PT93547A - Equipamento e metodo de dosagem aplicaveis a celulas completas - Google Patents

Description

0 presente invento dis respeito a um equipamento e a um método de dosagem utiUsando este equipamento, para a dosagem de receptores membranários característicos de populações ou sub—po— pulações de células» 0 método de dosagem s o equipamento correspondente são igualmente destinados a dosagem das próprias células por intermédio da dosagem dos seus receptores de superfície» Estas dosagens são aplicáveis ao diagnóstica»· fazem

Os receptores de superfície ou parte dos marcadores de superfície receptores membranários celulares assim como os antigénios de uma estrutura capas de se receptor» Um superfície» Um receptor membranário de uma célula é macromo 1 acu 1 ar inserida na membrana, de uma. célula e ligar a um ligando específico característico deste receptor membranário pode assim ser considerado como um antigénxo e,, como tal., pode—se ligar a um anticorpo específico»

Os receptores membranários de ume. célula são caracts-rísticos de uma população celular ou parque eles estejam presentes para essa população em condições normais de vida da célula», olu porque eles foram expressos à superfície da célula por intervenção de um factor endógeno ou exógeno e marcam assim quer um estado de diferenciação, quer um estado fisiológico da célula em questão. 0 conhecimento dos antigénios ou marcadores de superfície celular tem feito.enormes progressos com a regulação da hibridação linfocitária e a descoberta dos anticorpos monoclonais por KOEHLER et MILSTEIN, (Nature, 1975, 256, 495-497)= Os anticorpos monoclonais têm nomeadamenie permitido pôr em evidência e analisar os marcadores de superfície ou antigénios membranários de células das origens mais variadas» As caracterizações procuradas dirigem-se principalmente a marcadores de tecido ou de orgão,, .1 a marcadores tís estados de diferenciação ou. de activaçSo de células normais e a identificação ou tipificação de células nurjuais uu uanutíra^. Um dorazriia de aplicação particularmente importante é o estudo das linhagens celulares da hematopoese l3 ranu 1 oc i tár ia, monoc i tária, í e r i fc r oc i t á r i a, ineg ac a r i oc i tá r i a, linfocitária)»

Assxsíí;i por exemplo os anticorpos monoclonais permitiram precisar as caracteristicas de superfície respectivas dos linfé-

eitos T '<* Os marcadores correr ponoentes sozinhos ou em comhi· espscis- nação identificam os estádios de diferenciação e de lização luncional dos linfócildsc Por convenção internacional, os marcadores de superfície dos. leucócitos humanos têm sido classificados em grupos ou classes de diferenciação (CD) definidos aquando do "Sous-Comité IVIS-OMS», 1984 e descritos no Bulletin G05E .1 Ur*Cj£ã.nXSS.ilXDTí PlOOcJlãlB de 1¾ 3-5.Π*Cê‘i! r, 1 \ *Z } Oj^T— À medida que as pesquisas progridem, uma crescente proporção destes antigénios revela-ss serem moléculas funcionais e em particular receptores de ligandos específicos,

Os receptores localizados à superfície das células são detectados classicamente por fixação dos ligandos radiomaresdos correspondentes,. Estes receptores são frequentemente receptores hormonais cujos ligandos são hormonas.

Os ligandos- radiomarcados são comerciais ou são preparados de acordo com os métodos conhecidos <F,C, 8REENWQ0D, W,M, HUNTER et Coll„, Biochem» J., 1963, 89, 114), A imunocaptura de células sobre um suporte sólido é descrita no pedido de patente WO 86/02091 no qual o objectivo é eliminar as células indesejáveis nas amostras de medula óssea destinada a transplantações. Neste pedido de patente, a captura ί

