PT92059B - Processo para a preparacao dum promotor de virus da variola de aves domesticas - Google Patents
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-
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Description
Fundamentos da invenção
1. - Sector da invenção
A invenção insere-se no campo da tecnologia do AD recombinante e diz respeito a um promotor do vírus da vario la em aves, em especial varíola de aves domésticas, o qual é útil para a expressão do ADE estranho inserido num vector do vírus da varíola nas aves.
2. - Descrição do estado da técnica
Os vírus da varíola são vírus grandes com uma mor fologia complexa contendo genomas do ADE lineares com dupla tira. Eles estão entre os poucos grupos dos vírus ADE que se reproduzem dentro do citoplasma da célula. Eles são subdivididos em seis tipos:- vírus ortopox, virús avipox, víru capripox, vírus leporipox, vírus parapox e vírus entomopox. 0 vírus da vacina (VV), um vírus ortopox, é o mais amplamen te estudado dos vírus da varíola e ê objecto da patente U3 & 503 112 (Paoletti et al.). 0 vírus de. varíola nas aves do mésticas (FPV) é um vírus avipox ou vírus de varíola em ave
Os avanços recentes na tecnologia do ADE recombinante têm permitido que o W seja usado como vector para tr portar e expressar genes estranhos. 0 ADE estranho é introduzido no genoma W por um processo de recombinação homóloga. A recombinação homóloga implica, essencialmente: (1) a pré-selecção de uma extensão do genoma VV em alguma região que não prejudique a réplica e o funcionamento normal do ví rus (em seguida denominada uma região nao-essencial); (2) a formação de um conjunto que inclui un promotor VV e uma extensão do ADE estranho dentro de essencial (EEF) de forma que o ADE trolo do promotor e de forma que a estranho é flanqueada por extensas uma cópia da região não estranho fica sob o concombinação promotor-ADE sequências da região não
- 3 -essencial do ΑΏΝ V7; (3) a co-infecção de adequadas células da cultura de tecido com o W e o conjunto construído, e (Z a escolha de células que contêm W, em que a extensão pré-escclhida foi recombinada in vivo, de forma que é substituída no genoma pelo conjunto construído de AON. C W recom binante expressa o gene estranho in vivo, estimulando a imuni dade à proteína num agente adequado. 0 processo tem um considerável valor potencial para a utilização na vacinação.
liais recentemente, uma tecnologia semelhante foi aplicada ao vírus da varíola nas aves (FFV). Embora os promotores W tenham sido usados com êxito nos compostos laboratoriais de PPV, não é conveniente incorporar elementos do citado VV, um vírus ortopox, que tem uma vacina recombinante numa ampla gama de agentes, devido ao receio de ocorrências de recombinação que poderiam representar um risco para a saúde. Existe, portanto, a necessidade de desenvolver os promotores PPV para utilização como PPV recombinante. Deter minados promotores FPV, designados como promotores do gene PP4b foram descritos no pedido de patente UX S 824 74ó, agora publicação número 2 211 504 A, ou pedido PCT G3 83/ /00922, agora publicação rZ. VO/89/O3379 (NPDG). No entanto cada promotor tem as suas características especiais de forç e tempo de promoção. For conseguinte, é altamente convenien ;e a realização de uma escolha dos promoton
Sumario da Invenção
Quando 03 pedidos de patente anteriores foram positados, embos em 21 de Outubro de 1988, o seu tema f< ampliado pouco tempo antes do depósito, a fim d promotor de um outro gene conhecido como 0 gene 790 bp, ircluir o ;orcu:
bases 79 ele .enrro ’ra~mento EcoP.I :om tr dí écie de PPV sob pesquisa. Os dois pedidos parente anteriores eram 03 prim;
do requere:
l2~fb te eni qualquer país, para este tema especial. 0 resultada d continuação dos trabalhos é que agora é possível definir o gene 790 bp, s, portanto, o promotor, mais exactamente. A presente invenção proporciona o citado promotor e o presente pedido reivindica a prioridade de UKPA 8 824 745, deposi. tada em 21 de Outubro de 1988, e de um outro pedido depositado em 21 de Abril de 1989, antes que qualquer publicação sobre o promotor ocorresse nos pedidos anteriores (ou em ou tros documentos).
