PT92281A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo acido etilinodiaminotetraacetico como inibidor da proteinoquinase ii dependente do calcio/calmodulina ou da proteinoquinase c - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de HQECHSI AKIIENGESELLSCHÀEií, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Erankfurt am Main 80, República Eederal Alemã, (inventores: Prof. Perdinand Huciio, Dr. íris Pribilla, Dr. Werner Schiebler, Dr. Dominique Tripier e Dr. Herbert Kogler, residentes na Alemanha Ocidental), para "PROCESSO PARA A PREgARAQlO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS OQEIEKDO ÁCIDO ETIIBEODIAMI-' 1101EIRAACEII00 ΟΡΜΟ IUIBIDOR DA PEOTEIKO-QU11ASE II DEPEIDENIE DE CÁLCIO/CAIMODuII-KA OU DA PROTEIKOQDINASE 0"

DESCRIÇÃO A proteinoquinase II dependente de cálcio/ /calmodulina (COPE II) e a proteinoquinase 0 (PKC) fazem parte de um mecanismo de transferência de sinal celular que transforma, de um modo controlado pelo receptor, o 4,5-bisfosfato de fos fatidilinositol (PIP2) no 1,4,5-trifosfato de inositol mensagei ro secundário (IP3) e em diacilglicerol (DAG). Ο IP3 liberta cálcio a partir das reservas intracelulares, que se liga à calmodulina e que activa a COPE II como complexo de cálcio/calmo-dulina. 0 DAG activa directamente a PKC na zona citoplasmática da membrana células. 0 cálcio, bem como os activadores conheci dos da PEC como o DAG ou esteres forbóticos, podem desencadear contrações de músculos lisos, estimular precursores de secreções e influenciar a protiferação de células (ϊ. llishizuka (1986), Eature 308, 693-698, (1988) ittid. 334-, 661-665), Exis-• te um grande interesse em encontrar inibidores para a COPE II e

JL para a PKO específicos e de elevada afinidade, que possam desempenhar um papel activo no tratamento de doenças cardio-vas-culares, em processos reumáticos, doenças do sistema nervoso central e no cancro.

Mo se descreveram até agora quaisquer inj^ bidores específicos para a OOPK II.

Os inibidores da PEC até agora conhecidos são mais ou menos não específicos (L.G. Garlande et al. (1987) 2IPS 8, (1987), 334)· Em E. Albert et al., Proc. Bati. Acad. Sei. USA 81, (1984), 3622-3625): P. Hueho et al., PEBS Lett. 211(1987)? 3)7-210; J.E. McDonald andM.P. Walsh, Biochem. J. 232, (I985)? 559-567, encontram-se descritos proteínas/pépti-dos inibidores da PKO existentes nas próprias células. Os lisosfingolípidos e a esfingosina são produtos da degradação dos lípidos, que ocorrem nas membranas celulares e que podem também eventualmente actuar como inibidores da PKO (Y.A.

Hannun and Ε.Μ. Bell, Science 235 (1987)? 670-674) , Mo se conhecem ate agora inibidores solúveis em água, endógenos e de baixo peso molecular. 0 objectivo da presente invenção são os novos inibidores de baixo peso molecular da COPE II e da PEC.

Descobriu-se então surpreendentemente que o ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA) e os seus análogos são extraordinários inibidores destas quinases. Â invenção refere-se por isso à utilização de ácido etilenodiaminotetraacético (ΕΏΤΑ) ou dos seus análogos como inibidores da proteinoquinase II dependente de cál-cio/calmodulina ou da proteinoquinase 0.

Os análogos do EDUÂ preferidos são os seus ésteres, em especial ésteres alifáticos com 1 a 6 átomos * de carbono. Um análogo particularmente preferencial é 0 éster . etilico. - 2 -

Para a inibição da COPE II e da PICO utiliza-se contudo muito em especial o próprio EDIA. 0 EDTA e os seus análogos inibem a OGPK IE e a PEQ, conforme a concentração, até 100%.

Para a determinação da actividade da COPE II utiliza-se uma preparação de membranas do cérebro de rato, que se incuba conjuntamente com ÀTP marcado (gama 32Ρ-ΑΪΡ) e sem ou com calmodulina como activâdor. Efectua-se a análise por meio de separação da proteína, marcada radioactivamente por transferencia do fosfato J2P, em electroforese de gel de poliacrilamida SDS, seguida de auto-radiografia e quantificação por densitometria Laser.

