PT946725E - Activador do receptor de nf-kappa b, o receptor é membro da superfamília do receptor tnf - Google Patents

Description

ΕΡ0946725Β1

DESCRIÇÃO

ACTIVADOR DO RECEPTOR DE NF-KAPPA B, O RECEPTOR É MEMBRO DA SUPERFAMÍLIA DO RECEPTOR TNF

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se de um modo geral ao campo dos receptores de citoquina, e mais especificamente a pares de receptor de citoquina/ligando que possuem actividade imunorreguladora.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O funcionamento eficiente do sistema imunitário requer um equilíbrio fino entre proliferação celular e diferenciação e morte celular, para assegurar que o sistema imunitário é capaz de reagir com antigénios externos, mas não com os antigénios próprios, integrante ao processo de regulação da resposta imunitária e inflamatória estão vários membros da superfamília do Receptor do Factor de Necrose Tumoral (TNF)/Receptor do Factor de Crescimento Nervoso (Smith et al., Science 248:1019; 1990). Esta família de receptores inclui dois receptores de TNF diferentes (Tipo I e Tipo II; Smith et al., supra·, e Schall et al., Cell 61:361, 1990), receptor do factor de crescimento do nervo (Johnson et al., Cell 47:545, 1986), antigénio CD40 de células B (Stamenkovic et al., embo J. 8:1403, 1989), CD27 (Camerini et al., J. Immunol. 147:3165, 1991), CD30 (Durkop et al., Cell 68:421, 1992), antigénio 0X40 de células T (Mallett et al., EMBO J. 9:1063, 1990), antigénio Fas humano (Itoh et al., Cell 66:233, 1991), receptor 4-1BB de murino (Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 1 ΕΡ0946725Β1 USA 86:1963, 1989) e um receptor referido como Receptor de Indução de Apoptose (AIR; USSN 08/720,864, submetido em 4 de Outubro de 1996). O CD40 é um receptor presente em linfócitos B, células epiteliais e algumas linhas celulares de carcinoma que interagem com um ligando encontrado em células T activadas, CD40L (USSN 08/249 189, submetido em 24 de Maio de 1994) . A interacção deste par ligando/receptor é essencial para ambas as respostas imunitárias celular e humoral. A transdução de sinal via CD40 é mediada através da associação do domínio citoplásmico desta molécula com membros dos factores associados ao receptor de TNF (TRAFs; Baker e Reddy, Oncogene 12:1, 1996). Verificou-se recentemente que os murganhos que são deficientes na expressão de TRAF3 devido a uma ruptura direccionada no gene que codifica TRAF3 parecem normais ao nascer mas desenvolvem a hipoglicemia progressiva e o esgotamento de células brancas periféricas, e morrem por volta dos dez dias de idade (Xu et al., Immunity 5:407, 1996) As respostas imunitárias de murganhos quiméricos reconstituídos com TRAF3_/_ células de fígado fetal assemelham-se àquelas de murganhos deficientes para CD40, embora as células TRAF3_/“ B pareçam ser funcionalmente normais. O papel crítico de TRAF3 na transdução de sinal pode estar na sua interacção com um dos outros membros da superfamília do receptor de TNF, por exemplo, CD30 ou CD27, que estão presentes nas células T. Alternativamente, podem existir outros membros, ainda não identificados, desta família de receptores que interagem com TRAF3 e desempenham um papel importante no desenvolvimento pós-natal, assim como 2 ΕΡ0946725Β1 no desenvolvimento de um sistema imunitário competente. Identificar membros adicionais da superfamilia do receptor TNF iria proporcionar um meio adicional de regulação da resposta imunitária e inflamatória, assim como proporcionar potencialmente outros conhecimentos sobre o desenvolvimento pós-natal em mamíferos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um receptor novo, referido como RANK (para Activador do Receptor de NF-κΒ), que é um membro da superfamilia do receptor TNF. RANK é uma proteina transmembranar de Tipo I que possui 616 resíduos de aminoácidos que interagem com TRAF3. 0 desencadear de RANK através de sobre-expressão, co-expressão de RANK e do ligando de RANK ligado à membrana (RANKL), e com a adição de RANKL solúvel ou anticorpos agonísticos para RANK resulta na regulação positiva do factor de transcrição NF-κΒ, um factor de transcrição ubíquo que é muito extensivamente utilizado em células do sistema imunitário.

As formas solúveis do receptor podem ser preparadas e utilizadas para interferir com a transdução de sinal através de RANK ligado à membrana, e desse modo a regulação positiva de NF-κΒ; consequentemente, as composições farmacêuticas que compreendem formas solúveis do novo receptor são também proporcionadas. A inibição de NF-κΒ por antagonistas de RANK pode ser útil no melhoramento dos efeitos negativos de uma resposta inflamatória que resulta do desencadeamento de RANK, por exemplo no tratamento de choque tóxico ou sepsia, reacções de enxerto-versus-hospedeiro, ou reacções inflamatórias agudas. Formas solúveis do receptor serão 3 ΕΡ0946725Β1 também úteis in vitro para o rastreio de agonistas ou antagonistas da actividade de RANK. 0 dominio citoplásmico de RANK será útil nos ensaios de desenvolvimento de inibidores da transdução de sinal, por exemplo, para o rastreio de moléculas que inibem a interacção de RANK com TRAF2 ou TRAF3. Também são reveladas as formas eliminadas e as proteínas de fusão compreendendo o novo receptor. A presente invenção também identifica uma contra-estrutura, ou ligando, para RANK, referida como RANKL. RANKL é uma proteína transmembranar de Tipo 2 com um domínio intracelular inferior a cerca de 50 aminoácidos, um domínio de transmembrana e um domínio extracelular desde cerca de 240 até 250 aminoácidos. De uma forma semelhante a outros membros da família de TNF à qual ela pertence, a RANKL possui uma região 'espaçadora' entre o domínio de transmembrana e o domínio de ligação ao receptor que não é necessário para a ligação ao receptor. Consequentemente, as formas solúveis de RANKL podem compreender o domínio extracelular inteiro ou os seus fragmentos que incluem a região de ligação ao receptor.

Estes e outros aspectos da presente invenção serão evidentes após referência à seguinte descrição detalhada da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 demonstra a influência de RANK.Fc e hRANKL no crescimento de células T activadas. As células T de sangue periférico humano foram cultivadas como descrito 4 ΕΡ0946725Β1 no Exemplo 12; a recuperação de células T viáveis foi determinada através de contagens em azul de tripano em triplicado. A Figura 2 ilustra a capacidade de RANKL para induzir a formação da aglomeração de DC humana. As células dendriticas funcionalmente maduras (DC) foram criadas in vitro a partir da medula óssea de CD34 + (BM) progenitores e cultivadas como descrito no Exemplo 13. Foram cultivadas CDla+ DC num cocktail de citoquina isoladamente (Figura 2A), em cocktail mais CD40L (Figura 2B), RANKL (Figura 2C), ou RANKL inactivada pelo calor (ΔΗ) (Figura 2D), e depois fotografados utilizando um microscópio de inversão. A Figura 3 demonstra que a RANKL aumenta a capacidade alo-estimuladora de DC. As células T alogeneicas foram incubadas com números variáveis de DC irradiadas cultivadas como descrito no Exemplo 13. As culturas foram pulsadas com [3H]-timidina e as células foram recolhidas em folhas de fibra de vidro para contagem. Os valores representam a média ± desvio padrão (SD) de culturas em triplicado. A Figura 4 apresenta um alinhamento de RANK humano com outros membros da família de TNFR na região de pseudo-repetições ricas em cisteína extracelular conservadas estruturalmente. As ligações de persulfureto previstas (DS1-DS3) estão indicadas. RANK e CD40 contêm substituições de aminoácidos idênticos (CAH, CAG) eliminando DS2 na segunda pseudo-repetição. 5 ΕΡ0946725Β1 A Figura 5 apresenta um alinhamento de RANKL humana com outros membros da família de TNF.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Uma nova inserção de cDNA parcial com uma grelha de leitura aberta prevista que possui alguma semelhança com CD4 0 foi identificada numa base de dados contendo a informação de sequência a partir de cDNAs criados a partir de células dendríticas derivadas da medula óssea humana (DC). A inserção foi utilizada para hibridar com transferências de colónias criadas a partir de uma biblioteca de cDNA de DC contendo cDNAs de cumprimento total. Realizaram-se várias hibridações de colónias e isolaram-se dois clones (SEQ ID N°s:l e 3) . A SEQ ID N°:5 apresenta a sequência de nucleótidos e de aminoácidos de uma proteína de comprimento total prevista com base no alinhamento das sequências sobreponíveis das SEQ ID N°s:1 e 3. RANK é um membro da superfamília do receptor TNF; assemelha-se muito a CD40 na região extracelular. Semelhante a CD4 0, a RANK associa-se com TRAF2 e TRAF3 (como determinado por ensaios de co-imunoprecipitação substancialmente como descrito por Rothe et al., Cell 83:1243, 1995) . As TRAFs são criticamente importantes na regulação da resposta imunitária e inflamatória. Através da sua associação com vários membros da superfamília do receptor TNF, um sinal é transduzido para uma célula. Esse sinal resulta na proliferação, diferenciação ou apoptose da célula, dependendo de qual o receptor (es) que é/são desencadeados e que TRAF(s) se associam com os(s) receptor(es); podem ser transduzidos diferentes sinais a uma célula através da coordenação de vários eventos de 6 ΕΡ0946725Β1 sinalização. Assim, um sinal transduzido através de um membro desta família pode ser proliferativo, diferenciador ou apoptótico, dependendo de outros sinais que são transduzidos para a célula, e/ou o estado de diferenciação da célula. Essa regulação extraordinária desta via proliferativa/apoptótica é necessária para desenvolver e manter a protecção contra patogénios; os desequilíbrios podem resultar em doença autoimune. A RANK é expressa em células epiteliais, algumas linhas celulares B, e em células T activadas. Contudo, a sua expressão em células T activadas é tardia, cerca de quatro dias após a activação. Este curso de tempo de expressão coincide com a expressão de Fas, um agente de apoptose conhecido. A RANK pode actuar como um sinal anti-apoptótico, recuperando células que expressam RANK da apoptose como CD40 é conhecido fazerem. Alternativamente, a RANK pode confirmar um sinal apoptótica nas circunstâncias apropriadas, novamente semelhantes a CD40. A RANK e o seu ligando desempenham provavelmente um papel integral na regulação da resposta imunitária e inflamatória.

Além disso, a letalidade pós-natal de murganhos que possui uma ruptura direccionada do gene TRAF3 demonstra a importância desta molécula não apenas na resposta imunitária mas no desenvolvimento. 0 isolamento de RANK, como uma proteína que se associa a TRAF3, e o seu ligando irá permitir posterior definição desta via de sinalização, e desenvolvimento das modalidades de diagnóstico e terapêutica para utilização na área das doenças autoimunes e/ou inflamatórias. 7 ΕΡ0946725Β1 DNAs, Proteínas e Análogos A presente invenção proporciona polipéptidos de RANK humana isolada e seus análogos (ou muteínas) que possuem uma actividade apresentada pela molécula nativa (i.eas muteinas RANK que se ligam especificamente a um ligando de RANK expresso em células ou imobilizadas numa superfície ou a anticorpos específicos para RANK; suas formas solúveis que inibem sinalização induzida pelo ligando de RANK através de RANK). Essas proteínas estão substancialmente isentas de materiais endógenos contaminantes e, opcionalmente, sem Derivados de Glicosilação de RANK de padrão nativo associados dentro do âmbito da invenção também incluem várias formas estruturais das proteínas primárias que retêm actividade biológica. Devido à presença de grupos amino e carboxilo ionizáveis, por exemplo, uma proteína RANK pode estar na forma de sais acídicos ou básicos, ou pode estar na forma neutra. Também podem ser modificados resíduos de aminoácidos individuais por oxidação ou redução. A estrutura de aminoácidos primários pode ser modificada formando conjugados covalentes ou agregativos com outras unidades químicas, tais como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes, ou através da criação de mutantes de sequência de aminoácidos. Os derivados covalentes são preparados através da ligação de grupos funcionais particulares a cadeias laterais de aminoácidos ou nos terminais N- ou C-.

Os derivados de RANK também podem ser obtidos pela acção de agentes de ligação reticulada, tais como o éster de M-maleimidobenzoil succinimida e N-hidroxissuccinimida, a resíduos de cisteína e lisina. As proteínas inventivas podem também ser ligadas covalentemente através dos grupos laterais 8 ΕΡ0946725Β1 reactivos a vários substratos insolúveis, tais como activadas por brometo de cianogénio, activadas por bisoxirano, activadas por carbonildiimidazole ou estruturas de agarose activadas por tosilo, ou através da adsorção a superfícies de poliolefina (com ou sem ligação reticulada de glutaraldeido). Uma vez ligadas a um substrato, as proteínas podem ser utilizadas para se ligarem selectivamente (para objectivos de ensaio ou purificação) a anticorpos criados contra as proteínas ou contra outras proteínas que são semelhantes a RANK ou RANKL, assim como a outras proteínas que se ligam a RANK ou RANKL ou seus homólogos.

Formas solúveis de RANK estão também dentro do âmbito da invenção. A sequência de nucleótidos e a sequência prevista de aminoácidos de RANK é apresentada nas SEQ ID N°s:l até 6. A análise por computador indicou que a proteína possui um péptido sinal N terminal; o sítio de clivagem previsto segue-se ao resíduo 24. Os especialistas na técnica reconhecerão que o próprio sítio de clivagem pode ser diferente daquele da análise prevista por computador. Assim, é esperado que o aminoácido N-terminal do péptido clivado esteja dentro de cerca de cinco aminoácidos em qualquer lado do sítio de clivagem previsto, preferido após o resíduo 24. Para além disso, foi preparada uma forma solúvel começando com o aminoácido; esta forma solúvel liga-se a RANKL. 0 péptido sinal é previsto como sendo seguidos por um domínio extracelular de 188 aminoácidos, um domínio de transmembrana de 21 aminoácidos, e uma cauda citoplásmica de 383 aminoácidos. 0 RANK solúvel compreende o péptido sinal e o domínio extracelular (resíduos 1 até 213 da SEQ ID N°: 6) ou um seu 9 ΕΡ0946725Β1 fragmento. Alternativamente, um péptido sinal diferente pode ser substituído pelo líder nativo, começando com o resíduo 1 e continuando através de um resíduo seleccionado a partir do grupo que consiste nos aminoácidos 24 até 33 (inclusivamente) da SEQ ID N°: 6. Para além disso, os fragmentos do domínio extracelular irá também proporcionar formas solúveis de RANK. Os fragmentos podem ser preparados utilizando técnicas conhecidas para isolar uma porção desejada da região extracelular, e pode ser preparada, por exemplo, comparando a região extracelular com aqueles dos outros membros da família de TNFR e seleccionando formas semelhantes àquelas preparadas para outros membros da família. Alternativamente, podem ser utilizados sítios únicos de restrição ou técnicas de PCR que são conhecidos na técnica para preparar numerosas formas truncadas que podem ser expressas e analisadas para actividade.

Podem ser preparados fragmentos utilizando técnicas conhecidas para isolar uma porção desejada da região extracelular, e podem ser preparados, por exemplo, comparando a região extracelular com aqueles dos outros membros da família de TNFR (do da qual a RANK é um membro) e seleccionar formas semelhantes àqueles preparados para outros membros da família. Alternativamente, os sítios de restrição únicos ou técnicas de PCR que são conhecidas na técnica podem ser utilizadas para preparar numerosas formas truncadas que podem ser expressas e analisadas para a actividade.

Outros derivados das proteínas RANK dentro do âmbito desta invenção incluem conjugados covalentes ou agregantes das proteínas ou seus fragmentos com outras proteínas ou polipéptidos, tal como através de síntese em cultura 10 ΕΡ0946725Β1 recombinante como fusões N-terminal ou C-terminal. Por exemplo, o péptido conjugado pode ser uma sequência de polipéptido sinal (ou lider) na região N-terminal da proteína que, por co-tradução ou pós-tradução dirige a transferência da proteína do seu sítio de síntese para o seu sítio de função dentro ou fora da membrana ou parede celular (e.g., o factor líder α de levedura).

As proteínas de fusão podem compreender péptidos adicionados para facilitar a purificação ou identificação de proteínas RANK e homólogos (e.g., poli-His). A sequência de aminoácidos das proteínas inventivas pode também ser ligadas a um péptido de identificação, tal como descrito por Hopp et al., Bio/Technology 6:1204 (1988). Um tal péptido altamente antigénico proporciona um epitopo ligado reversivelmente através de um anticorpo monoclonal específico, permitindo um ensaio rápido e purificação fácil da proteína expressa de forma recombinante. A sequência de Hopp et al. é também clivada especificamente por enterocinase da mucosa bovina, permitindo a remoção do péptido a partir da proteína purificada. As proteínas de fusão protegidas com esses péptidos podem também ser resistentes à degradação intracelular em E. coll.

As proteínas de fusão compreendem ainda uma sequência de aminoácidos de uma RANK ligada a uma região de imunoglobulina Fc. Uma região de Fc exemplar é uma igGi humana que possui uma sequência de nucleótidos e aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 8. Também podem ser utilizados fragmentos de uma região Fc, assim como podem ser utilizadas muteínas de Fc. Por exemplo, certos resíduos dentro da região da dobra de uma região Fc são críticos para a elevada ligação de afinidade 11 ΕΡ0946725Β1 para FcyRI. Canfield e Morrison (J. Exp. Med. 173:1483; 1991) relataram que Leu (234) e Leu(235) foram críticos para a ligação de elevada afinidade de IgG3 até FcyRI presentes em células U937. Foram obtidos resultados semelhantes por Lund et al. (J. Immunol. 147:2657, 1991; Molecular Immunol. 29:53, 1991). Essas mutações, isoladamente ou em combinação, podem ser realizadas numa região Fc de igGi para diminuir a afinidade de igGi para FcR. Dependendo da porção da região Fc utilizada, pode ser expressa uma proteína de fusão como um dímero, através da formação de ligações de persulfureto intercadeia. Se as proteínas de fusão são realizadas com ambas as cadeias pesadas e leves de um anticorpo, é possível formar um oligómero de proteína com tantas quanto quatro regiões de RANK.

Noutra forma de realização, as proteínas RANK compreendem ainda um péptido de oligomerização, tal como um domínio de fecho de leucina. Os fechos de leucina foram originalmente identificados em várias proteínas de ligação a DNA (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988). O domínio de fecho de leucina é um termo utilizado para se referir a um domínio de péptido conservado presente nestas (e noutras) proteínas, que é responsável pela dimerização das proteínas. O domínio de fecho de leucina (também aqui referido como um domínio de oligomerização, ou de formação de oligómero) compreende uma heptada repetitiva, com quatro ou cinco resíduos de leucina intercalados com outros aminoácidos. Exemplos de domínios de fecho de leucina são aqueles que se encontram no factor de transcrição GCN4 de levedura e uma proteína de ligação a DNA estável ao calor que se encontra em fígado de rato (C/EBP; Landschulz et al., Science 243:1681, 1989) . Duas proteínas de transformação nuclear, fos e jun, 12 ΕΡ0946725Β1 também apresentam domínios de fecho de leucina, com o faz o produto genético do proto-oncogene de murino, c-myc (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988). Os produtos dos oncogenes nucleares fos e jun que compreendem domínios de fecho de leucina formam preferencialmente um heterodímero (0'Shea et al., Science 245:646, 1989; Turner e Tjian, Science 243:1689, 1989). O domínio de fecho de leucina é necessário para a actividade biológica (ligação a DNA) nestas proteínas.

As proteínas fusogénicas de vários vírus diferentes, incluindo paramixovírus, coronavírus, vírus do sarampo e muitos retrovírus, também possuem domínios de fecho de leucina (Buckland e Wild, Nature 338:547,1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart e Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6:703, 1990). Os domínios de fecho de leucina nestas proteínas fusogénicas virais estão próximos da região transmembranar das proteínas; foi sugerido que os domínios de fecho de leucina podem contribuir para a estrutura oligomérica das proteínas fusogénicas. A oligomerização das proteínas fusogénicas virais está envolvida na formação de poros de fusão (Spruce et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88:3523, 1991). Os domínios de fecho de leucina também foram relatados recentemente como desempenhando um papel na oligomerização de factores de transcrição de choque térmico (Rabindran et al., Science 259:230, 1993) .

Os domínios de fecho de leucina dobram-se como hélices enroladas curtas, paralelas. (0'Shea et al., Science 254:539; 1991) A arquitectura geral da hélice enrolada paralela foi bem caracterizada, com um empacotamento "botões-em-buracos", 13 ΕΡ0946725Β1 como proposto por Crick em 1953 (Acta Crystallogr. 6:689). 0 dímero formado por um domínio de fecho de leucina é estabilizado pela repetição de heptada, designada (abcdefg)n de acordo com a notação de McLachlan e Stewart (J. Mol. Biol. 98:293; 1975), na qual os resíduos a e d são geralmente resíduos hidrofóbicos, com d sendo uma leucina, que alinham na mesma face de uma hélice. Resíduos com cargas opostas ocorrem normalmente nas posições g e e. Assim, numa hélice enrolada paralela formada a partir de dois domínios em hélice de fecho de leucina, os "botões" formados pelas cadeias laterais hidrofóbicos da primeira hélice são empacotados nos "buracos" formados entre as cadeias laterais da segunda hélice.

Os resíduos de leucina na posição d contribuem com fortes energias de estabilização hidrofóbicas, e são importantes para a formação de dímeros (Krystek et al., Int. J. Peptide Res. 38:229, 1991). Lovejoy et al. relataram recentemente a síntese de um emaranhado de hélices α de cadeia tripla, no qual as hélices correm para cima-para cima-para baixo (Science 259:1288, 1993). Os seus estudos confirmaram que a energia de estabilização hidrofóbica proporciona a principal força motriz para a formação de hélices enroladas a partir de monómeros helicoidais. Estes estudos também indicam que as interacções electrostáticas contribuem para a estequiometria e geometria das hélices enroladas. Vários estudos indicaram que os aminoácidos conservadores podem ser substituídos para resíduos de leucina individuais com uma diminuição mínima da capacidade para dimerizar; alterações múltiplas, todavia, resultam 14 ΕΡ0946725Β1 normalmente na perda desta capacidade (Landschulz et al., Science 243:1681, 1989; Turner e Tjian, Science 243:1689, 1989; Hu et al., Science 250:1400, 1990). van Heekeren et al. relataram que vários resíduos amino diferentes podem ser substituídos pelos resíduos de leucina no domínio de fecho de leucina de GCN4, e verificaram ainda que algumas proteínas GCN4 que continham duas substituições de leucina eram fracamente activas (Nucl. Acids Res. 20:3721, 1992). A mutação da primeira e da segunda leucinas heptadicas do domínio de fecho de leucina da proteína de fusão do vírus do sarampo (MVF) não afectam a formação de sincício (uma medida da fusão celular induzida por vírus); todavia, a mutação de todos os quatro resíduos de leucina preveniram a fusão completamente (Buckland et al., J. Gen. Virol. 73: 1703, 1992) . Nenhuma das mutações afectaram a capacidade de MVF para formar um tetrâmero.