promotor da invenção é definido por referência ao gene URF 1 identificado na sequência do fragmento 790 bp ilustrado abaixo. Note-se que esta sequência é obtida na ou tra linha para o fragmento ilustrado em UKPA 8 824 745, mas é disposto na mesma direcção 3' e 5'· Além disso, a extensa exacta do fragmento foi determinada em 783 bp. Consequentemente, a posição 1 na sequência abaixo e o complemento da posição 795 (um número arbitrário) em UKPA 8 824 745, enquanto a posição 758 na sequência ilustrada abaixo é o complemento da posição 1 (também um número arbitrário) em UKPA 8 324 745. (Os nucleótidos com o número 759~783 abaixo não foram postos em sequência no pedido de patente anterior identi estão sóment
Referindo a sequência abaixo, ver-se-á que ficadas três estruturas de leitura-aberta. OS? totalmente dentro do fragmento, enquanto OS? 3 s em parte dentro dele. Determinou-se que OS?
foram s 1 e 2 está 1 é 0 gene que é forbemente otegi:
ATGATGTTCTATGTTAGGTAATTTAGACTATTCTTTTACTTCAATATTTATAATATCTAA
AGTATGGTAATTTATATAAACATTATTACAAAATAACGTACATTAAAAATGAAAAAGAAC (0RF1) MBSPAEKPTIDS 1 21 CATTAATATTATTGAACCCTAAAGCCATGGAATCTCCAGCTGAAAAACCAACAATCGATT
PPEGNVQPPSTDDKGVNTGP 181 CTCCCCCAGAAGGGAATGTACAACCTCCATCTACCGATGATAAAGGCGTAAATACCGGAC
KPSDGGCCEPECPYKTQDTN 241 CTAAACCTTCTGATGGGGGTTGTTGTGAGCCAGAATGTCCTTACAAAACCCAAGATACTA *
K *
01 ATAAGTAATTAAATTATTATATTCATTTTTATCTATATCGTAAAACATAAAAAATAGATA YTILNNYENKDIDYFMFFLY
61 TGTATTAATATGACGTAATATATGAATATATAATCTATACGATACACAAAATATCAATAG
TNIHRLIHIYLRYSVCFILL [0RF3] MFYISIIIVI
21 TATTATAAAATATAACAGTATACCAACCATAATGTTTTATATAAGTATCATCATCGTTAT
IIFYLLIGV M (0RF2J
LLVIPCNIAKI ISPRVKSKL 4 81 ACTTTTGGTAATACCGTGTAATATCGCTAAAATAATATCTCCCCGTGTTAAGAGCAAGTT
TENNIEFRYKTYMEDVVIYR 541 GACTGAAAATAATATCGAGTTTAGGTATAAAACTTATATGGAAGATGTGGTTATATATCG
TDCNTRLI IGVTNTVYVVNT 601 CACGGATTGTAATACCCGACTAATTATAGGAGTAACAAATACTGTATACGTGGTAAATAC tdksnitv.dfspdnvstqsg
661 AACCGATAAAAGCAATATTACGGTGGACTTTTCACCCGATAATGTATCGACACAATCAGG
ANYITF IGGYDDK I L V C G T N 721 CGCTAATTATATTACATTTATAGGTGGATATGATGACAAAATTCTAGTGTGTGGAACGAA
781 TTC
A ciência dos promotores do viras da varíola no ADZT a actualmente ainda pouco desenvolvida. Sabe-se que cer tas regiões na extremidade 5' om a montante de um gene se vem para ajudar na transcrição do ADN genomico para o RITA mensageiro mediante a ligação da polimerase RI7A implícita n transcrição, de forma que o mRNA, que contém o codão inicia] do gene, pode ser transcrito. As referidas regiões a montan te são designadas como o promotor. Não é frequentemente possível dizer ao certo quais os nucleótidos da sequência a montante que são essenciais, e quais os que nSo são essenciais, para a promoção, nem o comprimento mínimo ou máximo do promotor é conhecido com muita exectidão. Ainda que esta falta de exactidão no conhecimento acerca da localização e da extensão do promotor possam, à primeira vista, parecer bastan te insatisfatórios, na prática não representa um problema, visto que não há, normalmente, nenhum dano quando se inclui ADN além da reçião que serve para transcrever o ADN. Confor me ainda se vai descrever mais adiante, é possível determinar por meio de experiências repetidas a citada região com lais exactidão.
