tratamento com hirudina ou aconselhável a terapia preventiva com hirudina. Em adição, os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são úteis para o controle da terapia com hirudina pela determinação da actividade de hirudina, para o estabelecimento da dosagem correcta de hirudina e para o registo da prograssão possível da doença.The monoclonal antibodies of the invention and their derivatives are useful for a number of medical purposes in vitro and in vivo, all of which are based on the qualitative and / or quantitative determination of the thrombin / hirudin complex. In particular, the monoclonal antibodies of the invention and their derivatives can be used in the early diagnosis of thrombosis, especially in high-risk groups and patients with thrombotic disorders. This is achieved by detecting small amounts of thrombin spontaneously generated by injecting hirudin as a mark followed by measuring the complex formed, thus determining when treatment with hirudin is necessary or preventive therapy with hirudin is advisable. In addition, the monoclonal antibodies of the invention and their derivatives are useful for controlling hirudin therapy by determining hirudin activity, for establishing the correct dosage of hirudin and for recording possible disease progression.
Para a determinação quantitativa do complexo trombina/hirudina, os anticorpos minoclonais do invento e/ou seus derivados podem ser usados por exemplo em qualquer dos imunoensaios conhecidos que se baseiam na interacção da ligação entre os determinantes antigénicos da molécula do complexo trombina/hirudina e os paratopos dos anticorpos monoclonais. São exemplos de tais ensaios os imunoensaios que usam marcação radioactiva, enzimas, fluorescência, quimioluminescência, imunoprecipitação, aglutinação com latex e hemeglutinação, desvio de raios laser ou testes com luz evanescente.For the quantitative determination of the thrombin / hirudin complex, the minoclonal antibodies of the invention and / or its derivatives can be used, for example, in any of the known immunoassays that are based on the interaction of the link between the antigenic determinants of the thrombin / hirudin complex molecule and paratopes of monoclonal antibodies. Examples of such assays are immunoassays that use radioactive labeling, enzymes, fluorescence, chemiluminescence, immunoprecipitation, agglutination with latex and hemegglutination, laser beam deviation or tests with evanescent light.
Os anticorpos monoclonais do invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados marcados radioactivamente (RIA). Tais imunoensaios também incluem processos de testes em que são usados os anticorpos marcados radioactivamente conhecidos per se que reconhecem e ligam um epitopo dos anticorpos do invento. Pode ser usada qualquer uma das modificações reconhecidas de RIA, por exemplo RIA em fase solúvel (homogénea), RIA em fase sólida (heterogénea), RIA simples ou RIA dupla (sanduíche) com determinação directa ou indirecta do complexo trombina/hirudina.The monoclonal antibodies of the invention can be used as such or in the form of radiolabeled derivatives (RIA). Such immunoassays also include testing procedures in which the radiolabeled antibodies known per se that recognize and bind an epitope of the antibodies of the invention are used. Any of the recognized modifications of RIA can be used, for example RIA in soluble phase (homogeneous), RIA in solid phase (heterogeneous), single RIA or double RIA (sandwich) with direct or indirect determination of the thrombin / hirudin complex.
É preferida uma RIA em sanduíche na qual um veículo adequado, por exemplo a superfície de plástico de uma placa de microtitulação ou de um tubo de ensaio, e.g. de polistireno, polipropileno ou cloreto de polivinilo, esferas de vidro ou plástico, papel de filtro, dextrano, etc., filtros de acetato de celulose ou nitrocelulose, partículas magnéticas ou similares, é revestido com um anticorpo monoclonal do invento, preferencialmen te MAb 4107-76-1. Em seguida são adicionadas as soluções aA sandwich RIA is preferred in which a suitable vehicle, for example the plastic surface of a microtiter plate or test tube, eg polystyrene, polypropylene or polyvinyl chloride, glass or plastic beads, filter paper, dextran, etc., cellulose acetate or nitrocellulose filters, magnetic particles or the like, is coated with a monoclonal antibody of the invention, preferably MAb 4107-76-1. Then the solutions are added to
testar, por exemplo plasma de um doente, que contêm o complexo trombina/hirudina e finalmente o segundo anticorpo policlonal ou monoclonal que reconhece um epítopo do antigénio diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo monoclonal ligado ao veículo . . 125 e que estão marcados radioactivamente, e.g. com I, preferencialmente anticorpo monoclonais marcados radioactivamente do tais como MAb 4158-81-7.A quantidade do complexo trombina/hirudina na | solução a testar é directamente proporcional à quantidade de segundo anticorpo ligado e é determinado por medição da radioactividade ligada ao veículo.testing, for example, a patient's plasma, containing the thrombin / hirudin complex and finally the second polyclonal or monoclonal antibody that recognizes an antigen epitope different from that recognized by the first monoclonal antibody bound to the vehicle. . 125 and which are radiolabeled, e.g. with I, preferably radiolabeled monoclonal antibodies such as MAb 4158-81-7.The amount of the thrombin / hirudin complex in | The test solution is directly proportional to the amount of second antibody bound and is determined by measuring the radioactivity bound to the vehicle.
_ Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma dos derivados enzima-conjugado num imunoensaio com enzima. Tal imunoensaio também inclui processos teste em que são usados os anticorpos marcados com enzima conhecidos per se que reconhecem e se ligam a um epítopo dos anticorpos do invento. Comodescrito atrás para os radio-imunoensaios, pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas dos imunoensaios com enzimas.The monoclonal antibodies according to the invention can be used as such or in the form of enzyme-conjugated derivatives in an enzyme immunoassay. Such an immunoassay also includes test procedures in which enzyme-labeled antibodies known per se that recognize and bind to an epitope of the antibodies of the invention are used. As described above for radioimmunoassays, any of the known modifications of enzyme immunoassays can be used.
Os testes são realizados de forma análoga aos radio-imunoensaios descritos atrás usando uma marca nezimática em lugar de uma marca radioactiva. A quantidade de complexo imune formado que φ corresponde à quantidade do complexo trombina/hirudina presente na solução a testar é determinado pela adição de uma solução de substrato da enzima. A reacção do substrato com a enzima resulta, por exemplo, numa alteração de cor que pode ser observado a olho nu ou com sistemas ópticos de medição.The tests are carried out in a manner analogous to the radioimmunoassays described above using a nezymphatic mark instead of a radioactive mark. The amount of immune complex formed that φ corresponds to the amount of the thrombin / hirudin complex present in the solution to be tested is determined by adding an enzyme substrate solution. The reaction of the substrate with the enzyme results, for example, in a color change that can be observed with the naked eye or with optical measurement systems.
É preferido um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) no qual um veículo como o descrito atrás para a RIA é revestido com um anticorpo monoclonal do invento, preferencialmente MAb 4107-76-1, incubado com soluções a testar contendo o complexo trombina/hirudina, com segundo anticorpo policlonal ou monoclonal quie reconhecem um epítopo do antigénio diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo monoclonal ligado ao veículo e que estã conjugado com enzima, preferencialmente anticorpos monoclonais conjugados com enzimas do invento tais como MAb 4158-81-7 e com uma solução de substrato. A reacção da enzima e substrato resulta por exemplo numa alteração de cor e pode ser observado a olho nu ou com sistemas ópticos de medição, de forma que pode ser determinada a quantidade de enzima ligada, a qual é proporcional à quantidade do complexo trombina/hirudina na solução a testar. Uma alternativa consiste num imunoensaio que é realizado essencialmente como descrito atrás mas em que o primeiro anticorpo monoclonal ligado ao veículo do invento está acoplado a um grupo químico pequeno como seja biotina e é detectado por um reagnete marcado, e.g. uma proteína de ligação à biotina como seja a avidina ou a estreptavidina.An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is preferred in which a vehicle such as that described above for RIA is coated with a monoclonal antibody of the invention, preferably MAb 4107-76-1, incubated with test solutions containing the thrombin / hirudin complex. , with a second polyclonal or monoclonal antibody that recognizes an epitope of the antigen different from that recognized by the first monoclonal antibody bound to the vehicle and which is conjugated to the enzyme, preferably monoclonal antibodies conjugated to enzymes of the invention such as MAb 4158-81-7 and with a solution of substrate. The reaction of the enzyme and substrate results, for example, in a color change and can be observed with the naked eye or with optical measurement systems, so that the amount of bound enzyme can be determined, which is proportional to the amount of the thrombin / hirudin complex. in the solution to be tested. An alternative is an immunoassay that is carried out essentially as described above but in which the first monoclonal antibody bound to the vehicle of the invention is coupled to a small chemical group such as biotin and is detected by a labeled reagent, eg a biotin-binding protein as be it avidin or streptavidin.
Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados conjugados com marcas quimioluminescentes num imunoensaio quimioluminescente. Tais imunoensaios também incluem processos teste em gue são usados anticorpos conhecidos per se que reconhecem e se ligam a um epítopo dos anticorpos do invento e que estão conjugados com marca quimioluminescentes. Conforme descrito atrás para os radio-imunoensaios pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas de um imunoensaio quimioluminescente.The monoclonal antibodies according to the invention can be used as such or in the form of derivatives conjugated to chemiluminescent labels in a chemiluminescent immunoassay. Such immunoassays also include test methods in which antibodies known per se are used that recognize and bind to an epitope of the antibodies of the invention and which are conjugated to chemiluminescent labels. As described above for radioimmunoassays, any of the known modifications of a chemiluminescent immunoassay can be used.
Os testes são realzados de forma análoga aos radio-imunoensaios descritos atrás usando uma marca quimioluminescente em vez de uma marca radioactiva. A quantidade de complexo imune formada que corresponde à quantidade de anticorpos dirigidos contra o complexo trombina/hirudina presente nas soluções a testar é determinada pela adição de um composto que capta a luminescência, e.g. H2O2 e NaOH e medindo a emissão de luz com um sistema óptico de medição.The tests are carried out in a manner similar to the radioimmunoassays described above using a chemiluminescent marker instead of a radioactive marker. The amount of immune complex formed that corresponds to the amount of antibodies directed against the thrombin / hirudin complex present in the solutions to be tested is determined by adding a compound that captures luminescence, eg H 2 O 2 and NaOH and measuring the light emission with an optical measuring system.
A utilização de acordo com o invento dos anticorpos monoclonais e seus derivados como aqui jádescrito para a determinação qualitativa e quantitativa do complexo trombina/hirudina também inclui outros imunoensaios conhecidos per se. por exemplo ensaios de imunofluorescência usando anticorpos ou derivados do anticorpo conjugados com marcas fluorescentes tais como fluoresceína, aglutinação a latex com partículas de latex revestidas com anticorpo ou com antigénio, hemaglutinação com corpúsculos de glóbulos vermelhos revestidos anticorpo ou revestidos com antigénio, ensaios com luz evanescente usando uma fibra óptica revestida com anticorpo e outros imuno-sensores de actuação directa que convertem o acontecimento de ligação a um sinal eléctrico ou óptico ou similares.The use according to the invention of monoclonal antibodies and their derivatives as described herein for the qualitative and quantitative determination of the thrombin / hirudin complex also includes other immunoassays known per se. for example immunofluorescence assays using antibodies or antibody derivatives conjugated with fluorescent tags such as fluorescein, latex agglutination with antibody-coated or antigen-coated latex particles, hemagglutination with antibody-coated or antigen-coated red blood cells, tests with evanescent light using an antibody coated optical fiber and other direct acting immuno-sensors that convert the binding event to an electrical or optical signal or the like.
A aplicação dos anticorpos monoclonais do invento e/ou seus derivados como jã descrito permite a determinação da presença e/ou a concentração do complexo trombina/hirudina no tampão, urina e plasma em concentrações que variam entre 1 e 200 ng/ml.The application of the monoclonal antibodies of the invention and / or its derivatives as already described allows the determination of the presence and / or the concentration of the thrombin / hirudin complex in the buffer, urine and plasma in concentrations ranging between 1 and 200 ng / ml.
O invento também diz respeito a kits de testes para a determinação qualitativa e quantitativa do complexo trombina/hirudina compreendendo anticorpos monoclonais do invento e/ou seus derivados e, facultativamente, outros anticorpos monoclonais ou policlonais e/ou aditivos.The invention also relates to test kits for the qualitative and quantitative determination of the thrombin / hirudin complex comprising monoclonal antibodies of the invention and / or its derivatives and, optionally, other monoclonal or polyclonal antibodies and / or additives.
Kits de testes de acordo com o invento para o radio-imunoensaio contêm, por exemplo, um veículo adequado, e.g. placas de microtitulação ou folhas de nitrocelulose, não revestidas ou revestidas com um anticorpo monoclonal do invento, facultativamente soluções liofilizadas ou concentradasde um segundo anticorpo marcado radioactivamente dirigido contra um epítopo do complexo trombina/hirudina diferente do reconhecido pelo anticorpo monoclonal ligado ao veículo e/ou um seu derivado marcado radioactivamente, soluções padrão do complexo trombina/hirudina, soluções tampão e facultativamente, polipeptídeos e detergentes para prevenção da adsorção inespecífica e formação de agregados , pipetas, vasos de reacção, curvas de calibração, manuais de instruções e similares.Test kits according to the invention for the radioimmunoassay contain, for example, a suitable vehicle, eg microtiter plates or nitrocellulose sheets, uncoated or coated with a monoclonal antibody of the invention, optionally lyophilized or concentrated solutions of a second antibody radioactively labeled against a thrombin / hirudin complex epitope other than that recognized by the vehicle-bound monoclonal antibody and / or a radioactively labeled derivative, standard thrombin / hirudin complex solutions, buffer and optionally, polypeptides and detergents to prevent unspecific adsorption and formation of aggregates, pipettes, reaction vessels, calibration curves, instruction manuals and the like.
Os kits de teste de acordo com o invento para um imunoensaio com enzima contêm por exemplo, um veículo adequado, revestido ou não com um anticorpo monoclonal do invento, facultativamente soluços liofilizadas ou concentradas de um segundo anticorpo marcado com enzima dirigido contra um epítopo do complexo trombina/hirudina diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo monoclonal e/ou um seu derivado marcado com enzima, substratos de enzimas na forma sólida ou dissolvida, soluções padrão do complexo trombina/hirudina, soluções tampão e, facultativamente polipeptídeos e detergentes para a prevenção da adsorção inespecífica e formação de agregados, pipetas, vasos de reacção, curvas de calibração, manuais de intruções e similares.The test kits according to the invention for an enzyme immunoassay contain, for example, a suitable vehicle, coated or not with a monoclonal antibody of the invention, optionally lyophilized or concentrated solutions of a second enzyme-labeled antibody directed against an epitope of the complex thrombin / hirudin other than that recognized by the first monoclonal antibody and / or an enzyme-labeled derivative, enzyme substrates in solid or dissolved form, standard solutions of the thrombin / hirudin complex, buffer solutions and, optionally, polypeptides and detergents to prevent adsorption nonspecific and formation of aggregates, pipettes, reaction vessels, calibration curves, instruction manuals and the like.
Os exemplos que se seguem ilustram o invento, mas não o limitam de forma alguma.The following examples illustrate the invention, but do not limit it in any way.
AbreviaturasAbbreviations
HAT - hipoxantina/aminopterina/timidina HPLC - cromatografia líquida de alta pressão MAb - anticorpo monoclonalHAT - hypoxanthine / aminopterin / thymidine HPLC - high pressure liquid chromatography MAb - monoclonal antibody
MES - ãcido 2-[N-morfolino]etanossulfónico PBS - tampão de fosfatos salino PEG - polietilenoglicolMES - 2- [N-morpholino] ethanesulfonic acid PBS - PEG saline phosphate buffer - polyethylene glycol
I rHVl - hirudina recombinante variante HV1I rHVl - HV1 variant recombinant hirudin
RT - temperatura ambienteRT - room temperature
THC - complexo trombina-hirudinaTHC - thrombin-hirudin complex
ExemplosExamples
Exemplo 1 Preparação de anticorpos monoclonais contra o complexo trombina/hirudinaExample 1 Preparation of monoclonal antibodies against the thrombin / hirudin complex
1.1 Preparação dos imunogénios1.1 Preparation of immunogens
Como imunogénios podem ser usados: (1) um conjugado de hirudina recombinante HV1 (rHVl) com (rHVl) com hemocianina de lapa (KLH) e (2) o complexo trombina/rHVl.As immunogens can be used: (1) a conjugate of recombinant hirudin HV1 (rHVl) with (rHVl) with keyhole limpet hemocyanin (KLH) and (2) the thrombin / rHVl complex.
rHVl (Plantorgan/Ciba-Geigy) é acoplado a KLH (Calbiochem) pelo método da carbodiimida como descrito a seguir: 2 mg de rHVl em 560 μΐ de tampão O,1M MES pH 4,75 são misturados com 100 μΐ de KLH (10 mg/ml) e 200 μΐ de hidrocloreto N-etil-N'-(3-dimetliaminopropil)-carbodiimida (20 mg/ml). Após 2 horas a 22°C, a mistura foi dialisada em PBS.rHVl (Plantorgan / Ciba-Geigy) is coupled to KLH (Calbiochem) by the carbodiimide method as described below: 2 mg of rHVl in 560 μΐ of buffer O, 1M MES pH 4.75 is mixed with 100 μΐ of KLH (10 mg / ml) and 200 μΐ of N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (20 mg / ml). After 2 hours at 22 ° C, the mixture was dialyzed in PBS.
O complexo trombina/rHVl foi preparado misturando um excesso de rHVl com trombina em PBS (proporção molar de 1,7:1).The thrombin / rHV1 complex was prepared by mixing an excess of rHV1 with thrombin in PBS (1.7: 1 molar ratio).
