PT91410B - PROCESS FOR IDENTIFYING AND USING BIOSAETIC OR REGULATING GENES FOR THE ENHANCED PRODUCTION OF SECONDARY METABOLITES - Google Patents
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Abstract
Description
Descriçãodescription
PROCESSO PARA A IDENTIFICAÇÃO E DE UTILIZAÇÃO DE GENES BIOSSINTfiTICOS OU DE REGULAÇÃO PARA A PRODUÇÃO MELHORADA DE META.PROCESS FOR THE IDENTIFICATION AND USE OF BIOSYSTIC GENES OR REGULATION FOR IMPROVED GOAL PRODUCTION.
BOLITOS SECUNDÁRIOSSECONDARY BULLETS
INTRODUÇÃOINTRODUCTION
Domínio Técnico domínio da presente invenção diz respeito ao isolamento e ao uso de genes para a produção de metabolitos secundários.Technical Domain domain of the present invention concerns the isolation and use of genes for the production of secondary metabolites.
Antecedentes e Literatura de InteresseBackground and Literature of Interest
Como resultado dos melhoramentos na estirpe classica, a produção de penicilina ausentou enormemen te nas ultiaas quatro décadas* Estes melhoramentos da estirpe clássica foram inicialmente baseados em tratamentos mutagénicos de Penicillium chrysogenua e selecção subsequente dos mutantes que produzem mais penicilina. 0 desenvolvimento de téc_ nicas de clonagem contudo introduziu uma nova ferramenta po— tenclalmente mais poderosa para uma melhoria adicional da pr<> duçao de penicilina neste fungo.As a result of improvements in the classic strain, penicillin production has been largely absent for the past four decades * These improvements of the classic strain were initially based on mutagenic treatments of Penicillium chrysogenua and subsequent selection of the mutants that produce more penicillin. The development of cloning techniques, however, introduced a new, potentially more powerful tool for further improvement of penicillin production in this fungus.
A penicilina é produzida pelo fungo filamentoso P. chrysogenua em várias fases enzimáticas (por exemplo E. Alvarez et al., Antimlcrob. Agents Chemother. 31 (1987) pp. 1675-1682). Estas fases são apresentadas na FiguraPenicillin is produced by the filamentous fungus P. chrysogenua in various enzymatic phases (eg E. Alvarez et al., Antimlcrob. Agents Chemother. 31 (1987) pp. 1675-1682). These phases are shown in Figure
1. Ao longo da presente memória descritiva entende-se por genes directamente envolvidos na via biosintética, aqueles genes que codificam as enzimas activas em várias fases que conduzem ã produção de um metabolito secundário. Deste modo, no caso da produção de penicilina G ou V, os genes que codificam para as enzimas estão representados na Figura 1. A primeira reacçao é a formação do tripeptldeo £ -(L-ó^— amlnoadipil)—L-cis. teini1-D-vanila a partir de ácido -amino-adípico, cistelna e valina. A enzima que é responsável por esta reacçao é a sinte^ tase de ACV (daqui em diante referida como ACVS), uma enzima multifuncional de grande dimensão. 0 tripeptldeo é cicllzado pela acção da sintetase de isopenlcllina N (daqui em diante referida como IPNS) ou da ciclase. 0 produto de reacção é a isopenlcllina N, um composto que contem a estrutura de anel deO-lactama típica e que possui activldade antibacteriana. A fase final na formaçao da penicilina consiste na troca da cadeia lateral do ácido ot -aoinoadlpico da isopenlcllina N por uma cadeia lateral mais hidrofóbica. As cadeias laterais hidrofóbicas geralmente usadas na produção industrial sao quer o ácido fenilacético, dando como resultado a penicilina G, quer o ácido fenoxiacético, dando como resultado a penicilina1. Throughout this specification, genes directly involved in the biosynthetic pathway are those genes that encode the active enzymes in various stages that lead to the production of a secondary metabolite. Thus, in the case of the production of penicillin G or V, the genes that code for the enzymes are shown in Figure 1. The first reaction is the formation of the tripeptide £ - (L-O ^ - amylnoadipil) —L-cis. teini1-D-vanila from amino-adipic acid, cysteline and valine. The enzyme that is responsible for this reaction is the synthesis of ACV (hereinafter referred to as ACVS), a large multifunctional enzyme. The tripeptide is cycled by the action of N-isopenethyl synthase (hereinafter referred to as IPNS) or cyclase. The reaction product is isopenylcine N, a compound which contains the typical O-lactam ring structure and which has antibacterial activity. The final phase in the formation of penicillin consists of the exchange of the side chain of the isopenyllline N Î ± -oainoadlopic acid for a more hydrophobic side chain. The hydrophobic side chains generally used in industrial production are either phenylacetic acid, resulting in penicillin G, or phenoxyacetic acid, resulting in penicillin
V. Foi sugerido que a troca da cadeia lateral era uma reacçao catalisada por uma única enzima (A.L. Demain (1983) in: A.L. Demain e N.A. Solooon (ed), Àntibiotics containing theJ3-lactam structure I. Springer Verlag, Berlin; pp. 189-228). Contju do, é também possível uma reacção de duas fases que envolve oV. It was suggested that the side chain exchange was a reaction catalyzed by a single enzyme (AL Demain (1983) in: AL Demain and NA Solooon (ed), Àntibiotics containing theJ3-lactam structure I. Springer Verlag, Berlin; pp. 189-228). However, a two-phase reaction involving the
6-ÀPA como intermediário (E. Alvarez et al. , vide supra). A enzima que foi identificada como estando envolvida na reacção final é a acilCoA;6—APA-aciltransferase (daqui em diante refe_ rida como AT); esta enzima foi purificada até à homogeneidade (E. Alvarez et al.. vide supra). 0 envolvimento duma segunda enzima, catalisando a transformação de IPN em 6-APA, não pode ainda ser confirmada nem excluída.6-ÀPA as an intermediary (E. Alvarez et al., See above). The enzyme that has been identified as being involved in the final reaction is acylCoA; 6 — APA acyltransferase (hereinafter referred to as AT); this enzyme was purified to homogeneity (E. Alvarez et al .. see above). The involvement of a second enzyme, catalyzing the transformation of IPN into 6-APA, cannot yet be confirmed or excluded.
Nao é claro se uma ou mais reacçoes enzimátlcas limitam a velocidade qo processo da biosíntese da penicilina e se assim fôr, quais as fases enzimáticas que estão envolvidas.It is not clear whether one or more enzyme reactions limit the speed of the penicillin biosynthesis process and if so, which enzyme phases are involved.
Uma vez que a via biossintética da penicilina começa coo três ácidos aminados, os quais cada um por sua vez participam em outras vias metabólicas, as fases reguladoras nessas vias irão também influênciar a biossíntese da penicilina penicilina. Por outro lado, a produção de penici la é sujeita a um complexo mecanismo de repressão catabóllca das fontes de carbono e á regulaçao da fonte de azoto (J.F. Martin et al. In: H. Kleinkauf, H. von Dohren, R. Donnauer and G Neseman (eds), Regulation of secondary metbollte formation. VCH Verlaggesellschaft, Weinheim (1985), pp. 41-75). Poj dem também estar envolvidas nestes tipos de regulaçao proteínas reguladoras. Estas proteínas reguladoras e as proteínas reguladas por elas, são definidas como estando indirectamente envolvidas na via biossintética de um metabolito secundário, neste caso a penicilina.Since the penicillin biosynthetic pathway begins with three amino acids, which in turn each participate in other metabolic pathways, the regulatory phases in these pathways will also influence the penicillin biosynthesis. On the other hand, penile production is subject to a complex mechanism of catabolic repression of carbon sources and regulation of the nitrogen source (JF Martin et al. In: H. Kleinkauf, H. von Dohren, R. Donnauer and G Neseman (eds), Regulation of secondary metbollte formation, VCH Verlaggesellschaft, Weinheim (1985), pp. 41-75). They may also be involved in these types of regulation regulatory proteins. These regulatory proteins and the proteins regulated by them, are defined as being indirectly involved in the biosynthetic pathway of a secondary metabolite, in this case penicillin.
Até recentemente, apenas tinha sido clonado e sequenciado o gene de uma só das enzimas activas na via biossintética para a penicilina G, a sintetase de isopeni. cilina N (IPNS) ou ciclase (L.G. et al., Gene 48 (1986) pp. 257—266), usando o gene correspondente de Acremonium Chrysogenum (S. M. Samson et al. Nature 318 (1985) pp. 191-194). Es_Until recently, the gene for only one of the enzymes active in the biosynthetic pathway for penicillin G, isopeni synthase, had been cloned and sequenced. cilina N (IPNS) or cyclase (L.G. et al., Gene 48 (1986) pp. 257—266), using the corresponding Acremonium Chrysogenum gene (S. M. Samson et al. Nature 318 (1985) pp. 191-194). Es_
te gene foi clonado e identificado purificando a proteína IPNS, determinando a sequência de ácidos aainados amino-termi. nal, preparando um conjunto de oligodesoxirrlbonucleõtidos de acordo com esta sequência e sondando um banco genómico de cojb mídeos com estes oligodeoxyribonucleótidos misturados (S.M. Samson, vide supra).This gene was cloned and identified by purifying the IPNS protein, determining the amino acid amino acid sequence. nal, preparing a set of oligodeoxyribonucleotides in accordance with this sequence and probing a genomic bank of cojbids with these mixed oligodeoxyribonucleotides (S.M. Samson, see supra).
Estudos de melhoria de estirpes usen do os genes de sintetase de isopenicilina N de Penicillium chrysogenum clonados em Penicilium chrysogenum tiveram como resultado o reforço da actividade da enzima, mas não se obteve qualquer melhoria na produção da penicilina, nem se verifi. cou estimulação da síntese da penicilina (P.L. Slcatrud et al., Póster presentation 1987 Ânnual meeting of Society of Industrial Microbiology, Baltimore, August 1987, resumo publicado in SIM News 37 (1987) pp. 77).Strain improvement studies using the Penicillium chrysogenum isopenicillin N synthase genes cloned into Penicillium chrysogenum resulted in enhanced enzyme activity, but no improvement in penicillin production was found, nor was it verified. stimulated penicillin synthesis (P.L. Slcatrud et al., Poster presentation 1987 Annual meeting of Society of Industrial Microbiology, Baltimore, August 1987, abstract published in SIM News 37 (1987) pp. 77).
Foi descrito que a biossíntese dos antibióticos de β—lactama á submetida a repressão pela glucose (J.F. Martin e P. Liras, TIBS 3^ (1985), pp. 39-44). Esta repressão pela glucose foi inequivocamente estabelecida para a formação do tripeptídeo pelo ÀCVS e para a actividade dos IPNS (Revilla et al., J. Bact. 168 (1986), pp. 947-952). Para a aciltransferase, por outro lado, os dados são menos convincentes. Revilla et al (vide supra) referem que a AT nao é sub metida á repressão pela glucose, mas outros dados sugerem que a actividade de AT está ausente, ou pelo menos diminuída, na presença da glucose (B.Spencer e T. Maung, Proc. Biochem. Soc. 1970,pp. 29-30).It has been reported that the biosynthesis of β-lactam antibiotics is subjected to glucose suppression (J.F. Martin and P. Liras, TIBS 3 ^ (1985), pp. 39-44). This glucose repression was unequivocally established for the formation of the tripeptide by ÀCVS and for the activity of IPNS (Revilla et al., J. Bact. 168 (1986), pp. 947-952). For acyltransferase, on the other hand, the data is less convincing. Revilla et al (see above) report that AT is not subjected to glucose repression, but other data suggest that AT activity is absent, or at least decreased, in the presence of glucose (B.Spencer and T. Maung, Proc. Biochem, Soc. 1970, pp. 29-30).
Nao se conhece em que fase da expres. sao é exercida a repressão pela glucose; esta repressão tanto se pode dar no nível da transcrição como no nível da traduçao. Se se aplica a primeira regulaçao, as diferenças em níveis de RNAm entre as culturas que produzem e as que nao produzem podem ser utilizadas para isolar os referidos genes.It is not known at what stage of the expression. healthy repression by glucose is exerted; this repression can take place both at the level of transcription and at the level of translation. If the first regulation applies, the differences in mRNA levels between the cultures they produce and those they do not produce can be used to isolate those genes.
Existe para além disso incerteza nos níveis dos RNÀm’s que codificam para as várias enzimas nas cá.In addition, there is uncertainty in the levels of RNÀm’s that code for the various enzymes in them.
lulas que produzem penicilina.squid that produce penicillin.
RESUMO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION
São utilizados métodos de isolamento por subtracção para identificar genes associados com a produção de metabolitos secundários em microorganismos. 0 método é exemplificado com a produção de penicilina em P. chrysogenum.Subtraction isolation methods are used to identify genes associated with the production of secondary metabolites in microorganisms. The method is exemplified with the production of penicillin in P. chrysogenum.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figura 1Figure 1
A via biossintética para a penicilina 6 ou V em P. chrysogenum *é apresentada esquematicamente.The biosynthetic pathway for penicillin 6 or V in P. chrysogenum * is shown schematically.
Figura 2Figure 2
Mapa físico dos clones lambda isolado pelo método da presente invenção. Os clones lambda G2 e lambda B21 contêm o aglomerado dos genes da ciclase e da acil_ transferase. Os clones lambda B9, G5 e L5 contêm o gene críptico Y. Outros clones lambda contêm outros genes crípticos.Physical map of lambda clones isolated by the method of the present invention. The lambda G2 and lambda B21 clones contain the cluster of the cyclase and acyl transferase genes. Lambda clones B9, G5 and L5 contain the cryptic Y gene. Other lambda clones contain other cryptic genes.