^m ;odas estas circunstâncias é, portanto, mais apropriado definir o promotor por referência ao gene que ele precede, em vez da referência à sequência do promoe 790 bp fortemente promovido gene cado por pesquisa entre quantidades de mRNA que são susceptíveis de se produzirem quando o ADN, virótico é transcrito.
A teoria e a cão de maiores q c o s . J de que os fo:
oomorore s antidades d 'im de evitar os problemas das experiências in vivo, o RIA foi preparado in vitro, de uma forma considerada como a de simular provavelmente a transcrição in vivo. 0 RNA assim preparado foi hibridisado para originar 3amHI e EcoRI a transcri 'rammentos ds istrição íNA do qu:
os promotores frado RPY 1DN. A forte hibridização
es vários fragmentos foi considerada como indicando um gene fortemente promovido e, por este meio, um tal gene que se inclui, pelo menos em parte, dentro de um fragmento 790 op ZcoRI, foi identificado e o fragmento parcialmente prolonga do em sequência.
Estes cinco genes podem ser definidos de várias maneiras, recordando sempre, é claro, que haverá indubitável mente diferenças menos significativas na sua sequência entre uma espécie ou tipo de FPV e uma outra. Uma maneira vantajosa, arbitrária, de os definir é por referência a uma adequa da extensão de sequência de aminoácido que eles codificam. Pode-se supor, razoavelmente, que os primeiros 20 aminoácidos, digamos, costumam formar uma sequência única no FPV.
Consequêntemente, o ADN promotor do vírus da vario la nas aves domésticas de acordo com a invenção, para a promoção da transcrição de um gene estranho, inserido num vector FPV, é definido como incluindo o promotor do gene que co difica uma proteína de cerca de 55 aminoácidos numa sequência que inicia:Met Glu Ser Pro Ala Glu Lys Pro T:
:ie
Asp Ser Pro Pro Glu Gly Asn Vai Gin Pro ou uma variante desta sequência de aminoácidos, em que o re ferido promotor consiste essencialmente na sequência para a extremidade 5' io gene citado, a nado gene.
A respeito das possíveis variações nos 20 aminoác: •sos entre as diferentes espécies de FPV, provavelmente haverá pelo menos 9Cp de homologia em todo o gene, mas oolerá haver realmente menos homologia nos orimeiros 20 aminoácido talve é 3 ou 4 diferenças. Todavia, rdit' verdadei?amente que nenhum especialista nesta técnica terá qualquer lúvida a respeito de qual o gene visado, apesar de alguma χ· aberraçao daquele tipo na sequencia do amrnoacido.
Embora o comprimento exacto do ADN exigido para a promoção não seja conhecido, é geralmente considerado como sendo de até 100 pares de base desde o local do início do AON, porém pode ser de até 50 pares de base afastados da re gião inicial do ADN (o codão ATG). Consequentemente, uma se quência de ADN, contida em 200 pares de base, geralmente dei tro de 150 pares e mais usualmente dentro de 100 ou mesmo 80 pares de base até ao gene ORFI na extremidade 5' (que pr£ cede imediatamente o codão inicial), tem especial interesse para os objectivos da invenção. A sequência ADN de 146 parei de base está ilustrada acima (0S?I começa em 147) e 0 restam te pode ser facilmente encontrado mediante a amplificação da sequência ao longo do genoma FPV, usando-se o fragmento 790 bp como amostra, que se identificar um clono que contém a sequência adicional necessária.
Como em todas as invenções de ADN, dever-se-á apro ciar que são possíveis algumas variações dos nucleótidos, ou seja, que a sequência dc promotor será capaz de variação, conforme se pode constatar por experiências.
A invenção inclui as moléculas de ADN, os vectores de recombinação, as cassetes, os vectores recombinantes de clonação, 0 ??V recombinante produzido pela recombinação no móloga de um ?FV similar com um inserto de ADN, culturas in vrt ro de células ni mai:
_ , processos de vacinaçao, e outros, todos conforme estão descritos e reivindicaics no no: so pedido de patente UN 3 824 7^8, mutatis mutaniis sm relação à definição do promotor do gene 790 cp 02? 1 do pressa te cedido.
