JP2001507567A

JP2001507567A - 好塩アルカエアによるハロゲン化炭化水素の分解

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Publication number: JP2001507567A
Application number: JP51530298A
Authority: JP
Inventors: パッツェルトハイコ; ケスラーブリギッテ; エスターヘルトディーター
Original assignee: パッツェルトハイコ
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-29
Publication date: 2001-06-12
Also published as: EP0941137A1; DK0941137T3; DE59704259D1; ATE203922T1; DE19639894A1; AU4706697A; GR3036404T3; ES2159119T3; WO1998013105A1; PT941137E; EP0941137B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、好塩アルカエア、その抽出物または成分によってハロゲン化有機化合物を少なくとも部分的に分解する方法に関する。更に、ハロゲン化化合物に適応された微生物の取得方法ならびにその方法によって得ることができる微生物が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】好塩アルカエアによるハロゲン化炭化水素の分解本発明は、好塩アルカエア、その抽出物または成分によってハロゲン化有機化合物を少なくとも部分的に分解する方法に関する。更に、ハロゲン化化合物に適応された微生物の取得方法ならびにその方法によって得ることができる微生物が開示されている。ハロゲン化炭化水素、殊に植物保護剤および工業廃棄物からの残留物は、毒性および存続性のために世界的規模で増大する環境問題を生じている。従来の廃棄方法は、極めて費用のかかる土壌抽出およびゴミ捨て場での封印された毒性物質の最終貯蔵もしくは特殊な高温炉内での燃焼を含んでいる。ゴミ捨て場での最終貯蔵の際の問題は、殊に現在、毒性物質の永続的な封印が実際に保証されうるか全く確信が持てないことにある。最適でない条件下での燃焼の場合には、極めて毒性の物質、例えばダイオキシンおよびジベンゾフランが形成される。此処１５年間に亘って塩素化炭化水素を生物学的に分解するという一連の微生物の能力についての研究がなされてきた（FetznerおよびLingens，Microbiologi cal Rewievs 58(1994)，641-685の概括的刊行物参照）。一般に、シュードモナス（Pseudomonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ハイフォミクロビウム（Hyphomicrobium）属およびメチロバクテリウム（Methylobacte rium）属が重要である試験された微生物は、それぞれのハロゲン化炭化水素を僅かな効率および僅かな濃度で多くの場合に不完全に形質転換するにすぎない。従って、公知技術水準の欠点を少なくとも部分的に排除する、ハロゲン化有機化合物を分解するための方法を提供することが必要とされている。殊に、この方法は、非毒性の最終生成物へのできるだけ完全な分解を可能にすることができなければならない。意外なことに、好塩アルカエアは、ミリモルの濃度までのハロゲン化有機化合物に適応しうることが確認された。この微生物は、ハロゲン化化合物のハロゲン原子を、毒性の代謝産物を増加させることなしに、特に例えば無機塩のような無機化合物に分解する状態にある。この分解は、例示的に液状培養物中の多数の核異性体のトリクロルフェノール、リンダンおよびＤＤＴについての発酵処理液からの有機抽出物の組合わされたガスクロマトグラフィー−質量スペクトル分析によって証明されることができた。全ての分解経路については、それぞれ少なくとも１つの中間生成物を質量スペクトルにより同定することができた。ハロゲン化有機化合物の分解は、完全な細胞、細胞抽出液、細胞画分または単離された細胞成分、例えば酵素によって行なうことができる。また、この分解は、高級塩条件下または有機溶剤の存在下で行なうこともできる。好塩アルカエアによるハロゲン化有機化合物の本発明による分解は、存在する方法の本質的な改善を表わす。