Verificou-se que as substituições de aminoácidos nos resíduos a e d de um péptido sintético representam o domínio GCN4 de fecho de leucina alteram as propriedades de oligomerização do domínio de fecho de leucina (Alber, Sixth Symposium of the Protein Society, San Diego, CA) . Quando todos os resíduos na posição a são alterados para isoleucina, o fecho de leucina ainda forma um dímero paralelo. Quando, adicionalmente a esta alteração, todos os resíduos de leucina na posição d são também alterados para isoleucina, o péptido resultante forma espontaneamente uma hélice enrolada trimérica em paralelo em solução. A substituição de todos os aminoácidos na posição d com isoleucina e na posição a com leucina resulta num péptido que tetrameriza. Os péptidos contidos nestas substituições são ainda referidos como os domínios de fecho de leucina. 15 ΕΡ0946725Β1

Estão também incluídos dentro do âmbito da invenção fragmentos ou derivados do domínio intracelular de RANK. Esses fragmentos são preparados por qualquer das técnicas aqui mencionadas, e incluem péptidos que são idênticos ao domínio citoplásmico de RANK como apresentado na SEQ ID N°: 6, e aqueles que compreendem uma porção da região do citoplasma. Todas as técnicas utilizadas na preparação de formas solúveis também podem ser utilizadas na preparação de fragmentos ou análogos do domínio citoplásmico (í.e., técnicas de RT-PCR ou utilização de enzimas de restrição seleccionadas para preparar truncagens). Os DNAs que codificam a totalidade ou um fragmento do intradomínio citoplásmico serão úteis na identificação de outras proteínas que estão associadas com a sinalização de RANK. Por exemplo utilizando as técnicas de imunoprecipitação aqui descritas, ou outra técnica, tal como um sistema de dois híbridos de levedura (Rothe et al., supra). A presente invenção também inclui RANK com ou sem glicosilação padrão nativa associada. Proteínas expressas em sistemas de expressão de leveduras ou de mamíferos, e.g., células COS-7, podem ser semelhantes ou ligeiramente diferentes em peso molecular e padrão de glicosilação do que as moléculas nativas, dependendo do sistema de expressão. A expressão de DNAs que codificam as proteínas inventivas em bactérias tais como E. coli proporciona moléculas não glicosiladas. Os análogos mutantes funcionais da proteína RANK que possuem sítios de N-glicosilação inactivados podem ser produzidos através de síntese de oligonucleótidos e ligação ou através de técnicas de mutagénes dirigida para um sítio. Estas proteínas análogas podem ser produzidas de uma forma homogénea, de carbo-hidratos reduzida em rendimento elevado utilizando sistemas de expressão de levedura. Os 16 ΕΡ0946725Β1 sítios de N-glicosilação em proteínas eucarióticas são caracterizados pelo tripleto de aminoácidos Asn-Αχ-Ζ, em que Αχ é qualquer aminoácido excepto Pro, e Z é Ser ou Thr. Nesta sequência, a asparagina proporciona um grupo amino de cadeia lateral para a ligação covalente de carbo-hidratos. Um tal sítio pode ser eliminado através da substituição de outro aminoácido por Asn ou por resíduo Z, eliminando Asn ou Z, ou inserindo um aminoácido não Z entre Ai e Z, ou um aminoácido diferente de Asn entre Asn e Αχ.

Os derivados da proteína RANK também podem ser obtidos através de mutações da RANK nativa ou suas subunidades. Uma proteína RANK mutada, como aqui referida, é um polipéptido homólogo a uma proteína RANK nativa, respectivamente, mas que possui uma sequência de aminoácidos diferente da proteína nativa devido a uma ou a uma variedade de deleções, inserções ou substituições. 0 efeito de qualquer mutação produzida num DNA que codifica um péptido mutado pode ser facilmente determinado através da análise da capacidade do péptido mutado para se ligar à sua contra-estrutura de um modo específico. Para além disso, a actividade de análogos de RANK, muteínas ou derivados podem ser determinadas por qualquer um dos ensaios aqui descritos (por exemplo, inibição da capacidade de RANK para activar a transcrição).

Análogos das proteínas inventivas podem ser construídas, por exemplo, através de a realização de várias substituições de resíduos ou sequências ou eliminação de resíduos ou sequências terminais ou internas não necessárias para a actividade biológica. Por exemplo, podem ser eliminados resíduos de cisteína ou substituídos por outros aminoácidos para prevenir a formação de ligações persulfureto 17 ΕΡ0946725Β1 intramolecular incorrectas após renaturação. Outras abordagens para mutagénese envolvem a modificação de resíduos de aminoácidos dibásicos adjacentes para aumentar a expressão em sistemas de leveduras, nas quais a actividade de protease de KEX2 está presente.

Quando se adopta uma estratégia de deleção ou inserção, o efeito potencial da deleção ou inserção na actividade biológica deve ser considerado. As subunidades das proteínas da invenção podem ser construídas eliminando os resíduos ou sequências terminais ou internas. As formas solúveis de RANK podem ser rapidamente preparadas e testadas para a sua capacidade para inibir a activação de NF-κΒ induzida por RANK. Os polipéptidos que correspondem às regiões citoplásmicas, e seus fragmentos (por exemplo, um domínio letal) podem ser preparados através de técnicas semelhantes. Ajuda adicional sobre que tipos de mutações podem ser produzidas é fornecida por uma comparação da sequência de RANK com as proteínas que possuem estruturas semelhantes, assim como através da realização de análise estrutural das proteínas RANK da invenção.

De um modo geral, as substituições devem ser realizadas de um modo conservador; í.e., os aminoácidos substituintes mais preferidos são aqueles que não afectam a actividade biológica de RANK (í.e., a capacidade das proteínas inventivas para se ligaram a anticorpos contra a proteína nativa correspondente de um modo substancialmente equivalente, A capacidade para se ligar á sua contra-estrutura substancialmente do mesmo modo que a proteína nativa, a capacidade para transduzir uma RANK sinal, ou a capacidade para induzir a activação de NF-κΒ após a sobre-expressão em 18 ΕΡ0946725Β1 sistemas de transfecção transiente, por exemplo). Exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de aminoácidos fora do(s) domínio(s) de ligação (quer ligando/receptor ou áreas de ligação ao anticorpo para o domínio extracelular, ou regiões que interagem com outras proteínas, intracelulares, para o domínio citoplásmico), e substituição de aminoácidos que não alteram a estrutura secundária e/ou terciária da proteína nativa. Exemplos adicionais incluem a substituição de um resíduo alifático por outro, tal como Ile, Vai, Leu, ou Ala por um outro, ou substituições de um resíduo polar por outro, tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. Dão bem conhecidas outras substituições conservadoras, por exemplo, substituições entre regiões internas que possuem características de hidrofobicidade semelhantes.

As mutações nas sequências de nucleótidos construídas para a expressão de proteínas análogas ou seus fragmentos devem, obviamente, preservar a fase de grelha de leitura das sequências codificantes e, preferencialmente não criarão regiões complementares que iriam hibridar para produzir estruturas secundárias de mRNA, tais como ansas ou ganchos que iriam afectar adversamente a tradução do mRNA.

Nem todas as mutações na sequência de nucleótidos que codificam uma proteína RANK ou seus fragmentos serão expressas no produto final, por exemplo, as substituições de nucleótidos podem ser realizadas para aumentar a expressão, principalmente para evitar as ansas da estrutura secundária no mRNA transcrito (ver EPA 75,4444A), ou para proporcionar codões que são traduzidos mais rapidamente pelo hospedeiro 19 ΕΡ0946725Β1 seleccionado, e.g., os codões de preferência de E. coli bem conhecidos para a expressão em E. coli.

Embora se possa predeterminar um sitio de mutação, não é necessário que a natureza da mutação per se seja predeterminada. Por exemplo, de modo a seleccionar as caracteristicas óptimas dos mutantes, pode ser realizada mutagénese aleatória e as proteínas mutadas expressas podem ser rastreadas para a actividade desejada. As mutações podem ser introduzidas em loci particulares através da síntese de oligonucleótidos que contêm uma sequência mutante, flanqueada por sítios de restrição que permitem a ligação aos fragmentos da sequência nativa. Após a ligação, a sequência reconstruída resultante codifica um análogo que possui a inserção, substituição, ou deleção de aminoácidos desejada.

Em alternativa, podem ser empregues processos de mutagénese dirigida por oligonucleótido específica para um sítio para proporcionar um gene alterado que possui codões particulares alterados de acordo com a substituição, deleção, ou inserção necessárias. Métodos exemplares de produção das alterações apresentadas acima são revelados por Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Janeiro de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); e Patentes U.S. N°s. 4 518 584 e 4 737 462 revela técnicas adequadas.

Outras formas de realização das proteínas da invenção incluem polipéptidos RANK codificados por DNAs capazes de hibridar com o DNA de SEQ ID N°:5 em condições de restringência moderadas (solução de pré-lavagem de 5 X SSC, 20 ΕΡ0946725Β1 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) e condições de hibridação de 50°C, 5 X SSC, durante a noite) com as sequências de DNA que codificam RANK, ou de uma forma mais preferível em condições de restringência (por exemplo, hibridação em 6 x SSC a 63°C durante a noite: lavagem em 3 X SSC a 55°C), e outras sequências que são degeneradas em relação àquelas que codificam a RANK. Numa forma de realização, os polipéptidos de RANK são pelo menos cerca de 70% idênticas na sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos da proteína RANK nativa como apresentado na SEQ ID N°: 6. Numa forma de realização preferida, os polipéptidos RANK são pelo menos cerca de 80% idênticos na sequência de aminoácidos com a forma nativa de RANK; de uma forma mais preferida os polipéptidos são aqueles que são pelo menos cerca de 90% idênticos a RANK nativa. A identidade em percentagem pode ser determinada utilizando um programa de computador, por exemplo, o programa de computador GAP descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) e disponível a partir de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Para os fragmentos derivados da proteína RANK, a identidade é calculada com base na porção da proteína RANK que está presente no fragmento. A actividade biológica dos análogos de RANK ou muteínas pode ser determinada testando a capacidade dos análogos ou muteínas para inibirem a activação de transcrição, por exemplo como descrito nos Exemplos aqui apresentados. Alternativamente, ensaios adequados, por exemplo, um imunoensaio enzimático ou uma transferência em gota, empregando um anticorpo que se liga a RANK nativa, ou uma forma solúvel de RANKL, pode ser utilizado para avaliar a 21 ΕΡ0946725Β1 actividade de análogos de RANK ou muteínas, como o podem ensaios que empregam células que expressam RANKL. Os ensaios adequados também incluem, por exemplo, ensaios de transdução de sinal e métodos que avaliam a capacidade da região citoplásmica de RANK para se associar com outras proteínas intracelulares (í.e., TRAFs 2 e 3) envolvidas na transdução de sinal também serão úteis para avaliar a actividade de análogos ou muteínas de RANK. Esses métodos são bem conhecidos na técnica.

Os fragmentos das sequências de nucleótidos de RANK são também úteis. Numa forma de realização, esses fragmentos compreendem pelo menos cerca de 17 nucleótidos consecutivos, de um modo preferido pelo menos cerca de 25 nucleótidos, de um modo mais preferido pelo menos 30 nucleótidos consecutivos, do DNA de RANK aqui revelado. O DNA e o RNA complementar desses fragmentos são aqui fornecidos, juntamente com ambas as formas de cadeia simples e de cadeia dupla do DNA de RANK da SEQ ID N°:5, e aquelas que codificam os polipéptidos acima mencionados. Um fragmento de DNA de RANK compreende geralmente pelo menos cerca de 17 nucleótidos, de um modo preferido desde cerca de 17 até cerca de 30 nucleótidos. Esses fragmentos de ácidos nucleicos (por exemplo, uma sonda correspondente ao domínio extracelular de RANK) são utilizados como uma sonda ou como iniciadores numa reacção em cadeia pela polimerase (PCR).

As sondas também têm utilidade na detecção da presença de ácidos nucleicos de RANK em ensaios in vitro e em processos como transferência de Northern e Southern. Os Tipos Celulares que expressam RANK também podem ser identificados. Esses processos são bem conhecidos, e os técnicos 22 ΕΡ0946725Β1 especialistas podem escolher uma sonda de comprimento adequado, dependendo da aplicação particular pretendida. Para PCR, são empregues iniciadores 5' e 3' que correspondem aos terminais de uma sequência de dna de RANK desejada, para amplificar essa sequência, utilizando técnicas convencionais.

Outros fragmentos úteis dos ácidos nucleicos de RANK são oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido que compreendem uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples (seja RNA ou DNA) capaz de se ligar ao mRNA de RANK alvo (de sentido) ou sequências de DNA de RANK (anti-sentido) . A capacidade para criar um oligonucleótido anti-sentido ou de sentido, com base numa sequência de cDNA para uma dada proteína é descrita em, por exemplo, Stein e Cohen, Câncer Res. 48:2659, 1988 e van der Krol et al., BioTechniques 6:958, 1988.

Utilizações de DNAs, Proteínas e Análogos

Os DNAs, proteínas e análogos de RANK aqui descritos terão numerosas utilizações, incluindo a preparação de composições farmacêuticas. Por exemplo, formas solúveis de RANK serão úteis como antagonistas da activação NF-κΒ mediada por RANK, assim como para inibir a transdução de um sinal via RANK. As composições de RANK (tanto de proteína como DNAs) serão também úteis no desenvolvimento de ambos anticorpos agonísticos e antagonísticos contra RANK. Os DNAs da invenção serão úteis para a expressão de proteínas recombinantes, e as sondas para análise (quer quantitativa ou qualitativa) da presença ou distribuição de transcritos de RANK.

As proteínas da invenção serão também úteis em kits de

preparação que são utilizados para detectar RANK ou RANKL 23 ΕΡ0946725Β1 solúvel, ou monitorizar a actividade relacionada com RANK, por exemplo, em espécimes de doentes. As proteínas RANK também encontrarão utilidades na monitorização da actividade relacionada com rank noutras amostras ou composições, como é necessário quando se realiza o rastreio para antagonistas ou miméticos desta actividade (por exemplo, péptidos ou moléculas pequenas que inibem ou mimetizam, respectivamente, a interacção). Uma variedade de formatos de ensaio são úteis nesses kits, incluindo (mas não limitados a) ELISA, transferência em gota, ensaios de ligação em fase sólida (tais como aqueles que utilizam um biosensor), ensaios de formato rápido e bioensaios. A RANK purificada de acordo com a invenção irá facilitar a descoberta de inibidores de RANK, e desse modo, os inibidores de uma resposta inflamatória (através da inibição da activação de NF-κΒ). A utilização de um polipéptido de RANK purificado no rastreio para potenciais inibidores é importante e pode eliminar virtualmente a possibilidade de interferir reacções com contaminantes. Esse ensaio de rastreio pode utilizar quer o domínio extracelular de RANK, o domínio intracelular, ou um fragmento de qualquer um desses polipéptidos. Detectar a actividade inibidora de uma molécula iria envolver tipicamente a utilização de uma forma solúvel de RANK derivada do domínio extracelular num ensaio de rastreio para detectar moléculas capazes de se ligar a RANK e inibir a ligação de, por exemplo, um anticorpo agonístico ou RANKL, ou utilizando um polipéptido derivado do domínio intracelular num ensaio para detectar a inibição da interacção de RANK e outras, proteínas intracelulares envolvidas na transdução de sinal. 24 ΕΡ0946725Β1

Além disso, podem ser utilizados sistemas in vitro para determinar a capacidade das moléculas para antagonizar ou agonizar a actividade de RANK. Estão incluídos nesses métodos utilizações de quimeras de RANK, por exemplo, uma quimera do domínio intracelular de RANK e um domínio extracelular derivado de uma proteína que possui um ligando conhecido. Os efeitos na transdução de sinal de várias moléculas podem ser então monitorizados utilizando o ligando conhecido para transduzir um sinal.

Adicionalmente, os polipéptidos de RANK também podem ser utilizados para a concepção de inibidores de RANK à base da estrutura. Essa concepção à base da estrutura é também conhecida como "concepção do fármaco racional". Os polipéptidos de RANK podem ser analisados tridimensionalmente através de, por exemplo, cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear ou modelação por homologia, todos os quais são métodos bem conhecidos. A utilização da informação estrutural de RANK em sistemas de programas de computador de modelação molecular para auxiliar na concepção de um inibidor está também englobada pela invenção. Essa modelação assistida por computador e a concepção do fármaco pode utilizar informação, tal como análise de conformação química, potencial electrostático das moléculas, dobragem de proteína, etc. Um método particular da invenção compreende analisar a estrutura tridimensional de RANK para sítios prováveis de ligação dos substratos, sintetizando uma nova molécula que incorpora um sítio reactivo previsto, e ensaiar a nova molécula, como descrito acima. 25 ΕΡ0946725Β1

Expressão de RANK Recombinante

De preferência, as proteínas da presente invenção são produzidas através de métodos de DNA recombinante através da inserção de uma sequência de DNA que codifica a proteína RANK ou um seu análoqo num vector de expressão recombinante e expressando a sequência de DNA num sistema de expressão recombinante em condições que promovem a expressão. As sequências de DNA que codificam as proteínas proporcionadas por esta invenção podem ser montadas a partir de fragmentos de cDNA e ligantes oligonucleotídicos curtos, ou a partir de uma série de oligonucleótidos, para proporcionar um gene sintético que é capaz de ser inserido num vector de expressão recombinante e expresso uma unidade de transcrição recombinante.

Os vectores de expressão recombinante incluem fragmentos de DNA sintéticos ou derivados de cDNA que codificam RANK, ou seus homólogos, muteínas ou análogos bioequivalentes, ligados operacionalmente a elementos de regulação de transcrição ou de tradução adequados derivados de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de insectos. Esses elementos de regulação incluem um promotor de transcrição, uma sequência de operador opcional para controlar a transcrição, uma sequência que codifica para sítios de ligação ribossómica de mRNA adequados, e sequências que controlam a terminação de transcrição e de tradução, como descrito em detalhe abaixo. A capacidade para replicar num hospedeiro, conferida normalmente por uma origem de replicação, e um gene de selecção para facilitar o reconhecimento de transformantes pode ser adicionalmente incorporados. 26 ΕΡ0946725Β1

As regiões de DNA estão ligadas operacionalmente quando estão funcionalmente relacionadas uma com a outra. Por exemplo, o DNA para um péptido sinal (lider de secreção) está ligado operacionalmente ao DNA para um polipéptido se for expresso como um precursor que participa na secreção do polipéptido; um promotor está ligado operacionalmente a uma sequência codificante se controla a transcrição da sequência; ou um sitio de ligação ao ribossoma é ligado operacionalmente a uma sequência codificante se estiver posicionado de modo a permitir a tradução. De um modo geral, ligado operacionalmente significa contíguo e, no caso de líderes de secreção, contíguos e em grelha de leitura. As sequências de DNA que codificam RANK, ou seus homólogos ou análogos que se pretende que sejam expressos num microrganismo não conterão, de um modo preferido, intrões que podem terminar prematuramente a transcrição de DNA em mRNA.

Vectores de expressão para utilização bacteriana podem compreender um marcador de selecção e origem de replicação bacteriana derivados de plasmídeos disponíveis comercialmente que compreendem elementos genéticos do vector de clonagem bem conhecido pBR322 (ATCC 37017) . Esses vectores comerciais incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) e pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA) . Estas secções de "esqueleto" de pBR322 são combinadas com um promotor adequado e a sequência estrutural a ser expressa. E. coli é transformada tipicamente utilizando derivados de pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli (Bolívar et al., Gene 2:95, 1977). O pBR322 contém genes para a resistência à ampicilina e tetraciclina e desse modo proporciona meios simples para identificar células transformadas. 27 ΕΡ0946725Β1

Os promotores normalmente utilizados em vectores de expressão microbiana recombinantes incluem o sistema de promotor da β-lactamase (penicilinase) e da lactose (Chang et al., Nature 275:615, 1978; e Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), o sistema de promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; e EPA 36,776) e o promotor de tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Um sistema de expressão bacteriana particularmente útil emprega o promotor do fago λ PL e o repressor termolábil cl857ts. Os vectores plasmídicos disponíveis na American Type Culture Collection, que incorporam derivados do promotor de λ PL incluem o plasmídeo pHUB2, residente na estirpe de E. coli JMB9 (ATCC 37092) e pPLc28, residente em E. coli RRl (ATCC 53082) .

As sequências de promotor adequado em vectores de levedura incluem os promotores para a metalotioneina, 3-fosfoglicerato quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; e Holland et al., Bíochem. 17:4900, 1978), tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase, e glucoquinase. Vectores e promotores adequados para utilizar em expressão em levedura são ainda descritos em R. Hitzeman et al., EPA 73 657.

Podem ser montados vectores de levedura preferidos utilizando sequências de DNA de pBR322 para selecção e replicação em E. coli (gene Ampr e origem de replicação) e as 28 ΕΡ0946725Β1 sequências de DNA de leveduras incluindo um promotor repressivel pela glucose ADH2 e líder de secreção do factor a. 0 promotor ADH2 foi descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) e Beier et al. (Nature 300:724, 1982). O líder do factor α de levedura, que dirige a secreção de proteínas heterólogas, pode ser inserido entre o promotor e o gene estrutural a ser expresso. Ver, e.g., Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; e Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:5330, 1984. A sequência líder pode ser modificada para conter, próximo da sua extremidade 3', um ou mais sítios de restrição úteis para facilitar a fusão da sequência líder para genes estranhos.

As sequências de controlo de transcrição e tradução nos vectores de expressão a serem utilizados na transformação de células de vertebrados podem ser proporcionados por fontes virais. Por exemplo, os promotores e intensificadores normalmente utilizados são derivados de Polioma, Adenovírus 2, vírus de Símio 40 (SV40), e citomegalovírus humano. Podem ser utilizadas sequências de DNA derivadas do genoma virai de SV40, por exemplo, origem de SV40, promotor tardio e precoce, intensificador, sítios de excisão e de poliadenilação, para proporcionar os outros elementos genéticos necessários para a expressão de uma sequência de DNA heteróloga. Os promotores precoce e tardio são particularmente úteis porque são ambos obtidos facilmente a partir do vírus como um fragmento que também contém a origem de replicação virai de SV40 (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Podem também ser utilizados fragmentos mais pequenos ou maiores de SV40, desde que esteja incluída a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende desde o sítio Hind III até ao sítio Bgl I localizado na origem virai da replicação. Para além disso, o promotor 29 ΕΡ0946725Β1 genómico virai, as sequências de controlo e/ou de sinal podem ser utilizadas, desde que essas sequências de controlo sejam compatíveis com a célula hospedeira escolhida. Podem ser construídos vectores exemplares como revelado por Okayama e Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983).

Um sistema útil para a expressão estável de nível elevado de cDNAs de receptor de mamífero em células mamárias de murino C127 pode ser construído substancialmente como descrito por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Um vector eucariótico preferido para expressão de DNA de RANK é referido como pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991), e inclui sequências de regulação derivadas de SV4 0, vírus da imunodeficiência humana (HIV), e vírus Epstein-Barr (EBV). Outros vectores de vírus preferidos incluem pDC409 e pDC410, que são derivados de pDC406. O pDC410 foi derivado de pDC406 através da substituição da origem de replicação de EBV com as sequências que codificam o antigénio T grande de SV40. O pDC409 difere de pDC406 no facto de um sítio de restrição de Bgl II fora do sítio múltiplo de clonagem site ter sido eliminado, tornando o sítio Bgl II no sítio múltiplo de clonagem único.

Uma linha celular útil que permite a replicação epissómica dos vectores de expressão, tal como pDC406 e pDC409, que contém a origem de replicação EBV, é CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478). A linha celular CV-l/EBNA foi derivada por transfecção da linha celular CV-1 com um gene que codifica o antigénio-1 nuclear do vírus Epstein-Barr (EBNA-1) e expressa constitutivamente EBNA-1 derivada do intensificador/promotor imediato-precoce de CMV humano. 30 ΕΡ0946725Β1 Células Hospedeiras Células hospedeiras transformadas são células que foram transformadas ou transfectadas com vectores de expressão construídos utilizando técnicas de DNA recombinante e que contêm sequências que codificam as proteínas da presente invenção. As células hospedeiras transformadas podem expressar a proteína desejada (RANK, ou seus homólogos ou análogos), mas as células hospedeiras transformadas para efeitos de clonagem ou amplificação do DNA da invenção não precisam de expressar a proteína. As proteínas expressas serão, de um modo preferido, secretadas no sobrenadante da cultura, dependendo do DNA seleccionado, mas pode ser depositado na membrana celular. Células hospedeiras adequadas para expressão de proteínas incluem células procariotas, de levedura ou de eucariotas superiores sob o controlo de promotores apropriados. Procariotas incluem organismos gram negativos ou gram positivos, por exemplo E. coli ou Bacillus spp. Células eucarióticas superiores incluem linhas celulares estabelecidas de origem em mamíferos como descrito abaixo. Também podem ser empregues sistemas de tradução sem células para produzir proteínas utilizando RNAs derivados das construções de DNA aqui reveladas. A clonagem apropriada e os vectores de expressão para utilização com hospedeiros de células bacterianas, fúngicas, de levedura, e de mamíferos são descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985).