Descrição das fo:
•‘ealização promotor de invenção pode ser obtido a partir do ??V, mas existem possivelmente variantes do mesmo noutros
vírus da varíola nas aves domésticas, por exemplo, no vírus da varíola em pombos ou em canários. Uma espécie adequado do vírus da varíola nos pombos está descrita no pedido de paten te europeu número 284 41õ A. Por conveniência, a invenção será seguida descrita com relação ao vírus da varíola nas aves domésticas, mas deverá ser entendido que o promotor pjo deria ser derivado de um outro vírus de varíola nas aves e, se se desejar, utilizado num vector de outro vírus de vario la de aves.
C vector de recombinação da invenção pode ser definido como incluindo um vector de clonação que contém uma região não essencial (UFF) de sequência do FPV, sendo a dita região UFE interrompida pelo ADU o qual é constituído por, ou inclui: (a) o promotor ADU da invenção, seguido por (b) um gene estranho (isto é, um gene que se deseja inserir no vector do FPV) que pode ser transcrito pelo promotor.
Pum aspecto especial, a invenção inclui um vector de recombinação, o qual compreende os seguintes elementos na ordem indicada:(1) uma primeira sequência recombinável de forma homóloga d genoma do vírus da varióla nas aves domésticas (FPV);
(2) uma sequencia dentro de não essencial (USA) do · uma orimei:
io ma FuV:
so PA, se li
| Apm de | acordo com a |
| tranho, | que pode ser |
| quando | c vírus da va |
| ligam | ao promotor, |
| ene est | ranho oara de |
o citauo vírus ira ;a.rte ue uma resiao ode ser transcrito ajusante no a dentro do mPUA);
;r.tro d ;endo a iquencia . uo genoma FPV, ferivelmente a meirs. e segunde
-cu ídc os e naa s s qu enc 1 a pr e ia orientação relativa que têm a primes ua ϋ±-.ϊ' uentro do genoma do FPV, e
(δ) uma segunda sequência recombinável de forna homóloga do genoma FPV, de forna que as referidas sequências (1) e (6) flanqueiam a iiFE. no genoma do FPV e têm a mesma orientação relativa no vector de recombinação, como têm den tro do genoma do FPV.
Num outro aspecto, a invenção inclui um conjunto construído, o qual compreende um promotor da invenção ligado, de forma transcrevível, a um gene estranho. Uma tal com» trução ou cassete pode ser inserida num vector de clonação o qual depois pode ser empregado como um vector recombinante, útil para a preparação de um vector de recombinação da invenção.
A invenção inclui ainda os hospedeiros que alojam 03 vectores da recombinação e recombinantes conforma a inven ção, especialmente um hospedeiro bacteriano que aloja um vec tor de plasmida.
A invenção é ainda dirigida a um FPV recombinante o qual é o produto dr recombinação homóloga do FPV com um vector de recombinação da invenção contendo um gene estranho ao processo de recombinação homóloga; às células de animais infectados com o citado recombinante de FPV; a um processo de cultura in vitro das citadas células infectadas; e a um processo de vacinação num animal que apresente uma reacção, em especial um frango, o qual compreende a inoculação do re ferido animal com o vector de recombinação da invenção.
hão se sabe ainda exactamente qual a quantidade da sequência 5' não codificada que é necessária para uma pro moção eficiente. Uo entanto, experiências podem ser realizadas no sentido de responder a esta questão, e de facto sigi mas pesquisas têm sido feitas em relação ao VV. Alas estão completamente descritas no acima citado documento UKPA S 824 7V6, nas páginas 12 e lp, cuja revelação é aqui ircoj porada a título de referência.
sequência sem perda ao efeito promocional, dever-se-á apreciar que é necessário que a invenção inclua sequências que são variantes devido a substituição, assim como anulação ou adição, a partir da sequência não codificada acima descrita vector de recombinação poderia conter uma sequem cia adicional à aqui mencionada, como ADN promotor. A sequê.i cia adicional poderia incluir; (a) uma. sequência adicional, adicionada à extremidade 5' do promotor; (b) uma sequência inserida no-promotor, sem se destruir a actividade do pronio tor, ou (c) parte da sequência do gene do PPV (inclusive o codão inicial do ATG e o seguimento), por exemplo até 100 h da mesma.
