PT95380A - Metodos para a modulacao do promotor responsavel pela expressao da proteina precursora beta-amiloide - Google Patents
Metodos para a modulacao do promotor responsavel pela expressao da proteina precursora beta-amiloide Download PDFInfo
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Description
FUNDAMENTO DO INVENTO O presente invento está relacionado com um método para o controle (modulação) da expressão da proteína precursora beta-amilóide <APP) que é chave no estudo dos efeitos do peptídeo beta amilóide. Este método envolve a utilização de um sistema repórter para a expressão da hormona de crescimento humana íhSH) que está sob o controle directo do promotor APP, especificamente um promotor que tem como elementos chave um elemento de resposta ao choque térmico <HSE>e sítios de ligação a AP-1 encontrados no promotor de APP» Ainda, o presente invento também está relacionado cora o promotor especificado e um mecanismo para a medição da regulação das capacidades de expressão do promotor APP através da utilização de um sistema repórter ligada â expressão da hormona de crescimento humana expressa» Surpreendentemente, o presente inventa também está relacionado com o facto da Interleuquina-1 (IL-l beta humana) induzir o presente promotor de APP e compostos tipo Interleuquina-!. que actuam substancialmente do mesmo modo no sistema promotor determinou-se serem chave no controle da produ-çãoda proteína precursora amilóide» Alguns destes compostos tipo Interleuquina—i incluem interleuquina—6 e Factor de Necrose Turooral. Portanto, eles podem também ser chave no controle da formação de placas que se observou acumularem nos cérebros da Doença de Alzheimer. Finalmente, o presente invento também está relacionado com métodos para o tratamento da Doença de Alzheimer pela utilização de agentes que modulam o sistema promotor ligado ao sistema repórter em que é medida a hormona de crescimento humana, é óbvio que tais agentes controlam portanto a expressão da proteína precursora beta-amilóide que por sua vez é chave na produção de placas contenda beta-amilóide encontradas nos cérebros de doentes com a Doença de Alzheimer. \ κ
A Doença de Alzheimer é a principal causa da demência e a quarta causa de morte r»a população maxs idosa nos USA (32)« A neuropato1 og ia da Doença de Alzheimer caracteriza-se pela formação no cérebro de placas amilôides, emaranhados neurofibrilhares que não contêm BAP e depósitos cerebrovasculares consistindo predominantemente num peptídeo de 42 aminoácidos conhecido como o peptídeo A4 ou beta amilóide (BAP) (9), Investigação recente sobre o mecanismo de deposição de BAP sugere que estas estruturas resultam da sobreprodução e/ou processamento incorrecto de proteínas precursoras amilôides (APP), particularmente no corte:·! frontal, hipocampus e núcleus basalis (2, 4, 13). BAP está contido dentro da proteína precursora maior da qual são conhecidas pelo menos três (3) formas expressas no cérebroíó, 8, 14, 22, 31). A forma específica que é processada de APP para BAP não # conhecida. As três formas (3) de APP produzidas através de «splicing» alternativo do pre-mRNA diferem pela inserção de uma região inibidora de proteases tipo Kunitz de 57 ou 76 aminoácidos inserida na forma mais pequena de 695 aminoácidos produzindo formas de 751 e 77@ aminoácidos. Pensa-se que todas estas três (3) formas sejam codificadas por um único gene no cromossoma vinte e um (21) no genoma humano (29). Nos cérebros AD as quantidades relativas das três formas podem ser alteradas resultando na acumulação anormal de uma das formas e seu subsequente processamento no BAP depositado.
Foi isolado um promotor do gene APP e mostrou-se conter sequências que são homólogas dos genes expressos constitutivamente e de genes induzíveis (24). Encontrou-se APP nos tecidos periféricas e do cérebro (11, 29) sugerindo que as sequências dos promotores constitutivos são activas em muitos tipos de células. A actividade das sequência indutíveis que são características dos sítios de ligação de ftp-l, elementos de choque térmico e sequências induzidas por éster de forbol sugerem ainda que o gene APP é activado par agentes que activam o sistema mensageiro da protei-na-cinase C (1, 2Θ) ou induzem a produção de proteínas fos relacionadas (5, 17) e/ou outros factares de transcrição envolvidos na regulação da produção de mRNA a partir deste gene. A cópia de gene simples do gene de APP humana, situada no cromossoma vinte um (21) não mapeia no iocus da Doença de Alzheimer Familial (FAD) (9)« 0 gene APP contem pelo menos dezasseis exões, Dependendo do «splicing» do produto de transcrição inicial <ió>5 pelo menos três formas de proteína são expres— sas a partir deste gene através de «splicing» alternativo do produto de transcrição primário. Não são conhecidas as via de processamento de proteínas do precursor APP grande até ao SAP de quarenta e dois aminoácidos nem a forma que está envolvida de facto no processamento proteico conhecido.