Podem ser utilizados hospedeiros de expressão procarióticos para a expressão de RANK, ou seus homólogos ou 31 ΕΡ0946725Β1 análogos que não necessitam de processamento extensivo proteolítico e de persulfureto. Os vectores de expressão procarióticos compreendem geralmente um ou mais marcadores de selecção fenotípica, por exemplo um gene que codifica proteínas que conferem resistência a antibióticos ou fornecendo um requerimento autotrófico, e uma origem de replicação reconhecida pelo hospedeiro para assegurar a amplificação sem o hospedeiro. Hospedeiros procarióticos adequados para a transformação incluem E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, e várias espécies dentro do género Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus, embora também possam ser empregues outros, por escolha. 0 RANK recombinante também pode ser expressa um hospedeiros de leveduras, de um modo preferido, a partir de espécies de Saccharomyces, tais como S. cerevisiae. Também podem ser empregues leveduras de outros géneros, tais como Pichia ou Kluyveromyces. Os vectores de levedura irão conter geralmente uma origem de replicação do plasmídeo de levedura 2μ ou uma sequência de replicação autónoma (ARS), promoína, sequências para poliadenilação e terminação de transcrição e um gene de selecção. De um modo preferido, os vectores de levedura incluirão uma origem de replicação e um marcador de selecção que permite a transformação de ambos a levedura e E. coli, e.g., o gene de resistência à ampicilina de E. coli e o gene trpl de S. cerevisiae, que proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura que não tem a capacidade para crescer em triptofano, e um promotor derivado de um gene de levedura expresso em quantidades elevadas para induzir a transcrição de uma sequência estrutural a jusante. A presença da lesão de trpl no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para detectar a 32 ΕΡ0946725Β1 transformaçao através do crescimento na ausência de triptofano.

Protocolos de transformação de leveduras adequados são conhecidos dos especialistas na técnica; uma técnica exemplar é descrita por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929, 1978, que selecciona transformantes de Trp+ num meio de selecção que consistem em base de azoto de levedura a 0,67%, casaminoácidos a 0,5%, glucose a 2%, adenina a 10 pg/mL e 20 pg/mL de uracilo. As estirpes hospedeiras transformadas por vectores que compreendem o promotor ADH2 podem ser cultivadas para expressão num meio rico que consiste em extracto de levedura a 1%, peptona a 2%, e glucose a 1% suplementada com adenina a 80 pg/mL e uracilo a 80 pg/mL. A desrepressão do promotor ADH2 ocorre após a exaustão da glucose no meio. Os sobrenadantes de levedura brutos são recolhidos por filtração e mantidos a 4 °C antes de purificação posterior.

Podem ser empregues vários sistemas de cultura de células de mamíferos ou de insectos para expressar a proteina recombinante. Sistemas de baculovirus para a produção de proteínas heterólogas em células de insectos são fornecidos por Luckow e Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Exemplos de linhas celulares de hospedeiros de mamíferos adequados incluem as linhas COS-7 de células de rim de macaco, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), e outras linhas celulares capazes de expressar um vector apropriado incluindo, por exemplo, as linhas celulares CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478), células L, C127, 3T3, de ovário de hamster chinês (CHO), HeLa e BHK. Vectores de mamíferos de expressão podem compreender elementos não transcritos, tais como uma origem de replicação, 33 ΕΡ0946725Β1 um promotor adequado e intensificador ligado ao gene a ser expresso, e outras sequências flanqueadoras 5' ou 3' não transcritas, e sequências 5' ou 3' não traduzidas, tais como sitios de ligação ao ribossoma necessários, um sitio de poliadenilação, sitios dadores e aceitadores de excisão, e sequências de terminação de transcrição.

Purificação de RANK Recombinante 0 RANK purificado, e seus homólogos ou análogos são preparados cultivando sistemas de hospedeiro/vector adequados para expressar os produtos de tradução recombinante dos DNAs da presente invenção, que são então purificados a partir do meio de cultura ou dos extractos celulares. Por exemplo, os sobrenadantes dos sistemas que secretam proteína recombinante para o meio de cultura podem ser primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteína, que está disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração da Amicon ou Millipore Pellicon.

Após o passo de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada. Por exemplo, uma matriz de afinidade adequada pode compreender uma proteína contra estrutura ou lectina ou molécula de anticorpo ligada a um suporte adequado. Alternativamente, pode ser utilizada uma resina de permuta aniónica, por exemplo, uma matriz ou substrato que possui grupos de dietilaminoetil pendentes (DEAE). As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos normalmente empregues em purificação de proteína. Alternativamente, pode ser empregue um passo de permuta catiónica. Permutadores catiónicos adequados incluem várias matrizes insolúveis que compreendem 34 ΕΡ0946725Β1 grupos sulfopropilo ou carboximetilo. Os grupos sulfopropilo são preferidos. A cromatografia de filtração em gel também proporciona um meio de purificação das proteínas da invenção. A cromatografia de afinidade é um método particularmente preferido de purificar RANK e os seus homólogos. Por exemplo, uma RANK expressa como uma proteína de fusão que compreende uma região de imunoglobulina Fc pode ser purificada utilizando cromatografia de afinidade em Proteína A ou Proteína G. Para além disso, uma proteína RANK que compreende um domínio de fecho de oligomerização pode ser purificado numa resina que compreende um anticorpo específico para o domínio de fecho de oligomerização. Anticorpos monoclonais contra a proteína RANK também podem ser úteis na purificação através de cromatografia de afinidade, através da utilização de métodos que são bem conhecidos na técnica. Também pode ser utilizado um ligando para preparar uma matriz de afinidade para purificação de afinidade de RANK.

Finalmente, podem ser empregues um ou mais passos de cromatografia líquida de elevado desempenho de fase reversa (RP-HPLC) que empregam meios hidrofóbicos de RP-HPLC, e.g., sílica gel que possui metilo ou outros grupos alifáticos pendentes, podem ser empregues para purificar ainda mais uma composição de RANK. Algus ou todos os passos de purificação anteriores, em várias combinações, também podem ser empregues para proporcionar uma proteína recombinante homogénea. A proteína recombinante produzida em cultura de bactérias é normalmente isolada através da extracção inicial a partir de sedimentos celulares, seguido por um ou mais passos de concentração, precipitação salina, permuta iónica 35 ΕΡ0946725Β1 aquosa ou de cromatografia de exclusão por tamanho. Finalmente, pode ser empregue cromatografia liquida de elevado desempenho (HPLC) para os passos de purificação finais. Células microbianas empregues na expressão da proteina recombinante podem ser interrompidas através de qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelação-descongelação, sonicação, rebentamente mecânico, ou utilização de agentes de lise celular. A fermentação das leveduras que expressam a proteina da invenção como uma proteina secretada simplifica em grande medida a purificação. A proteina recombinante secretada que resulta de uma fermentação em larga escala pode ser purificada através de métodos análogos aos revelados por Urdal et ai. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Esta referência descreve dois passos de HPLC sequencial, de fase reversa, para a purificação de GM-CSF recombinante humana, numa coluna de HPLC preparativa. A proteina sintetizada em cultura recombinante é caracterizada pela presença de componentes celulares, incluindo proteínas, em quantidades e de um carácter que depende dos passos de purificação tomados para recuperar a proteína da invenção a partir da cultura. Estes componentes serão normalmente de origem em leveduras, procariotas ou eucariotas superiores não humanos e, de um modo preferido, estão presentes em quantidades inócuas de contaminante, da ordem inferior a cerca de 1 porcento em peso. Para além disso, a cultura de células recombinante permite a produção das proteínas da invenção isentas de outras proteínas que podem estar normalmente associadas com as proteínas como elas se encontram na natureza nas espécies de origem. 36 ΕΡ0946725Β1

Utilizações e Administração de Composiçoes de RANK A presente invenção proporciona métodos para utilizar composições terapêuticas que compreendem uma quantidade eficaz de uma proteina e um diluente e transportadores adequados, e métodos para regular uma resposta imunitária ou inflamatória. A utilização de RANK em conjunção com receptores solúveis de citoquina ou citoquinas, ou outras moléculas imunorreguladoras está também contemplada.

Para utilização terapêutica, a proteina purificada é administrada a um doente, de um modo preferido um humano, para o tratamento de um modo apropriado para a indicação. Assim, por exemplo, composições da proteina RANK administradas para regular a função imunitária podem ser administradas através de injecção de bólus, infusão continua, libertação sustentada a partir de implantes, ou outra técnica adequada. Tipicamente, um agente terapêutico será administrado na forma de uma composição que compreende RANK purificada, em conjunção com veículos fisiologicamente aceitáveis, excipientes ou diluentes. Esses veículos serão não tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações empregues.

Normalmente, a preparação dessas composições de proteína englobam a combinação da proteína da invenção com tampões, antioxidantes, tais como ácido ascórbico, polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos), proteínas, aminoácidos, carboidratos incluindo glucose, sacarose ou dextrinas, agentes quelantes tais como EDTA, glutationa e outros estabilizadores e excipientes. Soluções Salinas tamponadas neutras ou solução salina misturada com 37 ΕΡ0946725Β1 albumina de soro conspecífica são diluentes apropriados exemplares. De um modo preferido, o produto é formulado como um liofilizado utilizando soluções de excipiente apropriadas (e.g., sacarose) como diluentes. Podem ser determinadas dosagens apropriadas em ensaios. A quantidade e frequência de administração irá depender, obviamente, de factores como a natureza e gravidade da indicação a ser tratada, a resposta desejada, o estado do doente, e assim por diante.

Podem ser administradas formas solúveis de RANK e outros antagonistas de RANK, tais como anticorpos monoclonais antagonísticos para o objectivo de inibir a indução induzida por RANK da actividade de NF-κΒ. NF-kB é um factor de transcrição que é utilizado extensivamente por células do sistema imunitário, e desempenha um papel na resposta inflamatória. Assim, os inibidores de sinalização de RANK serão úteis nas condições de tratamento nas quais a sinalização através de RANK deu origem a consequências negativas, por exemplo, choque tóxico ou séptico, ou reacções de enxerto-versus-hospedeiro. Eles também podem ser úteis na interferência com o papel de NF-κΒ na transformação celular. As células tumorais têm mais capacidade de resposta à radiação quando o seu NF-κΒ está bloqueado; Assim, o RANK solúvel (ou outros antagonistas da sinalização de RANK) será útil como uma terapêutica adjunta para a doença caracterizada por células neoplásicas que expressam RANK.

Os exemplos seguintes são oferecidos a titulo de ilustração, e não por meio de limitação. 38 ΕΡ0946725Β1 EXEMPLO 1 O exemplo descreve a identificação e o isolamento de um ADN que codifica um novo membro da superfamilia do receptor TNF. Uma inserção de DNA parcial com uma grelha de leitura aberta que possui alguma semelhança com CD40 (um antigénio de superfície celular presente na superfície de ambas as células normais e as células B humanas neoplásicas que se demonstrou desempenharem um papel importante na proliferação e diferenciação de células B-; Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403, 1989), foi identificada numa base de dados que contêm a informação de sequência dos cDNAs criados a partir de células dendrítica derivadas da medula óssea humana (DC). A inserção foi excisada a partir do vector por digestão de endonuclease de restrição, purificada em gel, marcada com 32P, e utilizada para hibridar com transferências de colónia criadas a partir de uma biblioteca de cDNA de DC contendo inserções de cDNA maiores utilizando técnicas de hibridação de elevada restringência e lavagem (hibridação em 5xSSC, formamida a 50% a 42°C durante a noite, lavagem a 0,5xSSC a 63°C); outras condições de restringência elevada adequados são reveladas em Sambrook et al. em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 1989), 9.52-9.55. Experiências iniciais produziram um clone referido como 9D-8A (SEQ ID N°:l); a análise subsequente indicou que este clone continha todas menos a extremidade do extremo 5' de um novo cDNA, com a sequência de intrões prevista na extremidade do extremo 5' (nucleótidos 1-92 de SEQ ID N°:l). Foram realizadas hibridações de colónias adicionais, e foi isolado um segundo clone. Um segundo clone, referido como 9D-15C (SEQ ID N°:3), continha a extremidade 5' sem interrupção de intrão, mas não 39 ΕΡ0946725Β1 a extremidade 3' completa. A SEQ ID N°:5 apresenta a sequência de nucleótidos e de aminoácidos de uma proteína de comprimento total prevista, com base no alinhamento das sequências sobreponíveis de SEQ ID N°s:l e 3. A proteína codificada foi designada RANK, para o activador do receptor de NF-κΒ. O cDNA codifica uma proteína transmembranar prevista de Tipo 1 que possui 616 resíduos de aminoácidos, com uma sequência sinal de 24 aminoácidos prevista (o computador previu o sítio de clivagem se encontra após Leu24), um domínio extracelular de 188 aminoácidos, um domínio transmembranar de 21 aminoácidos, e uma cauda citoplásmica de 383 aminoácidos. A região extracelular de RANK apresentou homologia de aminoácidos significativa (38,5% de identidade, 52,3% de semelhança) com CD40. Um vector de clonagem (pBluescriptSK-) contendo a sequência de RANK humana, designado pBluescript:huRANK (em E. coli DH10B), foi depositado com a American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) em 20 de Dezembro de 1996, nos termos do Tratado de Budapeste, e foi-lhe atribuído o número de acesso 98285. EXEMPLO 2

Este exemplo descreve a construção de uma construção de DNA de RANK para expressar uma proteína de fusão RANK/Fc. Uma forma solúvel de RANK fundido com a região Fc de igGi humana foi construída no vector de expressão de mamíferos pDC409 (USSN 08/571 579). Este vector de expressão codifica a sequência líder da grelha de leitura aberta de Citomegalovírus (CMV) R27080 (SEQ ID N°:9), seguido pelos aminoácidos 33-213 de RANK, seguido por uma forma mutada do domínio constante de IgGi humana que apresenta afinidade 40 ΕΡ0946725Β1 reduzida para receptores de Fc (SEQ ID N°:8; para a proteína de fusão, a porção Fc da construção consistiu em Arg3 até Lys232). Um vector de expressão alternativo que compreende os aminoácidos 1-213 de RANK (utilizando a sequência líder nativa) seguido pela muteína IgGi foi também preparado. Verificou-se que ambos os vectores de expressão induzem níveis de expressão elevados da proteína de fusão RANK/Fc em células transfectadas.

Para obter a proteína RANK/Fc, um plasmídeo de expressão de RANK/Fc é transfectado para células CV-l/EBNA, e os sobrenadantes são recolhidos durante cerca de uma semana. A proteína de fusão de RANK/Fc é purificada através de meios bem conhecidos na técnica para a purificação de proteínas de fusão Fc, por exemplo, através de cromatografia em coluna de sepharose de proteína A, de acordo com as recomendações do fabricante (i.e., Pharmacia, Uppsala, Suécia). A análise por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS indicou que a proteína RANK/Fc purificada migrou com um peso molecular de ~55 kDa na presença de um agente de redução, e com um peso molecular de ~110 kDa na ausência de um agente de redução. A sequenciação dos aminoácidos N-terminais da proteína purificada que foi realizada utilizando o líder CMV R27080 apresentou 60% de clivagem após Ala20, 20% de clivagem após Pro22 e 20% de clivagem após Arg28 (que é o sítio de clivagem da Furina; os resíduos de aminoácidos são relativos a SEQ ID N°:9); a análise de aminoácidos N-terminais da proteína de fusão expressa com a líder nativa apresentou uma clivagem predominantemente após Gln25 (80% após Gln25 e 20% após Arg23; 41 ΕΡ0946725Β1 os resíduos de aminoácidos são relativos a SEQ ID N°:6, RANK de tamanho completo). Ambas as proteínas de fusão foram capazes de se ligar a um ligando para RANK de um modo específico (í.e., elas ligam-se à superfície de várias linhas celulares, tais como uma linha celular de timoma de murino, EL4), indicando que a presença de aminoácidos adicionais no terminal N de RANK não interfere com a sua capacidade para se ligar a RANKL. Para além disso, é esperado que a construção que compreende o líder CMV codificava RANK que começa no aminoácido 33; assim, um péptido de RANK que possui um terminal N no aminoácido entre Arg23 e Pro33, inclusive, seja capaz de se ligar a um ligando para RANK de um modo específico.

Outros membros da superfamília do receptor TNF possuem uma região de aminoácidos entre o domínio de transmembrana e o domínio de ligação ao ligando que é referido como uma região de 'espaçador' , que normalmente não é necessária para a ligação ao ligando. Em RANK, os aminoácidos entre 196 e 213 são previstos que formem uma tal região de espaçador. Consequentemente, espera-se que uma forma solúvel de RANK que termina com um aminoácido nesta região retenha a capacidade para se ligar a um ligando para RANK de um modo específico. Aminoácidos C-terminal preferidos para péptidos RANK solúveis são seleccionados a partir do grupo que consiste nos aminoácidos 213 e 196 da SEQ ID N° : 6, embora possam ser utilizados outros aminoácidos na região espaçadora como um terminal C. EXEMPLO 3 42 ΕΡ0946725Β1

Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais contra RANK. As preparações de RANK recombinante purificado, por exemplo, ou células transfectadas que expressam níveis elevados de RANK, são empregues para criar anticorpos monoclonais contra RANK utilizando técnicas convencionais, tais como aquelas reveladas na Patente U.S. 4 411 993. O DNA que codifica RANK pode também ser utilizado como um imunogénio, por exemplo, como revisto por Pardoll e Beckerleg em Immunity 3: 165, 1995. Esses anticorpos são provavelmente úteis na interferência com sinalização induzida por RANK (anticorpos antagonisticos ou de bloqueamento) ou na indução de sinal por ligação reticulada de RANK (anticorpos agonísticos), como componentes de diagnóstico ou ensaios de investigação para RANK ou actividade de RANK, ou em purificação de afinidade de RANK.

Para imunizar roedores, um imunogénio de RANK é emulsificado num adjuvante (como um adjuvante de Freund completo ou incompleto, alúmen, ou outro adjuvante, tal como adjuvante R700 de Ribi (Ribi, Hamilton, MT), e injectado em quantidades que variam desde 10-100 pg subcutaneamente para um roedor seleccionado, por exemplo, murganhos BALB/c ou ratos Lewis. O DNA pode ser administrado intradermicamente (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:9519, 1994) ou intramuscularmente (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:4156, 1993); a solução salina verificou-se ser ainda um diluente adequado para antigénios baseados em DNA. Dez dias até três semanas mais tarde, os animais imunizados são reforçados com imunogénio adicional e reforçados periodicamente dai em diante num calendário de imunização semanal, bissemanal ou a cada três semanas. 43 ΕΡ0946725Β1

As amostras de soro são retiradas periodicamente por retirar sangue por via retro-orbital ou excisão da ponta da cauda para ensaio de teste através de transferência de gota (anticorpo em sanduíche), ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado a enzima), imunoprecipitação, ou outros ensaios adequados, incluindo análise de FACS. Após a detecção de um título de anticorpo apropriado, os animais positivos são administrados através de uma injecção intravenosa de antigénio em solução salina. Três a quatro dias mais tarde, os animais são sacrificados, os esplenócitos são recolhidos, e fundidos com uma linha de células de mieloma de murino (e.g., NS1 ou de um modo preferido Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Linhas celulares de hibridoma criadas por este processo são plaqueadas em placas de microtitulação múltiplas num meio selectivo (por exemplo, uma contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina, ou HAT) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos mieloma-mieloma, e híbridos esplenócito-esplenócito.

Os clones de hibridoma assim criados podem ser rastreados por ELISA para reactividade com RANK, por exemplo, por adaptações das técnicas reveladas por Engvall et ai., Immunochem. 8:871 (1971) e na Patente U.S. 4 703 004. Uma técnica de rastreio preferido é a técnica de captura de anticorpo descrita por Beckman et al., J. Immunol. 144:4212 (1990) . São então injectados clones positivos nas cavidades peritoneais de roedores singeneicos para produzir ascites contendo concentrações elevadas (>1 mg/mL) de anticorpo monoclonal anti-RANK. O anticorpo monoclonal resultante pode ser purificado por precipitação com sulfato de amónia seguido por cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, a cromatografia de afinidade baseada após ligação do anticorpo 44 ΕΡ0946725Β1 a proteína A ou proteína G pode também ser utilizado, como pode a cromatograf ia de afinidade com base na ligação à proteína RANK.

Foram criados anticorpos monoclonais utilizando proteína de fusão RANK/Fc como o imunogénio. Estes reagentes foram rastreados para confirmar a reactividade contra a proteína RANK. Utilizando os métodos aqui descritos para monitorizar a actividade dos mAbs, foram isolados anticorpos tanto bloqueadores (í.e., anticorpos que se ligam a RANK e inibem a ligação de um ligando a RANK) como não bloqueadores (í.e., anticorpos que se ligam a RANK e não inibem a ligação ao ligando). EXEMPLO 4

Este exemplo ilustra a indução da actividade de NF-kB por RANK em células 293/EBNA (a linha celular foi derivada por transfecção da linha celular 293 com um gene que codifica o antigénio-1 nuclear do vírus Epstein-Barr (EBNA-1) que expressa constitutivamente EBNA-1 derivado de intensificador/promotor imediato/precoce CMV humano). A activação da actividade de NF-κΒ foi medida em células 293/EBNA essencialmente como descrito por Yao et al. (Immunity 3:811, 1995). Os extractos nucleares foram preparados e analisados para a actividade de NF-κΒ através de um ensaio de retardamento em gel utilizando um oligonucleótido de 25 pares de bases que se espalha pelos sítios de ligação a NF-κΒ. Foram semeados dois milhões de células em placas de 10 cm dois dias antes para a transfecção de DNA e cultivadas em meio DMEMF12 contendo 2,5% FBS (soro 45 ΕΡ0946725Β1 de bovino fetal) . As transfecções de DNA foram realizadas como aqui descrito para os ensaios de promotor/repórter IL-8.

Os extractos nucleares foram preparados por solubilização de núcleos isolados com 400 mM de NaCl (Yao et al., supra). Oligonucleótidos contendo um sitio de ligação de NF-κΒ foram emparelhados e marcados na extremidade com 32P utilizando quinase de polinucleótido de DNA de T4. As reacções de desvio de mobilidade continham 10 pg de extracto nuclear, 4 pg de poli(dl-dC) e 15 000 cpm de oligonucleótido de cadeia dupla marcado e incubadas à temperatura ambiente durante 20 minutos. Os complexos de proteina-DNA resultantes foram resolvidos num gel de poliacrilaminda nativo a 6% em 0,25 X de tampão Tris-borato-EDTA. A sobre-expressão de RANK resultou na indução de actividade de NF-κΒ como apresentado através de um desvio apropriado na mobilidade da sonda radioactiva no gel. Foram observados resultados semelhantes quando a RANK foi desencadeada por um ligando que se liga a RANK e transduz um sinal para as células que expressam o receptor (i.e., através de co-transfecção de células com DNA de RANK humana e RANKL de murino; ver Exemplo 7 abaixo), e seria de esperar que ocorresse quando o desencadear é realizado com anticorpos agonisticos. EXEMPLO 5

Este exemplo descreve um sistema de promotor/repórter de gene, com base no promotor da Interleuquina-8 humana (IL-8) utilizado para analisar a activação da transcrição do gene in vivo. A indução da transcrição do gene de IL-8 humana pelas citoquinas Interleuquina-1 (IL-1) ou factor α de necrose 46 ΕΡ0946725Β1 tumoral (TNF-α) é conhecida como sendo dependente dos sítios de ligação ao factor de transcrição de NF-κΒ e NF-IL-6 intactos. A fusão do promotor de IL-8 de resposta a citoquina com um cDNA que codifica o receptor de IL-4 de murino (mIL-4R) permite a medição da activação do promotor através da detecção da proteína repórter heteróloga (mIL-4R) da superfície celular das células transfectadas. Células epiteliais de rim humano (293/EBNA) são transfectadas (através do método DEAE/DEXTRANO) com plasmídeos que codificam: 1) . A construção repórter/promotor (referida como plL-8rep), e 2). O(s) cDNA(s) de interesse. As concentrações de DNA são sempre mantidas constantes pela adição de DNA de vector vazio. As células 293/EBNA são plaqueadas a uma densidade de 2,5 x 104 células/mL (3 mL/poço) numa placa de 6 poços e incubadas durante dois dias antes da transfecção. Dois dias após a transfecção, o receptor mIL-4 é detectado por um radioimunoensaio (RIA) descrito abaixo.