Ma prática da invenção em relação às aves domésti cas de galinheiro, um gene estranho, importante para a melhj> ria da condição das aves, seria inserido no vírus da varíola em aves. Preferivelmente, o gene será um adequado para vacina de sub-unidade in vivo, por exemplo um ou mais genes escolhidos entre o vírus da bronquite infecciosa (IBV), o vírus da bursite infecciosa, o vírus da doença de Nevcastle (MOV), o vírus da doença de ...arek, o vírus da infecção de la ringe e traqueia e as proteínas antigénicas codificadas nos genes da espécie Eimeria. Genes especiais com interesse são os genes de ponta do I3V e os genes HM e ? do MOV, conforme descritos no pedido de patente publicado r±2. V'C/86/05805 e pedido de patente europeu publicado n2 . 227G1G A (ambos da uma
National Research Deveio gens estranho seja correctamerJ cessário que o gene estranho tenha ciai ATG inserido na região que se promotor.
ent Corporation). A fim d;
que /
transferido in vivo, e ne;u
Orno
Ê necessário localiz;
uma ;piai :ouao ímo mcial ) do PPV, na quaJ ;e vai inserir o oromotoi da mvencao
oderiai
U' estranho. En principio, inseridos em qualquer região do genoma FF’ casse as funções básicas do vírus, ou interferisse na acção do promotor do FPV ou do gene estranho. Preferivelmente, a FER está dentro da repetição terminal invertida do genoma do FPV, conforme se descreve no pedido de patente UK F2.8914-50φ. 9 ou no seu PCT equivalente FCT/G3S9/00698, ambos depositados em 22 de Junho de 1939, cuja revelação á aqui incluída como referência. Seria de esperar, então, que duas cópias do gene estranho fossem inseridas no genoma do FPV, cada uma na direcção de uma extremidade.
A preparação dos vectores recombinantes e de recon binação, a inoculação de pássaros e todas as outras metodologias relevantes para a invenção são conforme descritas no supracitado UZPA 3 824- 74-6 e todas essas descrições são aqu;. incorporadas a título de referência, para fins de brevidade
Para a administração às aves como vacina, o vírus rscombinante pode ser dado às aves por meio de qualquer pro cesso adequado, por exemplo por aerossol, água potável, por via oral, por injecção intramuscular ou por inoculação nas o desejado g;
se;
que nao prejudi-1
Ingredientes como leite d
3 S ser usados oara estabili com a idade de 1 aerossol. A dose situada preferivelmente entre IC cada ave int O;
e snadado
-Γ* 1 ” Ό-Τ.
_l j_ a o . cr ~ cor ε no m:
e .a geralmente recom
Eme ora. a invençao tratamento ie pintos, .a t;
ou glicerol podem fere-se vacinar os através ie e 10S pfu,
Lo FPV rscombinante ooh
3211Γ13υΓδ.^δ.Ο 2 mal o enore IC pfu, cada .am;
destinaua ao cotenciald mimais que possam ser
-A u litíS.jO Γ3 í'êS Í1'3223Í2O3 C0’2 3 333 _ devidos ensaios, desse caso, a estranho torrar-se-ia muito amola.
'a oucros •em ο V77'1.'’, 'ectar
3ÍV com t
ao o;
> Jr ' d u. O 3 , :onsideraâo iscoina com segurança, eguro ine ealístic
C seguinte exemplo elustra a invenção.
