PT941137E

PT941137E - Degradacao de hidrocarbonetos halogenados atraves de archaea halofilas

Info

Publication number: PT941137E
Application number: PT97909332T
Authority: PT
Inventors: Heiko Patzelt; Brigitte Kessler; Dieter Oesterhelt
Original assignee: Heiko Patzelt
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-29
Publication date: 2002-02-28
Also published as: EP0941137A1; DK0941137T3; DE59704259D1; ATE203922T1; DE19639894A1; AU4706697A; GR3036404T3; ES2159119T3; JP2001507567A; WO1998013105A1; EP0941137B1

Description

DESCRIÇÃO "Degradação de hidrocarbonetos halogenados através de Archaea halõfilas" O presente invento refere-se a um processo para a degradação, pelo menos parcial, de compostos orgânicos halogenados através de Archaea halófilas, extractos ou componentes das mesmas. Além disso são revelados processos para a obtenção de organismos adaptados a compostos halogenados, assim como os organismos que podem ser obtidos através do processo.

Os hidrocarbonetos halogenados, especialmente os resíduos de fitossanitários e resíduos industriais, representam, devido à sua toxicidade e persistência, um problema ambiental crescente a nível mundial. O métodos de remoção tradicionais de resíduos compreendem extracções muito dispendiosas de terrenos e o armazenamento final das substâncias tóxicas seladas em aterros sanitários ou a incineração em fornos especiais a altas temperaturas. O problema do armazenamento final em aterros sanitários consiste especialmente no facto de, neste momento, se desconhecer completamente se é realmente possível garantir uma selagem duradoura dos produtos tóxicos. Na incineração sob condições não optimizadas são formadas substâncias extremamente tóxicas como, por exemplo, dioxinas e dibenzofuranos.

Ao longo dos últimos 1 5 anos tem sido examinada, por isso, uma série de microrganismos quanto à sua capacidade para degradar biologicamente hidrocarbonetos clorados (compare-se o artigo de Fetzner e Lingens, Microbiological Reviews 58 (1994), 641-658, que dá uma visão geral sobre esta matéria). Os microrganismos estudados, que se tratam geralmente de organismos bacterianos dos géneros Pseudomonas, Alcaligenes,

Flavobacterium, Rhodococcus, Streptomyces, Hyphomicrobium e Methylobacterium, transformam os hidrocarbonetos halogenados em questão apenas com uma eficácia reduzida, em pequenas concentrações e, na maior parte das vezes, de forma incompleta. L. Adrian et a/. ("Anaerober Abbau von Trichlorbenzolen in hochangereicherten Mischkulturen", Biologische

Abwasserreinigung Vol. 6, (1995), 81-89), descrevem um processo para a degradação microbiológica de compostos orgânicos halogenados através de culturas mistas contendo bactérias Archaea. L. Adrian et al. revelam, além 86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 2

disso, que as arqueobactérias metanogénicas de cultura mista não participam na descoloração.

Existe portanto uma grande necessidade de disponibilizar processos para a degradação de compostos orgânicos halogenados em que os inconvenientes do nível tecnológico actual sejam, pelo menos parcialmente, eliminados. Pretende-se nomeadamente que o processo torne possível uma degradação tão completa quanto possível obtendo-se produtos finais não tóxicos.

Inesperadamente verificou-se que as Archaea halófilas podem ser adaptadas a compostos orgânicos halogenados presentes em concentrações mesmo milimolares. Os organismos são capazes de degradar os átomos de halogéneo dos compostos halogenados sem que haja um enriquecimento de metabolitos tóxicos, de preferência originando compostos inorgânicos como, por exemplo, sais minerais. Esta degradação pôde ser comprovada de modo exemplar com vários triclorofenóis isoméricos, Lindan e DDT numa cultura líquida, através de uma análise combinada de cromatografia em fase gasosa/ espectroscopia de massa dos extractos orgânicos provenientes de caldos de fermentação. Para cada via de degradação foi possível identificar por espectroscopia de massa, pelo menos, um produto intermediário. A degradação de compostos orgânicos halogenados pode ser realizada por células completas, extractos celulares, fracções celulares ou componentes celulares isolados como, por exemplo, enzimas. Também pode ter lugar sob as condições de alta concentrações salina ou na presença de solventes orgânicos. A degradação de acordo com o invento, de compostos orgânicos halogenados através de Archaea halófilas representa um melhoramento essencial de métodos existentes. A elevada tolerância das Archaea halófilas em relação a elevadas concentrações de compostos orgânicos halogenados, assim como a sua capacidade para degradar estas substâncias surpreende muitíssimo perante a conhecida sensibilidade das halobactérias em relação a substâncias estranhas como, por exemplo, ácidos biliares e antibióticos (compare-só, p.ex., Kamekura et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 990-995 e Oren, Arch. Microbiol. 165 (1996), 354-358). 3 86 Λ 27 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ

Um objecto do presente invento é, portanto, um processo para a degradação, pelo menos parcial, de compostos orgânicos halogenados, caracterizado por se colocar os compostos em contacto com Archaea halófilas ou com extractos ou componentes das mesmas, incubando-os sob condições em que se dá a degradação dos compostos orgânicos.

As Archaea halófilas são uma subclasse das Euryarchaeota (compare-se, p.ex., Woese, Microbiological Rev. 58 (1994), 1-9). De preferência devem entender-se por esta designação, organismos da ordem das Halobactérias, particularmente organismos da família das Halobacteriáceas. Exemplos de géneros apropriados são Haloarcula, Halobacterium, Halococcus, Haloferax, Halorubrum, Natronobacterium e Natronococcus. Preferem-se particularmente organismos dos géneros Haloarcula, Halobacterium e Haloferax.

Exemplos de espécies apropriadas do género Haloarcula são H. hispanica, H. japonica, H. marismortui, H. vallismortis, H. californiae e H. sinaiiensis. Espécies apropriadas do género Halobacterium são H. salinarium, H. cutirubrum, H. trapanicum, H. sodomense, H. lacusprofundis, H. distributum e Amoebobacter morrhuae (Torreblanca, System. Appl. Microbiol. 8 (1986), 89-99). Espécies apropriadas do género Halococcus são H. morrhuae, H. turkmenicus e H. saccharolyticus. Espécies apropriadas do género Haloferax são H. denitrificans, H. mediterranei, H. gibbonsii e H. volcanii. Uma espécie apropriada do género Halorubrum é H. saccharovorum. Espécies apropriadas do género Natronobacterium são N. gregoryi, N. magadii e N. pharaonis. Uma espécie apropriada do género Natronococcus é N. occultus. Em relação à classificação dos organismos refira-se - se não for indicado em contrário - ao artigo de Tindall (The Procaryonts, Vol. 1 (1991), 768-808) que dá uma visão geral sobre o assunto, ou à classificação da DSMZ (catálogo on-line: http://www.gbf-braunschweig.de/DSMZ/species/archaea.htm).

Apesar de numerosas estirpes de Archaea halófilas existentes na natureza serem apropriadas para o degradação dc substâncias orgânicas halogenadas, são utilizados preferencialmente organismos que tenham sido sujeitos a um processo de selecção adicional para a adaptação a compostos orgânicos halogenados. Para este efeito é seleccionado, em primeiro lugar, um organismo que ocorre na natureza e que apresenta crescimento perante determinadas substâncias halogenadas como, por exemplo, clorofenol ou

86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 4

Lindan, p.ex, em concentrações de 1 μΜ, 10 μΜ ou 100 μΜ. Esta estirpe é utilizada como material de partida para um processo de adaptação que pode ser realizado, por exemplo, através de plaqueamento dos organismos em placas na presença de concentrações crescentes de substâncias tóxicas como, por exemplo, Lindan ou clorobenzeno.

Através de um processo de adaptação deste género é ohtido um organismo que apresenta, comparado com o organismo natural de partida, uma tolerância e capacidade de degradação essencialmente mais elevadas em relação a substâncias orgânicas halogenadas. Um exemplo de um organismo adaptado deste género é a estirpe Halobacterium CB1, que foi depositada no dia 10-09-1996 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg 1b, 38124, Braunschweig, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste, sob a referência DSM 11147. Um organismo adaptado deste género pode ser sujeito, a seguir, a um outro processo de selecção, no qual a tolerância em relação a compostos específicos como, por exemplo, triclorofenóis, DDT ou Lindan, é mais uma vez aumentada. A descendência do organismo de partida, obtida desta maneira, pode então ser utilizada especificamente para a degradação destes compostos.

