PT91094B

PT91094B - Metodo de diagnostico de infeccoes virais associadas com a fadiga cronica

Info

Publication number: PT91094B
Application number: PT91094A
Authority: PT
Inventors: William A Carter
Original assignee: Hem Res Inc
Priority date: 1988-07-07
Filing date: 1989-07-07
Publication date: 1995-01-31
Also published as: DE68914201T2; IL90875A; ES2066847T3; NZ229849A; ATE103493T1; AU6883694A; ES2018903A6; DK332289A; IE892180L; EP0350151A2; PT91094A; IE63927B1; DE68914201D1; EP0350151A3; EP0350151B1; DK332289D0; IL90875A0; CN1039722A; AU684288B2; ZA895143B

Description

DESCRIÇÃO

ANTECEDENTES DA INYENÇnG

Sindroma de Eadiga crónica (SEC), uma condição genérica que envolve cerca de IC a 12 milhões de pessoas apenas nos Estados Unidos, é uma doença ubígua difícil de diagnosde

caracte	risada por uma
.nfática	e	sintomas con
so, perd		de apetite, .

constitucionais como por exemplo perda gência em alguns pacieru :a ocorr especialmen ;m gente jovem, activa e esta associada com infecções com vírus contendo ARN e ADN. Alguns paciente; oões neuroasieuiatricas com sntam alteraz ce ceco na e problemas semelhantes. Deste modo, o sindroma de fadiga crónica s per veses dificil de distinguir de doenças totalmente neurológicas, partacularmente em gicusçoos ae dooa^essao® larios estudos laboratoriais indicam que muitos vírus diferentes se replicam em indivíduos com fadiga Crónica, e que esses indivíduos se tornam de facto, cultivadores de vírus. Vírus como o

BAD ORIGINAL

de Epstein-Barr, citamegalovirus, retrovírus, viras herpes, etc, estão frequentemente presentes nesses indivíduos onde podem per manecer durante anos e os pacientes tornara-se progressivamente cansados e presos à cama.

Determinou-se que existem alterações específicas na via molecular 2’-5’A na maior parte dos indivíduos que apre sentam Síndroma de Fadiga Crónica, alterações que têm valor diagnóstico e prognóstico muito grande. Como ilustração, considera- se que muitas mulheres com 25-30 anos com crianças muito activas se queixam muitas vezes de fadiga crónica, mas não es tão necessariamente infectadas com vírus. Os procedimentos de diagnóstico aqui descritos permitem ao módico saher que pacientes apresentando sintomas de fadiga crónica e sintomas semelhan tes, incluindo nalguns casos a perda de peso, perda de apetite e alterações neuropsiquiátricas, são adequadamente classificados como possuindo o Sindroma de Fadiga Crónica com envolvimento Virai associado e distinguir com precisão esses pacientes daqueles que apresentam sintomas de fadiga cansados per outras razões frequentemente externas e/ou depressão. 0 dispositivo adequado do Sindroma de Fadiga Crónica ό o pró-requisito necessário para uma terapia eficaz, terapia essa que tamcóra ó aqui descrita. Estes procedimentos valiosos sao a seguir descritos.

de diagnostico e ;erí ’ara alem destes nrocedimentos de dis no:

primeira terapia definitiva oara esta doença foi desenvolvida utilizando vários ARE de duola esniral oara corri, as acenca:

associaaas com viras e tratar com sucesso a conaiçaa dos pacien ο ε s · u es wos and e r a o r s co Oe comoonentes individi . er/. dia jaica *-5’ oligoadcnilato REase xoi rezerioo ípecralmente nc que se reiere a cioenças ce v infeccoes n;

retrovírus em narticuiar s rus em gera^ rencia particular acs sintomas da fadiga. crónica. Especificamsnte, foi agora determinado que no Sindroma da Fadiga Crónica, entre outras coisas, existem uma enzima 2’-5^!A sintetase anormalmente baixa e uma enzima REase 1 aberrantemente activada aue

ambas estão partes integrant correlacionadas es da via antiviral natural da célula com a condição mórbida de fadiga.

Estas duas medidas podem assim servir como indicadores ou marcadores o Sindroma de Eadiga Crónica e podem portanto ser utilizados para diagnosticar definitivamente e seguir o tratamento do sindroma de uma forma totalmente nova e clinicamente fiável. Além disso, o diagnóstico é convenientemen te efectuado numa amostra de sangue periférico do paciente sem necessidade de cirurgia ou outros ensaios de diagnóstico invasivos.