ZXEÃTLO
Os promotores são sinais no ADN virótico que orientam a transcrição do ERA. Portanto, os promotores fortes irão dirigir a transcrição de maiores quantidades de RITA do que os promotores fracos. Isto é usado como uma forma de id tificaçao dos promotores eficazes. 3e o RKA virótico rotula, por rádio for hibridizado em fragmentos de restricção do ΑΒΪ virótico, imobilizado num filtro de nitrocelulose, poderiam ser identificadas regiões especiais do vírus que contêm os promotores fortes. Uo caso do último RUA, poder-se-ía esperar que isso fosse difícil, visto que se sabe que as transcrições do último RITA se estendem muito além das extremidades dos seus genes, possivelmente para dentro de fragmentos de restricção adjacentes, e por isso provocam confusão em quaisquer tentativas de mapeamento. Todavia, no primeiro RH seria uma abordagem útil (o primeiro RNA é o RUA feito antes da réplica do ADN, e o último EUA é feito após a réplin io ca do APU, por definição. 0 RIA feito mais tes da síntese da proteína pode ser referido como RHA imediato). Um processo conveniente para se efectuar o RUA, rotulado por rádio, da classe do primeiro imediato á utilizar um sistema in vitro que cortem o vírus purificado, trifosfatos de desoxi-nucleosido, um dos quais e rotulado or rádio e uma substância de amortacimento adequada. Isto
Hl) 1-0 oi rescrito a rrocosito ou seja anrimeiro vírus vaccinia ror S· Venkatesa?!
(η oqi > x u tuco de ensaio), destá ico in vivo (isto e, na d B. ”033, J. Virology 57 , 713-7 ^7 e verificou-se o RUA orodusido in vitro (isto é,
3 ΠΘ 12? 3 cultura i· mo ίο)
Purificação do vírus
;.rao :omo o
vírus foi desenvolvido nas células de fibroblas to do embrião do pinto (CEF) e purificado da seguinte forma:! quarenta frascos de 7 5 cm2 de CEFs foram infectados com 5xl0(> pfu por frasco, de PP9 (um composto isolado de HP 440 purificado em placa, sendo o HP 440 derivado por meio da passagem dupla, nas células CEF da estirpe HP 438, ctescrita no documento UKPA 8 824 746). Os frascos foram incubados a 37SC por 5 dias. Depois as células foram agitadas para dentro do meio e descidas a 7.000 rpm, durante 15 minutos. A camada sobrenadante contendo o vírus foi então centrifugada a 15.000 rpm, por 30 minutos, a 4eC. As peletes de vírus foram ressuspensas em 40 ml de solução salina tamponizada com fosfato (PBS). Esta foi colocada numa almofada de 10 ml de sacarose a 35% (peso por volume) e centrifugada a 15.000 rpm por 30 minutos. As peletes com vírus foram depois novamente suspensas num mililitro de PBS. Este foi colocado num gradiente de sacarose a 20-50% (peso/volume e centrifugado a 15.000 rpm durante 30 minutos. As duas tiras viréticas foram recolhidas e colocadas em gradientes de metrizamida a 20-60% (cerca de 1 ml por gra diente) e centrifugadas a 30.000 rpm durante 18-20 horas. Ee colheu-se depois a tira virótica (l ml por gradiente).
Síntese in vitro do ENA -marcado pfu de partículas do vírus purificado, da pre veniência acima indicada, foram usadas de forma seguinte, para produzir o ENA marcado (pelo processo de S.Venkatesan & B. Moss, 1981 loc. cit. ). A solução do vírus foi processada para originar 0,05% de Nonidet P-40 (NP-40) e deixada sobre gelo por 1 hora. Esta foi depois adicionada a uma solução contendo 50 mM de Tris-HGl (pH de 8,5), 10 mM de ditiotreitol, 5 mM de ATP, 1 mM de GTP e CTP, 10 mM de MgCl^, 10 /ãM de S-adenosil-metionina (AdoMet) e 100 jiCi de UTP rotulado com 32 P, sendo o volume total de 5 ml. Passados 30 minutos a 379C, adicionou-se mais AdoMet ( outra vez a mesma quan- 15 tidade) e a reacção incubada por mais 30 nfinutos. A reacção foi concluída com a adição de BDTA para 10 mM, e oa tubos fo ram colocados em gelo. 0 vírus foi depois peletizado por cen trifugação a 3θ·000 rpm, por 30 minutos, sendo o RNA rotulado contido na camada sobrenadante. A camada sobrenadante adicionou-se dodecil-sulfato de sódio (SDS) para uma concentração final de 0,25$ e a mistura foi extraída com um volume igual de fenol saturado em TE (10 mM de Tris-CHl, pH 7,5, 1 mM de EDTA). A camada aquosa foi retirada e extraída com die tiléter e o RNA precipitado por adição de l/lO volume de ace tato de sódio 3M e 2,5 volumes de etanol. 