1.2 Protocolo de imunização1.2 Immunization protocol
A dois grupos de cinco murganhos fêmea Balb/c (4-6 semanas de idade) foram dadas três séries de injecções com rHVl conjugado com KLH (30 Mg/injecção; grupo I) ou com o complexo trombina/rHVl (15 Mg/injecção; grupo II). A primeira injecção consiste em 0,1 ml do respectivo imunogénio em PBS numa prporção molar de 1:1 com 0,1 ml de adjuvante completo de Freund (Difco);Two groups of five female Balb / c mice (4-6 weeks of age) were given three series of injections with rHVl conjugated to KLH (30 Mg / injection; group I) or with the thrombin / rHVl complex (15 Mg / injection group II). The first injection consists of 0.1 ml of the respective immunogen in PBS in a 1: 1 molar ratio with 0.1 ml of Freund's complete adjuvant (Difco);
μΐ foram injectados intraperitonealmente e 150 μΐ subcutaneamente. No segundo (dia 14) e terceiro (dia 30) das injecções, o adjuvante completo de Freund foi substituido por adjuvante incompleto de Freund. Uma semana após a última injecção, o soro foi colhido e determinados os títulos de anticorpos por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) como descrito no exemplo 1.3.μΐ were injected intraperitoneally and 150 μΐ subcutaneously. On the second (14th) and third (30th) of the injections, Freund's complete adjuvant was replaced by Freund's incomplete adjuvant. One week after the last injection, serum was collected and antibody titers determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as described in example 1.3.
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1.3 Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para determinação do título de anticorpos no soro1.3 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of antibody titer in serum
Os títulos de anticorpos no soro foram determinados por ELISA como se descreve a seguir.Serum antibody titers were determined by ELISA as described below.
Misturou-se um excesso molar de duas vezes de trombina com rHVl (0,2 yg e 0,02 jug/cavidade, respectivamente). As placas de microtitulação (Dynatech) foram revestidas com 100 μΐ por cavidade de uma solução do complexo trombina/rHVl em tampão de revestimento (tampão carbonato de sódio 50 mM pH 9,6: 477 mg Na2C03, 1,8 ml NaN3 0,5M ad 300 ml H20). As placas foram incubadas durante a noite a 4°C numa câmara húmida e lavadas cinco vezes com PBS-Tween 0,1% (lml Tween-20, Serva, 1000 ml PBS). As cavidades foram deixadas a secar, cheias com 200 ml por cavidade de PBS-BSA 1% (lg BSA, 3 ml NaN3 0,5M, ad 100 ml de PBS), incubadas duas horas à t.a. e lavadas cinco vezes com PBS-Tween 0,1%. Em seguida adicionou-se 100 μΐ do respectivo soro diluído em PBS-Tween 0,1%. Após 2 horas de incubação à temperatura ambiente as placas foram lavadas cinco vezes com PBS-TweenO,1%. No passo seguinte, adicionou-se a cada uma das cavidades 100 μΐ anticorpo de cabra purificado por afinidade contra IgG de murganho e conjugado com fosfatase alcalina (Kikegaard & Perry Laboratories) diluido a 1:1500 em PBS-Tween 0,1%. Finalmente, adicionou-se 150 μΐ por cavidade de solução de substrato (1 mg de p-nitrofenilfosfato [Sigma] por ml de tampão dietanolamina pH 9,8 : 97 ml de dietanolamina [Merck], 6 ml NaN^ 0,5M, 100 mg MgC^.ôB^O, ajustado a pH 9,8 com HCl concentrado, ad 1000 ml H^O), a reacção foi parada pela adição de 50 μΐ de NaOH 3M e lida a densidade óptica a 405 nm após 2 horas de incubação à t.a. no escuro.A two-fold molar excess of thrombin was mixed with rHV1 (0.2 yg and 0.02 µg / well, respectively). The microtiter plates (Dynatech) were coated with 100 μΐ per well of a solution of the thrombin / rHVl complex in coating buffer (50 mM sodium carbonate buffer pH 9.6: 477 mg Na 2 C0 3 , 1.8 ml NaN 0.5M 3 ad 300 ml H 2 0). The plates were incubated overnight at 4 ° C in a humid chamber and washed five times with PBS-Tween 0.1% (1 ml Tween-20, Serva, 1000 ml PBS). The wells were allowed to dry, filled with 200 ml per well of 1% PBS-BSA (1g BSA, 3 ml 0.5M NaN 3 , ad 100 ml of PBS), incubated for two hours at rt and washed five times with PBS- 0.1% Tween. Then 100 μΐ of the respective serum diluted in PBS-Tween 0.1% was added. After 2 hours of incubation at room temperature, the plates were washed five times with PBS-TweenO, 1%. In the next step, 100 µl goat antibody affinity purified against mouse IgG and conjugated to alkaline phosphatase (Kikegaard & Perry Laboratories) diluted 1: 1500 in PBS-Tween 0.1% was added to each well. Finally, 150 μΐ was added per well of substrate solution (1 mg of p-nitrophenylphosphate [Sigma] per ml of diethanolamine buffer pH 9.8: 97 ml of diethanolamine [Merck], 6 ml NaN ^ 0.5M, 100 mg MgC ^ .ôB ^ O, adjusted to pH 9.8 with concentrated HCl, ad 1000 ml H ^ O), the reaction was stopped by adding 50 μΐ of 3M NaOH and reading the optical density at 405 nm after 2 hours of incubation in the dark.
*-1 ui·* -1 ui ·
1.4 Protocolo de fusão1.4 Fusion protocol
Após um período de descanso de mais de dois meses, os murganhos receberam uma injecçâo de reforço intraperitoneal com 300 Mg de conjugado rHVl-KLH (grupo I) ou 70 Mg do complexo trombina/rHVl (grupo II). Três a quatro dias mais tarde os murganhos foram sacrificados, as células do baço foram fundidas com alinha de células de mieloma murino PAI (Stocker et al., Research Disclosure Ne 21713, p.155, 1982), usando PEG 4000 (Merck), por uma modificação do método original de Kohler e Milstein (Galfre et al., Nature 266, 550, 1977) e as células foram distribuídas por cavidades de placas de microtitulação contendo meio HAT (Boehringer). Após 2 a 4 semas, as cavidades contendo hibridomas a crescer foram testadas relativamente a anticorpos monoclonais específicos por ELISA do Exemplo 1.5.After a rest period of more than two months, the mice received an intraperitoneal boost injection with 300 mg of rHV1-KLH conjugate (group I) or 70 mg of the thrombin / rHV1 complex (group II). Three to four days later the mice were sacrificed, the spleen cells were fused with PAI murine myeloma cell lines (Stocker et al., Research Disclosure Ne 21713, p.155, 1982), using PEG 4000 (Merck), by a modification of the original method by Kohler and Milstein (Galfre et al., Nature 266, 550, 1977) and the cells were distributed into microtiter plate wells containing HAT medium (Boehringer). After 2 to 4 weeks, the wells containing hybridomas to be grown were tested for specific monoclonal antibodies by the ELISA of Example 1.5.
1.5 Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para despiste de hibridomas ' Os hibridomas que cresceram foram testados quanto à presença de anticorpos específicos por uma ELISA como descrito no Exemplo 1.3. Em vez de soro adicionou-se 200 μΐ de sobrenadantes de hibridomas diluidos a 1:2 em PBS Tween 0,1% às placas de φ microtitulação revestidas com o complexo trombina/rHVl.1.5 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for hybridoma screening 'Hybridomas that have grown have been tested for the presence of specific antibodies by an ELISA as described in Example 1.3. Instead of serum, 200 µl hybridoma supernatants diluted 1: 2 in PBS Tween 0.1% were added to φ microtiter plates coated with the thrombin / rHV1 complex.
Destas três fusões realizadas como grupo de murganhos I (eficiência de fusão 100%), obtiveram-se seis secretores de MAbs reactivos com o complexo trombina/rHVl. As três fusões com os murganhos do grupo II resultam em quatro desses hibridomas, um dos quais secreta MAbs que dão reacção cruzada co m rHVl, enquanto que os MAbs secretados pelos restantes três hibridomas dão reacção cruzada com trombina. Duas linhas de células de hibridoma, uma de cada grupo, foram seleccionadas para posterior jjwFrom these three fusions performed as a group of mice I (fusion efficiency 100%), six MAbs secretors reactive with the thrombin / rHV1 complex were obtained. The three fusions with the group II mice result in four such hybridomas, one of which secretes MAbs that cross-react with rHV1, while the MAbs secreted by the remaining three hybridomas cross-react with thrombin. Two lines of hybridoma cells, one from each group, were selected for later jjw
I caracterização dos MAbs secretados. Ambas as linhas secretadas foram depositadas em 14 de Junho, 1990 na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), com os números de depósito 90061405 para o hibridoma 4158-81-7 (grupo I) e 90061404 para o hibridoma 4107-76-1 (grupo II). Os anticorpos monoclonais secretados por estes hibridomas foram designados pelo prefixo ”MAb” e o número interno do respectivo hibridoma, e.g. MAb 4107-76-1.I characterization of secreted MAbs. Both secreted lines were deposited on June 14, 1990 at the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), under deposit numbers 90061405 for hybridoma 4158-81-7 (group I) and 90061404 for hybridoma 4107-76- 1 (group II). The monoclonal antibodies secreted by these hybridomas were designated by the prefix "MAb" and the internal number of the respective hybridoma, e.g. MAb 4107-76-1.