Outros exemplos de organismos adaptados apropriados são a estirpe Hf-X1 proveniente de uma estirpe da espécie Haloferax mediterranei e depositada no dia 24-09-1997 na DSMZ sob a referência DSM 11795, e a estirpe Hc-U2 proveniente de uma estirpe da espécie Haloarcula catiforniae e depositada no dia 24-09-1997 na DSMZ sob a referência DSM 11794. A Hf-X1 é particularmente apropriada para a degradação de fenóis policlorados como, p.ex., tri-, tetra- e pentaclorofenóis. A Hc-U2 é particularmente apropriada para a degradação de hidrocarbonetos bromados como, por exemplo, do agente retardador de chamas bis-2,2-(3,5-dibromo-hidroxifenil)propano.

Através de selecção de organismos naturais apropriados, como supraindicado, ou/e aplicação dos processos de selecção supradescritos, podem ser disponibilizados organismos apresentando uma tolerância em relação ao composto ou aos compostos a degradar numa concentração de, pelo menos, 10 μΜ, de preferência pelo menos 50 μΜ, preferindo-se particularmente pelo menos 100 μΜ, sendo ainda melhor pelo menos 1 mM.

86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 5

Os compostos a degradar são escolhidos, de preferência, de compostos orgânicos contendo carbono, eventualmente hidrogénio e heteroátomos como, por exemplo, O, N, S e P, assim como, pelo menos, um átomo de halogéneo. De preferência, os compostos contêm, pelo menos, um átomo de flúor, iodo, bromo ou/e cloro, preferindo-se particularmente que contenham, pelo menos, um átomo de flúor, bromo ou/e cloro. Através do processo de degradação de acordo com o invento, os átomos de halogéneo ligados em compostos orgânicos são transformados em halogenetos inorgânicos.

Os átomos de halogéneo podem estar ligados aos mais diversos tipos de átomos de carbono, p.ex. a átomos de carbono alifáticos (lineares ou cíclicos), aromáticos ou/e de olefinas. Prefere-se particularmente que os compostos a degradar sejam escolhidos de entre compostos aromáticos eventualmente policlorados como, por exemplo, fenóis ou benzenos ou dioxinas ou furanos aromáticos clorados como, por exemplo, dibenzodioxinas ou dibenzofuranos, clorados, p.ex. 2,3,4-triclorofenol, 2,3,5-triclorofenol, 2,4,5-triclorofenol, 2-clorodibenzodioxina (2-MCDD), ou 1,2,3,4-tetraclorodibenzodioxina (1,2,3,4-TCDD). Outros exemplos de compostos apropriados contêm vários átomos de halogéneo ligados a átomos de carbono alifáticos ou de olefinas e a átomos de carbono aromáticos, p.ex. DDT ou o seu produto de decomposição DDE. Uma outra categoria preferida de compostos a degradar são os compostos policlorados alicíclicos como, por exemplo, Lindan (γ-hexaclorociclo-hexano).

Outros exemplos específicos de compostos a degradar são o 2,3,6-triclorofenol, 2,4,6-tri-halogenofenol (no qual halogéneo = flúor, cloro, bromo, iodo), clorobenzeno, cloreto de benzilo, cloreto feniletílico, hexaclorociclo-hexanos, p.ex. a-HCH, β-HCH, γ-HCH e δ-HCH, 2,3,4-trifluorofenol, 2,3,5-trifluorofenol, 2,2-bis-(4-clorofenil)-1,1-dicloroetano (DDD), fracções de cloroparafina, éter decabromodifenílico, penta-halogenofenol (no qual halogéneo - cloro, flúor, bromo), Bis-2,2-(3,5-dibromo-4-hidroxifenil)propano, 3,4,5-tríclorofenol, 2,3,4,5-tetraclorofenol, 2,3,4,6-tetraclorofenol, atrazina, aldrina, dieldrina, endrina e os seus derivados como, por exemplo, aldeído de endrina ou cetona de endrina, endossulfano I e II, sulfato de endossulfano, heptacloro, epóxido de heptacloro e metoxicloro, assim como misturas contendo vários dos compostos mencionados.

