PT97184B

PT97184B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceutica uteis no tratamento de seres humanos submetidos a transplante de medula ossea, tratamento citostatico ou irradiacao

Info

Publication number: PT97184B
Application number: PT97184A
Authority: PT
Inventors: Bo Nilssom; Terje Kalland; Birgitta Termander
Original assignee: Pharmacia & Upjohn Ab
Priority date: 1990-03-27
Filing date: 1991-03-27
Publication date: 1998-07-31
Also published as: EP0522001A1; DE69120529T2; AU7562391A; ES2089206T3; WO1991014432A1; SE9001111D0; DE69120529D1; JPH05505194A; DK0522001T3; AU640223B2; IE76287B1; CA2077996C; CA2077996A1; IE910973A1; PT97184A; EP0522001B1; ATE139695T1; GR3020667T3

Description

Descrição referente a patente de invenção de KABI PHARMACIA AB, sueca, industrial e comercial, com sede em S-751 82 Uppsala, Suécia, (inventores: Bob Nilsson, Terje Kalland e Birgitta Termander, residentes na Suécia), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICA UTEIS NO TRATAMENTO DE SERES HUMANOS SUBMETIDOS A TRANSPLANTE DE MEDULA ÓSSEA, TRATAMENTO CITOSTÁTICO OU IRRADIAÇÃO CONTENDO N-FENIL-N-METIL-1,2-DI-HIDRO-4-HIDROXI-1-METIL-2-0X0-QUIN0LINA-3-CARB0XAMIDA(LINOMIDE)

DESCRIÇÃO

ÂMBITO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à utilização de Linomide ou de um seu sal farmaceuticamente aceitavel para o tratamento de seres humanos submetidos a transplantações de medula óssea, tratamento citostático, irradiações ou suas combinações.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As transplantações de medula óssea (TMO) tem progredido nos últimos 15 anos desde um procedimento a ser utilizado apenas como ultima medida em casos desesperados ate ser uma modalidade terapeuticamente eficaz para o tratamento de pacientes seleccionados com doenças malignas.

Ê geralmente sabido que a dose da maior parte dos agentes quimioterapêuticos antineoplasticos que pode ser administrada e largamente limitada pela toxicidade em relaçao a medula normal. Todavia, a disponibilidade da medula doada para transplantaçao faz com que seja possivel administrar quimioterapia em doses supraletais num esforço para destruir uma fracçao muito elevada de células malignas e permite utilizar a medula doada para salvar o paciente de uma morte iatrogénica. A medula infundida reconstruirá os sistemas hematopoiético e imunológico do hospedeiro. Além disso, se o sistema imune da medula transplantada puder exercer um efei.to anti-tumor, a tr ansplantaçao da medula pode representar também uma forma de imunoterapia de tumores adoptiva.

Os enxertos de medula autólogos referem-se à própria medula do paciente que foi obtida e normalmente conservada criogenicamente e reinfundida apos o paciente ter sido submetido a uma quimio-radioterapia supraletal. Obtem-se medula singénica a partir de um doador que seja um gemeo geneticamente idêntico e obtém-se medula alogónica a partir de um doador de origem geneticamente diferente.

Os pacientes com cancro sao frequentemente tratados com um regime quimioterapêutico de doses elevadas ou recorre-se à irradiaçao corporal total (ICT) para erradicar as células malignas. A maior parte dos regimes preliminares engloba a ICT supraletal porque possui um efeito anti-tumor, pode penetrar em sítios privilegiados (por exemplo, SNC e testículos) em que a quimioterapia ó ineficaz, e é suficientemente imunossupressiva para permitir o enxerto.

regime mais vulgarmente utilizado consiste em administrar ciclofosfamida (60 mg/Kg/dia, IV) durante dois dias consecutivos seguindo-se uma dose supraletal de ICT, normalmente 1000 rad, fornecidos à razão de 5 a 8 rad/minuto, ou 200 a 225 rad/dia durante 6 a 7 dias. A medula é infundida nas 24 horas que se seguem à última dose de ICT.