1.6 Armazenamento e processamento de hibridomas1.6 Hybridoma storage and processing
As células de hibridoma seleccionadas podem ser cultivadas em cultura, congeladas a -80°C e mantidas em azoto líquido e depois reactivadas. As células foram clonadas pelo método de diluição limite (J.W. Goding, J. Immunol. Methods 39., 285, 1980) e expandidas formando ascites em murganhos Balb/c sensibilizados com pristano (ver Exemplo 2.1).The selected hybridoma cells can be grown in culture, frozen at -80 ° C and kept in liquid nitrogen and then reactivated. The cells were cloned by the limit dilution method (J.W. Goding, J. Immunol. Methods 39., 285, 1980) and expanded to form ascites in pristane-sensitized Balb / c mice (see Example 2.1).
Exemplo 2 Produção, isolamento e purificação dos anticorpos monoclonais anti-THCExample 2 Production, isolation and purification of anti-THC monoclonal antibodies
2.1 Expansão de hibridomas in vivo e purificação dos anticorpos monoclonais2.1 Expansion of hybridomas in vivo and purification of monoclonal antibodies
Para a produção de ascites, murganhos fêmea Balb/c (20-25 g) (Tierfarm Sisseln, Switzerland) foram prétratados com 0,3 ml de óleo de pristano (Aldrich) intraperitonealmente. 1 A 3 semanas mais tarde, os murganhos receberam uma segunda injecção de pristano (0,2 ml i.p.) e foram simultaneamente inoculados i.p. com 2 x 10 células de hibridoma em 0,2 ml de PBS. Após 8-10 dias, o fluido de ascites resultante foi colhido centrifugado a 800 g e guardado a -20°C ou a -80°C.For the production of ascites, female Balb / c mice (20-25 g) (Tierfarm Sisseln, Switzerland) were pretreated with 0.3 ml of pristane oil (Aldrich) intraperitoneally. 1 At 3 weeks later, the mice received a second injection of pristane (0.2 ml i.p.) and were simultaneously inoculated i.p. with 2 x 10 hybridoma cells in 0.2 ml PBS. After 8-10 days, the resulting ascites fluid was collected by centrifugation at 800 g and stored at -20 ° C or -80 ° C.
II
O fluido de ascites descongelado foi clarificado por centrifugação a 30000g durante lh. Após remoção a camada de cima contendo lípidos, determinou-se a concentração de proteína e ajustou-se a 10-12 mg/ml com PBS. A facção de imunoglobulina G (IgG) foi precipitada adicionando gota a gota 0,9 volumes de sulfato de amónio sarturado a 0°C. Após 1 hora, a fracção de IgG foi sedimentada por centrifugação durante 1 hora a 22000g. 0 sedimento foi dissolvido em tampão 20 mM Tris-HCl pH 7,9 contendo 50 mM NaCl e foi dialisado contra o mesmo tampão durante a noite a 4°C. A fracção de IgG foi ainda purificada por cromatografia de permuta aniónica numa coluna de DE52 dietilaminoetilcelulose (Whatman). A amostra foi diluida a 1:2 (v/v) em 20 mM Tris-HCl pH 7,9 para uma concentração final de 25 mM NaCl e 10 mg de proteína por ml de gel foram aplicados na coluna. A eluição foi obtida aumentando a concentração de cloreto de sódio de 25 mM para 200 mM (gradiente linear). Em geral, os MAbs foram eluidos à volta de 80 mM NaCl. As fracções foram dialisadas contra PBS durante a noite a 4°C e guardadas a -70°C. A pureza foi testada por SDS-PAGE e focagem isoeléctrica. A pureza era mais de 90%.The thawed ascites fluid was clarified by centrifugation at 30000g for 1h. After removing the top layer containing lipids, the protein concentration was determined and adjusted to 10-12 mg / ml with PBS. The immunoglobulin G (IgG) faction was precipitated by adding dropwise 0.9 volumes of saturated ammonium sulfate at 0 ° C. After 1 hour, the IgG fraction was pelleted by centrifugation for 1 hour at 22000g. The pellet was dissolved in 20 mM Tris-HCl pH 7.9 buffer containing 50 mM NaCl and was dialyzed against the same buffer overnight at 4 ° C. The IgG fraction was further purified by anion exchange chromatography on a DE52 diethylaminoethylcellulose column (Whatman). The sample was diluted 1: 2 (v / v) in 20 mM Tris-HCl pH 7.9 to a final concentration of 25 mM NaCl and 10 mg of protein per ml of gel were applied to the column. The elution was obtained by increasing the sodium chloride concentration from 25 mM to 200 mM (linear gradient). In general, MAbs were eluted around 80 mM NaCl. The fractions were dialyzed against PBS overnight at 4 ° C and stored at -70 ° C. Purity was tested by SDS-PAGE and isoelectric focusing. Purity was more than 90%.
2.2 Expansão de hibridomas in vitro2.2 Expansion of hybridomas in vitro
Uma précultura de qualquer uma das linhas celulares foi obtida cultivando as células de hibridoma à temperatura fisiológica (cerca de 37 °C) em meio RPMI1640 (Seromed) contendo 10% de soro fetal de vitela (FCS) para uma densidade final de 5 x 10 a 10° células por ml. Toda a précultura foi foi usada para encher frascos de cultura Bellco e ajustada a um volume total de 1500 ml com meio RPMI fresco/10%FCS. A cultura foi agitada a 37°C com 5% de C02 a 30 rpm durante dois a três dias, depois diluido para um volume total de 3000 ml com RPMI 1640/10% FCS e agitada durante mais sete a dez dias. Após este tempo, 95% das células estavam mortas. O caldo de cultura foi centrifugado a lOOOxg durante 20 minutos a 4°C. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro com um poro de 0,2 /xm em condições de esterilidade. A imunohglobulina bruta foi precipitada pela adição lenta gota a gota de 0,9 volumes de sulfato de amónio saturado a 0°C. Este precipitado foi purificado como descrito no Exemplo 2.1.A pre-culture of any of the cell lines was obtained by culturing the hybridoma cells at physiological temperature (about 37 ° C) in RPMI1640 medium (Seromed) containing 10% fetal calf serum (FCS) to a final density of 5 x 10 at 10 ° cells per ml. The entire pre-culture was used to fill Bellco culture flasks and adjusted to a total volume of 1500 ml with fresh RPMI / 10% FCS medium. The culture was stirred at 37 ° C with 5% CO 2 at 30 rpm for two to three days, then diluted to a total volume of 3000 ml with RPMI 1640/10% FCS and stirred for another seven to ten days. After this time, 95% of the cells were dead. The culture broth was centrifuged at 100xg for 20 minutes at 4 ° C. The supernatant was filtered through a 0.2 µm pore filter under sterile conditions. The crude immunohglobulin was precipitated by the slow dropwise addition of 0.9 volumes of saturated ammonium sulfate at 0 ° C. This precipitate was purified as described in Example 2.1.
Exemplo 3 Determinação da classe e subclasse dos anticorpos monoclonais anti-THCExample 3 Determination of the class and subclass of anti-THC monoclonal antibodies
A classe e subclasse dos anticorpos monoclonais foi determinada num kit de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) da Bio-Rad. MAb 4158-81-7 e MAb 4107-76-1 são da classe de IgGl.The class and subclass of monoclonal antibodies was determined in a Bio-Rad enzyme-linked immunosorbent assay kit (ELISA). MAb 4158-81-7 and MAb 4107-76-1 are of the IgGl class.
Exemplo 4 Preparação de análogos de rHVlExample 4 Preparation of rHV1 analogs
4.1 Preparação de peptídeos sintéticos de rHVl4.1 Preparation of synthetic rHV1 peptides
Peptídeos sintéticos de rHVl representando as sequências 52-65, 40-65, 29-38 e 1-15 foram sintetizados pelo método de fase sólida conhecido (Rink, Tetrahedron Letters 28., 3787, 1987) . 0 peptídeo representando a sequência 1-43 foi sintetizado como descrito em Chang et al., FEBS Letters 260, 209, 1990.Synthetic rHV1 peptides representing sequences 52-65, 40-65, 29-38 and 1-15 were synthesized by the known solid phase method (Rink, Tetrahedron Letters 28., 3787, 1987). The peptide representing the sequence 1-43 was synthesized as described in Chang et al., FEBS Letters 260, 209, 1990.