das células é realizada sobre microesferas fiuBuâbtss e necessita que o anticorpo utilizado seja religado ao suporte sólido por uma estrutura macromolecuiar complexa designada rede/reié, capaz de assegurar uma orientação priveiigiada do anticorpo em relação à do antigénio celular correspondente. Neste pedida nlo é indicada qualquer aplicação da técnica à dosagem quantitativa de um antigénio. A imunocaptura de células é igualmente descrita no pedido de pedido, o quais pe designada patente WO 84/03151 para uma aplicação analítica. Neste objectivo é a identificação dos grupos tecidulares aos rtencem as células examinadas (operação geralmente por txpificação HLA). A captura de células é efectuada graças aos anticorpos dispostas segundo uma geometria especifica em suportes muito especializados (lamelas de microscópio). Os resultados são obtidos por simples observação visual do suporte e conduzem a respostas de "tudo ou nada". Assim, os sistemas de imunocaptura de células descritas até ao presente não conduzem às aplicações analíticas que permitem a determinação quantitativa de um receptor expressa na membrana de algumas células. O método de dosagem que é objecto do presente invento, possui vantagens consideráveis relativamente a todas as técnicas anteriormente conhecidas e utilizadas pois ela permite medir de forma quantitativa qualquer receptor membranário de uma população celular num só tempo de análise. Esta dosagem é realizada sobre células que não tenham sofrida qualquer intervenção química ou física e que estio no seu estado de integridade fisiológica, Para além disso o método de dosagem de acordo com α invento possui as características de especificidade muito elevada. próprias dos sistemas de duplo reconhecimento pondo sm funcionamento 2 marcadores diferentes específicos transportados pela mesma célula sendo um o antigénio escolhido para imunocapturar as células que α se'querem analisar., e α outro o reesptor membranário a dosar qual é muito específicemente reconhecido pelo ligando corresporr lente» Este método é simples. ipido e reorodu t i ve1» Ele perfeitamente adaptado à análise de grande número de amostras o que permite a sua utilizaç-lo para fins de diagnóstico nas laboratórios de biologia clínica de grande capacidade* respezto a tun squ.xpamerrco membranário caracteris— elular compreendendo corno

Assim, α presente invento diz i para a dosagem de pelo menos um receptor tico de uma população ou sub-população o COÍHDOn©nt©B « a) um suporte sólido sobre o qual ss covalente ou adsorção física um ou mais anticorpos monoclonais dirigidos contra antigénios de superfície da população celular examinada, para além da referido receptor, destinados a imobilizar sobre o suporte as células entre as quais se encontram as das sub-população que transporta o receptor a dosarg b) uma solução contendo, sob forma radiomareada, o ligando especifico do receptor membranário a dosar» 0 termo “célula”, utilizado na presente memória descritiva e nas reivindicações anexas, inclui as células humanas ou células animais e nomeadamente as células sanguíneas, incluindo as plaquetas» 0 método d

Josaqem de células a dosar completas , isto é nlo li .cordo com o invento aplica—se a adas, transportando o receptor intervenção física ou estado de in teg ridade

As células não sofreram nehnuma química e elas são postas em execução num

fisiológica completa. Esta situação constitui a melhor garantia de integridade dos marcadores membranários escolhidos, o antigé-n 10 de imunocsocurs e o recepcor a dosar.

Como suporte sólido, pode-se utilizar qualquer dispositivo a adaptar à manipulação de suspensões celulares e preferencialmente de tubos, suportes magnéticos particulares ou placas ríg idas ou flex ívex-s- de nu. uru ti tu laçSo í=?m pol Ia ren o, e! loreto d e po1i vi ni lo ou ni tr o c e 1 u 1 OSí mie rocavidades, Os anticar pGS HíOí iOL 1 υΠ .“2 X des A. P . ção das células podem ser f i K 2* obre os supor t’ 1 xg ação química cavalente, ou por ads orç So f ia ·, ·- í- ; s oe acorda com as técnicas clássicas bem conhecidas ao perito na técnica da especial idade, nomeadamente tais como as descritas por STOCKER et HEUSSER J. Immunol= Methods, 1979, vol» 26, p» 87—95= De preferência, o suporte pode ser previamente saturado por meio de uma proteína.

De acordo com o invento, o ou os anticorpos ntonoclonais fixados no suporte sólido devem permitir a imunocaptura da população celular entre a qual ss encontra a ou as populações celulares portadoras dos receptores membranários a dosar. Quando esta população é constituída por células humanas, os anticorpos monoclonais preferidos para a imunocaptura são anticorpos anti-· -HLA de classe I, que são específicos da parte comum dos antigé-nios HLA A, B e C presentes nos leucócitos e numerosas outras linhagens celulares do organismo. Entre estes anticorpos, o designado por S-classe I, comercializada por BIQSYS é particular-mente preferido.

