PT92105A - Metodo e solucao reagente para o tratamento de semen e/ou espermatozoides - Google Patents

Description

THE VICTORIA UNIVERSITY OF MANCHESTER "MÉTODO E SOLUÇÃO REAGENTE PARA O TRATAMENTO DE SÉMEN E/OU ESPERMATOZÓIDES11 A presente invenção refere-se a um processo ginecológico melhorado e mais particularmente a um processo para o tratamento de espermatozóides destinado a reforçar a sua capacidade para fertilizar o óvulo e a reduzir e ultrapassar os problemas de infertilidade resultantes da presença de anticorpos antiesper ma no sémen.

Sabe-se que os espermatozóides oodem ser afectados nocivamente por várias substancias antagonistas-anticorpos e outras substâncias - que estão associadas com problemas de infertilidade. Estas substâncias de um modo geral reduzem a motilidade mas reduzem também a capacidade de fertilização dos espermatozóides no óvulo por alterações não associadas com a motilidade. 0 meca^ nismo para isto não esta completamente esclarecido, mas aceita--se que esteja associado com anticorpos que estão presentes em e se ligam com os espermatozóides no momento da ejaculação.

Até ao momento não se tinha descoberto qualquer método cltnicamente aplicável, compatTvel com a retenção da capacidade de fertilização para remoção destas substâncias antagonistas dos espermatozóides no sémen ejaculado.

Presentemente descobriu-se que este problema se pode ul ..2-/ λί trapassar numa proporção grande de casos e o efeito da substância antagonista ser reduzido ou modificado de uma forma que não antagonize a fertilização,

Assim, de acordo com a presente invenção proporciona-se um método para tratar o sêmen que consiste em: a) misturar-se o sémen com uma solução reagente conter^ do uma protease e um sacarido, b] incubar-se a mistura sob condições que mantenham a protease activa, e cl separar-se os espermatozóides da mistura resultante. A presente invenção também proporciona reagentes, principalmente soluções reagentes, uteis para o tratamento de semen para se utilizarem no método citado anteriormente que compreende uma solução de um sacarido e de uma protease e ainda prepara ções contendo espermatozóides e tendo um conteúdo reduzido de anticorpos, produzidos pelo método anteriormente citado. A função desta protease não esta inteiramente esclarecida, mas considera-se que ela actua em parte por hidrólise do material proteináceo (proteínas e/ou glicoproteínas), e parcial_ mente por possuir um efeito 1iquédificante do semen, A protease pode ser qualquer protease (enzima proteolT-tica) que esteja isenta de DNAse (isto e a enzima que degrada o -3- ^ Η DNA) e que seja actíva a um pH e que não seja indevidamente nociva ou antagónica dos espermatozSides, De preferência, Dortan_ to, deve ser actíva a um pK substancialmente neutro ou ligeira-mente acida relativamente ao estrfctamente neutro, de modo a preservar o espermatozóide e a reduzir a gravidade da degradação enzimatica.

Assim, pode ser qualquer orotease mas de preferencia uma serina protease, como por exemplo qútmotripsina, Em geral, prefere-se a quimotrtpsina porque tem a vantagem de ser facilmente adquirida numa forma sufíctentemente pura aprooriada para uso humano (isto e, sob a forma estéril) e porque aumenta a velocidade de liquefação do semen. Como alternativa ã serina protea se pode utilizar-se, se apropriado, uma pronase mas presentemeni te não e fácil adquiri-la no-.comércio no estado suficientemente puro para se utilizar de acordo com esta invenção, 0 sacarido pode ser qualquer composto contendo uma estru^ tura proveniente de um hidrato de carbono (açúcar) e conveniente mente referido por um "análogo" deste, mas prefere um derivado do açúcar galactose, Assim pode ser um monossacarido ou um oli-gossacarido (especialmente um radical de galactose como unidade terminal], Mais convenientemente pode ser a prÕDria galactose, 0 radical da galactose e preferível que seja da D-qalac tose., portanto, se apropriado, podem-se utilizar aqueles e outros enantiomeros ou misturas de enantiÕmeros (por exemplo D-e/ou L-galactose], V, -4