ハロゲン化有機化合物の高い濃度に対する好塩アルカエアの高い耐性ならびにこの化合物を分解する能力は、異質物質、例えばガレン酸および抗生物質に対する好塩細菌類の公知の敏感度の点で著しく驚異的なものである（例えば、Kamekura他、Appl．Environ．Microbiol．54(1988)，990- 995およびOren，Arch．Microbiol．165(1996)，354-358参照）。従って、本発明の対象は、ハロゲン化有機化合物を好塩アルカエアまたはその抽出液もしくは成分と接触させ、かつこの有機化合物の分解が生じる条件下で恒温保持することによって特徴付けられる、ハロゲン化有機化合物を少なくとも部分的に分解する方法である。好塩アルカエアは、エウリアルカエオタ（Euryarchaeota）の亜種である（例えば、Woese，Microbilogical Rev．58(1994)，1-9参照）。特に、この表記は、ハロバクテリアレス（Halobacteriales）目からの微生物および特に有利にハロバクテリアケアエ（Halobact eriaceae）科であると理解される。適当な属の例は、ハロアルクラ（Haloarcula ）、ハロバクテリウム（Halobacterium）、ハロコッカス（Halococcus）、ハロフェラックス（haloferax）、ハロルブルム（Halorubrum）、ナトロノバクテリウム（Natronobacterium）およびナトロノコッカス（Natronococcus）である。特に好ましくは、ハロアルクラ（Haloarcula）属、ハロバクテリウム（Halobact erium）属およびハロフェラックス（haloferax）属の微生物が使用される。ハロアルクラ（Haloarcula）属からの適当な種の例は、H.hispanica、H.japon ica、H.marismortui、H.vallismortis、H.californiaeおよびH.sinaiiensisである。ハロバクテリウム（Halobacterium）属からの適当な種は、H.salinarium、H .cutirubum、H.trapanicum、H.sodomense、H.lacusprofundis、H.distributumおよびAmoebobacter morrhuaeである（Torrebalanca，System．Appl．Microbiol．８(1986)，89-99）。ハロコッカス（Halococcus）属からの適当な種は、H.morrh uae、H.turkmenicusおよびH.saccharolyticusである。ハロフェラックス（Halof erax）属からの適当な種は、H.denitrificans、H.mediterranei、H.gibbonsiiおよびH.volcaniiである。ハロルブルム（Halorubrum）属からの適当な種は、H.sa ccharovorumである。ナトロノバクテリウム（Natronobacterium）属からの適当な種は、N.gregoryi、N.magadiiおよびN.pharaonisである。ナトロノコッカス（Natronococcus）属からの１つの適当な種は、N.occultus である。微生物の分級に関しては、別記しない限り、ティンダール（Tindall）の概括的刊行物（The Procaryonts,第１巻(1991)，768-808）またはＤＳＭＺ（オンラインカタログ：http://www.gbf-braunschweig.de/DSMZ/species/archaea. htm）の分級に指摘されている。ハロゲン化有機物質を分解するための好塩アルカエアの天然に由来する数多くの菌種が適当であるとしても、特にハロゲン化有機化合物へ適応させるための付加的な選択処理が行なわれるような微生物が使用される。このために、最初に一定のハロゲン化物質、例えばクロルフェノールまたはリンダンに対して、例えば１μＭ、１０μＭまたは１００μＭの濃度で成長を示す、天然に由来する微生物が選択される。この菌株は、出発物質として、例えば上昇する濃度の毒性物質、例えばリンダンまたはクロルベンゾールの存在下での平板培養によって行なうことができる適応処理のために使用される。このような適応処理によって、天然の出発微生物に対して本質的に高い耐性およびハロゲン化有機物質に対する分解効率を示す微生物が得られる。