86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 6

Em produtos tóxicos particularmente lipófilos como, por exemplo, 2-MCDD, 1,2,3,4-TCDD ou éter decabromodifenílico, a biodisponibilidade pode ser aumentada drasticamente e a degradação fortemente acelerada através da adição de agentes solubilizantes. Exemplos de agentes deste género são as ciclodextrinas como, por exemplo, β- ou γ-ciclodextrinas, p.ex. Heptakis-2,6-di-O-metil-p-ciclodextrina. Como agentes solubilizantes podem ser utilizados também substâncias tensioactivas, p.ex. do tipo dos alquilglicósidos ou colatos. Os agentes solubilizantes são adicionados à cultura em crescimento, de preferência, numa quantidade de, pelo menos, 0,01 equivalentes molares, preferindo-se particularmente 0,1-1 equivalentes molares em relação a um equivalente molar do produto tóxico. Particularmente tolerantes em relação a concentrações mais elevadas de agentes solubilizantes deste género são, p.ex., estirpes provenientes de organismos do género Haloarcula, especialmente H. hispanica, ou Haloferax, especialmente Haloferax gibbonsii. A degradação de acordo com o invento pode ser realizada sob condições aeróbias, microaeróbias ou anaeróbias. Por condições microaeróbias deve entender-se uma fermentação num recipiente de reacção selado cujo volume livre não foi desgaseificado. No início da fermentação está disponível oxigénio, mas depois de algumas horas já não há quase nenhum. O crescimento dos organismos pode ser melhorado, sob estas condições microaeróbias, conforme a estirpe, através da adição de arginina ou/e nitrato. Para a degradação microaeróbia preferem-se particularmente estirpes que ainda dispõem de bacteriorodopsina fotossinteticamente activa, p.ex. a estirpe CB1. Com estas é possível obter, em caso de exposição simultânea à luz, densidades celulares elevadas semelhantes às que são obtidas sob condições de fermentação aeróbias. Com certos produtos tóxicos, p.ex. pentaclorofenol, é possível aumentar desta maneira a tolerância e a taxa de degradação, pelo menos, uma ordem de grandeza.

Além disso é possível melhorar o rendimento por espaço/tempo das reacções de degradação - especialmente com substâncias muito tóxicas -através de alimentação por impulsos ou adição da substância quando a densidade celular for elevada.

Um outro objecto do presente invento é um processo para a produção de organismos Archaea halófilos adaptados a compostos orgânicos halogenados.

86 427

EPO 941 137/PT 7

Neste processo é seleccionado um organismo Archaea halófilo de partida, o qual já apresenta uma tolerância em relação a uma concentração predeterminada de um ou vários compostos orgânicos halogenados seleccionados, e este organismo de partida é sujeito a um processo de selecção em que é obtido um organismo adaptado apresentando, em comparação com o organismo de partida, uma tolerância ou/e capacidade de degradação maiores em relação aos compostos seleccionados. Este processo de selecção compreende, de preferência, plaquear o organismo sobre um meio de cultura sólido na presença de substâncias tóxicas, a identificação de organismos que, naquela concentração de produtos tóxicos, ainda crescem e, se for necessário, repetir uma ou várias vezes este procedimento, com concentrações crescentes dos produtos tóxicos. Como produtos tóxicos para esta selecção primária podem ser utilizados, p.ex., Lindan ou clorofenol. São exemplos de organismos adaptados que podem ser obtidos desta maneira, Halobacterium CB1 (DSM 11147), Haloferax Hf-X1 (DSM 11795), Haloarcula Hc-U2 (DSM 11794) ou organismos com uma tolerância ou/e capacidade de degradação, pelo menos, igual em relação a compostos orgânicos halogenados seleccionados como, por exemplo, triclorofenóis, DDT ou Lindan. O organismo adaptado pode ser sujeito, a seguir, a um outro processo de selecção para aumentar ainda mais a tolerância ou/e capacidade de degradação em relação a compostos orgânicos halogenados específicos, cultivando, de preferência, o organismo na presença de uma determinada concentração de um composto orgânico halogenado específico e sujeitando as células sobreviventes desta cultura, a uma ou várias outras operações de cultura com uma concentração mais elevada do composto. Este processo de selecção secundária é realizado, de preferência, num meio de cultura líquido.