Numa dessas experiências, as células 293/EBNA foram co-transfectadas com DNA que codifica RANK e com DNA que codifica RANKL (ver Exemplo 7 abaixo). A co-expressão deste receptor e a sua contraestrutura através de células que resultam em activação do processo de sinalização da RANK. Para esses estudos de co-transfecção, a concentração de DNA/poço para a transfecção de DEAE foi como se segue: 40 ng de piL-8rep [pBluescriptSK- vector (Stratagene)]; 0,4 ng CD40 (CD40 que codifica DNA, um receptor de controlo; vector pCDM8); 0,4 ng de RANK (DNA que codifica RANK; vector pDC409), e 1-50 ng CD40L (DNA que codifica o ligando para CD40, que actua como um controlo positivo quando co-transfectado com CD40 e com um controlo negativo quando co-transfectado com 47 ΕΡ0946725Β1 RANK; em pDC304) ou RANKL (DNA que codifica um ligando para RANK; em pDC406) . Podem ser realizadas experiências semelhantes utilizando RANKL solúvel ou anticorpos agonísticos para RANK para desencadear células transfectadas com RANK.

Para o RIA especifico para mlL-4R, um anticorpo / ioc / monoclonal reactivo com mlL-4R e marcado com I através de um método de conjugação com Cloramina T; a actividade especifica resultante é tipicamente de 1,5 x 1016 cpm/nmol. Após 48 horas, as células transfectadas são lavadas uma vez com meio (DMEM/F12 5% FBS). Os sitios de ligação não específicos são bloqueados através da adição de meio de ligação pré-aquecido contendo 5% de leite magro em pó e incubação a 37°C/5% C02 numa incubadora de cultura de tecidos durante uma hora. 0 meio de bloqueamento é decantado e o tampão de ligação contendo I anti-mIL-4R (clone Ml; IgGl de rato) é adicionado às células e incubado com agitação oscilante à temperatura ambiente durante 1 hora. Após incubação das células com o anticorpo marcado radioactivamente, as células são lavadas extensivamente com tampão de ligação (2X) e duas vezes com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) . Células arc lisadas em 1 mL de NaOH a 0,5 M, e a radioactividade total é medida com um contador gama.

Utilizando este ensaio, 293/EBNA co-transfectadas com DNAs que codificam RANK demonstrou activação de transcrição, como demonstrado através da detecção de muIL-4R na superfície celular. A sobre-expressão de RANK resultou na transcrição de muIL-4R, assim como o desencadear de RANK por RANKL. São 48 ΕΡ0946725Β1 observados resultados semelhantes quando a RANK é desencadeada através de anticorpos agonísticos. EXEMPLO 6

Este exemplo ilustra a associação de RANK com proteínas TRAF. A interacção de RANK com proteínas TRAF citoplásmica foi demonstrada por ensaios de co-imunoprecipitação essencialmente como descrito por Hsu et al. (Cell 84:299; 1996). Resumidamente, as células 293/EBNA foram co-transfectadas com plasmídeos que dirigem a síntese de RANK e TRAF2 ou TRAF3 marcadas no epitopo (FLAG®; SEQ ID N°:7). Dois dias após a transfecção, as proteínas de superfície foram marcadas com éster de biotina, e as células foram lisadas num tampão contendo 0,5% NP-40. RANK e proteínas associadas com este receptor foram imunoprecipitadas com anti-RANK, lavadas extensivamente, resolvidas por separação electroforética num gel de poliacrilamida na presença de SDS a 6-10% e transferidas electroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose para transferência de Western. A associação das proteínas TRAF2 e TRAF3 com RANK foi visualizada rastreando a membrana com um anticorpo que reconhece especificamente o epitopo FLAG®. TRAFs 2 e 3 não imunoprecipitaram com anti-RANK na ausência da expressão de RANK. EXEMPLO 7

Este exemplo descreve o isolamento de um ligando para RANK, referido como RANKL, através de clonagem de expressão directa. O ligando foi clonado essencialmente como descrito em USSN 08/249, 189, submetido a 24 de Maio de 1994, para CD40L. Resumidamente, foi preparada uma biblioteca a partir 49 ΕΡ0946725Β1 de um clone de uma linha celular de timona de murganho EL-4 (ATCC TIB 39), denominada EL-40-5, derivada por selecção por tamanho cinco vezes com proteína de fusão biotinilada CD40/Fc num FACS (separador de células activado por fluorescência). A biblioteca de cDNA foi realizada utilizando metodologia convencional; o DNA plasmidico foi isolado e transfectado em células CVl-EBNA sub-confluentes utilizando um método de DEAE-dextrano. Os transfectantes foram rastreados por autorradiografia em lâmina para a expressão de RANKL utilizando um método de ligação em dois passos com proteína de fusão de RANK/Fc como preparada no Exemplo 2 seguido por anticorpo igG radioiodinado de cabra anti-humano.

Um clone que codifica uma proteína que se liga especificamente a RANK foi isolado e sequenciado; o clone foi referido como 11H. Um vector de expressão contendo a sequência de RANKL de murino, designado pDC406:muRANK-L (em E coli DH10B), foi depositado com a American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) em 20 de Dezembro de 1996, nos termos do Tratado de Budapeste, e foi-lhe atribuído o número de acesso 98284. A sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos prevista deste clone são ilustradas na SEQ ID N°:10. Este clone não contém uma metionina iniciadora; foram obtidos clones adicionais de comprimento total a partir de uma biblioteca 7B9 (preparada substancialmente como descrito na Patente US 5 599 905, emitida em 4 de Fevereiro de 1997); verificou-se que a região 5' era idêntica à de RANKL humana, como apresentado na SEQ ID N°: 12, aminoácidos 1 até 22, excepto para a substituição de um Gly por um Thr no resíduo 9. 50 ΕΡ0946725Β1

Este ligando é útil para avaliar a capacidade de RANK para se ligar a RANKL através de vários ensaios diferentes. Por exemplo, as células transfectadas que expressam RANKL podem ser utilizadas num ensaio de FACS (ou ensaio semelhante) para avaliar a capacidade de RANK solúvel para se ligar a RANKL. Para além disso, podem ser preparadas formas solúveis de RANKL e utilizadas em ensaios que são conhecidos na técnica (i.e., ensaios de ELISA ou BlAcore essencialmente como descrito em USSN 08/249, 189, submetida a 24 de Maio de 1994) . RANKL é também útil na purificação por afinidade de RANK, e como um reagente em métodos para medir os níveis de RANK numa amostra. RANKL solúvel é também útil na indução da activação de NF-κΒ e desse modo na protecção de células que expressam RANK da apoptose. EXEMPLO 8

Este exemplo descreve o isolamento de um ligando de RANK humana (RANKL) utilizando uma técnica à base de PCR. Foram utilizados iniciadores oligonucleotídicos específicos para ligando de RANK de murino em reacções de PCR utilizando cDNAs de primeira cadeia derivada da linha celular humana como moldes. Os iniciadores correspondem aos nucleótidos 478-497 e ao complemento dos nucleótidos 858-878 do ligando de RANK de murino (SEQ ID N°: 10). Uma banda amplificada de aproximadamente 400 pb de comprimento a partir de uma reacção utilizando a linha celular epidermóide humana KB (ATCC CCL-17) foi purificada a partir de gel, e a sua sequência de nucleótidos foi determinada; a sequência era 85% idêntica à região correspondente de ligando de RANK de murino, confirmando que o fragmento era de RANKL humano. 51 ΕΡ0946725Β1

Para obter cDNAs de RANKL humanos de comprimento total, foram marcados radioactivamente dois oligonucleótidos específicos para RANKL humana derivados da sequência de nucleótidos do produto de PCR de kb e foram utilizados como sondas de hibridação para o rastreio de uma biblioteca de cDNA de PBL humano preparada em lambda gtlO (Stratagene, La Jolla, CA), substancialmente como descrito na Patente US 5 599 905, emitida em 4 de Fevereiro de 1997. Foram identificadas e purificadas várias placas de hibridação positivas, as suas inserções subclonadas em pBluescript SK-(Stratagene, La Jolla, CA), e a sua sequência de nucleótidos foram determinadas. Verificou-se que um isolado, PBL3, codifica a maior parte de RANKL humana prevista, mas pareceu não ter aproximadamente 200 pb da região codificante 5' . Verificou-se que um segundo isolado, PBL5 codifica a maior parte da RANKL humana prevista, incluindo a extremidade 5' inteira e uns 200 pb adicionais da sequência 5' não traduzida A extremidade 5' de PBL5 e a extremidade 3' de PBL3 foram ligadas uma à outra para formar um cDNA de comprimento total codificando RANKL humana. A sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos prevista do ligando RANK de comprimento total humano é apresentado na SEQ ID N°:12. O ligando RANK humano partilha 83% de identidade de nucleótidos e 84% de identidade de aminoácidos com ligando RANK de murino Um vector plasmidico que contém a sequência de RANKL humana, designado pBluescript:huRANK-L (em E. coli DH10B), foi depositado na American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) em 11 de Março de 1997 nos termos do Tratado de Budapeste, e foi-lhe atribuído o número de acesso 98354. 52 ΕΡ0946725Β1

As RANKL de murino e humana são proteínas de transmembrana de Tipo 2. A RANKL de murino contém um domínio intracelular de 48 aminoácidos previsto, domínio de transmembrana de 21 aminoácidos e domínio extracelular de 247 aminoácidos. A RANKL humana contém um domínio intracelular de 47 aminoácidos previsto, domínio transmembranar de 21 aminoácidos e domínio extracelular de 249 aminoácidos. EXEMPLO 9

Este exemplo descreve o mapeamento cromossómico da RANK humana utilizando estratégias de mapeamento à base de PCR. As atribuições aos cromossomas humanos iniciais foram realizadas utilizando iniciadores de PCR específicos para RANK e RANKL e um BIOS Somatic Cell Hybrid PCRable DNA kit de BIOS Laboratories (New Haven, CT), seguindo as instruções do fabricante. A RANK foi mapeada no cromossoma humano 18; o ligando de RANK foi mapeado no cromossoma humano 13. o mapeamento mais detalhado foi realizado utilizando um painel de mapeamento híbrido por radiação e Genebridge 4 Radiation Hybrid Panei (Research Genetics, Huntsville, AL; descritos em Walter, MA et al., Nature Genetics 7:22-28, 1994). Os resultados desta análise foram então submetidos electronicamente no MIT Radiation Hybrid Mapper (URL: http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) seguindo as instruções aí contidas. Esta análise produziu nomes de marcador genético específico que, quando submetidos electronicamente no NCBI Entrez browser (URL: http:// www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?db=c&form=0), produziu as localizações de mapa específicas. RANK foi mapeado no cromossoma 18q22.1, e RANKL foi mapeado no cromossoma 13ql4. 53 ΕΡ0946725Β1 EXEMPLO 10

Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais contra RANKL. As preparações de RANKL purificada recombinante, por exemplo, ou as células transfixadas que expressam níveis elevados de RANKL, são empregues para criar anticorpos monoclonais contra RANKL utilizando técnicas convencionais, tais como aquelas reveladas na Patente US 4 411 993. O DNA que codifica RANKL também pode ser utilizado como um imunogénio, por exemplo, como revisto por Pardoll e Beckerleg em Immunity 3:165, 1995. Esses anticorpos são provavelmente úteis na interferência com sinalização de RANKL (anticorpos antagonísticos ou de bloqueamento), como componentes de diagnóstico ou ensaios de investigação para a actividade de RANKL ou RANKL, ou na purificação por afinidade de RANKL.

Para imunizar roedores, o imunogénio de RANKL é emulsificado num adjuvante (tal como adjuvante completo ou incompleto de Freund, alúmen, ou outro adjuvante, tal como adjuvante de Ribi R700 (Ribi, Hamilton, MT), e injectado em quantidades que variam desde 10-100 pg subcutaneamente num roedor seleccionado, por exemplo, murganhos BALB/c ou ratos de Lewis. O DNA pode ser administrado intradermicamente (Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:9519, 1994) ou intramuscularmente (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:4156, 1993); verificou-se que o soro fisiológico é um diluente adequado para antigénios à base de DNA. Dez dias a três semanas mais tarde, os animais imunizados são reforçados com imunogénio adicional e reforçados periodicamente daí em 54 ΕΡ0946725Β1 diante num calendário de imunização semanal, bissemanal ou a cada três semanas.

As amostras de soro são retiradas periodicamente através de hemorragia retro-orbital ou excisão da ponta da cauda para testes através de ensaios de transferência em gota (anticorpo de sanduíche), ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado a enzima), imunoprecipitação, ou outros ensaios adequados, incluindo análise de FACS. Após detecção de um titulo de anticorpo apropriado, é administrada aos animais positivos uma injecção intravenosa de antigénio em soro fisiológico. Três a quatro dias mais tarde, os animais são sacrificados, os esplenócitos são recolhidos, e são fundidos com uma linha celular de mieloma de murino (e.g., NS1 ou, de um modo preferido, Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]). Linhas celulares de hibridoma criadas através deste processo são plaqueadas em placas de microtitulação múltipla num meio selectivo (por exemplo, um que contenha hipoxantina, aminopterina, e timidina, ou HAT) para inibir a proliferação de células não fundidas, hibridos mieloma-mieloma, e hibridos de esplenócito-esplenócito.

Os clones de hibridoma assim criados podem ser rastreados por ELISA para reactividade com RANKL, por exemplo, através de adaptações das técnicas reveladas por Engvall et al., Immunochem. 8:871 (1971) e na Patente US 4 703 004. Uma técnica de rastreio preferida é a técnica de captura por anticorpo descrita por Beckman et al., J. Immunol. 144:4212 (1990). Os clones positivos são então injectados nas cavidades peritoneais de roedores singeneicos para produzir ascites contendo concentrações elevadas (>1 mg/mL) de anticorpo monoclonal anti-RANK. O anticorpo monoclonal 55 ΕΡ0946725Β1 resultante pode ser purificado por precipitação com sulfato de amónio seguido por cromatografia por exclusão em gel. Alternativamente, a cromatografia de afinidade com base na ligação do anticorpo à proteína A ou proteína G também pode ser utilizada, como pode a cromatografia de afinidade com base na ligação da proteína RANKL. Utilizando os métodos aqui descritos para monitorizar a actividade dos mAbs, são utilizados tanto anticorpos de bloqueamento (i.e., anticorpos que se ligam a RANKL e inibem a ligação a RANK) e anticorpos de não bloqueamento (i.e., anticorpos que se ligam a RANKL e não inibem a ligação). EXEMPLO 11

Este exemplo demonstra que a expressão de RANK pode ser regulada positivamente. As células T de sangue periférico humano foram purificadas através de separação por tamanho por citometria de fluxo ou através da selecção negativa utilizando esferas revestidas com anticorpo, e activadas com placas revestidas com anti-CD3 (0KT3, Dako) ou fito-hemaglutinina na presença ou ausência de várias citoquinas, incluindo a Interleuquina-4 (IL-4), Factor-β de Transformação de Crescimento (TGF-β) e outras citoquinas disponíveis comercialmente (ILl-α, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-γ, TNF-a). A expressão de RANK foi avaliada por FACS no decorrer de uma experiência durante o dia 2 até ao dia 8, utilizando um anticorpo monoclonal de murganho mAbl44 (preparado como descrito no Exemplo 3), como apresentado na tabela abaixo. Os resultados são expressos como ' +' até ' ++++' referindo-se ao aumento relativo na intensidade da coloração com anti-RANK. Também foram 56 ΕΡ0946725Β1 realizadas experiências de marcação dupla utilizando tanto anticorpos anti-RANK e anti-CD8 ou anti-CD4.

Tabela 1: Regulação positiva de RANK por Citoquinas

Citoguina (concentração) Resultados: IL-4 (50 ng/mL) + TGF-β (5 ng/mL) + até ++ IL-4 (50 ng/mL) + TGF-β (5 ng/mL) ++++ ILl-a (10 ng/mL) - IL-2 (20 ng/mL) - IL-3 (25 ng/mL) - IL-7 (20 ng/mL) - IL-8 (10 ng/mL) - IL-10 (50 ng/mL) - IL-12 (10 ng/mL) - IL-15 (10 ng/mL) - IFN-γ (100 U/mL) - TNF-a (10 ng/mL) -

Das citoquinas testadas, IL-4 e TGF-β aumentaram o nivel da expressão de RANK em ambas as células CD8+ citotóxicas e CD4 + T auxiliares desde o dia 4 até ao dia 8. A combinação de IL-4 e TGF-β actuaram sinergisticamente para a expressão regulada positivamente deste receptor em células T activadas. Esta combinação particular de citoquinas é secretada por células T supressoras, e crê-se que seja importante na criação de tolerância (revisto em Mitchison e Sieper, Z. Rheumatol. 54:141, 1995), implicando a interacção de RANK na 57 ΕΡ0946725Β1 regulação de uma resposta imunitária em direcção à tolerância ou à indução de uma resposta imunitária activa. EXEMPLO 12

Este exemplo ilustra a influência de RANK.Fc e hRANKL no crescimento de células T activadas. A adição de TGFp a linfócitos T de sangue periférico humano activados por anti-CD3 induz a paragem da proliferação e por último a morte da maioria dos linfócitos nos primeiros dias de cultura. Nós testamos o efeito de interacções RANK:RANKL em células T tratadas com Τ6Εβ- adicionando RANK.Fc ou RANKL humano solúvel às culturas de células T. Células T de sangue humano periférico (7 x 105 PBT) foram cultivadas durante seis dias em placas de 24 poços revestidos com anti-CD3 (OKT3, 5 pg/mL) e anti-Flag (Ml, 5 pg/mL) na presença de TGFp (1 ng/mL) e IL-4 (10 ng/mL) , com ou sem hRANKL solúvel marcado com flag recombinante (1 pg/mL) ou RANK.Fc (10 pg/mL). A recuperação de células T viáveis foi determinada através de contagens de azul trépano em triplicado. A adição de RANK.Fc reduziu significativamente o número de células T viáveis recuperadas após seis dias, enquanto a RANKL solúvel aumentou fortemente a recuperação de células T viáveis (Figura 1). Assim, a RANKL endógena ou exógena aumenta o número de células T viáveis criadas na presença de TGFp. A TGFp, juntamente com IL-4, foi implicada na regulação da resposta imunitária quando secretada pelo subconjunto de células T TH3/reguladoras. Crê-se que estas células T medeiem a supressão espectadora das células T efectoras. 58 ΕΡ0946725Β1

Consequentemente, RANK e o seu ligando podem actuar de um modo auto/paracrino para influenciar a tolerância de células T. Para além disso, a TGFp é conhecida por desempenhar um papel na evasão do sistema imunitário realizada por certos organismos patogénicos ou oportunistas. Adicionalmente a desempenhar um papel no desenvolvimento da tolerância, a RANK pode também desempenhar um papel na evasão do sistema imunitário pelos patogénios. EXEMPLO 13

Este exemplo ilustra a influência da interacção de RANK em células dendriticas CDla+ (DC). Foram criadas células dendriticas (DC) funcionalmente maduras in vitro a partir de progenitores de medula óssea (BM) CD34+. Resumidamente, células BM humanas de voluntários saudáveis normais foram fraccionadas por densidade utilizando meio Ficoll e células CD34+ isoladas por imunoafinidade utilizando uma coluna de matriz anti-CD34 (Ceprate, CellPro). As células BM CD34+ foram então cultivadas em GM-CSF humano (20 ng/mL), IL-4 humano (20 ng/mL), TNF-α humano (20 ng/mL), Flt3L derivado de CHO humano (FL; 100 ng/mL) em meio Super McCoy's suplementado com 10% de soro de vitela fetal num incubador totalmente humidificado a 37 °C (CO2 a 5%) durante 14 dias. CDla+, HLA-DR+ DC foram então separadas por tamanho utilizando um FACStar Plus™, e utilizadas para avaliação biológica de RANK.

Em CDla+ DC humanas derivadas de células da medula óssea CD34+, apenas um subconjunto (20-30%) de CDla+ DC expressaram RANK na superfície celular, como avaliado por análise de citometria de fluxo. Contudo, a adição de CD40L às culturas de DC resultou na expressão de superfície de RANK na maioria 59 ΕΡ0946725Β1 das células de CDla+ DC. Foi demonstrado que CD40L activa DC aumentando a formação do aglomerado in vitro, induzindo alterações morfológicas de DC e regulando positivamente a expressão de HLA-DR, CD54, CD58, CD80 e CD86. A adição de RANKL às culturas de DC aumenta significativamente o grau da agregação de DC e a formação de agregados acima das culturas de controlo, semelhante aos efeitos observados com CD40L (Figura 2) . As CDla+ DC humanas foram cultivadas num cocktail de citoquinas (GM-CSF, IL-4, TNF-α e FL) (painel superior esquerdo), em cocktail mais CD40L (1 pg/mL) (em cima à direita), em cocktail mais RANKL (1 pg/mL) (em baixo à esquerda), ou em cocktail mais inactivado por aquecimento (ΔΗ) RANKL (1 pg/mL) (em baixo à direita) em placas de cultura de 24 poços de fundo plano em 1 mL de meio de cultura durante 48-72 horas e depois fotografados utilizando um microscópio de inversão. Um aumento na agregação de DC e na formação de agregados acima de culturas de controlo não foi evidente quando foi utilizado RANKL inactivado pelo calor, indicando que este efeito estava dependente da proteína biologicamente activa. Todavia, a análise fenotípica inicial da expressão da molécula de adesão indicou que a aglomeração induzida por RANKL não foi devida aos níveis aumentados de CD2, CDlla, CD54 ou CD58. A adição de RANKL para CDla+ DC aumentou a sua capacidade alo-estimuladora numa reacção de linfócitos mista (MLR) em pelo menos 3- até 10-vezes, comparável com DC cultivadas com CD40L (Figura 3). Células T alogeneicas (lxlO5) foram incubadas com números variáveis de DC irradiadas (2000 rad) cultivadas como indicado acima para a Figura 2 em placas de cultura de 96 poços de fundo redondo em 0,2 mL de meio de 60 ΕΡ0946725Β1 cultura durante quatro dias. As culturas foram pulsadas com 0,5 mCi [3H]-timidina durante oito horas e as células foram recolhidas em folhas de fibra de vidro para a contagem num contador β em fase gasosa. As contagens de fundo para células T ou DC cultivadas isoladamente eram < 100 cpm. Os valores representam a média ± DP em culturas em triplicado. RANKL inactivada pelo calor não teve qualquer efeito. A actividade alo-estimuladora de DC não foi mais aumentada quando foram utilizadas RANKL e CD40L em combinação, possivelmente devido à capacidade funcional de DC que atingiu um nivel máximo com qualquer uma das citoquinas isoladamente. Nem RANKL nem CD40L aumentaram o crescimento in vitro de DC ao longo do período de cultura de três dias. Ao contrário de CD40L, a RANKL não aumentou significativamente os níveis de expressão de HLA-DR nem a expressão de CD80 ou CD86. A RANKL pode aumentar a formação de aglomeração de DC e a capacidade funcional sem modular moléculas conhecidas envolvidas na adesão celular (CD 18, CD54), apresentação de antigénio (HLA-DR) ou co-estimulação (CD86), todas elas reguladas por sinalização de CD40/CD40L. A falta de um efeito na expressão dessas moléculas sugere que a RANKL pode regular a função de DC através de uma via(s) alternativa distinta de CD40/CD40L. Dado que CD40L regula a expressão de superfície RANK numa DC criada in vitro e que CD40L é regulado positivamente em células T activadas durante as interacções de células DC-T, RANK e seus ligandos podem formar uma parte importante da cascata de activação que é induzida durante a expansão de células T mediada por DC. Para além disso, a cultura de DC em RANKL resulta em niveis diminuídos da expressão de CDlb/c, e níveis aumentados de CD83. Ambas estas moléculas são moduladas de forma semelhante durante a 61 ΕΡ0946725Β1 maturação de DC por CD40L (Caux et al. J. Exp. Med. 180:1263; 1994), indicando que a RANKL induz a maturação de DC.