このような適応された微生物の１例は、ブダペスト条約の規約により、１９９６年１０月９日にドイチェン・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン社（Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture n GmbH）,Mascheroder Weg1b，38124 Braunschweig在、に登録番号ＤＳＭ１１１４７で寄託された菌株ハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ１である。引続き、このような適応された微生物は、さらに選択処理を行なうことができ、この場合特殊な化合物、例えばトリクロルフェノール、ＤＤＴまたはリンダンに対する耐性は、再び高められる。更に、こうして得られる、適応された出発微生物の子孫は、前記化合物の分解のために使用されることができる。適当な適応された微生物の他の例は、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ha loferax mediterranei）種の菌株から生じかつ１９９７年９月２４日に登録番号ＤＳＭ１１７９５でＤＳＭＺに寄託された菌株Ｈｆ-Ｘ１およびハロアルクラ・カリフォルニアエ（Haloarcula californiae）種の菌株から生じかつ１９９７年９月２４日に登録番号ＤＳＭ１１７９４でＤＳＭＺに寄託された菌株Ｈｃ−Ｕ２である。Ｈｆ−Ｘ１は特に高度に塩素化されたフェノール、例えばトリクロルフェノール、テトラクロルフェノールおよびペンタクロルフェノールの分解のために好適である。Ｈｃ−Ｕ２は、特に例えば難燃剤のビス−２，２−（３，５−ジブロム−ヒドロキシフェニル）−プロパンのような臭素化炭化水素の分解のために好適である。先に記載されたような適当な天然の微生物の選択および／または先に記載された選択処理の使用によって、分解すべき化合物もしくは少なくとも１０μＭ、特に少なくとも５０μＭ、特に有利に少なくとも１００μＭおよび多くの場合に有利に少なくとも１ｍＭの濃度で分解すべき化合物に対して耐性を有する微生物を準備することができる。分解すべき化合物は、特に炭素、場合によっては水素およびヘテロ原子、例えばＯ、Ｎ、ＳおよびＰならびに少なくとも１つのハロゲン原子を含有する有機化合物から選択される。特にこの化合物は、少なくとも１つの弗素原子、沃素原子、臭素原子または／および塩素原子、特に有利に少なくとも１つの弗素原子、臭素原子または／および塩素原子を含有する。本発明による分解方法によって、有機的に結合されたハロゲン原子は、無機ハロゲン化物に変換される。ハロゲン原子は、多種多様の炭素原子、例えば脂肪族（線状または環状）炭素原子、芳香族炭素原子または／およびオレフィン系炭化水素に結合していてもよい。特に好ましくは、分解すべき化合物は、場合によっては塩素化されたポリ芳香族化合物、例えば塩素化フェノールもしくはベンゾールまたは芳香族ダイオキシンもしくはフラン、例えばジベンゾダイオキシンもしくはジベンゾフラン、例えば２，３，４−トリクロルフェノール、２，３，５−トリクロルフェノール、２，４，５−トリクロルフェノール、２−クロルジベンゾダイオキシン（２−ＭＣＤＤ）または１，２，３，４−テトラクロルジベンゾダイオキシン（１，２，３，４−ＴＣＤＤ）から選択される。適当な化合物の別の例は、脂肪族またはオレフィン系炭素原子および芳香族炭素原子に結合している多数のハロゲン原子、例えばＤＤＴまたはその分解生成物ＤＤＥを含む。なおもう１つの好ましい種類の分解すべき化合物は、塩素化されたポリ脂環式化合物、例えばリンダン（γ− ヘキサクロルシクロヘキサン）である。分解すべき化合物の他の特殊な例は、２，３，６−トリクロルフェノール、２，４，６−トリハロゲンフェノール（この場合、ハロゲン＝弗素、塩素、臭素、沃素）、クロルベンゾール、塩化ベンジル、フェニルエチルクロリド、ヘキサクロルシクロヘキサン、例えばα−ＨＣＨ、β−ＨＣＨ、γ−ＫＣＨおよびδ−ＨＣＨ、２，３，４−トリフルオルフェノール、２，３，５−トリフルオルフェノール、２，２−ビス−（４−クロルフェニル）−１，１−ジクロルエタン（ＤＤＤ）、クロルパラフィン画分、デカブロムジフェニルエーテル、ペンタハロゲンフェノール（この場合、ハロゲン＝塩素、弗素、臭素）、ビス−２，２−（３，５−ジブロム−４−ヒドロキシフェニル）−プロパン、３，４，５−トリクロルフェノール、２，３，４，５−テトラクロルフェノール、２，３，４，６−テトラクロルフェノール、アトラジン、アルドリン、ジエルドリン、エンドリンおよびその誘導体、例えばエンドリン−アルデヒドまたはエンドリン−ケトン、エンドスルファンＩおよびＩＩ、エンドスルファン−スルフェート、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシドおよびメトキシクロルならびに記載された化合物の複数のものを含有する混合物である。