PT99047B

PT99047B - Processo de preparacao de um meio de cultura de celulas de insecto , isento de soro, a base de um meio basal, de hidrolisado de levedura e de dextrano ou albumina

Info

Publication number: PT99047B
Application number: PT99047A
Authority: PT
Inventors: Luciano Ramos; Amy Anne Murnane; Melvin Susumu Oka
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1990-09-25
Filing date: 1991-09-25
Publication date: 1999-02-26
Also published as: NZ239899A; DE69128538T2; ATE161575T1; WO1992005247A1; DE69128538D1; AU663060B2; GR3026395T3; JP3224539B2; CA2091444A1; EP0550678A4; ES2112866T3; IE913346A1; DK0550678T3; PT99047A; EP0550678A1; EP0550678B1; CA2091444C; JPH06500922A; AU8844991A; MX9101253A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do invento presente invento refere-se ao campo dos meios para cultura de células. Mais particularmente o invento refere-se a meios de cultura de células de insectos.

Antecedentes do Invento

Verificou-se que para além de uma mistura basal nutriente de sais, açúcares, aminoácidos e vitaminas, as células in vitro também necessitam, para a proliferação, de um suplemento de fluidos ou extractos biológicos mal caracterizados. Devido à disponibilidade e facilidade de armazenamento, o suplemento mais comummente utilizado é o soro.

Contudo o uso de soro em meios de cultura de células tem várias desvantagens. 0 soro é comparativamente caro. Uma vez que o soro não é um componente definido, diferentes lotes de soro podem variar na concentração dos compostos presentes e, assim, podem resultar em crescimento de culturas não predizivel. 0 soro pode, também, estar contaminado com vírus ou com micoplasmas. A proteína no soro pode complicar a purificação dos produtos celulares a partir do meio de cultura.

Em esforços para ultrapassar as desvantagens do meio contendo soro, os investigadores têm tentado proporcionar meios isentos de soro substituindo o soro por componentes definidos ou melhor caracterizados. Infelizmente, a complexidade do soro e os diferentes requisitos de crescimento de diferentes tipos de células têm tornado difícil proporcional esses meios. Para revisões sobre os meios isentos de soro para culturas de células de insectos ver Mitsuhashi (1982) Contínuos Cultures of Insect Cell Lines in Media Free of Sera, Appl. Ent. Zool. 17.: 575-581; e Goodwin, Growth of insect cells in serum-free media in Technicrues in the life Sciences. Settinq Up and Maintenance of

Tissue and Cell Cultures. Elsevier Scientific Publishers Ireland, Ltd., (1985) pag. C109/1-C109/28. Lazar et al. (1987) Dev. Biol. Stand. 66.: 315-323 (Resumo) referem um meio isento de soro para a

-3'Ifc

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cultura de células Aedes aegypti que contém albumina de soro bovino.

A mosca do fruta Drosophila melanoqaster tem sido durante muitos anos o objecto de análise genética intensiva e foram desenvolvidos vários meios para a cultura de células de Drosophila. Xndow et al. (1989) J. Tissue Culture Methods 12; 13-16 descrevem um meio isento de soro para a cultura de células de Drosophila que contém hidrolisado de levedura e uma emulsão lipídica. Para meios contendo soro, ver Shields et al. (1975) J. Embryol. Exp. Morph. 3_3_: 159-175; Lengyel et al. Methods with Insect Cells in Suspension Culture II. Drosophila melanoqaster em Methods in Cell Biol. volume 10, pag. 195-208, (1975); Shields e Sang (1977) Drosophila Information Service, volume 52, pagina 161; Cross e Sang (1978) J. Embryol. exp. Morph. 45.; 161-172; Sang (1981) Drosophila Cells and Cell Lines em Advances in Cell Culture volume 1, pag. 125-182; e Ueda e Miyake (1987) In Vitro Cellular & Developemental Biology 23.: 707-711.