4.2 S-carboximetilação redutora4.2 Reducing S-carboxymethylation
A S-carboximetilação redutora de rHVl foi realizada segundo Hirs (Methods in Enzymol- 11, 199, 1967). Ela resulta na destruição completa da estrutura tridimensional de rHVl.RHV1-reducing S-carboxymethylation was performed according to Hirs (Methods in Enzymol-11, 199, 1967). It results in the complete destruction of the three-dimensional structure of rHV1.
4.3 Digestão de rHVl por protease estafilocóccica V8 de rHVl nativo dissolvido em 90 (NH4)HCO3 50 mM, pH 8,0, suplementado com EDTA misturados com 20 μ% (em 20 μΐ) de protease de aureus estirpe V8 (Sigma) e incubado durante 30 minutos, 2 h ou 4 h a 37°C. A reacção foi parada pela adição de 5 μΐ de diisopropil fluorofosfato 0,01M (Sigma). O grau de digestão foi testado por HPLC de fase reversa como descrito por Schlaeppi et al. (Eur. J. Biochem. 188, 463, 1990) ou por análise amino-terminal (Chang,4.3 Digestion of rHVl by V8 staphylococcal protease of native rHVl dissolved in 90 (NH 4 ) 50 mM HCO 3 , pH 8.0, supplemented with EDTA mixed with 20 μ% (in 20 μΐ) of aureus protease strain V8 (Sigma) and incubated for 30 minutes, 2 h or 4 h at 37 ° C. The reaction was stopped by adding 5 μΐ of 0.01M diisopropyl fluorophosphate (Sigma). The degree of digestion was tested by reverse phase HPLC as described by Schlaeppi et al. (Eur. J. Biochem. 188, 463, 1990) or by amino-terminal analysis (Chang,
Analytical Biochem. 170, 542, 1988) e por SDS-PAGE.Analytical Biochem. 170, 542, 1988) and by SDS-PAGE.
μΐ de tampão 2 mM, foram Staphylococusμΐ of 2 mM buffer, were Staphylococus
4.4 Digestão de rHVl por lisil endopeptidase4.4 Digestion of rHVl by lysyl endopeptidase
A 70 jug de rHVl dissolvido em 97,5 μΐ de 25 mM Tris/HCl pH 8,3, adicionou-se 2,5 Mg em 2,5 μΐ de lisil endopeptidase (Wako Chemicals) e incubou-se durante diferentes períodos de temopo a 37°C. Os fragmentos proteolíticos foram separados por HPLC como descrito por Schlaeppi et al., (loc. cit.) e determinado o grau de digestão por análise N-terminal quantitativa.To 70 µg of rHVl dissolved in 97.5 μΐ of 25 mM Tris / HCl pH 8.3, 2.5 Mg in 2.5 μΐ of lysyl endopeptidase (Wako Chemicals) was added and incubated for different periods of time at 37 ° C. The proteolytic fragments were separated by HPLC as described by Schlaeppi et al., (Loc. Cit.) And the degree of digestion determined by quantitative N-terminal analysis.
Exemplo 5 Processos teste usados para a caracterização dos anticorpos monoclonais anti-THC »Example 5 Test processes used for the characterization of anti-THC monoclonal antibodies »
5.1 Biotinilação de rHVl, trombina e os anticorpos monoclonais5.1 Biotinylation of rHVl, thrombin and monoclonal antibodies
A trombina (1,1 nmol em 2 μΐ de DMSO) durante 3 horas a 4°C. Em seguida adicionou-se 360 μΐ de PBS antes da diálise durante a noite contra PBS.Thrombin (1.1 nmol in 2 μΐ DMSO) for 3 hours at 4 ° C. Then 360 μΐ of PBS was added before dialysis overnight against PBS.
A biotinilação dos anticorpos monoclonais foi realizada essencialmente como descrito pr Bayer et al. (Methods Enzymol. 62, 308, 1979). Éster de biotina-X-N-hidroxissuccinimida (200 μg em 200 μΐ de DMSO) foi adicionado a 5 mg do MAb purificado em 5 ml de PBS (pH 7,0) (proporção molar de 13:1). Após 4 h a 4°C a mistura foi extensivamente dialisada em PBS.Biotinylation of monoclonal antibodies was performed essentially as described by Bayer et al. (Methods Enzymol. 62, 308, 1979). Biotin-X-N-hydroxysuccinimide ester (200 μg in 200 μΐ DMSO) was added to 5 mg of purified MAb in 5 ml of PBS (pH 7.0) (13: 1 molar ratio). After 4 h at 4 ° C the mixture was extensively dialyzed in PBS.
0,5 mg de rHVl em 200 μΐ de tampão acetato (20 mM, pH 6,0) foram misturados com 100 μg do éster de biotina-X-N-hidroxis succinimida (Calbiochem) dissolvido em 40 gl de etanol/água (1:1, v/v) de forma a que a razão molar de biotina para rHVl seja de 3,2:1 e a mistura foi incubada 20 minutos à t.a. Em seguida, 260 μΐ de PBS foram adicionados e a solução dialisada durante a noite contra PBS a 4°C.0.5 mg of rHVl in 200 μΐ of acetate buffer (20 mM, pH 6.0) were mixed with 100 μg of the biotin-XN-hydroxis succinimide ester (Calbiochem) dissolved in 40 g of ethanol / water (1: 1 , v / v) so that the molar ratio of biotin to rHV1 is 3.2: 1 and the mixture was incubated for 20 minutes at Then, 260 μΐ of PBS was added and the solution dialyzed overnight against PBS at 4 ° C.
5.2 ELISA competitiva mapeamento de epítopos foi realizado por experiências de ELISA competitiva usando rHVl, análogos de rHVl como descrito no exemplo 4 e hirudina recombinante variante PA (rHV3; Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367. 803, 1983). A ELISA competitiva em dois passos foi realizada como descrito a seguir.5.2 Competitive ELISA epitope mapping was performed by competitive ELISA experiments using rHV1, rHV1 analogs as described in example 4 and recombinant hirudin variant PA (rHV3; Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367. 803, 1983) . The competitive two-step ELISA was performed as described below.
rHVl (0,2 μ9/100 μΐ de tampão de revestimento 50 mM) foi adosrvida a placas de mierotitulação. Após incubação durante a noite a 4°C, as placas foram lavadas com PBS-Tween 0,1% e os restantes sítios livres no suporte sólido foram bloqueados por incubação com PBS/BSA(1% p/v). Em tubos de ensaio separados, 50 μΐ de cada um dos MAb purificados (40 a 400 ng/ml) foram incubados com 650 μΐ de uma solução padrão contendo quantidades crescen tes de rHVl ou análogos de rHVl. Após incubação durante a noite a 4°C, 200 μΐ da mistura de anticorpo-antigénio foram adicionados a cada uma das cavidades e incubado mais uma hora. As cavidades foram então lavadas cinco vezes e adicionados 100 μΐ por cavidade de anticorpo de cabra anti-murganho conjugado com fosfatase alcalina (diluição 1:1500) durante 1,5 h. Após lavagem,rHVl (0.2 μ9 / 100 μΐ of 50 mM coating buffer) was attached to mierotiter plates. After overnight incubation at 4 ° C, the plates were washed with 0.1% PBS-Tween and the remaining free sites on the solid support were blocked by incubation with PBS / BSA (1% w / v). In separate test tubes, 50 μΐ of each of the purified MAbs (40 to 400 ng / ml) were incubated with 650 μΐ of a standard solution containing increasing amounts of rHVl or rHVl analogs. After overnight incubation at 4 ° C, 200 μΐ of the antibody-antigen mixture was added to each well and incubated for another hour. The wells were then washed five times and 100 μΐ per well of goat anti-mouse antibody conjugated with alkaline phosphatase (dilution 1: 1500) was added over 1.5 h. After washing,
adicionou-se às cavidades 150 μΐ por cavidade do substrato p-nitrofenilfosfato (1 mg/ml em tampão dietanolamina pH 9,8, suplementado com 0,5 mM MgCl2.H2O).A mudança de cor, que é proporcional à quantidade de anticorpo que reage com o antigénio ligado à fase sólida foi controlado a 405 nm. Todas as amostras correram em triplicado. Obtiveram-se curvas de inibição típicas representando graficamente B/Bo x 100 (percentagem ligada) vs. a concentração de inibidor presente (Bo representa a absorvância medida sem rHVl adicionado ao anticorpo e B a absorvância medida com várias concentrações de rHVl). O valor de ΙΟ^θ representa a concentração de antigénioque inibe 50% da ligação do anticorpo à fase sólida. IC5Q foi calculado usando uma adaptação do program de adaptação de curvas ENZFITTER (R. J. Leatherbarrow, Elsevier) baseado numa curva de quatro parâmetros logísticos: U=(D-C)/1+(z/A)b)+C, onde U é a resposta esperada para uma dose z do padrão. Os quatro parâmetros descrevem a forma da curva, D e C dão a assímtota superior e inferior e A é a dose da assímtota média (Raab, Clin. Chem. 29., 1757, 1983).150 μΐ was added to the wells per well of the substrate p-nitrophenylphosphate (1 mg / ml in diethanolamine buffer pH 9.8, supplemented with 0.5 mM MgCl 2 .H 2 O). The color change, which is proportional to the amount of antibody that reacts with the antigen bound to the solid phase was controlled at 405 nm. All samples were run in triplicate. Typical inhibition curves were plotted representing B / Bo x 100 (bound percentage) vs. the concentration of inhibitor present (Bo represents the absorbance measured without rHV1 added to the antibody and B the absorbance measured with various concentrations of rHV1). The value of ΙΟ ^ θ represents the concentration of antigen that inhibits 50% of antibody binding to the solid phase. IC 5Q was calculated using an adaptation of the ENZFITTER curve fitting program (RJ Leatherbarrow, Elsevier) based on a curve with four logistical parameters: U = (DC) / 1 + (z / A) b) + C, where U is the expected response for a z dose of the standard. The four parameters describe the shape of the curve, D and C give the upper and lower asymptote and A is the average asymptote dose (Raab, Clin. Chem. 29., 1757, 1983).