Para estudar a regulação da expressão do gene APP, a região do promotorfoi isolada e analisada quanto à actividade num sistema de gene repórter em cultura de tecidos. 0 promotor contem regiões ricas em adenosina-citosina C8C) características dos genes expressos constitutivamenta incluindo genes de manutenção como a vimentina (2fe), receptor do factor de crescimento dos nervos (N8F) (27) e os genes precoces do vírus Símio 4Θ (SV40) (3) mas não contem uma caixa TATA ou CAAT (Estes são um padrão de nucleotídeos encontrados na maior parte dos DNAs de promotores) típicos de promotores específicos de tecidos e de outros promotores de eucariotas.
Para além de regiões ricas em BC, este promotor contem um elemento que responde ao choque térmico (HSE)e um sítio de ligação a AP-1 CAP-i é um complexo proteico de proteínas FDS e JUN? o sítio de ligação a AP-1 tem um padrão específica de nucleotídeos) dentro de trezentos e cinco (305) a quatrocentos e oitenta e cinco (405) nucleotídeos do sítio de iniciação da transcrição» Estas sequências de promotor induzivel foram testados no sistema de gene repórter h8H quanto à sua capacidade para responder a IL-i,
Encontrou-se que os fragmentos de promotor contendo os sítios de ligação a AP-1 e HSe respondem a IL-1 e aumentam o nível de produção de h8H dirigidos por estes fragmentos de promotor. 0 fragmento promotor contendo apenas sequências SC sem os sítios de ligação de HSE ou AP-Í Distai não respondem a IL—i mas produzem um nível constitutivo de hSH na ausência ou presença de IL-i» seja
Mostrou-se que IL-1 activa a expressão de genes via sistema de proteína-cinase C (23), através da síntese das proteínas Fos-uun que actuam como factores da transcrição que se ligam ao sítio deligação a AP-1 no DNA do promotor de outros genes induzíveis (17). Estudos anterioresmostraram que IL-i é capaz de aumentar a produção de NSF através da estabilização e auumento da transcriçãodo mRNA de NSF (18). Esta estimulação pode envolver facilitação via sistema mensageiro da proteína-cinase C que se demonstrou estar envolvido na estimulação de mRMA de APP em culturas primárias de células humanas» NSFtambém estimula direc-tamente a síntese de APP no cérebro de hamster em desenvolvimento Íi9) através de uma via desconhecida. Em adição, o gene fos é direclamente estimulado pelo tratamento de células com IL-1 (17)» Portanto, se bem que não querendo ser limitado pela teoria, é proposto que a resposta a IL-1 em células AB-1 (neurofalastoma de ratinho) esteja envolvida com os produtos do gene fos e possivelmente outras factores de transcrição relacionados com oncogenes» Também, uma vez que a produção de NSF é estimulada por IL-1, é possível que a indução observada neste estudo seja mediada através de NGF» \
Para investigar a actividatíe das sequências reguladoras do promotor, uma sequência isolada do promotor APP foi introduzida em células de neuroblastoma de ratinho para testar a activida-de numa variedade de condições» Surpreendentemente, o presente invento descobriu que o promotor è activo naquelas células de neuroblastoma quando os sítios ds ligação de H5E e AP-Í estão presentes e é induzível pelos compostos tipo Interleuquina-1« Portanto, o presente invento sugere que este promotor seja capaz de regular a produção de APP e a resposta aos factores indutores de «stress» em células neuronais e isto pode ser um mecanismo pelo qual BAPé produzido em excesso levando à acumulação anormal de BAP na Doença de Alzheimer.
BREVE DESCRIC«Q DOS DESENHOS FIGURA 1« 0 fragmento BamHI-BamHí do subclone de pUC19 contendo o fragmento EcoRI-BamHI do clorse lambda foi isolado e ligado no sitio BamHZ de pOGH para produzir pCLL EB íaka pCLL 7B3) e pCLL. BE(aka pCLL 784). pCLL—EB foi digerido com HindiII ou Xbal para produzir respsctivaroente pCLL—HB e pCLL—XB, respectivamente» Todos os números na figura se referem à sequência transcrita onde +1 ê a primeira base da grelha de leitura aberta de APp na sequência de mRNA. FI6URA 2.