特に親油性の毒性物質、例えば２−ＭＣＤＤ、１，２，３，４−ＴＣＤＤまたはデカブロムジフェニルエーテルは、溶解補助試薬の添加によって生物使用可能性を劇的に高めることができ、かつ分解を著しく促進させることができる。このような試薬の例は、シクロデキストリン、例えばβ−またはγ−シクロデキストリン、例えばヘプタキス−２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリンである。同様に、溶解補助試薬として、例えばアルキルグリコシドまたはコラートの種類の界面活性剤を使用することができる。溶解補助試薬は、特に成長する培養物の毒性物質のモル当量に対して少なくとも０．０１モル当量、特に有利に０．１〜１モル当量の量で添加される。例えば、ハロアルクラ（Haloarcula）属、殊にH.hispanica、またはハロフェラックス（haloferax）属、殊にHaloferox gi bbonsiiの微生物から生じる菌株は、このような溶解補助試薬の高い濃度に対して特に耐性を有している。本発明による分解は、好気性、微好気性または嫌気性の条件下で行なうことができる。微好気性条件とは、空気室を脱ガスしない封印された反応容器中での発酵のことである。発酵の開始時には、酸素が使用されるが、しかし、数時間後には、もはや殆んど酸素は使用されない。微生物の成長は、この微好気性条件下で菌株に応じてアルギニンまたは／および硝酸塩を添加することによって改善されることができる。微好気性分解のためには、なお光合成により活性のバクテリオロドプシンを提供する菌株、例えば菌株ＣＢ１が特に好ましい。この場合、同時に光を照射した際には、好気性発酵条件下の場合と類似の高い細胞密度を達成させることができる。こうして、特定の毒性物質、例えばペンタクロルフェノールの場合には、少なくともある程度だけ耐性および分解速度を高めることができる。更に、殊に極めて毒性の物質の場合の分解反応の空時収量は、既に高い細胞密度の場合にパルス食餌または物質の添加によって改善することができる。本発明の他の対象は、ハロゲン化有機化合物に適応された好塩アルカエア微生物を製造するための方法である。この場合には、好塩アルカエア出発微生物が選択され、この場合この微生物は、既に１種以上の選択されたハロゲン化有機化合物の所定の濃度に対して耐性を有し、また、この出発微生物には、選択処理が行なわれ、その際に出発微生物に対して選択された化合物に関連する高められた耐性または／および分解効率を有する適応された微生物が得られる。この分解処理は、特に毒性物質の存在下での固体培地上での微生物の平板培養、各毒性物質の際になお成長する微生物の同定および場合によっては毒性物質の濃度が上昇する際の前記方法の１回以上の繰返しを含む。この一次選択の際の毒性物質として、例えばリンダンまたはクロルフェノールを使用することができる。こうして得ることができる適応された微生物の例は、ハロバクテリウム（Halo bacterium）ＣＢ１（DSM １1147）、ハロフェラックス（haloferax）Ｈｆ−Ｘ１（DSM 11795）、ハロアルクラ（Haloarcula）Ｈｃ−Ｕ２(DSM 11794)または選択されたハロゲン化有機化合物、例えばトリクロルフェノール、ＤＤＴまたはリンダンに対して少なくとも同様の耐性または／および分解効率を有する微生物である。引続き、適応された微生物には、特殊なハロゲン化有機化合物に関連して耐性または／および分解効率を再び上昇させるためにもう１つの選択処理を行なうことができ、この場合には、特に一定の濃度の特殊なハロゲン化有機化合物の存在下で微生物を培養し、この培養により化合物の濃度が高い際に生き残っている細胞を１つ以上の他の培養過程に施こす。この二次選択処理は、特に液状培地中で実施される。更に、本発明のもう１つの対象は、ハロゲン化有機化合物に適応されかつ先に記載された選択方法によって得ることができる好塩アルカエア微生物である。ハロゲン化有機化合物を分解するための本発明による方法は、完全な細胞ならびにこの細胞の抽出液または成分、例えば酵素調製物を用いて実施されることができる。好塩アルカエアからの抽出液または酵素の調製、単離または濃度の増加は、例えばツァン（Zhang）およびプールター（Poulter），J．Org．Chem．58(1 993)，3919-3922、ケルシャー（Kerscher）およびエスターヘルト（Oesterhelt ），J．Biochem．116(1981)，587-594ならびにダスサルマ（S．