E — EcoRI; B - BamHI; H « HindIII; K - Xpnl; Sa « Saci;E - EcoRI; B - BamHI; H «HindIII; K - Xpnl; Sa «Saci;
Sp - Sphl; P - PstI; X - Xhol; Xb · Xbal; Hp · Hpal;Sp - Sphl; P - PstI; X - Xhol; Xb · Xbal; Hp · Hpal;
N - Ncol e Bg - BglIIN - Ncol and Bg - BglII
K\\\\\\\\\5NS5NI · braço direito do bacteriófago lambda EMBL3 (9 Xb) | | « braço esquerdo do bacteriófago lambda EMBL3 (20,3 kg) n região que hibrida para pen+ ADNc ------ · região nao clara do mapa ( ) - posição/ocurrência de local de restrição não níti_ do la e ra são o braço esquerdo e o braço direito respectivamente do bacteriófago lambda.K \\\\\\\\\ 5NS5NI · right arm of the bacteriophage lambda EMBL3 (9 Xb) | | «Left arm of bacteriophage lambda EMBL3 (20.3 kg) n region that hybridizes to pen + cDNA ------ · unclear region of the map () - position / occurrence of unclear restriction site la and ra are the left arm and the right arm respectively of the lambda bacteriophage.
Figura 3Figure 3
Sequência de nucleótidos e sequência de ácidos aminados deduzida a partir do gene de aciltransfera.Nucleotide sequence and amino acid sequence deduced from the acyltransphere gene.
se de _P. chrysogenua.if _P. chrysogenua.
Figura 4Figure 4
Sequência de nucleótidos e sequência de ácidos aminados deduzida do gene pyrG de P_ chrysogenua. Es. ta sequência forna a maior parte do fragmento EcoRI de 2,4 kb que actua como uma sequência de estímulo da transformação.Nucleotide sequence and amino acid sequence deduced from the pyrG gene of P_chrysogenua. Es. this sequence forms the major part of the 2.4 kb EcoRI fragment that acts as a transformation stimulus sequence.
Figura 5Figure 5
Sequência de nucleótidos do pronotor do gene de quinase de fosfo^licerato de P. chrysogenua.Nucleotide sequence of the pronator of the P. chrysogenua phospho-lycerate kinase gene.
Figura 6Figure 6
Figura 8Figure 8
Um local de restrição e um mapa funcional de pRR05.A restriction site and a functional map of pRR05.
Figura 9Figure 9
Um local de restrição e um mapa funcional de pGJOl A e B.A restriction site and a functional map of pGJOl A and B.
Figura 10Figure 10
Um local de restrição e um mapa fun- 6 cional de pPS47.A restriction site and a functional map of pPS47.
DESCRIÇÃO DAS FORMAS ESPECÍFICAS DE CONCRETIZAÇÃODESCRIPTION OF THE SPECIFIC FORMS OF ACCOMPLISHMENT
De acordo com a presente invenção, ldentlflcam—se fragmentos de ADN que incluem sequências que são Donocistrõnicas ou policistrónicas. Os gene(s) codificado (s) pelas sequências são traduzidos em enzimas relacionadas com a produção de metabolitos secundários ou de outros produtos de interesse comercial. Estas sequências de interesse são identificadas por comparação com sequências de ARN isoladas de um organismo competente para produzir o metabilito secunda rio, no qual os genes de interesse são activamente expressos, e um microorganismo no qual a expressão é silenciosa. Por esta via é possível obter fragmentos de ADN que codificam um ou maia genes que são expressos diferencialmente e que estão envolvidos na formaçao de um produto de interesse comercial.According to the present invention, fragments of DNA are included which include sequences that are Donocistronic or polycistronic. The gene (s) encoded by the sequences are translated into enzymes related to the production of secondary metabolites or other products of commercial interest. These sequences of interest are identified by comparison with RNA sequences isolated from a competent organism to produce the second metabolite, in which the genes of interest are actively expressed, and a microorganism in which the expression is silent. In this way it is possible to obtain fragments of DNA that encode one or more genes that are differentially expressed and that are involved in the formation of a product of commercial interest.
termo expresso diferencialmente é usado através da sua aplicaçao para expressão do gene ou dos genes de interesse que sao especificamente activos somente sob certas condlçoes definidas e que está ausente (o que significa na presente memória descritiva estar presente a um ba^ xo nível de 5X ou inferior comparado com a fase actlva) sob outras condiçoes Igualmente bem definidas. A ausência de expressão pode ser um resultado de repressão ou da falta de indução da expressão do gene, de mutaçao ou de outros acontecimentos que têm como resultado o silêncio da transcrição do ge ne(s) de interesse. 0 ADN que e isolado pode resultar de uma selecção a partir de um banco de genes, quer seja de um banco genómica quer um banco que contem ADNc contido por exemplo num vector lambda ou num vector de clonagem cosmídico ou num vector de expressão. Pelo emprego de uma sonda de ADNc enriquecida por sequências expressas durante a biossíntese de me— tabolitos secundários, podem ser identificados híbridos positivos no banco para manipulaçao subsequente a fim de permitir a preparaçao de construções de expressão para as enzima(s) as. sociadas com a produção do metabolito secundário. Por conse—differentially expressed term is used through its application to express the gene or genes of interest which are specifically active only under certain defined conditions and which are absent (which means in the present specification to be present at a low level of 5X or compared to the active phase) under other equally well-defined conditions. The absence of expression can be a result of repression or the lack of induction of gene expression, mutation or other events that result in the silence of the transcription of the gene (s) of interest. The DNA that is isolated may result from a selection from a gene bank, whether from a genomic bank or a bank containing cDNA contained for example in a lambda vector or a cosmid cloning vector or an expression vector. By employing a cDNA probe enriched for sequences expressed during the biosynthesis of secondary metabolites, positive hybrids can be identified in the bank for subsequent manipulation to allow the preparation of expression constructs for the enzyme (s) as. associated with the production of the secondary metabolite. Therefore—
guinte procede-se a uma busca num banco de genes de um microorganismo usando duas sondas de ADNc, uma das quais é enrique^ cida em sequências do estado activo de transcrição e a outra é derivada da situaçao de silêncio de transcrição. Por comparação e subtração, é possível isolar os clones que contêm gene(s) que sao activamente expressos somente sob as condiçoes activas definidas.Next, a gene bank of a microorganism is searched using two cDNA probes, one of which is enriched in transcriptional active state sequences and the other is derived from the transcriptional silence situation. By comparison and subtraction, it is possible to isolate clones that contain gene (s) that are actively expressed only under the defined active conditions.
método é exemplificado pelo isolamento de genes envolvido na biossíntese de um metabolito secundário, ma is especif icamente de penicilina, usanido duas eon das de ADNc, a partir de micélio cultivado em lactose (produtor) e micélio cultivado em glucose (não produtor).The method is exemplified by the isolation of genes involved in the biosynthesis of a secondary metabolite, more specifically penicillin, using two eons of cDNA, from mycelium grown in lactose (producer) and mycelium grown in glucose (non-producer).
As sequências de ADN identificadas contêm pelo menos um gene que codifica para uma enzima biossíntetica de antibiótico e/ou para uma proteína reguladora a partir da via sitética integral ou mais geralmente qualquer proteína que se encontre envolvida seja qual for o caminho, quer positivo quer negativo, na biossíntese do referido antibiótico.The identified DNA sequences contain at least one gene that codes for an antibiotic biosynthetic enzyme and / or a regulatory protein from the integral pathway or more generally any protein that is involved, whether positive or negative , in the biosynthesis of said antibiotic.
As construções que actuam positivamente, quando devidamente introduzidos num raicroorganismo hos^ pedeiro adequado, aumentam a eficiência das vias biossínteticae operativas na produção de microorganismos que produzem — lactamas por aumento da dosagem do gene ou por expressão mais elevada do gene. Por outro lado, podem ser isoladas construções que têm um efeito negativo na produção de antibiótico (p.e. formação de produtos secundários). Estas construções são utilizados para inactivar o gene que actua negativamente por substituição do gene ou por outros métodos com um efeito semelhante. Ambas as utilizações dão como resultado rendimentos mais elevados do antibiótico pretendido durante a produção industrial. Este método Ó exemplificado por microorganismos que produzem —lactama para a produção de antibióticos, particularmente penicilinas, e encontra particular aplicação nestes casos. De preferência, o bloco integrado de expressão (cassete de expressão) incluirá genes que codificam para enzi.The constructs that act positively, when properly introduced into a suitable host microorganism, increase the efficiency of the biosynthetic and operative pathways in the production of microorganisms that produce - lactams by increasing the dose of the gene or by higher expression of the gene. On the other hand, constructions that have a negative effect on the production of antibiotics (e.g. formation of by-products) can be isolated. These constructs are used to inactivate the gene that acts negatively by replacing the gene or by other methods with a similar effect. Both uses result in higher yields of the desired antibiotic during industrial production. This method is exemplified by microorganisms that produce —lactam for the production of antibiotics, particularly penicillins, and finds particular application in these cases. Preferably, the integrated expression block (expression cassette) will include genes encoding for enzi.
mas que catalisam fases que limitam a velocidade ou genes que codificam para proteínas reguladoras para a indução de transcrição ou qualquer outros.but that catalyze speed-limiting phases or genes that code for regulatory proteins for the induction of transcription or any other.
método exposto para além disso pro porciona sequências para as quais o produto codificado nao é conhecido, mas verifica—se que a sequência proporciona uma ae lhorla do rendimento de um produto pretendido. Estas sequências sao referidas como genes crípticos, o que significa se quências que se podem obter por métodos de isolamento aqui descritos, sequências estas que abrangem genes para os quais nao é ainda atribuível qualquer função conhecida. Estes genes sao caracterizados por serem doseados e/ou expressos em quantidades mais elevadas nos microorganismos hospedeiros transformados em comparaçao com os seus hospedeiros nao transforoja dos. Para além dos genes crípticos, outros genes proporcionados são os genes de IPNS e de aclltransferase. Verificou-se que um gene críptico chamado Y proporciona uma biossíntese da penicilina melhorada.The exposed method furthermore provides sequences for which the encoded product is not known, but it appears that the sequence provides an improvement in the yield of a desired product. These sequences are referred to as cryptic genes, which means sequences that can be obtained by the isolation methods described herein, sequences that encompass genes for which no known function is yet attributable. These genes are characterized by being dosed and / or expressed in higher amounts in transformed host microorganisms compared to their non-transformed hosts. In addition to the cryptic genes, other genes provided are the IPNS and aclltransferase genes. A cryptic gene called Y has been found to provide improved penicillin biosynthesis.
Os microorganismos utilizados na prje sente invenção incluem tanto procariontes como eucariontes, incluindo bactérias, tais como as pertencentes ao grupo taxonõmico dos Actinomycetes ou dos Flavobacterium, ou fungos incluindo leveduras, pertencentes aos géneros Aspergillua, Acre monium ou Penicillium.The microorganisms used in the present invention include both prokaryotes and eukaryotes, including bacteria, such as those belonging to the taxonomic group of Actinomycetes or Flavobacterium, or fungi including yeasts, belonging to the genera Aspergillua, Acre monium or Penicillium.
Em dependência da origem dos fragmen. tos, é possível construír vários blocos integrados de expressão, quer genómicos ou de ADNc, quer procariéticos ou eucario ticos. Com ADN genómico de uma bactéria, o fragmento que contém uma região de codificação monocistronica ou policistroni— ca pode incluir a sua própria região de regulaçao de início de transcrição bem como uma região de terminação de transcrição e sinais de traduçao apropriados, por exemplo uma sequência de Shine—Delgarno e codoes de paragem. Quando o ADN geno— mico é de um fungo, normalmente apenas um gene está associado com uma região de regulaçao de início de transcrição, de tal modo que cada gene possui a sua própria região de regulaçao do início de transcrição independente. Quando se utiliza ADNc,Depending on the origin of the fragmen. several integrated expression blocks, either genomic or cDNA, prokaryotic or eukaryotic, can be constructed. With genomic DNA from a bacterium, the fragment containing a monocistronic or polycistronic coding region can include its own transcription start regulation region as well as a suitable transcription termination region and translation signals, for example a sequence from Shine — Delgarno and stop codons. When genomic DNA is from a fungus, normally only one gene is associated with a transcription start regulation region, such that each gene has its own independent transcription start regulation region. When using cDNA,
e necessário proporcionar uma região de regulação de início de transcrição apropriada, dependendo do organismo hospedeiro usado para a expressão subsequente.it is necessary to provide an appropriate transcriptional start regulation region, depending on the host organism used for subsequent expression.
Os genes de interesse podem ser obti dos por busca num banco de ADN preparado a partir do referido microorganisao com sondas obtidas de ARNm ou de ADN derivado de uma(primeira cultura do referido microorganismo que produza o referido metabolito secundário; por busca do referido banco de ADN com sondas obtidas de ARNm ou de ADN derivado de uma segunda cultura do referido microorganismo ou de um seu autante, que não produza o referido metabolito secundário; e identificação de fragmentos que contêm genes transcritos na referida primeira cultura que não são substancialaente transcritos na referida segunda cultura.The genes of interest can be obtained by searching a DNA bank prepared from said microorganism with probes obtained from mRNA or DNA derived from one ( first culture of said microorganism that produces said secondary metabolite; by searching for said bank of DNA with probes obtained from mRNA or DNA derived from a second culture of said microorganism or its autant, which does not produce said secondary metabolite, and identification of fragments containing genes transcribed in said first culture that are not substantially transcribed in said second culture.
