PT979278E

PT979278E - Métodos para detecção de resistência a compostos de lactona macrocíclica

Info

Publication number: PT979278E
Application number: PT98917525T
Authority: PT
Inventors: Roger K Prichard; Ming Xu; Ana Paula Ribeiro; William J Blackhall; Robin N Beech; Marcelo Molento; Hao Yuan Liu
Original assignee: Univ Mcgill
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-29
Publication date: 2007-12-17
Also published as: AU748564C; US7358053B2; DE69838450D1; DK0979278T3; EP0979278A1; DE69838450T2; US6593087B2; WO1998049294A1; US20030190666A1; EP2305247A2; EP0979278B1; EP2305247A3; US20020037920A1; ES2294813T3; AU7073098A; NZ500430A; ATE373709T1; AU748564B2; US6403308B1; CA2288853A1

Description

ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Métodos para detecção de resistência a compostos de lactona macrocíclica"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo do Invento 0 presente invento refere-se a novos métodos para diagnóstico de resistência a compostos de lactona macrocíclica. Mais especificamente, o presente invento refere-se a métodos únicos para detecção do desenvolvimento de resistência a lactonas macrocíclicas utilizando sondas de ácido nucleico.

Descrição da Arte Relacionada

Compostos de lactona macrocíclica tais como os compostos LL-F28249, as milbemicinas e as avermectinas são amplamente utilizados para tratamento de parasitas nematodes e artrópodes. A família de compostos LL-F28249 altamente activa tem agentes endectocidas naturais isolados do caldo de fermentação de Streptomyces cyaneogriseus subesp. noncyanogenus. A Patente U.S. N.° 5106994 e a sua continuação Patente U.S. N.° 5169956 descrevem a preparação dos componentes principais e menos importantes, LL-F28249a-A. A família de compostos LL-F28249 inclui ainda, mas não se limita a, derivados 23-oxo e derivados 23-imino semi-sintéticos de LL-F28249a-À que são mostrados na Patente U.S. N.° 4916154. A moxidectina, quimicamente conhecida como 23-(O-metiloxima)-LL-F28249a, é um derivado 23-imino particularmente potente. Outros exemplos de derivados de LL-F28249 incluem, mas não se limitam a, 23-(O-metiloxima)-5-(fenoxiacetoxi)-LL-F28249a, 23-(semicarbazona)-LL-F28249a e 23-(tio-semicarbazona)-LL-F28249a.

As milbemicinas, também conhecidas como a série B-41 de antibióticos, são lactonas macrocíclicas de ocorrência natural isoladas a partir do microrganismo Streptomyces hygroscopicus subesp. aureolacrimosus. A Patente U.S. N.° 3950360 mostra a preparação dos antibióticos macrólidos milbemicinaai-aio, 2 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ milbemicinapi-pio, etc. Estes compostos são também vulgarmente referidos como milbemicina A, milbemicina B, milbemicina D e semelhantes, ou antibiótico B-41A1, antibiótico B-41A3, etc.

As avermectinas, também conhecidas como a família de compostos C-076, são lactonas macrocíclicas de ocorrência natural produzidas pelo microrganismo do solo actinomiceto, Streptomyces avermitilis. A Patente U.S. N.° 4310519 divulga o isolamento e a preparação dos componentes principais Aia (p. ex., avermectina Aia), A2a, Bia e B2a, e dos menos importantes Alt (p. ex., avermectina A2b), A2b, Bia e B2b. A família C-076 engloba adicionalmente os derivados semi-sintéticos tais como as 22,23-di-hidroavermectinas descritas na Patente U.S. N.° 4199569. Os derivados semi-sintéticos incluem, mas não se limitam a, ivermectina, abamectina, doramectina, eprinomectina e semelhantes.

Foi encontrada resistência a todos os compostos de lactona macrocíclica de amplo espectro na maioria das regiões de todo o mundo onde os compostos são utilizados rotineiramente em produção animal. Por exemplo, a resistência ao fármaco ivermectina (IVM), quimicamente conhecido como 22,23-di-hidroavermectina Bb ou 22,23-di-hidro C-076 Bb e um membro vulgarmente utilizado da família dos fármacos avermectina, tornou-se um problema disseminado, particularmente em nematodes de ovelhas, cabras e gado (Shoop, Parasitol. Today 9: 154-159, 1993). Nalgumas partes do mundo, a sobrevivência da produção comercial de animais está ameaçada pelo desenvolvimento de resistência anti-helmíntica. Adicionalmente, existem provas conflituosas quanto a se a resistência à ivermectina (avermectina) confere resistência a milbemicinas relacionadas ou outros macrólidos (Arena et al., J. Parasitol. 81: 286-294, 1995; Oosthuizen e Erasmus, J. So. African Vet. Assoe. 64: 9-12, 1993; Pomroy e Whelan, Vet. Rec. 132: 416, 1993; Shoop, 1993; Condora et al., Vet. Rec. 132: 651-652, 1993; Pomroy et al., N.Z. Vet. J. 40: 76, 1992; Pankavich et al., Vet. Rec. 130: 241-242, 1992; Craig et al., Vet. Parasitol. 41: 329-333, 1992). Os mecanismos de resistência às avermectinas, às milbemicinas e a outros compostos de lactona macrocíclica permanecem desconhecidos. 3 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

As glicoproteínas Ρ (Pgp) foram identificadas há alguns anos como proteínas envolvidas em resistência a múltiplos fármacos (MDR) de células tumorais de mamifero (Julino e Ling, 1976; Gros e Buschman, 1993; Gotteesman e Pastan, 1993). As proteinas MDR podem também estar envolvidas em resistência a múltiplos fármacos nos parasitas protozoários Entamoeba histolytica (Whirth, Archivos De Investigacion Medica 21 (Sup. 1): 183-189, 1990; Samuelson et al.r Mol. Biochem. Parasitol. 38: 281-290, 1990), Leishmania enriietti (Chow, Mol. Biochem. Parasitol. 60: 195-208, 1993), L. dononani (Callahan et al., Mol. Biochem. Parasitol. 68: 145-149, 1994); e Plasmodium falciparum (Volkman et al., Mol. Biochem. Parasitol. 57: 203-211, 1993; Cowman et al., J. Cell Biol. 113: 1033-1042, 1991). Embora muitos investigadores acreditem que o mecanismo proposto para o envolvimento das Pgp na resistência a fármacos seja que as Pgp se comportem como uma bomba aumentando o efluxo de fármaco, Callahan et al. (1994) sugeriram que as Pgp podem funcionar diminuindo o influxo do fármaco. Contudo, o quadro geral de como as Pgp podem ser responsáveis pela resistência aos fármacos permanece obscuro.

Apenas recentemente homólogos de Pgp foram investigados em nematodes (Sangster, Parasitol. Today 10: 319-322, 1994; Lincke et al., EMBO j. 12: 1615-1620, 1993; Lincke et al., J. Mol. Biol. 228: 701-711, 1992). Três genes inteiros de Pgp e um gene parcial de Pgp do nematode de vida livre Caenorhabditis elegans, foram clonados, sequenciados e mapeados nos cromossomas I, IV e X (Lincke et al., 1992). Sangster et al., J. Cell Biochem. 17(Sup.): 1223, 1993, indicaram provas de vários genes parciais de Pgp no nematode parasitário Haemonchus contortus, embora faltasse informação da sequência. Experiências in vivo mostraram que a destruição do gene mdrl de ratinho, um gene de glicoproteina P, conduz a uma deficiência na barreira hemato-encefálica e a maior sensibilidade a fármacos nestes ratinhos (Schinkel et al., Cell 77:491-502, 1994). Os ratinhos com a deleção de mdrl eram 50-100 vezes mais sensíveis a ivermectina que os ratinhos normais.

Mostrou-se que a resistência a fármacos baseada na sobre-expressão da glicoproteina P era revertida por verapamil e vários outros bloqueadores de canais de cálcio, antagonistas 4 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ da calmodulina, esteróides e análogos hormonais, ciclosporinas, dipiridamole e outros agentes de reversão de MDR (Ford, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 9: 337-361, 1995). Contudo, não houve relatos nem sugestões na literatura para utilizar agentes de reversão da MDR para combater a resistência a pesticidas em nematodes e artrópodes.

Existe definitivamente a necessidade de compreender o mecanismo de resistência às lactonas macrociclicas, para sermos capazes de detectar uma resistência incipiente antes de se tornar flagrante e de ser difícil de gerir a saúde dos animais. A capacidade para reverter a resistência tem um grande potencial para a manutenção do controlo de parasitas no caso de um fracasso do tratamento convencional. Um objectivo importante do presente invento é assim determinar estes mecanismos de resistência para definir meios viáveis e sensíveis para detectar e superar a resistência problemática melhorando deste modo o controlo dos parasitas.

BREVE SUMÁRIO DO INVENTO

Até agora desconhecido, verifica-se agora que o mecanismo de resistência aos compostos de lactona macrocíclica é devido à sobre-expressão de novos homólogos da glicoproteína P. Foi também recentemente verificado que as moléculas de ácido nucleico codificando os homólogos da glicoproteína P ou fragmentos desta que regulam esta resistência são úteis como sondas únicas em métodos para diagnóstico de resistência às lactonas macrociclicas. 0 presente invento proporciona a utilização de acordo com a reivindicação 1 e uma molécula de ácido nucleico ou um seu fragmento de acordo com a reivindicação 9.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os antecedentes do presente invento e o seu afastamento da técnica serão aqui melhor descritos com referência aos desenhos anexos, em que: A Figura 1 mostra o produto de PCR de 432 pb que é gerado a partir de uma biblioteca de ADNc em pBluescript de 5 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

Haemonchus contortus como molde e iniciadores degenerados com base nos domínios de ligação ao ATP conservados dos genes das glicoproteinas P de Caenorhabditis elegans após electroforese num gel de agarose.

As Figuras 2A e 2B representam, respectivamente, a sequência nucleotidica do produto de PCR de 432 pb mostrado na Figura 1 e a tradução em aminoácidos prevista do ADNc (que corresponde a SEQ id N0:1 e SEQ ID N0:2, respectivamente). A Figura 3 mostra as autorradiografias de Northern blots do ARN extraído de ovos de estirpes de nematodes sensíveis e resistentes a ivermectina (MKIS e MKIR; ACIS e ACIR), respectivamente. 0 produto de PCR de 432 pb marcado com [32P], com homologia com Pgp, é utilizado como sonda e o fragmento de actina marcado com [32P] de pBAl é utilizado como segunda sonda.

As Figuras 4A e 4B representam a sequência de ADNc inteira (4175 pb) do clone PGP-A da biblioteca de ADNc de H. contortus com elevada homologia com glicoproteinas P conhecidas (que corresponde a SEQ ID N0:3). A Figura 5 representa a sequência de ADNc parcial (1810 pb) da extremidade 5' do clone PGP-A da biblioteca de ADNc de H. contortus (que corresponde a SEQ ID NO:4). A Figura 6 representa a sequência de ADNc parcial (2698 pb) da extremidade 3' do clone PGP-A da biblioteca de ADNc de H. contortus (que corresponde a SEQ ID NO:5). A Figura 7 representa a putativa tradução em aminoácidos (1275 aa) do ADNc de PGP-A (que corresponde a SEQ ID NO:6).

As Figuras 8A e 8B representam a sequência de ADNc parcial (3512 pb) da extremidade 3' do clone diferente mas aparentado PGP-0 da biblioteca de ADNc de H. contortus (que corresponde a SEQ ID NO:7). A Figura 9 representa a sequência de ADNc parcial (2681 pb) da extremidade 3' do clone aparentado mas diferente 6 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ PGP-B da biblioteca de ADNc de H. contortus (que corresponde a SEQ ID NO:8). A Figura 10 mostra as autorradiografias dos Southern blots do ADN genómico extraído de ovos de estirpes de H. contortus sensíveis e resistentes a ivermectina (MKIS e MKIR) após digestão com Pvull, electroforese e sondado com a sonda de Pgp de H. contortus de 432 pb marcada com [32P]. A Figura 11 mostra o polimorfismo de comprimento de restrição dos produtos de PCR do ADN de cada verme adulto macho de estirpes de H. contortus susceptíveis (pistas 1-9) ou resistentes (pistas 11-20) a ivermectina, gerados com os iniciadores de glicoproteína P PGP2S e PGPAS seguido de digestão com Dde I e separação em electrof orese em gel de poliacrilamida não desnaturante. As setas apontam para os três fragmentos de digestão que estão associados a resistência.

As Figuras 12a e 12B representam as sequências de ácido nucleico que constituem o iniciador de sentido directo PGP2S (Fig. 12A, que corresponde a SEQ ID NO:9) e o iniciador anti-sentido PGPAS (Fig. 12B, que corresponde a SEQ ID NO: 10) que são construídos a partir do clone de ADNc PGP-O-3' do homólogo da glicoproteína P do nematode (região de intrão de 53 pb) e são utilizados para gerar produtos de PCR que são diagnósticos de resistência a lactonas macrocíclicas endectocidas.

As Figuras 13A e 13B ilustram a eficácia da moxidectina (MOX) contra estirpes de H. contortus susceptíveis (Fig. 13A) ou resistentes (Fig. 13B) a moxidectina em gerbos.

As Figuras 14A e 14B ilustram a eficácia da ivermectina (IVM) contra estirpes de H. contortus susceptíveis (Fig. 14A) e resistentes (Fig. 14B) a moxidectina em gerbos.

As Figuras 15A e 15B ilustram a eficácia do verapamil (VRP) com ou sem ivermectina (IVM; DL50) contra estirpes de H. contortus susceptíveis (Fig. 15A) ou resistentes (Fig. 15B) a moxidectina em gerbos.

As Figuras 16A e 16B ilustram a eficácia da combinação de moxidectina (MOX; Fig. 16A) ou ivermectina (IVM; Fig. 16B) com 7 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ verapamil (VRP) contra uma estirpe de H. contortus resistente a moxidectina em gerbos.

As Figuras 17A, 17B e 17C ilustram, respectivamente, a digestão com Hinfl de fragmentos de PCR de glicoproteinas P do ADN de cada verme de H. contortus susceptivel, resistente a ivermectina e resistente a moxidectina, utilizando os iniciadores PGP2S e PGPAS, seguido de digestão e separação em electroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. As setas à direita das Figuras 17B e 17C apontam para os fragmentos de digestão que estão associados a resistência enquanto que as setas à esquerda indicam a posição e o tamanho dos marcadores padrão.