5.3 ELISA dupla em sanduíche com MAbs selectivos para a hirudina livre para determinar epítopos sobreponíveis5.3 Double sandwich ELISA with MAbs selective for free hirudin to determine overlapping epitopes
Realizou-se uma ELISA com dois anticorpos em sanduicheusando MAbs selectivos para a hirudina livre como descrito a seguir para determinar se anticorpos monoclonais reconhecem epítopos sobreponíveis.An ELISA with two antibodies was performed on sandwiches using MAbs selective for free hirudin as described below to determine whether monoclonal antibodies recognize overlapping epitopes.
As placas de microtitulação foram revestidas com 0,5 ^g/cavidade de MAb purificado anti-THC do grupo I preparado em tampão carbonato de sódio (50 mM, pH 9,6) e incubado durante a noite a 4°C. Após os passos de bloqueio e de lavagem (por 1% BSA e PBS-Tween 0,1%, respectivamente), adicionou-se concentrações crescentes de rHVl preparado em PBS-Tween 0,1% (0 a 100 ng/cavidade) ao anticorpo monoclonal ligado e incubou-se durante 1 hora à t.a. Após lavagem, adicionou-se um segundo MAb biotinilado selectivo para rHVl livre (0,5 ^g/cavidade) e incubou-se durante 2 h. Como segundo anticorpo monoclonal foram empregues MAb 4114-96-1, MAb 4120-37-7 e MAb 4049-83-12 respectivamente, como descrito por Schlaeppi et al., (loc. cit.). Em seguida, apóslavagem, adicionou-se 100 μΐ de estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (diluida a 1:2500) e incubou-se durante 1,5 h à t.a. Após lavagem, o substrato (ver Exemplo 5.2) foi adicionado e medida a absorVancia a 405 nm após diferentes intervalos de tempo, começando 15 minutos após a adição do substrato.The microtiter plates were coated with 0.5 µg / well of purified group I anti-THC MAb prepared in sodium carbonate buffer (50 mM, pH 9.6) and incubated overnight at 4 ° C. After the blocking and washing steps (by 1% BSA and 0.1% PBS-Tween, respectively), increasing concentrations of rHV1 prepared in 0.1% PBS-Tween (0 to 100 ng / well) were added to the bound monoclonal antibody and incubated for 1 hour at After washing, a second biotinylated MAb selective for free rHV1 (0.5 µg / well) was added and incubated for 2 h. As the second monoclonal antibody, MAb 4114-96-1, MAb 4120-37-7 and MAb 4049-83-12 respectively, were used, as described by Schlaeppi et al., (Loc. Cit.). Then, after washing, 100 μΐ of streptavidin conjugated to alkaline phosphatase (diluted 1: 2500) was added and incubated for 1.5 h at r.t. After washing, the substrate (see Example 5.2) was added and absorbance at 405 nm was measured after different time intervals, starting 15 minutes after adding the substrate.
5.4 ELISA em sanduíche para determinar o complexo rHVl/trombina complexo trombina/rHVl foi preparado misturando 3 pmoles de a-trombina (3000 unidades NIH/mg;CBR Laboratories) com 15 pmoles de rHVl em 100 μΐ de PBS Tween 0,1% contendo 0,1% BSA ou em 100 μΐ de plasma humano diluído a 1:3 em PBS-Tween 0,1% contendo 0,1% BSA ou em 100 μΐ de plasma humano diluido a 1:3 em PBS-Tween.5.4 Sandwich ELISA to determine the rHVl / thrombin complex thrombin / rHVl complex was prepared by mixing 3 pmoles of a-thrombin (3000 NIH units / mg; CBR Laboratories) with 15 pmoles of rHVl in 100 μΐ of 0.1% PBS Tween containing 0.1% BSA or in 100 μΐ of human plasma diluted 1: 3 in PBS-Tween 0.1% containing 0.1% BSA or in 100 μΐ of human plasma diluted 1: 3 in PBS-Tween.
As placas de microtitulação foram revestidas com o MAb anti-trombina MAb EST6 (0,2 ^g/100 μΐ; Bioscot, Edinburgh, UK). Após incubação durante a noite a 4°C, bloqueio com PBS-BSA (0,1%) e lavagem com PBS-Tween, 100 μΐ de uma série de diluições de duas vezes do complexo trombina/rHVl preparado como descrito atrás (proporção molar 1:5) foram adicionados à cavidade e incubados durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida adicionaram-se consecutivamente os seguintes reagentes: (1) 0,5 μg/100 μΐ do MAb 4107-76-1 biotinilado e MAb 4158-81-7, respectivamente, durante 2 h, (2) estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (diluido a 1:2500) durante 1,5 horas, (3) substrato (ver exemplo 5.2). As incubações foram feitas a 22°C. Entre cada passo as placas foram lavadas com PBS-Tween 0,1%. A absorvância foi controlada a405 nm após 15 a 30 minutos.The microtiter plates were coated with the MAb EST6 anti-thrombin MAb (0.2 µg / 100 μΐ; Bioscot, Edinburgh, UK). After overnight incubation at 4 ° C, blocking with PBS-BSA (0.1%) and washing with PBS-Tween, 100 μΐ of a series of two-fold dilutions of the thrombin / rHVl complex prepared as described above (molar ratio 1: 5) were added to the well and incubated for 2 hours at room temperature. Then the following reagents were added consecutively: (1) 0.5 μg / 100 μΐ of biotinylated MAb 4107-76-1 and MAb 4158-81-7, respectively, for 2 h, (2) streptavidin conjugated to alkaline phosphatase (diluted 1: 2500) for 1.5 hours, (3) substrate (see example 5.2). Incubations were carried out at 22 ° C. Between each step the plates were washed with PBS-0.1% Tween. Absorbance was controlled at 405 nm after 15 to 30 minutes.
Foi desenvolvido um ensaio simplificado usando placas de microtitulação revestidas com o MAb escolhido. Adicionou-se trombina biotinilada (0,2 /zg/cavidade) complexada com rHVl (proporção molar 1:1) às cavidades e a trombina biotinilada foi revelada directamente por estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina.A simplified assay was developed using microtiter plates coated with the chosen MAb. Biotinylated thrombin (0.2 µg / well) complexed with rHV1 (1: 1 molar ratio) was added to the wells and the biotinylated thrombin was revealed directly by streptavidin conjugated to alkaline phosphatase.
5.5 Filtração em gel por HPLC5.5 Gel filtration by HPLC
Usou-se filtração em gel por HPLC (cromatografia líquida de alta resolução para analisar o complexo trombina/rHVl ou complexos antigénio-anticorpo. As amostras contendo trombina (0,3 nmole) e rHVl (1,5 nmoles) foram incubadas durante 15 minutos. O MAb testado anti-THC ou o controle anti-hirudina MAb 4049-83-12 (0,2 nmole; Schlaeppi et al., loc. cit) foi adicionado (volume total 45 μΐ) e ainda incubado durante 5 h à temperatura. As amostras foram injectadas numa coluna de filtração em gel TSK-G3000SW (LKB; 8 x 300 mm) e eluidas com PBS a um fluxo de 0,3 ml/min. A absorvância da proteína foi controlada a 280 nm.HPLC gel filtration (high performance liquid chromatography was used to analyze the thrombin / rHVl complex or antigen-antibody complexes. Samples containing thrombin (0.3 nmole) and rHVl (1.5 nmoles) were incubated for 15 minutes The tested anti-THC MAb or anti-hirudin control MAb 4049-83-12 (0.2 nmole; Schlaeppi et al., Loc. Cit) was added (total volume 45 μΐ) and further incubated for 5 h at room temperature The samples were injected into a TSK-G3000SW gel filtration column (LKB; 8 x 300 mm) and eluted with PBS at a flow rate of 0.3 ml / min The protein absorbance was controlled at 280 nm.