Alternativas para os proprios açucares incluem compostos derivados desse açúcar, por exemplo, N-acetil-D-galactosamina. 0 sacarido especialmente a D-galactose e um aditivo altamente vantajoso, uma vez que parece actuar em conjunto com a protease para se obter uma eliminação reforçada das substâncias antagonistas. Uma porção conveniente, e a que varia entre 1,5 e 2,0 gramas por 100 ml de solução a misturar com ejaculação, A co-^incubação com o sacarido desloca ou inibe a ligação posterior com o anticorpo, como se detectou pela ligação com anti-TgG e antUCgA marcadas, A solução reagente para utilizar na mistura/tratamento (a) pode preparar-se em qualquer meio aquoso, de um modo muito conveniente deve conter uma quantidade do sacarido que proporcione uma concentração de sacarido na solução reagente entre 1,5 e 2,0 gramas por 100 ml de solução reagente, A concentração da protease contida pode ser muito variável dependendo de certos factores tais como a pureza da protease e a actividade e evideia temente a protease ou mistura de protease especificas utilizadas; mais çonvenientemente pode estar compreendida entre 0,01 e 0,1 gramas de protease purificadas por 100 ml de solução reagente no caso da quimotripsina, mas podem-se utilizar concentra ções ma'iores ou menores de acordo com a actividade proteol itica da enzima utilizada e devem usar-se quantidades maiores se a en zima exibe uma forma menos activa, A solução reagente pode ainda conter aditivos aceitáveis do ponto de vista fisiológico, Estes aditivos podem destinar--se a contrariar a infecção ou a deterioração orgânica da mistura ou componentes desta ou a auxiliar a manutenção de um ambiente não nocivo aos espermatozóides e Dode utilizar-se quaisquer proporções ou associações que não tenham efeito indesejável sobre os espermatozóides. Estes aditivos podem incluir-se para manter a solução isotÓntca (ou substancialmente ou cerca de} com os fluidos corporais ou podem ser um agente antisséptico ou antibacteriano. A solução reagente e de preferência sub£ tancialmente neutra ou ligeiramente maís acida do que a zona neutra descrita, por exemplo um põ cerca de uma unidade inferior ao pH Óptimo para a actuaçao da enzima. Para armazenagem, o re£ gente deve manter-se a uma temperatura (a que a enzima protease seja substancialmente estável] mas prefere-se grandemente que a solução reagente seja de .preparação recente antes do uso e usa_ da para o tratamento do semen entre cerca de 1 hora, mas se po£ STvel tão rápido quanto possível após a sua preparação, E importante tratar o semen com uma demora mínima, portanto prefere-se que a mistura do semen com a solução reagente para uso no estado de mistura/tratamento (a) citados anterior-mente, se realize numa prática tão rápida quanto possível e com um mínimo de demora após a ejaculação - de preferencia dentro de 10 segundos, mas em menos tempo se possível, t portanto muito adequado misturar o semen directamente com a solução reagente contendo ambos os comoonentes, isto Ó, a protease e sacando, -6-

Para assegurar os melhores resultados, o dador masculino do sémen deve ejacular de preferencia para a solução reagente de protease e sacarido que fora ja preparada e à temperatura adequada uma vez que isto reduz o factor tempo ao mínimo. A temperatura da mistura da solução reagente com o sémen deve ser tal que não actue de um modo indesejável e significativo sobre os espermatozóides. Prefere-se uma temperatura perto da temperatura corporal, Uma temperatura muito apropriada situa--se entre 25° e 30^0,

ApÕs o semen e a solução estarem juntas, pode realizar--se uma mistura por qualquer meio conveniente que não imponha condições [por exemplo forças mecânicas] sob os espermatozóides que as prejudique, Podem-se utilizar formas de mistura moderada convencionais, por exemplo mistura simples por inversão da mistura 5 ou 10 vezes o que sera suficiente, Deve evitar-se quaisquer métodos de agitação forte ou de mistura ultrassónica porque estes são letais para os espermatozóides e mesmo uma agi^ tação excessiva poderá precipitar as proteínas por formação de espuma e também por dano sobre os espermatozóides.