Tem havido algumas comunicações sobre meios isentos de soro contendo dextrano ou 0-ciclodextrina, contudo, os meios referidos são para a cultura de células de mamíferos. Pietrzkowski et al. (1988) Folia Histochemica et Cytobilogica 26; 123-132 referem um meio isento de soro para a cultura de células de embrião de galinha, contendo dextrano. Pietrzkowski e Korohoda (1988) Folia Histochemica et Cytobiologica 26; 143-154 referem um meio isento de soro, contendo dextrano, para a cultura de fibroblastos de embrião de galinha. Ohmori (1988) Journal of Immunological Methods 112: 227-233 refere um meio isento de soro que é capaz de suportar respostas primárias de anticorpo por linfõcitos murinos cultivados. Este meio é baseado num meio basal suplementado com j3-ciclodextrina, insulina, transferrina, albumina, lipoproteína de baixa dehsidade, putrescina e alanina.

Foi referido um meio isento de soro para a cultura em grande escala de células de insecto (Spodoptera fruqiperda) em Maiorella et al. . (19β8) Biotechnology 6.: 1406-1410. Para além de um meio basal, o meio continha extracto de levedura, ésteres metilicos de

-473 139 SBC 14534 ácidos gordos poli-insaturados de óleo de fígado de bacalhau, colesterol e Tween. Murhammer e Goochee (1988) Biotechnology 6.: 1411-1418 descrevem um meio para a cultura de Spodoptera fruqiperda que contém soro.

É um objectivo de invento proporcionar meios isentos de soro para a cultura de células de insectos. É também objectivo do invento proporcionar meios isentos de soro para cultura de células de insectos transformadas para produzirem produtos recombinantes que aumentam o rendimento em produto. É, ainda, um outro objectivo do invento proporcionar meios isentos de soro para a cultura de células de Drosophila.

Sumário do Invento presente invento proporciona meios para a cultura de células de insecto. O invento está mais particularmente especificado nas reivindicações em anexo e é descrito nas suas concretizações preferidas na descrição seguinte.

Descrição detalhada do invento

Os meios isentos de soro do invento são úteis para a cultura de células de insecto. Verificou-se que os meios do invento são úteis para a cultura de células de Drosophila e devem ter utilidade na cultura de uma larga variedade de células de insectos. As células podem ser cultivadas em culturas descontínuas e contínuas com os meios isentos de soro do invento. As células de Drosophila cultivadas nos meios do invento atingem densidade celular mais elevada e mostram segregação aumentada do produto recombinante, quando comparadas com células de Drosophila cultivadas num meio contendo soro. Os meios do invento têm um baixo teor em proteína o que vantajoso para a cultura de células para a produção de proteínas recombinantes. 0 baixo teor em proteínas dos meios reduz a quantidade de proteínas não desejadas que têm que ser separadas do produto proteico durante a purificação do produto proteico. Adicionalmente, os meios podem ser feitos a um custo muito mais baixo do que os meios contendo soro.

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-5Os meios para a cultura de células são preparados pela adição de suplementos a um meio basal concebido para a cultura de células de insectos. Os meios são preparados de acordo com procedimentos comuns para a preparação de meios de cultura de células.

Um meio basal preferido para a utilização dos meios isentos de soro do invento é descrito no Exemplo 1. Outros meios basais adequados incluem os meios de Grace (Gibco, Grand Island, New York) e de schneider (Gibco).

Adicionam-se, assim, suplementos ao meio basal. Adiciona-se hidrolisado de levedura na quantidade de cerca de 1 acerca de 10 gramas por litro. Adicionam-se dextrano ou albumina na quantidade de cerca de0,1 a cerca de 5 gramas por litro. A albumina para uso nos meios é, preferivelmente, albumina de soro bovino, contudo, também é adequada albumina de outras espécies. 0 dextrano para uso nos meios é, preferivelmente, dextrano com uma massa molecular de cerca de 500 000 como o Dextrano T-500. Numa concretização do invento, adiciona-se hidrolisado de lactalbumina na quantidade de cerca de 0,2 a cerca de 5 gramas por litro, preferivelmente na quantidade de cerca de 5 gramas por litro.

A gama de pH dos meios está, preferivelmente, na gama de 6,3 a cerca de 6,7. A osmolaridade está, preferivelmente, na gama de cerca de 320 a cerca de 360 miliosmoles.