Genes especialmente valiosos incluem os genes que são expressos especificamente durante a biossíntese de antibióticos, incluindo os genes que codificam para enzimas biossintáticas de ^-lactamas conhecidas na especialidade, por exemplo sintetase de tripeptídeo (ACVS), ciclase (INPS), aciltransferase (AT), epimerase, expandase, hidroxila^ se, transcarbamoilase, metoxilase e transacetilase. De preferência os genes que codificam para IPN:6-APÀ-aciltransferase ou o gene críptico ϊ sao doseados ou expressos em quantidades superiores o que dá como resultado rendimentos mais eleva, dos do antibiótico pretendido no fungo transformado.Especially valuable genes include genes that are expressed specifically during antibiotic biosynthesis, including genes encoding for β-lactam biosynthetic enzymes known in the art, for example tripeptide synthase (ACVS), cyclase (INPS), acyltransferase (AT) , epimerase, expandase, hydroxylase, transcarbamoylase, methoxylase and transacetylase. Preferably, the genes encoding for IPN: 6-APÀ-acyltransferase or the cryptic gene ϊ are dosed or expressed in higher quantities, which results in higher yields, of the desired antibiotic in the transformed fungus.
Será de interesse para os especialis. ta na matéria que os gene(s) a serem expressos num hospedeiro que produz uma lactama possam conter a sua própria sequência de promotor nativa que é reconhecida por uma polimerase de ARN da célula hospedeira, ou possam ser ligados a qualquer oti tro promotor adequado, p.e. o de um gene biossintético de · ~ lactama diferente ou o de um gene glicolítico tal como quinase de fosfoglicerato, deidrogenase de fosfato de gliceraldeído, isomerase de fosfato de trlose ou a do factor de elongaçao de translacção, Ef-Tu, ou similares.It will be of interest to specialists. It is important in the matter that the gene (s) to be expressed in a host that produces a lactam may contain their own native promoter sequence that is recognized by a host cell RNA polymerase, or may be linked to any other suitable promoter, eg a different lactam biosynthetic gene or a glycolytic gene such as phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, trlose phosphate isomerase or translation elongation factor, Ef-Tu, or the like.
Um tal promotor pode ser utilizado para influenciar a regulaçao da expressão de um ou de váriosSuch a promoter can be used to influence the regulation of the expression of one or more
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genes que codificam para as referidas enzimas. Isto conduzirá a uma produção aumentada do antibiótico depois da transformação, uma yez que a produção da penicilina á agora possível sob condições em que na estirpe de hospedeiro não transformada não levam á produção de penicilina, por exemplo, enzimas gllcolltos sao expressas na presença de glucose, enquanto a produção de penicilina, por outro lado, ó reprimida na presen. ça de glucose (J.F. Martin, vide supra). Submetendo a expressão dos genes biosslnteticos da penicilina à regulaçao de um promotor de um gene glicolltlco, os genes podem também ser ex pressos na presença da glucose e deste modo a penicilina pode ser produzida mais cedo na fermentação, quando uma alta concentração de glucose é necessária para a produção de uma quan^ tidade suficiente de micélio. Também o marcador de selecção pode ser mantido sob a regulação deste promotor.genes that code for said enzymes. This will lead to an increased production of the antibiotic after transformation, a way that penicillin production is now possible under conditions where in the untransformed host strain do not lead to the production of penicillin, for example, glycolated enzymes are expressed in the presence of glucose , while penicillin production, on the other hand, is repressed in the presence. glucose (J.F. Martin, see above). By subjecting the expression of the penicillin biosynthetic genes to the regulation of a promoter of a glycollic gene, the genes can also be expressed in the presence of glucose and thus penicillin can be produced earlier in fermentation, when a high concentration of glucose is required for the production of a sufficient amount of mycelium. The selection marker can also be kept under the regulation of this promoter.
A presente invenção exemplifica o promotor do gene de fosfogliceratoquinase de P. chrysogenun como um promotor para ser usado para superar a repressão pela glucose da blosslntese da penicilina. Este promotor foi isola, do a partir do banco genómico de P, chrysogenum por métodos normais, usando sondas de ollgodesoxirribonucleótldos da sequência de levedura publicada por R.A. Hitzman et al., Nucleic Acids Res. 10 (1982) pp. 7791—7808. A sequência de nucleótldos de um promotor de fosfogliceratoquinase encontra-se especificada na Figura 5.The present invention exemplifies the promoter of the P. chrysogenun phosphoglyceratokinase gene as a promoter to be used to overcome glucose repression of penicillin blosynthesis. This promoter was isolated from the genomic bank of P, chrysogenum by normal methods, using ollgodeoxyribonucleotide probes from the yeast sequence published by R.A. Hitzman et al., Nucleic Acids Res. 10 (1982) pp. 7791—7808. The nucleotide sequence of a phosphoglyceratokinase promoter is specified in Figure 5.
Para a transformaçao de Penicillium. empregam—se construções que incluem pelo menos um marcador pa. ra a selecção de células transformadas e, de preferência, para reforçar a conservação do ADN integrado. Contudo, de prefe^ rência o vector inclui uma sequência de ADN conhecida por aumentar a eficiência de transformaçao. Um exemplo de uma sequência de ADN com esta propriedade é o elemento ans, isola, do a partir de Aspergillus nidulans (cf. Ballance and Tutner, Gene 36 (1985) pp. 321-331). A presente invenção proporciona uma sequência de ADN, isolada a partir de um genoma de P. chrysogenum. que foi identificada como uma sequência com um efeito semelhante ao efeito da sequência βοβ. Uma vez queFor the transformation of Penicillium. constructions that include at least one pa marker are employed. for the selection of transformed cells and, preferably, to enhance the conservation of integrated DNA. However, the vector preferably includes a DNA sequence known to increase transformation efficiency. An example of a DNA sequence with this property is the element ans, isolated, from Aspergillus nidulans (cf. Ballance and Tutner, Gene 36 (1985) pp. 321-331). The present invention provides a DNA sequence, isolated from a P. chrysogenum genome. which has been identified as a sequence with an effect similar to the effect of the βοβ sequence. Once
esta sequência é nativa em relação a P. chrysogenua, pode ser usada para aumentar as eficiências de transformação em P. chrYsogenum. A sequência de ADN abrange o gene PyrG de P. chrysogenua e pode ser usado quer isoladamente, em combinação com um hospedeiro de pyrG. caso este em que a citada sequência de ADN proporciona tanto a selecçao de transformantes como o efeito de aumento da transformaçao (cf. EPA-260762), quer em combinação com um outro marcador de selecçao, por exemplo um gene que codifica para resistência a um biocida, tal como íleo, micina. Neste último caso a selecçao de transformantes e o efeito de realce da transformação são proporcionados por duas sequências separadas de ADN e a única função do elemento pyrG é de realçar as frequências de transformação.this sequence is native to P. chrysogenua, can be used to increase transformation efficiencies in P. chrYsogenum. The DNA sequence comprises the PyrG gene of P. chrysogenua and can be used either alone, in combination with a pyrG host. this case in which the aforementioned DNA sequence provides both the selection of transformants and the effect of increasing the transformation (cf. EPA-260762), or in combination with another selection marker, for example a gene that codes for resistance to a biocide, such as ileum, mycine. In the latter case, the selection of transformants and the transformation enhancement effect are provided by two separate DNA sequences and the only function of the pyrG element is to enhance the transformation frequencies.
Marcadores úteis para a selecçao de clones de transformantes podem ser genes biossintéticos homólogos ou heterólogos capazes de complementar uma necessidade auxotrífica da célula hospedeira, causada por um defeito na via metabólica para um ácido aminado, por exemplo arginina, para um precursor de um nucleótido, por exemplo uracilo, e si^ milares.Useful markers for the selection of transformant clones can be homologous or heterologous biosynthetic genes capable of complementing an auxotriphic need of the host cell, caused by a defect in the metabolic pathway for an amino acid, for example arginine, for a nucleotide precursor, for example example uracil, and similar.
gene estrutural que proporciona o marcador para selecçao pode ser nativo em relaçao ao hospedei, ro Penicillium de tipo selvagem ou um gene estrutural heteró— logo que é funcional no hospedeiro. Por exemplo, genes estruturais que codificam para uma enzima numa via metabólica podem ser derivados de Penicillium ou de outros fungos filamentosos, por exemplo Aspergillus. Neurospora, Podospora. ou de leveduras, em que o gene estrutural e funcional no hospedeiro Penicillium e complementa a auxotrofia para prototrofia.The structural gene providing the marker for selection may be native to the host, ro wild type Penicillium or a heterologous structural gene as soon as it is functional in the host. For example, structural genes that code for an enzyme in a metabolic pathway can be derived from Penicillium or other filamentous fungi, for example Aspergillus. Neurospora, Podospora. or yeast, in which the structural and functional gene in the host Penicillium and complements the auxotrophy for prototrophy.
gene estrutural complementar pode ser derivado de uma via metabílica, tal como a síntese de purinas ou de pirimidinas (nucleósidos) ou de ácidos aminados.Complementary structural gene can be derived from a metabolic pathway, such as the synthesis of purines or pyrimidines (nucleosides) or amino acids.
De interesse particular são os genes estruturais que codificam para enzimas na via da pirimidina, por exemplo o gene que codifica para a enzima descarboxilase de orotidina-5'-fosfato (pyrG ou pyr4). Outros genes de interesse sao os genes bios- 12 Of particular interest are the structural genes encoding enzymes in the pyrimidine pathway, for example the gene encoding the orotidine-5'-phosphate decarboxylase enzyme (pyrG or pyr4). Other genes of interest are the bios- 12 genes
sintéticos de ácidos aminados, por exemplo transferase de or— nitina—carbamoílo (arqB) e liase de arginino-succionato (arq4) 0 nso dos marcadores de selecçao anteriormente referidos é proporcionado por EP-A-260762.synthetic amino acid compounds, for example, orinitine-carbamoyl transferase (arqB) and arginine suctionate lyase (arq4) The number of the aforementioned selection markers is provided by EP-A-260762.
Em vez de marcadores auxotróficos, podem ser usados marcadores de fermentação, tais como a capacidade do uso de amidas como única fonte de carbono ou de azo, to, a cultura em vários açúcares, por exemplo em galactose, ou semelhantes.Instead of auxotrophic markers, fermentation markers, such as the ability to use amides as the sole source of carbon or azo, to culture in various sugars, for example in galactose, or the like, can be used.
Para além disso, podem ser usados os genes que codificam para a resistência a biocidas, tais como higromicina, gentamicina, fleomicina, glifosato, bialafos, e similares.In addition, genes encoding biocide resistance, such as hygromycin, gentamicin, phleomycin, glyphosate, bialaphos, and the like, can be used.
Sao proporcionadas construções que contêm a sequência de interesse e que podem incluir outras funções, tais como sistemas de replicação em um ou vários hos. pedeiros, por exemplo em hospedeiros de clonagem e/ou em hospedeiros alvo para expressão do oetabolito secundário; um ou mais marcadores para selecçao em um ou vários hospedeiros, co mo indicado acima; genes que realçam a eficiência da transfo£ aaçao; ou outra função especializada.Constructions are provided which contain the sequence of interest and which may include other functions, such as replication systems in one or more hoses. stonemasons, for example in cloning hosts and / or target hosts for expression of secondary oetabolite; one or more markers for selection on one or more hosts, as indicated above; genes that enhance the efficiency of transformation; or other specialized function.
A construção deve conter pelo menos um gene isolado pelo método da presente invenção. A construção pode ser preparada pelos meios convencionais isolando outros genes pretendidos dum hospedeiro adequado, sintetizando todos ou alguns dos genes ou as suas combinações. De mouo semelhante os sinais de regulaçao, as regiões de início de trans. criçao e de traduçao e as regiões de terminação podem ser iso. ladas de uma fonte natural, podem ser sintetizadas ou podem ser obtidas por combinações destes métodos. Os vários fragmen. tos podem ser submetidos a digestão por endonucleases (restr_i. çao), a ligaçao, a sequenciaçao, a mutagénese in vitro. a reparaçao por iniciadores ou a técnica semelhante. As várias ma nlpulações são bem conhecidas na literatura e podem ser utiM zadas para atingir fins específicos.The construct must contain at least one gene isolated by the method of the present invention. The construct can be prepared by conventional means by isolating other desired genes from a suitable host, synthesizing all or some of the genes or their combinations. Similar to the regulation signals, the regions of beginning of trans. and translation and termination regions can be iso. from a natural source, can be synthesized or obtained by combinations of these methods. The various fragmen. All of these can be subjected to endonuclease digestion (restriction), ligation, sequencing, in vitro mutagenesis. repair by initiators or similar technique. The various combinations are well known in the literature and can be used to achieve specific purposes.