Sequência de DNA da região do promotor clonada em pCLL—HB.
A» A sequência de DNA de 485 bases da região do promotor de APP 8. Localização e sequência de regiões potencialmente activas do promotor APP mostrando a sequência consensos e a localização de desemparelhamentos de bases (sublinhado), FIGURA 3»
Produção de hormona de crescimento humana por células AB-i transitoriamente infectadas com construções do promotor de APP apresentadas na Figura 1» A» Células A8-1 foram transfectadas com cada uma das construções de promotores e tstatias após 6Θ horas quanto á produção de hGH» B« Indução de células AB-i transitóriamente transfectadas com 1 ng/ml de Interleuquina-i. As células foram testadas quanto à produção de hBH após 60 horas»
SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento está relacionado com um método para a modulação da expressão da proteína precursor amilóide em que o referido método envolve a utilização de um promotor para a expressão da referida proteína precursora amilóide (APP)contendo sítios de ligação de HSE e AP-i. E?e preferência, estes sítios de ligação estão dentro de trezentos e cinco <3@5) a quatrocentos e oitenta e cinco (4B5) nucleotídeos do sinal de iniciação da transcrição de um sistema repórter.
Para além deste ohjectvo, o presente invento está relacionado com o actual promotor em que os elementos chave são os sítios de ligação de HSE e de AP~i. Ainda, o presente invento também está relacionado com métodos para a medição da capacidade de indução de um DNA promotor em que este método envolve a inserção do DMA promotor num plasmídeo que constitui um sistema para expressão da hormona de crescimento humana e depois testagem da capacidade de indução do sistema promotor com Interleuquina—í ou compostos tendo actividade tipo Interleuquina—1«
Para além do referido, o presente inyento também está relacionado com o mecanismo para o controle da produção e proteínas beta-smílóides pelo controle da produção de RNAs do precursor amilóide. finalmente, é apreciado que o presente invento também está relacionado com o mecanismo para o tratamento da Doença de Alcheimer através da regulação da produção da proteína precursor amilóide com agonistas -a antagonistas da Interleuquina-1 ou que afectam esta produção da proteína precursor amilóide de modo semelhante aos compostos tipo Interleuquina-·! „
Para fins do presente invento todos os plasmídeos, sequências de DNA e microorganismos depositados em relação com o presente invento, excepto sempre que especificado o contrário, estão depositados na colecção de culturas da American Cyanamid Company mantida em Princeton, New Jersey e estão depositadas na American Type Culture Collection em Rockford, Maryland 2Θ952 USA, como se segues pCLL em E« coli é ATCC 6S@86 depositado em 3'i de Agosto de 1989 e a linha celular de neuroblastoma AB-i é ATCC CRL10211 também depositado em 31 de Agosto d 1989«
Estes e outros objectivos do invento tornar-se-ão mais óbvios pela descrição detalhada do invento apresentada abaixo»
DESCRI cm DETALHADA DO INVENTO A seguir são proporcionados exemplos do invento que não são limitantes destes
EXEMPLO 1
Clonaqem Senómica e Seguenciacão de DMA
Unia biblioteca da cromossoma vinte um <21) íATCC 57743) contendo fragmentos EcoRI foi despistado com um oligonucleotídeo sonda de cinquenta e nove bases (59) homólogo do extremo 55 da sequência de mRNA de APP» Os fragmentos identificados foram subclanados no sitio EcoRI de pUC19 e sequneciados usando o método da reacção de terminação de cadeias e SequenaseX (US Biochemicals). EXEMPLO 2
Construção do Sistema de 8ene Repóter
Fragmentos de restrição dos subclones de pUC19 contendo a região do promotor foram inseridos no sistema de gene repórter da hormona de crescimento humana (Nichols Institute Diagnostics). As enzimas usadas e resultados da subclonagem estão apresentados na Figura L 0 DMA de plasmideo a ser usado nas experiências de transfecção foi isolado por dupla sedimentação em gradientes de densidade isopícnicos de cloreto de césio (CsCl). EXEMPLO 3
Caracterização dos Clonss Senómicos
Quatro (4) de fagos foram identifiçados no despiste inicial e encontrou-se conterem fragmentos EcoRI de 4 Kb que apresentam o mesmo padrão de restrição. Um destes clones fágicos foi usado para isolar o fragmento inserção que foi subc1 raiado em pUC19 e sequenciado o DMA usando iniciadores sintáticos homólogos ii -