As Figuras 18A, 18B e 18C ilustram, respectivamente, a digestão com Alui de fragmentos de PCR de glicoproteinas P a partir do ADN de cada verme de H. contortus susceptivel, resistente a ivermectina e resistente a moxidectina, utilizando os iniciadores PGP2S e PGPAS, seguido de digestão e separação em electroforese de gel de poliacrilamida não desnaturante. As setas à direita nas Figuras 18B e 18C apontam para os fragmentos de digestão que estão associados a resistência enquanto que as setas à esquerda indicam a posição e o tamanho dos marcadores padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

De acordo com o presente invento, são proporcionadas novas moléculas de ácido nucleico purificadas e isoladas codificando novos homólogos de glicoproteinas P ou seus fragmentos que regulam a resistência a lactonas macrociclicas. Estes ácidos nucleicos têm utilidade como sondas em métodos inovadores para o diagnóstico inicial de uma resistência em desenvolvimento aos endectocidas. No passado, não havia métodos disponíveis de detecção de resistência a lactonas macrociclicas baseados em ADN ou ARN. Agora, apenas o presente invento proporciona a base genética da resistência e do diagnóstico de resistência utilizando sondas de ácido nucleico. A detecção inicial sob orientação do presente invento permite a manutenção do controlo adequado de parasitas e a manutenção da utilidade dos compostos de lactona macrociclica. Adicionalmente, o mecanismo de resistência às 8 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ lactonas macrocíclicas pode ser utilizado no desenvolvimento de pesquisas para identificação de novos agentes antiparasiticos.

Os novos métodos do presente invento que são úteis para detecção da resistência a compostos de lactona macrociclica em nematodes utilizam as novas sondas de ácido nucleico aqui descritas. Uma variedade de técnicas bem conhecidas dos peritos na arte podem ser empregues para a análise. Desejavelmente, o método detecta alterações no ADN ou ARNm genómico para proporcionar um meio viável para o diagnóstico de resistência a lactonas macrocíclicas.

Estes métodos incluem, por exemplo, Reacção em Cadeia com Polimerase (PCR), hibridação numa análise Southern blot, Dot blot ou Northern blot, ou a utilização de um anticorpo para uma sequência de péptidos correspondente à tradução das sequências nucleotídicas entre os novos iniciadores do presente invento de uma praga ou de uma mistura de pragas tais como vermes, utilizando iniciadores ou sondas, por exemplo, correspondentes à porção da sequência de ADNc de PGP-0 entre as sequências identificadas como PGP2S e PGPAS (ver Figs. 12A e 12B). Os iniciadores ou sondas alternativos dentro desta região que podem ser utilizados nos métodos do presente invento incluem, mas não se limitam a, todas as combinações de iniciadores de PCR ou sondas dentro desta região ou as de outras sequências homólogas de PGP tais como PGP-A, PGP-B, PGP-0 e semelhantes. Basicamente, a região de codificação dos genes homólogos de glicoproteínas P correspondentes às sequências de ADNc identificadas como PGP-A, PGP-A-3', PGP-B, PGP-B-3', PGP-0, PGP-0-3' e semelhantes é detectada através de PCR, Southern blot, Dot blot, Northern blot, Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP) e outros meios padrão de análise. Surpreendentemente, verificou-se que o padrão de digestão do fragmento de PCR, ou dos dados dos "blots" estão associados a características de susceptibilidade ou resistência que são diagnóstico do desenvolvimento de resistência a lactonas macrocíclicas. A Reacção em Cadeia com Polimerase (PCR) pode ser empregue para a detecção de resistência aos compostos de lactona macrociclica através da síntese de um produto de ácido 9 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ nucleico que possa ser sondado em conjunto com a análise

Southern blot ou inicialmente digerido com uma enzima de restrição para análise de RFLP tal como aqui descrito. Os iniciadores são utilizados para iniciar uma reacção de PCR utilizando os ácidos nucleicos extraídos do espécimen da praga. São utilizados para sintetizar uma ou mais sequências de glicoproteina P. Os produtos de PCR podem então ser cortados com enzimas de restrição e as sequências digeridas corridas num gel de electroforese. Exemplos de enzimas de restrição adequadas que podem ser empregues na digestão dos produtos de PCR incluem, mas não se limitam a, Alui, DdeI, Hinfl, Rsal e semelhantes. 0 padrão de bandas observado num Southern blot ou num Northern blot indica quais os alelos de glicoproteina P que estão presentes num espécimen da praga tal como o verme ou grupo de vermes. Alguns dos alelos podem estar associados a sensibilidade a lactonas macrociclicas e outros a resistência a lactonas macrociclicas. Os produtos de PCR, seguidos de digestões com enzimas de restrição, proporcionam meios viáveis para a detecção de resistência. 0 processo de corte dos produtos de PCR ou dos ácidos nucleicos tais como ADN para análise de RFLP aumenta grandemente a sensibilidade e especificidade do diagnóstico. A Reacção em Cadeia com Polimerase - Transcritase Inversa (RT-PCR) pode ser empregue de forma semelhante para a detecção de resistência a compostos de lactona macrociclica em pragas de nematodes ou artrópodes. Tipicamente, o arn de um espécimen de nematode ou artrópode é extraído e é utilizada transcritase inversa seguida de PCR, tal como aqui descrito, para detectar resistência.

Para fins de ilustração, os ácidos nucleicos, tipicamente ADN para o procedimento de PCR ou ARNm para RT-PCR, são extraídos do espécimen da praga, uma praga que se saiba ser resistente aos compostos de lactona macrociclica e uma praga que se saiba ser susceptível às lactonas macrociclicas. Os ácidos nucleicos, derivados das pragas resistente e susceptível, são utilizados como ponto de referência. 0 ADN ou ADNc, produzido a partir do ARNm através da Transcritase Inversa, é desnaturado e os iniciadores do presente invento são adicionados para formar uma mistura. As três misturas são sujeitas a muitos ciclos de PCR, normalmente digeridas com uma 10 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ enzima de restrição e sujeitas a electroforese em gel. Subsequentemente, o padrão e a intensidade das bandas do espécimen em relação aos ácidos nucleicos de referência, i.e., ADN ou ADNc, dos extractos da resistente e da susceptível são comparados para detectar a população resistente. Opcionalmente, é incluida no processo a hibridação de uma sonda do presente invento ou a utilização de um corante tal como brometo de etidio para ajudar na visualização das bandas.

As novas sondas são utilizadas no diagnóstico de resistência a lactonas macrociclicas através de detecção de susceptibilidade ou resistência às lactonas macrociclicas no ensaio de PCR. Os iniciadores que são utilizados no ensaio de PCR são construídos, por exemplo, a partir de sequências de ácido nucleico para os clones de ADNc homólogos das glicoproteinas P dos parasitas. Exemplos de iniciadores de PCR adequados que podem ser empregues na análise de PCR são os iniciadores PGP2S e PGPAS utilizados nas orientações de sentido directo e anti-sentido, respectivamente, que são construídos a partir de PGP-O-3' ou PGP-0 (ver Figs. 12A e 12B) . Os iniciadores podem também ser preparados a partir das sequências totais ou parciais de outros ácidos nucleicos de glicoproteinas P tais como PGP-A, PGP-A-3', PGP-B-3', PGP-O, etc. e as cadeias complementares destes que contenham a região verificada como sendo diagnóstico de resistência a lactonas macrociclicas. Sequências alternativas úteis podem ser obtidas através de meios convencionais tais como técnicas de hibridação sob condições padrão ou rigorosas. 0 Southern blot, o Dot blot ou o Northern blot podem ser preparados com as moléculas de ácido nucleico do espécimen de nematode ou artrópode e, utilizando uma sonda compreendendo uma das sequências da molécula de ácido nucleico codificando para resistência ou uma porção desta, pode-se comparar o nivel dos ácidos nucleicos extraídos do espécimen com o nivel dos ácidos nucleicos da sonda, por exemplo, através da medição ou detecção do nível de adn ou ARNm. Geralmente, são mapeados três extractos de ácido nucleico para fazer a comparação: do espécimen da praga, de uma praga que se sabe ser resistente e de uma praga que se sabe ser susceptível. No caso do Southern blot, é comparado o padrão das bandas. Com o Northern blot, é 11 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ comparado ο padrão ou a intensidade das bandas. Para o Dot blot, é comparada a intensidade dos pontos.

Outra técnica envolve a condução de uma análise de Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP) através da extracção dos ácidos nucleicos de um espécimen de nematode ou artrópode, digestão do ácido nucleico com uma enzima de restrição, utilização de uma sonda compreendendo uma das sequências da molécula de ácido nucleico codificando para resistência ou uma porção desta e comparando o padrão de digestão com o padrão de digestão de nematodes ou artrópodes que se saiba serem de populações resistentes ou sensíveis às lactonas macrocíclicas endectocidas. Quando o ADN é cortado com a enzima de restrição, corrido num gel e sondado sob a técnica de RFLP, a sonda híbrida com as sequências semelhantes, mas o seu comprimento variará dependendo de onde ocorrem os locais de restrição para essa enzima. Através da repetição da análise com o ADN de cada verme, são observados padrões ligeiramente diferentes devido a polimorfismo. Padrões específicos são diagnóstico para o gene de resistência. PvuII é um exemplo de uma enzima de restrição preferida que pode ser empregue para análise de RFLP. Outras enzimas de restrição convencionais conhecidas dos peritos na arte podem ser substituídas no método.

Um outro exemplo de um processo útil para detecção de resistência refere-se à produção de anticorpos que emprega os novos homólogos de proteínas PGP. Por exemplo, pode ser preparado um anticorpo para uma sequência do péptido correspondendo à tradução em aminoácidos dos ácidos nucleicos ou do fragmento destes codificando os homólogos das glicoproteínas P que regulam a resistência. Depois, um espécimen da praga de nematodes ou artrópodes, ou o extracto deste, é preparado para reagir com o anticorpo de cima. 0 espécimen ou o extracto reage com o anticorpo sob condições adequadas que permitam a ocorrência de ligação anticorpo-antigénio e, a partir daí, a presença da ligação anticorpo-antigénio é detectada através de métodos convencionais.

Os métodos acima descritos para a detecção de resistência aos compostos de lactona macrocíclica podem utilizar opcionalmente um ligando ou corante específico de 12 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ glicoproteínas Ρ. Normalmente, ο nível da glicoproteína Ρ no espécimen pode ser mais facilmente observado utilizando o ligando ou corante e comparado com os níveis obtidos em populações conhecidas de nematodes ou artrópodes resistentes e susceptíveis a lactonas macrocíclicas. 0 ligando ou corante é normalmente radiomarcado de modo a que possa ser facilmente detectado. Exemplos de ligandos adequados úteis neste método incluem, mas não se limitam a, prazosina, azidoprazosina, iodoaril-azidoprazosina e semelhantes. Pode ser empregue uma variedade de corantes convencionais tais como, por exemplo, rodamina 123, brometo de etídio e outros.

Para fins deste invento, a molécula de ácido nucleico pode ser ADN, ADNc ou ARN. Contudo, na concretização mais preferida deste invento, a sonda de ácido nucleico é uma molécula de ADNc. Muitos dos métodos antecedentes ilustram ácidos nucleicos extraídos de Haemonchus contortus. Está contemplado que o presente invento engloba a utilização de ácidos nucleicos recombinantes codificando para resistência ou susceptibilidade aos macrólidos bem como ácidos nucleicos isolados de outras estirpes de vermes ou espécies de pragas.

Os plasmídeos contendo ADNc derivado de Haemonchus contortus estão depositados em ligação ao presente pedido de patente e mantidos de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC), Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA. As sequências de ADNc aqui descritas estão contidas dentro de plasmídeos (pBluescript® II, comercialmente disponíveis em Stratagene Inc., La Jolla, CA) transformados em estirpes bacterianas de Escherichia coli XLI-blue. Os plasmídeos identificados como PGP-B-3', PGP-O-3' e PGP-A-5' foram depositados na ATCC a 29 de Janeiro de 1997 e foram-lhes atribuídos os Números de Designação ATCC 98307, 98309 e 98310, respectivamente. O plasmídeo PGP-A-3' foi depositado na ATCC a 26 de Fevereiro de 1997 e foi-lhe atribuído o Número de Designação ATCC 98336. Deve notar-se que outros plasmídeos, que podem ser facilmente construídos utilizando mutagénese dirigida ao local e as técnicas aqui descritas, estão também englobados no âmbito do presente invento. 13 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ É descrita a reversão de resistência única em parasitas a compostos de lactona macrociclica através de administração ou aplicação de agentes de reversão de resistência a múltiplos fármacos. Esta reversão de um problema de resistência existente permite ganhar novamente um controlo satisfatório dos parasitas. 0 nematode deste invento refere-se a insectos de colheitas e nematodes de colheitas ou mamíferos.

Desejavelmente, o agente de reversão da resistência a múltiplos fármacos é um bloqueador de canais do cálcio tal como verapamil, nifedipina e semelhantes; um antagonista da calmodulina tal como trifluoroperazina, proclorperazina e semelhantes; um análogo de alcaloides vinca tal como vindolina, taliblastina e semelhantes; um agente esteróide tal como progesterona e semelhantes; um agente hormonal tal como tamoxifeno, estradiol e semelhantes; um agente imunossupressor tal como ciclosporina A, SDZ-PSC 833 e semelhantes, um antibiótico tal como eritromicina, cefoperazona, ceftriaxona, tetraciclina e semelhantes; compostos mistos tais como dipiridamole, quinidina, reserpina, amiodarona, etc.; e outros agentes de reversão da resistência a múltiplos fármacos conhecidos dos versados na arte.

Para aumentar a eficácia dos macrólidos parasiticidas, os compostos são administrados a mamíferos oralmente, parentericamente, topicamente (actividade local) ou de modo transdérmico (actividade sistémica) dependendo da biodisponibilidade do produto medicinal seleccionado através da via de administração desejada. A administração parentérica dos produtos medicinais engloba qualquer meio para além de oralmente, tal como por exemplo, intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, intratraquealmente ou intra-ruminalmente, etc. É evidente que os agentes reversão da MDR são administrados em conjunto com a administração do composto de lactona macrociclica que encontra resistência nos nematodes ou nos artrópodes ectoparasitas ou endoparasitas de mamíferos. Contudo, a administração dos agentes de reversão da MDR pode ser feita antes ou durante a administração concorrente das lactonas macrocíclicas. Se o agente de reversão da MDR for dado antes do endectocida, o pessoal médico ou veterinário pode facilmente determinar através dos níveis sanguíneos apropriados, o quanto antes o agente de 14 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ reversão da MDR pode ser dado para aumentar a eficácia do macrólido. Tipicamente, o agente de reversão da MDR pode ser administrado dentro de 24 horas desde o inicio da terapia endectocida e, de preferência, dentro de 4 horas antes ou concomitantemente com a administração da lactona macrociclica.

Em termos de dosagem, a quantidade adequada do agente de reversão da MDR que é eficaz para aumentar a eficácia do composto de lactona macrociclica contra nematodes resistentes ou artrópodes resistentes ectoparasitas ou endoparasitas variará tipicamente dentro de um intervalo amplo de quantidades a uma variedade de concentrações. O agente de reversão da MDR particular seleccionado para utilizar com o endectocida especifico afectará claramente a dose útil do agente de reversão da MDR. Está contemplado que a selecção de dosagens apropriadas de cada agente de reversão da MDR e do composto de lactona macrociclica para alcançar a quantidade eficaz de aumento pesticida possa ser facilmente titulada através de testes de rotina conhecidos dos vulgares peritos nas artes médica e veterinária.