Os vários fragmentos podem ser combi.The various fragments can be combined.
nados, clonados, isolados e eequenciados de acordo com as téç, “ 13 -cloned, isolated and equated according to the techniques, “13 -
nicas convencionais. Depois de cada manipulaçao o fragmento de ADN ou a combinação de fragmentos podem ser inseridos no vector de clonagem, o vector pode ser transformado num hospedeiro de clonagem, por exemplo em E. coli, o do hospedeiro de clonagem pode ser cultivado e lisado, o plasmídeo pode ser isolado e o fragmento pode ser analisado por análise de restrição ou por sequenciação, suas combinações ou por operações similares. 0 E. coli pode também ser usado como hospedeiro pa, ra a expressão de genes de interesse com o objectivo de produ. zir elevadas quantidades de proteína.conventional techniques. After each manipulation the DNA fragment or combination of fragments can be inserted into the cloning vector, the vector can be transformed into a cloning host, for example in E. coli, that of the cloning host can be cultured and lysed, the plasmid can be isolated and the fragment can be analyzed by restriction analysis or by sequencing, their combinations or similar operations. E. coli can also be used as a host for the expression of genes of interest for the purpose of production. high amounts of protein.
Podem ser utilizados vários vectores durante o decurso do desenvolvimento da construção e a transformação da célula hospedeira. Estes vectores podem incluir vectores de clonagem, vectores de expressão e vectores que proporcionam a integração no hospedeiro ou o uso de ADN simpli para transformaçao e integração.Various vectors can be used during the development of the construction and transformation of the host cell. These vectors can include cloning vectors, expression vectors and vectors that provide integration into the host or the use of simple DNA for transformation and integration.
vector de clonagem será caracteri— zado, na sua maior parte, por um marcador para aelecçao de um hospedeiro que contém o vector de clonagem e opcionalmente uma sequência de estimulação de transformaçao, pode ter um ou mals poliligantes, ou sequências adicionais para inserção, se_ lecção, manlpulaçao, facilidade de sequenciaçao, excisao ou similares.The cloning vector will be characterized, for the most part, by a marker for the selection of a host containing the cloning vector and optionally a transformation stimulation sequence, it may have one or more polylinkers, or additional sequences for insertion, if_ selection, manipulation, ease of sequencing, excision or similar.
A inserção de uma construção que inclui a região de início de transcrição e de tradução e as regiões de terminação pode normalmente ser conseguida por meio de vectores de expressão; em alternativa a construção pode li. gar uma ou ambas as regiões de regulaçao, que serão fornecidas pela expressão do vector na inserção da sequência que codifica para o produto proteico.The insertion of a construct that includes the transcription start and translation region and the termination regions can normally be achieved by means of expression vectors; alternatively the construction can be read. establish one or both of the regulatory regions, which will be provided by the expression of the vector in the insertion of the sequence coding for the protein product.
ADN que codifica as enzima(s) de interesse pode ser introduzido num hospedeiro Penicillium de acordo de forma substancial com o procedimento descrito em EP-A-260762.DNA encoding the enzyme (s) of interest can be introduced into a Penicillium host in a substantial manner according to the procedure described in EP-A-260762.
A transformaçao eficiente de Penicil liun é proporcionada para produzir transformantes que têm um ou maia genas estruturais capazes de expressão, particularmejnThe efficient transformation of Penicil liun is provided to produce transformants that have one or more structural genes capable of expression, particularly
te integrados no genoma do hospedeiro (integrantes). São preparadas construções de ADN que permitem a selecçao de células hospedeiras transformadas. Sao utilizadas condiçoes para a transformaçao as quais têm como resultado uma elevada frequên. cia de transformaçao para deste modo assegurar a selecçao e o isolamento dos hospedeiros transformados que expressam o gene (s) estrutural de interesse. Os transformantes proporcionam a manutenção estável e a expressão do ADN integrado. É de notar que o hospedeiro transformado de acordo com a presente invenção pode ser usado como estirpe inicial nos processos de melhoria de estirpe em vez de se usar uma transformaçao de mediação de ADN, por exemplo, fusão de protoplastos, emparelha— mento em massa e mutaçao. As estirpes resultantes sao conside. radas como fazendo parte da presente invenção.integrated into the host genome (members). DNA constructs are prepared that allow selection of transformed host cells. Conditions for transformation are used which result in a high frequency. transformation to thereby ensure the selection and isolation of transformed hosts that express the structural gene (s) of interest. Transformants provide stable maintenance and expression of integrated DNA. It is to be noted that the host transformed according to the present invention can be used as a starting strain in strain improvement processes instead of using a DNA mediating transformation, for example, protoplast fusion, mass matching and mutation. The resulting strains are considered. considered to be part of the present invention.
Os genes com interesse para serem in. troduzldos por transformaçao podem formar uma parte integral do vector de transformaçao, mas será muitas vezes mais conveniente proporcionar estes genes num vector separado na mistura de transformaçao, introduzindo deste modo os referidos genes por cotransformação em conjunto com o vector selectivo, o que é um processo razoavelmente eficiente em fungos filamento, sos (P.J. Punt et al., Gene 56 (1987) pp. 117-124; X. Wernars et al, Mol. Gen. Genet: 209 (1987) pp. 71-77; I.E. Mattern et al., Mol. Gen, Genet. 210 (1987) pp. 460-461).The genes with interest to be in. Transformation troducts can form an integral part of the transformation vector, but it will often be more convenient to provide these genes in a separate vector in the transformation mixture, thereby introducing said genes by cotransformation together with the selective vector, which is a process reasonably effective on filamentous, sos fungi (PJ Punt et al., Gene 56 (1987) pp. 117-124; X. Wernars et al, Mol. Gen. Genet: 209 (1987) pp. 71-77; IE Mattern et al., Mol. Gen, Genet. 210 (1987) pp. 460-461).
Como resultado da transformação have. rã pelo menos uma copia do gene(s) com interesse, frequentemente duas ou mais, normalmente nao excedendo cerca de 100, mais habitualmente nao excedendo cerca de 10. 0 numero dependerá acima de tudo de se empregar integração ou manutenção episomal estável, do número de cópias integrado e de a construção que se pretende preparar ser submetida a amplificaçao e de factores semelhantes.As a result of the have transformation. frog at least one copy of the gene (s) of interest, often two or more, usually not exceeding about 100, most usually not exceeding about 10. The number will depend above all on whether to employ stable episomal integration or maintenance, the number of integrated copies and the construction to be prepared to undergo amplification and similar factors.
A presente invenção exemplifica um método para isolar genes que envolve a biosslntese da penicilina a partir de um banco de genes do organismo produtor, P.. chrysogenum, usando sondas de ADNc específicas, método este que é paradigmático para a identificação de genes criptícosThe present invention exemplifies a method for isolating genes that involves the biosynthesis of penicillin from a gene bank of the producing organism, P .. chrysogenum, using specific cDNA probes, a method that is paradigmatic for the identification of cryptic genes
para a melhoria da produção de metabolitos secundários. Este método para o isolamento de construções de ADN que codificam um ou mais genes que tomam parte na biossíntese de metabolitos secundários, compreende a busca num banco de genes com uma sonda de ADNc enriquecida em sequências expressas especificamente durante a biossíntese. Por expresso especificamen— te pretende-se significar que a expressão destes genes á silenciosa ou a um nível muito baixo (por exemplo menos que 5% do nível de produção) na ausência de produção de penicilina e em contraste á alto durante a produção da penicilina. Para e_s te fim, sintetizam—se sondas de ADNc marcadas por radioisõto— pos ou de outra forma em moldes de RNAm isolados a partir de micálio de P. chrysogenum durante a fase de produção de penicilina .to improve the production of secondary metabolites. This method for the isolation of DNA constructs that encode one or more genes that take part in the biosynthesis of secondary metabolites, comprises searching a gene bank with a cDNA probe enriched in sequences specifically expressed during biosynthesis. By express specifically, it is meant that the expression of these genes is silent or at a very low level (for example less than 5% of the production level) in the absence of penicillin production and in contrast to high during penicillin production . To this end, radioisotope-labeled cDNA probes or otherwise are synthesized in mRNA templates isolated from P. chrysogenum mycelium during the penicillin production phase.
As sondas sao em seguida enriquecidas em sequências que hibridam especificamente com os genes pretendidos eliminando aquelas sequências de ADNc que hibri— dam com ARNm derivado de uma fermentação de Penicillium sob condiçoes que nao permitem a produção de penicilina, por exea pio concentração de glucose alta. Usando esta sonda enriqueci, da seleccionam-se clones de um banco de genes de chrysogenum que nao hibrida com uma sonda derivada de um micálio nao produtor. Parece que um grande número de clones assim isolados codificam para a enzima biossintética de penicilina sinte^ tase de isopenicilina N (IPNSou ciclase).The probes are then enriched in sequences that specifically hybridize with the desired genes by eliminating those cDNA sequences that hybridize with mRNA derived from a Penicillium fermentation under conditions that do not allow the production of penicillin, for example by the high glucose concentration. Using this enriched probe, clones are selected from a chrysogenum gene bank that does not hybridize with a probe derived from a non-producing mycelium. It appears that a large number of clones thus isolated encode the biosynthetic enzyme of penicillin synthase isopenicillin N (IPNS or cyclase).
Para além disso, verifica-se estarem presentes entre os clones seleccionados algumas cópias do gene que codifica para a enzima de permuta da cadeia lateral (aciltransferase). Esta presença á provada com experiências em que se utiliza uma sonda de ADN, com base na sequência pe£ tídica aminoterminal da enzima purificada. A entidade destes clones á verificada por via bioquímica e biológica. A sequência nucleotídica e a sequência deduzida de ácidos aminados do gene de aciltransferase são especificados na Figura 3. Surpre. endentemente, os genes que codificam para as enzimas sintetase de isopenicilina N e aciltransferase estão presentes ambosIn addition, some copies of the gene encoding the side chain exchange enzyme (acyltransferase) are found among the selected clones. This presence is proven with experiments using a DNA probe, based on the amino acid terminal sequence of the purified enzyme. The entity of these clones is verified biochemically and biologically. The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of the acyltransferase gene are specified in Figure 3. Surprise. Accordingly, the genes encoding the isopenicillin N synthase and acyltransferase enzymes are both present
num fragmento de ADR. Esta presença foi demonstrada pela hibridação de um banco genõmico de chrysogenua no vector laio da EMBL3 com sondas separadas, específicas para cada um dos dois genes referidos. Clones idênticos hibridam separadaaente com as duas sondas.in an ADR fragment. This presence was demonstrated by the hybridization of a genomic bank of chrysogenua in the ilium vector of EMBL3 with separate probes, specific for each of the two genes mentioned. Identical clones hybridize separately with the two probes.
Para além disso, depois da construção de um mapa físico de um clone lambda genõmico e da hibridaçao de produtos de digestão do clone lambda com sondas sepa, radas para os dois genes, a organização genómica é verificada ser conforme delineado na Figura 2 (clones B21 e G2). A presença dos dois genes de um fragmento de ADN extenso permite a construção de estirpes de P. chrysogenum com uma dosagem maior dos genes da sintetase de isopenicilina N e da aciltransferase , sem perturbação da organização relativa ou da expressão equilibrada dos dois genes. Para além disso, a introdução de coplas múltiplas do referido fragmento de ADN extenso permite a expressão dos dois genes do referido fragmento no seu meio natural com sequências a montante e a jusante que são idênticas à situação normal.In addition, after the construction of a physical map of a genomic lambda clone and the hybridization of digestion products of the lambda clone with sepa probes, used for both genes, the genomic organization is verified to be as outlined in Figure 2 (clones B21 and G2). The presence of the two genes of an extensive DNA fragment allows the construction of strains of P. chrysogenum with a higher dosage of the isopenicillin N synthase and acyltransferase genes, without disturbing the relative organization or balanced expression of the two genes. In addition, the introduction of multiple plots of said extensive DNA fragment allows the expression of the two genes of said fragment in its natural environment with sequences upstream and downstream that are identical to the normal situation.
Tanto a expressão equilibrada como a manutenção do meio natural podem ser beneficas para a eficiêii cia do gene de expressão e deste modo para a produção da penjL cilina. As técnicas de isolamento do aglomerado dos genes da sintetase de isopenicilina N e da aciltransferase podem ser aplicadas com vantagem para o Isolamento de outros genes bios. sínteticos de penicilina por técnicas de movimentação cromos— sómica, na qual os genes biossinteticos de penicilina podem ser aglomerados.Both balanced expression and the maintenance of the natural environment can be beneficial for the efficiency of the expression gene and thus for the production of penilin. The isolation techniques of the isopenicillin N synthetase and acyltransferase genes can be applied with advantage to the isolation of other bios genes. synthetic penicillin by chromosomal movement techniques, in which penicillin biosynthetic genes can be clustered.
Para além disso, isolaram-se vários genes crípticos, para os quais nenhuma função foi assinalada ainda mas que provavelmente desempenham um papel na biossínte_ se da —lactamas. Na figura 2 apresenta—se um mapa físico dos genes crípticos da presente invenção (clones B9 a B23).In addition, several cryptic genes have been isolated, for which no function has yet been identified but which probably play a role in the biosynthesis of —lactams. Figure 2 shows a physical map of the cryptic genes of the present invention (clones B9 to B23).