As primeiras 3 ou 4 semanas após o enxerto sao críticas uma vez que a quimio-radioterapia erra2 dica todas as funções da medula normal e existe um intervalo de tempo antes de ocorrer uma produção celular detectável devida à medula infundida. A. contagem de granulócitos atinge normalmente 500 mm apos 2 a 4 semanas. A produção de plaquetas geralmente leva mais tempo. Até que decorra esse periodo de tempo, o paciente necessita de cuidados que o suportem com utilização adequada de transfusões e antibióticos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em conformidade com a presente invenção descobriu-se agora surpreendentemente que o composto N-fenil-N-metil-1,2-di-hidro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-quinolina-3-carboxamida possui propriedades que podem ser úteis para o tratamento de um ser vivo submetido a transplantações da medula óssea, tratamento citostático, irradiaçao ou suas combinações .

A Linomide^), cuja designação química é N-fenil-N-metil-1,2-di-hidro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-quinolina-3-carboxamida, foi descrita pela primeira vez na patente norte-americana N^e . 4547511 como agente imunoestimulador. Este agente, também conhecido pela designação genérica de roquinimex, pode ser utilizado também na forma de um sal farmaceuticamente aeeitavel tal como os sais de Na ou Ca.

Demonstrou-se que a Linomide possui poderosas propriedades imunoestimuladoras em diversos modelos de murganhos e de ratos (1-5) e também em estudos clínicos iniciais. Permite também aumentar a reacçao à hipersensibilidade retardada, a capacidade de os linfócitos responderem aos mitogenos das células T e B e possui efeitos auxiliares idênticos sobre a produção de anticorpos. Uma das características principais da Linomide reside na sua capacidade para estimular a actividade das células aniquiladoras naturais (NK) (ou ÁN) em diversos orgãos.

mecanismo primário de acção da Linomide ainda nao está bem esclarecido. Todavia, a análise dos efeitos da Linomide sobre células NK dos murganhos demonsJ trou surpreendentemente que o seu mecanismo de acçao e distinto do mecanismo de qualquer dos imunomoduladores sintéticos descritos .

Em experiencias piloto efectuadas em seres humanos descobriu-se surpreendentemente que a Linomide possui um efeito benefico sobre a regeneração das células linfóides após a transplantaçao de medula óssea.

Em conformidade com a presente invenção, a Linomide pode ser administrada pela boca, intramuscular ou parenteralmente em doses compreendidas entre 0.01 e 10, de preferência entre 0.05 ele mais preferencialmente entre

0.2 e 0.3 mg/Kg de peso corporal diariamente ou com a frequência de 2 semanas de intervalo, e mais preferencialmente duas vezes por semana.

As composiçoes utilizadas para experiências clínicas podem ser, por exemplo, as seguintes:

Composição 1

Roquinimex....................10 mg

Lactosum,....................100 mg

Amylum maydis................ 60 mg

Aqua purificata........ 25 mg*

Avicel PH 102................ 20 mg

Kollidon 30.................. 5 mg

Sterotex regular............. 5 mg

Composição II

Roquinimex.................. 5 mg

Lactosum............... 105 mg

Amylum maydis................ 60 mg

Aqua purificata.............. 25 mg*

Avicel PH 102................ 20 mg

Kollidon 30 ............ 5 mg

Sterotex regular............. 5 mg

Desaparece da formulação no decurso da preparaçao.

Encontram-se descritas outras composições na patente norte-americana N^s . 4547511 anteriormente referida e aqui incorporada como referência.

' EXEMPLOS

I. Experiências em animais

Para se determinar o efeito da Linomide sobre a regeneração de células linfóides após a sua depleçao, fez-se o acompanhamento da .actividade das células NK no baço dos morganhos após exposição â ciclofosfamida ou a irradiaçao.