Um outro objecto do presente invento é um organismo de Archaea halófilo adaptado a compostos orgânicos halogenados que pode ser obtido através do processo de selecção anteriormente descrito. O processo de acordo com o invento para degradação dos compostos orgânicos halogenados pode ser realizado não apenas com células completas como também com extractos ou componentes destas células, p.ex. com preparações enzimáticas. A preparação, o isolamento ou o enriquecimento de extractos ou enzimas provenientes de Archaea halófilas estão descritos, por

06 427 EPO 941 137/PT exemplo, em Zhang e Poulter, J. Org. Chem. 58 (1993), 3919-3922, Kerscher e Oesterhelt, J. Biochem. 1 16 (1981), 587-594 e S. DasSarma e E.M. Fleischmann (ed.), Archaea: A laboratory manual. Halophiles. xvi - 280 p. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, Estados Unidos, 1995, e Ryu et aí., Enzyme Microb. Technol. 16 (1994), 266-275). Para a preparação de extractos, preparações enzimáticas ou enzimas, o perito pode servir-se dos métodos gerais descritos naquelas publicações.

As células, extractos ou componentes das mesmas, podem ser utilizados, no processo de degradação de acordo com o invento, sob a forma dissolvida, mas também sob a forma imobilizada. Além disso é possível combinar células, extractos e componentes de vários organismos. Este procedimento deverá ser recomendável particularmente no caso de estarem presentes simultaneamente vários compostos halogenados. A degradação é realizada, de preferência, sob condições em que as células, extractos ou componentes das mesmas apresentem capacidades de degradação satisfatórias. A degradação pode der realizada em meios aquosos, meios orgânicos ou em misturas dos mesmos. A temperatura de degradação pode ser variada dentro de um amplo intervalo, p.ex. 20-60°C. Além disso prefere-se realizar a degradação sob condições aeróbias, p.ex. com arejamento. A degradação pode ser realizada, por exemplo, num biorreactor, o qual contém as células, extractos celulares, ou componentes celulares sob uma forma imobilizada. Neste biorreactor são introduzidos os compostos orgânicos a degradar, numa corrente de águas residuais, e retidos no reactor durante o tempo necessário para se atingir o grau de decomposição desejado. A corrente de águas residuais que sai do biorreactor e que está, de preferência, essencialmente isenta de átomos de halogéneo organicamente ligados, pode a seguir ser removida introduzindo-a, por exemplo, numa estação de tratamento de águas residuais. O presente invento pormenorizar-se-á, adicionalmente, através dos exemplos que se seguem. 86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 9

Exemplo 1

Fabricação de microrganismos adaptados

Ensaiaram-se 10 isolados dos géneros Halobacterium, H. trapanicum, H. salinarium e H. cutirubrum, através de incubação em placas de ágar na presença de nlnrobenzeno ou Lindan, com ou sem exposição à luz, em concentrações de 0,1 μΜ a 10 μΜ, com vista à sua tolerância em relação a compostos orgânicos halogenados. 4 das 10 estirpes ensaiadas, 2 das quais eram provenientes de isolados de H. salinarium e 2 de H. trapanicum, conseguiram crescer até atingir uma concentração de10 μΜ.

Uma das estirpes proveniente de H. trapanicum era o microrganismo Halobacterium CB1 (DSM 11147).

Para uma adaptação ulterior a compostos específicos como, por exemplo, triclorofenóis, DDT ou Lindan, o Halobacterium CB1 foi sujeito a mais outro processo de selecção. Para este efeito foi cultivado CB1 num meio de cultura líquido (condições de fermentação como descritas no exemplo 2) na presença de uma concentração de 1 μΜ do respectivo produto tóxico e inoculado até a densidade celular final da cultura ter atingido a densidade celular de uma cultura de comparação, que tinha sido cultivada na ausência do produto tóxico. A seguir aumentou-se a concentração do produto tóxico para 10 μΜ. Este processo repetiu-se de forma análoga até se atingir a concentração máxima tolerável ou o limite de solubilidade do produto tóxico.

Desta maneira foram obtidos descendentes de CB1 adaptados a compostos específicos. Assim, o CB1-H está adaptado a 2,3,4-triclorofenol até uma concentração máxima de 50 μΜ. As estirpes CB1-G e CB1-K estão adaptadas a Lindan ou DDT, respectivamente, até ao limite de solubilidade destes produtos tóxicos no meio de cultura. As estirpes CB1-N e CB1-0 estão adaptadas a 2-clorodibenzodioxina ou 1,2,3,4-tetracíorodibenzodioxina, respectivamente, até uma concentração máxima > 100 μΜ.

Também isolados dos géneros Haloarcula e Haloferax puderam ser adaptadas a Lindan, DDT e a dioxinas no meio de cultura.

86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 10

Uma das estirpes provenientes de Haloferax mediterranei foi o microrganismo Hf-X1 (DSM 1 1795) que é particularmente apropriado para a degradação de tri-, tetra- e pentaclorofenóis.