Destes genes criptícos, o gene designado por Y, presente nos clones B9, L5 e G5, quando utilizado na transformaçao (num sub—fragmento Sphl + BamRI de 3,0 kb) dum hospedeiro adequado, estimula a produção de penicili17Of these cryptic genes, the gene designated by Y, present in clones B9, L5 and G5, when used in the transformation (into a 3.0 kb Sphl + BamRI sub-fragment) of a suitable host, stimulates the production of penicilli17
na em 26Z, em conparaçao cora o hospedeiro nao transformado. Este facto demonstra o envolvimento do produto do gene Y na biossíntese da penicilina. Para além disso, esta observação demonstra que a transformação asando os genes que isolados pe. lo método da presente invenção, sem conhecimento da sua função ou da sua identidade, podem ser aplicadas sucessivamente na melhoria da estirpe de P.. chrysogenum.in 26Z, in comparison with the untransformed host. This fact demonstrates the involvement of the Y gene product in penicillin biosynthesis. In addition, this observation demonstrates that the transformation using the genes that isolated Fr. The method of the present invention, without knowledge of its function or identity, can be applied successively to the improvement of the P. chrysogenum strain.
A presente invenção é para além disso exemplificada pela transformação de Penicillium chrysogenoa com genes que sao especificamente expressos sob condiçoee nas quais o antibiótico é sintetizado, e que codificam para produtos génicos que catalisam reacçoes biossintéticas que lje vam aos referidos antibióticos.The present invention is further exemplified by the transformation of Penicillium chrysogenoa with genes that are specifically expressed under conditions in which the antibiotic is synthesized, and which code for gene products that catalyze biosynthetic reactions that go against said antibiotics.
Uma destas enzimas, a aciltransferase (daqui em diante referida como AT), cataliza a fase final na biossíntese da penicilina, isto é a permuta da fracção de amlnoadipilo da Isopenicilina N com um precursor da cadeia la. teral de acilo hidrifóbica, por exemplo ácido fenilacético ou ácido fenoxiacético, dando assim origem a penicilina G ou a penicilina V, respectivamente.One of these enzymes, acyltransferase (hereinafter referred to as AT), catalyzes the final phase in the biosynthesis of penicillin, that is, the exchange of the amlnoadipyl fraction of Isopenicillin N with a precursor of the la chain. hydrophobic acyl ester, for example phenylacetic acid or phenoxyacetic acid, thereby giving rise to penicillin G or penicillin V, respectively.
Apreeenta-se o gene de aciltransf era. se de P_. chrysogenum, incluindo a sequência de ácido nucleíco. A presente invenção proporciona mutações conservativae, em que as sequências codificam para as mesmas sequências de ácidos aminados, mas podem ter ate 30Z de bases diferentes, ou mutações que não são conservativae, em que menos que cerca de 10Z, mais usualmente menos que cerca de 5Z, e de preferência não mais do que IX dos ácidos aminados sao substituídos ou eli^ minados, e há menos de 5Z de ácidos aminados inseridos, sendo a percentagem baseada no número de ácidos aminados de ocurrên. cia natural. Para além disso podem ser utilizados como sondas para a produção de anticorpos fragmentos dos dois ácidos que codificam para a enzima, normalmente de pelo menos cerca de 9 codoes, mais normalmente de pelo menos cerca de 15 codoes, bem como os seus produtos de expressão ou semelhantes. As son. das podem ser usadas para identificar a enzima em outras espe^ cies pelo emprego de ácidos nucleicos para hibridação ou dosThe acyltransf era gene is prized. if P_. chrysogenum, including the nucleic acid sequence. The present invention provides conservative mutations, in which the sequences encode the same amino acid sequences, but can have up to 30Z of different bases, or mutations that are not conservative, in which less than about 10Z, more usually less than about 5Z, and preferably no more than IX of the amino acids are substituted or eliminated, and there is less than 5Z of amino acids inserted, the percentage being based on the number of amino acids occurring. natural science. In addition, fragments of the two acids encoding the enzyme can be used as probes for the production of antibodies, usually at least about 9 codons, more usually at least about 15 codons, as well as their expression products or similar. The son. can be used to identify the enzyme in other species by using nucleic acids for hybridization or
anticorpos para Identificação das proteínas de reacção cruzada.antibodies for identification of cross-reactive proteins.
 pesquisa de precursores de cadeia lateral não natural ou de outras penicilinas ou cefalosporinas que podem servir como substrato para a aciltransferese po. de ser complementada pela pesquisa de enzimas de aciltranafe— rese mutantes que podem aceitar como substrato precursores de uma cadela lateral diferentes do ácido fenilacático ou do áci^ do fenoxiacético, ou penicilinas ou cefalosporinas que não ee jam isopenicilina N. A presente invenção proporciona a matéria prima para tal pesquisa de uma enzima de aciltransferase mutante. 0 melhor hospedeiro para experiências de clonagem muta. cional é o E.. coli: uma vez que o E. coll não tem a aparelhagem de corte para a remoção dos iroes presentes no gene de aciltransferase, um clone de ADNc do gene de aciltransferase é a sequência preferida para a expressão da enzima ee E. coll. Esta sequência de ADNc pode ser facilmente mutata por processos bem conhecidos na especialidade tais como, por exemplo, tratamento com radiaçao (raios X ou UV) ou substâncias químicas mutagénicas tais como metanossulfonato de etilo, nitrosoguanldina ou metanossulfonato de metilo) ou mutagéneae especX fica para um local, para obter enzimas mutantes que por um la. do reconheçam os precursores de cadeia lateral nao natural co mo substrato e catalizem a formação de penicilinas nao naturais a partir da isopenicilina N, ou por outro lado catalizem a reacção de permuta em penicilinas e cefalosporinas que não sejam a isopenicilina N.Searching for unnatural side chain precursors or other penicillins or cephalosporins that can serve as a substrate for acyltransferesis po. to be complemented by the search for mutant acyltransfer enzymes that can accept precursors of a side bitch other than phenylacetic acid or phenoxyacetic acid, or penicillins or cephalosporins other than isopenicillin N. The present invention provides the material press for such a search for a mutant acyltransferase enzyme. The best host for mute cloning experiments. is E. coli: since E. coll does not have the cutting apparatus for removing the ions present in the acyltransferase gene, a cDNA clone of the acyltransferase gene is the preferred sequence for the expression of the ee enzyme E. coll. This cDNA sequence can be easily mutated by processes well known in the art such as, for example, radiation treatment (X-rays or UV) or mutagenic chemicals such as ethyl methanesulfonate, nitrosoguanldine or methyl methanesulfonate) or specific mutagenicity for a place, to get mutant enzymes that put it there. recognize unnatural side chain precursors as a substrate and catalyze the formation of unnatural penicillins from isopenicillin N, or on the other hand catalyze the exchange reaction in penicillins and cephalosporins other than isopenicillin N.
isolamento dos genes da AT e Y e outros genes biosslntéticos permite a identificação de elemen^ toa reguladores dos genes individuais tais como um promotor, uma sequência activadora a montante (SAM), um terminador e si. milares. Isto pode ser conseguido por comparaçao de sequência dos genes entre eles próprios e por comparaçao com a sequência como é obtida para o gene biossintético de sintetase de isope. nicillna N e outros genes referidos. Esta última comparaçao, contudo, pode apresentar a natureza específica da regulaçao da expressão do gene do grupo de genes biosslntéticos de penlisolation of AT and Y genes and other biosynthetic genes allows for the identification of regulatory elements of individual genes such as a promoter, an upstream activator sequence (SAM), a terminator and si. pillars. This can be accomplished by comparing the sequence of the genes among themselves and by comparing the sequence as obtained for the isope synthetase biosynthetic gene. nicillna N and other related genes. This last comparison, however, may present the specific nature of the regulation of gene expression in the group of penl biosynthetic genes
cilina.cilina.
A identificação de um tal elemento regulador bioasintetico de penicilina leva ã identificação de proteínas reguladoras específicas por meio de técnicas nor_ mais como retardamento de gel, ligação cruzada, rasto de ADN e similares. 0 isolamento de proteína reguladora específica por cromatografia de afinidade tem como resultado a clonagem do gene que codifica para a referida proteína e a subsequente menlpulaçao num hospedeiro adequado.The identification of such a bioasynthetic regulatory element of penicillin leads to the identification of specific regulatory proteins by means of standard techniques such as gel retardation, crosslinking, DNA tracing and the like. Isolation of specific regulatory protein by affinity chromatography results in the cloning of the gene encoding that protein and subsequent meningulation in a suitable host.
Pela utilização do gene AT, do gene Y e de outros genes biossinteticos de penicilina clonados, po_ dem ser projectadas e sintetizadas enzimas modificadas. Estas modificações darão como resultado modificação das caracterís— ticas das enzimas, tal como uma mudança nos valores óptimos de pH ou de temperatura, uma mudança na estabelidade ou uma mudança na especificidade do substrato. As estirpes hospedeiras, transformadas com genes que codificam para estas enzimas modificadas, podem ser programadas para realizar a síntese de antibiótico sob condições diferentes ou para sintetizar antibióticos alternativos, por exemplo ampicillna em vez de penicilina.By using the AT gene, the Y gene and other cloned penicillin biosynthetic genes, modified enzymes can be designed and synthesized. These modifications will result in modification of the characteristics of the enzymes, such as a change in the optimum pH or temperature values, a change in the establishment or a change in the specificity of the substrate. The host strains, transformed with genes that code for these modified enzymes, can be programmed to perform antibiotic synthesis under different conditions or to synthesize alternative antibiotics, for example ampicillna instead of penicillin.
Num outro aspecto da presente invenção, os genes clonados podem ser usados para transformar as estirpes hospedeiras que nao possuem naturalmente estas enzimas. δ conhecido que em Streptomyces e em Acremonlum nao ocor re a enzima AT, enquanto que por outro lado em Penlcillium nao ocorrem os genes das enzimas blossintéticas da cefalosporina e da cefamicina. A introdução de tais genes nos hospedei^ ros dará como resultado a blossíntese de cefalosporina ou de cefamicina por Penlcillium ou de penicilina ou cefalosporinas com uma cadeia lateral hidrofóbica por Acremonlum.In another aspect of the present invention, the cloned genes can be used to transform host strains that do not naturally contain these enzymes. It is known that in Streptomyces and Acremonlum the AT enzyme does not occur, whereas in Penlcillium, on the other hand, the genes of the blosynthetic enzymes of cephalosporin and cephamycin do not occur. The introduction of such genes into hosts will result in blosynthesis of cephalosporin or cephamycin by Penlcillium or penicillin or cephalosporins with a hydrophobic side chain by Acremonlum.
É evidente a partir dos resultados seguintes que a produção de metabolitos secundários pode ser grandemente aumentada utilizando processos de selecçao que permitem a identificação de ADN associadas com a produção de um metabolito secundário. Usando métodos de subtracçao em sequências específicas de identificação associadas com a produ—It is evident from the following results that the production of secondary metabolites can be greatly increased using selection processes that allow the identification of DNA associated with the production of a secondary metabolite. Using subtraction methods on specific identification strings associated with the production—
çao de metabolitos secundários, á possível isolar e identificar o ARNm e o ADNc para ser usados como sondas. Assim, verifica—se que fragmentos que contêm genes crípticos, que ainda nao tenham uma função conhecida, apresentam uma produção de metabolitos secundários grandemente aumentada e pode ser utilizados para transformar um hospedeiro para a produção do metabolito secundário. Este processo á especificamente exemplificado para penicilina.secondary metabolites, it is possible to isolate and identify the mRNA and cDNA to be used as probes. Thus, it appears that fragments containing cryptic genes, which do not yet have a known function, have a greatly increased production of secondary metabolites and can be used to transform a host for the production of the secondary metabolite. This process is specifically exemplified for penicillin.
Adicionalmente, um gene de aciltrans ferase de acordo com a presente invenção pode ser utilizado em várias vias, como uma enzima para a modificação de compostos de -lactama, como uma marca, como uma fonte de um antige ne para a produção de anticorpos para aciltransferase, como uma fonte para uma sequência de promotor, como uma fonte para expressar quantidades elevadas de proteína para cristalizaçao como um molde para mutagénese in vitro para obter uma enzima com características modificadas, etc..In addition, an acyltransferase gene according to the present invention can be used in several ways, as an enzyme for the modification of β-lactam compounds, as a brand, as a source of an antigen for the production of antibodies to acyltransferase , as a source for a promoter sequence, as a source for expressing high amounts of protein for crystallization, as a template for in vitro mutagenesis to obtain an enzyme with modified characteristics, etc.
Todas as publicações e pedidos de pja tente referidos na presente memória descritiva sao aqui inco£ poradas por referência como se cada publicação individual ou pedido de patente forem especificamente e individualmente indicadas para ser incorporadas por referência.All publications and patent applications referred to in this specification are hereby incorporated by reference as if each individual publication or patent application is specifically and individually indicated to be incorporated by reference.
Apesar de a invenção precedente ter sido descrita com todo o pormenor por meio de ilustrações e e. xemplos com intuitos de clareza e compreensão, será rapidamen. te evidente para os especialistas no assunto á luz dos ensina, mentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas sem que se ultrapasse o espírito ou âmbito das reivindicações em apêndice.Although the preceding invention has been described in full detail by means of illustrations and e. xemples for the sake of clarity and understanding, will be quickly. It is evident to those skilled in the art in light of the teachings of this invention that certain changes and modifications can be made without exceeding the spirit or scope of the claims in the appendix.
Os exemplos apresentados em seguida destinem—se a ilustrar a invenção sem limitar o seu âmbito.The following examples are intended to illustrate the invention without limiting its scope.