As células dendríticas são referidas como células de apresentação de antigénio "profissional", e possuem uma capacidade elevada para sensibilizar células T restringidas por MHC. Existe um interesse crescente na utilização de células dendriticas ex vivo como adjuvantes de vacina para tumor ou vacina de doenças infecciosas (ver, por exemplo, Romani, et al., J. Exp. Med., 180:83, 1994). Por isso, é provável que um agente tal como RANKL que induz a maturação de DC e aumenta a capacidade das células dendríticas para estimular uma resposta imunitária, seja útil na imunoterapia de várias doenças. EXEMPLO 14

Este exemplo descreve o isolamento do homólogo de murino de RANK, referida como muRANK. A MuRANK foi isolada através de uma combinação de PCR de espécies cruzadas e hibridação de colónias. A conservação dos residuos de Cys nas pseudo-repetições ricas em Cys dos domínios extracelulares de proteínas do membro da superfamília de TNFR foi explicada para designar iniciadores de PCR com base de RANK humana a ser utilizada em cDNAs da primeira cadeia de murino de várias fontes. Ambos os iniciadores de sentido a montante e o iniciador anti-sentido a jusante foram concebidos para possuírem as suas extremidades 3' terminaram nos resíduos Cys O iniciador de sentido a montante codificou os nucleótidos 272-295 de SEQ ID N°:5 (região que codifica aminoácidos 79-86); o iniciador a jusante anti-sentido 62 ΕΡ0946725Β1 codificou o complemento dos nucleótidos 409-427 (região codificando os aminoácidos 124-130). As reacções de PCR convencionais foram preparadas e realizadas, utilizando estes iniciadores e cDNAs de primeira cadeia de várias fontes de linha celular de murino ou tecido. Foram corridos trinta ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 30 segundos, e 72 °C durante 20 segundos. Os produtos de PCR foram analisados por electroforese, e as bandas especificas foram observadas em várias amostras. A banda de uma amostra foi purificada em gel e a sequenciação do DNA revelou que a sequência entre os iniciadores foi aproximadamente 85% idêntica à sequência de nucleótidos de RANK humana correspondente.

Uma biblioteca de cDNA baseada em plasmideos preparada a partir da linha epitelial de figado fetal de murino FLE18 (uma das linhas celulares identificada como positiva no rastreio de PCR) foi rastreada para cDNAs de RANK de comprimento total utilizando sondas oligonucleotidicas especificas para RANK de murino derivadas da sequência de RANK de murino determinada a partir da sequenciação do produto de PCR. Dois cDNAs, um codificando a extremidade 5' e um que codifica a extremidade 3' de RANK de murino de comprimento total (baseado na comparação de sequências com a RANK humana de comprimento total) foram recombinados para criar um cDNA de RANK de murino de comprimento total. A sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos de muRANK são apresentadas nas SEQ ID N°s:14 e 15. O cDNA codifica uma proteína de transmembrana de Tipo 1 prevista que possui 625 resíduos de aminoácidos, com uma sequência sinal de 30 aminoácidos prevista, um domínio 63 ΕΡ0946725Β1 extracelular de 184 aminoácidos, um domínio transmembranar de 21 aminoácidos, e uma cauda citoplásmica de 390 aminoácidos. A região extracelular de muRANK apresentou homologia de aminoácidos significativa (69,7% de identidade, 80,8% de semelhança) com huRANK. Os especialistas na técnica irão reconhecer que o sítio de clivagem actual pode ser diferente daquele previsto por computador; consequentemente, o N-terminal de RANK pode ser do aminoácido 25 até ao aminoácido 35.

Outros membros da superfamília do receptor TNF possuem uma região de aminoácidos entre o domínio de transmembrana e o domínio de ligação ao ligando que é referido como uma região de 'espaçador', que não é necessária para a ligação ao ligando. Na muRANK, os aminoácidos entre 197 e 214 são previstos formar uma tal região de espaçador. Consequentemente, é esperado que uma forma solúvel de RANK que termina com um aminoácido nesta região retenha a capacidade para se ligar a um ligando para RANK de um modo específico. Aminoácidos C-terminais preferidos para péptidos RANK solúveis são seleccionados a partir do grupo que consiste nos aminoácidos 214, e 197 de SEQ ID N°: 14, embora outros aminoácidos na região espaçadora possam ser utilizados como o terminal C. EXEMPLO 15

Este exemplo ilustra a preparação de várias formas solúveis diferentes de RANK e RANKL. Foram utilizadas técnicas convencionais de corte e ligação com enzimas de restrição, em combinação com isolamento de fragmentos à base de PCR para os quais não existiam sítios de restrição 64 ΕΡ0946725Β1 convenientes. Quando foi utilizada PCR, os produtos de PCR foram sequenciados para avaliar se quaisquer mutações tinham sido introduzidas; não foram encontradas essas mutações.

Adicionalmente a huRANK/Fc descrita no Exemplo 2, foi preparada outra proteína de fusão RANK/Fc através da liqação de DNA que codifica os aminoácidos 1-213 de SEQ ID N°:6, Para codificar o DNA que codifica os aminoácidos 3-232 da muteína descrita anteriormente (SEQ ID N°:8). Foi preparada uma construção semelhante para RANK de murino, ligando DNA que codifica os aminoácidos 1-213 de RANK de murino de comprimento total (SEQ ID N°:15) para o DNA que codifica os aminoácidos 3-232 da muteína Fc (SEQ ID N°:8).

Foi preparada uma versão solúvel, marcada, poli-His de huRANKL através da ligação do DNA que codifica o péptido líder a partir da cadeia kapa da imunoglobulina (SEQ ID N°:16) ao DNA que codifica uma versão curta da marca FLAG™ (SEQ ID N°:17), seguido por codões que codificam Gly Ser, depois uma marca poli-His (SEQ ID N°:18), seguido por codões que codificam Gly Thr Ser, e DNA que codifica os aminoácidos 138-317 de SEQ ID N°: 13. Foi preparada uma versão solúvel, marcada com poli-His de RANKL de murino, ligando o DNA que codifica o líder CMV (SEQ ID N°:9) aos codões que codificam Arg Thr Ser, seguido pelo DNA que codifica poli-His (SEQ ID N°: 18) seguido pelo DNA que codifica os aminoácidos 119-294 da SEQ ID N°: 11.

Uma forma solúvel, oligomérica de huRANKL foi preparada ligando o DNA que codifica o líder de CMV (SEQ ID N°: 9) a um codão que codifica Asp seguido pelo DNA que codifica um fecho de "leucina" que forma um trímero (SEQ ID N°:19), depois por 65 ΕΡ0946725Β1 codões que codificam Thr Arg Ser seguidos pelos aminoácidos 138-317 da SEQ ID N°: 13.

Estas e outras construções são preparadas por experimentação de rotina. Os vários DNAs são então inseridos num vector de expressão adequado, e expressos.

Particularmente, vectores de expressão preferidos são aqueles que podem ser utilizados em células de mamíferos. Por exemplo, pDC409 e pDC304, aqui descritos, são úteis para a expressão transiente. Para transfecção estável, é preferida a utilização de células CHO; são descritos vários vectores úteis em USSN 08/785,150, agora permitido, por exemplo, um dos vectores de expressão derivados de 2A5-3 λ ai discutidos. EXEMPLO 16

Este exemplo demonstra que a expressão de RANKL pode ser regulada positivamente em células T de murino. As células foram obtidas a partir de nódulos linfáticos mesentéricos de murganhos C57BL/6, e activadas com placas revestidas com anti-CD3, Concanavalina A (ConA) ou acetato de forbol miristato em combinação com ionomicina (anti-CD3: 500A2; Immunex Corporation, Seattle WA; ConA, PMA, ionomicina, Sigma, St. Louis, MO) substancialmente como aqui descrito, e cultivadas desde cerca de 2 até 5 dias. A expressão de RANKL foi avaliada numa análise de três cores por FACS, utilizando anticorpos contra os marcadores de células τ CD4, CD8 e CD45RB, e RANK/Fc, preparadas como aqui descrito. RANKL não foi expresso em células T de murino não estimuladas. Células T estimuladas com anti-CD3, ConA, ou PMA/ionomicina, apresentaram a expressão diferencial de RANKL: 66 ΕΡ0946725Β1 as células CD4+/CD45RBLo e CD4+/CD45RBHl foram positivas para RANKL, mas as células CD8+ não foram. Não foi observada RANKL em células B, semelhante aos resultados observados com células humanas. EXEMPLO 17

Este exemplo ilustra os efeitos de RANKL de murino na proliferação e activação celular. Várias células ou linhas celulares representativas das células que desempenham um papel numa resposta imunitária (baço de murino, timo e nódulo linfático) foram avaliadas cultivando-as nas mesmas condições que promovem a sua viabilidade, na presença ou ausência de RANKL. A RANKL não estimula qualquer uma das células testadas para proliferar. Uma linha celular, uma linha celular de macrófago referida como RAW 264.7 (número de acesso ATCC TIB 71) apresentou alguns sinais de activação. Células RAW produzem constitutivamente pequenas quantidades de TNF-α. A incubação com RANKL humana ou de murino aumentou a produção de TNF-α por estas células de um modo dependente da dose. Os resultados não foram devidos a contaminação de preparações de RANKL com endotoxina, uma vez que ferver a RANKL durante 10 minutos anulou a produção de TNF-α, enquanto um tratamento semelhante de endotoxina purificada (LPS) não afectou a capacidade de LPS para estimular a produção de TNF-α. Apesar do facto de a RANKL ter activado a linha celular de macrófagos RAW T64.7 para a produção de TNF-α, nem a RANKL humana nem a RANKL de murino estimularam a produção de óxido nítrico por estas células. 67 ΕΡ0946725Β1 EXEMPLO 18

Este exemplo ilustra os efeitos de RANKL de murino no crescimento e desenvolvimento do timo em murganhos fetais. Murganhos fêmeas grávidas foram injectados com 1 mg de RANK/Fc ou proteína de controlo veículo (albumina de soro de murino; MSA) nos dias 13, 16 e 19 de gestação. Após o nascimento, os recém-nascidos continuaram a ser injectados com RANK/Fc intraperitonealmente (IP) numa base diária, começando com uma dose de 1 pg, e duplicando a dose a cerca de cada quatro dias, para uma dosagem final de 4 pg. Os recém-nascidos foram retirados aos dias 1, 8 e 15 após o nascimento, os seus timos e baços foram recolhidos e examinados em relação ao tamanho, celularidade e composição fenotípica.

Foi observada uma ligeira redução no tamanho do timo no dia 1 em recém-nascidos nascidos da fêmea injectada com RANK/Fc; não foi observada uma diminuição de tamanho semelhante nos recém-nascidos do controlo. No dia 8, o tamanho tímico e a celularidade foram reduzidos em cerca de 50% nos animais tratados com RANK/Fc em comparação com murganhos tratados com MSA. A análise fenotípica demonstrou que as proporções relativas de diferentes populações de células T no timo foram as mesmas nos murganhos RANK/Fc que nos murganhos do controlo, indicando que a celularidade diminuída foi devida a uma depressão global no número de células T tímicas, em oposição a uma diminuição numa população(ões) específica(s). Os recém-nascidos tratados com RANK/Fc não eram significativamente diferentes dos recém- 68 ΕΡ0946725Β1 nascidos de controlo no dia 15 em relação ao seu tamanho, celularidade ou fenótipo de células timicas. Não foram observadas diferenças significativas no tamanho do baço, celularidade ou composição em qualquer um dos pontos de tempo avaliados. A diferença na celularidade no dia 8 e não no dia 15 pode sugerir que RANK/Fc possa exercer o seu efeito precocemente no desenvolvimento timico. EXEMPLO 19

Este exemplo demonstra que a região do terminal C doe domínio citoplásmico de RANK é importante para a ligação de várias diferentes proteínas TRAF. 0 RANK contém, pelo menos, dois motivos reconhecíveis PXQX(X)T que são provavelmente TRAF sitios de acostamento. Consequentemente, a importância de várias regiões do dominio citoplásmico de RANK para a ligação de TRAF foi avaliada. Uma proteína de fusão RANK/GST foi preparada substancialmente como descrito em Smith e Johnson, Gene 67: 31 (1988), e utilizada na preparação de vários truncados como a seguir descrito. A comparação da sequência de murino e humano RANK indica que existem várias regiões conservadas que podem ser importantes para a ligação a TRAF. Consequentemente, uma técnica com base em PCR foi desenvolvida para facilitar a preparação de várias truncagens C-terminais irá reter a respectiva região conservada, os iniciadores de PCR foram concebidos para introduzir um codão stop e enzima de restrição nos pontos seleccionados, produzindo as truncagens descritas na Tabela 1 a seguir. A sequenciação confirmou que não tinham sido introduzidas mutações indesejadas nas construções. 69 ΕΡ0946725Β1

As proteínas TRAF marcadas radioactivamente (35S-Met, Cys) foram preparadas por tradução in vitro utilizando um kit de lisados de reticulócitos disponível comercialmente de acordo com instruções do fabricante (Promega). As proteínas de fusão GST truncadas foram purificadas substancialmente como descrito em Smith e Johnson {supra) . Resumidamente, a E. coli foi transfectada com num vector de expressão que codifica a proteína de fusão, e induziu a expressão da proteína. A bactéria foi lisada, o material insolúvel removido, e a proteína de fusão isolada por precipitação com esferas revestidas com glutationa (Sepahrose 4B, Pharmacia, Uppsala Suécia).

As esferas foram lavadas, e incubadas com várias proteínas TRAF marcadas radioactivamente. Após incubação e passos de lavagem, os complexos de proteína de fusão/TRAF foram removidos das esferas por fervura em 0,1% SDS + β-mercaptoetanol, e aplicados em géis SDS a 12% (Novex) . Os géis foram sujeitos a autorradiografia, e a presença ou ausência de material marcado radioactivamente foi registado. Os resultados são apresentados na Tabela 2 a seguir.

Tabela 2: Ligação de Várias Proteínas TRAF ao Domínio Citoplásmico de RANK

Truncagens do terminal C E206-S339 E206-Y421 E206-M476 E206-G544 Comprimento total TRAF1 “ “ ++ TRAF2 “ “ ++ TRAF 3 “ “ ++ TRAF4 “ “ - TRAF 5 “ “ + 70 ΕΡ0946725Β1 TRAF 6 + + + ++

Estes resultados indicam que TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF 5 e TRAF6 se ligam à porção mais distai do domínio citoplásmico RANK (entre o aminoácido G544 e A616). 0 TRAF6 também possui um sítio de ligação entre S339 e Y421. Nesta experiência, o TRAF5 também se ligou ao domínio citoplásmico de RANK. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Immunex Corportion (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Activador de Receptor de NF-

kapaB (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 19 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) MORADA: Immunex Corporation, Law Department (B) RUA: 51 University Street (C) cidade: Seattle

(D) ESTADO: WA

(E) PAÍS: USA (F) ZIP: 98101 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: Apple Power Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Apple Operating System 7.5.5 71 ΕΡ0946725Β1 (D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: Microsoft Word for Power Macintosh 6.0.1 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE PARQUIVO: 22 de DEZEMBRO de 1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: USSN 60/064,671 (B) DATA DE ARQUIVO: 14 de OUTUBRO de 1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: USSN 08/813,509 (B) DATA DE ARQUIVO: 07 DE MARÇO de 1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: USSN 08/772,330 (60/064,671) (B) DATA DE ARQUIVO: 23 de DEZEMBRO de 1996 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) ADVOGADO/AGENTE DE INFORMAÇÃO: (A) NAME: Perkins, Patrícia Anne (B) NÚMERO DE REGISTO: 34,693

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ARQUIVO: 2851-WO 72 ΕΡ0946725Β1 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: (206)587-0430 (B) TELEFAX: (206)233-0644 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3115 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (vii) FONTE IMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DA MEDULA ÓSSEA (B) CLONE: 9D-8A (ix) CARACTERÍSTICA: 73 ΕΡ0946725Β1

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 93..1868 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:1:

GCTGCTGCTG CTCTGCGCGC TGCTCGCCCG GCTGCAGTTT TATCCAGAAA GAGCTGTGTG

GACTCTCTGC CTGACCTCAG TGTTCTTTTC AG GTG GCT TTG CAG ATC GCT CCT

Vai Ala Leu Gin Ile Ala Pro 1 5

CCA TGT ACC AGT GAG AAG CAT TAT GAG CAT CTG GGA CGG TGC TGT AAC

Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asn 10 15 20

AAA TGT GAA CCA GGA AAG TAC ATG TCT TCT AAA TGC ACT ACT ACC TCT

Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser 25 30 35

GAC AGT GTA TGT CTG CCC TGT GGC CCG GAT GAA TAC TTG GAT AGC TGG

Asp Ser Vai Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp 40 45 50 55

AAT GAA GAA GAT AAA TGC TTG CTG CAT AAA GTT TGT GAT ACA GGC AAG

Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Vai Cys Asp Thr Gly Lys 60 65 70

GCC CTG GTG GCC GTG GTC GCC GGC AAC AGC ACG ACC CCC CGG CGC TGC

Ala Leu Vai Ala Vai Vai Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys 75 80 85

GCG TGC ACG GCT GGG TAC CAC TGG AGC CAG GAC TGC GAG TGC TGC CGC

Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Ser Gin Asp Cys Glu Cys Cys Arg 90 95 100

CGC AAC ACC GAG TGC GCG CCG GGC CTG GGC GCC CAG CAC CCG TTG CAG

Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gin His Pro Leu Gin 105 110 115

CTC AAC AAG GAC ACA GTG TGC AAA CCT TGC CTT GCA GGC TAC TTC TCT

Leu Asn Lys Asp Thr Vai Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser 120 125 130 135 60 113 161 209 257 305 353 401 449 497 74 ΕΡ0946725Β1 GAT GCC TTT TCC TCC ACG GAC AAA TGC AGA CCC TGG ACC AAC TGT ACC 545 Asp Ala Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr 140 145 150 TTC CTT GGA AAG AGA GTA GAA CAT CAT GGG ACA GAG AAA TCC GAT GCG 593 Phe Leu Gly Lys Arg Vai Glu His His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala 155 160 165 GTT TGC AGT TCT TCT CTG CCA GCT AGA AAA CCA CCA AAT GAA CCC CAT 641 Vai Cys Ser Ser Ser Leu Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His 170 175 180 GTT TAC TTG CCC GGT TTA ATA ATT CTG CTT CTC TTC GCG TCT GTG GCC 689 Vai Tyr Leu Pro Gly Leu Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ala Ser Vai Ala 185 190 195 CTG GTG GCT GCC ATC ATC TTT GGC GTT TGC TAT AGG AAA AAA GGG AAA 737 Leu Vai Ala Ala Ile Ile Phe Gly Vai Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys 200 205 210 215 GCA CTC ACA GCT AAT TTG TGG CAC TGG ATC AAT GAG GCT TGT GGC CGC 785 Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg 220 225 230 CTA AGT GGA GAT AAG GAG TCC TCA GGT GAC AGT TGT GTC AGT ACA CAC 833 Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly Asp Ser Cys Vai Ser Thr His 235 240 245 ACG GCA AAC TTT GGT CAG CAG GGA GCA TGT GAA GGT GTC TTA CTG CTG 881 Thr Ala Asn Phe Gly Gin Gin Gly Ala Cys Glu Gly Vai Leu Leu Leu 250 255 260 ACT CTG GAG GAG AAG ACA TTT CCA GAA GAT ATG TGC TAC CCA GAT CAA 929 Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gin 265 270 275 GGT GGT GTC TGT CAG GGC ACG TGT GTA GGA GGT GGT CCC TAC GCA CAA 977 Gly Gly Vai Cys Gin Gly Thr Cys Vai Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gin 280 285 290 295 GGC GAA GAT GCC AGG ATG CTC TCA TTG GTC AGC AAG ACC GAG ATA GAG 1025 Gly Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser Leu Vai Ser Lys Thr Glu Ile Glu 300 305 310 GAA GAC AGC TTC AGA CAG ATG CCC ACA GAA GAT GAA TAC ATG GAC AGG 1073 Glu Asp Ser Phe Arg Gin Met Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg 315 320 325 CCC TCC CAG CCC ACA GAC CAG TTA CTG TTC CTC ACT GAG CCT GGA AGC 1121 Pro Ser Gin Pro Thr Asp Gin Leu Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser 330 335 340 AAA TCC ACA CCT CCT TTC TCT GAA CCC CTG GAG GTG GGG GAG AAT GAC 1169 Lys Ser Thr Pro Pro Phe Ser Glu Pro Leu Glu Vai Gly Glu Asn Asp 345 350 355 AGT TTA AGC CAG TGC TTC ACG GGG ACA CAG AGC ACA GTG GGT TCA GAA 1217 Ser Leu Ser Gin Cys Phe Thr Gly Thr Gin Ser Thr Vai Gly Ser Glu 360 365 370 375 75 ΕΡ0946725Β1 AGC TGC AAC TGC ACT GAG CCC CTG TGC AGG ACT GAT TGG ACT CCC ATG 1265 Ser Cys Asn Cys Thr Glu Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met 380 385 390 TCC TCT GAA AAC TAC TTG CAA AAA GAG GTG GAC AGT GGC CAT TGC CCG 1313 Ser Ser Glu Asn Tyr Leu Gin Lys Glu Vai Asp Ser Gly His Cys Pro 395 400 405 CAC TGG GCA GCC AGC CCC AGC CCC AAC TGG GCA GAT GTC TGC ACA GGC 1361 His Trp Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn Trp Ala Asp Vai Cys Thr Gly 410 415 420 TGC CGG AAC CCT CCT GGG GAG GAC TGT GAA CCC CTC GTG GGT TCC CCA 1409 Cys Arg Asn Pro Pro Gly Glu Asp Cys Glu Pro Leu Vai Gly Ser Pro 425 430 435 AAA CGT GGA CCC TTG CCC CAG TGC GCC TAT GGC ATG GGC CTT CCC CCT 1457 Lys Arg Gly Pro Leu Pro Gin Cys Ala Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro 440 445 450 455 GAA GAA GAA GCC AGC AGG ACG GAG GCC AGA GAC CAG CCC GAG GAT GGG 1505 Glu Glu Glu Ala Ser Arg Thr Glu Ala Arg Asp Gin Pro Glu Asp Gly 460 465 470 GCT GAT GGG AGG CTC CCA AGC TCA GCG AGG GCA GGT GCC GGG TCT GGA 1553 Ala Asp Gly Arg Leu Pro Ser Ser Ala Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly 475 480 485 AGC TCC CCT GGT GGC CAG TCC CCT GCA TCT GGA AAT GTG ACT GGA AAC 1601 Ser Ser Pro Gly Gly Gin Ser Pro Ala Ser Gly Asn Vai Thr Gly Asn 490 495 500 AGT AAC TCC ACG TTC ATC TCC AGC GGG CAG GTG ATG AAC TTC AAG GGC 1649 Ser Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gin Vai Met Asn Phe Lys Gly 505 510 515 GAC ATC ATC GTG GTC TAC GTC AGC CAG ACC TCG CAG GAG GGC GCG GCG 1697 Asp Ile Ile Vai Vai Tyr Vai Ser Gin Thr Ser Gin Glu Gly Ala Ala 520 525 530 535 GCG GCT GCG GAG CCC ATG GGC CGC CCG GTG CAG GAG GAG ACC CTG GCG 1745 Ala Ala Ala Glu Pro Met Gly Arg Pro Vai Gin Glu Glu Thr Leu Ala 540 545 550 CGC CGA GAC TCC TTC GCG GGG AAC GGC CCG CGC TTC CCG GAC CCG TGC 1793 Arg Arg Asp Ser Phe Ala Gly Asn Gly Pro Arg Phe Pro Asp Pro Cys 555 560 565 GGC GGC CCC GAG GGG CTG CGG GAG CCG GAG AAG GCC TCG AGG CCG GTG 1841 Gly Gly Pro Glu Gly Leu Arg Glu Pro Glu Lys Ala Ser Arg Pro Vai 570 575 580 CAG GAG CAA GGC GGG GCC AAG GCT TGA GCGCCCCCCA TGGCTGGGAG 1388 Gin Glu Gin Gly Gly Ala Lys Ala 585 590 CCCGAAGCTC GGAGCCAGGG CTCGCGAGGG CAGCACCGCA GCCTCTGCCC CAGCCCCGGC 1948 CACCCAGGGA TCGATCGGTA CAGTCGAGGA AGACCACCCG GCATTCTCTG CCCACTTTGC 2008 CTTCCAGGAA ATGGGCTTTT CAGGAAGTGA ATTGATGAGG ACTGTCCCCA TGCCCACGGA 2068 76 ΕΡ0946725Β1 TGCTCAGCAG CCCGCCGCAC TGGGGCAGAT GTCTCCCCTG CCACTCCTCA AACTCGCAGC 2128 AGTAATTTGT GGCACTATGA CAGCTATTTT TATGACTATC CTGTTCTGTG GGGGGGGGGT 2188 CTATGTTTTC CCCCCATATT TGTATTCCTT TTCATAACTT TTCTTGATAT CTTTCCTCCC 2248 TCTTTTTTAA TGTAAAGGTT TTCTCAAAAA TTCTCCTAAA GGTGAGGGTC TCTTTCTTTT 2308 CTCTTTTCCT TTTTTTTTTC TTTTTTTGGC AACCTGGCTC TGGCCCAGGC TAGAGTGCAG 2368 TGGTGCGATT ATAGCCCGGT GCAGCCTCTA ACTCCTGGGC TCAAGCAATC CAAGTGATCC 2428 TCCCACCTCA ACCTTCGGAG TAGCTGGGAT CACAGCTGCA GGCCACGCCC AGCTTCCTCC 2488 CCCCGACTCC CCCCCCCCAG AGACACGGTC CCACCATGTT ACCCAGCCTG GTCTCAAACT 2548 CCCCAGCTAA AGCAGTCCTC CAGCCTCGGC CTCCCAAAGT ACTGGGATTA CAGGCGTGAG 2608 CCCCCACGCT GGCCTGCTTT ACGTATTTTC TTTTGTGCCC CTGCTCACAG TGTTTTAGAG 2668 ATGGCTTTCC CAGTGTGTGT TCATTGTAAA CACTTTTGGG AAAGGGCTAA ACATGTGAGG 2728 CCTGGAGATA GTTGCTAAGT TGCTAGGAAC ATGTGGTGGG ACTTTCATAT TCTGAAAAAT 2788 GTTCTATATT CTCATTTTTC TAAAAGAAAG AAAAAAGGAA ACCCGATTTA TTTCTCCTGA 2848 ATCTTTTTAA GTTTGTGTCG TTCCTTAAGC AGAACTAAGC TCAGTATGTG ACCTTACCCG 2908 CTAGGTGGTT AATTTATCCA TGCTGGCAGA GGCACTCAGG TACTTGGTAA GCAAATTTCT 2968 AAAACTCCAA GTTGCTGCAG CTTGGCATTC TTCTTATTCT AGAGGTCTCT CTGGAAAAGA 3028 TGGAGAAAAT GAACAGGACA TGGGGCTCCT GGAAAGAAAG GGCCCGGGAA GTTCAAGGAA 3088 GAATAAAGTT GAAATTTTAA AAAAAAA 3115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 591 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:2 77 ΕΡ0946725Β1