Noutros casos em que as células examinadas são células-humanas e em todos os casos em que estas células não são humanas, pode—se igualmente utilizar anticorpos monoclonais apropriados ao %

tipo de células examinadas para a irounocaptura de acordo corri o invento» A expressão "um ligando de um receptor sob forma radiomaruada ou. "um ligando marcado por uma sonda radioisotró-pit_a significa que este ligando transportaj sobre uns elemento próprio da sua estrutura, tua isótopo radioactivo permitindo a sua dosagem por contagem da radioactividade que lhe está associada. 0 equipamento de dosagem pode conter como componente adicional umct solução tampao destinada á lavagem do suporta bólido depuis da imobilização e marcação dos receptores membrsná-· rios com o ligando do receptor radiomarcado. 0 equipamento de dosagem pode também conter componentes adicionais das amostras necessárias à aferição da dosagem assim como so controlo de qualidade da dosaqem. O presente invento tem igualmente como objectivo um processo para a dosagem dos receptores de superfície e uma populaçao ou de uma sub—população celular caracterizada por consistirs a) em imobilizar a população celular contendo o recsp-*-Qt a uosar ou uma sub~pcpulaç§0 contendo o receptor a dosar, -•obi e um suporte sólido, uci i i Pando um ou ma is anticorpos mono-CiOuais, previamente rxxos.por ligação covalente ou por adsorção física sobre o referido suporte e capasses de reconhecer um «antigênio presente na superfície das células diferente do recep-toi a doscU· 5 e na mesma scaps g marcar directamente certas células pertencendo â população ou sub-população celular imotaili-io.da, por meio de pexo menos um ligando específico deste receptor a dosar, contendo o referida ligando uma sonda radioisotrópica;

:é lulas Γ* âd X0-"*

Suixdu ρw.r-“i. eliminar· w.™.-1 íq g.n d o c on t en d o a sond a c) em lavar α suporte não imobilizadas e o excesso do íso uropiLd§ d) em ler os resu.lta.dos oor contaqecn da ra.dioa.ctivida.de fina, referindo—se eventual mente a uma gama. de aferição. o processo de acordo com o ncia.1 à dosagem dos recepto-iqurâdos do sanque humano icularmente os lintácitos» 0 equipamento de dosagem e invento aplicam-se de maneirai prefere res de superfície dos elementos- f nomeadamente os leucócitos,, mais pari U equipamento de dosagem e o processo de acordo com o invento permitem medir os sinais de radioctivida.de dependendo de ‘SS9H u0S Π r? po pulaçáo celular itor medida à superfíc xe das •mi t uma a. v e. X iaçlo qu e3.Ct X X Χβ. des TI €5 recep ror que são trans- tlaç 8 D celul Sf* examinada u de uma apl XCâÇaQ do X n vento,, LOS T humanos, Ρ5.Γ-5 Ob quais h ta.tu.ia ae xlustraça-· pode—se citar o caso dos linfó< eκiste nomeadamente uma sub—população de células; o caractsrizados pale presença, do receptor na interleucina

Este receptor é expresso com uma. densidade muita aumentada na superfície dos liníécitos- no caso em que o sistema imunitário ê solicitado; por exemplo no decurso das patologias infeciosas3 em certas doenças não imunitárias ou em enxertos de oraaos. 5 sj

Utilizando ο acordo com o invento recolhida de um doente na-lo com o número de

equipamento de dosagem e o processo de 5 pode-se medir, numa amostra de sangue 5 α número de lintácitos activos e relacιοί i féci tos totai s.

Da mesma maneira Xinfècitos quiescentes e os relação no decurso da evolu aplicada ao doente» pode-se medir a relação entre os 1 ic ifócitos au. L i. vo~. .¾ var ' 1SÇ ãO desta ão da doenç a ©iti τunção da terapê 'utica

Para T da amostra, ίποηoc 1 ona.1 s ca 30 obter a imobilização esf 3SCÍ fica dos 1 in fócz tos uti 1iza-se de preferência um ou mais anticorpos pazes isolados ou em combinação d-e reconhecer a totalidade das células T da amostra, o que é o caso dos anticor c ornun s (ou an t i -CD45) ou dos anticor pos que da população T (ditos !ipan T") tais como D 3 l _, . _ ~ -L. Z T4 ·{ \ \ UU CÍ.ÍÍ L. J. í .1 l / n anti-CD5 (ou anti-Ti> , dl 111 — anticorpos anti-CD'2 (ou —CD7 (qu anti-12) ou outros anticorpos pan—T ainda não afsctados a uma classe de diferenciação de acordo com os critérios OMS»