No estádio de incubação (b] do método descrito antes, pode-se utilizar condições que permitam a enzima proteiolTtica hidrolisar a proteína mas que não tenham efeito indesejável apreciável nos próprios espermatozóides, (Exigências idênticas também se aplicam a escolha da própria protease, como o uso de uma enzima que necessite de um pH muito acido para actuar, por exemplo tripsina] podem ter um efeito adverso indesejável em vir tude das condições de pHI. Estas condições são substancialmente as condições padrão convencionais sob as quais o enzima actua mas de preferência mantem-se o meio ligeiramente mais acido do que esse, por exemplo cerca de uma unidade de pH abaixo do pH óptimo de actuação da enzima. Esta ligeira modificação de pH e apropriada para preservar os- espermatozóides e reduzir a gravi_ dade da degradação enzimatica. São condições muito convenientes as temperaturas entre 30 e 37°C. Temperaturas maiores prejudicarão os espermatozóides e temperaturas menores diminuirão afetividade da enzima para um nTvel baixo inconveniente, 0 tempo necessário para o tratmento (isto e a incubação) ou o tempo total para que o semen entre em contacto com a solução reagente contem a protease pode também variar muito mas situa-se convenientemente entre 10 e 20 minutos. Em alguma exten são o tempo e a temperatura estão inter-relacionadas mas pode determinar-se o tempo Óptimo por meio de um ensaio simples. Na pratica a variação da temperatura Ó limitada e a exposição longa a enzima e inconveniente, de tal modo que o tempo mais convenien te Ó de 20 minutos, A quantidade de enzima presente na mistura de semen e solução reagente indicou-se.tnteriormente e no caso da quimotripsina pode situar-se convenientemente cerca de 5000 unidades USP o que cor responde a uma concentração da enzima de cerca de 500 unidades USP por ml, mas podem-se utilizar quantidades e concentrações maiores ou menores. Diferentes enzimas devem medir-se em "uni- dades" diferentes se as unidades de referencia VSP nao forem apropriadas para essas enzimas, A proporção mais conveniente de solução reagente (pro-tease/sacarido) para o semen deve situar-se entre 1 e 3 partes em volume de semen para cada 10 partes de volume solução, Apr^ sentar uma relação desta ordem e mais conveniente na pratica uma vez que o volume de uma dada amostra de semen pode ser muito variável (usualmente mas não sempre entre cerca de 1 e 3 ml} e e conveniente combinar esta amostra de "volume variável" com um dado volume de solução reagente, por exemplo 10 ml, que Ó suficiente para a tratar, A principal consideração e diluir o anticorpo não ligado para reduzir a ligação aos espermatozóides, A redução da vis cosfdade do semen também facilita a acção da enzima e permite uma velocidade razoável e separação satisfatória dos espermatozóides . A separação dos espermatozóides da mistura resultante na fase de separação [c\ citada antes pode realizar-se facilmen^ te por meios convencionais desde que a primeira exigência seja proteger os espermatozóides dos efeitos indesejáveis das substancias antagonistas na ejaculação natural mas que não estão , por outro lado virtualmente afectados, 0 método muito conveniente e a centrifugação, neste ca^ so com velocidades e tempos convencionais numa centrífuga, ten--do em atenção os factores habituais tais como a viscosidade da -9-