O meio basal pode ser armazenado a 4°C durante um ano. 0 meio completo (meio basal com suplementos adicionados) numa forma líquida pode ser armazenado a 4°C durante seis meses.

Descrevem-se concretizações preferidas do invento nos Exemplos seguintes.

mi1igramas/1itro

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-6Exemplo 1

COMPONENTES DO MEIO BASAL: MEIOS ISENTOS DE SORO

COMPONENTES

MgSO₄.7H₂O	4,40
Glutamato de Potássio	7,88
Glutamato de Sódio	6,53
NaH₂PO₄.H₂O (monobásico)	0,78
Glucose	10,0
Ácido Oxaloacético	0,25
Bis-Tris	1,05
Ácido L-aspártico	0,30
L-Treonina	0,50
L-Serina	0,35
L-Asparagina	0,30
L-Glutamina	0,60
L-Prolina	0,40
Glicina	0,50
L-Alanina	1,50
L-Valina	0,40
L-Metionina	0,25
L-Isoleucina	0,25
L-Leucina	0,40
L-Tirosina	0,25
L-Fenilalanina	0,25
B-Alanina	0,25
L-Histidina	0,55
L-Triptofano	0,10
L-Arginina	0,50
L-Lisina.HCl	0,85
L-Cisteína.HCl	0,20
Cloreto de Colina	0,05
CaCl₂.2H₂O	1,00
KHCO₃	0,50
NaOH 1M	0 necessário

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-7Preparacão do Meio Basal;

Os componentes do meio basal são misturados e moídos num moinho de bolas para formularem um pó homogéneo. 0 meio em pó é, depois, colocado em pacotes de 100 1 e armazenado a 4’C até um ano.

Para um volume final de 100 1:

Medera-se para um recipiente de mistura adequado noventa litros de água desionizada-destilada. Adiciona-se um pacote de 100 1 do meio em pó, moído em moinho de bolas (como descrito anteriormente). Ajusta-se o pH do meio a 6,6 usando NaOH 10N. Leva-se o volume do meio a 100 1 pela adição de água. O meio pode, então,ser esterilizado por filtração em membrana usando um filtro de acetato de celulose de 0,2 micra.

Exemplo 2

O meio MR-D1 contém o meio basal do Exemplo 1 suplementado com 5 gramas por litro de hidrolisado de lactalbumina TC (Difco, Detroit, Miçhigan), 1 grama por litro de Yeastolate TC (Difco, Detroit, Miçhigan) e 1 grama por litro de albumina de soro bovino (Armour, Kankakee, Illinois). O meio é preparado com se segue:

Para um volume final de 100 litros

1. Medir 90 litros de água desionizada-destilada para um recipiente de mistura adequado.

2. Adiôionar um pacote de 100 1 do meio em pó, moído em moinho de bolas (do Exemplo 1).

3. Adicionar 500 gramas de hidrolisado de lactalbumina TC, misturar até à dissolução.

4. Adicionar 100 gramas de Yeastolate TC, misturar até à dissolução.

5. Adicionar 100 gramas de albumina de soro bovino, misturar até à dissolução.

6. Ajustar o pH a 6,6 usando NaOH 10 N.

7. Adiçionar água para levar o volume final a 100 litros e misturar completamente.

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8. Esterilizar por filtração usando um filtro de acetato de celulose de 0,2 micra.

9. Verificar a osmolaridade e registar.

10. Armazenar a 4°C durante até seis meses.

Exemplo 3 meio MR-D2 contém o meio basal do Exemplo 1 suplementado com 5 gramas por litro de Yeastolate TC (Difco, Detroit, Michigan) e 1 grama por litro de albumina de soro bovino (Armour, Kankakee, Illinois). O meio é preparado como se segue:

Para um volume final de 100 1

2. Adicionar um pacote de 100 1 de meio em pó, moído em moinho de bolas (do Exemplo 1).

3. Adicionar 500 gramas de Yeastolate TC, misturar até à dissolução.

4. Adicionar 100 gramas de albumina de soro bovino, misturar até à dissolução.

5. Ajustar o pH a 6,6 usando NaOH 10N.

6. Adicionar água para levar o volume final a 100 litros e misturar completamente.

7. Esterilizar por filtração usando um filtro de acetato de celulose de 0,2 micra.

8. Verificar a osmolaridade e registar.

9. Armazenar a 4°C durante até seis meses.

Exemplo 4 meio MR-D3 contém o meio basal do Exemplo 1 suplementado com 5 gramas por litro de Yeastolate TC (Difco, Detroit, Michigan) e 1 grama por litro de Dextrano T-500 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). O meio é preparado como se segue:

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-9“

Para um volume final de 1001

1. Medir 90 litros de água desionizada-destilada para um recipiente dé mistura adequado.

3. Adicionar 500 gramas de Yeastolate TC, misturar até à dissolução.

4. Adicionar 100 gramas de Dextrano T-500, misturar até à dissolução.

5. Ajustar o pH a 6,6 usando NaOH 10N.

8. Verificar a osmolaridade e registar.

9. Armazenar a 4C durante até seis meses.

Exemplo 5 Comparação do Crescimento de Células de Drosophila (ACC086) em M3+5%FBS, MR-D1 ou MR-d2 e produção de qp!20 nestes meios

Cultivaram-se células de Drosophila (linha celular ACC086) (2xl0⁶ por mililitro), que tinham sido transfectadas para expressarem a proteína gpl20 do vírus-1 da imunodeficiência humana, em meio M3 com 5% de soro de bovino fetal (FBS); em MR-Dl, o meio do Exemplo 2; ou em MR-D2, o meio do Exemplo 3. O meio M3 é o meio descrito no Exemplo 1 com a adição de 1 grama por litro d© Yeastolate (Difco, Detroit, Michigan). Cada um dos meios continha também 300 ^g/ml de higromicina b (HB), um antibiótico. As células foram cultivadas durante 14 dias e o número de células e a quantidade de gpl20 foi determinada em intervalos de tempo.

Como se mostra na Tabela 1, após sete dias, as células cultivadas em M3+%% FBS tinham uma densidade de l,6xl0⁷ e a concentraçãq era 956 ng/ml. As células cultivadas em meio MR-D1 e em meiofe MR-D2 tinham densidades de l,7xio⁷ e l,8xl0⁷,

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-10respectivamente e as concentrações de gpl20 eram de 916 ng/ml e 912 ng/ml, respectivamente. Contudo, após 14 dias de cultura, a densidade celular e a produção de gpl20 nos meios MR-D1 e MR-D2 eram significativamente mais elevadas do que no meio M3+5% FBS. No meio MR-D1, a densidade celular era 3,0xl0⁷ e a concentração de gpl20 era 1962 ng/ml. No meio MR-D2, a densidade celular era 2,7xl0⁷ e a concentração de gpl20 era 2750 ng/ml. Em contraste, a densidade das células cultivadas em meio M3+5% FBS era 2,lxl0⁷ e a concentração de gpl20 era 1207 ng/ml.

	Tabela 1
M3+5% FBS	MR-D1	MR-D2
+300 Mg/ml HB	+300 Mg/ml HB	+300 Mg/ml HB
CÉLULA #....GP120	CÉLULA #....GP120	CÉLULA #.... GP120

D 1.6e7..956ng/ml 1.7e7..916ng/ml 1.8e7..912ng/ml

D 2.1e7..1207ng/ml 3.0e7..1962ng/ml 2.7e7..2750ng7ml

Exemplo 6 Estudo de Longa Duração Comparando o Crescimento de

Células de Drosophila (Linha Celular ACC086) e Produção de qpl20 em Meios MR-D2 ou MR-D3

Cultivaram-se células de Drosophila (2xl0⁶ células por mililitro), que tinham sido transfectadas para exprimirem a proteína gpl20 do vírus-l da imunodeficiência humana (linha celular ACC086), num balão SP contendo 120 ml de meio MD-R2, o meio do Exemplo 3? ou MD-R3, o meio do Exemplo 4. As células foram passadas a intervalos de 7 dias e foram cultivadas durante 41 passagens.