DasSarma）およびフライシュマン（E.M．Fleischmann）（編）Archaea：A laboratory manual． Halophiles．xvi-280p．Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，Ne w York，USA，1995およびリュー（Ryu）他，Enzyme Microb．Technol．16(1994) ，266-275に記載されている。当業者は、抽出液、酵素調製物または酵素の製造のために前記刊行物中に記載された一般的方法を用いることができる。細胞、抽出液またはその成分は、本発明による分解法で溶解された形で使用されてもよいが、しかし、不動態化された形で使用されることもできる。更に、多数の微生物の細胞、抽出液および成分を組み合わせることもできる。この方法は、殊に数多くのハロゲン化化合物が同時に存在する場合に推奨されてもよい。分解は、特に細胞、抽出液またはその成分が十分な分解効率を示すような条件下で実施される。この分解は、水性媒体、有機媒体またはこれらの混合物中で行なうことができる。分解温度は、幅広い範囲、例えば２０〜６０℃に亘って変動されることができる。更に、好気性の条件下で、例えば通気により分解を実施することは、有利である。例えば、分解は、細胞、細胞抽出液または細胞成分を不動態化された形で含む生物反応器中で実施されることができる。排水流中の分解すべき有機化合物は、この生物反応器中に導入され、望ましい分解度を達成するために十分な時間で反応器中に維持される。引続き、特に本質的に有機的に結合したハロゲン原子を含有しない、生物反応器から導出される排水流は、廃棄されることができ、例えば清澄装置中に導入されることができる。更に、本発明は、次の実施例によって詳説される。例１適応された微生物の製造ハロバクテリウム（Halobacterium）属のH.trapanicum、H.salinariumおよびH .cutirubumの１０個の分離片を、寒天板上でクロルベンゾールまたはリンダンの存在下で照射を用いてかまたは照射なしに０．１μＭ〜１０ｍＭの濃度で恒温保持することによって、ハロゲン化有機化合物に対する耐性について試験した。H. salinariumおよびH.trapanicumの分離片からそれぞれ２個ずつを生じさせた、１０個の試験された菌株の中の４個の菌株は、１０μＭの濃度になるまで成長することができた。 H.trapanicumから生じた菌株の中の１個の菌株は、微生物のハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ１（DSM 11147）であった。特殊な化合物、例えばトリクロルフェノール、ＤＤＴまたはリンダンにさらに適応させるために、ハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ１にもう１つの選択処理を行なった。このために、ＣＢ１を液状培養物（例２の記載と同様の発酵条件）中でそれぞれ１μＭの濃度の毒性物質の存在下で培養し、培養物の最終的な細胞密度が毒性物質の不在下で培養された比較培養物の細胞密度に到達するまで接種した。引続き、毒性物質の濃度を１０μＭに上昇させた。この処理を、毒性物質の最大許容濃度または溶解性の限界が達成されるまで相応して繰り返した。この場合には、特殊な化合物に適応されているＣＢ１の子孫が得られた。即ち、ＣＢ１−Ｈは、５０μＭの最大濃度になるまで２，３，４−トリクロルフェノールに適応されている。菌株ＣＢ１−ＧおよびＣＢ１−Ｋは、培地中の前記毒性物質の溶解限界になるまでリンダンもしくはＤＤＴに適応されている。菌株ＣＢ１−ＮおよびＣＢ１−Ｏは、最大濃度が１００μＭを越えるまで２−クロルジベンゾダイオキシンもしくは１，２，３，４−テトラクロルジベンゾダイオキシンに適応されている。また、ハロアルクラ（Haloarcula）属およびハロフェラックス（haloferax）属の分離片は、培地中のリンダン、ＤＤＴおよびダイオキシンに適応させることができた。ハロフェラックス・メディテラネイ（Haloferaxmediterranei）から生じた菌株の中の１つは、トリクロルフェノール、テトラクロルフェノールおよびペンタクロルフェノールの分解のために適している微生物Ｈｆ−Ｘ１（DSM 11795）であった。ハロアルクラ・カリフォルニアエ（Haloarculacaliforniae）から生じた菌株の中の１つは、特に臭素化炭化水素の分解に適している微生物Ｈｃ−Ｕ２（DSM 11794）であった。