mistura e a fragilidade dos espermatozóides. A seguir a separação pode fazer-se uma lavagem para reforçar a eliminação das substancias indesejáveis e qualquer tra tamento da solução em excesso, dè.modo a eliminar a enzima tanto quanto possível e viável e evita qualquer ataque continuo sobre os espermatozóides. Realiza-se a lavagem de uma forma muito eficaz, utilizando-se um meio aquoso, de preferencia uma $o lução isotónica, centrifusando depois e finalmente ressuspendeji do os espermatozóides apenas em meio recente. 0 meio de lavagem pode ser qualquer meio não hostil para os espermatozóides ou que os possa prejudicar, t muito conveniente que possa conter uma quantidade de sacarido (por exemplo com uma concentração igual a da solução reagente) numa ou mais etapas de 1avagem/reparação sucessivas, uma vez que a pre- -c ' 1 - sença continua do sacarido parece ter um efeito benefico. Deve manter-se a melhor temperatura nesta fase de lavagem para não afectar indesejavelmente os espermatozóides. Uma temperatura muito adequada estará na gama 25° e 30°C, A presente invenção também proporciona preparações contendo espermatozóides que tem um conteúdo de anticorpos reduzido, produzidos pelos métodos citados antes. Estes são utilizados de preferencia para a fertilização do óvulo tão rápido quan to possível porque mantendo os espermatozóides a sua viabilidade pode deteriorar-se, Contudo, se necessário, os concentrados se parados contendo espermatozóides tratados podem conservar-se oor métodos convencionais, por exemplo, por armazenagem em condições -10- v. / 5» de temperatura batxa estéreis (com ou sem dissolventes anropria_ dos) ou sob condições criogénicas casos em que devem, ser tomadas as precauções habituais para impedir o dano dos espermatozóides por congelamento, por exemplo, mediante adição de crioprotecto-res convencionais.

Quando se separaram os espermatozóides pode-se utilizar na fertilização do Óvulo uma diversidade de formas. Uma forma conveniente e suspende-los no meio de líquido aceitável do ponto de vista farmacêutico e não nocivo para os espermatozóides (usualmente um meio liquido aquoso estéril) de preferência um meio isotÕnico com os fluidos corporais. Exemplos destes meios líquidos incluem liquido idêntico ao liquido tubular humano (meio de Ham FIO e solução de Tyrode, mas qualquer meio razoável^ mente compatível com os gametos (isto é com os espermatozóides) pode utilizar-se se se desejar,

Pode realizar-se esta ressuspensão com uma proporção de liquido que forneça um numero conveniente de espermatozóides mo veis (uma "contagem de esperma") para serem utilizados na fertj[ £ lização, 0 numero conveniente ê usualmente da ordem de 20 x 10 por mililitro, 0 método da presente invenção e os produtos obtidos des^ te modo podem utilizar-se para o tratamento de sémen (esperma), a partir de uma diversidade de origens diferentes, incluindo e£ perma humano ou animal e portanto pode aplicar-se em seres humanos e ainda em trabalho de veterinária. Parece impraticável e anti-econÓmico utilizar o método da presente invenção para animais uma vez que é normalmente suficiente resolver um caso de infertilidade em veterinária pela utilização simDlesmente de um animal macho e/ou fêmea alternativo, Contudo pode encontrar-se justificação suficiente quando o dador animal macho do esperma e um animal excepcionalmente valioso (portanto considera-se importante assegurar a sua progêní de preferência ã dum macho alternativo). Como nos casos de criação de animais de sangue puro valiosos e nas tentativas para criar e preservar espécies ani^ mais raras, A presente invenção pode apresentar-se de uma forma mais aplicável a utilização clinica, por intermédio da preparação de um equipamento adaptado para a produção de uma solução reagente como descrita anteriormente,

Este "equipamento",contem, especialmente, em recipiente separado respectivamente: a) um meio aquoso estéril contendo aditivos necessários para o tornarem substancialmente isotÕnico e/ou para actuarem como agentes conservantes, quer na própria solução quer apos o uso, b) uma mistura seca do sacarido e da protease.