Exemplo 6 Caracterização dos anticorpos monoclonais anti-THCExample 6 Characterization of anti-THC monoclonal antibodies
6.1 Os anticorpos monoclonais do grupo I os resultados da ELISA competitiva do exemplo 5.2 MAb 4158-81-7 (grupo I) estão apresentados na Tabela 1 abaixo.6.1 Group I monoclonal antibodies the results of the competitive ELISA of example 5.2 MAb 4158-81-7 (group I) are shown in Table 1 below.
-» ί Λ- »ί Λ
Tabela 1: Caracterização do MAb 4158-81-7 por ELISA competitivaTable 1: Characterization of MAb 4158-81-7 by competitive ELISA
Legenda:Subtitle:
A- concentração de inibidor para 50% de inibição do MAb em fase sólidaA- inhibitor concentration for 50% solid phase MAb inhibition
B- resíduos de rHV3 que são diferentes de rHVl: Ile, Tre 2, Lis 24, Gin 33, Lis 35, Asp 36, Gin 53, Pro 58, Asp 62, Ala 63,B- rHV3 residues that are different from rHVl: Ile, Tre 2, Lis 24, Gin 33, Lis 35, Asp 36, Gin 53, Pro 58, Asp 62, Ala 63,
Asp 65, Glu 66Asp 65, Glu 66
C- rHVl reduzida e S-carboximetiladaReduced C- rHVl and S-carboxymethylated
D- 97% de clivagem em Glu 43; 50% de clivagem em Glu 61D- 97% cleavage on Glu 43; 50% cleavage in Glu 61
E- 100% de clivagem em Lis 47; 100% de clivagem em Lis 36E- 100% cleavage in Lys 47; 100% cleavage in Lis 36
MAb 4158-81-7 liga-se a rHVl em solução com um valor de IC5Q de 3,5 ng/ml mas não apresenta reactividade cruzada com os quatro peptídeos rHVl 1-15, 29-38, 40-65 e 52-65 que constituem a maior parte da sequência de rHVl. Ainda, a ligação de rHVl reduzida e S-carboximetilada decresceu drasticamente comparado com rHVl não modificada, sugerindo uma conformação dependente de epítopo. 0 MAb 4158-81-7 dá totalmente reacção cruzada com o domínio central N-terminal de rHVl, assim como com rHVl digerido com protease V8 na qual o domínio central de rHVl permaneceu intacto. A afinidade do MAb para rHVl 1-43 e para rHVl digerido com V8 é superior do que para a molécula de rHVl completa, sugerindo que ocorre algum impedimento espacial do domínio C-terminal, o qual altera a sua conformação nativa.MAb 4158-81-7 binds rHVl solution with an IC 5Q value of 3.5 ng / ml but did not cross-react with the four rHVl peptides 1-15, 29-38, 40-65 and 52- 65 that make up most of the rHV1 sequence. In addition, the binding of reduced rHV1 and S-carboxymethylated decreased dramatically compared to unmodified rHV1, suggesting an epitope-dependent conformation. MAb 4158-81-7 fully cross-reacts with the central N-terminal domain of rHV1, as well as with rHV1 digested with protease V8 in which the central domain of rHV1 remained intact. The affinity of MAb for rHVl 1-43 and for rHVl digested with V8 is higher than for the complete rHVl molecule, suggesting that some spatial impediment of the C-terminal domain occurs, which alters its native conformation.
Na ELISA dupla em sanduíche do exemplo 5.3, o MAb 4158-81-7 combina-se com qualquer um dos anticorpos monoclonais anti-hirudina que se ligue ao domínio C-terminal (ver Schlaeppi et al., loc. cit.), indicador de epítopos não sobreponíveis. No entanto, são necessárias concentrações dez a vinte vezes superiores de rHVl quando o MAb 4158-81-7 foi combinado com o MAb 4049-83-12 que se liga aos resíduos dentro do domínio 41-47. Isto indica uma sobreposição parcial entre os epítopos de ambos os MAbs que foi ainda confirmado por proteolise limitada do complexo rHHl/anticorpo pela protease V8. A clivagem entre Glu 43e Gli 44 foi evitada pela ligação do MAb 4158-81-7 a rHVl.In the double sandwich ELISA of example 5.3, MAb 4158-81-7 combines with any of the anti-hirudin monoclonal antibodies that bind to the C-terminal domain (see Schlaeppi et al., Loc. Cit.), Indicator of non-overlapping epitopes. However, ten to twenty times higher rHV1 concentrations are required when MAb 4158-81-7 was combined with MAb 4049-83-12 which binds to residues within the 41-47 domain. This indicates a partial overlap between the epitopes of both MAbs which was further confirmed by limited proteolysis of the rHH1 / antibody complex by protease V8. Cleavage between Glu 43 and Gli 44 was prevented by binding MAb 4158-81-7 to rHV1.
Todos os restantes MAbs do grupo I também dão reacção cruzada com o peptídeo rHVl 1-43, sugerindo que os MAbs do grupo I se ligam a apenas ao domínio central N-terminal de rHVl. Estes resultados também indicam que os principais determinantes antigénicos de rHVl acessíveis na superfície do complexo trombina/rHVl estão situados exclusivamente no domínio N-terminal, conforme sugerido pela estrutural cristalina do complexo trombina/hirudina (Grutter et al., EMBO Journal 9, 2361, 1990).All other group I MAbs also cross-react with the rHV1 1-43 peptide, suggesting that group I MAbs bind to only the central N-terminal domain of rHV1. These results also indicate that the main antigenic determinants of rHVl accessible on the surface of the thrombin / rHVl complex are located exclusively in the N-terminal domain, as suggested by the crystalline structural of the thrombin / hirudin complex (Grutter et al., EMBO Journal 9, 2361, nineteen ninety).
MAb 4158-81-7 não seliga ao complexo trombina/rHVl em solução, mas liga-se ao complexo adsorvido numa superfície sólida como seja uma placa de microtitulação ou apresentado por um anticorpo como seja o MAb EST6 ou MAb 4107-76-1. Em adição, o MAb 4158-81-7 não se liga ao complexo trombina biotinilada/rHVl (aoMAb 4158-81-7 does not bind to the thrombin / rHV1 complex in solution, but binds to the complex adsorbed on a solid surface such as a microtiter plate or presented by an antibody such as MAb EST6 or MAb 4107-76-1. In addition, MAb 4158-81-7 does not bind to the biotinylated thrombin / rHVl complex (when
contrário do MAb 4107-76-1, ver abaixo). Portanto, concluiu-se que a conformação do complexo trombina/rHVl em solução é diferente do comportamento num suporte sólido e que o domínio central de rHVl, ao qual se liga o MAb 4158-81-7, fica exposto apenas na última conformação. Segue-se que o MAb 4158-81-7 dã reacção cruzada com o complexo trombina/rHVl apenas em condições restrictas mas não em geral.contrary to MAb 4107-76-1, see below). Therefore, it was concluded that the conformation of the thrombin / rHVl complex in solution is different from the behavior on a solid support and that the central domain of rHVl, to which MAb 4158-81-7 is attached, is exposed only in the last conformation. It follows that MAb 4158-81-7 cross-reacts with the thrombin / rHV1 complex only under restricted conditions but not in general.