Para utilizar em tratamento parasiticida, os compostos de lactona macrociclica podem ser administrados oralmente numa forma de unidade de dosagem tal como uma cápsula, um bolo ou um comprimido. As cápsulas e os bolos compreendem o ingrediente activo misturado com um veiculo transportador convencional tal como amido, talco, estearato de magnésio ou fosfato dicálcico. As formas de dosagem unitária secas e sólidas são preparadas através da mistura de forma intima e uniforme do ingrediente activo com diluentes adequados finamente divididos, enchimentos, agentes desintegrantes e/ou aglutinantes tais como amido, lactose, talco, estearato de magnésio, gomas vegetais e semelhantes. Tais formulações de dosagem unitária podem ser amplamente variadas em relação ao seu peso total e teor de ingrediente activo dependendo de factores tais como o tipo e o peso do mamífero a tratar e o tipo e a gravidade da infecção ou infestação. Geralmente, a quantidade do composto macrocíclico dada em administração oral é de cerca de 0,001 mg a cerca de 10 mg por kg de peso corporal e, de preferência, de cerca de 1 mg a cerca de 5 mg por kg de peso corporal. Contudo, a quantidade variará 15 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ dependendo da extensão da resistência já desenvolvida no parasita.

Para animais, o composto de lactona macrociclica e muitos dos agentes de reversão da MDR podem também ser administrados através de um produto alimentar animal através da dispersão intima do ingrediente activo na ração ou utilizando como revestimento superficial ou na forma de pastilhas que possam ser adicionadas à ração pronta ou opcionalmente dadas em separado. Composições adequadas incluem ração pré-misturada ou suplementos nos quais o composto activo está presente em quantidades relativamente grandes, em que as referidas rações pré-misturadas ou suplementos são adequados para alimentação directa ao animal ou para adição à ração directamente ou após uma diluição intermédia ou um passo de mistura.

Transportadores ou diluentes tipicos adequados para tais composições incluem grãos secos de destiladores, farinha de milho, farinha de citrinos, residuos de fermentação, conchas de ostra moidas, derivados de trigo, melaço, farinha de carolo, ração edivel de feijão moído, grãos de soja, calcário esmagado e semelhantes. Os compostos activos são intimamente dispersos ao longo do transportador através de métodos tais como trituração, agitação, moagem ou rotação. As composições contendo cerca de 0,005% a cerca de 2,0%, em peso, do composto activo são particularmente adequadas como rações pré-misturadas .

Os suplementos da ração, que são dados directamente ao animal, contêm cerca de 0,0002% a 0,3%, em peso, dos compostos activos. Tais suplementos são adicionados à ração animal numa quantidade para dar à ração final a concentração de composto activo desejada para o tratamento ou controlo da doença parasitária resistente. Embora a concentração desejada do composto activo vá variar dependendo de uma variedade de factores tais como o composto particular empregue ou a gravidade da aflição, os compostos macrocíclicos do presente invento são normalmente dados a concentrações de cerca de 0,00001% a cerca de 0,02% na ração.

Alternativamente, os compostos podem ser administrados aos mamíferos afligidos de modo parentérico, caso em que o 16 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ ingrediente activo é dissolvido, disperso ou suspenso num veiculo transportador liquido estéril, isotónico e não tóxico. 0 material activo é misturado com o veiculo não tóxico farmaceuticamente aceitável, de preferência um óleo vegetal tal como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou semelhantes. Outros veículos parentéricos tais como propilenoglicol, glicerol e semelhantes podem também ser utilizados para formulações parentéricas.

Nas formulações parentéricas, os macrólidos activos são tipicamente dissolvidos ou suspensos na formulação em quantidade suficiente para proporcionar de cerca de 0,005% a cerca de 5,0%, em peso, do composto activo na referida formulação.

Convenientemente, os macrólidos podem também ser administrados a mamíferos afectados através da via tópica ou transdérmica para se alcançar um efeito local ou sistémico. Quando utilizados em animais, os compostos podem ser aplicados numa forma tipo drench líquido. O drench animal é normalmente uma solução, suspensão ou dispersão do composto activo, normalmente em água, juntamente com um agente de suspensão tal como bentonite e um agente molhante ou um excipiente semelhante. Geralmente, os drenches contêm também um agente anti-espuma. As formulações tipo drench contêm tipicamente cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, em peso, do composto macrocíclico activo. As formulações tipo drench preferidas contêm cerca de 0,01% a cerca de 0,1%, em peso.

Adicionalmente, os compostos macrocíclicos podem ser administrados através da aplicação de um gel, uma loção, uma solução, um creme ou um unguento na pele humana ou vertendo na pele ou coro do animal através de uma solução. As formulações tópicas ou transdérmicas compreendem o ingrediente activo em combinação com excipientes e transportadores inactivos convencionais. O creme, por exemplo, pode utilizar vaselina líquida, vaselina branca, propilenoglicol, álcool estearílico, álcool cetílico, laurilsulfato de sódio, tampão fosfato de sódio, polissorbatos, parabenos, cera emulsionante, copolímeros de blocos de polioxietileno-polioxipropileno, água purificada e semelhantes. Os unguentos, por exemplo, podem empregar vaselina, óleo mineral, cera mineral, glicerina e 17 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ semelhantes. As soluções tópicas podem proporcionar o ingrediente activo formulado com propilenoglicol, parabenos, hidroxipropilcelulose, conservantes. As formulações para verter podem consistir no ingrediente activo dissolvido num solvente inerte adequado, tal como dimetilsulfóxido, propilenoglicol, butoxietoxietanol e semelhantes. Uma formulação para verter particularmente útil compreende o ingrediente activo dissolvido ou disperso num solvente aromático, propionato de éter miristilico PPG-2, polibuteno, um agente antimicrobiano, um antioxidante e um óleo mineral ou vegetal não tóxico farmaceuticamente aceitável.

Para aumentar a eficácia dos macrólidos como agentes pesticidas, os agentes de reversão da resistência a múltiplos fármacos são aplicados às colheitas, sementes de colheitas ou ao solo ou à água nos quais as colheitas ou sementes crescem ou vão crescer numa quantidade eficaz de aumento pesticida. Os agentes de reversão da MDR podem ser aplicados antes ou concorrentemente com a aplicação da lactona macrociclica. Tipicamente, o agente de reversão da MDR será aplicado dentro de 4 horas antes ou, de preferência, concomitantemente com a aplicação da lactona macrociclica.

Em termos de taxas de aplicação, a quantidade adequada do agente de reversão da MDR que é eficaz para aumentar a eficácia do composto de lactona macrociclica contra pragas resistentes de colheita variará tipicamente dentro de uma ampla variedade de quantidades a uma variedade de concentrações e taxas. 0 agente de reversão da MDR particular seleccionado para utilizar com o pesticida da colheita terá claramente um efeito na taxa de aplicação do agente de reversão da MDR. Está contemplado que a escolha das quantidades, concentrações, taxas de vaporização e semelhantes apropriadas de cada agente de reversão da MDR e do composto de lactona macrociclica para alcançar a quantidade eficaz de aumento pesticida podem ser facilmente determinadas através de procedimentos de rotina conhecidos dos peritos na arte da agricultura.

Como agentes nematocidas úteis para proteger sementes de colheita ou as colheitas ou o produto das colheitas do ataque de pragas, os compostos podem ser formulados em grânulos 18 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ compactados secos, composições dispersáveis, pós molháveis, poeiras, concentrados em pó, microemulsões e semelhantes, todos eles se prestam para aplicação no solo, na água e na folhagem e proporcionam o requisito de protecção das plantas. Tais composições incluem os compostos do presente invento misturados com transportadores sólidos ou líquidos agronomicamente aceitáveis.

Na composição agrícola, os compostos activos são intimamente misturados ou moídos junto com os excipientes e transportadores em quantidades suficientes para proporcionar tipicamente de cerca de 3% a cerca de 20% em peso do composto de lactona macrocíclica na referida composição.

As composições são úteis no combate a pragas agrícolas que infligem danos nas colheitas enquanto estas crescem ou estão armazenadas. Os compostos são aplicados às colheitas em crescimento ou armazenadas utilizando técnicas conhecidas tais como sprays, pós, emulsões, pós molháveis, dispersáveis e semelhantes para proporcionar protecção contra infestação por pragas agrícolas.

Inesperadamente, verifica-se que o mecanismo de resistência ao composto de lactona macrocíclica é devido à sobre-expressão de novos homólogos das glicoproteínas P que causam um efluxo do anti-helmíntico do parasita. O presente invento ilustra o envolvimento dos genes dos homólogos de Pgp em resistência a IVM em H. contortus. A sobre-expressão de proteína Pgp em estirpes resistentes a IVM de H. contortus é mostrada ser regulada tanto pelo rearranjo do ADN genómico codificando os homólogos de Pgp como através da transcrição génica. O H. contortus em gerbos da Mongólia (Meriones unguículatus) foi utilizado para a avaliação da eficácia anti-helmíntica e mostrou-se que se correlaciona bem com estudos deste parasita em ovelhas (Conder et al., J. Parasitol. 78: 492-497, 1992). Empregando o modelo de gerbo, é descrito que agentes de reversão de múltiplos fármacos podem inesperadamente ser utilizados para aumentar a eficácia das lactonas macrocíclicas contra parasitas resistentes. Como exemplo representativo, mostra-se que o agente de reversão da 19 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ resistência a múltiplos fármacos (MDR), verapamil (VRP), aumenta de modo único a acção da moxidectina e da ivermectina contra H. contortus susceptivel e resistente à moxidectina.

Parasitas tais como H. contortus contêm genes de homólogos de Pgp que são expressos em diferentes estádios do ciclo de vida do parasita. Este invento verifica que o nivel de expressão da glicoproteina P é surpreendentemente elevado em diferentes estirpes que são resistentes a lactonas macrociclicas tais como ivermectina em comparação com os níveis em estirpes susceptíveis das quais as estirpes resistentes são derivadas. 0 maior nível de expressão de Pgp, em estirpes resistentes à ivermectina, está associado com uma alteração ao nível genómico.

As glicoproteínas P podem actuar como bombas moleculares para o efluxo de xenobióticos hidrófobos das células. Uma elevação no nível das glicoproteínas P é a base da resistência a múltiplos fármacos em células cancerígenas e parece também estar envolvida nalgumas formas de resistência a fármacos nalguns protozoários. Um nível elevado de Pgp não foi até agora descrito como o mecanismo de resistência a fármacos em parasitas nematodes. Esta é a primeira prova que mostra que a resistência à ivermectina pode ser devida a uma elevação nas glicoproteínas P. A resistência à ivermectina está a tornar-se um problema vulgar em parasitas nematodes de animais e potencialmente em parasitas artrópodes. É provável que a sua utilização continuada contra artrópodes conduza à selecção de uma resistência semelhante àquela em nematodes.

Existem provas de que a ivermectina partilha uma acção comum com outras avermectinas, tais como a doramectina, as milbemicinas (Arena et al., 1995) e a moxidectina. Pode-se prever que o desenvolvimento de resistência contra outros compostos de lactona macrocíclica envolverá a hiper-expressão de glicoproteina P conduzindo a elevadas taxas de efluxo do fármaco.

Este trabalho é significativo porque permite a detecção sensível de resistência a ivermectina e resistência a outros compostos de lactona macrocíclica em nematodes e artrópodes utilizando sondas de ADN e ADNc baseadas nas diferenças 20 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ demonstradas verificadas em digestões com Pvull do ADN de organismos resistentes e susceptiveis. Permite também a previsão do grau de resistência a partir do nivel de expressão da glicoproteina P com base nos níveis de ARNm de Pgp ou da proteína Pgp. Esta compreensão do mecanismo de resistência aos macrólidos permite que sejam sintetizados análogos activos que permanecerão eficazes na presença de um mecanismo de resistência baseado em mdr a outras lactonas macrocíclicas. Mais especificamente, os químicos que actuam sobre o modo de acção do receptor, o canal de cloreto regulado por glutamato (Arena et al., 1995), mas que não são eficientemente sujeitos a efluxo pela bomba da glicoproteina P, i.e., são substratos fracos para efluxo por Pgp, podem ser seleccionados para superar a resistência. Isto conduzirá a melhorias nos controlos de parasitas, especialmente na prevenção e tratamento de resistência à ivermectina e da resistência cruzada a outra ivermectinas, milbemicinas e aos compostos LL-F28249 .

Este invento proporciona novas provas de que na resistência a lactonas macrocíclicas endectocidas, tais como ivermectina, em parasitas nematodes e artrópodes dos animais, a expressão da glicoproteina P é elevada em comparação com o nível de expressão nas estirpes susceptiveis parentais do parasita. Mostra ainda que o maior nível de expressão está associado a diferenças, ao nível genómico, de genes de glicoproteínas P. Por exemplo, utilizando análise de Southern blot de ADN reunido e através de análise de PCR (Reacção em Cadeia da Polimerase) de cada verme, as diferenças são determinadas no ADN genómico para Pgp em Haemonchus contortus resistente a ivermectina em comparação com a estirpe parental susceptível, e a diversidade alélica para Pgp nos vermes resistentes parece estar marcadamente reduzida em comparação com a estirpe susceptível parental. Novas sondas de ácido nucleico que podem diferenciar entre parasitas susceptiveis e resistentes são agora verificadas e consideradas úteis na detecção precoce do desenvolvimento de resistência a compostos de lactona macrocíclica. É descrito que a resistência a macrolactonas pode ser superada através da utilização de um agente de reversão da MDR. Por exemplo, verapamil, um agente de reversão da MDR bem 21 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ conhecido e relativamente fraco, aumenta significativamente a eficácia da moxidectina contra H. contortus resistente a moxidectina. Os vermes resistentes à moxidectina mostram resistência secundária à ivermectina e a resistência à ivermectina é também superada com a utilização de um agente de reversão da MDR suave.

Os seguintes exemplos demonstram certos aspectos do presente invento. Contudo, deve entender-se que estes exemplos são apenas para fins de ilustração. Deve apreciar-se que embora tenham sido dadas condições de reacção típicas (p. ex., temperatura, tempos de reacção, etc.), as condições que estiverem tanto acima como abaixo dos intervalos especificados podem também ser utilizadas, apesar de serem geralmente menos convenientes. Os exemplos são conduzidos à temperatura ambiente (de cerca de 23°C a cerca de 28°C) e à pressão atmosférica. Todas as partes e percentagens aqui referidas são com base no peso e todas as temperaturas são expressas em graus centígrados a menos que especificado em contrário.