Para a determinação da actividade da 3P0K utiliza-se uma preparação de cérebro de rato, que se incuba juntsmente com ΑΪΡ marcado (gama 32P-ArfP) , histona como proteína substrato, fosfatidilserina, cálcio e/ou DAG· como activadores (t = 0,5 % 1 ou 2 minutos, respectivamente). Para--se a reacção de fosforilação a) por pipetagem sobre fosfoce-lulose ou b) por adição de SDS(dodecilsuifato de sódio) a 3%.

Ho processo a) remove-se Q ÁIP marcado que fica em excesso por meio de lavagem repetidas da fosfocelulose e em b) por meio de electroforese de gel SDS, de acordo com Laemmli (U.E. Laemmli (1970)Hature 225, 680-688). A determinação da radio-actividade na fosfocelulose (radiação de Cerenkov em contador Beta) (a), ou a densitometria de um filme de raios X colocado sobre o gel de electroforese SDS seco (b), permite a quantificação da actividade de PKC na ausência (controle « 100%) e na presença do inibidor.

Devido ao efeito inibitório pode empregar--se o BDIÂ e os seus análogos para. o tratamento de doenças cardiovasculares (por exemplo, Mpertonia, arterosclerose) , doenças do sistema nervoso central, processos inflamatórios, • cancro e infecções virais. - 3 -

0 exemplo seguinte destinado a ilustrar a invenção.

a) Enriquecimento e teste de actividade da COPK II O enriquecimento e o ensaio da OCPK II efectuam-se essencialmente de acordo com o processo de Schul-man e G-reengard (Schulman, H.J. and Greengard, P. (1978),

Itfature 271, 478-479).

b) Purificação da PEG

Isola-se a PEO a partir de cérebro de vaca e modifica-se de acordo com o processo de Walton (G. M« Jalton et al. (1978), Ãnal. Biochem. 161, 425 ~ 437)· iodos os passos seguintes se efectuam a 4°0:

Homogeneizam-se 200-250 g de cérebro de vaca (córtex) em 1 1 de tampão de homogeneização (20 mM trie-t ano lamina, pH 7,4; 10 mM ÉGUA; 2 mM EDTA; 1 mM ditioeritritol; 2 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo; 10 mg/ml de aprotinina; 10 mg/ml de leupêptido) e centrifuga-se durante 1 hora a 16 000 xg. Eiltra-se a camada sobrenadante através de lã de vidro e coloca-se numa coluna de celulose DEAE (180 ml d.e volume de enchimento equilibrado com 20 mM trietanolamina, pm 7,4 ; 10 mM EGTA; 2 mM ΕΌΪΑ; 50 mM beta-mercaptoetanol). Lava-se primeiro a coluna com 500 ml de tampão A (20 mM trietá nolamina, pH 7,4; 1 mM ÉGUA; 1 mM EDITA; 10 mM beta-mercaptoetanol) e depois com 1000 ml de NaOl 20 mM em tampão A. Elimina-se a PUO com 500 ml de HaCl 90 mM em tampão A. Mistura-se ao eluído HaOl até uma concentração final de 1 M e coloca-se numa coluna de fenil-Sepherose (volume de enchimento 50 ml, equilibrado com 1 M líaOl em tampão B (20 mM trietanolamina. pH 7,4 ; 2 mM EG1'A ; 2 mM EDiA ; 1 mM ditioeritritol)) . Lava--se a coluna com 500 ml de laOl 1 M em tampão B e elui-se con 25O ml de um gr adi ante de 1 M NaCl até 0 M ÍTaCl em tampão 3. Heunem-se as fracções contendo PEC, misturam-se com glicerol - 4 -

(10¾ (v/v) de concentração final) e colocam-se numa coluna de protamina-agarose (volume de enchimento 10 ml, equilibrado com 0 ,1 M Kacl e 10% de glicerol (v/v) em tampão B) . Lava-se a coluna com 40 ml do tampão de equilíbrio e elui-se com 120 ml de um gradiante de 0,1 I EaCl ate 1,5 M BaCl em tampão B e 10% de glicerol (v/v). Reunem-se as fracções contendo PEC, dialisam-se contra tampão B e guarda-se em partes alíquotas com glicerol (concentração final 10% (v/v)) e azoto líquido Triton x 100, a -70°0. A PKO assim obtida tem uma pureza de pelo menos 95% (electroforese de gel SDS) e apresenta uma actividade específica de 2 - 3 micromol de fosfato transferido por minàto e mg.