Pode-se por exemplo, fixar por adsorção um anticorpo monoclonai ou uma mistura de anticorpos monoclonais específicos da totalidade dos antigénios de superfície das células T sobre as paredes das microcavidades» Estes anticorpos monoclonais permitem imobilizar ulteriormente nas microcavidades toda a população das células "í da amostra examinadas As placas assim preparadas podem ser liofilizadas e armazenadas d-e preferência a 4°C» Esta etapa pode ser realizada industrialmente e pode-se assim dispor de placas prontas a empregar em equipamentos de dosagem aplicáveis a toda a sub-população dos do rscsptor de qualquer 1 sob a forma radiomarcada» infócitos T carscterizada. pela presença, gando identificado que possa ser obtido >

—i i—

As amostras contendo as células a dosar e provenientes do sangue ou de qualquer liquido biológico apropriado? normal ou patológico? podem ser utilizadas tal como se apresentam ou. após preparadas? nomeadamente por centrifugação em gradiente de densidade de acordo com os métodos já conhecidos e em paricular num meio de forte densidade como por exemplo? o FICOLL-PAQUE? comercializado por Pharmacia. Para a dosagem dos linfócitos sanguíneos pode-se igualmente tratar a amostra de sangue a dosar com uma solução designada por tampão de lisa, que lisa os glóbulos vermelhos.

Colocam-se partes aliquotas da suspensão celular apropriada em contacto com o suporte sólido? por exemplo nas microcavidades de uma placa de microtitulação previamente preparada? ao mesmo tempo que a solução que faz parte do equipamento e que contém o ligando específico do receptor da população celular visada e que transporta uma sonda ratíia-isotrópica. Os ligandos específicos dos receptores membranários são qeralmente acessíveis comercialmente; senão eles são preparados? por exemplo pela marcação do ligando com iodo 125 ou iodo 131? por exemplo na presença de cloramiria T de acordo com um processo conhecido (F.C. GREEWWOOD? W.M. HUNTER et Coll? Biochem. J„, 1963? 89? 114). 0 período de incubação, isto é a duração necessária para a imobilização s a marcação simultânea das células é de prferfncia inferior ou. igual a I hora. Durante este período de tempo? o suporte sólido pode eventualssente ser centrifugado para melhorar a imobilização das células. 0 suporte sólido? a placa de microtitulação por exemplo, é em seguida lavada para eliminação ao mesmo tempo das células não fixas e o ligando que transporta a sonda radio-isotrópica, em excesso. 12-

A radiaactivxda.de associada às. células é contada num contador gama de acordo com qualquer modalidade apropriada e por exemplo depois de solubilisaçSo das células por uma solução alcalina (por exemplo uma solução de soda.) e recuperação da solução contendo a radioactividade com a ajuda de um tampão absorvente„

Ds resultados da dosagem dos receptores membranários de acordo com o invento podem ser expressos de acordo com qualquer modalidade apropriada ao exame eíectuado» Fiais sspecíficamente pode-se exprimir estes resultados em número total de moléculas de um receptor particular presentes num dado volume da amostra examinada (por exemplo por microlitro de sangue).

Para determine o número ds moléculas de um determinado receptor, na amostra examinada, utilisar-se-á. de preferência uma gama de aferição constituída por células ou de preparações celulares apropriadas, transportando o receptor a dosar e que terão sido prsviamente calibradas por um método de referência conhecido» Estes padrões serão de preferência constituídos ou por células .idênticas na sua proveniência de células que serão objecto da dosagem, ou por células de linhagens celulares estabelecidas transportando o receptor pretendido, ou por preparações, por exemplo de,membranas, provenientes de células»

Estes padrões são exactamente tratados como as amostras a examinar» Os sinais deles decorrentes servem para construir uma gama de aferição à qual se relacionam os sinais medidos com as amostras a examinar» Os cálculos posteriores são clássicos» 0 método de dosagem de acordo com o invento á simples, rápido e reprodutível» A sua uitilização é totalmente adaptada á análise de um grande número de amostras» Para compreender as

V Ei ri l_ cl MΠ ":r- Sííl C íjíh Q-*S cr; O l-OlTí C analisar a.s diferentes- etapas w'