Uma melhor compreensão do presente invento pode ser obtida a partir dos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLO 1 Síntese por PCR e Clonaqem de um ADN de 432 pb para um Homólogo de Glicoproteínas P a partir de uma Biblioteca de ADNc de H. contortus

Com base nos domínios de ligação ao ATP altamente conservados da Pgp de C. elegans, é desenhado um par de iniciadores de PCR degenerados. O iniciador de sentido directo é 5'-ACNGTNGCNYTNGTNGG-3' (que corresponde a SEQ ID NO:11) e o iniciador anti-sentido é 5’-GCNSWNGTNGCYTCRTC-3’ (que corresponde a SEQ ID NO:12). A PCR é realizada durante 40 ciclos a uma temperatura desnaturante de 94°C durante 1 minuto, uma temperatura de ligação de 37°C durante 1 minuto e uma temperatura de extensão de 72°C durante 3 minutos utilizando uma biblioteca de ADNc de H. contortus (Geary et al., Mol. Biochem. Parasitol. 50: 295-306, 1992) como molde. Um produto de 432 pb é purificado através de electroforese em gel de agarose e o produto purificado é utilizado como molde 22 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ para um segundo ciclo de amplificação por PCR com os mesmos iniciadores. Um produto de 432 pb enriquecido é subsequentemente clonado num vector TA (Invitrogen) de acordo com protocolos padrão. Os plasmideos com inserções são transformados para Escherichia coli e depois plaqueados em placas LB-Ampicilina contendo um substrato cromogénico, X-GAL® (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido, comercialmente disponível em Gibco BRL, Bethesda, MD) (Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). São identificados dez clones como sequências do domínio de ligação a ATP da glicoproteína P. EXEMPLO 2

Pesquisa da Biblioteca de ADNc de H. contortus 0 fragmento de 432 pb é excisado através de EcoRI, marcado através de iniciação aleatória com [32P]-d-CTP e utilizado como sonda para pesquisar a biblioteca de ADNc (Sambrook et al., 1989). São pesquisados aproximadamente um milhão de clones e são identificados nove putativos clones. Os clones positivos são digeridos com PvuII e três deles contendo inserções do tamanho previsto são subsequentemente sequenciados. EXEMPLO 3

Estirpes de Parasitas São utilizados dois pares de estirpes de H. contortus susceptíveis e resistentes à ivermectina. 0 primeiro par é uma estirpe resistente à ivermectina (MFR) desenvolvida nos Merck Research Laboratories, Rahway, NJ (Rohrer et al., J. Parasitol. 80: 493-497, 1994) e a estirpe parental susceptível à ivermectina (MFS) da qual a estirpe resistente é seleccionada ao fim de dezassete gerações de selecção com ivermectina. O segundo par é uma estirpe resistente à ivermectina (ACR) desenvolvida em American Cyanamid Company, Princeton, NJ e a estirpe parental susceptível à ivermectina (ACS) da qual a estirpe resistente é seleccionada ao fim de catorze gerações de selecção com ivermectina. Está relatado 23 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ que a estirpe MFR é 10* mais resistente à DE95 em comparação com MFS, e a ACR, após doze gerações de selecção, verifica-se que é 6,3x mais resistente à DE95 em comparação com ACS. EXEMPLO 4

Extracção de ARN e Hibridação de Northern

Vermes adultos de H. contortus susceptíveis e resistentes a ivermectina são colhidos a partir do abomaso de ovelha (Lubega e Prichard, Biochem. Pharmacol. 41: 93-101, 1991). Os ovos de cada estirpe são colhidos e isolados a partir das fezes de ovelha (Weston et al., J. Parasítol. 14: 159-164, 1984) que foram previamente tornadas isentas de vermes e inoculadas com uma das quatro estirpes de H. contortus. ARN total é extraído de tecidos das estirpes susceptíveis e resistentes a ivermectina, respectivamente, utilizando Reagente TRIzol® (Gibco BRL Life Technlogies, Inc., Gaithersburg, MD, protocolo da companhia). O ARN total é corrido em electroforese de gel de formaldeído-agarose desnaturante e transferido para membranas de nylon com ligações H. As membranas são pré-hibridadas a 65°C em bissulfato de dextrano a 10%, SDS (dodecilsulfato de sódio) a 1%, NaCl 1,0 M durante 4 horas. O fragmento de Pgp de H. contortus de 432 pb marcado com 32P e uma sonda de actina consistindo no fragmento PstI de 1,25 kb de pBAl (Degen et al., J. Biol. Chem. 258: 12153, 1983) são misturados e incubados de um dia para o outro com as membranas a 65°C no mesmo tampão de hibridação. As membranas são lavadas com SSC 2x (mistura 1:2 de citrato trissódico e cloreto de sódio), SDS a 0,1% a 65°C durante 30 minutos e SSC 0,5x a 35°C durante 1 hora e depois autorradiografadas. São feitas análises de imagem das autorradiografias do gel para determinação quantitativa da expressão de ARNm, utilizando 0 programa IMAGE (0'Neil et al., Appl. Theor. Electrophor. 1: 163-167, 1989). As sondas de ADN de actina de uma fonte de ratinho, marcadas e hibridadas com o mesmo "blot", utilizando 0 mesmo método de cima, são utilizadas como controlo interno para o carregamento do ARNm. Os resultados são mostrados na Fig. 3 (S = estirpes não seleccionadas; R = estirpes seleccionadas com IVM; MKI = estirpes desenvolvidas em Merck Research Laboratories, Rahway, 24 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ NJ; ACI = estirpes desenvolvidas em American Cyanamid Company, Princeton, NJ). EXEMPLO 5

Southern blots É extraído ADN genómico de ambas as estirpes susceptíveis e resistentes a ivermectina (Sambrook et al.r 1989). São utilizadas quatro enzimas de restrição, EcoRI, Ciai, PvuII e EstI, para digerir o ADN genómico seguindo as orientações dos fornecedores. Cada reacção é realizada com ambas as estirpes resistentes e susceptíveis a ivermectina. Após uma digestão com enzima de restrição de um dia para o outro, as amostras são corridas em géis de agarose a 1% e depois transferidas para membranas com ligações H (Sambrook et al., 1989). As membranas com o ADN são expostas sob luz UV para fixar o ADN às membranas. As membranas são pré-hibridadas a 65°C em tampão (dextrano de enxofre a 10%, SDS a 1% e NaCl 1 M) durante pelo menos 4 horas. O fragmento de 432 pb, marcado com [32P], é adicionado como sonda e hibridado com o ADN genómico no tampão de pré-hibridação, de um dia para o outro. As membranas são subsequentemente lavadas duas vezes com SCC 2x durante 10 minutos, duas vezes com SCC lx durante 15 minutos e depois autorradiografadas.

RESULTADOS

Amplificação por PCR

Dois ciclos de amplificação por PCR geram um produto de 432 pb (Fig. 1) que é altamente homólogo ao domínio de ligação ao ATP conservado da glicoproteína P (Fig. 2A) . A putativa sequência de aminoácidos (Fig. 2B) mostra que este fragmento é altamente homólogo à glicoproteína P ou a proteínas resistentes a múltiplos fármacos de C. elegans, ratinho e outras espécies. Estes dados indicam que o fragmento de 432 pb representa a sequência de ligação ao ATP de um homólogo de Pgp de H. contortus. 25 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

Expressão de ARNm de Glicoproteína P em Estirpes de H. contortus Resistentes e Susceptíveis a Ivermectina

Uma única espécie animal pode ter uma Pgp diferente que pode variar de tamanho. A hibridação de Northern, com o produto de PCR homólogo de Pgp de H. contortus de 432 pb, mostra que o tamanho molecular do ARNm para a Pgp de H. contortus é de cerca de 4 kb. Contudo, verifica-se que os niveis de ARNm de Pgp em estirpes resistentes e susceptíveis a ivermectina de H. contortus são diferentes. Para ilustração, os resultados de vários Northern blots representativos em ARN de ovos de H. contortus são mostrados na Fig. 3. 0 ARN é também é também sondado com uma sonda de actina para permitir a correcção para diferentes quantidades de ARN carregadas nos géis. A intensidade da banda de ARNm de Pgp varia com a estirpe do parasita. Após correcção para a intensidade da banda de actina, verifica-se que a quantidade da banda de ARNm de 4 kb reconhecida pela sonda de Pgp de 432 pb é muito superior em ambas as estirpes resistentes a ivermectina em comparação com as suas respectivas estirpes precursoras susceptíveis a ivermectina. O aumento varia de 250% a 6 70% após padronização para a expressão do ARNm de actina em estirpes resistentes e susceptíveis ao fármaco (Tabela 1). Resultados semelhantes são também obtidos em comparações da expressão de Pgp utilizando ARN extraído de H. contortus de adulto. A Tabela 1 mostra a intensidade relativa de ARNm para a glicoproteína P e actina em estirpes de Haemonchus contortus susceptíveis e resistentes a ivermectina. O ARN é extraído de ovos das respectivas estirpes emparelhadas de Merck (MKI) e American Cyanamid (ACI). Cada par susceptível e resistente é processado ao mesmo tempo. O ARN é separado num gel de agarose e sondado com ambas as sondas radiomarcadas de 432 pb de Pgp de H. contortus e de actina de pBAl. A intensidade relativa de cada banda é determinada, após autorradiografia em gel, através de densitometria em gel. A intensidade de cada banda de Pgp é corrigida quanto à intensidade da sua banda de actina correspondente para ajustar para diferentes quantidades de ARN que tenham sido carregadas nos géis. Todas as comparações são 26 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ feitas aos pares (resistente (R) versus a correspondente susceptivel (S)). TABELA 1

Razão R/S corrigida 6,77 6,08 2,57 4,19

Comparação das estirpes MKIS/MKIR MKIS/MKIR MKIS/MKIR ACIS/ACIR

Sequenciação dos Homólogos da Glicoproteína P a partir da Biblioteca de ADNc de H. contortus

Os clones mais longos (4,2 kb, 3,5 kb e 2,7 kb) identificados utilizando a sonda de 432 pb, que se mostrou serem homólogos à glicoproteína P, são completa ou parcialmente sequenciados. As Figuras 4A a 4B mostram a sequência de ADNc completa para o clone de PGP-A (4175 pb) que possui elevada homologia com genes de glicoproteínas P conhecidos tal como a proteína putativa de resistência a múltiplos fármacos de Xenopus (Xemdr) e o gene cepgpK de C. elegans para glicoproteína P A. As Figuras 5 e 6 mostram a sequência parcial, na direcção de sentido directo (Fig. 5; PGP-A-5') e na direcção anti-sentido (Fig. 6; PGP-A'-3') do fragmento de ADNc que também é altamente homólogo à glicoproteína P. As Figuras 7-9 ilustram, respectivamente, a putativa tradução de aminoácidos do ADNc de PGP-A, a sequência de ADNc parcial da extremidade 3' do clone PGP-0 (3,5 kb), direcção anti-sentido, e a sequência de ADNc parcial da extremidade 3' do clone PGP-B (2,7 kb), direcção anti-sentido.

Diferenças no ADN Genómico Entre as Estirpes de H. contortus Resistentes e Susceptíveis a Ivermectina e Determinação de uma Sonda de Ácido Nucleico para a Detecção de Susceptibilidade ou

Resistência a Macrolactonas

As hibridações de ADN genómico mostram que pelo menos duas bandas são reconhecidas pela sonda de 432 pb em mapas de digestão de Ciai e PstI de ambas as estirpes susceptíveis e resistentes a ivermectina. Os mapas de digestão de EcoRl mostram três bandas que hibridam fortemente e uma banda clara 27 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ para ambas as estirpes susceptíveis e resistentes. Contudo, os padrões de digestão de PvuII são claramente diferentes entre as estirpes resistentes e susceptíveis a ivermectina (Fig. 10).

Os produtos de PCR são gerados utilizando pares de iniciadores que são específicos para genes de Pgp de parasitas. Num exemplo, o iniciador inverso é específico para uma região de 53 pares de bases de comprimento presente num dos clones de Pgp (PGP-O). O iniciador directo liga-se a uma região comum a múltiplos clones de Pgp. O ADN genómico extraído de cada macho adulto de H. contortus de populações sensíveis a IVM (24 vermes) e resistentes a IVM (29 vermes) (MKIS e MKIR) é utilizado como molde para amplificação por PCR. Os produtos de PCR de Pgp, com aproximadamente 900 pb de comprimento, são digeridos com a enzima de restrição DdeI e os produtos de digestão são separados através de electroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante (Fig. 11; ver também as Figs. 17A-18C que ilustram os padrões de restrição de diagnóstico para resistência após selecção com ivermectina ou moxidectina, utilizando diferentes estirpes de vermes e diferentes enzimas de restrição). O padrão de digestão para os vermes da população susceptível é variável, enquanto que para os vermes da população resistente é mais homogéneo. Um padrão de digestão idêntico de três bandas (setas) verifica-se em 20 dos 29 vermes da população resistente (Fig. 11, pistas 11-18 e 20, por exemplo), enquanto que apenas 4 ou 5 vermes da população susceptível possuem este padrão (Fig. 11, pistas 6 e 9, por exemplo). Exemplos das sondas são mostrados na Figuras 12A e 12B.

Estes resultados são repetidos várias vezes. Os dados de PCR e os dados de Southern blot indicam claramente que a selecção de resistência a endectocidas de lactonas macrocíclicas causa uma redução na diversidade genética dos alelos de Pgp e que as diferenças em Pgp ao nível do ADN podem ser detectadas através de técnicas de sondas específicas tais como PCR (Reacção em Cadeia com Polimerase), análise de Southern blot e RFLP (Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição). 28 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ Métodos Adicionais (Referência) EXEMPLO 6

Estabelecimento da DL5q para Moxidectina e Ivermectina Contra H. contortus Susceptível e Resistente a Moxidectina no Gerbo

Os gerbos, que são alimentados com uma ração comercial padrão à qual foi adicionada hidrocortisona a 0,02% 5 dias antes da infecção, são inoculados com 1000 H. contortus L3 sem revestimento. No dia 10 após a inoculação, os gerbos são tratados com água ou várias doses de moxidectina ou ivermectina oralmente. Cada grupo de tratamento contém 6 gerbos. As estirpes do parasita e as taxas de dose anti-helmíntica são mostradas na Tabela 2. Os resultados destas titulações das doses são mostrados nas Figuras 13A-14B. São utilizadas análises de probabilidade para estimar os níveis de DL50 para cada anti-helmíntico contra cada estirpe. A DL50 estimada de moxidectina contra as estirpes susceptível e resistente a moxidectina é de 0,010 e 0,017 mg/kg, respectivamente, e para a ivermectina os níveis estimados da DL5o são de 0,024 e 0,046 mg/kg, respectivamente.

Os resultados indicam que (i) a moxidectina é mais potente que a ivermectina contra ambas as estirpes susceptíveis e resistentes a moxidectina e (ii) os H. contortus resistentes a moxidectina são secundariamente resistentes a ivermectina.