do BKtremo 55 da sequência de mRNA» A sequenciàção de quase cinco centenas (SDC*) bases a montante do sítio de iniciação da transcrição não revelou uma caixa CAAT ou TATA comum à maior parte dos promotores eucarióticos (Figura 2). No entanto» esta região contem sequências homólogas dos promotores dos genes de manutenção!, genes induzíveis por choque térmico e genes regulados pelo factor de transcrição AP-i » A Figura 2B mostra a localização do promotor APP das sequências homólogas que se sabe existirem noutros promotores» Como se mostra na Figura 2B, regiSes ricas em GC estão situadas nos primeiros trezentos (300) pares de bases a montante do nucleotídeo de iniciação e as sequências indttzíveis foram encontradas trezentos e cinco (3Φ5) e quatrocentos e oitenta e cinco’(485) pares de bases a montante daquele sítio de iniciação da transcrição» A sequência de DNA aqui difere da descrita por Salbaum et al»5 (24) nos nucleotídeos da posição -132? -133 e -158. EXEMPLO 4
Construção do Sistema de Gene Reoórter
Para determinar a actividade das sequências identificadas nesta região do promotor os plasmideos mostrados na Figura 1 foram construidos e caracterizados por mapeamento com enzimas ds restrição e sequenciação de DNA para confirmar a presença dos fragmentos de restrição adequados» 0 sítio BamHI está situado na base +1D1 da sequência transcrita como determinado pela clonagem de cDNA e análise SI (24)para determinar o extremo 5J e portanto a base #+i» 0 fragmento BamHI de 2948 pares de bases foi isolado e inserido no vsctor pOSH (28) em ambas as orientações para produzir pCLL—EB e pCLL-BE (Figura D» Construiu-se pCLL-BE para servir como plasmídeo testemunha para a expressão de h8H uma vez que o promotor está incorrectamente orientado» pCLL-EBfoi
digerido com HindiII ou Xbal e novamente ligado após a remuçSa dos fragmentos de 2345 e 2525 pb para produzir pCLL—HBe pCLL—XB, respectivamente«
As três (3) construções portadoras do promotor na orientação correcta são activas na produção de e secreção de hBH para o meio (Figura 3). As células AB-i foram transfectadas com 10 pg de cada uma das quatro construções de promotores mostradas na Figura 1. Após incubação durante &Θ horas, testou-se 100 çl de meio de crescimento quanto à presença da hormona de crescimento humana (hBÍ-Ο por ensioa radioimunes. Cada uma das três (3) sequências de promotor orientadas correctamente produzem quantidades aprc-Kimadamente iguais de hBH. A produção de hBH no meio está dependente da quantidade de DMA adicionada às células e não é produzido na ausência de uma sequência promotora adequadamente orientada (Figura 3). A produção de hSH é dentro de 24 horas após a transfecção e acumula linearmente durante cerca de 12© horas (Tabela 1). Este resultado indica que o promotor contem sequências que são constitutivamente activas.A presença de regiões ricas em 8C são suficientes para suportar a produção de APP enquanto a presença do sítio de ligação de AP-i (-350) e o HSE (-317) não alteram significativamente a expressão constitutiva.
EXEMPLO
Indução da Actividade de Promotor com IL—1 Recombinante Humana
Para determinar se o
de ligação de AP-1 a HSE veis, as estão activos no ensaio transitório como sequência intiu. construções de promotor 8 ά 10 U/mg de proteína) Figura 4 mostra que a
células transformadas com cada uma £jas foram tratadas com í ng/ml de IL-l <3,2 imediatamente antes da transfer;,-^, A
produção ds hSH pelas'células transfectadas com as construções contendo HSE e o sítio de ligação de AP-1 (pCLL-EB e pCLL-HB) aumentou cerca de duas <2> vezes relativamente às culturas não tratadas com as mesmas construções, mas as células transfectadas com pCLL~XB não alteram os níveis de produção na presença ou ausãncia de IL-i» Aumentando a quantidade de IL-i não aumenta a produção de h8H sugerindo que 1 ng/ml é uma dose saturante para estas células. EXEMPLO &
Produção de hSH por Células Estávelmente Transfectadas
Após selecção de células portadoras do repórter promotor e pRSVMeo em 250 pg/ml de B41S durante vinte oito (28) dias, uma população de células ao acaso foi semeado em placas de 35 mm 5 a 5 x 10 células por placa e testou—se após vários tempos para determinar se se produzia h8H. A Tabela 1 mostra que as células portadoras das construções de promotor pCLL—HB na orientação correcta produz HSH de modo linear durante vinte e quatro (24) horas» (Tabela í > .