Tratamento dos animais

Todos os animais utilizados possuiam entre 5 e 8 semanas de idade e eram morganhos C57B1/6 obtidos em Gamle Bomholtgaard, Ry, Dinamarca.

Administrou-se Linomide (LS 2616; Pharmacia LEO Therapeutics AB, Helsingborg, Suécia), continuamente a murganhos através da sua água de beber numa quantidade correspondente a uma dose diária de 160 mg/Kg, Antecipadamente havia sido descoberto que este regime de dosagem era óptimo para estimular a actividade das células NK. Em experiências de transplantaçao de medula óssea singénica os recipiendos foram irradiados com 800 rad e decorridos 4 horas injectados

i.v. com 2 χ 10⁷ células de medula ossea singénica preparadas conforme adiante descrito. A ciclofosfamida (Sendoxan: Pharmcia, Uppsala, Suécia) foi administrada em injecção i.p. única correspondente a 300 mg/Kg.

Preparações celulares

As células da medula óssea foram preparadas inundando a tíbia e o femur .com RPMI 1640 arrefecido com gelo (Flow Laboratories, Irvine, Escócia) enriquecido com Hepes 25 mM, L-glutamina 2mM, 2-mercapto-etanol 5 x

1θ-5 m 107o d^{e soro} de vitela fetal (Flow Laboratories) e penicilina/estreptomicina (100U/pg/ml) (meio completo). As células do baço foram preparadas fazendo a crivagem dos baços através de uma malha de aço inoxidável. Os glóbulos vermelhos foram, removidos da preparaçao de células, do baço por tratamento de choque hipotónico conforme descrito pormenorizadamente noutra publicação (3).

Ensaio de citotoxicidade

As células cuja actividade NK se pretendia testar foram examinadas através de um ensaio conven- 51 cional de libertação de Cr contra células alvo YAC-1 conforme descrito pormenorizadamente noutra publicação (3). Resumidamen3 te, efectuou-se a incubaçao de 5 x 10 células alvo marcadas com ^^Cr utilizando células infectoras na proporção de 100:1,

50:1 e 25:1 em 200 pl de meio completo durante 4 horas e depois 51 determinou-se a quantidade libertada de Cr em 100 pl de sobrenadente num contador LKB 1272 Clinigamma. A citotoxicidade percentual especifica determinou-se pela expressão cpm do teste - cpm espontâneas 1 1 _ X 100 cpm total - cpm espontâneas

A libertação espontânea foi determinada por incubaçao das células ' alvo apenas em meio e pela libertação total por incubaçao em SDS a 0,1%.

Culturas de medula óssea

Preparou-se uma cultura de 5 x 10^ células de medula ossea separadas conforme anteriormente descri_ to em 200 pl de meio completo enriquecido com concentrações óptimas (40 U/ml) ou sub-optimas (10 U/ml) de rIL-2 durante 4 dias conforme descrito noutra publicação (6). As culturas foram realizadas em placas de microtitulação de 96 cavidades de fundo arredondado.

A Linomide dissolvida em meio comple6

to foi adicionada no início das culturas segundo concentrações indicadas na secção correspondente aos Resultados.

As culturas das células de baço provenientes do mesmo murganho foram realizadas em paralelo. Resumidamente, preparou-se uma cultura de 5 x 10^ células por ml em meio completo durante 4 dias em presença de rlL-2 (10 U/ml) e para várias concentrações de Linomide.

Análise estatística

Todos os dados foram analisados em conformidade com o teste de Mann-Whitney.