Eventualmente, se o processo a seguir inclui uma fase de lavagem e/ou armazenagem é desejável utilizar na lavagem e/ou a^ mazenagem um liquido que nao seja o mesmo meio aquoso estéril a), portanto deverá incluir-se um terceiro recipiente c) conteii -12- do o meto de 1avagem/armazenagem,

Evidentemente que não e necessário num •"equipamento" des; te tipo confina-lo apenas aos simples recipientes dos iTquidos e, se se desejar podem incluir-se uns tantos. Assim pode incluir-se equipamento uttl, espectalmente uma seringa hipodérmica para (como referido anteriormente) a mistura e utilização do "equipamento" para a preparação da solução reagente.

Prefere-se que os recipientes sejam feitos de materiais escolhidos de um modo apropriado no que se refere a sensíbilida^ de ou instabilidade potencial das substancias para serem a1i ma£ tidas, Especialmente o recipiente para a solução a) deve ser constituído de um material resistente a qualquer interacção com a solução reagente contaminando-a; de preferencia constituído por vidro e especialménte por vidro de borossiliçado, 0 recipiente para a mistura seca b) ê adaptado de modo a manter a mistura s-ecã sob vacuo ou sob uma atmosfera gasosa inerte para auxiliar a conservação dos conteúdos, Pode ser em vidro mas pode utilizar-se alguns materiais plásticos que tem duração e pureza apropriados (por exemplo policarbonato, polie-tileno, etc.}.

Uma forma mais conveniente e um ou os dois recipientes para a} e/ou b} estarem providos com um septum selado através do qual se pode inserir uma seringa hipodérmica, 0 método para a utilização do equipamento consiste então em inserir uma agulha hipodérmica através do septum do recipiente a} retirar a quanti- -13- /

I dade desejada da solução e em seguida inserir a seringa hipoder^ mica através do septum do rectpfente b) para ínjectar a solução neste e, em seguida agitar a mistura resultante no recipiente b) para dissolver os componentes sol idos e formar a solução reagente desejada.

Em seguida pode-se aquecer a solução reagente ã tempera^ tura necessária para utilização,

Esta forma ê muito pratica porque permite a um utente dispor dos componentes para manipular em quantidades apropriadas pré-determinadas e de condições perfeitamente estéreis, pa_ ra os utilizar com um minimo de dificuldade, A enzima solida tem que estar seca para impedir a sua deterioração durante a ar mazenagem, sendo muito conveniente ter os dois componentes pri£ cipais activos conjuntamente sob a forma mais estãvel possível, prontos para uso quando necessário,

As preparações de espermatozóides tratadas obtidas pelos processos da presente invenção podem utilizar-se na fertilização do ovulo por qualquer dos muitos meios de concepção assistida conhecidos ou métodos e processos de fertilização. Podem utilizar-se, por exemplo, nas técnicas de "GIFT" (Transferência dos gametos para a trompa de falÕpioj ou de IVF (fertilização in vi-tro).

Nos estudos clínicos, ate 66¾ das ejeculações que apresentavam uma ligação total com os anticorpos IgG e IgA quando eji saiados com "Immunobeads". Tornaram-se anticorpos-negativos -14- após; este tratamento ou mostraram um nível superior na redução da ligação com "Immunogrãos". (0 termo "Immunobeads" e uma mar ca registada dos Laboratórios BioRad ). 0 processo mostrou não ter efeitos indesejáveis sob a ca pacidade fertilizante dos espermatozóides e foi utilizado no apoio de processos de fertilização com espermatozóides isentos de anticorpos ANTI-ESPERMA que resultaram no nascimento de ninha das normais após processos de concepção assistidos, A presente invenção e ilustrada mas não limitada pelo exemplo que se segue em que as partes e percentagens são em peso salvo indicação contraria,