Vai Ala Leu Gin Ile Ala Pro Pro 1 5 His Leu Gly Arg Cys Cys Asn Lys 20 Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser Asp 35 40 Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp Asn 50 55

Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu 10 15

Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser 25 30

Ser Vai Cys Leu Pro Cys Gly Pro 45

Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His 50 78 ΕΡ0946725Β1

Lys Vai Cys Asp Thr Gly Lys Ala 65 70

Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys Ala 85

Gin Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg 100

Gly Ala Gin His Pro Leu Gin Leu 115 120

Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser Asp 130 135

Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe 145 150

Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala Vai 165

Lys Pro Pro Asn Glu Pro His Vai 180

Leu Leu Phe Ala Ser Vai Ala Leu 195 200

Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys Ala 210 215

Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg Leu 225 230

Asp Ser Cys Vai Ser Thr His Thr 245

Cys Glu Gly Vai Leu Leu Leu Thr 260

Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gin Gly 275 280

Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gin Gly 290 295

Vai Ser Lys Thr Glu Ile Glu Glu 305 310

Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg Pro 325

Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser Lys 340

Leu Glu Vai Gly Glu Asn Asp Ser 355 360

Gin Ser Thr Vai Gly Ser Glu Ser 370 375

Leu Vai Ala Vai Vai Ala Gly Asn 75 80

Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Ser 90 95

Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Leu 105 110

Asn Lys Asp Thr Vai Cys Lys Pro 125

Ala Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys 140

Leu Gly Lys Arg Vai Glu His His 155 160

Cys Ser Ser Ser Leu Pro Ala Arg 170 175

Tyr Leu Pro Gly Leu Ile Ile Leu 185 190

Vai Ala Ala Ile Ile Phe Gly Vai 205

Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp 220

Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly 235 240

Ala Asn Phe Gly Gin Gin Gly Ala 250 255

Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu 265 270

Gly Vai Cys Gin Gly Thr Cys Vai 285

Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser Leu 300

Asp Ser Phe Arg Gin Met Pro Thr 315 320

Ser Gin Pro Thr Asp Gin Leu Leu 330 335

Ser Thr Pro Pro Phe Ser Glu Pro 345 350

Leu Ser Gin Cys Phe Thr Gly Thr 365

Cys Asn Cys Thr Glu Pro Leu Cys 380 79 ΕΡ0946725Β1

Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met Ser Ser Glu Asn Tyr Leu Gin Lys Glu 385 390 395 400 Vai Asp Ser Gly His Cys Pro His Trp Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn 405 410 415 Trp Ala Asp Vai Cys Thr Gly Cys Arg Asn Pro Pro Gly Glu Asp Cys 420 425 430 Glu Pro Leu Vai Gly Ser Pro Lys Arg Gly Pro Leu Pro Gin Cys Ala 435 440 445 Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro Glu Glu Glu Ala Ser Arg Thr Glu Ala 450 455 460 Arg Asp Gin Pro Glu Asp Gly Ala Asp Gly Arg Leu Pro Ser Ser Ala 465 470 475 480 Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ser Ser Pro Gly Gly Gin Ser Pro Ala 485 490 495 Ser Gly Asn Vai Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ser Gly 500 505 510 Gin Vai Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile Vai Vai Tyr Vai Ser Gin 515 520 525 Thr Ser Gin Glu Gly Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro Met Gly Arg Pro 530 535 540 Vai Gin Glu Glu Thr Leu Ala Arg Arg Asp Ser Phe Ala Gly Asn Gly 545 550 555 560 Pro Arg Phe Pro Asp Pro Cys Gly Gly Pro Glu Gly Leu Arg Glu Pro 565 570 575 Glu Lys Ala Ser Arg Pro Vai Gin Glu Gin Gly Gly Ala Lys Ala 580 585 590 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1391 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: única 80 ΕΡ0946725Β1 (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (vii) FONTE IMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DA

MEDULA ÓSSEA

(B) CLONE: 9D-15C (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 39..1391 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:3: 81 ΕΡ0946725Β1 CCGCTGAGGC CGCGGCGCCC GCCAGCCTGT CCCGCGCC ATG GCC CCG CGC GCC 53

Met Ala Pro Arg Ala 1 5 CGG CGG CGC CGC CCG CTG TTC GCG CTG CTG CTG CTC TGC GCG CTG CTC 101 Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Leu 10 15 20 GCC CGG CTG CAG GTG GCT TTG CAG ATC GCT CCT CCA TGT ACC AGT GAG 149 Ala Arg Leu Gin Vai Ala Leu Gin Ile Ala Pro Pro Cys Thr Ser Glu 25 30 35 AAG CAT TAT GAG CAT CTG GGA CGG TGC TGT AAC AAA TGT GAA CCA GGA 197 Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asn Lys Cys Glu Pro Gly 40 45 50 AAG TAC ATG TCT TCT AAA TGC ACT ACT ACC TCT GAC AGT GTA TGT CTG 245 Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser Asp Ser Vai Cys Leu 55 60 65 CCC TGT GGC CCG GAT GAA TAC TTG GAT AGC TGG AAT GAA GAA GAT AAA 293 Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp Asn Glu Glu Asp Lys 70 75 80 85 TGC TTG .CTG CAT AAA GTT TGT GAT ACA GGC AAG GCC CTG GTG GCC GTG 341 Cys Leu Leu His Lys Vai Cys Asp Thr Gly Lys Ala Leu Vai Ala Vai 90 95 100 GTC GCC GGC AAC AGC ACG ACC CCC CGG CGC TGC GCG TGC ACG GCT GGG 389 Vai Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys Ala Cys Thr Ala Gly 105 110 115 TAC CAC TGG AGC CAG GAC TGC GAG TGC TGC CGC CGC AAC ACC GAG TGC 437 Tyr His Trp Ser Gin Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn Thr Glu Cys 120 125 130 GCG CCG GGC CTG GGC GCC CAG CAC CCG TTG CAG CTC AAC AAG GAC ACA 485 Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gin His Pro Leu Gin Leu Asn Lys Asp Thr 135 140 145 GTG TGC AAA CCT TGC CTT GCA GGC TAC TTC TCT GAT GCC TTT TCC TCC 533 Vai Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser Asp Ala Phe Ser Ser 150 155 160 165 ACG GAC AAA TGC AGA CCC TGG ACC AAC TGT ACC TTC CTT GGA AAG AGA 581 Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe Leu Gly Lys Arg 170 175 180 GTA GAA CAT CAT GGG ACA GAG AAA TCC GAT GCG GTT TGC AGT TCT TCT 629 Vai Glu His His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala Vai Cys Ser Ser Ser 185 190 195 82 ΕΡ0946725Β1 CTG CCA GCT AGA AAA CCA CCA AAT GAA CCC CAT GTT TAC TTG CCC GGT 677 Leu Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His Vai Tyr Leu Pro Gly 200 205 210 TTA ATA ATT CTG CTT CTC TTC GCG TCT GTG GCC CTG GTG GCT GCC ATC 725 Leu Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ala Ser Vai Ala Leu Vai Ala Ala Ile 215 220 225 ATC TTT GGC GTT TGC TAT AGG AAA AAA GGG AAA GCA CTC ACA GCT AAT 773 Ile Phe Gly Vai Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys Ala Leu Thr Ala Asn 230 235 240 245 TTG TGG CAC TGG ATC AAT GAG GCT TGT GGC CGC CTA AGT GGA GAT AAG 821 Leu Trp Hls Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg Leu Ser Gly Asp Lys 250 255 260 GAG TCC TCA GGT GAC AGT TGT GTC AGT ACA CAC ACG GCA AAC TTT GGT 869 Glu Ser Ser Gly Asp Ser Cys Vai Ser Thr His Thr Ala Asn Phe Gly 265 270 275 CAG CAG GGA GCA TGT GAA GGT GTC TTA CTG CTG ACT CTG GAG GAG AAG 917 Gin Gin Gly Ala Cys Glu Gly Vai Leu Leu Leu Thr Leu Glu Glu Lys 280 285 290 ACA TTT CCA GAA GAT ATG TGC TAC CCA GAT CAA GGT GGT GTC TGT CAG 965 Thr Phe Pro Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gin Gly Gly Vai Cys Gin 295 300 305 GGC ACG TGT GTA GGA GGT GGT CCC TAC GCA CAA GGC GAA GAT GCC AGG 1013 Gly Thr Cys Vai Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gin Gly Glu Asp Ala Arg 310 315 320 325 ATG CTC TCA TTG GTC AGC AAG ACC GAG ATA GAG GAA GAC AGC TTC AGA 1061 Met Leu Ser Leu Vai Ser Lys Thr Glu Ile Glu Glu Asp Ser Phe Arg 330 335 340 CAG ATG CCC ACA GAA GAT GAA TAC ATG GAC AGG CCC TCC CAG CCC ACA 1109 Gin Met Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg Pro Ser Gin Pro Thr 345 350 355 GAC CAG TTA CTG TTC CTC ACT GAG CCT GGA AGC AAA TCC ACA CCT CCT 1157 Asp Gin Leu Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser Lys Ser Thr Pro Pro 360 365 370 TTC TCT GAA CCC CTG GAG GTG GGG GAG AAT GAC AGT TTA AGC CAG TGC 1205 Phe Ser Glu Pro Leu Glu Vai Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gin Cys 375 380 385 TTC ACG GGG ACA CAG AGC ACA GTG GGT TCA GAA AGC TGC AAC TGC ACT 1253 Phe Thr Gly Thr Gin Ser Thr Vai Gly Ser Glu Ser Cys Asn Cys Thr 390 395 400 405 GAG CCC CTG TGC AGG ACT GAT TGG ACT CCC ATG TCC TCT GAA AAC TAC 1301 Glu Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met Ser Ser Glu Asn Tyr 410 415 420 TTG CAA AAÀ GAG GTG GAC AGT GGC CAT TGC CCG CAC TGG GCA GCC AGC 1349 Leu Gin Lys Glu Vai Asp Ser Gly His Cys Pro His Trp Ala Ala Ser 425 430 435 83 1391 ΕΡ0946725Β1 CCC AGC CCC AAC TGG GCA GAT GTC TGC ACA GGC TGC CGG AAC Pro Ser Pro Asn Trp Ala Asp Vai Cys Thr Gly Cys Arg Asn 440 445 450 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 451 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:4: 84 ΕΡ0946725Β1

Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg 1 5

Leu Cys Ala Leu Leu Ala Arg Leu 20

Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr 35 40

Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met 50 55

Asp Ser Vai Cys Leu Pro Cys Gly 65 70

Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu 85

Ala Leu Vai Ala Vai Vai Ala Gly 100

Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp 115 120

Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly 130 135

Leu Asn Lys Asp Thr Vai Cys Lys 145 150

Asp Ala Phe Ser Ser Thr Asp Lys 165

Phe Leu Gly Lys Arg Vai Glu His 180

Vai Cys Ser Ser Ser Leu Pro Ala 195 200

Vai Tyr Leu Pro Gly Leu Ile Ile 210 215

Leu Vai Ala Ala Ile Ile Phe Gly 225 230

Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu 10 15

Gin Vai Ala Leu Gin Ile Ala Pro 25 30

Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asn 45

Ser Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser 60

Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp 75 80

His Lys Vai Cys Asp Thr Gly Lys 90 95

Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys 105 110

Ser Gin Asp Cys Glu Cys Cys Arg 125

Leu· Gly Ala Gin His Pro Leu Gin 140

Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser 155 160

Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr 170 175

His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala 185 190

Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His 205

Leu Leu Leu Phe Ala Ser Vai Ala 220

Vai Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys 235 240 85 ΕΡ0946725Β1

Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg 245 250 255 Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly Asp Ser Cys Vai Ser Thr His 260 265 270 Thr Ala Asn Phe Gly Gin Gin Gly Ala Cys Glu Gly Vai Leu Leu Leu 275 280 285 Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gin 290 295 300 Gly Gly Vai Cys Gin Gly Thr Cys Vai Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gin 305 310 315 320 Gly Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser Leu Vai Ser Lys Thr Glu Ile Glu 325 330 335 Glu Asp Ser Phe Arg Gin Met Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg 340 345 350 Pro Ser Gin Pro Thr Asp Gin Leu Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser 355 360 365 Lys Ser Thr Pro Pro Phe Ser Glu Pro Leu Glu Vai Gly Glu Asn Asp 370 375 380 Ser Leu Ser Gin Cys Phe Thr Gly Thr Gin Ser Thr Vai Gly Ser Glu 385 390 395 400 Ser Cys Asn Cys Thr Glu Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met 405 410 415 Ser Ser Glu Asn Tyr Leu Gin Lys Glu Vai Asp Ser Gly His Cys Pro 420 425 430 His Trp Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn Trp Ala Asp Vai Cys Thr Gly 435 440 445

Cys Arg Asn 450 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3136 pares de bases 86 ΕΡ0946725Β1 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (vii) FONTE IMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DA MEDULA ÓSSEA(B) (B) CLONE: RANK DE COMPRIMENTO TOTAL (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 39..1886 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:5: 87 ΕΡ0946725Β1 CCGCTGAGGC CGCGGCGCCC GCCAGCCTGT CCCGCGCC ATG GCC CCG CGC GCC 53

Met Ala Pro Arg Ala 1 5 CGG CGG CGC CGC CCG CTG TTC GCG CTG CTG CTG CTC TGC GCG CTG CTC 101 Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Leu 10 15 20 GCC CGG CTG CAG GTG GCT TTG CAG ATC GCT CCT CCA TGT ACC AGT GAG 149 Ala Arg Leu Gin Vai Ala Leu Gin Ile Ala Pro Pro Cys Thr Ser Glu 25 30 35 AAG CAT TAT GAG CAT CTG GGA CGG TGC TGT AAC AAA TGT GAA CCA GGA 197 Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asn Lys Cys Glu Pro Gly 40 45 50 AAG TAC ATG TCT TCT AAA TGC ACT ACT ACC TCT GAC AGT GTA TGT CTG 245 Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser Asp Ser Vai Cys Leu 55 60 65 CCC TGT GGC CCG GAT GAA TAC TTG GAT AGC TGG AAT GAA GAA GAT AAA 293 Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp Asn Glu Glu Asp Lys 70 75 80 85 TGC TTG CTG CAT AAA GTT TGT GAT ACA GGC AAG GCC CTG GTG GCC GTG 341 Cys Leu Leu His Lys Vai Cys Asp Thr Gly Lys Ala Leu Vai Ala Vai 90 95 100 GTC GCC GGC AAC AGC ACG ACC CCC CGG CGC TGC GCG TGC ACG GCT GGG 389 Vai Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys Ala Cys Thr Ala Gly 105 110 115 TAC CAC TGG AGC CAG GAC TGC GAG TGC TGC CGC CGC AAC ACC GAG TGC 437 Tyr His Trp Ser Gin Asp Cys Glu cys Cys Arg Arg Asn Thr Glu Cys 120 125 130 GCG CCG GGC CTG GGC GCC CAG CAC CCG TTG CAG CTC AAC AAG GAC ACA 485 Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gin His Pro Leu Gin Leu Asn Lys Asp Thr 135 140 145 GTG TGC AAA CCT TGC CTT GCA GGC TAC TTC TCT GAT GCC TTT TCC TCC 533 Vai Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser Asp Ala Phe Ser Ser 150 155 160 165 ACG GAC AAA TGC AGA CCC TGG ACC AAC TGT ACC TTC CTT GGA AAG AGA 581 Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe Leu Gly Lys Arg 170 175 180 GTA GAA CAT CAT GGG ACA GAG AAA TCC GAT GCG GTT TGC AGT TCT TCT 629 Vai Glu His His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala Vai Cys Ser Ser Ser 185 190 195 88 ΕΡ0946725Β1 CTG CCA GCT AGA AAA CCA CCA AAT GAA CCC CAT GTT TAC TTG CCC GGT 677 Leu Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His Vai Tyr Leu Pro Gly 200 205 210 TTA ATA ATT CTG CTT CTC TTC GCG TCT GTG GCC CTG GTG GCT GCC ATC 725 Leu Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ala Ser Vai Ala Leu Vai Ala Ala Ile 215 220 225 ATC TTT GGC GTT TGC TAT AGG AAA AAA GGG AAA GCA CTC ACA GCT AAT 773 Ile Phe Gly Vai Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys Ala Leu Thr Ala Asn 230 235 240 245 TTG TGG CAC TGG ATC AAT GAG GCT TGT GGC CGC CTA AGT GGA GAT AAG 821 Leu Trp His Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg Leu Ser Gly Asp Lys 250 255 260 GAG TCC TCA GGT GAC AGT TGT GTC AGT ACA CAC ACG GCA AAC TTT GGT 869 Glu Ser Ser Gly Asp Ser Cys Vai Ser Thr His Thr Ala Asn Phe Gly 265 270 275 CAG CAG GGA GCA TGT GAA GGT GTC TTA CTG CTG ACT CTG GAG GAG AAG 917 Gin Gin Gly Ala Cys Glu Gly Vai Leu Leu Leu Thr Leu Glu Glu Lys 280 285 290 ACA TTT CCA GAA GAT ATG TGC TAC CCA GAT CAA GGT GGT GTC TGT CAG 965 Thr Phe Pro Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gin Gly Gly Vai Cys Gin 295 300 305 GGC ACG TGT GTA GGA GGT GGT CCC TAC GCA CAA GGC GAA GAT GCC AGG 1013 Gly Thr Cys Vai Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gin Gly Glu Asp Ala Arg 310 315 320 325 ATG CTC TCA TTG GTC AGC AAG ACC GAG ATA GAG GAA GAC AGC TTC AGA 1061 Met Leu Ser Leu Vai Ser Lys Thr Glu Ile Glu Glu Asp Ser Phe Arg 330 335 340 CAG ATG CCC ACA GAA GAT GAA TAC ATG GAC AGG CCC TCC CAG CCC ACA 1109 Gin Met Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg Pro Ser Gin Pro Thr 345 350 355 GAC CAG TTA CTG TTC CTC ACT GAG CCT GGA AGC AAA TCC ACA CCT CCT 1157 Asp Gin Leu Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser Lys Ser Thr Pro Pro 360 365 370 TTC TCT GAA CCC CTG GAG GTG GGG GAG AAT GAC AGT TTA AGC CAG TGC 1205 Phe Ser Glu Pro Leu Glu Vai Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gin Cys 375 380 385 TTC ACG GGG ACA CAG AGC ACA GTG GGT TCA GAA AGC TGC AAC TGC ACT 1253 Phe Thr Gly Thr Gin Ser Thr Vai Gly Ser Glu Ser Cys Asn Cys Thr 390 395 400 405 GAG CCC CTG TGC AGG ACT GAT TGG ACT CCC ATG TCC TCT GAA AAC TAC 1301 Glu Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met Ser Ser Glu Asn Tyr 410 415 420 TTG CAA AAA GAG GTG GAC AGT GGC CAT TGC CCG CAC TGG GCA GCC AGC 1349 Leu Gin Lys Glu Vai Asp Ser Gly His Cys Pro His Trp Ala Ala Ser 425 430 435 89 ΕΡ0946725Β1 CCC AGC CCC AAC TGG GCA GAT GTC TGC AC A GGC TGC CGG AAC CCT CCT 1397