Para determinar a capacidade de indução das sequfncias promotoras integradas, as células portadoras da construção pCLL—HB foram semeadas a 5 x 10w células por cavidade e estabilizadas durante a noite» 0 meio foi mudado e metade das culturas recebeu 1 ng/ml de IL—1 no meio» Colheram-se amostras do meio em duplicado ao longo do tempo e testou-se como se mostra na Tabela ^ 1» A indução com IL-i começa dentro de duas horas resultando na produção estável de hSH em níveis superiores aos níveis observados nas células não tratadas» 0 declínio da velocidade de indução após duas horas sugere que a indução é transitória e que as ι_έ 1 ιλΙ 3¾ aumento continuam a produzir um nível constitutivo de htíH após o brusco inicial de actividade. 15 15
i □ TABELA 1
Indução com 1L-1 de células estávelmente transfectadas com pCLL-HB» HRS CPM C± ShM NHO TRATADO } IL-13 RAZÃO IL-1/ NÃO TRATADO 0 45 ± -! A / &4 ± 17 — r? .£» 254 ± 28 658 ± 42 2,59 3 i *ϊ TCj -ΙΑ l ·-»□ — 107 1986 ± 6 1, / o B 2Θ33 ± 75 3745 ± 145 1,85 24 7190 ± 691 í 2686 jl £T~?ír* O / ._j 1,76 50 25417 ± 1016 40427 ± 1855 1,59 a» 1 ng/1 de IL—1 adicionado a o meio às o horas» Cé1u1as tra t e nlo tratadas foram incubadas em paralelo»
Estes resultadas indicam que as sequências de promotor estávelmente transfectadas mantêm as earacteristicas esperadas do promotor nativa s servem como um sistema para estudar os efeitos dos vários factores de crescimento, compostos, drogas e condições de expressão de AhP em cérebros com Doença de Alzhsimer»
Para fins do presente invento as linhas celulares de neurabiastoma e E» coli contendo pCULL EB foram depositadas em ligação com o presente invento, excepto quando especificado contrário, foram depositadas na colecçSo de culturas da American Cyanamid Company mantida em Pearl River, New York e foram depositadas na American Type Culture Collection em Rockford, Maryland 20952 U.S..A. Especificamente foram feitos os seguintes depósitos na ATCC;
Depósito da célula de neuroblastoma AB-1 é ATCC CRL 10211 oll estirpe ΗΒ1Θ1 contendo ρ-CLL-EB é ATCC 68086 1 /
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Bruns, P. St George-Hyslop, M. L. Van Keuren, D. Patterson, S. Pagan, D. M. Kurnit, and R. L. Neve. 1987. Amyloid B protein gene: cDNA, mRNA distribution, and genetic linkage near the Alzheimer locus. Science 235:880-994. 31. Tanzi, R., A. McClatchey, E. Lamperti, L. Villa-Kamaroff, J. Gusella and R. Neve. Protease Inhibitor domain encoded by an amyloid protein *
precursor mRNA associated with Alzheimer's disease. 1988. Nature 331:528-530. 32. Tanzi. R. E., P. H. St George-Hyslop, and J. F. Gusella. 1989. Molecular genetic approaches to Alzheimer's disease. TINS 12:152-158. ,1 33. Yanisch-Perron, Celeste, Jeffrey Vieira and Joachim
Messing. 1985. Improved M13 pahge cloning vectors and host strains: Nucleotide seguences of the
Mi3mpi8 and pUCi9 vectors. Gene 33: 103-119.