例２トリクロルフェノールの分解細胞を、接種培養物１ｍｌで接種した１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中の培養物３５ｍｌとして、適当な成長媒体（ＮａＣｌ２５０ｇ）ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ２０ｇ）クエン酸三ナトリウム３ｇ、ＫＣｌ２ｇ、細菌学的ペプトンの酸化物１０ｇ、Ｈ₂Ｏ１ｌ）中で４０℃で好気性または微好気性条件下で培養した。このフラスコに、微少量のエタノールまたはイソプロパノール中に溶解した毒性物質２，３，４−、２，３，５−または２，４，５−トリクロルフェノールを発酵の開始時に添加した。毒性物質の最終濃度は、５０μＭであった。４０℃で振盪機上で１００ｒｐｍで７〜１０日間の恒温保持後、処理培養物全部を酢酸エチルエステル中の５％の酢酸溶液２×２０ｍｌを用いて抽出した。このフラスコを再び同じ抽出液で洗浄した。合わせた有機抽出液を場合によっては窒素流中での濃縮後に組み合わされたガスクロマトグラフィー／ｅｉ−質量分析法を用いて分析した。更に、発酵の間に処理培養物それぞれ６００μｌの対照試料を抽出液８００μｌを用いて抽出し、かつ分析した。これと同時に、不利な対照試験（細胞の不在下での媒体中の毒性物質の恒温保持）を実施し、この場合には、毒性物質の重要な分解は見出されなかった。ＧＣ−ＭＳ分析のために、酢酸エステル抽出液１μｌを常温放出系（Gestel K AS-502）を介して直接に半極性の３０ｍＤＰ−１−カラム（J & W Scientific Inc.）上に噴射し、１つの勾配（８０〜２５０℃）１０℃／分）に亘ってクロマトグラフィー処理した。フィンニガン（Finnigan）ＭＡＴ３１２電子衝突型質量分析計を用いての検出により、”分断がない（splitless）”ことを生じた。トリクロルフェノールに適応された微生物のＣＢ１ −Ｈを発酵させる場合には、７〜８日後の恒温保持後に好気性条件下で塩素化有機物質は、もはや検出されることができなかった。微好気性条件下では、緩徐な分解が見い出された。第１ａ図は、２，３，４−トリクロルフェノール（１０μＭ）の存在下でのハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ１−Ｈの発酵０日後の有機抽出液のガスクロマトグラムを示す。第１ｂ図からは、微好気性条件下で５日間の恒温保持後に２，３，４−トリクロルフェノールの殆ど完全な分解が生じたことが明らかになる。第２図は、２，３，４−トリクロルフェノールの質量スペクトルを示し（ｍ／ｅ＝１９６／１９８／２００）、第３図は、微好気性条件下で同定された推定上の代謝産物、即ち３，４，５−トリクロル−Ｏ−メチルベンズカテキンの質量スペクトルを示す（ｍ／ｅ＝２２６／２２８／２３０）。例３リンダンの分解リンダンの分解を、微生物のハロバクテリウム(Halobacterium)ＣＢ１−Ｇを用いてリンダン１ｍＭの存在下で実施した。発酵抽出液の製造および分析は、例２の場合と同様に行なわれた。第４ａ図および第４ｂ図は、好気性条件下でリンダン１ｍＭの存在下での発酵２日後もしくは１５日後の有機抽出物のガスクロマトグラムを示す。リンダンのピークの明らかな減少を認めることができる。第５図は、リンダンの質量スペクトルを示す（ｍ／ｅ＝２８８／２９０／２９２）。第６図は、リンダンの微好気性条件下で検出可能な推定上の代謝産物、即ち１，３，４，５，６−ペンタクロルシクロヘキサンの質量スペクトルを示す（ｍ／ｅ＝２５２／２５４／２５６）。例４ＤＤＴの分解２，２−ビス（４−クロルフェニル）−１，１，１−トリクロルエタン（ＤＤＴ）の分解を、例２の記載と同様にＤＤＴ１ｍＭの存在下でハロバクテリウム (Halobacterium)ＣＢ１−Ｋを用いての発酵によって実施した。また、抽出液の製造および分析は、例２の記載と同様に行なった。第７ａ図および第７ｂ図は、ＤＤＴ１ｍＭの存在下で発酵２日後もしくは８日後の有機抽出液のガスクロマトグラムを示す。第７ａ図の場合には、ＤＤＴのピークとともに、代謝産物２，２−ビス−（４−クロルフェニル）−１，１−ジクロルエチレン（ＤＤＥ）のピークも確認することができる。第７ｂ図の場合には、なおもう１つの代謝産物（第９図参照）を確認することができる。第７ａ図に示されたクロマトグラムは、分析的理由（高すぎるＤＤＴ濃度）から１０分の１に希釈された抽出液に由来する。第７ａ図と第７ｂ図のクロマトグラムを比較することにより、恒温保持時間が増大するにつれてＤＤＴの濃度が減少し、かつ変化された代謝産物スペクトルが生じることが明らかになる。