0 RNA foi centrifugado a 15.000 rpm por 10 minutos e a pelete foi novamente suspensa em 4 ml de solução de tio-cianato de guanidina (tiocianato de guanidina GM, 0,5$ de N-lauril-sarcosina de sódio, 5 mM de citrato de sódio, 0,1 M de 2-mercapto-etanol). Isto fo:. colocado numa almofada de 1 ml de CsCl/EDTA (5,7 M de CsCl,
0,1 M de EDTA) e centrifugado a 38.000 rpm por 18-20 horas a 18SC, para peletizar o RNA. A camada sobrenadante foi cui— dadosamente retirada e afastada e a pelete de RNA foi ressus pensa em 500 ^1 de água tratada com pirocarbonato de dietilo,
Hibridização para ADN
Um digesto de EcoRI do FPV ADN foi separado em geles com 0,9$ de agarose. 0 ADN foi transferido para filtros de nitrocelulose. Os filtros foram hibridizados previamente em 10 ml de 5x SSC (SSG é 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sódio) durante 2 horas a 602C. A suspensão foi rotulada,
ADN sendo usado como amostra, foi fervida por 3 minutos antes da adição aos filtros-. A amostra e os filtros foram incubados, com agitação, a 60- C, durante 18—20 horas. Os filtros foram lavados em 2xSSG, 0,1$ de SDS a 42eG por 30 minutos, depois em O,lxSSC, 0,1$ SDS a 25G por 30 minutos, e em seguida expostos a película de raios X.
ii ' I
RNA virótico marcado foi constatado hibridizar fortemente para sómente dois fragmentos 'EcoRI no digesto de FPV ADN. Um tinha 790 bp de comprimento, e o outro 3830 bp (algumas tiras com tamanho maior, especialmente na região de cerca de 6.000 bp, hibridizarem francamente. A tira de 38 bp foi depois identificada como estando dentro do fragmento 11,2 kb BamHI, referido no documento UKPA 8 824 746). 0 frag mento de cerca de 790 bp (extensão exacta:- 783 bp) foi ampliado como se mostrou acima.
Na patente UKPA 8 824 746» Exemplo 2, mostrou-se, no caso de outros promotores, que a forte hibridização do gene para o RNA correlato está relaccionada com a força do promotor (conforme determinada por ensaio).
i Identificação do ORF 1 !
Tendo estabelecido que 0 total fragmento de 790 j! bp é fortemente hibridizado para o FPV mRNA radiomarcado, i a fase seguinte era identificar qual dos supostos genes, representado pelae três ORF, é 0 responsável pela forte í hibridização e, portanto, pela forte promoção do mRNA. As seguintes experiências foram realizadas nas ORF 1-3 θ» como controlos, a sequência complementar.
Uma série de clonos Ml 3 de tira dnica, derivados das ORFs, foi colocada em filtros de nitrocelulose e ensaiada com RNA marcado in vitro, como já se descreveu para 0 11,2 kb BamHI ORFs na patente UKPA 8 824 746. Esta patente é aqui incluída a título de referência.
Os clonos eram como se seguem:I ORF Clono ref.
1.(147-305) US20 US11
| Nucleotido NQ | Hibridização esperada | |
| Início | Fim | (+ = Sim; - = Não) |
| 186 | 295 | + |
| 353 | 155 | — |
Ό)
| ORE | Clono 1 ref. | 'ucleotido 2. | Hibridização esperada “ = Í'i3.o) | |
| início | Eim | |||
| 2. | (4-50-501) U327 | 44-4- | 219 | + |
| U321 | 301 | 464- | - | |
| 7 s · | (4-52-783) U312 | 462 | 563 | + |
| US14- | 695 | 524- | - | |
| Somente o | clorto U320 hibridizou para o RNA in vi |
tro, demonstrando assim que a transcrição do OREI no fragme to de 0,79 kb EcoRI é o responsável peio facto de se iluminar com tanto brilho.
Devido à correlação acima referida entre o hibridização mRNA/ADN e a actividade do promotor, pode-se razoavelmente supor que o promotor de ORE 1 é o promotor forte.