Uma das estirpes provenientes de Haloarcula californiae foi o microrganismo Hc-U2 (DSM 1 1794) que é particularmente apropriado para a degradação de hidrocarbonetos bromados.

Exemplo 2

Degradação de triclorofenóis

As células foram cultivadas em culturas de 35 ml, num balão de Erlenmeyer de 100 ml, inoculadas com 1 ml de cultura de inoculação, num meio de crescimento apropriado (250 g de NaCI, 20 g de MgS04-7 H20, 3 g de citrato trissódico, 2 g de KCl, 10 g de óxido de peptona bacteriológica, 1 I de H20), a 40°C sob condições aeróbias ou microaeróbias. Ao balão foram adicionados, no início da fermentação, os produtos tóxicos 2,3,4-, 2,3,5- ou 2,4,5-triclorofenol dissolvidos em quantidades pequenas de etanol ou isopropanol. As concentrações finais dos produtos tóxicos foram de 50 μΜ. Após uma incubação de 7-10 dias a 40°C sobre um aparelho vibrador a 100 rpm, todo o caldo de cultura foi extraído com 2 x 20 ml de uma solução a 5% de ácido acético em acetato de etilo. O balão foi mais uma vez lavado com a mesma solução de extracção.

Os extractos orgânicos reunidos foram, eventualmente após serem concentrados sob uma corrente de azoto, analisados por meio de uma combinação de cromatografia em fase gasosa/ei-espectrometria de massa. Além disso foram extraídas e analisadas, durante a fermentação, amostras de controlo, cada uma de 600 μΙ de caldo de cultura com 800 μΙ de solução de extracção. Simultaneamente foram realizados controlos negativos (incubação do produto tóxico na ausência de células), nos quais não se verificou nenhuma degradação significativa do produto tóxico.

Para a análise por GC-MS foi aplicado, por pulverização, 1μΙ do extracto de acetato de etilo através de um sistema de aplicação a frio (Gerstel KAS-502) directamente numa coluna 30 m DP-1 semipolar (J & W Scientific Inc.), e

86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 11 cromatografado através de um gradiente (80-250°C, 10 °C/min). A detecção foi realizada de modo "sp/it/ess", com um espectrómetro de massa de bombardeamento de electrões Finnigan MAT312.

No caso da fermentação do microrganismo Halobacteríum CB1-H adaptado para triclorofenóis, não foram detectadas substâncias orgânicas cloradas depois de uma incubação de 7-8 dias sob condições aeróbias. Sob condições microaeróbias verificou-se uma degradação mais lenta. A figura 1 a mostra um cromatograma de fase gasosa do extracto orgânico de uma fermentação do Halobacteríum CBJ-H na presença de 2,3,4-triclorofenol (10 μΜ) após 0 dias. Na figura 1b vê-se que após uma incubação de 5 dias sob condições microaeróbias ocorreu uma degradação quase completa do 2,3,4-triclorofenol. A figura 2 mostra o espectro de massa de 2,3,4-triclorofenol (m/e = 1 96/198/200) e a figura 3 o espectro de massa de um presumível metabolito, a saber, o 3,4,5-tricloro-O-metilcatecol, identificado sob condições microaeróbias (m/e = 226/228/230).

Exemplo 3

Degradação de Lindan A degradação de Lindan foi realizada com o organismo Halobacteríum CB1-G na presença de 1 mM de Lindan. A preparação e análise de extractos de fermentação foram feitas como descritas no exemplo 2.

As figuras 4a e 4b mostram cromatogramas de fase gasosa dos extractos orgânicos de uma fermentação na presença de 1 mM de Lindan após 2 e 1 5 dias, respectivamente, sob condições aeróbias. Vê-se nitidamente uma diminuição do pico de Lindan. A figura 5 mostra o espectro de massa de Lindan (m/e = 288/290/292). A figura 6 mostra o espectro de massa de um presumível metabolito de Lindan, a saber, o 1,3,4,5,6-pentaclorociclo-hexeno, identificável sob condições microaeróbias (m/e = 252/254/256). 12 86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ

Exemplo 4

Degradação de DDT A degradação de 2,2-bis-(4-clorofenil)-1,1,1 -tricloroetano (DDT) foi realizada através de fermentação com o organismo Halobacterium CB1-K na presença de 1 mM de DDT, como descrita no exemplo 2. Também a preparação dos extractos e as análises foram realizados como descritos no exemplo 2.