Tabela 2. TAXAS DE DOSE (mg/kg) DE MOXIDECTINA (MOX) OU IVERMECTINA (IVM) CONTRA ESTIRPES DE H. contortus RESISTENTES E SUSCEPTÍVEIS A MOX EM GERBOS (n=6) COMPOSTO (mg/kg) SUSCEPTÍVEL (PF14) RESISTENTE (MOF14) CONTROLO — — MOX 0,0125 0,0125 MOX 0,025 0, 025 MOX 0,05 0,05 MOX 0,1 0,1 IVM 0,025 0, 025 IVM 0,1 0,1 IVM 0,4 0,4 IVM 1,6 1,6 29 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ EXEMPLO 7

Determinação da Toxidade e da Eficácia de Verapamil Sozinho e em Combinação com Ivermectina

Esta experiência é efectuada para determinar a toxidade de verapamil, um agente de reversão da MDR fraco, sozinho e em combinação com ivermectina, a eficácia de verapamil sozinho contra H. contortus e o efeito de verapamil a 20 mg/kg na eficácia da ivermectina contra vermes susceptiveis e resistentes a moxidectina. São utilizadas taxas de dose de verapamil entre 20 e 80 mg/kg sozinho ou em combinação com ivermectina a 0,024 e 0,046 mg/kg em gerbos infectados com H. contortus susceptivel e resistente a moxidectina. O verapamil é dado concomitantemente com a ivermectina através da via oral. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3. DEMONSTRAÇÃO DA TOXIDADE E EFICÁCIA DE VERAPAMIL (VRP) COM OU SEM IVERMECTINA CONTRA ESTIRPES DE H. contortus RESISTENTES OU SUSCEPTIVEIS A MOXIDECTINA EM GERBOS (n = # por grupo) COMPOSTO (mg/kg) # SUSCEPTIVEL (PF14) # RESISTENTE (MOF14) CONTROLO 5 5 VRP 20 5 5 VRP 40 3 3 VRP 60 3 3 VRP 80 3 3 IVM** 5 5 IVM/VRP 20 5 5 IVM/VRP 40 5 5 IVM/VRP 60 5 5 IVM/VRP 80 5 5 ** A dose de ivermectina é de 0, 024 mg/kg contra a estirpe PF14 e de 0,046 mg/kg contra a estirpe MOF14.

Uma vez que não são observadas mortes nem outros sinais de toxidade à taxa de dose de verapamil de 20 mg/kg, na ausência ou na presença de ivermectina, esta taxa de dose é 30 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ utilizada para subsequentes experiências de reversão da resistência. Verifica-se que o verapamil sozinho não possui um efeito significativo nas contagens de vermes a nenhuma das taxas de dose utilizadas. A toxidade de verapamil está resumida na Tabela 4.

Tabela 4. TOXIDADE DE VERAPAMIL PARA GERBOS VRP (mg/kg) MORTES - VRP SOZINHO MORTES - VRP + IVM* 20 0/10 0/10 40 0/5 2/10 60 1/6 1/10 80 3/7 2/10 * A ivermectina é utilizada a 0,24 mg/kg ou 0,046 mg/kg de acordo com a Tabela 3.

Devido à toxidade do verapamil a taxas de dose de 40 mg/kg e acima, apenas são considerados os efeitos de verapamil a 20 mg/kg na eficácia da ivermectina contra vermes susceptiveis e resistentes a moxidectina. Estes resultados, mostrados nas Figuras 15A e 15B, estão resumidos na Tabela 5. O verapamil a 20 mg/kg aumenta significativamente a eficácia da ivermectina contra os vermes resistentes a moxidectina.

Tabela 5. EFEITO DE VERAPAMIL (20 mg/kg) SOBRE A EFICÁCIA (%)

DE IVERMECTINA ESTIRPE SUSCEPTÍVEL (PF14) RESISTENTE A MOX (MOF14) TRATAMENTO (mg/kg) % DE EFICÁCIA* % DE EFICÁCIA* CONTROLO 0 0 VRP 20 17 (n.s.) -53 (n.s.) IVM# 54 (A) 79 (A) IVM#/VRP 20 92 (A) 96 (B) # A ivermectina é administrada a 0,024 mg/kg a gerbos infectados com a estirpe PF14 e a 0, 046 mg/kg a gerbos infectados com a estirpe MOF14. "n.s." indica que as contagens de vermes não são significativamente diferentes dos controlos, “A" significa significativamente diferente dos controlos, mas não de outras contagens de vermes, da mesma estirpe, com a mesma letra; "B" significa contagens de vermes significativamente diferentes de "A" para a mesma estirpe e taxa de dose de ivermectina. 31 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ EXEMPLO δ

Efeitos de Verapamil na Eficácia da Moxidectina e Ivermectina contra H. contortus Susceptível e Resistente a Moxidectina

Esta experiência é efectuada em gerbos para determinar os efeitos de verapamil a 20 mg/kg sobre a eficácia da moxidectina e ivermectina contra H. contortus susceptível e resistente a moxidectina. Todos os tratamentos têm 7 gerbos/grupo. As taxas de dose da moxidectina e da ivermectina são seleccionadas para dar aproximadamente 50% de eficácia na ausência de verapamil. Verapamil a 20 mg/kg aumenta significativamente a eficácia da moxidectina contra os vermes resistentes. O aumento observado quando o verapamil é co-administrado com ivermectina não é significativo nesta experiência uma vez que a eficácia obtida com ivermectina sozinha é já relativamente alta. Os resultados são mostrados na Tabela 6 (ver representação gráfica dos resultados nas Figuras 16A e 16B).

Tabela 6

EFEITO DE VERAPAMIL NA EFICÁCIA (%) DE MOXIDECTINA E IVERMECTINA CONTRA A ESTIRPE RESISTENTE A MOXIDECTINA DE H. contortus (MOF14) TRATAMENTO CONTAGENS DE VERMES (MÉDIA ± E.P.) SIGNIFICÂNCIA DA EFICÁCIA (%) A P<0,05 PLACEBO 46 ± 7 — A# VRP* 80 ± 9 -73 A MOX (0,017 mg/kg) 14 ± 3 70 B MOX (0,017 mg/kg) + VRP* 2 ± 1 96 C IVM (0, 028 mg/kg) 9 ± 1 80 B IVM (0,028 mg/kg) + VRP* 3 ± 1 93 B * O verapamil é administrado a 20 mg/kg. Todos os tratamentos são através da via oral. # Letras diferentes indicam que as contagens médias dos vermes são estatisticamente diferentes. Contudo, os resultados da ivermectina (± verapamil) não são comparados com os resultados da moxidectina (± verapamil). 0 verapamil por si próprio aumenta as contagens de vermes, mas a contagem média não é estatisticamente diferente da do controlo. 32 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

Esta experiência confirma que o fraco agente de reversão da MDR verapamil supera a resistência em nematodes às macrolactonas. Estes resultados são completamente consistentes com as provas moleculares acima de que a resistência às macrolactonas está associada à sobre-expressão de um homólogo das glicoproteinas P devido a uma alteração no ADN das glicoproteinas P em parasitas resistentes. Agentes de reversão da MDR mais potentes, tais como ciclosporina A, SDZ-PSC 833 ou outros potentes agentes de reversão podem, a baixas taxas de dose, aumentar marcadamente a eficácia dos endectocidas de lactonas macrociclicas contra parasitas resistentes.

No antecedente, foi proporcionada uma descrição detalhada de concretizações particulares do presente invento para fins de ilustração e não de limitação.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: McGill University (B) RUA: 845 Sherbrooke Street W. (C) CIDADE: Montreal (D) PROVÍNCIA: Quebec (E) PAÍS: Canadá (F) CÓDIGO POSTAL: H3A 2T5

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODOS PARA DETECÇÃO E REVERSÃO DE RESISTÊNCIA A COMPOSTOS DE LACTONA MACROCÍCLICA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/IB98/00735 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 29-ABRIL-1998 (C) CLASSIFICAÇÃO: 33 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 60/045,160 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 30-ABRIL-1997 (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 09/067,676 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-ABRIL-1998 (vii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE:

(A) NOME: SMART & BIGGAR

(B) RUA: P.O.BOX 2999, STATION D

(C) CIDADE: OTTAWA

(D) PROVÍNCIA: ONTARIO (E) PAÍS: CANADÁ (F) CÓDIGO POSTAL: KIP 5Y6 (G) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 73836-3 (viii) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (613)-232-2486 (B) TELEFAX: (613)-232-8440 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 432 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: ACGGTGGCGT TTGTTGGGCA GTCTGGTTGT GGAAAAAGCA CTGTGAAGGC GTTGTTGGAC 60 GGTTTTACAA TCAAAACAAG GGCGTGATTA CGGACGCCGA AAACATCAGA AACATGAACA 120 TACGCAATCT TCGTGAGCAA GTGTGTATTG TAAGCCAGGA ACCAACGCTG TTCGACTGTA 180 CCATCATGGA AAACATCTGT TACGGTCTCG ATCGACCCCA AGCTCCTACG AACAGGTTGT 240 TGCTGCAGCA AAATCGGTCG AGTCGAAATG GCGAACATTC ACAATTTTGT GCTGGGACTA 300 CCAGAGGGTT ACGATACGCG TGTTGGTGAG AAAGGCACTC AGCTGTCAGG CGGACAGAAG 360 AAACGAATAG CCATAGCCAG AGCGCTGATT CGAGATCCGC CTATACTTCT GCTGGATGAG 420 GCTACGACGG CC 432 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 144 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 34 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Thr vai Ala Phe Vai Gly Gin Ser Gly Cys Gly Lys Ser Thr Vai Lys 15 io 15

Ala Leu Leu Glu Arg Pbe Tyr Asn Gin Asn Lya Gly Vai Ile Thr Asp 20 25 30

Ala Glu Asn Ile Arg Asn Met Asn Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gin vai 35 40 45

Cys Ile Vai Ser Gin Glu Pro Thr Leu Phe Asp Cys Thr Ile Met Glu

Asn Ile Cya Tyr Gly Leu Asp Asp Pro Lys Leu Leu Arg Thr Gly Cys 55 70 75 80

Cys Cys Ser Lys Ile Gly Arg Vai Glu Met Ala Asn lie His Asn Phe 85 90 95

Vai Leu Gly Leu Pro Glu Gly Tyr Asp Thr Arg Vai Gly Glu Lys Gly 100 105 110

Thr Gin Leu ser Gly Gly Gin Lys Lys Arg ile Ala Ile Ala Arg Ala 115 120 125

Leu Ile Arg Asp Pro Pro Ile Leu Leu Leu Asp Glu Ala Thr Thr Ala 130 135 140 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4175 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGAGATCGTT CTCAAGCTGG TAAAATGTTC GAAAAAGGCC

AAGATGATGA ACGTATACCA TTACTCGGTT CATCCAAGAA AAGTTCAATC GGCGAAGTCA

GTAAAAAAGA AGAACCGCCT ACAATAACAA ACCGTGGAAT TCTCTCCTTA GCCACTACAT

TGGATTATGT GCTTCTTGCG GCTGGTACGC TGGCGCCGTG TGTTCATGGC GCTGGATTCT

CAGTACTCGG TATTGTACTC GGTGGTATGA CGACAGTCTT TCTCAGAGCT CAGAACTCAQ 35 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

AATTCGTTCT GGGCACTGTT AOTCGGGATC CTGAAGGGCT ACCAGCTCTT ACTAAGGAAG 3SO AATTTGACAC ACTAGTACGT AGGTATTGCT TATACTACCT TGGATTAGGC TTTGCTATGT 420 TTGCAACATC TTATATACAG ATTGTGTGTT GGGAGACGTT CGCCGAACGA ATTACCCATA 480 AATTACGAAA AATTTATCTA AAAGCCATAC TTCGGCAGCA GATCTCATGG TTTGACATTC S40 AACAAACAGG AAATCTCACA GCTCGTCTAA CCGATGATCT CGAACGTGTT CGTGAAGGAC ¢00 TTGGTGATAA ACTGTCGCXT TTTATACAAA TGGTGTCTGC TTTTGTGGCT GGTTTCTGTG «60 TAGGATTCGC GTATAGCTGG XCAATGACGC TCGTGATGAT GGTCGTGGC3 CCGTTTATAG 720 TTATTTCTGC TAATTGGATG TCAAAAATCG TTGCTACTAG GACCCAAGTT GAACAGGAAA 780 CCTACGCTGT TGCCGGTGCT ATAGCGGAGG AGACTTTCTC ATCOATACGA ACCGTACACT 840 CGATATGTGG CCATAAAAGA GAGCTAACAA GATTTGAGGC AGCGTTGGAG AAAGGACGTC 900 AGACAGGCCT TGTCAAATAT TTCTATATGG GTGTTGGTGT GGGATTTGGT CAGATGTGTA 960 CCTATGTGTC CTACGCCTTG GCTTTTTGGT ATGGCAGTGT ACTGATCATC AACGACCCTG 1020 CATTGGAXCa TGGCCGAATT TTCACAGTCT TTTTTGCTGT GATGTCCGGC TCAGCAGCTC 1080 TCGGCACATG TCTGCCACAT CTTAACACCA TATCCATCGC TCGAGGAGCG GTACGAAGTG 1140 TACTGTCAGT GATTAATAGT CGTCCAAAAA TCGATCCCTA TTCGTTAGAT GGCATTGTGC 1200 TCAACAATAT GAGAjGGATCT ATCCGCTTCA AGAACGTGCA TTTCTCCTAT CCTTCCCGAA 1260 GAACATTGCA GATATTGAAA GGTGTGTCAC TGCAAGTGTC GGCTGGCCAA AAAATTGCTT 1320 TGGTGGGTTC AAGCGGTTGT GGAAAGTCAA CGAACGTCAA TTTATTATTG AGATTTTATG 1380 ATCCGACAAG GGGAAAGGTA ACCATAGATG ATATTGATGT GTGTGATCTC AACGTGCAAA 1440 AACTTCGTGA ACAAATCGGT GTTGTTAGTC AGGAACCAGT GCTTTTCGAT GGCACACTAT 1500 TCGAAAATAT CAAGATGGGT TATGAACAGG CCACAATGGA GGAGGTCCAA GAAGCGTGCC 1560 GTGTGGCGAA TGCXGCCGAC TTCACCAAAC GACTTCCAGA AGGTTACGGC ACCCGAGTTG 1620 GTGAACGTGG TGTGCAGTTA AGTGGCGGAC AAAAGCAGCG AATTGCCATA GCTCGTGCGA 1680 36 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ TCATCAAGAA CCCTCGCATA CTGCTGCTCG ATGAAGCCAC CAGTGCTCTA GACACAGAAG 1740 CGGAATCAAT CGTGCAAGAG GCTCTGGAGA AGGCTCAAAA AGGGAGAACA ACCGTCATTG 1800 TAGCGCATCG TCTGTCTACT ATGAGAAACG TGGATCAGAT TTTCGTTTTC AAGAACGGAA 18$0 CGATCGTTGA GCAGGGCACT CATGCCGAGT TGATGAACAA ACGTGGAGTA TTCITTGAAA 1520 TGACTCAAGC ACAAGTCCTC CGACAAGAGA AGGAAGAGGA AGTTTTAGAT AGCGATGCGG 1980 AATCCGATGT CGTGTCACCG GATATTGCAT TACCCCATCT TAGTTCACTT CGATCCCGTA 2040 AAGAATCCAC AAGAAGTGCT ATCTCCGCGG TCCCCAGCGT TCGAAGTATG CAAAXCGAAA 2100 TGGAGGACCT TCGTGCCAAA CCAACTCCAA TGTCGAAAAT TTTCTATTTT AACCGTGACA 2160 AATGGGGATA TTTCATTTTG GGACTCATCG CCTGTATTAT TACTGGAACT GTTACACCGA 2220 CATTTGCAGT TTTATATGCG CAGATCATAC AGGTATACTC GGAACCTGTT GATCAAATGA 2280 AAGGCCATGT GCTGTTCTGG TGTGGAGCTT TCATCGTCAT TGGTCTCGTA CACGCTTXTG 2340