DESCRIÇÃO DA INYENÇaO

Esta invenção inclui procedimentos para identificar o Sindroma de Eadiga'Crónica, evidenciada por aberração associada com vírus da enzima RNase L ligada com o baixo teor da enzima 2’-5’A sintetase nos linfócitos do sangue periférico do paciente, procedimentos de diagnóstico que utilizam esta informação para determinar a presença do Sindroma de Eadiga Crónica, procedimentos terapêuticos para restaurar as aberrações da via molecular 2^!-5’À do paciente por exemplo por administração de dsARKs exógenos e melhorando a condição clínica do pacien te, procedimentos terapêuticos para monitorar a condição do paciente em relação ao Sindroma de Eadiga Crónica e medir o grau de Substituição ds dsARD necessário numa base individual, e com posições terapêuticas para o tratamento do Sindroma de Eadiga Crónica.

PROCEDIMENTOS DE DIAGNÓSTICO

De terminou-se a concentração in vivo da enzima 2’-5’A sintetase, moléculas 2’-5’ A e RNase L activada em indivíduos normais e em pesscas com o Sindroma de Eadiga Crónica a cartir de amostras de pacientes (linfócitos do sangue periférico purificado por ficoll-Hypaque). C teor de 2’ - 5’A foi determinado por análises de celulose do número de 2’ - 5’A (cro3r·\ mc iograna ae alimaade) com p oli U - {/T } -pCp.

i\esr( ensaio,

BAD OHIGINA

utilisa-se a capacidade de RUase u activada com 2⁵ -5’A para hidrolisar poli (U) para determinar a concentração de 2’ - 5’A — un c i o nal.

Os valores de referência foram estabelecidos ensaiando 25 pessoas normais sem historia recente de infecções virais evidenciado pela falta de cultura de vírus, febre, ausên cia de sintomas constitucionais, borbulhas, etc. As concentrações dos teores de 2’ - 5’A de linfócitos de pessoas ensaiadas foram determinadas utilizando curvas de calibração obtidos com moléculas de 2’ - 5’A autênticas. Os valores de referência de indivíduos normais expressos em nanomoles de 2' - 5’A por grama de proteina de linfócito, estão geralmente na gama de 0,2 a 1,0 As curvas normais de calibração foram também estabelecidas para enzima 2⁽ -5’A sintetase e enzima Rlíase L.

Utilizando estes métodos de ensaio, analizaram-se dez pacientes apresentando os sintomas habituais do Síndroma de Padiga Crónica e os resultados representativos determinados sao apresentados a seguir. Os níveis de 2’ - 5’A oligonucleotido são tipicamente maiores de cerca de 2 -15 vezes enouan to a enzima 2' -5’A sintetase è propcrcionalmonte diminuída e aparece uma nova aberração enzímica da Rhass 1.

Aberrações de Pré-Terapia na via 2' - 5A/RUase 1 em Pacientes que Sofrem de Padiga Crónica Secundária em relação a Infecção_Virai_____________

Uumero do n moles de 2’-5’A por

Paciente grama de proteina de lin fócito

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10.1

5.2 l»MU

TASE1A 1 (continuação)

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11.3

7.6

8o3

4.7

3.8

5.9

Alem disso, todos os 10 pacientes apresentavam antes da terapia com dsARN, diminuição da enzima intracelular 2’-5’A sintetase para valores de- aproximadamente 5 a 50 vezes inferiores aos de pessoas saudáveis não infectadas. Os pacientes com o Sindròma de Fadiga Crónica têm geralmente associado um defeito (ou aberração) no mediador terminal da via de defesa autiviral designada por RNase 1. Assim, a via global de defesa autiviral demonstra ambos os defeitos (valores alterados dos mediadores) ou aberrações (novas actividades de componentes de enzimas). 0 tratamento definitivo dessas pessoas com o Síndroma da Fadiga Crónica é efeotuado administrando dsARNs exógenos, como necessário, até oue o nível intracelular de 2^f - 5’A oligonucleótidos e 2’ - 5’A sintetase atinja o valor normal a aber ração da Riíase L seja corrigida, e/ou diminua a sintomatologia clínica do paciente. Frequentemente estas melhorias moleculares ocorrem aparentemente de forma simultânea com melhorias clínicas muito elevadas, como se pode observar comparando a Tabela 2 (uma via enzimática estudada em função do tempo nc paciente

-τ.; com qua do cpue 9Qp dros clínicos do paciente A (Tabelas 3 e 4) dos outros nacisntes estudado:

riaiS ;e amora tinham melhorias ensimaticas muito elevadas associadas cos.

recuperaçao clínica.

bad or'^g,nal

- b moles por grama de proteina = Nível normal; ++++ = nível de RNase L hiperactivo medido no ensaio de clivagem de rARN.