6.2 Os anticorpos monoclonais do gruno II6.2 Group II monoclonal antibodies
Entre os quatro MAbs do grupo II, apenas um MAb dá reacção cruzada com rHVl, no entanto com baixa afinidade. Como se mostra pela ELISA competitiva do exemplo 5.2, este MAb também dá reacção cruzada com o domínio central de rHVl (resíduos 1-43), indicando que ele está estreitamente relacionado com os MAbs do grupo I. Entre os restantes três MAbs, o MAb 4107-76-1 foi estudado mais detalhadamente pois liga-se muito fortemente ao complexo trombina/rHVl. Não se liga nem a rHVl nem a trombina em solução. No entanto, este MAb liga-se à trombina adsorvida às placas de microtitulação. Várias linhas de evidência sugerem que a ligação ocorre apenas quando a trombina está adsorvida a uma superfície sólida mas não quando está em solução. Em primeiro lugar nas experiências de filtração em gel por HPLC como descrito no exemplo 5.6, o MAb 4107-76-1 liga-se ao complexo, mas não à trombina livre. 0 MAb 4049-83-12 anti-rHVl que apenas reconhece rHVl livre, é usado como testemunha. Em segundo lugar, usando trombina biotinilada, o MAb 4107-76-1 liga-se apenas ao complexo e não à trombina biotinilada livre. Finalmente pela ELISA dupla em sanduíche com dois MAb usando o MAb EST6 para evitar adsorção directa da trombina à placa, a ligação do MAb 4107-76-1 ocorre apenas com o complexo mas não com trombina. Quando o peptídeo C-terminal de rHVl 40-65substitui rHVl no complexo, não ocorre ligação do MAb 4107-76-1, sugerindo que toda a molécula de rHVl éAmong the four MAbs in group II, only one MAb cross-reacts with rHV1, however with low affinity. As shown by the competitive ELISA in example 5.2, this MAb also cross-reacts with the central rHV1 domain (residues 1-43), indicating that it is closely related to group I MAbs. Among the remaining three MAbs, MAb 4107-76-1 has been studied in more detail as it binds very strongly to the thrombin / rHV1 complex. Neither rHVl nor thrombin in solution binds. However, this MAb binds to the thrombin adsorbed to the microtiter plates. Several lines of evidence suggest that binding occurs only when thrombin is adsorbed to a solid surface but not when it is in solution. First of all in HPLC gel filtration experiments as described in example 5.6, MAb 4107-76-1 binds to the complex, but not to free thrombin. MAb 4049-83-12 anti-rHV1, which only recognizes free rHV1, is used as a control. Second, using biotinylated thrombin, MAb 4107-76-1 binds only to the complex and not to free biotinylated thrombin. Finally by the double sandwich ELISA with two MAb using MAb EST6 to avoid direct adsorption of thrombin to the plate, the binding of MAb 4107-76-1 occurs only with the complex but not with thrombin. When the 40-65 rHVl C-terminal peptide replaces rHVl in the complex, MAb 4107-76-1 does not bind, suggesting that the entire rHVl molecule is
158, 1988), conforme (Grutter et al., loc.158, 1988), according to (Grutter et al., Loc.
necessária para a ligação. No entanto, a substituição de rHVl pela variante rHV3 reduz a ligação do MA 4107-76-1 ao complexo apenas parcialmente, sugerindo gue os MAbs reconhecem um determinante comum. Nem inibidores de baixo peso molecular nem heparina puderam induzir a ligação do MAb à trombina. Estes resultados sugerem que o MAb 4107-76-1 reconhece um neo-epítopo na trombina expresso quando da ligação de rHVl ou da adsorção de trombina a uma fase sólida. A trombina sofre alteração conformacional quando da ligação de rHVl (S. Konno et al., Arch. Biochem.Biophys. 267.necessary for the connection. However, the replacement of rHV1 by the rHV3 variant reduces the binding of MA 4107-76-1 to the complex only partially, suggesting that MAbs recognize a common determinant. Neither low molecular weight inhibitors nor heparin could induce the binding of MAb to thrombin. These results suggest that MAb 4107-76-1 recognizes a neoepitope in thrombin expressed upon binding of rHV1 or adsorbing thrombin to a solid phase. Thrombin undergoes conformational changes when rHV1 is bound (S. Konno et al., Arch. Biochem.Biophys. 267.
confirmado por dados de cristalografia cit.). Esta alteração conformacional deve criar neo-epítopos imunodominantes. A alteração conformacional ou mesmo a desnaturação de um antigênio quando da adsorção a uma superfície sólida está bem documentado e pode explicar a ligação do MAb 4107-76-1 à trombina adsorvida à superfície.confirmed by cit. crystallography data). This conformational change must create immunodominant neo-epitopes. Conformational change or even denaturation of an antigen upon adsorption to a solid surface is well documented and may explain the binding of MAb 4107-76-1 to thrombin adsorbed to the surface.
Alguns resultados de testes para o anticorpo monoclonal do grupo II MAb 4107-76-1 estão apresentados na Tabela 2.Some test results for the group II monoclonal antibody MAb 4107-76-1 are shown in Table 2.
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Tabela 2: Determinação por ELISA da ligação do complexo trombina/rHVl aos MAbs absorvância (405 nm) reagentes adicionadosTable 2: ELISA determination of the binding of the thrombin / rHVl complex to the MAbs absorbance (405 nm) added reagents
MAb4107-76-l| MAb EST6MAb4107-76-l | MAb EST6
A: Os reagentes foram adicionados às placas de microtitulação revestidas com os MAbs e foram reveladas com estreptavidina conjugada com fosfatase alcalinaA: The reagents were added to the MAbs-coated microtiter plates and developed with streptavidin conjugated to alkaline phosphatase
Exemplo 7 ELISA em sanduíche oara determinação do complexo trombina/hirudina no plasmaExample 7 Sandwich ELISA for the determination of the thrombin / hirudin complex in plasma
A determinação específica do complexo trombina/hirudina no plasma foi conseguida pela ELISA em sanduíche usando o MAb4107-76-l como anticorpo de captura e o MAb 4158-81-7 como segundo anticorpo. A ELISA é uma modificação da ELISA descrita no exemplo 5.4 por substituição do MAb EST6 com o MAb 4107-76-1 e foi realizada como descrito a seguir.Specific determination of the thrombin / hirudin complex in plasma was achieved by sandwich ELISA using MAb4107-76-1 as the capture antibody and MAb 4158-81-7 as the second antibody. ELISA is a modification of the ELISA described in example 5.4 by replacing MAb EST6 with MAb 4107-76-1 and was performed as described below.
Placas de microtitulação foram revestidas com o MAb 4107-76-1 (0,2 gg/100 gl). Após bloqueio com PBS-BSA 1% e lavagem com PBS-Tween 0,1%, 200 gl de plasma a ser testado foram adicionados à cavidade e incubados durante 2 horas. Então adicionaram-se consecutivamente os seguintes reagentes: (1) 0,5 gg/100 gl do MAb 4158-81-7 biotinilado durante 2 hors, (2) estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (diluido a 1:2500) durante 1,5 h, (3) substrato (ver exemplo 5.2). As incubações foram feitas aMicrotiter plates were coated with MAb 4107-76-1 (0.2 gg / 100 gl). After blocking with PBS-BSA 1% and washing with PBS-Tween 0.1%, 200 g of plasma to be tested were added to the well and incubated for 2 hours. Then the following reagents were added consecutively: (1) 0.5 gg / 100 g of biotinylated MAb 4158-81-7 for 2 hours, (2) streptavidin conjugated to alkaline phosphatase (diluted 1: 2500) for 1.5 hours h, (3) substrate (see example 5.2). Incubations were performed
22°c. Entre cada um dos passos as placas foram lavadas com22 ° c. Between each step the plates were washed with
PBS-Tween 0,1%. A absorvância foi controlada a 405 nm após 15 a minutos.0.1% PBS-Tween. Absorbance was controlled at 405 nm after 15 minutes.
teste permite a determinação da presença e/ou a concentração do complexo trombina/hirudina em concentrações que variam entre 1 e 200 ng/ml.The test allows the determination of the presence and / or concentration of the thrombin / hirudin complex in concentrations ranging from 1 to 200 ng / ml.
Exemplo 8 Kit de testes para uma ELISA para determinação do complexo trombina/hirudinaExample 8 Test kit for an ELISA for determining the thrombin / hirudin complex
Um Kit de testes para a ELISA descrito no exemplo 7 contem:An ELISA test kit described in example 7 contains:
. placas de microtitulação em cloreto de polivinilo;. microtiter plates in polyvinyl chloride;
. 20 ml do anticorpo monoclonal MAb 4107-76-1 (10^g/ml) em tampão de revestimento;. 20 ml of the MAb 4107-76-1 monoclonal antibody (10 µg / ml) in coating buffer;
. 20 ml do MAb 4158-81-7 biotinilado em PBS-Tween 0,1% (5 μ9/ιη1) ; . 2 ml de solução padrão contendo 5 ^g de rHVl;. 20 ml of biotinylated MAb 4158-81-7 in PBS-Tween 0.1% (5 μ9 / ιη1); . 2 ml of standard solution containing 5 µg rHV1;
. 300 ml de PBS-Tween 0,1%;. 300 ml of 0.1% PBS-Tween;
. 300 ml de PBS-BSA 1%;. 300 ml of 1% PBS-BSA;
. 0,5 ml de estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina;. 0.5 ml streptavidin conjugated to alkaline phosphatase;
. 50 ml de p-nitrofenilfosfato (1 mg/ml) em tampão de dietanolamina (10%, 0,5 mM MgCl2, 0,02% NaN^, ajustado a pH 8,9 com HCl);. 50 ml of p-nitrophenylphosphate (1 mg / ml) in diethanolamine buffer (10%, 0.5 mM MgCl 2 , 0.02% NaN ^, adjusted to pH 8.9 with HCl);
. curva de calibração;. calibration curve;
. escala de intensidade de cor;. color intensity scale;
. manual de instruções.. instruction manual.
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