• ib- COn VS'iii A iiTíobilisação das célula sobre α suporte sólido é a fase da dosagem que apresenta habitualmente maís dificuldades ou que é a mais crítica na sua realização. 0 meio frequentemente utilizado e f i y í-í ΐ pó. mesmo suprx mx r rio. induzir m :él u. las p elo gluta ral deído ou L U om ρο 1 i-L- 1 isin a ( VAN LE m ΈΝ 97 O 109 ) » No entanto. as i 0 KSCUÇ So p odem di minuir ou. .ca procu rada ou. pel o con tr -á- fQS i txvas de cél u. 1 as o qu.e É Uffl inconveniente muito grave (DROVE R e *c MARyHALL 3» I mmu.no 1= Methods, 1986, 90, 275-281) - Para além disso a reali2 ação do processo por f i KaçSCo química necessita de várias etapass a cent rifugação das tZ tÉ X Li X <ΞΙ Έ> % a preparação da mistura do gems de células fixadas. fixador. a « x !·. ação e depois a A dessecação das c é 1 u 1 a.s a 37 *C seguida ou não de uma fiMação ao metanol em microcav idades foi também proposta ÍBAUMBARTEN, 3 . ímmu.no 1Methods, í986, 94, 91-98). De facto a desidratação das células a 37°C pode alterar certos constituintes membranários frágeis e permeabilizar a membrana plásmica peri— celular o que facilita o acesso do ligando radiomarcado a estruturas intracelulares que não são visadas.

Para além disso a reprodutibilidade deste processa é incertap com efeito, a decantação das células nas microcavidades da dosagem e a dessecação das células podem variar de uma experiência para. a outra. Por fim, esta dosagem ê de longa duração

»·-<${! 0 élulas nscessi-ts.',' só ela,, de um pois a etapa de dessecação das período de tempo superior a 2 horas A imobilização de populações linfocitárias foi também obtida graças à utilização de anticorpos palie lanais adsorvidos em microcavidades STOCKER et HEUSSER d Immunol» Methods, 1979, 26, S7-95), Este método permite a imobilização de células estranhas à única população que se deseja analisar, A utilização de anticorpos monoclonais altamente específicos e afins adsorvidos ou finados sobre o suporte sólido e nameadaments em cavidades de dosagem permite a captura exclusiva das células pretendidas, sendo as outras populações celulares não retidas eliminadas ao longo das lavagens efectuadas no final da marcação dos antigénios a dosar,- Para além disso nenhum agente químico ou físico modifica as características dos antigénios nesta etapa porque as diferentes operações destinadas a fixar quimicamente ou fisicamente as células ao suporte são suprimidas.

Assim, de acordo com o presente invento, verificou—se que a imobilização das células pelos anticorpos monoclonais é um processo que permite simplificar a etapa de imobilização das células que transportam o receptor a dosar, tornando os resultados roais fiáveis, 0 processo de acordo com o invento consistindo na utilização simultânea, numa só etapa, de ura processo de imunacap— tura das células completas, sem intervenção física ou química sobre as células, e a marcação de todas ou de parte destas células por um ou vários ligandos transportando directamente uma sonda radio-isotrópica, permite pela primeira vez, a dosagem quantitativa sobre as próprias células dos receptorss membraná-rios escolhidos.

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De acordo com a invento , imobilisabas imunológicamente permite .í v 0-\.v marcação' 'direc ta ias células a simplificação do método de dosagem por supressão das manipulações intermediárias repetidas entre as etapas sucessivas da marcação no caso da marcação indirectas centrifugações das células, eliminação dos reagentes de marcação5 retorno á suspensãoρ uma economia de reagentes? uma fiabilidade melhorada por diminuição do número de etapas & U bf ÍÍÍ-S.Í l II X -SvÇ C;SS p um ganho de tempop m a ut x1x i açM.u tS 3. £ g de grandes a possibilidade de tratar ao mesmo tempo, cc exclusiva de materiais e de apareihagems non quantidades de amostras» 0 período de incubação para a imobilização da população celular e simultaneamente a marcação directa dos receptores da sub-população celular a. dosar é curto» Ele é inferior ou igual a 1 hora no caso da dosagem dos linfócitos T activos contendo o receptor da interleucina-2.