EXEMPLO 1EXAMPLE 1
Construção de um banco genómico de Penicillium ctinsogenuaConstruction of a genomic bank of Penicillium ctinsogenua
Construíu-se um banco genómico de Pe niclllium chrysogenum (ATCC 28089) substancialmente de acordo com os processos conhecidos na especialidade (T. Maniatis et al.,(1982), Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.). 0 ADN croraossómico foi extraído de Penicillium chrysogenum pela formaçao de protoplás— tos a partir do micélio como descrito previamente em EP-A260762.A genomic bank of Pe niclllium chrysogenum (ATCC 28089) was constructed substantially according to procedures known in the art (T. Maniatis et al., (1982), Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.). The chromosomal DNA was extracted from Penicillium chrysogenum by the formation of protoplasts from the mycelium as previously described in EP-A260762.
Os protopplastos foram então lisados por diluíçao da suspensão isotónica (XC1 0,7 M) com quatro vo lumes de tampão TES (Tris-HCl 0,05 M pH 8,0, EDTA 0,1 M, NaCl 0,15 M). Ao lisado juntou-se lauril-sulfato de sódio a 1Z e a mistura foi incubada a 55°C durante 30 minutos. Depois de uma extracçao com fenol e duas extracçoes cora clorofórmio, o ADN foi precipitado com etanol, seco e dissolvido em tampao TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). A solução de ADN foi então tratada com 100 ^.i.g/ml de RNase a 37°C durante 1 hora e a seguir com proteinase K a 200 /t g/ml a 42°C durante 1 hora. A so lução foi extraída uma vez com fenol e duas vezes com clorofórmio. Um volume igual de isopropanol foi deitado por cima da fase aquosa e o ADN foi recolhido na interface rodando a volta com uma vareta de vidro. Depois de seco o ADN foi dissolvido em tampao TE. 0 peso molecular duma preparaçao de ADN βThe protoplasts were then lysed by diluting the isotonic suspension (0.7 M XC1) with four volumes of TES buffer (0.05 M Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M EDTA, 0.15 M NaCl). To the lysate, 1Z sodium lauryl sulfate was added and the mixture was incubated at 55 ° C for 30 minutes. After extraction with phenol and two extractions with chloroform, the DNA was precipitated with ethanol, dried and dissolved in a TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0). The DNA solution was then treated with 100 µg / ml RNase at 37 ° C for 1 hour and then with proteinase K at 200 µg / ml at 42 ° C for 1 hour. The solution was extracted once with phenol and twice with chloroform. An equal volume of isopropanol was poured over the aqueous phase and the DNA was collected at the interface by rotating the loop with a glass rod. After drying, the DNA was dissolved in TE buffer. The molecular weight of a β DNA preparation
assim obtida foi de cerca de 10 . 0 ADN foi parcialmente dige^ rido com Sau3A. ligado a EMBL de 3 braços desfosforilado cortado com BamHI (Promega Biotec, Madison WI, USA), e empacotado em capsídeos de bacteriófago lambda usando o Packagene Sys. tem de Promega Biotec. Todas as reacções foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante excepto no que se refere à reacçao de empacotamento que foi realizada a 22 C du_ rante 2 a 3 horas. Os bancos foram amplificados por inocula22thus obtained was about 10. The DNA was partially digested with Sau3A. linked to BamHI-cut dephosphorylated EMBL with 3 arms (Promega Biotec, Madison WI, USA), and packaged in lambda bacteriophage capsids using Packagene Sys. has to Promega Biotec. All reactions were carried out according to the manufacturer's recommendations except for the packaging reaction which was carried out at 22 ° C for 2 to 3 hours. The banks were amplified by inocula22
çao em placas dos fagos empacotados, incubaçao durante 7 a 8 horas a 37°C e eluiçao dos fagos usando 4 ml de tampão SM (NaCl 0,1 M, MgS04 0,01 M, Tris HC1 0,o5 M pH 7,5, gelatina 0,012) por placa de Petri.Plated phage plates, incubation for 7 to 8 hours at 37 ° C and phage elution using 4 ml SM buffer (0.1 M NaCl, 0.01 M MgS0 4 , HCl 0, 0.5 M pH 7, 5, gelatin 0.012) per Petri dish.
EXEMPLO 2EXAMPLE 2
Isolamento de genes expressos especificamente durante a bios— síntese da penicilina usando um processo de separação diferen ciai.Isolation of genes specifically expressed during biosynthesis of penicillin using a different separation process.
Os genes que sao expressos específica ou predominantemente durante a biossíntese da penicilina foram identificados sondando o banco genómico do Exemplo 1 com sondas de ADNc marcadas sintetizadas em moldes de ARNm ex_ traídos de micélio produtor (cultivado em lactose) e nao produtor (cultivado em glucose), e seleccionado os clones que dão predomonantemente um sinal positivo com a sonda (+) anterior.The genes that are expressed specifically or predominantly during penicillin biosynthesis were identified by probing the genomic bank of Example 1 with labeled cDNA probes synthesized in mRNA templates extracted from producer (grown in lactose) and non-producer (grown in glucose) mycelium , and clones that predominantly give a positive signal with the previous (+) probe are selected.
Isolaram-se ARNs mensageiros de culturas com 3 ou 6 dias no meio de produção (cf. Exemplo 3) (preparação +) ou no mesmo meio com a lactose substituída por glucose (preparação-). 0 micélio foi recolhido por filtraçao, congelado em azoto líquido e homogeneizado e o ARNm foi isola, do usando o método de isoriocianato de guanidínio como descri, to por T. Maniatis et al. (vide supra).Messenger RNAs were isolated from cultures with 3 or 6 days in the production medium (cf. Example 3) (preparation +) or in the same medium with the glucose-substituted lactose (preparation-). The mycelium was collected by filtration, frozen in liquid nitrogen and homogenized and the mRNA was isolated using the guanidinium isoriocyanate method as described by T. Maniatis et al. (see above).
Sintetizaram-se ADNc’s e marcaram-se 3 2 para uma actividade específica alta com Q*- pJ~ dATP contra as duas populações de ARNm numa mistura reaccional de 30 1 que contemCDNAs were synthesized and 3 2 labeled for high specific activity with Q * - pJ ~ dATP against the two mRNA populations in a 30 1 reaction mixture containing
ηοβ quais o PoliA+ ARN e oligo-dt foram misturados separadamente, aquecidos a 100°C durante 1 minuto e arrefecidos em agua gelada antes de adicionar à mistura reaccional. Depois de 1,5 horas de incubaçao a 42°C, adicionaram-se 5/tl de dATP 1 mM e continuou-se a incubaçao durante 30 minutos. Subsequen. temente, a mistura reacional foi levada a 20 mM em EDTA, 40mM em NaOH (volume final 100 χΐ) e aquecida a 65°C. Depois de 1 hora de incubaçao adicionaram-se 5 /íl de Tris-HCl 1 M pH 8,3,ηοβ which PoliA + RNA and oligo-dt were mixed separately, heated to 100 ° C for 1 minute and cooled in ice water before adding to the reaction mixture. After 1.5 hours of incubation at 42 ° C, 5 µl of 1 mM dATP was added and the incubation continued for 30 minutes. Subsequent. The reaction mixture was then brought to 20 mM in EDTA, 40 mM in NaOH (final volume 100 χΐ) and heated to 65 ° C. After 1 hour of incubation, 5 µl of 1 M Tris-HCl pH 8.3 was added,
1 de HCl 0,01 N, 7 g de ADN de timo de vitela, 100 1 de tampao TES (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, SDS a 1Z pH 7,5) e 200 yjJL de acetato de amónio 5 mM e precipitou-se o ADN com 800 1 de etanol durante 16 horas a -20°C.1 of 0.01 N HCl, 7 g of calf thymus DNA, 100 1 of TES buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 1Z SDS pH 7.5) and 200 æl of 5 mM ammonium acetate and precipitated DNA with 800 l of ethanol for 16 hours at -20 ° C.
Separou-se o precipitado por centrifugação, lavou-se com etanol a 702, secou-se e dissolveu-se em 32,5 1 de tampao TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). A pre^ paraçao de ADNc ( + ) foi então enriquecida nas sequências expressas especificamente durante a biossíntese da penicilina por dois ciclos sucessivos (cascatas) de hibridaçao contra uma preparaçao de ARNm ( —) numa mistura reaccional de 75 /<.1 que contémThe precipitate was separated by centrifugation, washed with 702 ethanol, dried and dissolved in 32.5 L TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0). The cDNA (+) preparation was then enriched in the sequences expressed specifically during penicillin biosynthesis by two successive cycles (cascades) of hybridization against a mRNA preparation (-) in a 75 µl.1 reaction mixture containing
Depois de incubaçao durante 16 horas a 68°C, adicionaram-se 102„ 1 de água (concentração final de fosfato 170 aM) e passou-se a mistura através de usa coluna de hidroxilapatite equilibrada ea fosfato 170 mM a 68°C. Sob estas condlçoes, os ácidos nucleicos de dupla cadeia ligam—se à coluna enquanto que os ácidos de cadeia simples são eluídos. Recolheu-se o eluído, dlallsou-se contra tampão TE duranteAfter incubation for 16 hours at 68 ° C, 102 „1 of water (final concentration of 170 aM phosphate) was added and the mixture was passed through a balanced hydroxylapatite column and 170 mM phosphate at 68 ° C. Under these conditions, double-stranded nucleic acids bind to the column while single-stranded acids are eluted. The eluate was collected, diluted against TE buffer for
1,5 horas e precipitou-se com etanol depois da adição de 4 ju.g de ADN veículo (timo de vitela). Repetiu-se este processo e o ADNc final veículo (timo de vitela). Repetiu-se este processo e o ADNc final não ligado foi usado directamente como uma son da para efectuar uma busca no banco genómico de uma estirpe de Penicillium como se segue:1.5 hours and precipitated with ethanol after the addition of 4 µg of vehicle DNA (calf thymus). This process was repeated and the final vehicle cDNA (calf thymus). This process was repeated and the final unbound cDNA was used directly as a probe to search the genomic bank for a Penicillium strain as follows:
Inoculou-se uma amostra do banco amplificada do Exemplo 1 sobre 5 cápsulas de Petrl de modo a que cada cápsula contivesse 1500 placas. As placas foram tranjs feridas em duplicado para filtros Genes Screen Plus (New England Nuclear) de acordo com as recomendações do fabricante. Sondou-se um conjunto de filtros com a preparaçao de ADNc (+) enriquecida marcada; o conjunto duplicado foi sondado com o ADNc (—) para comparaçao.A sample from the amplified bank of Example 1 was inoculated onto 5 Petrl capsules so that each capsule contained 1500 plates. The plates were transferred in duplicate to Genes Screen Plus filters (New England Nuclear) according to the manufacturer's recommendations. A set of filters was probed with the tagged enriched cDNA (+) preparation; the duplicate set was probed with the cDNA (-) for comparison.
As placas positivas foram purificadas e submetidas a uma segunda selecção. Por este melo, foram seleccionadas 96 placas que deram um sinal predominantemente positivo com a sonda ADNc (+).Positive plates were purified and subjected to a second selection. For this purpose, 96 plaques were selected which gave a predominantly positive signal with the cDNA probe (+).
Os ADNs dos fagos recombinantes que tinham dado que tinham dado um sinal forte ou moderado na se— 32 lecçao inicial foram mercados com p e foram usados como eoii das para efectuar uma busca de manchas em Northern de ARNs de Penicillium isolados a partir de um micéllo produtor e não produtor, a fim de estabelecer os níveis de expressão sob ambas as condições. Por este meio os clones recombinantes foram divididos em três grupos:The DNAs of the recombinant phage that had given a strong or moderate signal in the initial selection were skin markets and were used as an opportunity to perform a Northern blot search of Penicillium RNAs isolated from a producing micelle. and non-producer, in order to establish levels of expression under both conditions. Hereby the recombinant clones were divided into three groups:
Classe 1 contêm genes expressos dum modo elevado durante a biossíntese da penicilina e é exemplificada pelos clonesClass 1 contains highly expressed genes during penicillin biosynthesis and is exemplified by clones
* G2 * Β9, L5 e G5 * L12 * K9* G2 * Β9, L5 and G5 * L12 * K9
Classe 2 expressa de modo moderado, exemplificado por * C12 * P3 e 111 * B13 * B20Class 2 moderately expressed, exemplified by * C12 * P3 and 111 * B13 * B20
Classe 3 expressa fracamente, exemplificado por * G3 * G1 * 116 * LIO * B23Class 3 weakly expressed, exemplified by * G3 * G1 * 116 * IOL * B23
Os mapas físicos destes fagos recom— binantes sao apresentados na Figura 2. Os clones G2 e B21 deram um sinal de hlbrldaçao positivos quando sondados com uma sonda específica de sintetase de isopenicilina N (S.M. Samson et al., vide supra). Surpreendentemente, parece que os mesmos clones hibridam com uma sonda específica de aciltransferase (ver Exemplo 5).The physical maps of these recombinant phages are shown in Figure 2. Clones G2 and B21 gave a positive hybridization signal when probed with a specific N isopenicillin synthase probe (S.M. Samson et al., See supra). Surprisingly, it appears that the same clones hybridize to a specific acyltransferase probe (see Example 5).