Exemplo 1

Preparou-se uma mistura submetendo o dador macho a eja^ culação dtrectamente numa solução aquosa 0,1M de D-galactose contendo quimotripsina, esterilizada previamente pela passagem através dum ultrafiltro (membrana de 0,22 ^im). Esta solução continha 0,05% de quimotripsina (calculada sob a forma de enzima pura] e 1,8% de D-galactose. A quantidade da solução usada para 10 ml, continha 5000 unidades USP de quimotripsina (cerca de 500 unidades USP por ml] dado que esta - na base da amostra de se mén ser cerca de 3 ml - fornece uma proporção apropriada da enzi_ ma para sémen e ainda uma mistura de viscosidade convenientemeii te reduzida, A mistura total misturou-se cuidadosamente por iii versão cinco vezes. \

Em seguida, incubou-se a mistura a temperatura de 37°C durante 20 minutos, sem agitação, para permitir a actuação da enzima e em seguida centrtfugou-se a 500g por 5 minutos, Reti_ rou-se do centrifugado o líquido sobrenadante e o granulo concentrado de espermatozóides res.suspendeu-se em 10 ml de um meio aquoso esteril contendo 0,1M de D-galactose, agitando-se por iii versão cuidadosa e repetida e a suspensão resultante centrifu-gou-se de novo a 500 g durante 5 minutos, Retirou-se novamente o liquido sobrenadante, 0 granulo resultante constituído por espermatozóides res suspendeu-se ainda num meio esteril simples de 10,0 ml, por exem pio fluido idêntico ao fluido tubular humano (P, Quinn, J, F. Kenin e G. M, Warnes; Fértil Steri1.; 44- pag, 493-498 (1985) , Em seguida agitou-se o volume, se necessário para se obter uma concentração de esperma rnovel cerca de 20 x 10 por ml, Se isto não se puder conseguir devido a Baixa presença de espermatozóides moveis, pode ressuspender-se o granulo em 0,5 ml de meio.

Esta preparação de espermatozóides e a mais conveniente para se utilizar em técnicas GIFT (Transferencia dos gametos pa_ ra as trompas de falopio) ou IVF (fertilização in vitro).

Nos estudos clínicos até 66% das ejaculações que mostra^ ram uma ligação total com anticorpos TgG e TgA quando testados com "Immunoheads" tornaram-se anticorpos negativos após este tratamento e mostraram uma taxa superior na redução da ligação com "Immunobeads" , (A designação "rmmunoheads" e a marca comercial dos Laboratórios BioRãd], -16- 0 processo mostrou não apresentar efeitos indesejáveis na capacidade fertilizante de espermatozóides e utilizou-se nos processos de fertilização assistida com espermatozóides isentos de anticorpos antiesperma o que resultou no nascimento de ninha_ das normais apÕs os processos de concepção assistida.

Os resultados resumem-se no Quadro I a seguir:

QUAtm-O Γ Doente Volume de Concentração Concentração Ligação com Ejaculação inicial inicial de "Immunobeads" m Total de es esperma móvel (Inicialmente 100¾) perma Cx 101 2 3 4 5 6 7 8/mU [x 106/ml) 0,8 50 18 100¾ IgG 100¾ IgA 3,6 92 9,2 26¾ IgG 65¾ IgA 61 47 100¾ IgG 100¾ IgA 2,5 9,1 1,7 0¾ IgG 0% IgA 1,0 246 216 100¾ IgG 100¾ IgA 8,7 38 3,5 41¾ IgG 50¾ IgA 2,8 7,7 1,3 0¾ IgG 0¾ IgA 4,5 114 5 14¾ IgG 40¾ IgA 3,2 52 24,4 0¾ IgG 0¾ IgA 9 1 2 3 4 5 6 7 8 -1 7 -

Estes resultados demonstram que em très de nove casos tratados, todos os anticorpos se eliminaram e que ainda em três casos se retiraram cerca de 50%, Nestes sets casos a motilidade do esperma no meio artificial e em muco cervical como se estabeleceu no momento, não existia inicialmente.