Após a lavagem do suporte sólido, a dosagem própriamente dita é efectuada por observação de um sinal preciso e de simples medição com aparelnagens usuais» a rsuioacuxvxdade»

Desse modo o processo de acordo com o invento apresenta numerosas vantagenss é rápido, fiável, económico e simples» 0 process receptores de super

de concentrações ce1u1ares» h sensibilidade do método face ao número de células depende da densidade do receptor da população celular dosada» Para cada receptor, pode-se, se se desejar., definir a concentração mínima molar em receptor podendo ser medida pelo processo de acordo com o invento»

Verificou—se que os sinais registados (contagem de radioactividade) permitem obter curvas de aferição regulares e satisfatórias era função do número de células postas em execução, nas condições usuais de manipulação»

Nos exemplos que se vão seguir, utilizar-se-á indiferentemente os sequintes termos ou as suas abreviaturas»

Ba A albumina, de soro bovino» ou soro aldomina bovino HBS tampão fosfato salino com ph 7,4 cpm batidas por minuto dpm desintegrações por minuto

'·- . _s Λ' í 0 N EXEMPLO 1 DOSAGEM DOS RECEPTORES DE INTERLEUCIMA 2 NO MEIO DO LIBANDO FISIOLÓGICO MARCADO.

Os receptores de interleucina 2 aparecem na membrana dos linfócitos T sctivos quando o sistema imunitário é solicitada »

No laboratório , pode—se trabalhar numa amostra de sangue não patológica, na condição de se obterem linfácitos activos a partir de linfócitos guiescentes por intervenção de um agente exógeno tal coma a fitohemaglutinina <PRA>» a concanavali-na A ou outras lectinas» A dosagem dos receptores de interleucina 2 a partir do sangue humano utiliza a interleucina 2 marcada com iodo 125 acessível comercialmente ÍNEX-229, DUPONT). A) Separação dos linfócitos de sangue completo e activação na PHA»

Recolhen—se θ?5 ml da amostra de sangue a dosar e mis*tura~se a 1,5 ml de tampão de fosfato salino» Num tubo de hemólise de 5 ml, introduz-se 1,5 ml de Ficai1-Paques (comercializado por Pharmacia) e deposita—se na superfície da camada de Ficai1 a amostra de sangue diluído em PBS» Depois de 5 minutos de centrifugação a 9ΘΘ >; g5 à temperaturas ambiente, recolhe-se de uma maneira estéril o anel de suspensão contendo as células monoclonais num volume ds 0,5 ml» A esta. amostra junta-se 1,5 ml do meio ds cultura» As células- são em seguida enumeradas depois s postas em cultura à razão de 5»1©'"" células por ml do meio RPMI 164€? (Flow) contendo 10% de soro de vitelo fetal (Flow) » « i' ο ' lo. meio A activaç.âo dos linfócitos T é obtida com PHA (HA WELLCOME) introduzida na concentração final de 50 ug/ml de de cultura, durante 3 dias. a)

Prepararão da. pisca,

Utiliza-se uma placa de microtitulação em plástico comercializada por NUNC (Referencia 64394) contendo 96 microcavi-dades. Introduz-se em cada microcavidade 2©0μ1 de uma solução contendo o anticorpo monoclonal purificado anti-CD2 (denominado ST lí) utilizado para imobilizar os lintácitos- T completos, isto éi. para efectuar a sua imunocaptura. Este anticorpo comercializado por BIOSYS, Compiè-gne, France, com a referencia ST 11 é utilizado na concentração de iOpg/ml num tampão fosfato salino com pH 7,4 CPBS>= A adsorçlo do anticorpo monoclonal efectua-se a 4°C durante 12 horas. Elimina—se o anticorpo em excesso virando a placa.

Prepara-se uma solução contendo 0,1% de gelatina e 0,5% de BSA num tampão de fosfato salino. Introduz—se 25Θμ1 desta solução em cada microcavidade, a fim de saturar a superfície das cavidades com proteína, o que se consegue depois 3e 1 hora 37°C, lavam—se as placas 3 vezes com a ajuda de um tampão fosfato salino. As placas assim preparadas são líofilisadas e armazenadas a 4°C num saco plástico selado. C>

Incubação das célula? A dosagem é realizada introduzindo nas microcavidades da placa um volume de 1Θ®μ1 de suspensão celular (2,5 10Q célula? pior ml) contendo as células tratadas com PHA durante 3 dias. ΥΥ

Junta—se em seguida 1 Φι marcada com iodo 125 (prs d pui em ίθθμΐ de tampão F1 Ν-/ Y. h-{}| úY uma. solução de interle uc i. fi a ef = NEX-229 DUP ONT OU SO j cl 12© Θ1 00 endo 5% de soro de vitelo) » Depo is ite as microcav ida dos ssv as iam— se se a s ísicroc a v ida des 4 vb 2 as c om 2θθμ1 de PBS em cada cavidade» Introduz—se* em seguida. 75μ1 de solução de hidróxido de sódio i M em cada cavidade» Depois de 1@ minutos5 o conteúdo de cada. cavidade é recuperado com um tampão absorvente antes da contagem da radioactividade no contador gama (contador de multicavidades LKB).