Claims (7)
- REIVINDICAÇÕES:1-.— Processo para a preparação de um promotor de vírus da varíola de aves mediante a formação duma cassete de ADN, que compreende a ligação de um ADN promotor de vírus da varíola de aves a um gene estranho, de forma a promover a transcrição do gene estranho quando a cassete é inserida numa região não essencial do genoma do vírus da varíola de aves domésticas, caracterizado pelo facto de o ADN, que compreende o promotor do gene que codifica uma proteína com cerca de 53 aminoácidos numa sequência que começa da seguinte formaMet Glu Ser Pro Ala Glu lys Pro Thr Ile Asp Ser Pro Pro Glu Gly Asn Vai Gin Pro ou uma variação da mencionada sequência inicial de aminoácidos, sendo o referido promotor constituído essencialmente pela sequência para a extremidade 5’ do citado gene, a qual é não codificante para o mencionado gene, ser ligado ao gene estranho.
- 2- · - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de sequência do promotor não codi— ficante ter um comprimento de atá 200 nucleótido que precede imediatamente o codão inicial do gene.
- 3- . - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a sequência do promotor não codificante ter um comprimento de até 150 nucleótidos que precede imediatamente o codão inicial do gene.
- 4- . — Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o promotor estar dentro da seguinte sequência de 146 nucleótidos que precede imediatamen— te o codão inicial do gene como se segue:—ATGATGTTOT ATGPTAGGTA ATTTAGAGTA19 TIPTACTTGAATATTTA TAATATOTAA AGTATGGTAA TTTATATAAACATTATTACA AAATAACGTA GATTAAAAAT GAAAáâGAAOOATTAATATT ATTGAAGGCT AAAGGG ou dentro de uma variação da citada sequência.
- 5ã„ - Processo para a preparação de um vector de recombinação, para ser utilizado na produção de um vírus re combinante de varíola de aves domésticas (FPV) por meio de recombinação do ADN homólogo, em que o citado processo compreende a inserção de uma cassete de ADN, que inclui: a) o ADN promotor ligado a b) um gene estranho transcrevível pelo promotor, numa sequência da região não essencial (NFS) d<£> vírus de varíola das aves (FPV) contido num vector de clona ção, caracterizado pelo facto de ser inserida a cassete de ADN de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 ou 4.
- 6&. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se preparar um vector de recombinação que compreende uu vector de clonação que contém, c£ mo inserto, e ua seguinte ordem:1) uma primeira sequência :ombinável de genoma do vírus da varíola das ave s domesticas (PPV);cn ?o cuna primeix-a oarte ae uma região nao e i o ADN4:ucial (NFS) do genoma de (PPV) ; O.motor de acordo com a1, 2, 3 ou um gene e forma que ;tre<nho transcrevível o gene estranho seja lo promooor to cara o ml i(i y p η ο ,-'1 ,'.a v -v-. ' · ;n ‘ T. o c -t> -”· 1 ^u'·' q T· Q ··ΝΞΝ do genoma de PPV, tendo a primeira cias a mesma orientação relativa que a da , 1Λ.?iseira e a serrar o geno da partes da NLE dentro do genoma do i-tV, eδ) uma segunda sequência homologamente recombinável ma do FPV, de forma que as mencionadas sequências (1) e (δ) flanqueiam a Γ.31. do genoma de FPV e estão na mesma orientação relativa no vector de recombinação que têm dentro do genoma de FPV.
- 7S. - processo para a preparação de um vírus de varíola de aves domésticas recombinante por meio da infecção de células do animal in vitro com uma estirpe infecciosa, de vírus da varíola das aves domésticas parente e introdução do ADN do vector de recombinação nas referidas células, deixan do que aconteça a recombinação homóloga, caracterizado pelo facto de ser empregado um vector de recombinação preparado por um processo de acordo com as reivindicações 5 ou 6.rocesso oara vacinação de um animal sensível, em especial um pinto, caracterizado pelo facto de se inocular no citado animal nm FPV recombinante preparado se gundo 0 processo de acordo com a reivindi de preferência compreendida entre cerca de 10'Los:çao 7, numa d2 -°· a 10“ unidate formam placa (píu), em especia] íntre cerca de 10PiuLisboa, 20 de Outubro .e ±n-Ί.. -.1al
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