As figuras 7a e 7b mostram cromatogramas de fase gasosa dos extractos orgânicos de uma fermentação na presença de 1 mM do DDT após 2 e 8 dias, respectivamente. Além do pico da DDT vê-se, na figura 7a, também o pico do metabolito 2,2-bis-(4-clorofenil)-1,1-dicloroetileno (DDE). Na figura 7b é ainda visível um outro metabolito (compare-se a figura 9). 0 cromatograma mostrado na figura 7a é proveniente de um extracto diluído 10 vezes por razões analíticas (concentração excessiva de DDT). De uma comparação dos cromatogramas das figuras 7a e 7b resulta que, com o aumento da duração da incubação, diminui a concentração de DDT no extracto e aparece um espectro alterado de metabolitos. A figura 8 mostra o espectro de massa de DDT (m/e = 352/354/356). A figura 9 mostra o espectro de massa de um outro presumível metabolito que aparece na fermentação microaeróbia, a saber, o 2-(4-clorofenil)-2-fenil-1,1-dicioroetileno (m/e = 282/284/286).

Exemplo 5

Em analogia aos processos descritos nos exemplos 2 a 4, foram ensaiados outros compostos orgânicos e estirpes de microrganismos.

Os resullados foram os seguintes:

As estirpes provenientes de Halobacterium CBI (DSM 11147) e Haloferax mediterranei foram particularmente apropriadas para a degradação de 2,3,6-triclorofenol, 2,4,6-tri-halogenofenol (halogéneo = flúor, cloro, bromo, 13 06 427 ΕΡ 0 941 137/ΡΤ iodo), 2,4,5-triclorofenol, 2,3,4-triclorofenol, 2,3,4-trifluorofenol, 2,3,5-triclorofenol, 2,3,5-trifluorofenol e 3,4,5-triclorofenol.

As estirpes provenientes de Halobacterium CB1 foram particularmente apropriadas para a degradação de Lindan.

As estirpes provenientes de Haloarcula hispanica e Haloferax gibbonsii foram particularmente apropriadas para a degradação de DDT, DDE e DDD.

As estirpes provenientes de Haloferax volcanii foram particularmente apropriadas para a degradação de fracções de cloroparafina.

As estirpes provenientes de Haloarcula californiae e Halorubrum saccharovorum foram particularmente apropriadas para a degradação de hidrocarbonetos bromados como, por exemplo, o éter decabromodifenílico e bis-2,2-(3,5-dibromo-4-hidroxifenil)propano.

As estirpes provenientes de Haloferax mediterranei e Halobacterium CB1 foram, sobretudo sob condições de fermentação microaeróbias, apropriadas para a degradação de penta-halogenofenol (halogéneo = cloro, flúor, bromo).

As estirpes provenientes de Haloferax mediterranei foram particularmente apropriadas para a degradação de 2,3,4,5-tetraclorofenol e 2,3,4,6-tetraclorofenol.

Lisboa, "t> -

Por HEIKO PATZELT

Claims

86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a degradação, pelo menos parcial, de compostos orgânicos halogenados, caracterizado por se colocar os compostos em contacto com Archaea halófilas ou com extractos ou componentes das mesmas, incubando-os sob condições em que ocorre a degradação dos compostos orgânicos.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se seleccionarem as Archaea halófilas de organismos dos géneros Haloarcula, Halobacterium, Halococcus, Haloferax, Halorubrum, Natronobacterium e Natronococcus.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se seleccionarem as Archaea halófilas de organismos dos géneros Haloarcula, Halobacterium, Haloferax e Halorubrum.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se utilizarem organismos do género Halobacterium.
5. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 - 4, caracterizado por se utilizarem organismos que foram sujeitos a um processo de selecção para adaptação a compostos orgânicos halogenados.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se utilizar um organismo seleccionado de Halobacterium CB1 (DSM 11147), Haloferax Hf-X1 (DSM 1 1795) e Haloarcula Hc-U2 (DSM 11794) ou um descendente dos mesmos adaptado a compostos específicos.
7. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-6, caracterizado por se utilizar um organismo que apresenta uma tolerância em relação aos compostos a degradar numa concentração no meio de, pelo menos, 10 μΜ.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se utilizar um organismo que apresenta uma tolerância em relação aos compostos a degradar numa concentração no meio de, pelo menus, 100 μΜ.