第８図は、ＤＤＴの質量スペクトルを示す（ｍ／ｅ＝３５２／３５４／３５６）。第９図は、微好気性発酵の際に生じる他の推定上の代謝産物、即ち２−（４ −クロルフェニル）−２−フェニル−１，１−ジクロルエチレンの質量スペクトルを示す（ｍ／ｅ＝２８２／２８４／２８６）。例５例２〜４に記載された方法と同様に、他の有機化合物および微生物を試験した。結果は、次の通りであった：ハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ１（DSM １1147）およびハロフェラックス・メディテラネイ（Haloferaxmediterranei）から生じた菌株は、特に２，３，６−トリクロルフェノール、２，４，６−トリハロゲンフェノール（ハロゲン＝弗素、塩素、臭素、沃素）、２，４，５−トリクロルフェノール、２，３，４−トリクロルフェノール、２，３，４−トリフルオルフェノール、２，３，５−トリクロルフェノール、２，３，５−トリフルオルフェノールおよび３，４，５−トリクロルフェノールの分解に適していた。ハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ１から生じた菌株は、特にリンダンの分解に好適であった。ハロアルクラ・ヒスパニカ（Haloarcula hispanica）およびハロフェラックス・ギッボンシイ（Haloferax gibbons）から生じた菌株は、ＤＤＴ、ＤＤＥおよびＤＤＤの分解に適していた。ハロフェラックス・ボルカニイ（Haloferax volcani）から生じた菌株は、特にクロルパラフィン画分の分解に適していた。ハロアルクラ・カリフォルニアエ（Haloarculacaliforniae）およびハロルブルム・サッカロボルム（Halorubrum saccharovoru）から生じた菌株は、特に臭素化炭化水素、例えばデカブロムジフェニルエーテルおよびビス−２，２−（３，５−ジブロム−４−ヒドロキシフェニル）−プロパンの分解に好適であった。およびハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ−１から生じた菌株は、殊に微好気性発酵条件下でペンタハロゲンフェノール（ハロゲン＝塩素、弗素、臭素）の分解に適していた。ハロフェラックス・メディテラネイ（Haloferaxmediterranei）から生じた菌株は、特に２，３，４，５−テトラクロルフェノールおよび２，３，４，６−テトラクロルフェノールの分解に適していた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．ハロゲン化有機化合物を少なくとも部分的に分解する方法において、この化合物を好塩アルカエアまたはその抽出液もしくは成分と接触させ、かつこの有機化合物の分解が生じる条件下で恒温保持することを特徴とする、ハロゲン化有機化合物を少なくとも部分的に分解する方法。２．好塩アルカエアをハロアルクラ（Haloarcula）属、ハロバクテリウム（Halo bacterium）属、ハロコッカス（Halococcus）属、ハロフェラックス（haloferax ）属、ハロルブルム（Halorubrum）属、ナトロノバクテリウム（Natronobacteri um）属およびナトロノコッカス（Natronococcus）属の微生物から選択する、請求項１記載の方法。３．好塩アルカエアをハロアルクラ（Haloarcula）属、ハロバクテリウム（Halo bacterium）属、ハロフェラックス（haloferax）属およびハロルブルム（Haloru brum）属の微生物から選択する、請求項２記載の方法。４．ハロバクテリウム（Halobacterium）属からの微生物を使用する、請求項３記載の方法。５．ハロゲン化有機化合物への適応のために選択処理を行なった微生物を使用する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。６．ハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ１（DSM 11147）、ハロフェラックス（Haloferax）Ｈｆ−Ｘ１（DSM 11795）およびハロアルクラ（Haloarcula）Ｈｃ−Ｕ２（DSM 11794）、または特殊な化合物に適応された前記微生物の子孫から選択された微生物を使用する、請求項５記載の方法。７．媒体中の少なくとも１０μＭの濃度で分解すべき化合物に対して耐性を有する微生物を使用する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。