c) 'leste de actividade da PKO <k) Determina-se a actividade da PKC de acordo com o método de Roskoski (R. Roskoski (1983) , kethods Bnzymol. 99» 3-6)· A mistura reaccional contém 20 mM trietan£ lamina, pli 7 »4; 4- bM acetato de magnésio; 0,4 mg/ml de histona III S ; 50 mM beta-mercaptoetanol; 20 microl AIP com vestígios de A33P marcado com gama-32P (actividade específica 2-10xl06 cpm/nmol); 1-100 nM PKO e, em condições estimuladas, 0,1 mg/ml de fosfatidilserina (em forma vesicular), juntamente com 1 mi-crog/ml de 12-miristato-13-acetato de forbol. Ajusta-se o teor de cálcio livre um tampão de Oa/EGTÂ ao valor de 0,1 a 100 micromolar. β ) Alternativa: A mistura reaccional contém 50 mM tampão de Hepe, pM 7,4 ; 10 ml cloreto de magnésio ; 1 mM EG-ΪΑ; 2 mM ditioeritritol ; 0,1 mg/ml de histona III S ; 10 micron M gama 32P-A1P(actividade específica 10-20 x 10^ cpm/nmol); 1 - 100 nM PEG e, em condições estimuladas, 0,05 mg/ml de fosfatidilserina vesicular, juntamente com cálcio livre 0,1 mM.

A reacção inicia-se normalmente por adiçãj do ATP marcado, em experiências cinéticas por adição do PKC.

Os tempos de reacção variam, conforme a experiencia, entre 0,5 e 10 minutos a 30°C, sendo de preferência de 1 minuto. 0 volume da mistura reaccional varia, conforme a experiência, entre 40 e 100 microlitros, sendo de preferência 80 microlitrcs. A quantificação efectua-se por pipetagem de uma alíquota (30 ou 40 microlitros) da mistura reaccional, após os tempos indicados, sobre fosfocelulose (P 81, Whatma) , Lavagem da fosfoce-· lulose (três vezes com ácido fosfórico a 0,05%) e determinação da radioactividade da histona fosforilada ligada por medição da radiação de Cerenkov num contador beta. Lm alternativa pode parar-se a reacção com 2% (v/v) de SDS e submeter-se a uma elec troforese de gel segundo ommêtodo de Laemmli (U.K. Laemmli (I97O), Nature 227, 680-685). Após secagem do gel e autoradio-grafia quantifica-se 0 escurecimento por meio de densitometria Laser. d) Determinação da actividade da proteinoquinase CAMP-dependente A actividade da subunidade catalítica da proteinoquinase CA1P-dependente determina-se segundo 0 método de Soskoski (Eoskoski, E. (1983) Methodo Enzymol., 99, 3-6). e) especificidade da inibição A Figura 1 mostra que o EDTA inibe a CCPK II com uma concentração semi-máxima de 2 microM e a PKC com uma concentração semi-máxima de 400 microM. Á concentração semi-máxima do EDTA para a subunidade catalítica da proteinoquinase CAMP-dependente é de cerca de 10 mM.

Uma concentração de inibição de 10 ml, como a obtida para a proteinoquinase CAMP- dependente, corresponde à concentração de iões magnésio presente em todos os tes-. tes. A sua complexação total pelo EDTA conduz a uma inibição - 6 -

Claims (1)

1. não específica de todos os processos dependentes de magnésio--ATP í A inibição da COPE II e da PICO pelo EDTA deve contudo atribuir-se a um outro mecanismo, pois neste caso também existiam iões magnésio livres numa concentração de 10 mM. Uma concentração de iões livres de 1 mii, nos testes da GGPK II e da PKC, também se situa nitidamente acima dos valores de inibição semi-máximos do EDTA encontrados, de modo que não ê de admitir uma complexação dos iões cálcio c como mecanismo de inibição. REIVINDICAÇÃO Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, para o tratamento de doenças do sistema cardio-vascular, doenças do sistema nervoso central, processos inflamatórios, cancro e infecçÕes virais, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo o ácido etilenodiamino-tetraacético (EDIA) ou seus derivados (de preferência ésteres) como inibidores da proteinoquinase II dependente de cáloio/cal-modulina ou da proteinoquinase 0, isoladamente ou em conjunto com veículos adequados, na proporção de 0,1% a 96% em peso. A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 10 de Novembro de 1988, sob o 1TS. ? 38 38 068.4. Lisboa, 10 de Novembro de 1989 © ΔβΜΕΞ ©EICIAl BA ΒΒΒΡΞΙΒΒΑΒΞ E®U§fMAlL,

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