Pro Ser Pro Asn Trp Ala Asp Vai Cys Thr Gly Cys Arg Asn Pro Pro 440 445 450 GGG GAG GAC TGT GAA CCC CTC GTG GGT TCC CCA AAA CGT GGA CCC TTG 1445 Gly Glu Asp Cys Glu Pro Leu Vai Gly Ser Pro Lys Arg Gly Pro Leu 455 460 465 CCC CAG TGC GCC TAT GGC ATG GGC CTT CCC CCT GAA GAA GAA GCC AGC 1493 Pro Gin Cys Ala Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro Glu Glu Glu Ala Ser 470 475 480 485 AGG ACG GAG GCC AGA GAC CAG CCC GAG GAT GGG GCT GAT GGG AGG CTC 1541 Arg Thr Glu Ala Arg Asp Gin Pro Glu Asp Gly Ala Asp Gly Arg Leu 490 495 500 CCA AGC TCA GCG AGG GCA GGT GCC GGG TCT GGA AGC TCC CCT GGT GGC 1589 Pro Ser Ser Ala Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ser Ser Pro Gly Gly 505 510 515 CAG TCC CCT GCA TCT GGA AAT GTG ACT GGA AAC AGT AAC TCC ACG TTC 1637 Gin Ser Pro Ala Ser Gly Asn Vai Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr Phe 520 525 530 ATC TCC AGC GGG CAG GTG ATG AAC TTC AAG GGC GAC ATC ATC GTG GTC 1685 Ile Ser Ser Gly Gin Vai Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile Vai Vai 535 540 545 TAC GTC AGC CAG ACC TCG CAG GAG GGC GCG GCG GCG GCT GCG GAG CCC 1733 Tyr Vai Ser Gin Thr Ser Gin Glu Gly Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro 550 555 560 565 ATG GGC CGC CCG GTG CAG GAG GAG ACC CTG GCG CGC CGA GAC TCC TTC 1781 Met Gly Arg Pro Vai Gin Glu Glu Thr Leu Ala Arg Arg Asp Ser Phe 570 575 580 GCG GGG AAC GGC CCG CGC TTC CCG GAC CCG TGC GGC GGC CCC GAG GGG 1829 Ala Gly Asn Gly Pro Arg Phe Pro Asp Pro Cys Gly Gly Pro Glu Gly 585 590 595 CTG CGG GAG CCG GAG AAG GCC TCG AGG CCG GTG CAG GAG CAA GGC GGG 1877 Leu Arg Glu Pro Glu Lys Ala Ser Arg Pro Vai Gin Glu Gin Gly Gly 600 605 610 GCC AAG GCT TGAGCGCCCC CCATGGCTGG GAGCCCGAAG CTCGGAGCCA 1926 Ala Lys Ala 615 GGGCTCGCGA GGGCAGCACC GCAGCCTCTG CCCCAGCCCC GGCCACCCAG GGATCGATCG 1986 GTACAGTCGA GGAAGACCAC CCGGCATTCT CTGCCCACTT TGCCTTCCAG GAAATGGGCT 2046 TTTCAGGAAG TGAATTGATG AGGACTGTCC CCATGCCCAC GGATGCTCAG CAGCCCGCCG 2106 CACTGGGGCA GATGTCTCCC CTGCCACTCC TCAAACTCGC AGCAGTAATT TGTGGCACTA 2166 TGACAGCTAT TTTTATGACT ATCCTGTTCT GTGGGGGGGG GGTCTATGTT TTCCCCCCAT 2226 ATTTGTATTC CTTTTCATAA CTTTTCTTGA TATCTTTCCT CCCTCTTTTT TAATGTAAAG 2286 GTTTTCTCAA AAATTCTCCT AAAGGTGAGG GTCTCTTTCT TTTCTCTTTT CCTTTTTTTT 2346 90 ΕΡ0946725Β1 TTCTTTTTTT GGCAACCTGG CTCTGGCCCA GGCTAGAGTG CAGTGGTGCG ATTATAGCCC 2406 GGTGCAGCCT CTAACTCCTG GGCTCAAGCA ATCCAAGTGA TCCTCCCACC TCAACCTTCG 2466 GAGTAGCTGG GATCACAGCT GCAGGCCACG CCCAGCTTCC TCCCCCCGAC TCCCCCCCCC 2526 CAGAGACACG GTCCCACCAT GTTACCCAGC CTGGTCTCAA ACTCCCCAGC TAAAGCAGTC 2586 CTCCAGCCTC GGCCTCCCAA AGTACTGGGA TTACAGGCGT GAGCCCCCAC GCTGGCCTGC 2646 TTTACGTATT TTCTTTTGTG CCCCTGCTCA CAGTGTTTTA GAGATGGCTT TCCCAGTGTG 2706 TGTTCATTGT AAACACTTTT GGGAAAGGGC TAAACATGTG AGGCCTGGAG ATAGTTGCTA 2766 AGTTGCTAGG AACATGTGGT GGGACTTTCA TATTCTGAAA AATGTTCTAT ATTCTCATTT 2826 TTCTAAAAGA AAGAAAAAAG GAAACCCGAT TTATTTCTCC TGAATCTTTT TAAGTTTGTG 2886 TCGTTCCTTA AGCAGAACTA AGCTCAGTAT GTGACCTTAC CCGCTAGGTG GTTAATTTAT 2946 CCATGCTGGC AGAGGCACTC AGGTACTTGG TAAGCAAATT TCTAAAACTC CAAGTTGCTG 3006 CAGCTTGGCA TTCTTCTTAT TCTAGAGGTC TCTCTGGAAA AGATGGAGAA AATGAACAGG 3066 ACATGGGGCT CCTGGAAAGA AAGGGCCCGG GAAGTTCAAG GAAGAATAAA GTTGAAATTT 3126 ΤΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 3136 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 616 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:6: 91 ΕΡ0946725Β1

Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Cys Ala Leu Leu Ala Arg Leu Gin Vai Ala Leu Gin Ile Ala Pro 20 25 30 Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Aán 35 40 45 Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser 50 55 60 Asp Ser Vai Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp 65 70 75 80 Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Vai Cys Asp Thr Gly Lys 85 90 95 Ala Leu Vai Ala Vai Vai Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys 100 105 110 92 ΕΡ0946725Β1

Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp 115 120 Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly 130 135 Leu Asn Lys Asp Thr Vai Cys Lys 145 150 Asp Ala Phe Ser Ser Thr Asp Lys 165 Phe Leu Gly Lys Arg Vai Glu His 180 Vai Cys Ser Ser Ser Leu Pro Ala 195 200 Vai Tyr Leu Pro Gly Leu Ile Ile 210 215 Leu Vai Ala Ala Ile lie Phe Gly 225 230 Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His 245 Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser 260 Thr Ala Asn Phe Gly Gin Gin Gly 275 280 Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro 290 295 Gly Gly Vai Cys Gin Gly Thr Cys 305 310 Gly Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser 325 Glu Asp Ser Phe Arg Gin Met Pro 340 Pro Ser Gin Pro Thr Asp Gin Leu 355 360 Lys Ser Thr Pro Pro Phe Ser Glu 370 375 Ser Leu Ser Gin Cys Phe Thr Gly 385 390 Ser Cys Asn Cys Thr Glu Pro Leu 405 Ser Ser Glu Asn Tyr Leu Gin Lys 420

Ser Gin Asp Cys Glu Cys Cys Arg 125

Leu Gly Ala Gin His Pro Leu Gin 140

Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser 155 160

Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr 170 175

His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala 185 190

Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His 205

Leu Leu Leu Phe Ala Ser Vai Ala 220

Vai Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys 235 240

Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg 250 255

Gly Asp Ser Cys Vai Ser Thr His 265 270

Ala Cys Glu Gly Vai Leu Leu Leu 285

Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gin 300

Vai Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gin 315 320

Leu Vai Ser Lys Thr Glu Ile Glu 330 335

Thr Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg 345 350

Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser 365

Pro Leu Glu Vai Gly Glu Asn Asp 380

Thr Gin Ser Thr Vai Gly Ser Glu 395 400

Cys Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met 410 415

Glu Vai Asp Ser Gly His Cys Pro 425 430 93 ΕΡ0946725Β1

His Trp Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn Trp Ala Asp Vai Cys Thr Gly 435 440 445 Cys Arg Asn Pro Pro Gly Glu Asp Cys Glu Pro Leu Vai Gly Ser Pro 450 455 460 Lys Arg Gly Pro Leu Pro Gin Cys Ala Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro 465 470 475 480 Glu Glu Glu Ala Ser Arg Thr Glu Ala Arg Asp Gin Pro Glu Asp Gly 485 490 495 Ala Asp Gly Arg Leu Pro Ser Ser Ala Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly 500 505 510 Ser Ser Pro Gly Gly Gin Ser Pro Ala Ser Gly Asn Vai Thr Gly Asn 515 520 525 Ser Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gin Vai Met Asn Phe Lys Gly 530 535 540 Asp Ile Ile Vai Vai Tyr Vai Ser Gin Thr Ser Gin Glu Gly Ala Ala 545 550 555 560 Ala Ala Ala Glu Pro Met Gly Arg Pro Vai Gin Glu Glu Thr Leu Ala 565 570 575 Arg Arg Asp Ser Phe Ala Gly Asn Gly Pro Arg Phe Pro Asp Pro Cys 580 585 590 Gly Gly Pro Glu Gly Leu Arg Glu Pro Glu Lys Ala Ser Arg Pro Vai 595 600 605 Gin Glu Gin Gly Gly Ala Lys Ala 610 615 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: não relevante (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 94 ΕΡ0946725Β1 (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: FLAG® péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 232 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: não relevante (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Humano (vii) FONTE IMEDIATA: (C) CLONE: muteína de Fc de igGl

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N ΕΡ0946725Β1

Glu Pro Arg Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 15 10 15

Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai 35 40 45

Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai 50 55 60

Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala 100 105 110

Leu Pro Ala Pro Met Gin Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 115 120 125

Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140

Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160

His Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190

Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe 195 200 205

Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos 96 ΕΡ0946725Β1 (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: não relevante (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: CMV (R2780 Líder) (ix) CARACTERÍSTICA: (D) OUTRA INFORMAÇÃO: Metl-Arg28 é o actual péptido líder; Arg29 fortalece o sítio de clivagem de furina; nucleótidos que codificam Thr30 e Ser31 adicionam um sitio Spel. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:9:

Met Ala Arg Arg Leu Trp Ile Leu Ser Leu Leu Ala Vai Thr Leu Thr 15 10 15

Vai Ala Leu Ala Ala Pro Ser Gin Lys Ser Lys Arg Arg Thr Ser 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1630 pares de bases 97 ΕΡ0946725Β1 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Mus musculus (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA:

(B) CLONE: RANKL (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 3..884 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:10: CC GGC GTC CCA CAC GAG GGT CCG CTG CAC CCC GCG CCT TCT GCA CCG 47

Gly Vai Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro Ala Pro Ser Ala Pro 15 10 15 98 ΕΡ0946725Β1 GCT CCG GCG CCG CCA CCC GCC GCC TCC CGC TCC ATG TTC CTG GCC CTC 95 Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met Phe Leu Ala Leu 20 25 30 CTG GGG CTG GGA CTG GGC CAG GTG GTC TGC AGC ATC GCT CTG TTC CTG 143 Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gin Vai Vai Cys Ser Ile Ala Leu Phe Leu 35 40 45 TAC TTT CGA GCG CAG ATG GAT CCT AAC AGA ATA TCA GAA GAC AGC ACT 191 Tyr Phe Arg Ala Gin Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser Glu Asp Ser Thr 50 55 60 CAC TGC TTT TAT AGA ATC CTG AGA CTC CAT GAA AAC GCA GAT TTG CAG 239 His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Asp Leu Gin 65 70 75 GAC TCG ACT CTG GAG AGT GAA GAC ACA CTA CCT GAC TCC TGC AGG AGG 287 Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro Asp Ser Cys Arg Arg 80 85 90 95 ATG AAA CAA GCC TTT CAG GGG GCC GTG CAG AAG GAA CTG CAA CAC ATT 335 Met Lys Gin Ala Phe Gin Gly Ala Vai Gin Lys Glu Leu Gin His Ile 100 105 110 GTG GGG CCA CAG CGC TTC TCA GGA GCT CCA GCT ATG ATG GAA GGC TCA 383 Vai Gly Pro Gin Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala Met Met Glu Gly Ser 115 120 125 TGG TTG GAT GTG GCC CAG CGA GGC AAG CCT GAG GCC CAG CCA TTT GCA 431 Trp Leu Asp Vai Ala Gin Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gin Pro Phe Ala 130 135 140 CAC CTC ACC ATC AAT GCT GCC AGC ATC CCA TCG GGT TCC CAT AAA GTC 479 His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Vai 145 150 155 ACT CTG TCC TCT TGG TAC CAC GAT CGA GGC TGG GCC AAG ATC TCT AAC 527 Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn 160 165 170 175 ATG ACG TTA AGC AAC GGA AAA CTA AGG GTT AAC CAA GAT GGC TTC TAT 575 Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Vai Asn Gin Asp Gly Phe Tyr 180 185 190 TAC CTG TAC GCC AAC ATT TGC TTT CGG CAT CAT GAA ACA TCG GGA AGC 623 Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser Gly Ser 195 200 205 GTA CCT ACA GAC TAT CTT CAG CTG ATG GTG TAT GTC GTT AAA ACC AGC 671 Vai Pro Thr Asp Tyr Leu Gin Leu Met Vai Tyr Vai Vai Lys Thr Ser 210 215 220 ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT AAC CTG ATG AAA GGA GGG AGC ACG AAA 719 Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys 225 230 235 AAC TGG TCG GGC AAT TCT GAA TTC CAC TTT TAT TCC ATA AAT GTT GGG 767 Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Vai Gly 240 245 250 255 99 ΕΡ0946725Β1 GGA TTT TTC AAG CTC CGA GCT GGT GAA GAA ATT AGC ATT CAG GTG TCC 815 Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser Ile Gin Vai Ser 260 265 270 AAC CCT TCC CTG CTG GAT CCG GAT CAA GAT GCG ACG TAC TTT GGG GCT 863 Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala 275 280 285 TTC AAA GTT CAG GAC ATA GAC TGAGACTCAT TTCGTGGAAC ATTAGCATGG 914 Phe Lys Vai Gin Asp Ile Asp 290 ATGTCCTAGA TGTTTGGAAA CTTCTTAAAA AATGGATGAT GTCTATACAT GTGTAAGACT 974 ACTAAGAGAC ATGGCCCACG GTGTATGAAA CTCACAGCCC TCTCTCTTGA GCCTGTACAG 1034 GTTGTGTATA TGTAAAGTCC ATAGGTGATG TTAGATTCAT GGTGATTACA CAACGGTTTT 1094 ACAATTTTGT AATGATTTCC TAGAATTGAA CCAGATTGGG AGAGGTATTC CGATGCTTAT 1154 GAAAAACTTA CACGTGAGCT ATGGAAGGGG GTCACAGTCT CTGGGTCTAA CCCCTGGACA 1214 TGTGCCACTG AGAACCTTGA AATTAAGAGG ATGCCATGTC ATTGCAAAGA AATGATAGTG 1274 TGAAGGGTTA AGTTCTTTTG AATTGTTACA TTGCGCTGGG ACCTGCAAAT AAGTTCTTTT 1334 TTTCTAATGA GGAGAGAAAA ATATATGTAT TTTTATATAA TGTCTAAAGT TATATTTCAG 1394 GTGTAATGTT TTCTGTGCAA AGTTTTGTAA ATTATATTTG TGCTATAGTA TTTGATTCAA 1454 AATATTTAAA AATGTCTCAC TGTTGACATA TTTAATGTTT TAAATGTACA GATGTATTTA 1514 ACTGGTGCAC TTTGTAATTC CCCTGAAGGT ACTCGTAGCT AAGGGGGCAG AATACTGTTT 1574 CTGGTGACCA CATGTAGTTT ATTTCTTTAT TCTTTTTAAC TTAATAGAGT CTTCAG 1630 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:ll: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 294 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 100 ΕΡ0946725Β1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:ll:

Gly Vai Pro Hls Glu Gly Pro Leu His Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu 20 25 30 Gly Leu Gly Leu Gly Gin Vai Vai Cys Ser Ile Ala Leu Phe Leu Tyr 35 40 45 Phe Arg Ala Gin Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser Glu Asp Ser Thr His 50 55 60 101 ΕΡ0946725Β1

Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Asp Leu Gin Asp 65 70 75 80

Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met 85 90 95

Lys Gin Ala Phe Gin Gly Ala Vai Gin Lys Glu Leu Gin His Ile Vai 100 105 110

Gly Pro Gin Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala Met Met Glu Gly Ser Trp 115 120 125

Leu Asp Vai Ala Gin Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gin Pro Phe Ala His 130 135 140

Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Vai Thr 145 150 155 160

Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met 165 170 175

Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Vai Asn Gin Asp Gly Phe Tyr Tyr 180 185 190

Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser Gly Ser Vai 195 200 205

Pro Thr Asp Tyr Leu Gin Leu Met Vai Tyr Vai Vai Lys Thr Ser Ile 210 215 220

Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn 225 230 235 240

Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Vai Gly Gly 245 250 255

Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser Ile Gin Vai Ser Asn 260 265 270

Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe 275 280 285

Lys Vai Gin Asp Ile Asp 290 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: 102 ΕΡ0946725Β1 (A) COMPRIMENTO: 954 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: (B) CLONE: huRANKL (comprimento total) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..951 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:12: 103 ΕΡ0946725Β1 ATG CGC CGC GCC AGC AGA GAC TAC ACC AAG TAC CTG CGT GGC TCG GAG 48 Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu 1 5 10 15 GAG ATG GGC GGC GGC CCC GGA GCC CCG CAC GAG GGC CCC CTG CAC GCC 96 Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala 20 25 30 CCG CCG CCG CCT GCG CCG CAC CAG CCC CCC GCC GCC TCC CGC TCC ATG 144 Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gin Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met 35 40 45 TTC GTG GCC CTC CTG GGG CTG GGG CTG GGC CAG GTT GTC TGC AGC GTC 192 Phe Vai Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gin Vai Vai Cys Ser Vai 50 55 60 GCC CTG TTC TTC TAT TTC AGA GCG CAG ATG GAT CCT AAT AGA ATA TCA 240 Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gin Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser 65 70 75 80 GAA GAT GGC ACT CAC TGC ATT TAT AGA ATT TTG AGA CTC CAT GAA AAT 288 Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn 85 90 95 GCA GAT TTT CAA GAC ACA ACT CTG GAG AGT CAA GAT ACA AAA TTA ATA 336 Ala Asp Phe Gin Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gin Asp Thr Lys Leu Ile 100 105 110 CCT GAT TCA TGT AGG AGA ATT AAA CAG GCC TTT CAA GGA GCT GTG CAA 384 Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gin Ala Phe Gin Gly Ala Vai Gin 115 120 125 AAG GAA TTA CAA CAT ATC GTT GGA TCA CAG CAC ATC AGA GCA GAG AAA 432 Lys Glu Leu Gin His Ile Vai Gly Ser Gin His Ile Arg Ala Glu Lys 130 135 140 GCG ATG GTG GAT GGC TCA TGG TTA GAT CTG GCC AAG AGG AGC AAG CTT 480 Ala Met Vai Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu 145 150 155 160 GAA GCT CAG CCT TTT GCT CAT CTC ACT ATT AAT GCC ACC GAC ATC CCA 528 Glu Ala Gin Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro 165 170 175 TCT GGT TCC CAT AAA GTG AGT CTG TCC TCT TGG TAC CAT GAT CGG GGT 576 Ser Gly Ser His Lys Vai Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly 180 185 190 104 ΕΡ0946725Β1 TGG GCC AAG ATC TCC AAC ATG ACT TTT AGC AAT GGA AAA CTA ATA GTT 624 Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Vai 195 200 205 AAT CAG GAT GGC TTT TAT TAC CTG TAT GCC AAC ATT TGC TTT CGA CAT 672 Asn Gin Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His 210 215 220 CAT GAA ACT TCA GGA GAC CTA GCT ACA GAG TAT CTT CAA CTA ATG GTG 720 His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gin Leu Met Vai 225 230 235 240 TAC GTC ACT AAA ACC AGC ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT ACC CTG ATG 768 Tyr Vai Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met 245 250 255 AAA GGA GGA AGC ACC AAG TAT TGG TCA GGG AAT TCT GAA TTC CAT TTT 816 Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe 260 265 270 TAT TCC ATA AAC GTT GGT GGA TTT TTT AAG TTA CGG TCT GGA GAG GAA 864 Tyr Ser Ile Asn Vai Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu 275 280 285 ATC AGC ATC GAG GTC TCC AAC CCC TCC TTA CTG GAT CCG GAT CAG GAT 912 Ile Ser Ile Glu Vai Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin Asp 290 295 300 GCA ACA TAC TTT GGG GCT TTT AAA GTT CGA GAT ATA GAT TGA 954 Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Vai Arg Asp Ile Asp 305 310 315 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 317 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:13: 105 ΕΡ0946725Β1

Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu 1 5 10 15 Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala 20 25 30 Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gin Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met 35 40 45 Phe Vai Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gin Vai Vai Cys Ser Vai 50 55 60 Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gin Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser 65 70 75 80 Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn 85 90 95 106 ΕΡ0946725Β1

Ala Asp Phe Gin Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gin Asp Thr Lys Leu Ile 100 105 110 Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gin Ala Phe Gin Gly Ala Vai Gin 115 120 125 Lys Glu Leu Gin His Ile Vai Gly Ser Gin His Ile Arg Ala Glu Lys 130 135 140 Ala Met Vai Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu 145 150 155 160 Glu Ala Gin Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro 165 170 175 Ser Gly Ser His Lys Vai Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly 180 185 190 Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Vai 195 200 205 Asn Gin Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His 210 215 220 His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gin Leu Met Vai 225 230 235 240 Tyr Vai Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met 245 250 255 Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe 260 265 270 Tyr Ser Ile Asn Vai Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu 275 280 285 Ile Ser Ile Glu Vai Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin Asp 290 295 300 Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Vai Arg Asp Ile Asp 305 310 315 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1878 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 107 ΕΡ0946725Β1 (C) TIPO DE CADEIA: única (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Murino (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Epitélio de Figado Fetal de Murino