８．媒体中の少なくとも１００μＭの濃度で分解すべき化合物に対して耐性を有する微生物を使用する、請求項７記載の方法。９．分解すべき化合物を、炭素、場合によっては水素およびヘテロ原子ならびに少なくとも１つのハロゲン原子を含有する有機化合物から選択する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。１０．分解すべき化合物が少なくとも１つの塩素原子を含有する、請求項９記載の方法。１１．ハロゲン原子が脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素または／およびオレフィン系炭化水素に結合する、請求項９または１０に記載の方法。１２．分解すべき化合物を場合によってはポリハロゲン化芳香族化合物から選択する、請求項９から１１までのいずれか１項に記載の方法。１３．分解すべき化合物をハロゲン化フェノール、ベンゾール、ダイオキシンおよびフランから選択する、請求項１２記載の方法。１４．２，４，６−トリハロゲンフェノール（ハロゲン＝弗素、塩素、臭素、沃素）、２，３，４−トリクロルフェノール、２，３，４−トリフルオルフェノール、２，４，５−トリクロルフェノール、２，３，６−トリクロルフェノール、２，４，５−トリクロルフェノール、３，４，５−トリクロルフェノール、２，３，４，５−テトラクロルフェノール、２，３，４，６−テトラクロルフェノールまたは／およびペンタハロゲンフェノール（ハロゲン＝弗素、塩素、臭素）を分解する、請求項13記載の方法。１５．２−クロルジベンゾダイオキシン（２−ＭＣＤＤ）または／および１，２，３，４−テトラクロルジベンゾダイオキシン（１，２，３，４−ＴＣＤＤ）を分解する、請求項１３記載の方法。１６．ＤＤＴ、ＤＤＥまたは／およびＤＤＤを分解する、請求項１２記載の方法。１７．リンダン（γ−ヘキサクロルシクロヘキサン）を分解する、請求項１１記載の方法。１８．溶解を補助する物質の存在下に分解を実施する、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法。１９．溶解を補助する物質をシクロデキストリン、アルキルグリコシドおよびコラートから選択する、請求項１８記載の方法。２０．溶解を補助する物質を分解すべき化合物１モル当たり少なくとも０．０１モル当量の量で使用する、請求項１８または１９に記載の方法。２１．ハロゲン化有機化合物に適応された好塩アルカエアを製造する方法において、１種以上の選択されたハロゲン化有機化合物の所定の濃度に対して耐性を有する出発微生物を選択し、この出発微生物を選択処理し、その際に出発微生物に対して選択された化合物に関連する高められた耐性または／および分解効率を有する適応された微生物が得られることを特徴とする、ハロゲン化有機化合物に適応された好塩アルカエアを製造する方法。２２．選択処理がハロゲン化有機化合物の存在下での固体培地上での出発微生物の平板培養、選択された毒性物質濃度の際になお成長する微生物の同定および場合によっては毒性物質の濃度が上昇する際の前記方法の１回以上の繰返しを含む、請求項２１記載の方法。２３．適応された微生物としてハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ１（DSM 11147）または少なくとも同様の耐性または／および分解効率を有する微生物が得られる、請求項２１または２２に記載の方法。２４．適応された微生物に、特殊なハロゲン化有機化合物に関連して耐性または／および分解効率を上昇させるためにもう１つの選択処理を行なう、請求項２１から２３までのいずれか１項に記載の方法。２５．請求項２１から２４までのいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、ハロゲン化有機化合物に適応された好塩アルカエア微生物。２６．ハロバクテリウム（Halobacterium）ＣＢ１（DSM 11147）またはハロゲン化有機化合物に関連して少なくとも同様の耐性または／および分解効率を有する微生物である、請求項25記載の微生物。２７．ハロフェラックス（Haloferax）Ｈｆ−Ｘ１（DSM 11795）またはハロゲン化有機化合物に関連して少なくとも同様の耐性または／および分解効率を有する微生物である、請求項25記載の微生物。２８．ハロアルクラ（Haloarcula）Ｈｃ−Ｕ２（DSM 11794）またはハロゲン化有機化合物に関連して少なくとも同様の耐性または／および分解効率を有する微生物である、請求項２５記載の微生物。