CqttcTTTTT CTCGGCTATT TGTTTGGGAC GTTGCGGCGA AGCGTTAACG AAAAAATTAC 2400 GTTTCGAGGC GTTCAAGAAC CTTCTGCGAC AGAATGTGGG ATTCTACGAC GAXATCCGAC 2460 ACGGTACCGG TAAACTCTGT ACGCGATTXG CTACAOATGC ACCCAATGTC CGATATGTGT 2520 TCACTCGACT TCCGGGTGTG CTTTCATCGG TGGTGACCAT AATTGGAGCT TTGGTTATTG 2580 GATTCATCXT CGGGTCGCAG CTGGCTXTGA TTCTTATGGT GATGGTACCG TTGATCAXCG 2640 GTAGTGGATA CTTCGAGATG CGCATGCAGT TTGGTAAGAA GATGCGTGAC ACAGAGCTTC 2700 TTGAAGAGGC TGGGAAAGTT GCCTCTCAAG CCGXGGAGAA CATTCGTACC GTGCATGCCC 2760 TGAATAGGCA AGAGCAGTTC CATTTCATGT ATTGCGAGTA TTTGAAGGAA CCCTATCGAG 2820 AAAATCTTTG CCAGGCGCAC ACCTACGGGG GTGTATTCGC GTTCTCACAA TCGTTGTTAT 2880 TCTTTAIGTA TGCTGTAGCA TTTTGGATTG GTGCAATCTT CGTGGACAAC CACAGCATGC 2940 AACCGATTGA CGTTTACCGA GTATTTTTCG CGTXCATGTT TTGTGGACAA ATGGTCGGCA 3000 ACATTTCTTC TTTTATTCCT GACGTTGTGA AAGCTCGCCT GGCTGCATCG CTCCTTXTCT 3060 37 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ ACCTTATCGA ACACCCATCA GAAATTGATA ATTTGTCCGA GGATGGTGTC ACGAAGAAAA 3120 TCTCTGGTCA TATCTCGTTC CGCAATGTCT ATTTCAATTA XCCGACAAGA AGACAGATCA 3180 GAGTACTCCG TGSACTTAAC CTAGAGATAA ATCCTGGCAC GACGGTAGCG CTTGTTGGGC 3240 AGTCTGGTTG TGGAAAAAGC ACTGTGATGG CGTTGTTGGA ACGGTTTTAC AATCAAAACA 3300 AGGGCGTGAT TACGGTGGAC GGCSAAAACA TCAGAAACAT GAACATACGC AATCTTCGTG 3360 AGCAAGTGTG TATTGTTAGC CAGGAACCAA CGCTGTTCGA CTGTACCATC ATGGAAAACA 3420 TCTGTTACGG TCTCGATGAC CCCAAGCCGT CCTACGAACA GGTTGTTGCT GCAGCAAAAA 3480 TGGCGAACAT TCACAATTTT GTGCTGGGAC TACCAGAGGG TTACGATACG CGTGTTGGTQ 3540 ARAAAGGCAC TCAGCTGTCA GGCGGACAGA AGCAACGAAT AGCCAXAGCC AGAGCGCTGA 3600 TTCGA6ATCC GCCTATACTT CTGCTGGATG AGGCGACAAG CGCGCTGGAT ACCGAGAGTG 3660 AAAAGATCGT GCAAGACGCC CTAGAGGTTG CTCGCCAAGG TAGAACGTGC CTTGTAATTG 3720 CCCATCGCCT TTCTACAATT CAAGACAGTG ACGTCATAGT GATGATCCAG GAGGGGAAAG 3780 CTACAGACAG AGGCACTCAT GAACATTTAC TGATGAAGAA CGATCTATAC AAACGGCTAT 3840 GCGAAACACA ACGACTCGTT GAATCACAAT GAGTTTTTAG TGCCAATCGA XAGTGATCGA 3900 XAAGCTATGG ATTAGTCTTT AACACTTACT GATCATATGA CTCTATCTCG TGCTTTATTA 3960 TAATGTACAT ATGTAATGGT TTTGATCTTA CATATCTTGT AATTGGTCCT CACTATCATA 4020 ATGCCTTTAG TAGTATATTA ACAGTTTTAT TAATACAACT TAAGTAACAT ATTAACAATT 4080 ΤΤΑΤΤΑΑΤΑΤ AACTTAAGTA AGATATTGAC AGTTTTATTA ATTTGGAGGA ΤΤΤΑΤΑΑΤΑΑ 4140 AACCTCGTGC CGCTCGTGCC GAAACGATAT CAAGC 4175 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1810 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: 38 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGAGATCGTT CTCAAGCTGG TAAAATGTTC GAAAAAGGCC 60 AAGATGATGA ACGTATACCA TTACTCGGTT CATCCAAGAA AAGTTCAATC G6CGAAGTCA 120 GTAAAAAAGA AGAACCGCCT ACAATAACAA ACCGTGGAAT TCTCTCCTTA GCCACIACAT 180 TGGATTATGT GCTTCTTGCG GCTGGTACGC TGGCGCCGTG TGTTCATGGC GCTGGATTCT 240 CAGTACTCSG TATTGTACTC GGTGGTATGA COACAGTCTT TCTCAGAGCT CAGAACTCAG 300 AATTCGTTCT GGGCACTGTT AGTCGGGAXC CTGAAGGGCT ACCAGCTCTT ACTAAGGAAG 360 AATTTGACAC ACTAGTACGT AGGTATTGCT TATACTACCT TGGATTAGGC TTTGCTATGT 420 TTGCAACATC TTATATACAG ATTGTGTGTT GGGAGACGTT CGCCGAACGA ATEACCCATA 480 AATTACGAAA AATTTATCTA AAAGCCAIAC TTCGGCAGCA GATCTCATGG TTTGACATTC 540 AACAAACAGG AAATCTCACA GCTCGTCTAA CCGATGATCT CGAACGTGTT CGTGAAGGAC 600 TTGGTGATAA ACTGTCGCTT TTTATACAAA TGGTGTCTGC XTTTGTGGCT GGTTTCTGTG 660 TAGGATTCGC GTATAGCTGG TCAATOACGC TCGTGATGAT GGTCGTGGCG CCGTTTATAG 720 TTATTTCTGC XAATTGGATG TCAAAAATCG TTGCTACXAG GACCCAAGTT GAACAGGAAA 780 CCTACGCTGT TGCCGGTGCT ATAGCGGAGG AGACTTTCTC ATCGATACGA ACCGTACACT 840 CGATATGTGG CCATAAAAGA GAGCTAACAA GATTTGAGGC AGCGTTGGAG AAAGGACGTC 900 AGACAGGCCT TGTCAAATAT TTCTATATGG GTGTTGGTGT GGGATTTGGT CAGATGTGTA 960 CCTATGTGTC CTACGCCTTG GCTTTTTGGT ATGGCAGTGT ACTGATCATC AACGACCCTG 1020 CATTGGATCG TGGCCGAATT TTCACAGTCT TTTTTGCTGT GATGTCCGGC TCAGCAGCTC 1080 TCGGCACATG TCTGCCACAT CTTAACACCA TATCCATCGC TCGAGGAGCG GTACGAAGTG 1140 TACTGTCAGT GATTAATAGT CGTCCAAAAA TCGATCCCTA TTCGTTAGAT GGCATTGTGC 1200 TCAACAATAT GAGAGGATCT ATCCGCTTCA AGAACGTGCA TTTCTCCTAT CCTTCCCGAA 1260 1320 39 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ GAACATTGCA GATATTGAAA GGTGTGTCAC TGCAAGTGTC GGCTGGCCAA AAAATTGCTT TGGTGGGTTC AAGCGGTTGT GGAAAGTCAA CGAACGTCAA TTTATTATTG AGATTTTATG ATCCGACAAG GGGAAAGGTA ACCATAGATG ATATTGATGT GTGTGATCTC AACGTGCAAA AACTTCGTGA ACAAATCGGT GTTGTTAGTC AGGAACCAGT GCTTTTCGAT GGCACACTAT TCGAAAATAT CAAGATGGGT TATGAACAGG CCACAATGGA GGAGGTCCAA GAAGCGTGCC GTGTGGCGAA TGCTGCCGAC TTCACCAAAC GACTTCCAGA AGGTTACGGC ACCCGAGTTG GTGAACGTGG TGTGCAGTTA AGTGGCGGAC AAAAGCAGCG AATTGCCA1A GCTCGTGCGA TCAXCAAGAA CCCTCGCATA CTGCTGCXCG ATGAAGCCAC CAGTGCTCTA GACACAGAAG CGGAATCAAT CGTGCAAGAG GCTCTGGAGA AGGCTCAAAA AGGGAGAACA ACCGTCATTG TAGCGCATCG (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2698 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5 :

AGTGCTTTTC GATGGCACAC TATTCGAAAA TATCAAGATG GGTTATGAAC AGGCCACAAT

GGAGGAGGTC CAAGAAGCGT GCCGTGTGGC GAATGCTGCC GACTTCACCA AACGACTTCC AGAAGGT7AC GGCACCCGAG TTGGTGAACG TGGTGTGCAG TTAAGTGGCG GACAAAAGCA GCGAATTGCC ATAGCTCGTG CGATCATCAA GAACCCTCGC ATACTGCTGC TCGATGAAGC CACCAGTGCT CTAGACACAG AAGCGGAATC AATCGTGCAA GA5GCTCTGG AGAAGGCTCA AAAAGGGAGA ACAACCGTCA TTGTAGCGCA TCGTCTGTCT ACTATCAGAA ACGTGGATCA

GATTTTCGTT TTCAAGAACG GAACGATCGT TGAGCAGGGC ACTCATGCCG AGTTGATGAA 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1BQ0 1810 60 120 180 240 300 360 420 40 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ CAAACGTGGA GTATTCTTTG AAATGACTCA AGCACAAGTC CTCCGACAAG AGAAGGAAGA 480 GGAAGTTTTA GATAGCGATG CGGAATCCGA TGTCGTGTCA CCGGATATTG CATTACCCCA 540 ICTTAGXTCA CTTCGATCCC GTAAAGAATC CACAAGAAGT GCTATCTCCG CGGTCCCCAG 600 CGTTCGAAGT ATGCAAATCG AAATGGAGGA CCTTCGTGCC AAACCAACTC CAATGTCGAA 560 ÃATTTTCTAT XTTAACCGTS ACAAATGGGG ATATTTCATT TTG6GACTCA TCGCCTGTAT 720 TATTACTGGA ACTGTTACAC CGACATTTGC AGTTTTATAT GCGCAGATCA TACAGGTATA 780 CTCGGAACCT GTTGATCAAA TGAAAGGCCA TGTGCTGTTC TGGTGTGGAG CXTTCATCGX 840 CATTG3TCTC GTACACGCTT TTGCGTTCTT TTTCTCGGCT ATTTGTTTGG GACGTTGCGG 900 CGAAGCGTTA ACGAAAAAAT TACGTTXCGA GGCGTTCAAG AACCTTCTGC GACAGAATGT 960 GGGATTCTAC GACGATATCC GACACGGTAC CGGTAAACTC TGTACGCGAT TTGCTACAGA 1020 TGCACCCAAT GTCCGATAXG TGTTCACXCG ACTTCCGGGT GTGCTTTCAT CGGTGGTGAC 1080 CATAATTQGA GCTTTGGTTA TTGGATTCAT CTTCGGGTGG CAGCTGGCTT TGATTCTTAT 1140 GGXGATGGTA CCGTXGATCA TCGGTAGTGG ATACTTCGAG ATGCGCATGC AGTTXGGTAA 1200 GAAGATGCGT GACACAGAGC TTCTTGAAGA GGCTGGGAAA GTTGCCTCTC AAGCCGXGGA 1260 GAACATTCGT ACCGTGCATG CCCTGAAIAG GCAAGAGCAG TTCCATTTCA TGTATTGCGA 1320 GTATTTGAAG GAACCCTATC GAGAAAATCT TTGCCAGGCG CACACCXACG GGGGTGTAXT 1380 CGCGTTCTCA CAATCGTTGT TAXTCXTTAT GTATGCTGTA GCAXTTTGGA TTGGTGCAAT 1440 CTTCGTGGAC AACCACAGCA TGCAACCGAT TGACGTTTAC CGAGTAXTTT TCGCGTTCAT 1500 GTTTTGTGGA CAAATGGTCG GCAACATTTC TTCTTTTATT CCTGACGTTG TGAAAGCTCG 1560 CCTGGCTGCA TCGC7CCTTT TCTACCJ7AT CGAAGACCCA TCAGAAATTG RTAATnVTTC XS20 CGAGGATGGT GTCACGAAGA AAATCTCTGG TCATATCTCG TTCCGCAATG XCTATTTCAA 1680 TTAXCCGACA AGAAGACAGA TCAGAGTACT CCGTGGACTT AACCTAGAGA XAAAXCC1QG 1740 CACGACGGTA GCGCTTGTTG GGCAGTCTGG TTGTGGAAAA AGCACTGTGA TGGCGTTGTT 1800 41 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

GGAACGGTTT TACAATCAAA ACAAGGGCGX GATTACGGTG GACGGCGAAA ACATCAGAAA 18SO CATGAACATA CGCAATCTTC GTGAGCAAGT GTGTATTGTT AGCCAGGAAC CAACGCTGTT 1920 CGACTGTACC ATCATGGAAA ACAXCTGTTA CGGTCTCGAT GACCCCAAGC CGTCCTACGA 1980 ACAGGTTGTT GCTGCA6CAA AAATGGCGAA CATTCACAAT TTTGTGCTGG GACTACCAGA 2040 GGGTTACGAT ACGCGTGTTG GTGARAAAGG CACTCAGCTG TCAGGCGGAC AGAAGCAMCG 2100 AATAGCCATA GCCAGAGCGC TGATTCCAGA TCCGCCTATA CTTCTGCTGG ATGAGGCGAC 2160 AAGCGCGCTG GATACCGAGA GTGAAAAGAT CGTGCAAGAC GCCCTAGAGG TTGCTCGCCA 2220 AGGTAGAACG TGCCTTGTAA TTGCCCATCG CCTTTCTACA ATTCAAGACA GTGACGTCAT 2280 AGTGATGATC CAGGAGGGGA AAGCTACAGA CAGAGGCACT CATGAACATT TACTGATGAA 2340 GAACGATCTA TACAAACGGC TATGCGAAAC ACAACGACTC GTTGAATCAC AATGAGTTTT 2400 TAGTGCCAAT CGATAGTGAT CGATAAGCTA TGGATTAGTC TTTAACACTT ACTGATCATA 2460 TGACTCTATC TCGTGCTTTA TTATAATGTA CATATGTAAT GGTTTTGATC TTACATATCT 2S20 TGTAATTGGT CCTCACTATC ATAATSCCTT TAGTAGTATA TTAACAGTTT TATTAATACA 2580 ACTTAAGTAA CATATTAACA ΑΤΤΤΤΑΤΤΑΑ TATAACTTAA GTAAGATATT QACAGTTTXA 2640 TTAATTTGGA GGATTTATAA TAAAACCTCG TGCCGCTCGT GCCGAAACGA TATCAAGC 2698 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1275 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Met Phe Glu Lys Gly Gin Aap Asp Glu Arg Ile Pro Leu Leu Gly Ser 42 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