EXEMPLO 3EXAMPLE 3
Purificação da aciltransferasePurification of acyltransferase
A estirpe Penlcillium chrysogenum (ATCC 28089) foi Inoculada (a 2 x 10^ conldeos/ml) num meio de Inoculação complexo contendo: líquido de maceraçao de milho (20 g/1); solúveis de destilaria (20 g/1); sucrose (20 g/1); CaCOg (5 g/1) (pH antes da esterilização 5,7). Depois de 36 horas de incubaçao a 25°C e a 250 rpm, a cultura obtida foi usada para inocular vinte volumes de meio de produção coe plexo contendo: sólidos de maceraçao de milho (35 g/1)? lacto, se (25 g/1); fenilacelato de potássio (2,5 g/1); MgSO^^E^OThe strain Penlcillium chrysogenum (ATCC 28089) was inoculated (at 2 x 10 ^ conids / ml) in a complex inoculation medium containing: corn maceration liquid (20 g / 1); distillery soluble (20 g / 1); sucrose (20 g / 1); CaCOg (5 g / 1) (pH before sterilization 5.7). After 36 hours of incubation at 25 ° C and 250 rpm, the culture obtained was used to inoculate twenty volumes of complex production medium containing: corn maceration solids (35 g / 1)? lacto, if (25 g / 1); potassium phenylacellate (2.5 g / 1); MgSO ^^ E ^ O
(3 g/1); KH2PO4 ( g/1) j Óleo de milho (2,5 g/1); CaC(>3 (10 g/1). Depois da continuação da incubaçao por mais 48 horas, recolheu-se o micélio por filtraçao e lavou-se o bolo de filtro quatro vezes com NaCl 0,15 M frio.(3 g / 1); KH 2 PO 4 (g / 1) j Corn oil (2.5 g / 1); CaC (> 3 (10 g / 1). After the incubation continued for another 48 hours, the mycelium was collected by filtration and the filter cake was washed four times with cold 0.15 M NaCl.
Suspenderam-se 200 g (peso húmido) de micélio em 700 ml de tampão de Tris-HCl 0,05 M (pH 8) contendo dltiotreltol 5 mM (daqui por diante referido como tampão TD) e desintegrou-se o micélio num desintegrador Braun (Braun, Meleungen, R.F.A.) usando esferas de vidro Ballotini (Sigma tipo V, 450 a 500 /í· de diâmetro) por períodos de 30 s a intervalos com refrigeração nua banho de etanol/gelo seco.200 g (wet weight) of mycelium were suspended in 700 ml of 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 8) containing 5 mM dltiotreltol (hereinafter referred to as TD buffer) and the mycelium was disintegrated in a Braun disintegrator (Braun, Meleungen, RFA) using Ballotini glass spheres (Sigma type V, 450 to 500 µm in diameter) for periods of 30 s at intervals with refrigeration in an ethanol / dry ice bath.
extrato foi em seguida centrifugado durante 30 minutos a 20 000 x g. Esta e todas as fazes seguintes foram realizadas a 4°C. Adicionaram-se lentamente a 640 al de extrato 27 al de uma solução de sulfato de protaaina a 10Z p/v em Tris-HCl 0,05 M a pB 8. Depois de agitar durante 45 minutos o ácido nti cleico precipitado foi removido por centrifugação a 20 000 x g e o sobrenadante foi fraccionado por precipitação coa sulfato de amónio enquanto se mantinha o pH da solução a 8,0 durante as adições de sulfato de amónio. A fracçao que precipitou entre 40Z e 55Z da saturação foi dissolvida em tampão TD que continha sulfato de amónio 1 M eaplicada a uma coluna de fe— nilsefaroee CL-4B (1,8 x 16 cm) equilibrada com o mesmo tampao. A coluna foi lavada com tampao TD a uma velocidade de 5 ml/min até não se libertarem mais proteínas nao ligadas.The extract was then centrifuged for 30 minutes at 20,000 x g. This and all the following steps were performed at 4 ° C. 640 µl of extract 27 µl of a solution of 10% w / v protaamine sulfate in 0.05 M Tris-HCl to pB 8 were added slowly after stirring for 45 minutes the precipitated nucleic acid was removed by centrifugation. at 20,000 xgeo supernatant was fractionated by precipitation with ammonium sulfate while maintaining the pH of the solution at 8.0 during ammonium sulfate additions. The fraction that precipitated between 40Z and 55Z of the saturation was dissolved in TD buffer containing 1M ammonium sulphate and applied to a CL-4B (1.8 x 16 cm) column of equilibrium with the same buffer. The column was washed with TD buffer at a speed of 5 ml / min until no more unbound proteins were released.
Em seguida a aciltransferase foi elulda da coluna coa etileno—glicol a 40Z em Tris-HCl 0,05 M a pH 8,0.Then the acyltransferase was eluted from the column with ethylene-glycol 40Z in 0.05 M Tris-HCl at pH 8.0.
As fracções eluídas foram analisadas para a detecçao de actividade de aciltransferase por incubação a 25°C numa mistura reaccional que contém fenilacetilcoeii ziaa A o,2 mM, ácido 6— aainopenicilânico 0,2 mM, ditiotrei! tol 5 mM, Tris-HCl 0,1 M a pH 8,0 e extrato de enzima num volume final de 200 /tl. Depois de 10 minutos a reacçao foi interrompida por adiçao de 200 /zl de metanol. Centrifugaram—se as amostras a 5000 x g e a penicilina G foi analizada no so—The eluted fractions were analyzed for the detection of acyltransferase activity by incubation at 25 ° C in a reaction mixture containing 0.2 mM phenylacetylcozyzase, 0.2 mM 6-aaminopenicillanic acid, dithiothrei! 5 mM tol, 0.1 M Tris-HCl at pH 8.0 and enzyme extract in a final volume of 200 µl. After 10 minutes the reaction was stopped by adding 200 µl of methanol. The samples were centrifuged at 5000 x g and penicillin G was analyzed in the—
brenadante por métodos convencionais microblológicos.brenadante by conventional microbiological methods.
As fracções activae da coluna de fenilsefarose foram reunidas e aplicadas numa coluna de Sephacel-DEAE (1.5 x 20 cm) equilibrada com tampão e eludíu-se a actividade de aciltransferase com um gradiente de NaCl (0 a 0,25 M) linear em tampão TD a uma velocidade de fluxo de 0,25 ml/mln. As fracções activas reunidas foram precipitadas com sulfato de aménio a 70% e o sólido foi dissolvido em3ml de tampão TD e aplicado numa coluna de Sefadex G—75 (de grão grosseiro) (2,6 x 70 cm) equilibrada com tampão TD. A aciltransferase foi eluída usando tampão TD com um caudal de 9 ml/h e foi recolhida na ultima parte das fracções eluídas como um pico simétrico de proteína que corresponde à actividade da aciltransferase: A purificação final foi de 258 vezes.The active fractions of the phenylsepharose column were pooled and applied to a Sephacel-DEAE column (1.5 x 20 cm) equilibrated with buffer and the acyltransferase activity eluted with a linear NaCl gradient (0 to 0.25 M) in buffer TD at a flow rate of 0.25 ml / mln. The combined active fractions were precipitated with 70% ammonium sulfate and the solid was dissolved in 3 ml of TD buffer and applied to a column of Sefadex G — 75 (coarse grain) (2.6 x 70 cm) equilibrated with TD buffer. The acyltransferase was eluted using TD buffer with a flow rate of 9 ml / h and was collected in the last part of the eluted fractions as a symmetrical peak of protein corresponding to the acyltransferase activity: The final purification was 258 times.
EXEMPLO 4EXAMPLE 4
Determinação da sequência de ácidos aminados aminoterminal de aciltransferase e projecto das correspondentes misturas de sondas de ollgonucleótido.Determination of the amino acid terminal amino acid sequence and design of the corresponding mixtures of ollgonucleotide probes.
A preparação enzimática, obtido como descrito no Exemplo 3, foi feita correr num gel de SDS-PÀGE (U.K. Laemmli, Nature, 227 (1970) pp. 680 ff) (acrilamida a 132, 50 A). Separou-se uma banda de 29 kD (cerca de 10 g de proteína) do gel de SDS e transferiu-se por electroforese a proteína para uma membrana de PCGM-2 (fibra de vidro impregna, da de polibreno, Jansen, Beerse, Bélgica), usando uma unidade de mancha Nova Multlphor II (LXB; 0,8 mÀ/cm ; 90 min; tampao de eléctrodo de borato de sódio 5 mM a pH 8,0). Depois de rea lizada a mancha, a membrana de PCGM foi levada quatro vezes com uma solução contendo NaCl 25 mM e borato de sodlo 10 mM a pH 8,0 e foi seca ao ar. A banda de proteína absorvida por PCGM assim obtida foi analizada para determinação da sequência N-terminal de ácidos aminados, usando um sequênciador de fase gasosa (Applied Biosystems modelo 470 a). Foi determinada a sequência seguinte:The enzymatic preparation, obtained as described in Example 3, was run on a SDS-PÀGE gel (U.K. Laemmli, Nature, 227 (1970) pp. 680 ff) (132, 50 A acrylamide). A 29 kD band (about 10 g protein) was separated from the SDS gel and the protein was electrophoretically transferred to a PCGM-2 membrane (impregnated glass fiber, polybene, Jansen, Beerse, Belgium) ), using a Nova Multlphor II stain unit (LXB; 0.8 mÀ / cm; 90 min; 5 mM sodium borate electrode plug at pH 8.0). After spotting, the PCGM membrane was flushed four times with a solution containing 25 mM NaCl and 10 mM sodium borate at pH 8.0 and was air-dried. The protein band absorbed by PCGM thus obtained was analyzed to determine the N-terminal amino acid sequence, using a gas phase sequencer (Applied Biosystems model 470 a). The following sequence was determined:
De acordo com a parte sublinhada da sequência de ácidoa amina. dos, sintetizaram-se os seguintes conjuntos de oligodeaoxirri. bonucleótidos:According to the underlined part of the amino acid sequence. the following sets of oligodeaoxirri were synthesized. bonucleotides:
TT
A C A T TA C A T T
5* CA GG CA AA TGGGA 3’5 * CA GG CA AA TGGGA 3 ’
G A G C CG A G C C
A sequência aoinoterminal de ácidos aainados de una banda de 10 kD presente algumas vezes na pre— paraçao foi também determinada, mas nao foi usada para a cons^ truçao de uma sonda de oligodesoxirribonucleõtido. A sequência obtida é:The terminal sequence of amino acids from a 10 kD band present sometimes in the preparation was also determined, but was not used for the construction of an oligodeoxyribonucleotide probe. The obtained sequence is:
Met-Leu-His-Ile-Leu-X-Gln-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Gly-Tyr-Gli£ -His-Gly-Ser-Ala—Ala-Lys-Ala-Val-Ile-Ala.Met-Leu-His-Ile-Leu-X-Gln-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Gly-Tyr-Gli £ -His-Gly-Ser-Ala — Ala-Lys-Ala-Val-Ile -Allah.
EXEMPLO 5EXAMPLE 5
Identificação do gene da aciltransferaseIdentification of the acyltransferase gene
ADN de vários clones do Exemplo 2 foi digerido com a endonuclease de restrição Sail, os fragmen. tos foram separados num gel de agarose a 0,7Z, transferidos para Genescreen Plus e hibridados com as misturas de oligonucleótidos do Exemplo 4 marcadas na extremidade por E^Pj. Os clones que davam um sinal positivo foram mapeados por análise de restrição usando métodos normais. Dois mapas físicos repre. sentativos derivados dos fagos recombinantes, lambda B21 e lambda G2, sao apresentados na Figura 2. A mistura de oligode^ soxirribonucleótidos hibrida especificamente com o subfragaeii to EcoRI/HindIII indicado no mapa. Este e os fragmentos adjacentes foram reclonados em pTZ 18/19 (United States Biocheaical Corporation) e submetidos a análise de sequência de nucleó^DNA from several clones of Example 2 was digested with the restriction endonuclease Sail, the fragmen. All of them were separated on a 0.7Z agarose gel, transferred to Genescreen Plus and hybridized with the oligonucleotide mixtures of Example 4 marked at the end by E ^ Pj. Clones that gave a positive signal were mapped by restriction analysis using normal methods. Two physical maps represent. Representatives derived from the recombinant phage, lambda B21 and lambda G2, are shown in Figure 2. The mixture of oligodeoxyribonucleotides specifically hybridizes with the subfragment EcoRI / HindIII indicated on the map. This and adjacent fragments were recloned in pTZ 18/19 (United States Biocheaical Corporation) and subjected to nucleotide sequence analysis.
tidos. A sequência determinada e a sequência de ácidos aminados deduzida sao apresentadas na figura 3.taken. The determined sequence and the deduced amino acid sequence are shown in figure 3.
A sequência amino-terminal de ácidos aminados de uma banda de 10 kD também presente na preparação foi determinada e verificou-se corresponder a uma sequência de ADN a montante da sequência de 29 kD. Por conseguinte, a AT é provavelmente sintetizada sob a forma de uma proteína de 40 kD. Esta noção é confirmada pelo comprimento do mensageiro de AT, que foi demonstrado ser de 1500 bases (semelhante ao ARNm de sintetase de isopenicilina N que codifica para uma proteína de 38kD), tomando assim em consideração as regiões nao traduzidas de 3' e 5* de 100 bases.The amino-terminal amino acid sequence of a 10 kD band also present in the preparation was determined and found to correspond to a DNA sequence upstream of the 29 kD sequence. Therefore, AT is probably synthesized as a 40 kD protein. This notion is confirmed by the length of the AT messenger, which has been shown to be 1500 bases (similar to the isopenicillin N synthetase mRNA encoding a 38kD protein), thus taking into account the 3 'and 5 * untranslated regions 100 bases.