Os resultados são calculados e sxprssas quadro seguinte» em dam. no NO de células do amostra 2,5 >i 1©W células 1 1 Branco sem | sem células ! Receptor de interleucina 2 435dpm j 185 i

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES iâ - Equipamento para dosagem de um receptor de superfície característico de uma população ou de uma sub-população celular caracterizado por compreender como componentess a) um suporte sólido sobre o qual estão fixas por ligação covalente ou por absorção física um ou mais anticorpos monoclanais dirigidos contra os antigénios de superfície da população celular a dosar para além do referido receptor; -b> uma solução contando, o ligando específico do receptor memhranário a dosar? contendo o referido ligando um sonda radio—isatópica; c) eventualmente um componente adicional constituído par uma solução tampão de lavagem e/ou amostras permitindo a aferição e o controlo de qualidade de dosagem»
2. 21 - Equipamento. de acordo com a reivindicação í5 caracterizado por o componente (a) ser um suporte sólido constituído por uma placa de microtitulação em cujas cavidades estão fixos o ou os anticorpos destinados a imobilizar as células entre as quais se encontram as da população ou sub-população contendo o receptor a dosar»
3. 31 - Equipamento de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o componemte (a) ser um suporte magnético p&rticulado»
4. 41 - Equipamento de acordo cora qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por o componemte Ca) ser constituído por 1 •X' % ψ- .·*·

   V-- v? -

   \

   um suporte sálido sobre α qual monoclonais HLA de classe l„ mai· an ticorpos 5i - Equipamento de caracterizado por o anticorpo denominada S-classe I. acordo com a reivindicação 4, monoclonal ίίκο ser o anticorpo hM. fcquipamwnto de acordo com e.s reivindicações i a 5, caracterizado por o ligando específico ser a interleucina 2 marcada com iodo 125* 7ã ~ Processo de dosagem dos receptores tís superfície de uma população ou suh--populsção celular, caracterizado por consistir; a) em imobilizar a população celular contendo o recep— tor a dosar ou uma população celular compreendendo a sufo—população contendo o receptor a dosar sobre um suporte sólido, utili-zando um ou mais anticorpos monoclonais, previamente fixos por ligação covalente ou por adsorçao física sobre o referido suporte e capazes de reconhecer um antigénio presente à superfície das células para além do receptor a dosar, . j e, na mesma etapa, em marcar directamente certas células da população ou. sub—população celular imobilizada por meio de pelo menos um ligandoe especifico do receptor membranário a dosar, contendo o referido ligando uma sonda radio-isotópicaj b) era observar um período de incubação? não c) em lavar o suporte para eliminar as células imobilizadas e o excesso do ligando? & d) de referindo era se

   ler os resultados- por contagem ''ã eventualmente a uma qama de afer ã·· rsdio-ac tivida-ição» 8â — PfDi_essu de aLordu com a reivindicação 7? Larscte· rizado por o suporte sólido ser tal como definido nas reivindica-
5. 91 - Processo de dosagem de acordo com a reivindicação 75 caracterizado por os ligandos conterem uma sonda radio-isotópica de iodo 125 ou de iodo 131» reivindi- execução iΘ1 - Processo de acordo com qualquer uma das cações 7, 8 ou. 9, caracterizado por a duração total da da dosagem ser inferior ou igual a 1 hora» 111 — Processo ;de acordo com a rteivindicação /, caracterizado por o ou os anticorpos monoclanais fi*as sobre o suporte sólido serem anticorpos antí—HLA de classe L
6. 121 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o anticorpo sononuclesl fi;<o sobre o suporte sólido sre o anticorpo denominado S-classe 1= Lisboa5 22 de Março de 199Θ

   rua VICTOR CQrtOOM, 10-A, 1/ 1200 LISBOA