Exemplo 2

Deslocamento de anticorpos anti-esperma dos espermatozóides utilizando-se D-galactose e quimotripsina ,

Para se avaliar a linha de base dos níveis de anticorpo, os doentes ejecularam directamente para liquido idêntico ao tubular humano [HTF, Quinn et al,, 1985], e os que se classificaram com 3 na mistura com a reacçao de aglutinaçao para os anticorpos IgG e IgA ou os que eram 100% positivos para IgG e IgA na li^ gação com "Immunobeads" escolheram-se para o teste seguinte.

As condições do teste envolviam a ejaculação em 10 ml de meio HTF contendo 0,1 M de D-galactose e 5000 unidades USP de quimotripsina, Incubou-se a mistura durante 20 minutos a temperatura de 37°C e separaram-se os espermatozóides por centrifugação a 500 g durante 10 minutos, lavaram-se com um meio HTF .contendo 0,1 M de D-galactose, centrifugaram-se de novo e suspenderam-se numa concentração apropriada de espermatozóides com meio HTF antes de se repetir o teste para a ligação com "Immunobeads" ou a penetração no muco cervical, -18- EXEMPLO 3

Escolheu-se um grupo de 16 casais estéreis, com uma infertilidade primaria desde hâ muito, cuja Cínica causa detectãvel consistia em um tTtulo'de anticorpos anti-esperma elevado no sémen do marido,

Mediante a aplicação de tratamento ao semen do marido com uma solução de quimiotripsina e D-galactose, de acordo com o método descrito no Exemplo 1, utilizaram-se os espermatozóides tratados para fertilizar os Óvulos da mulher resultando 5 casos de gravidez a seguir a um único tratamento, mediante a aplicação deste processo,

Os métodos utilizados de fertilização foram: a) 7 fertilizações tn vitro (IVF), que provocaram 2 c^ sos de gravidez, b) 3 transferencias de gametos para o tubo intrafalopia^ no (GΓFT) , que provocaram 2 casos de gravidez, cl 6 processos FREDI (uma associação de IVF com inseminação intra-uterinaI, que provocou uma gravidez,

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. - Método para o tratamento de sémen e/ou espermatozóides, caracterizado pelo facto: a) de se misturar o sémen com uma solução reagente contendo uma protease e um sacarídeo; b) de se incubar a mistura sob condições de actividade da protease; e c) de se separar depois os espermatozóides da mistura resultante .
2. 2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar um sacarídeo derivado da galactose, de pre ferência D-galactose.
3. 3.- Método de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, carac -20-

   terizado pelo facto de se utilizar uma protease (enzima proteolíti^ ca) isenta de DNAse (isto é, qualquer enzima que degrade o DNA) e activa a pH substancialmente neutro, e de preferência uma serina--protease, por exemplo quimotripsina.
4. 4. - Processo para a preparação de uma solução reagente apropriada para a realização do método descrito nas reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se incluir uma protease e um saca-rídeo de preferência sob a forma de uma solução aquosa, com vantagem substancialmente isotõnica com os fluídos corporais, e, eventualmente, de se misturarem um ou mais agentes auxiliares conservantes do reagente propriamente dito ou dos espermatozóides.
5. 5. - Equipamento para a preparação de uma solução reagente de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de compreen der recipientes separados contendo respectivamente: a) um meio aquoso estéril contendo agentes aditivos tais como os necessários para tornarem a solução substancialmente iso tónica e/ou para actuarem como agentes conservantes, quer para a solução propriamente dita ou para depois da utilização : b) uma mistura seca do sacarideo e da protease; e c) eventualmente, um meio de lavagem e/ou de armazenagem.
6. 6. - Método para a utilização de um equipamento de acordo com -21-

   a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se inserir uma agulha hipodérmica através de um septo do recipiente a) para retirar a quantidade desejada de solução e de se inserir, em seguida, a agulha hipodérmica através do septo do recipiente b) para injec-tar aí a solução e de se agitar, depois, a mistura resultante no recipiente b) para dissolver os produtos sólidos e formar deste modo a solução reagente desejada. Lisboa, 25 de Outubro de 1989 O Agente Oficial da Propriedade Industrial