Ser Lys Lys ser Ser Ile Gly Glu Vai Ser Lys Lys Glu Glu Pro Pro 20 25 30

Thr Ile Thr Asn Arg Gly Ile Leu Ser Leu Ala Thx Thr Leu Asp Tyr 35 40 45

Vai Leu Leu Ala Ala Gly Thr Leu Ala Pro Cya Vai Eia Gly Ala Gly 50 55 €0

Phe Ser Vai Leu Gly Ile Vai Leu Gly Gly Met Thr Thr Vai Phe Leu 65 70 75 80

Arg Ala Gin Asn Ser Glu Phe Vai Leu Gly Thr Vai Ser Arg Aap Pro 85 90 95

Glu Gly Leu Pro Ala Leu Thr Lya Glu Glu Phe Aap Thr Leu Vai Arg 100 105 110

Arg Tyr Cya Leu Tyr Tyr Leu Gly Leu Gly Phe Ala Met Phe Ala Thr 115 120 125

Ser Tyr Ile Gin Ile Vai Cys Trp Glu Thr Phe Ala Glu Arg Ile Thr 130 135 140

Bis Lya Leu Arg Lys Ile Tyr Leu Lys Ala Ile Leu Arg Gin Gin Ile 145 150 155 160

Ser Trp Phe Asp Ile Gin Gin Thr Gly Asn Leu Thr Ala Arg Leu Thr 165 170 175

Asp Asp Leu Glu Arg Vai Arg Glu Gly Leu Gly Asp Lya Leu Ser Leu 180 185 190

Phe Ile Gin Met Vai Ser Ala Phe Vai Ala Gly Phe Cys Vai Gly Phe 195 200 205

Ala Tyr Ser Trp Ser Met Thr Leu Vai Met Met Vai Vai Ala Pro Phe 210 215 220

Ile val He Ser Ala Asn Trp Met Ser Lys Ile Vai Ala Thr Arg Thr 225 230 235 240

Gin Val Glu Gin Glu Thr Tyr Ala Val Ala Gly Ala Ile Ala Glu Glu 245 250 255 250 43 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

Thr Phe Ser Ser Ile Arg Thr Vai His Ser Ile Cys 51y His Lys Arg 260 265 270

Glli Leu Thr Arg Phe Glu Ala Ala Leu Glu Lys Gly Arg Gin. Thr Gly 275 280 285

Leu Vai Lys Tyr Phe Tyr Met Gly Vai Gly Vai Gly Phe Gly Gin Met 290 295 300

Cya Thr Tyr Vai Ser Tyr Ala Leu Ala Phe Trp Tyr Gly Ser Vai Leu 305 310 315 320 ile ile Aen Asp Pro Ala Leu Asp Arg Gly Arg Ile Phe Thr Vai Phe 325 330 335

Phe Ala Vai Met Ser Gly Ser Ala Ala Leu Gly Thr Cya Leu Pro His 340 345 350

Leu Asn Thr Ile Ser lie Ala Arg Gly Ala vai Arg Ser Vai Leu Ser 355 360 365

Vai Ile Asn Ser Arg Pro Lys lie Asp Pro Tyr Ser Leu Asp Gly Ile 370 375 380

Vai Leu Asn Asn Met Arg Gly Ser Ile Arg Phe Lya Aen Vai His Phe 385 390 395 400

Ser Tyr Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gin Ile Leu Lys Gly Vai Ser Leu 405 410 415

Gin Vai Ser Ala Gly Gin Lys Ile 420 Gly Lys Ser Thr Asn Vai Asn Leu 435 440 Arg Gly Lys Vai Thr Ile Asp Asp 450 455 Gin Lye Leu Arg Glu Gin Ile Gly 465 470 Phe Asp Gly Thr Leu Phe Glu Asn 485

Ala Leu Vai Gly Ser Ser Gly Cys 425 430

Leu Leu Arg Phe Tyr Asp Pro Thr 445

Ile Asp Vai Cys Asp Leu Asn Vai 460

Vai Vai Ser Gin Glu Pro Vai Leu 475 480

Ile Lys Met Gly Tyr Glu Gin Ala 490 495 44 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

Thr Met Glu Glu Vai Gin Glu Ala Cya Azg Vai Ala Asn Ala Ala Asp 500 505 510

Phe Thr Lys Arg Leu Pro Glu Gly Tyr Gly Thr Arg Vai Gly Glu Arg 515 520 525

Gly Vai Gin Leu Ser Gly Gly Gin Lya Gin Arg Ile Ala Ile Ala Arg 530 535 540

Ala Ile Ile Lys Asn Pro Arg Ile Leu Leu Leu Asp Glu Ala Thr Ser 545 550 555 560

Ala Leu Asp Thr Glu Ala Glu Ser Ile Vai Gin Glu Ala Leu Glu Lys 565 570 575

Ala Gin Lys Gly Arg Thr Thr Vai Ile Vai Ala His Leu Arg Ser Thr 580 585 590

Ile Arg Asn Vai Asp Gin ile Phe Vai Phe Lys Asn Gly Thr Ile Vai 595 600 605

Glu Gin Gly Thr His Ala Glu Leu Met Asn Lys Arg Gly vai Phe Phe 610 615 620

Glu Met Thr Gin Ala Gin Vai Leu Arg Gin Glu Lys Glu Glu Glu Vai 625 630 635 640

Leu Asp Ser Asp Ala Glu Ser Asp Vai Vai Ser Pro Asp Ile Ala Leu 645 650 655

Pro His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Arg Lys Glu Ser Thr Arg Ser Ala 660 665 670

Ile Ser Ala Vai Pro Ser Vai Arg Ser Met Gin. Ile Glu Met Glu Asp 675 680 685

Leu Arg Ala Lys Pro Thr Pro Met Ser Lye Ile Phe Tyr Phe Asn Arg 690 695 700

Asp Lys Trp Gly Tyr Phe Ile Leu Gly Leu Ile Ala Cys Ile Ile Thr 705 710 715 720

Gly Thr Vai Thr Pro Thr Phe Ala Vai Leu Tyr Ala Gin Ile Ile Gin 725 730 735 45 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

Vai Tyr Ser Glu Pro Vai Asp Gin Met Lys Gly His Vai Leu Phe Trp 740 745 750 cys Gly Ala Phe Ile vai Ile Gly Leu Vai His Ala Phe Ala Phe Phe 755 760 765

Phe ser Ala ile Cys Leu Gly Arg cys Gly Glu Ala Leu Thr Lys Lys 770 775 780

Leu Arg Phe Glu Ala Phe Lys Asn Leu Leu Arg Gin Ass Vai Gly Phe 785 790 795 800

Tyr Asp Asp Ile Arg His Gly Thr Gly Lys Leu Cys Thr Arg Phe Ala 805 810 815

Thr Asp Ala Pro Asn vai Arg Tyr vai Phe Thr Arg Leu Pro Gly Vai 830 825 830

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Ile Ile Gly Ala Leu Vai Ile Gly Phe Ile 835 840 845

Phe Gly Trp Gin Leu Ala Leu Ile Leu Met Vai Met Vai Pro Leu Ile 850 855 860

Ile Gly Ser Gly Tyr Phe Glu Met Arg Met Gin Phe Gly Lys Lys Met 865 870 875 880

Arg Asp Thr Glu Leu Leu Glu Glu Ala Gly Lys Vai Ala Ser Gin Ala 885 890 895

Vai Glu Asn Ile Arg Thr Vai His Ala Leu Asn Arg Gin Glu Gin Phe 900 905 910

His Phe Met Tyr Cys Glu Tyr Leu Lys Glu Pro Tyr Arg Glu Asn Leu 915 920 925

Cys Gin Ala His Thr Tyr Gly Gly Vai Phe Ala Phe Ser Gin Ser Leu 930 935 940

Leu Phe Phe Met Tyr Ala Vai Ala Phe Trp Ile Gly Ala lie Phe Vai 945 950 955 960

Asp Asn His Ser Met Gin Pro Ile Asp Vai Tyr Arg Vai Phe Phe Ala 965 970 975 46 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

Phe Met Phe cys Gly Gin Met Vai Gly Asn Ile Ser Ser Phe Ile Pro 980 985 990

Asp Vai Vai Lys Ala Arg Leu Ala Ala Ser Leu Leu Phe Tyr Leu Ile 995 1000 1005

Glu His Pr o Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ser Glu Asp Gly Vai Thr Lys 1010 1015 1020

Lys Ile Ser Gly Hls He Ser Phe Arg Asn Vai Tyr Phe Asn Tyr Pro 1025 1030 1035 1040

Thr Arg Arg Gin Ile Arg Vai Leu Arg Gly Leu Asn Leu Glu Ile Asn 1045 1050 1055

Pro Gly Thr Thr Vai Ala Leu Vai Gly Gin Ser Gly Cys Gly Lys Ser 1060 1065 1070

Thr Vai Met Ala Leu Leu Glu Arg Phe Tyr Asa Gin Asn Lys Gly Vai 1075 1080 1085

Ile Thr val Asp Gly Glu Asn Ile Arg Asn Met Asn Ile Arg Asn Leu 1090 1095 1100

Arg Glu Gin Val Cys Ile Val Ser Gin Glu Pro Thr Leu Phe Asp Cys 1105 1110 1115 1120

Thr Ile Met Glu Asn Ile Cys Tyr Gly Leu Asp Asp Pro Lys Pro Ser 1125 1130 1135

Tyr Glu Gin Val Val Ala Ala Ala Lys Met Ala Asn Ile Hls Asn Phe 1140 1145 1150

Val Leu Gly Leu Pro Glu Gly Tyr Asp Thr Arg val Gly Glu Lys Gly 1155 1160 1165

Thr Gin Leu Ser Gly Gly Gin Lys Gin Arg Ile Ala Ile Ala Arg Ala 1170 117S 1180

Leu Ile Arg Asp Pro Pro Ile Leu Leu Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ala 1185 1190 1195 1200

Leu Asp Thr Glu Ser Glu Lys Ile Val Gin Asp Ala Leu Glu Val Ala 1205 1210 1215 47 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ

Arg 61η Gly Arg Thr Cya Leu Vai Ile Ala Hia Arg Leu ser Thr Ile 1220 1225 1230

Gin Asp Ser Asp Vai Ile Vai Met Ile Gin Glu Gly Lya Ala Thr Asp 1235 1240 1245

Arg Gly Thr Bis Glu Hie Leu Leu Met Lys Asn Asp Leu Tyr Lys Arg 1250 1255 1260

Leu Cys Glu Thr Gin Arg Leu Vai Glu Ser Gin 1265 1270 1275 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3512 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

CCCGTTGTTG CCGGTGCTAT AGCGGAGGAG ACTTTCTCAT CGATACGAAC CGTACACTCG

TTATGTGGCC ATAAAAGAGA GCTAACAAGS CAGCGTTGGA GAAAGGACGT CAGACAGGCC TTGTCAAATA TTTCTATATG GGTGTTGGTG TGAGATTTGG TCAGATGTGT ACCTATGTGT CCTACGCCTT GGCTTTTTGG TATGGCAGTG TACTGATCAT CAACGACCCT GCATTGGATC GTGGCCGAAT TTTCACAGTC TTTTTGCTGT GATGTCCGGC TCAGCAGCTC TCGGCACATG TCTGCCACAT CTTAACACCA TATCCATCGC TCGAGGAGCG GTACGAAGTG TACTGTCAGT GATTAATAGT CGTCCAAAAA TCGATCCCTA TTCGTTAGAT GGCATTGTGC TCAACAATAT GAGAGGATCT ATTCGCTTCA AGAACG1GCA TTTCTCCTAT CCTTCCCGAA GAACATTGCA GATATTGAAA GGTGTGTCAC TGCAAGTGTC GGCTGGCCAA AAAATTGCTT TGGTGGGTTC AAGCGGTTGT GGAAAGTCAA CGATCGTCAA TTTATTATT5 AGATTTTATG ATCCGACAAG