RESULTADOS

Verificou-se a existência de uma forte depressão de actividade das células NK após a deterioração do tecido hematopoiêtico com uma dose única elevada de ciclofosfamida. Os murganhos expostos à Linomide demonstraram uma retenção ligeiramente melhor da actividade das células NK e uma recuperação significativamente mais rápida e um nível mais elevado de actividade das células NK do que os murganhos de controlo (Fig. 1).

efeito da Linomide sobre a recuperação das células NK após a irradiaçao letal e a transplantaçao de medula óssea singênica foram acompanhados por uma forma idêntica (Fig. 2). Foi possível detectar a actividade das células NK no baço de pacientes sujeitos a transplantaçao de medula ossea ao 6^S dias apos a transplantaçao. A recuperação foi nitidamente mais lenta do que após a depleçao com ciclofosfamida embora se tivesse alcançado uma recuperação plena ao 12^s dias em animais tratados com Linomide e ao 14^s dia nos animais de controlo. 0 nível de actividade das células NK comparável com o dos murganhos de controlo completamente recuperados foi obtido ao 10- dia nos murganhos tratados com Linomide.

Para se examinar directamente o efeito da Linomide sobre os progenitores de células NK, efectu7

ou-se uma análise por diluição restrita da frequência das células de medula óssea susceptíveis de se desenvolverem em células NK activas liticamente in vitro em presença de IL-2. 0 tratamento dos murganhos durante 4 dias com Linomide aumentou a frequência dos precursores das células NK da medula óssea de 1/11 900 para 1/6 000 (Fig. 3).

Recentemente foi descrito um sistema de cultura que permite gerar células NK maduras a partir de progenitores de medula óssea inactlva liticamente em presença de IL-2 (6). 0 efeito da Linomide in vitro foi examinado neste sistema de cultura (Fig. 4). A Linomide isoladamente na ausência de IL-2 nao é capaz de suportar a maturaçao das células NK conforme confirmado pelo aparecimento de actividade citotoxica. Por outro lado, a Linomide nao favorece a actividade citotóxica forte em cultura de medula óssea em presença de quantidades óptimas (40 U/ml) de IL-2. Todavia, para concentrações sub-óptimas de IL-2 (10 U/ml) a Linomide para concentrações compreendidas entre 1 e 50 pg/ml aumentou significativamente a actividade citotoxica. Nao foi possivel detectar qualquer efeito da linomide sobre as células NK maduras obtidas em cultura de baço na presença ou na ausência de IL-2.

II - Estudos com pacientes

Como parte da fase II de um estudo piloto aberto efectuado com pacientes sofrendo de Leucemia Mielogenica Aguda em fase de remissão, estudou-se o efeito, da Linomide sobre a regeneração das células hematopoiêticas apos a transplantaçao de medula óssea autóloga.

Colheita de medula óssea

No periodo que medeia entre 1 e 2 meses antes da infusão de medula aspirou-se medula dos pacientes numa quantidade correspondente a 15 ml/Kg de peso corporal. Concentrou-se a medula e armazenou-se a temperatura de -196 C ate ao dia da reinfusao.

Procedimentos que precedem a infusão ll² dia: aplicou-se o cateter venoso central. Preparou-se uma amostra de sangue e avaliou-se o estado da fase de remissão. Teve início o tratamento com ovirax (Aciclovir).

10² dia: teve início a terapia com Fenantoina (fenitoi na). Isolou-se o paciente.

8² a 5^a dias: administraçao oral de Myeleran (Busulfano) na dose de 1 mg(Kg em cada 6 horas).

4² dia;

3² dia;

administraçao de ciclofosfamida na dose de 60 mg/Kg i.v., infusão de Uromitexan na dose de 24 mg/Kg x 4. Teve início o tratamento profilático contra infecçoes.

administraçao de ciclofosfamida e de Uromitexan

2^e dia terminou Zilonic.

terapia com Fenantoina e com

Dia 0:

a medula foi rapidamente descongelada e reinfundida. Antes da infusão administrou-se Soly-Glyc (hidrocortisona) no total de 100 mg i.v.