Após 25 passagens, existiam aproximadamente 23xl0⁶ células no meio MR-D2. No meio MR-D3 existiam aproximadamente 19x10^ células por mililitro. Após 26 passagens a produção de gpl20 era de cerca 550 ng/ml em MR-D2 e 700 ng/ml em MR-D3. Após 30 passagens existiam aproximadamente 20xl0⁶ por mililitro em MR-D2 e aproximadamente 21xl0⁶ células por mililitro em MR-D3. Após 33

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SBC 14534 —11— passagens existiam aproximadamente 20χ10θ células por mililitro nos dois meios MR-D2 e MR-D3 e a produção de gpl20 era de cerca de 750 ng/ml em MR-D3 e 650 ng/ml em MR-D3.

Após 35 passagens existiam aproximadamente 19xl0⁶ células por mililitro no meio MR-D2 e aproximadamente 21χ10θ células por mililitro no meio MR-D3. A produção de gpl20 era de cerca de 550 ng/ml no meio MR-D2 e cerca de 500 ng/ml no meio MR-D3. Após 39 passagens existiam aproximadamente 20xl0⁶ por mililitro no meio MR-D2 e aproximadamente 19xl0⁶ células por mililitro em meio MR-D3. A produção de gpl20 era cerca de 375 ng/ml em meio MR-D2 e cerca de 525 ng/ml em meio MR-D3. Após 40 passagens, existiam aproximadamente 21xl0⁶ células por mililitro em meio MR-D2 e aproximadamente 19xl0⁶ por mililitro em meio MR-D3. A produção de gpl20 era cerca de 300 ng/ml em meio MR-D2 e cerca de 425 ng/ml em meio MR-D3.

Durante um período prolongado de tempo, o crescimento celular nestes meios isentos de soro era consistente apesar de a produção do produto gpl20 recombinante decrescer ligeiramente.

Claims

REIVINDICACÕES

1 - Processo de preparação de um meio de cultura de células de insecto, isento de soro, caracterizado por compreender misturar: (a) um meio basal sintético; com (b) cerca de 1 a cerca de 10 gramas por litro de hidrolisado de levedura; e (c) cerca de 0,1 a cerca de 5 gramas por litro de dextrano ou albumina.
2 - Processo por o hidrolisado gramas por litro.
3 - Processo por o hidrolisado gramas por litro.

de acordo com a reivindicação 1, caracterizado de levedura estar presente na quantidade de 2 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado de levedura estar presente na quantidade de 5 por
4 - Processo de acordo com o dextrano estar presente na a reivindicação quantidade de 1

1, caracterizado grama por litro.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o dextrano ser dextrano com uma massa molecular de cerca de 500 ooo.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a albumina estar presente na quantidade de 1 grama por litro.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida albumina ser albumina de soro bovino.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se misturar ainda cerca de 0,2 a cerca de 5 gramas por litro de hidrolisado de albumina.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido hidrolisado de albumina ser hidrolisado de lactalbumina.
10 - Processo de preparação de um meio de cultura de células

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-13de insecto, isento de soro, caracterizado por compreender misturar: (a) um meio basal sintético; com (b) cerca de 2 gramas por litro de hidrolisado de levedura; (c) cerca de 1 grama por litro de albumina de soro? e (d) cerca de 5 gramas por litro de hidrolisado de albumina.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a referida albumina de soro ser albumina de soro bovino e o referido hidrolisado de albumina ser hidrolisado de lactalbumina.
12 - Processo de preparação de um meio de cultura de células de insecto, isento de soro, caracterizado por compreender misturar: (a) um meio basal sintético? com (b) cerca de 5 gramas por litro de hidrolisado de levedura; e (c) cerca de 1 grama por litro de albtimina.
13 - processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a referida albumina ser albumina de soro bovino.
14 - Processo de preparação de um meio de cultura de células de insecto, isento de soro, caracterizado por compreender misturar: (a) um meio basal sintético? com (b) cerca de 5 gramas por litro de hidrolisado de levedura? e (c) cerca de 1 grama por litro de dextrano.
15 - Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o referido dextrano ser dextrano com uma massa molecular de aproximadamente 500 000.