GGGAAAGGTA ACCATAGATG ATATTGATGT GTGTGATCTC AACGTGCAAA AACTTCGTGA 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 48 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ ACAAATCGGT GTTGTTAGTC AGGAACCAGT GCTTTTCGAT GGCACACTAT TCGAAAATAT 720 CAAGATGGGT TATGAACAGG CCACAATGGA GGAGGTCCAA GAASCGTGCC GT6TGGCGAA 780 TGCTGCCGAC TTCATCAAAC GACTTCCAGA AGGTTACGGC ACCCGAGTTG GTGAACGTGG 840 TGTGCAGTTA AGTGGCGGAC AAAAGCAGCG AATTGCCATA GCTCGTGCGA TCATCAAGAA 900 CCCTCGCATA CTGCTGCTCG ATGAAGCCAC CAGTGCTCTA GACACAGAAG CGGAATCAAT 960 CGTGCAAGAG GCTCTGGAGA AGGCTCAAAA AGGGAGAACA ACCGTCATT3 TAGCGCATCG 1020 TCTGTCTACT ATCAGAAACG TGGATCAGAT TXTCGTTTTC AAGAACGGAA CGATCGTTGA 1080 GCAGGGCACT CATGCCGAGT TGATGAACAA ACGTGGAGTA TTCTTTGAAA TGACTCAAGC 1140 ACAAGTCCTC CGACAAGAGA AGGAAGAGGA AGTTTTAGAA AATACGGAAC'CAGXAGCGAA 1200 GTGTCAAGAG GXATCCCXCC CTGCTCCTGA TGTCACTATT TTGGCTCCCC ATGAG6AACA 1260 ACCCGAGCTA CCTAGCCCGC CGGGTCGGTT AGAAAATACA AAGCAACATG AGCATCTCTG 1320 AAIGTCTTTG TCTGAGATAG CGATGCGGAA TCCGATGTCG TGTCACCGGA TATTGCATTA 1380 CCCCATCTTA GTTCACTTCG ATCCCGTAAA GAATCCACAA GAAGTGCTAT CTCCGCGGTC 1440 CCCAGCGTTC GAAGTATGCA AATCGAAATG GAGGACCTTC GTGCCAAACC AACTCCAATG 1500 TCOAAAATTT TCTATTTTAA CCGTGACAAA TGGGCATATT TCATTTTGGG ACTCATCGCC 1S60 TGTATTATTA CTGGAACTGT TACACCGACA TTTGCAGTTT TATATGCGCA GATCATACAG 1620 GTATACTCGG AACCTGTTGA TCAAATGAAA GGCCATGTGC TGTTCTGGTG TGGAGCTITC 1680 ATCGTCATTG GTCTCGTACA CGCTTTTGC3 TTCTTTTTCX CGGCTATTTG TTTGGGACST 1740 TGCGGCGAAG CGTTAACGAA AAAATTACGT TTCSAGGCGT TCAAGAACCT TCTGCGACAG 1800 GATGTGGGAT TCTACGACGA TATCCGACAC GGTACCGGTA AACTCTGTAC GCGATTTGCT 1860 ACAGATGCAC CCAATGTCCG ATATGTGTTC ACTCGACTTC CGGGTGTGCT TTCATCGGTG 1920 GTGACCATAA TTGGAGCTTT GGTTATTGGA TTCATCTTCG GGTGGCAGCT GGCTTTGATT 1980 CTTATGGTQA TQGTACCGTT GATCATCGGT AGTGGATACT TCGAGATGCG CATGCAGTTT 2040 49 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ GGTAAGGAGA TGCGTGACAC AGAGCTTCTT GAAGAGGCTG GGAAAGTTGC CTCTCAAGCC 2100 GTGGAGAACA TTCGTACCGT GCATGCCCTG AATAGGCAAQ AGCAGTTCCA TTTCATGTAT 2160 TGCGAGTATT TGAAGGAACC CTATCGAGAA AATCTTTGCC AGGCGCACAC CTACGGGGGT 2220 GTATTCGCGT TCTCACAATC GTTGTTATTC TTTATGTATG CTGTAGCATT TTGGATTGGT 2280 GCAATCTTCG TGGACAACCA CAGCATGCAA CCGATTGACG TTTACCGAGT ATTTTTCGCG 2340 TTCATGTTTT GTGGACAAAT GGTCGGCAAC ATTTCTTCTT TTATTCCTGA CGTTGTGAAA 2400 GCTCGCCTGG CTGCATCGCT CCTTTTCTAC CTTATCGAAC ACCCATCAGA AATTGATAAT 2460 TTGTCCGAGG ATGGTGTCAC GAAGAAAATC TCTGGTCATA TCTCGTTCCG CAATGTCTAT 2520 TTCAATTATC CGACAAGAAG ACAGATCAGA GTACTCCGTG GACTTAACCT AGAGATAAAT 25S0 CCTGGCACGA AGGTAGCGCT TGTTGGGCAG TCTGGTTGTG GAAAAAGCAC TGTGATGGCG 2640 TTGTTGGAAC GGTTTTACAA TCAAAACAAG GGCGTGATTA CGGTGGACGG CGAAAACATC 2700 AGAAACATGA ACATACGCAA TCTTCGTGAG CAAGTGTGTA TTGTAAGCCA GGAACCAACG 2760 CTGTTCGACT GTACCATCAT GGAAAACATC TGTTACGGTC TCGATGACCC CAAGCCGTCC 2820 TACGAACAGG TTGTTGCTQC AGCAAAAATG GCGAACATTC ACAATTTTGT GCTGGGACTA 2880 CCAGAGGGTT ACGATACGCG TGTTGGTGAG AAAGGCACTC AGCTGTCAGG CGGACAGAAG 2940 CAACGAATAG CCATAGCCAG AGCGCTGATT CGAGATCCGC CTATACTTCT 6CTG6ATGAG 3000 GCGACAAGCG CGCTGGATAC CGAGAGTGAA AAGATCGTGC AAGACGCCCT AGAGGTTGCT 3060 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GAAGCTCTCG 180 AGAAAGCTCA AAAAGGACGA ACSACCGTCA TTGTAGCGCA TCGCCTATCT ACCATCAGAA 240 ATGTCGATCA AATTTTCGTC TTCAAGAATG AAACGATTGT IGAGCAGGGX ACACATGCAG 300 AGTTGATGAA CAAACGAGGA GTGTTCTTTG AAATGACTCA AGCACAGGTC CTTCGACAAG 360 AAAAGGAAGA GGAGGTCTTA GAAAAXACGG AACCAGXAGC GAAGTGTCAA GAGGCATCCI 420 TTCCTGCTCC TGATGTCACT ATTTTGACTC CCCATGACGA ACAACCCGAG CTACTTAGCC 480 CGCCGGAIAG CGATGCGGAA TCCGACGTCA TGTCACCGGA TCTTGGCTTA CCCCATCTTA 540 GTTCACTTCG ATCACGTAAA GAGTCCACAA GAAGTGCTAT TTCCGCAGTC CCCAGCGTTC 600 GGAGTATGCA GATCGAAATG GAGGACCTTC GTGCCAAACC GACTCCGATG TCGAAAATTT 660 XCTATTTCAA CCGTGACAAA XGGGGATTTT XCATXTTGGG ACTCATCGCC TGIATXAXAA 720 CTGGAACTGT TACACCGACA TTTGCAGTTT TATATGCGCA GATCATACAG GTAXACTCGG 780 AACCXGXXGA TCAAATGAAA GGCCATGIGC TGTTTTGGTG TGGAGCTTTC ATCGTCATTG 840 GTCXCGXACA CGCAXTTGCG XTCTTXXTCX CGGCCAXXXG TCTGGGACGX TGCGGCGAAG 900 51 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ CTTTAACGAA GAAGTTACGT TTCGAGGCGT TCAAGAACCT TCTCCGACAA GATGTGGGAT 960 TCTACGACGA TATCCGACAC GGTACCGGTA AACTCTGTAC GCGATTTGCT ACAGATGCAC 1020 CCAATGTTCQ ATATGTGTTC ACTCGACTTC CGGOTGIACT XTCAXCGGTO GTGACCATAA 1080 TCGGAGCTTT GGTTATTGGA TTTATTTTCG GGTGGCAGCT GGCCXTGATT CTXATGGTCA 1140 TGGTAGCGXT GATCATTGGC AGTGGATACT TCGAGATGCG CATGCAGTTT GGIAAAAAGA 1200 IGCGTGACAC AGAGCXICTT GAAGAGGCTG GGAAAGTTGC CTCACAAGCC GTAGAGAATA 1260 TTCGTACCGT ACATGCCCTG AATCGGCAAG AGCAGTTCCA TTTCATGTAC TGCGAGTATT 1320 TGAAGGAACC CTATCGAGAG AATCTTTGCC AGGCGCACAC TTACGGGGGT 6TATTCGCGT 1380 TTTCACAGTC GTTGTTATTC IXTAXGXATG CTGXAGCATT TTGGATTGGT GCAATCTTCG 1440 TGGACAACCA CAGCATGCAA CCGATTGATG TTTACCGAGT ATTTTTCGCG TTCATGTITT 1500 GTGGACAAAT GGTTGGCAAC ATTTCGTCCT TCATCCCTGA TGTTGTGAAA GCTCGCCTGG 1560 CTGCATCGCT CCTTTTCTAC CTCATCGAAC ACCCATCAGA AATTGATAAC TTGTCCGAGG 1620 ATGGTGTCAA GAAGAAAATC TCXGGTCACA TCXCGTTCCG CAATGTCXAT TXCAATTACC 1680 CGACGAGAAG GCAGATCAGA GTACTCCGTG GACTTAACCT AGAGATAAAT CCTGGCACGA 1740 CGGTAGCGCT TGTTGGACAA TCTGGTTGTG GAAAAAGCAC TGTGATGGCG TTGTTGGAAC 1800 GCTTTTACAA TCAAAACAAG GGCGTGATTA CGGTTGACGG CGAAAACATC AGAAACATGA 1860 ACATACGCAA TCTCCGTGAG CAAGTATGTA TAGTCAGCCA GGAACCAACA CTGTTCGACT 1920 GTACCATCAT GGAAAACATC TGTTACGGAC TCOATGACCC CAAACCGTCC TACGAACAGG 1980 TTGTTGCGGC AGCAAAAATG GCGAACATCC ACAATTTTGT GCTGGGACTG CCAGAGGGTT 2040 ATGACACGCG TGTTGGCGAG AAAGGCACTC AGCTGTCAGG CGGACAAAAG CAAA.GAATAG 2100 CCATAGCCCG AGCGCTGATC CGAGATCCGC CTATACTTCT GCTGGATGAG GCGACAAGCG 2160 CTCTGGACAC GGAGAGTGAG AAGATCGTGC AAGACGCCCT AGAGGTTGCX CGCCAAGGTA 2220 GAACGXGCCT TGTAATTGCC CACCGCCTTX CTACAATTCA AGACAGTGAC GTCAXAGTGA 2280 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ 2340 2400 2440 2S20 2580 2440 2481

TGATCCAGGA GGGAAAAGCT ATCTATACAA ACGGCTATGC CCGATCGATA GTGATCQATA ATCTCGTGCT ΤΤΑΤΤΑΤΑΑΤ GGTCXTCACT ATCATAATGC AACATATTGA CAGTTTTATT GAGAATTTAT AATGAAACIT

ACAGACAGAG GCACTCATGA GAAACACAAC GACTCGTTGA AGCTATGGAT TAGTCTTCAA GTACATATGT AATGGTTTTG CTTTAGTAAT GCATTAACAC AATATAACTT AAATAAGATA CTGGATTCCT GCAGCCCGGG

ACATTTACTG ATGAAGAACG ATCACAATGA GTTTTTAGTG CACTTACTGA TCATATGACT ATGIAAGTTA AGTIATAATT ΤΤΤΤΑΤΑΑΪΑ TAACTTGAAT TTGACAGTTT TATT7LATTTG G (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: GAAATGACTC AAGCACAAG 19 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 10: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: AGACAAAGAC ATTCAGAG 18 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 53 ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11 ACNGTNGCNY TNGTNGG 17 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12 GCNSWNGTNG CYTCRTC 17

Lisboa,2007-12-05

Claims

ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma molécula de ácido nucleico obtenível a partir de um nematode e codificando um homólogo de uma glicoproteína P para detecção de resistência a um composto de lactona macrocíclica com base em alterações no ADN genómico de uma praga de nematodes, em que o referido composto de lactona macrocíclica é seleccionado de entre o grupo que consiste em: LL-F28249a-A, um derivado 23-oxo de LL-F28249a-A, um derivado 23-imino de LL-F28249a-A, um derivado 23-semicarbazona de LL-F28249a-A, um derivado 23-tio-semicarbazona de LL-F28249a-A, uma avermectina, e uma milbemicina; em que a referida molécula de ácido nucleico possui uma sequência nucleotídica que exibe um padrão de digestão por enzimas de restrição num Southern blot consistente com a sequência nucleotídica identificada como: PGP-A apresentada em SEQ ID N0:3, PGP-A-3' apresentada em SEQ ID N0:5 (número de acesso ATCC 98336), PGP-B-3' apresentada em SEQ ID NO: 8 (número de acesso ATCC 98307), ou PGP-O-3' apresentada em SEQ ID NO: 7 (número de acesso ATCC 98309); ou um seu fragmento ou cadeia complementar; ou a referida molécula de ácido nucleico possui uma sequência nucleotídica que híbrida a cerca de 65°C na presença de um tampão de dextrano ao longo de pelo menos 4 horas com uma sequência nucleotídica identificada como PGP-A, PGP-A-3', PGP-B-3' ou PGP-O-3'.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida molécula de ácido nucleico possui uma sequência nucleotídica identificada como: ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ 2/4 PGP-A apresentada em SEQ ID NO:3, PGP-A-3' apresentada em SEQ ID NO:5, PGP-B-3' apresentada em SEQ ID NO:8, ou PGP-O-3' apresentada em SEQ ID NO:7; ou um seu fragmento ou cadeia complementar; ou a referida molécula de ácido nucleico possui uma sequência nucleotídica que híbrida a cerca de 65°C na presença de um tampão de dextrano ao longo de pelo menos 4 horas com uma sequência nucleotídica identificada como PGP-A, PGP-A-3', PGP-B-3' ou PGP-0-3'.
3. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que a referida praga de nematodes é Haemonchus contortus.
4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo a comparação de uma molécula de ácido nucleico codificando um homólogo de glicoproteína P extraída de um espécimen da referida praga de nematodes com: a) uma molécula de ácido nucleico que codifica um homólogo de glicoproteína P extraída de um espécimen do nematode que se sabe ser resistente ao composto de lactona macrocíclica e b) uma molécula de ácido nucleico que codifica um homólogo de glicoproteína P extraída de um espécimen do nematode que se sabe ser susceptível ao composto de lactona macrocíclica.
5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo a hibridação da molécula de ácido nucleico extraída de um espécimen da praga de nematodes com uma sonda de ácido nucleico possuindo uma sequência nucleotídica tal como definida na reivindicação 1.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pela mistura de uma a três das moléculas de ácido nucleico com um iniciador de Reacção em Cadeia com Polimerase (PCR) ou de Reacção em Cadeia com Polimerase -Transcritase Inversa (RT-PCR); em que o iniciador de PCR ou ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ 3/4 RT-PCR compreende uma sequência nucleotídica entre PGP2S de SEQ ID NO:9 e PGPAS de SEQ ID NO: 10 nas direcções de sentido directo e anti-sentido, respectivamente, ou uma sequência nucleotídica tal como definida na reivindicação 1.
7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo PCR utilizando iniciadores, sendo os referidos iniciadores seleccionados de entre o grupo que consiste em PGP2S de SEQ ID NO:9, PGPAS de SEQ ID NO:10, iniciadores preparados a partir de sequências inteiras ou parciais de ácidos nucleicos identificados como PGP-A, PGP-A-3', PGP-B-3' e suas cadeias complementares; e uma sequência nucleotídica que híbrida a cerca de 65°C na presença de um tampão de dextrano durante pelo menos cerca de 4 horas com uma sequência nucleotídica identificada como PGP-A, PGP-A-3', PGP-B-3' ouPGP-O-3'.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 6 ou 7, compreendendo análise de polimorfismo do comprimento de restrição dos produtos de PCR da reivindicação 6 ou 7 através de corte dos produtos de PCR com enzimas de restrição e correndo as sequências digeridas num gel de electroforese.
9. Molécula de ácido nucleico ou um seu fragmento, codificando a referida molécula de ácido nucleico ou o referido fragmento um homólogo de glicoproteína P, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica identificada como: PGP-A apresentada em SEQ ID NO:3, PGP-A-3' apresentada em SEQ ID NO: 5 (número de acesso ATCC 98336), PGP-B-3' apresentada em SEQ ID NO: 8 (número de acesso ATCC 98307), ou PGP-O-3' apresentada em SEQ ID NO: 7 (número de acesso ATCC 98309), ou ou uma sua cadeia complementar.
10. Vector plasmídico ou virai biologicamente funcional caracterizado por conter a molécula de ácido nucleico ou o fragmento tal como definido na reivindicação 9. ΕΡ Ο 979 278/ΡΤ 4/4
11. Célula hospedeira adequada estavelmente transformada ou transfectada com um vector caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico ou o fragmento de acordo com a reivindicação 9. Lisboa,2007-12-05