Dosagem da Linomide

Administrou-se 0.3 mg/Kg de peso corporal, uma vez por semana, durante períodos de 3 semanas alternados-tom periodos de 3 semanas sem qualquer fármaco. 0 tratamento foi iniciado no momento da transplantaçao da medula óssea.

Análise imunológica fenotipo das células mononucleares foi analisado em Ficoll-Paque, separadas do sangue periférico antes da TMO e no final de cada ciclo de 3 semanas em presença ou na ausência de Linomide.' Foram efectuadas duas análises de tipo FACS (ou RCAR) conforme descrito numa obra já publicada (7) com os seguintes anticorpos monoclonais:

Leu-M3, HLA-DR, Leu-1, Leu-12, Leu-16, Leu-11, Leu-19, Leu-3, Leu-4.

Determinou-se a actividade citotoxica das células mononucleares do sangue periférico contra a linha celular K-562 sensível às células NK recorrendo a um ensaio 51 convencional de libertação de Cr conforme descrito antes.

RESULTADOS

Foi observado um aumento nítido do número de células com o fenotipo NK (CD56) e também da actividade citotoxica contra a linha K-562 no paciente 1 (Fig. 5,6) e no paciente 2 (Fig. 7,8) no final dos períodos de tratamento com Linomide. Em contraste a frequência das células NK e também a actividade das células NK foi inferior no final de todos os intervalos na ausência de Linomide. Deste modo, a Linomide aumenta o numero de células NK maduras apos a transplantaçao de medula óssea.

III - Estudos com pacientes

Foram estudados 5 adultos (3 machos, 2 fêmeas, idades compreendidas entre 48 e 57 anos), com LMA sujeitos a TMOA na primeira fase de remissão completa. Antes da TMOA, todos os pacientes foram condicionados com Busulfano (16 mg/Kg) e com ciclofosfamida (120 mg(Kg) seguida pela infusão de células autologas de medula descongelada.

Calendário do tratamento

A Linomide foi administrada oralmente em solução aquosa com início no dia da infusão da medula.A dose foi de 0.3 mg/Kg uma vez por semana durante as primeiras 3 semanas, seguindo-se 3 semanas de terapia. Este ciclo de tratamento com Linomide durante 3 semanas seguido por 3 semanas de interrupção do tratamento foi mantido ao longo de 6 meses.

Tomando tudo em consideração, o estudo revelou que a terapia com Linomide após a TMOA pode ser benéfico para os pacientes no que diz respeito a sobrevivêii cia sem leucemia e às complicações infecciosas. Os efeitos observados são da mesma ordem de grandeza correspondente ao que se verificou após a infusão de IL2, mas os efeitos secundários foram consideravelmente mais suaves. A Linomide beneficia da conveniência de representar um fármaco para administraçao oral que é facilmente administrado a um maior numero de pacientes .

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: Efeito da Linomide sobre a regeneração da actividade das células NK no baço apos uma injecção unica de ciclofosfamida. o - o, controlo; · - · murganhos * tratados com Linomide. p<0.05. Resulatdos de uma experiência única com 24 murganhos por grupo.

Figura 2: Efeito da Linomide sobre a regeneração da actividade das células NK no baço apos irradiaçao letal e exerto de medula óssea singénica. o -o, controlo; · - · »1»

T· murganhos tratados com Linomide. p<0.05.

Resultados de uma ou duas experiências idênticas com 21 e 19 animais respectivamente, por grupo.

Figura 3: Análise de diluição restrita da frequência dos progenitores das células NK na medula óssea do murganho de controlo ou do murganho tratado com Linomide (160 mg/KG/dia durante 4 dias), o - o, controlo;

• - · murganhos tratados com Linomide. * _n p 4 0.05 .

Resultados de 1 de 3 experiências com resultados consistentes.