Claims (8)
- * a REIVINDICAÇÕES i§. - Método para o controlo da expressão da proteína precursora amilóide, caracterizado por compreenders a utilização de um promotor para a expressão da referida proteína precursora amilóide contendo sítios de ligação a HSE e AP-15 em que os referidos sítios de ligação a HSE e AP-1 estão dentro de 4B5 nucleotídeos antes da iniciação da transcrição. 2ã« - Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o referido promotor ser identificado pela sequência de DMA encontrada na Figura 2A que se segues 4Hind3 (-485) AAGCTTCACT CGTTCTCATT CTCTTCCAGA AACGCCTGCC CCACCTCTCC AAACCGAGAG AAAAAACGAA ATGCGGATAA AAACGCACCC TAGCAGCAGT -389 AP-1 CCTTTATACG ACACCCCCGG GAGGCCTGCG GGGTCGGAIS ATTCAAGCTC HSE Xbal ACGGGGACGA GCAGGAGCGC TCTCGACTTT TCTAGAGCCT CAGCGTCCTA -289 GGACTCACCT TTCCCTGATC CTGCACCGTC CCTCTCCTGG CCCCAGACTC TCCCTCCCAC TGTTCACGAA GCCCAGGTGG CCGTCGGCCG GGGAGCGGAG -189 GGGGCGCGTG GGGTGCAGGC GGCGCCAAGG GCGCTGCACC TGTGGGCGCG GGGCGCGAGG GCCCCTCCÇG GCGCGAGCGG GCGCAGTTCC CCGGCGGCGC -89 ***** "" AP-l CGCTAGGGGT CTCTCTCGGG TGCCGAGCGG GGTGGGCCGG ATCAGCTGÁC \ s ICdCCTGGCT CTGAGCCCCG CCGCCGCGCT CGGGCTCCGT CAGTTTCCTC/ +12 ' +1 GGCAGCGGTA GGCGAGAGCA CGCGGAGGAG CGTGCGCGGG GGCCCCGGGA (J BamHl GACGGCGGCG GTGGCGGCGC GGGCAGAGCA AGGACGCGGC GGATCC +101 25 25ou sequências de DNA tendo substancialmente-^-ers mesmas capacidades de expressão de APP da sequência de DNA encontrada na Figura 2A anterior.
- 35. - Método de acordo com a Reivindicação 2, caracte-rizado por o referido promotor ser pCLL-EB.
- 45. - Método para a obtenção de um promotor da proteína precursora amilóide, caracterizado por compreender a identificação dos fragmentos de restrição de DNA contendo a sequência da proteína precursora amilóide, a identificação dos sítios de ligação a HSE e AP-1 dentro de 485 nucleotídeos antes do sinal de ini-iniciação da transcrição do DNA da proteína precursora amilóide, e o isolamento da porçaõ do DNA que contém estes sítios de ligação
- 55. - Método de acordo com a Reivindicação 4, caracte-rizado por o referido promotor ser identificado pela sequência de DNA encontrada na Figura 2A anterior ou sequências de DNA tendo substancialmente as mesmas capacidades de expressão de APP da sequência de DNA encontrada na Figura 2A.
- 65. - Método de acordo com a Reivindicação 5, caracte-rizado por o referido promotor ser idêntico ao promotor presente em pCLL-EB.
- 75. - Método para medir a capacidade de indução de um DNA promotor, caracterizado por compreender: a inserção do promotor da Reivindicação 4 num plasmídeo que também tem clonado nele DNA de hGH; e o ensaio da regulação do promotor por um agente de regulação de APP através da medição da expressão de hGH.
- 85. - Método de acordo com a Reivindicação 7, caracte-rizado por o referido promotor ser o promotor da Reivindicação 5.
- 95. - Método de acordo com a Reivindicação 7, caracte-rizado por referido promotor ser o promotor da Reivindicação 6. 10â» ~ Método de acordo com a Reivindicação 7t carai-te-rizado por o referido regulador ser Interlsuqi.iina.~i , composto do tipo Interleuquina-1 s Interleuquina-6s Factor de Necrose Tumoral ou suas combinações» ilã» - Método de acordo com a Reivindicação 8, caracte-rizado por o referido agente regulador de APP ser Interleuqui-na-lj composto do tipo Interleuquina-1s Interieuquina-ó,, Factor de Necrose Tumoral ou suas combinações» 121» - Método de acordo com a Reivindicação 9, caracte-rizado por o referido agente regulador de APP ser Xnterleuqui-na-15 composto do tipo Interleuquina-i, Interleuquina-6, Factor de Necrose Tumoral ou suas combinações. 131« - Método para o tratamento da Doença de Alzheimer,, carcaterizado por compreenders a regulação da expressão da proteína precursora amilóide através do controlo da expressão do referido promotor da proteína precursora amilóide contendo sítios de ligação a HBE e AP~í com um agente regulador da proteína precursor amilóide» Í41» - Método de acordo com a Reivindicação i, caracte-rizado por o referido agente ser Interleuquina—i, um composto do tipo Interleuquina-1, InterIeuquina-6? Factor de Necrose Tumoral ou suas combinações» Lisboa, 21 de Setembro de 199ΘAgente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3." 1200 LISBOA.
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