As sequências de ácidos aminados das proteínas de 29kD (que foram extendidas para Thr-Thr-Ala-Tyr-Cys—Gln-Leu—Pro—Asp—Gly—Ala-Leu-Gln-Gly-Gln-Asn-Trp—Àsp-Phe— -Ser-Ala—Thr-Lys-Gln-Ala) e de 10 kD revelaram a presença de dois lntroes. Um terceiro intrao é postulado com base na composição bruta eo ácidos aminados de proteína de 10 kD (97 resíduos) e na sequência de consenso para os seus limites (D.J. Ballance, Yeast 2 (1986)pp. 229-236). A presença do terceiro intrao foi confirmada por exteneão de iniciador e hibridaçao de mancha de Northern usando sondas ollgonucleótidlcas a partir de regiões de codificação e de nao codificação.The amino acid sequences of the 29kD proteins (which have been extended to Thr-Thr-Ala-Tyr-Cys — Gln-Leu — Pro — Asp — Gly — Ala-Leu-Gln-Gly-Gln-Asn-Trp — Àsp- Phe— Ser-Ala — Thr-Lys-Gln-Ala) and 10 kD revealed the presence of two introns. A third intrao is postulated on the basis of crude composition and 10 kD protein amino acids (97 residues) and following consensus to their limits (D.J. Ballance, Yeast 2 (1986) pp. 229-236). The presence of the third intrao was confirmed by primer extinction and Northern blot hybridization using ollgonucleotide probes from coding and non-coding regions.
EXEMPLO 6EXAMPLE 6
Construção de pPS47 gene da quinase de fosfogiicerato (pgk) foi isolado a partir dum banco genómico de Penicillium por métodos normais (Manlatis; Exemplo 1), usando o gene de levedura correspondente (Hitzeman et al., vide supra) como uma sonda de hibridaçao. A região do promotor de pgk é em par. te especificada pela sequência apresentada na Figura 5, a qual é localizada directamente a montante da região de codificação Pgk.Construction of pPS47 phosphogiicerate kinase gene (pgk) was isolated from a Penicillium genomic bank by normal methods (Manlatis; Example 1), using the corresponding yeast gene (Hitzeman et al., See supra) as a hybridization probe . The pgk promoter region is paired. specified by the sequence shown in Figure 5, which is located directly upstream of the Pgk coding region.
promotor de pgk de P.. chrisogenua pgk promoter from P .. chrisogenua
foi clonado em pTZ8R como um fragmento HlndlII de 1,5 kb e sjb leccionou-se um clone que tivesse a orientação desejada.it was cloned into pTZ8R as a 1.5 kb HlndlII fragment and a clone having the desired orientation was selected.
Subsequentemente, o gene de resistên. cia a fleomicina foi clonado num local de BamHI do poliligante deste clone sob a forma de um fragmento BaaHI - BglII de 1,0 kb, Isolado a partir de pUT702 (Cayla, Toulouse Cedex, France). 0 promotor de pgk foi fundido ao gene de resistência de fleomicina em concordância de quadro por fecho exterino do ciclo da sequência a ser apagada usando um oligonucleõtido com a sequência: í*Subsequently, the resistance gene. phleomycin was cloned into a BamHI site of the polylinker of this clone as a 1.0 kb BaaHI - BglII fragment, isolated from pUT702 (Cayla, Toulouse Cedex, France). The pgk promoter was fused to the phleomycin resistance gene in frame agreement by exterine closing the cycle of the sequence to be deleted using an oligonucleotide with the sequence: *
II
II
5*-GGA ACG GCA CTG GTC AAC TTG GCC ATG GGT AGT TAA TGG TAT G-3’5 * -GGA ACG GCA CTG GTC AAC TTG GCC ATG GGT AGT TAA TGG TAT G-3 ’
Para além disso, este oligonucleótido introduz um local Ncol na posição de ATG (sublinhado).In addition, this oligonucleotide introduces an Ncol site at the ATG position (underlined).
EXEMPLO 8EXAMPLE 8
Verificação biológica e bioquímicaBiological and biochemical verification
PA IDENTIDADE DOS CLONES ATPA IDENTITY OF AT CLONES
A identidade dos clones AT foi verificada por complementação de um mutante negativo em relação a aciltransferase de J?. chrysoRenum Wis 54 - 1255, npe 8.The identity of the AT clones was verified by complementation of a negative mutant in relation to J? Acyltransferase. chrysoRenum Wis 54 - 1255, npe 8.
Cotransformarem—se 2 x 10? protoplas^ tos de um derivado que necessita de uracilo de estirpe Wis 54— 1255 npe 8, Wis 54 — 1255 npe 8 pyrG (CBS 512.88) com uma mistura de 5 jj-g do plasmídeo selectivo pDC 13:: pyrG e 15 ^.g de ADN de B21 lambda como descrito previamente (EP-A-260762).Co-transform 2 x 10? protoplasts of a derivative requiring uracil of strain Wis 54 - 1255 npe 8, Wis 54 - 1255 npe 8 pyrG (CBS 512.88) with a 5 µg mixture of the selective plasmid pDC 13 :: pyrG and 15 µg. g of B21 lambda DNA as previously described (EP-A-260762).
Obtiveram-se algumas centenas de transformantes dos quais se separam os conídios e depositaram em placas no meio de produção complexo do Exemplo 1 numa densidade de uma a dez colónias por cápsula de Petri. Depois de três dias de incubação a 25θϋ, as placas foram cobertas com uma suspençao de esporos de uma estirpe de um indicador Bacil las subtilis sensível à penicilina e incubadas toda a noite aA few hundred transformants were obtained from which the conidia were separated and plated in the complex production medium of Example 1 at a density of one to ten colonies per Petri dish. After three days of incubation at 25θϋ, the plates were covered with a spore suspension of a penicillin sensitive Bacil las subtilis indicator strain and incubated overnight at
ο — —ο - -
C para determinar a dimensão das zonas de inibição no campo bacteriano.C to determine the size of the zones of inhibition in the bacterial field.
A maior parte dos transformantes (75Z) apresentavam halos muito pequenos, semelhantes na dimejn sao aos da estirpe receptora pyrG npe 8 não produtora de peni. cilina. Os restantes 25Z mostravam largas zonas de inibição comparáveis ás da estirpe de tipo selvagem, Vis 54-1255. Concluíu-se que a primeira classe recebeu somente o plamídeo se— lectlvo pUC 13: :pyrG. enquanto o último tinha recebido tanto o pOC::pyrG como o lambda B21, que restabelece a produtividade da penicilina.Most of the transformants (75Z) had very small halos, similar in size to those of the non-peni producing pyrG npe 8 receptor strain. cilina. The remaining 25Z showed wide zones of inhibition comparable to those of the wild type strain, Vis 54-1255. It was concluded that the first class received only the plasmid se— lectlvo pUC 13:: pyrG. while the latter had received both pOC :: pyrG and lambda B21, which restores penicillin productivity.
Para vários clones transformantes dos dois grupos o nível de actividade de AT em extractos isen. tos de células foi determinado como se segue: recolheu-se micélio depois de dois dias de incubação como descrito no Exemplo 3, lavou-se, congelou-se em azoto líquido e pulverizou-se. Para cada análise, suspenderam-se 2,5 de micéllo triturado em tampão de fosfato de potássio 50mH (pH 8,0) contendo ditiotrei. tol 5 mM e EDTA 5 mH (volume final 12,5 ml) e agitou-se duran te 25 minutos. 0 extrato isento de células foi obtido por cen trifugaçao da suspensão (5 minutos a 1000 x g).For several transformant clones of the two groups the level of AT activity in isen extracts. Cell counts were determined as follows: mycelium was collected after two days of incubation as described in Example 3, washed, frozen in liquid nitrogen and sprayed. For each analysis, 2.5 µl of crushed micelle were suspended in 50mH potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing dithiothrei. 5 mM tol and 5 mH EDTA (final volume 12.5 ml) and stirred for 25 minutes. The cell-free extract was obtained by centrifuging the suspension (5 minutes at 1000 x g).
Analizou-se a actividade AT por incju bação de 2 ml de extrato livre de células com 0,1 ml de ditio. treitol (10 mg/ml), 0,2 ml de ácido 6-aminopenlcilânlco (10 mg/ml) e 0,2 ml de solução de fenilacetil—coenzima A (20 mg/ ml) a 25°C.AT activity was analyzed by incubating 2 ml of cell-free extract with 0.1 ml of dithio. treitol (10 mg / ml), 0.2 ml of 6-aminopenilclic acid (10 mg / ml) and 0.2 ml of phenylacetyl solution - coenzyme A (20 mg / ml) at 25 ° C.
Depois de 15 ou 30 minutos, a reac— çao foi interrompida por adiçao dum volume igual de metanol e centrifugou-se a amostra (20 minutos a 5000 x g). 0 sobrenadante foi em seguida analisado para determinar a penicilina G formada por métodos cromatográficos conhecidos na especlalida. de (HPLC). 0s resultados dum ensaio típico sao apresentados no Quadro 2 abaixo. Estes dados mostrem que nas estirpes transformadas (3) e (4) o nível da actividade de AT é aumenta, da 2 a 3 vezes para além da do tipo selvagem de acordo com a dosagem aumentada do gene.After 15 or 30 minutes, the reaction was stopped by adding an equal volume of methanol and the sample was centrifuged (20 minutes at 5000 x g). The supernatant was then analyzed to determine the penicillin G formed by chromatographic methods known in the speclalide. (HPLC). The results of a typical test are shown in Table 2 below. These data show that in transformed strains (3) and (4) the level of AT activity is increased, 2 to 3 times beyond that of the wild type according to the increased dosage of the gene.
aglomerado de IPNS mais AT foi sub.cluster of IPNS plus AT was sub.
clonado em pPS54, dando origem a pGJOl A e B. UM fragmento de 5 kb foi neutralizado pela acçao de uma poiimerase T4 de ADN e ligado no local HindIII singular de pPS54, depois do tratamento deste vector com poiimerase T4 de ADN.cloned into pPS54, giving rise to pGJO1 A and B. A 5 kb fragment was neutralized by the action of a DNA T4 polymerase and ligated into the unique HindIII site of pPS54, after treatment of this vector with DNA T4 polymerase.
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V-V-
EXEMPLO 9EXAMPLE 9
Aumento da produção da penicilina nuca estirpe hospedeira transformada com o gene críptico YIncreased production of penicillin on the back of the host strain transformed with the cryptic Y gene
Para mostrar o efeito dos genes aqnl identificados como envolvidos na produção da penicilina, a do, sagem genica de um destes genes foi aumentada numa estirpe hospedeira de Penicillium. Para este fim o gene Y, contido em clones lambda B9, L5 e G5, foi subclonado sob a forma de um fragmento BamHI-Sphl de 3,0 kb em pPS47. A construção resultante, pRH05, foi utilizada para transformação de £. chrysogenum Wis 54-1255 (ATCC 28089) e isolaram-se clones resistentes ã fleomicina. Vários clones foram testados para produção de penicilina em balões de Erlenmeyer agitados.To show the effect of the aqnl genes identified as involved in the production of penicillin, the genetic load of one of these genes was increased in a host strain of Penicillium. For this purpose, the Y gene, contained in lambda B9, L5 and G5 clones, was subcloned as a 3.0 kb BamHI-Sphl fragment in pPS47. The resulting construct, pRH05, was used for £ transformation. chrysogenum Wis 54-1255 (ATCC 28089) and phleomycin resistant clones were isolated. Several clones were tested for penicillin production in shaken Erlenmeyer flasks.
Os resultados obtidos para um transformante isolado sao apresentados no Quadro seguinte.The results obtained for an isolated transformant are shown in the following Table.
Quadro 3 estirpe produção relativa de penicilinaTable 3 strain relative production of penicillin
Wis 54-1255 100Wis 54-1255 100
Wis 54-1255::pRH05 122Wis 54-1255 :: pRH05 122
A dosagem genica aumentada do gene Y no transformante, por comparaçao com o hospedeiro nao-trans— formado, foi confirmada por análise de mancha de Southern.The increased genetic dosage of the Y gene in the transformant, by comparison with the untransformed host, was confirmed by Southern blot analysis.
Por consequência, a dosagem genica aumentada do gene Y, um ge ne críptico, isolado pelo método da presente invenção, resulta num substancial aumento na produção de penicilina.Consequently, the increased genetic dosage of the Y gene, a cryptic gene, isolated by the method of the present invention, results in a substantial increase in penicillin production.
A dimensão da transcrição para o gene Y foi determinada por hibridação de mancha de Northern: a transcrição tem cerca de 1,0 kb de comprimento.The size of the transcription for the Y gene was determined by Northern blot hybridization: the transcription is about 1.0 kb in length.
Claims (1)
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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EP88201714 | 1988-08-11 | ||
EP89200522 | 1989-03-03 |
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Family
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PT9141089A PT91410B (en) | 1988-08-11 | 1989-08-09 | PROCESS FOR IDENTIFYING AND USING BIOSAETIC OR REGULATING GENES FOR THE ENHANCED PRODUCTION OF SECONDARY METABOLITES |
Country Status (1)
Country | Link |
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PT (1) | PT91410B (en) |
-
1989
- 1989-08-09 PT PT9141089A patent/PT91410B/en active IP Right Grant
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PT91410A (en) | 1990-03-08 |
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