Figura 4: Efeito da Linomide in vitro em culturas de medula ossea ou de células do baço com actividade de células NK. Símbolos abertos, culturas enriquecidas com 10 U/ml IL-2, simbolos fechados, ausência de IL-2. Circulos, células de medula ossea, triângulos,

células do baço. As células foram examinadas para verificação da sua citotoxicidade contra as células YAC-1 após cultura durante 3 dias, proporção E:A 100:1. p<,0.05. Resultados de 1 de 2 experiências idênticas.

Figura 5: Frequência de células positivas CD56 no sangue periférico do paciente 1 antes e em momentos diferentes após a transplantaçao de medula óssea autóloga. Com = no fim de um período de 3 semanas de tratamento com Linomide, sem = no fim de um período de 3 semanas correspondente a um intervalo sem qualquer tratamento

Figura 6: Actividade citotoxica contra a linha K-562 dos linfócitos do sangue periférico do paciente 1 antes e em momentos diferentes após a transplantaçao de medula óssea autologa. Com = no fim de um período de 3 semanas correspondente a um intervalo sem qualquer tratamento. Proporção efector: alvo (E:A) 15:1.

Figura 7: Frequência das células positivas CD56 no sangue periférico do paciente 2 antes e em momentos diferentes apos a transplantaçao de medula óssea autóloga. Com = no fim de um período de 3 semanas de tratamento com Linomide, sem = no fim de um periodo de 3 semanas correspondente a um intervalo sem qualquer tratamento

Figura 8: Actividade citotoxica contra a linha K-562 dos linfécitos do sangue periférico do paciente 2 antes e em momentos diferentes após a transplantaçao de medula ossea autologa. Com = no fim de um período de 3 semanas de tratamento com Linomide, sem = no fim de um periodo de 3 semanas correspondente a um intervalo sem qualquer tratamento. Proporção efector: alvo (E:A) 30:1.

REFERENCIAS

1. Larsson, E.L., Joki, A.L. and Stalhandske, T.: Mechanism of action of the new immunmodulator LS 2616.

Int. J. Immunopharmacol. 9:425, 1987.

2. Kalland, T., Alm, G., and Stalhandske, T.: Augmentation of mouse natural killer cell activity by LS 2616, a new immunomudulator.

J.Immunol. 134:3956, 1985.

3. Stalhandske, T., and Kalland, T.: Effect of the novel immunomodulator LS 2616 on the delayed-type hypersensitivity reaction to Bordetella pertussis in the rat. Immunopharmacol. 11:87, 1986.

4. Tarkowski, A., Gunnarson, K., and Stalhandske, T.: Sucessful treatment of autoimmunity in MRL/1 mice with LS 2616, a new immunmodulator. Arthritis and Rheum. 29:1405, 1986.

5. Kalland, T. : Effects of the immunomodulator LS 2616 on growth and metastatis of the murinne B16-F10 melanoma.

Câncer Res. 46:3018, 1986.

6. Kalland, T.: Interleukin 3 is a major negative regulator of the generation of natural killer cells from bone marrow precursors.

J. Immunol. 137:2268, 1986.

7. Bengtsson, Μ. , Totterman, T.H., Smedmyr, B., Festin, R., Oberg, G. and Sominnsson, B.: Regeneration of functional and activated NK and T subset cells in the marrow and blood after autologous bone marrow transplantation: A prospective study with 2/3-color FACS analysis. Leukemia 3:68, 1989.

Claims

REIVINDICAÇÃO

Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para o tratamento de seres humanos submetidos a transplante de medula ossea, tratamento citostatico ou irradiaçao para administraçao oral ou percuteral, caracterizado por se incorporar com ingrediente activo N-fenil-N-metil-1,2-di-hidro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-quinolina-3-carboxamida (Linomide) ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, numa proporção que proporcione a administraçao de 0,01 a 10 mg de preferência 0,05 a 1 mg por Kg de peso de corpo de paciente.

A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente sueco apresentado em 27 de Março de 1990, sob o N^a. 9001111-5.