(B) CLONE: muRANK (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1875 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:14: 108 ΕΡ0946725Β1 ATG GCC CCG CGC GCC CGG CGG CGC CGC CAG CTG CCC GCG CCG CTG CTG 48 Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Gin Leu Pro Ala Pro Leu Leu 1 5 10 15 GCG CTC TGC GTG CTG CTC GTT CCA CTG CAG GTG ACT CTC CAG GTC ACT 96 Ala Leu Cys Vai Leu Leu Vai Pro Leu Gin Vai Thr Leu Gin Vai Thr 20 25 30 CCT CCA TGC ACC CAG GAG AGG CAT TAT GAG CAT CTC GGA CGG TGT TGC 144 Pro Pro Cys Thr Gin Glu Arg His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys 35 40 45 AGC AGA TGC GAA CCA GGA AAG TAC CTG TCC TCT AAG TGC ACT CCT ACC 192 Ser Arg Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Leu Ser Ser Lys Cys Thr Pro Thr 50 55 60 TCC GAC AGT GTG TGT CTG CCC TGT GGC CCC GAT GAG TAC TTG GAC ACC 240 Ser Asp Ser Vai Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Thr 65 70 75 80 TGG AAT GAA GAA GAT AAA TGC TTG CTG CAT AAA GTC TGT GAT GCA GGC 288 Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Vai Cys Asp Ala Gly 85 90 95 AAG GCC CTG GTG GCG GTG GAT CCT GGC AAC CAC ACG GCC CCG CGT CGC 336 Lys Ala Leu Vai Ala Vai Asp Pro Gly Asn His Thr Ala Pro Arg Arg 100 105 110 TGT GCT TGC ACG GCT GGC TAC CAC TGG AAC TCA GAC TGC GAG TGC TGC 384 Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys 115 120 125 CGC AGG AAC ACG GAG TGT GCA CCT GGC TTC GGA GCT CAG CAT CCC TTG 432 Arg Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Phe Gly Ala Gin His Pro Leu 130 135 140 CAG CTC AAC AAG GAT ACG GTG TGC ACA CCC TGC CTC CTG GGC TTC TTC 480 Gin Leu Asn Lys Asp Thr Vai Cys Thr Pro Cys Leu Leu Gly Phe Phe 145 150 155 160 TCA GAT GTC TTT TCG TCC ACA GAC AAA TGC AAA CCT TGG ACC AAC TGC 528 Ser Asp Vai Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys 165 170 175 ACC CTC CTT GGA AAG CTA GAA GCA CAC CAG GGG ACA ACG GAA TCA GAT 576 Thr Leu Leu Gly Lys Leu Glu Ala His Gin Gly Thr Thr Glu Ser Asp 180 185 190 109 ΕΡ0946725Β1 GTG GTC TGC AGC TCT TCC ATG ACA CTG AGG AGA CCA CCC AAG GAG GCC 624 Vai Vai Cys Ser Ser Ser Met Thr Leu Arg Arg Pro Pro Lys Glu Ala 195 200 205 CAG GCT TAC CTG CCC AGT CTC ATC GTT CTG CTC CTC TTC ATC TCT GTG 672 Gin Ala Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Vai Leu Leu Leu Phe Ile Ser Vai 210 215 220 GTA GTA GTG GCT GCC ATC ATC TTC GGC GTT TAC TAC AGG AAG GGA GGG 720 Vai Vai Vai Ala Ala Ile Ile Phe Gly Vai Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly 225 230 235 240 AAA GCG CTG ACA GCT AAT TTG TGG AAT TGG GTC AAT GAT GCT TGC AGT 768 Lys Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp Asn Trp Vai Asn Asp Ala Cys Ser 245 250 255 AGT CTA AGT GGA AAT AAG GAG TCC TCA GGG GAC CGT TGT GCT GGT TCC 816 Ser Leu Ser Gly Asn Lys Glu Ser Ser Gly Asp Arg Cys Ala Gly Ser 250 265 270 CAC TCG GCA ACC TCC AGT CAG CAA GAA GTG TGT GAA GGT ATC TTA CTA 864 His Ser Ala Thr Ser Ser Gin Gin Glu Vai Cys Glu Gly Ile Leu Leu 275 280 285 ATG ACT CGG GAG GAG AAG ATG GTT CCA GAA GAC GGT GCT GGA GTC TGT 912 Met Thr Arg Glu Glu Lys Met Vai Pro Glu Asp Gly Ala Gly Vai Cys 290 295 300 GGG CCT GTG TGT GCG GCA GGT GGG CCC TGG GCA GAA GTC AGA GAT TCT 960 Gly Pro Vai Cys Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Glu Vai Arg Asp Ser 305 310 315 320 AGG ACG TTC ÁCA CTG GTC AGC GAG GTT GAG ACG CAA GGA GAC CTC TCG 1008 Arg Thr Phe Thr Leu Vai Ser Glu Vai Glu Thr Gin Gly Asp Leu Ser 325 330 335 AGG AAG ATT CCC ACA GAG GAT GAG TAC ACG GAC CGG CCC TCG CAG CCT 1056 Arg Lys lie Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Thr Asp Arg Pro Ser Gin Pro 340 345 350 TCG ACT GGT TCA CTG CTC CTA ATC CAG CAG GGA AGC AAA TCT ATA CCC 1104 Ser Thr Gly Ser Leu Leu Leu Ile Gin Gin Gly Ser Lys Ser Ile Pro 355 360 365 CCA TTC CAG GAG CCC CTG GAA GTG GGG GAG AAC GAC AGT TTA AGC CAG 1152 Pro Phe Gin Glu Pro Leu Glu Vai Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gin 370 375 380 TGT TTC ACC GGG ACT GAA AGC ACG GTG GAT TCT GAG GGC TGT GAC TTC 1200 Cys Phe Thr Gly Thr Glu Ser Thr Vai Asp Ser Glu Gly Cys Asp Phe 385 390 395 400 ACT GAG CCT CCG AGC AGA ACT GAC TCT ATG CCC GTG TCC CCT GAA AAG 1248 Thr Glu Pro Pro Ser Arg Thr Asp Ser Met Pro Vai Ser Pro Glu Lys 405 410 415 CAC CTG ACA AAA GAA ATA GAA GGT GAC AGT TGC CTC CCC TGG GTG GTC 1296 His Leu Thr Lys Glu Ile Glu Gly Asp Ser Cys Leu Pro Trp Vai Vai 420 425 430 110 1344 ΕΡ0946725Β1 AGC TCC AAC TCA ACA GAT GGC TAC ACA GGC AGT GGG AAC ACT CCT GGG Ser Ser Asn Ser Thr Asp Gly Tyr Thr Gly Ser Gly Asn Thr Pro Gly 435 440 445 GAG GAC CAT GAA CCC TTT CCA GGG TCC CTG AAA TGT GGA CCA TTG CCC Glu Asp His Glu Pro Phe Pro Gly Ser Leu Lys Cys Gly Pro Leu Pro 450 455 460 CAG TGT GCC TAC AGC ATG GGC TTT CCC AGT GAA GCA GCA GCC AGC ATG Gin Cys Ala Tyr Ser Met Gly Phe Pro Ser Glu Ala Ala Ala Ser Met 465 470 475 480 GCA GAG GCG GGA GTA CGG CCC CAG GAC AGG GCT GAT GAG AGG GGA GCC Ala Glu Ala Gly Vai Arg Pro Gin Asp Arg Ala Asp Glu Arg Gly Ala 485 490 495 TCA GGG TCC GGG AGC TCC CCC AGT GAC CAG CCA CCT GCC TCT GGG AAC Ser Gly Ser Gly Ser Ser Pro Ser Asp Gin Pro Pro Ala Ser Gly Asn 500 505 510 GTG ACT GGA AAC AGT AAC TCC ACG TTC ATC TCT AGC GGG CAG GTG ATG Vai Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gin Vai Met 515 520 525 AAC TTC AAG GGT GAC ATC ATC GTG GTG TAT GTC AGC CAG ACC TCG. CAG Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile Vai Vai Tyr Vai Ser Gin Thr Ser Gin 530 535 540 GAG GGC CCG GGT TCC GCA GAG CCC GAG TCG GAG CCC GTG GGC CGC CCT Glu Gly Pro Gly Ser Ala Glu Pro Glu Ser Glu Pro Vai Gly Arg Pro 545 550 555 560 GTG CAG GAG GAG ACG CTG GCA CAC AGA GAC TCC TTT GCG GGC ACC GCG Vai Gin Glu Glu Thr Leu Ala His Arg Asp Ser Phe Ala Gly Thr Ala 565 570 575 CCG CGC TTC CCC GAC GTC TGT GCC ACC GGG GCT GGG CTG CAG GAG CAG Pro Arg Phe Pro Asp Vai Cys Ala Thr Gly Ala Gly Leu Gin Glu Gin 580 585 590 GGG GCA ccc CGG CAG AAG GAC GGG ACA TCG CGG CCG GTG CAG GAG CAG Gly Ala Pro Arg Gin Lys Asp Gly Thr Ser Arg Pro Vai Gin Glu Gin 595 600 605 GGT GGG GCG CAG ACT TCA CTC CAT ACC CAG GGG TCC GGA CAA TGT GCA Gly Gly Ala Gin Thr Ser Leu His Thr Gin Gly Ser Gly Gin Cys Ala 610 615 620 1392 1440 1488 1536 1584 1632 1680 1728 1776 1824 1872 1878

GAA TGA

Glu 625 111 ΕΡ0946725Β1 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 625 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:15 ΕΡ0946725Β1

Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Gin Leu Pro Ala Pro Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Vai Leu Leu Vai Pro Leu Gin Vai Thr Leu Gin Vai Thr 20 25 30 Pro Pro Cys Thr Gin Glu Arg His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys 35 40 45 Ser Arg Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Leu Ser Ser Lys Cys Thr Pro Thr 50 55 60 Ser Asp Ser Vai Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Thr 65 70 75 80 Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Vai Cys Asp Ala Gly 85 90 95 Lys Ala Leu Vai Ala Vai Asp Pro Gly Asn His Thr Ala Pro Arg Arg 100 105 110 Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys 115 120 125 Arg Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Phe Gly Ala Gin His Pro Leu 130 135 140 Gin Leu Asn Lys Asp Thr Vai Cys Thr Pro Cys Leu Leu Gly Phe Phe 145 150 155 160 Ser Asp Vai Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys 165 170 175 Thr Leu Leu Gly Lys Leu Glu Ala His Gin Gly Thr Thr Glu Ser Asp 180 185 190 Vai Vai Cys Ser Ser Ser Met Thr Leu Arg Arg Pro Pro Lys Glu Ala 195 200 205 Gin Ala Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Vai Leu Leu Leu Phe Ile Ser Vai 210 215 220 Vai Vai Vai Ala Ala Ile Ile Phe Gly Vai Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly 225 230 235 240 Lys Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp Asn Trp Vai Asn Asp Ala Cys Ser 245 250 255 Ser Leu Ser Gly Asn Lys Glu Ser Ser Gly Asp Arg Cys Ala Gly Ser 260 265 270 His Ser Ala Thr Ser Ser Gin Gin Glu Vai Cys Glu Gly Ile Leu Leu 275 280 285 Met Thr Arg Glu Glu Lys Met Vai Pro Glu Asp Gly Ala Gly Vai Cys 290 295 300 113

Pro Trp Ala Glu Vai Arg Asp Ser 315 320 Vai Glu Thr Gin Gly Asp Leu Ser 330 335 Tyr Thr Asp Arg Pro Ser Gin Pro 345 350 Gin Gin Gly Ser Lys Ser Ile Pro 365 Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gin 380 Vai Asp Ser Glu Gly Cys Asp Phe 395 400 Ser Met Pro Vai Ser Pro Glu Lys 410 415 Asp Ser Cys Leu Pro Trp Vai Vai 425 430 Thr Gly Ser Gly Asn Thr Pro Gly 445 Ser Leu Lys Cys Gly Pro Leu Pro 460 Pro Ser Glu Ala Ala Ala Ser Met 475 480 Asp Arg Ala Asp Glu Arg Gly Ala 490 495 Asp Gin Pro Pro Ala Ser Gly Asn 505 510 Phe Ile Ser Ser Gly Gin Vai Met 525 Vai Tyr Vai Ser Gin Thr Ser Gin 540 Glu Ser Glu Pro Vai Gly Arg Pro 555 560 Arg Asp Ser Phe Ala Gly Thr Ala 570 575 Thr Gly Ala Gly Leu Gin Glu Gin 585 590 Thr Ser Arg Pro Vai Gin Glu Gin 605 Thr Gin Gly Ser Gly Gin Cys Ala 620 ΕΡ0946725Β1

Gly Pro Vai Cys Ala Ala Gly Gly 305 310

Arg Thr Phe Thr Leu Vai Ser Glu 325

Arg Lys Ile Pro Thr Glu Asp Glu 340

Ser Thr Gly Ser Leu Leu Leu Ile 355 360

Pro Phe Gin Glu Pro Leu Glu Vai 370 375

Cys Phe Thr Gly Thr Glu Ser Thr 385 390

Thr Glu Pro Pro Ser Arg Thr Asp 405

His Leu Thr Lys Glu Ile Glu Gly 420

Ser Ser Asn Ser Thr Asp Gly Tyr 435 440

Glu Asp His Glu Pro Phe Pro Gly 450 455

Gin Cys Ala Tyr Ser Met Gly Phe 465 470

Ala Glu Ala Gly Vai Arg Pro Gin 485

Ser Gly Ser Gly Ser Ser Pro Ser 500

Vai Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr 515 520

Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile Vai 530 535

Glu Gly Pro Gly Ser Ala Glu Pro 545 550

Vai Gin Glu Glu Thr Leu Ala His 565

Pro Arg Phe Pro Asp Vai Cys Ala 580

Gly Ala Pro Arg Gin Lys Asp Gly 595 600

Gly Gly Ala Gin Thr Ser Leu His 610 615 114 ΕΡ0946725Β1

Glu 625 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:16:

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Gly 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:17: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:17:

Asp Tyr Lys Asp Glu 5 115 ΕΡ0946725Β1 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:18

His His His His His His 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:19 ΕΡ0946725Β1

Arg Met Lys Gin Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile 15 10 15

Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Glv Glu 20 25 30

Arg

Lisboa, 14 de Abril de 2011 117

Claims (39)

1. ΕΡ0946725Β1 REIVINDICAÇÕES 1. DNA isolado seleccionado a partir do grupo que consiste em: (a) um DNA que codifica uma proteína que possui uma sequência de aminoácidos como apresentado em SEQ ID N°:6, em que a proteína possui um terminal amino seleccionado a partir do grupo que consiste num aminoácido entre o aminoácido 1 e o aminoácido 33, inclusive, de SEQ ID N°:6, e um terminal carboxilo seleccionado a partir do grupo que consiste num aminoácido entre aminoácido 196 e aminoácido 616, inclusive; (b) moléculas de DNA capazes de hibridação com o DNA de (a) sob condições restringentes, que incluem 63 °C, 6X SSC, durante a noite; lavagem em 3X SSC a 55 °C, e que codifica activador do receptor biologicamente activo de NF-κΒ; e (c) moléculas de DNA que codificam fragmentos de proteínas codificadas pelo DNA de (a) ou (b), em que os fragmentos são biologicamente activos e a actividade biológica é seleccionada a partir do grupo que consiste em: ligação a TRAFs 1, 2, 3, 5 ou 6, ligação específica a um ligando de activador de receptor solúvel de NF-kB ou um ligando de activador de receptor de NF-κΒ expresso em células ou imobilizadas numa superfície, e ligação a anticorpos específicos para o activador de receptor de NF-kB. 1 ΕΡ0946725Β1
2. 2. DNA isolado da reivindicação 1, que codifica um polipéptido activador de receptor de NF-κΒ que é pelo menos 80% idêntica em sequência de aminoácidos a um polipéptido de SEQ ID NÃO: 6 e possui uma actividade exibida pelo referido polipéptido.
3. 3. DNA isolado da reivindicação 1 ou 2, em que a actividade biológica é seleccionada a partir do grupo que consiste em: ligação a TRAFs 1, 2, 3, 5 ou 6, ligação especifica a um ligando de activador de receptor solúvel de NF-κΒ ou um ligando de activador de receptor de NF-κΒ expresso em células ou imobilizadas numa superfície, e ligação a anticorpos específicos para o activador de receptor de NF-kB.
4. 4. DNA isolado da reivindicação 1 ou reivindicação 2 que codifica um polipéptido activador de receptor solúvel de NF-kB.
5. 5. DNA isolado da reivindicação 4, que compreende ainda um DNA que codifica um polipéptido seleccionado a partir do grupo que consiste num domínio Fc de imunoglobulina, uma muteína de Fc de imunoglobulina, uma marca FLAG™, um péptido compreendendo pelo menos cerca de 6 resíduos de His, um fecho de leucina, e suas combinações.
6. 6. Vector de expressão recombinante compreendendo uma sequência de DNA de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5.
7. 7. Célula hospedeira transformada ou transfectada com um vector de expressão de acordo com reivindicação 6. 2 ΕΡ0946725Β1
8. 8. Processo para preparar uma proteína activadora de receptor de NF-κΒ, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7 sob condições que promovem a expressão e recuperação do activador de receptor de NF-κΒ activo.
9. 9. Fragmento de DNA isolado seleccionado a partir do grupo que consiste em oligonucleótidos de pelo menos cerca de 17 nucleótidos de comprimento, oligonucleótidos de, pelo menos, cerca de 25 nucleótidos de comprimento, e oligonucleótidos de, pelo menos, cerca de 30 nucleótidos de comprimento, em que o fragmento é um fragmento de resíduos de nucleótidos 39-1886 de SEQ ID N°:5.
10. 10. Polipéptido isolado activador de receptor de NF-kB seleccionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 33 a 196 de SEQ ID N°:6; (b) um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 213 de SEQ ID N°:6; (c) um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 234 a 616 de SEQ ID N°:6; (d) um polipéptido activador de receptor de nf-kB codificado por um DNA capaz de hibridação com um DNA que codifica a proteína de (a) a (c) sob condições restringentes (63°C, 6 X SSC, durante a noite; lavagem em 3X SSC a 55°C) e que é biologicamente activa; 3 ΕΡ0946725Β1 (e) fragmentos dos polipéptidos de (a), a (d) que são biologicamente activos e a actividade biológica é seleccionada a partir do grupo que consiste em: indutores de actividade de nf-kB, ligação a TRAFs 1, 2, 3, 5 ou 6, ligação especifica a um ligando de activador de receptor solúvel de NF-κΒ ou um ligando de activador de receptor de NF-κΒ expresso em células ou imobilizado como uma superfície e ligação a anticorpos específicos para o activador de receptor de NF-kB.
11. 11. Polipéptido isolado activador de receptor de NF-κΒ da reivindicação 10, em que a actividade biológica é seleccionada a partir do grupo que consiste em: indutores de actividade de NF-κΒ, ligação a TRAFs 1, 2, 3, 5 ou 6, ligação específica a um ligando de activador de receptor solúvel de NF-κΒ ou um ligando de activador de receptor de NF-kB expresso em células ou imobilizado numa superfície e ligação a anticorpos específicos de activador de receptor de NF-kB.
12. 12. Proteína de acordo com reivindicação 10 ou 11, que possui uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 70% idêntica, pelo menos cerca de 80% idêntica ou pelo menos cerca de 90% idêntica à SEQ ID N°:6.
13. 13. Proteína de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 12, que é um activador de receptor solúvel de NP-kB.
14. 14. Proteína activadora de receptor solúvel de NF-kB conforme reivindicado na reivindicação 13, que compreende ainda um péptido seleccionado a partir do grupo que consiste num domínio Fc de imunoglobulina, uma muteína de Fc de imunoglobulina, uma marca FLAG™, um péptido compreendendo 4 ΕΡ0946725Β1 pelo menos cerca de 6 resíduos de His, um fecho de leucina, e suas combinações.
15. 15. Proteína activadora de receptor solúvel de NF-kB conforme reivindicado na reivindicação 14 compreendendo a porção Fc de IgGl humano que consiste nos aminoácidos 3 a 232 de SEQ ID N°:8.
16. 16. Anticorpo imunorreactivo com um polipéptido activador de receptor de NF-κΒ de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 13.
17. 17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16, que é um anticorpo monoclonal.
18. 18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, em que o referido anticorpo se liga a um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:6.
19. 19. Composição compreendendo o activador de receptor de NF-kB purificado codificado pelo DNA de qualquer das reivindicações 1 a 5 e um veículo, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável.
20. 20. Composição compreendendo um anticorpo antagonistico de acordo com a reivindicação 16, reivindicação 17 ou reivindicação 18 e um veículo, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável.
21. 21. Polipéptido activador de receptor de NF-κΒ como definido em qualquer das reivindicações 10-15, ou codificadas por um 5 ΕΡ0946725Β1 DNA como definido em qualquer das reivindicações 1-5, ou uma composição como definido na reivindicação 18 ou reivindicação 19, para utilização em medicina.
22. 22. Polipéptido activador de receptor solúvel de NF-κΒ como definido em qualquer das reivindicações 10-15, ou codificado por um DNA como definido em qualquer das reivindicações 1-5, para utilização na inibição da activação NF-kB.
23. 23. Polipéptido activador de receptor solúvel de NF-κΒ como definido em qualquer das reivindicações 10-15, ou codificado por DNA como definido em qualquer das reivindicações 1-5, para utilização no tratamento de um estado em que a sinalização através do activador de receptor de NF-κΒ deu origem a consequências negativas, tais como choque tóxico ou séptico ou rejeição enxerto-versus-hospedeiro.
24. 24. Polipéptido activador de receptor solúvel de NF-κΒ como definido em qualquer das reivindicações 10-15, ou codificadas por DNA como definido em qualquer das reivindicações 1-5, para utilização no tratamento de uma doença caracterizada por células neoplásicas que expressam o activador de receptor de nf-kb.
25. 25. Polipéptido activador de receptor solúvel de NF-κΒ como definido em qualquer das reivindicações 10-15, ou codificadas por um DNA como definido em qualquer das reivindicações 1-5, para utilização na regulação de uma resposta imunitária ou inflamatória.
26. 26. Utilização de um activador de receptor solúvel de NF-kB conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 13-15, 6 ΕΡ0946725Β1 ou codificado por um DNA como definido em qualquer das reivindicações 1-5, ou anticorpos monoclonais antagonisticos de activador de receptor de NF-κΒ na preparação de um medicamento para inibir a activação de nf-kB.
27. 27. Utilização de um activador de receptor solúvel de NF-kB conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 13-15, ou codificado por um DNA como definido em qualquer das reivindicações 1-5, ou anticorpos monoclonais antagonisticos de activador de receptor de NF-κΒ na preparação de um medicamento para o tratamento de um estado em que a sinalização através do activador de receptor de NF-κΒ deu origem a consequências negativas, tais como choque tóxico ou séptico ou rejeição de enxerto-versus-hospedeiro.
28. 28. Utilização de um activador de receptor solúvel de NF-kB conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 13-15, ou codificado por um DNA como definido em qualquer das reivindicações 1-5, ou anticorpos monoclonais antagonisticos de activador de receptor de NF-κΒ na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença caracterizada por células neoplásicas que expressam o activador de receptor de NF-κΒ.
29. 29. Utilização de um activador de receptor solúvel de NF-kB conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 13-15, ou codificado por um DNA conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1-5, ou anticorpos monoclonais antagonisticos de activador de receptor de NF-κΒ na preparação de um medicamento para interferir com o papel de NK-κΒ em transformação celular. 7 ΕΡ0946725Β1
30. 30. Utilização de uma composição de polipéptido activador de receptor solúvel de NF-κΒ, em que o activador de receptor de NF-κΒ é codificado por um DNA como definido em qualquer das reivindicações 1-5, ou anticorpos monoclonais antagonísticos de activador de receptor de NF-κΒ na preparação de um medicamento para regular uma resposta imunitária ou inflamatória.
31. 31. Utilização de um polipéptido activador de receptor solúvel de NF-κΒ, conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 13 to 15, para pesquisar um inibidor de activador de receptor de NF-κΒ de actividade de NF-kB induzida.
32. 32. Utilização de uma forma solúvel de um polipéptido activador de receptor de NF-κΒ, codificada por um DNA conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5, derivado do domínio extracelular, num ensaio de rastreio para detectar moléculas capazes de ligar um activador de receptor de NF-kB.
33. 33. Utilização de um polipéptido activador de receptor de NF-κΒ, codificado por um DNA conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5, derivado do domínio citoplásmico, num ensaio para detectar a inibição da interacção do activador de receptor de NF-κΒ e outras proteínas intracelulares envolvidas na transdução de sinal.
34. 34. Utilização conforme reivindicado na reivindicação 33, em que o ensaio é para detectar a inibição da associação de activador de receptor de NF-κΒ e TRAF 1, 2, 3, 5 ou 6. 8 ΕΡ0946725Β1
35. 35. Utilização de uma sequência de polipéptido activador de receptor de NF-κΒ, codificada por DNA conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5, na concepção com base na estrutura de um inibidor de activador de receptor de nf-kB
36. 36. Utilização de um activador de receptor de NP-kB polipéptido, codificado por DNA conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5 para assegurar a capacidade de moléculas para antagonizar ou agonizar o activador de receptor de NF-kB.
37. 37. Utilização de um polipéptido activador de receptor de NF-κΒ, codificado por DNA conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5, no desenvolvimento de anticorpos agonisticos ou antagonisticos do activador de receptor de NF-kB.
38. 38. Utilização de um polipéptido activador de receptor de NF-κΒ, codificado por DNA conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5, num rastreio para antagonistas da actividade do activador de receptor de NF-kB.
39. 39. Kit para detectar polipéptido activador de receptor solúvel de NF-κΒ ou para detectar o ligando de activador de receptor solúvel de NF-κΒ ou para monitorizar a actividade mediada pelo activador de receptor de NF-κΒ em amostras de doentes, compreendendo o referido kit o activador de receptor solúvel de NF-κΒ conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 13-15, em que o referido detectar ou monitorizar emprega um ensaio seleccionado a partir do grupo que consiste em ELISA, ensaio de transferência de mancha, 9 ΕΡ0946725Β1 ensaio de ligação de fase sólida (tal como os que utilizam um biosensor), um ensaio de formato rápido e um bioensaio. Lisboa, 14 de Abril de 2011 10