86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 2/4
9. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 - 8, caracterizado por os compostos a degradar serem seleccionados de compostos orgânicos contendo carbono, eventualmente hidrogénio e heteroátomos, assim como, pelo menos, um átomo de halogéneo.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por os compostos a degradar conterem, pelo menos, um átomo de cloro.
11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por os átomos de halogéneo estarem ligados a átomos de carbono alifáticos, aromáticos ou/e de olefinas.
12. Processo de acordo com uma das reivindicações 9-11, caracterizado por os compostos a degradar serem seleccionados de compostos aromáticos eventualmente poli-halogenados.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por os compostos a degradar serem seleccionados de fenóis, benzenos, dioxinas e furanos halogenados.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se degradar 2,4,6-tri-halogenofenol (halogéneo = flúor, cloro, bromo, iodo), 2,3,4-triclorofenol, 2,3,4-trifluorofenol, 2,3,5-triclorofenol, 2,3,6-triclorofenol, 2,4,5-triclorofenol, 3,4,5-triclorofenol, 2,3,4,5-tetraclorofenol, 2,3,4,6-tetraclorofenol ou/e penta-halogenofenol (halogéneo = flúor, cloro, bromo).
15. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se degradar 2-clorodibenzodioxina (2-MCDD), ou/e 1,2,3,4- tetraclorodibenzodioxina (1,2,3,4-TCDD).
16. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por se degradar DDT, DDE ou/e DDD.
17. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se degradar Liiidan (y-hexaclorociclo-hexano). ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ

3/4
18. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-17, caracterizado por se realizar a degradação na presença He suhstâncias solubilizantes.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por as substâncias solubilizantes serem seleccíonadas de ciclodextrinas, alquilglicósidos e colatos.
20. Processo de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado por se utilizarem as substâncias solubilizantes numa quantidade de, pelo menos, 0,01 equivalentes molares por mole de compostos a degradar.
21. Processo para a produção de Archaea halófilas adaptadas a compostos orgânicos halogenados, caracterizado por se escolher um organismo de partida que apresenta uma tolerância em relação a uma concentração previamente determinada de um ou vários compostos orgânicos halogenados seleccionados, e por se sujeitar este organismo de partida a um processo de selecção, obtendo-se um organismo adaptado que apresenta, comparado com o organismo de partida, uma tolerância ou/e capacidade de degradação mais elevadas em relação aos compostos seleccionados.
22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o processo de selecção compreender o plaqueamento do organismo de partida sobre um meio de cultura sólido na presença de compostos orgânicos halogenados, a identificação de um organismo ainda crescente na concentração seleccionada dos produtos tóxicos e, se for necessário, a repetição, uma ou mias vezes, deste procedimento, com concentrações crescentes dos produtos tóxicos.
23. Processo de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por o organismo adaptado obtido ser o Halobacterium CB1 (DSM 11147) ou um organismo com uma tolerância ou/e capacidade de degradação, pelo menos, igual. 86 427 ΕΡ Ο 941 137/ΡΤ 4/4
24. Processo de acordo com uma das reivindicações 21 - 23, caracterizado por se sujeitar o organismo adaptado a um outro processo de sclccção para aumento da tolerância ou/e capacidade de degradação em relação a compostos orgânicos halogenados específicos.
25. Organismo Archaea haiófilo adaptado a compostos orgânicos halogenados, que pode ser obtido através de um processo de acordo com uma das reivindicações 21-24.
26. Organismo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por ser Halobacterium CB1 (DSM 11147) ou um organismo com uma tolerância ou/e capacidade de degradação, pelo menos, igual em relação a compostos orgânicos halogenados.
27. Organismo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por ser Haloferax Hf-Xl (DSM 1 1 795) ou um organismo com uma tolerância ou/e capacidade de degradação, pelo menos, igual em relação a compostos orgânicos halogenados.
28. Organismo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por ser Ha/oarcu/a Hc-U2 (DSM 11794) ou um organismo com uma tolerância ou/e capacidade de degradação, pelo menos, igual em relação a compostos orgânicos halogenados. Lisboa, "3. ;!3V. £Jl Por HEIKO PATZELT - O AGENTE OFICIAL - O ApJUSTO

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERRO RA Ag. Of. Pr. Ind Rua c!ao Pioras. 74--4.° 1200-195 LISBOA