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Trailmaking A Suave Severo Severo Normal

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RESULTADOS DE ENSAIOS NEUROPSICOLQGICOS CUMULATIVOS rRSAlQ DE TOe^jRAi-.Cíí a Dl nmROiOiQ

TABELA 4

DATA	FASE	DURAÇÃO
7/23/88	I	1 min, 30 seg.
8/9/88	Terapia	com Ampli génio Iniciada
9/6/88	I	3 min.
10/20/88	II	3 min.
	III	5 min.
12/6/88	I '	3 min.
	II	6 min, 10'seg.
4/4/89	II	3 min.
	III	6 min.

A resistência do paciente ao Síndroma de Fadiga vírus oportunistas pode ser mantida continuando a meveis de 2^!-5'A oligonucleótidos intracelulares, 2'-5'A , e grande aberração na encima RAase 1, e administraARA exógeno, como necessário, para manter a normalida ase normalidade, destas funções moleculares.

Crónica o dir os ní sinte ó3ss trandc ds de, ou cu

Cs ds ARA naturais (intracelulares) nanei im.ncrts.nte na defesa do Aosnedeiro nuando um indivíduo itacado com agente(s) viral(is) como ηο ^^ΏΓusa ;o dc Síndroma de

r.ica . A redução especifica no ds ARA bicactivo, cu en a imas dependem directamente ou inaire;

noadamente a 2’-5'A sintetase e Knase n aoerran*

IgSCic Ο Ο ΓΠ tribui para a croníveis anormalmente baixos de 2'-õ’A em periférico, dentro de células específica nicidade de doenças virais, seja qual for o agente virai espeBAD UmoiivrtL

ClliCOo exemplo inverte lecular alterada.

C ds Aid.', ncmeadamente ds ARA incoeren ALÁPliGAA ^R uu?.; ?

, Hli-1 Research, inc., Rockville, HD., —> y (como por (EUA) a sintomatologia da doença por re-resulaçao da via mcSm ds ARA incoerente pretende incluem-se aqueles era que a ligaçao de hidrogénio (empilhamento de base) entre os espirais opostas está relativamente Intacta, isto é, na é interrompida com-frequência. 0 termo ds ARA emparelhado d_e ve ser entendido d& mesma forma. 0 ds ARA pode ser um complexo de um poliinosinato e um policitidilato contendo uma proporção de bases de uracilo ou bases.de guanidina, por exemplo, de 1 a dessas bases a 30 (poli I . poli (C^_2gX ;> U ou G).

ds ARA pode ter a formula geral rl .r(C xi ' ^UA ^{ou rI}n , U)^. São discutidos a seguir outros exemplos de ds ARA, e oligonucleotidos específicos de espiral dupla podem ser também utilizados era certos cases.

Os ds ARA incoerent

na pre	sente invenç	ao tem uma base
dos	de	entre poli	(0 ,u) e Poli ('
		-
cora	ura	valor entre	4 e 29 e são a'
;;os	Ο. Θ	ácidos poli	rrib0 ino s ini cos

n’ preferidos para utilizaçac ccpolinuclectidcs sscolhima.dos pela modificação de ri^orO^ para incorporar cases desem· parelkadas (uracilo ou guanidina) juntamente com a espiral polirribocitidilato (aO ) nol ti uernarivameir or rivado de coli (I)

Isto de ribesilo do ácido incluindo cs rosi' coersrfces xodem ser complexadcs cora ura polímero -ES t s ''JL CGÍLMC-bj-ílC-Cí o ds ARI pode ser de ificacão do esnue)rf ), por exemplõ de 2'-0-motil ribosilo. Cs ceaclexcs in- estabilizador ; analo ao s i no o e ites ce r.

,rd , cuoos nreieridos sao n’ ^J ΐ ϊ --ΌΡ ri'ⁿ a ) _n OU _J.i_nx.I^,(v2g_l-/_n, suo pcsoucs a icrmu sao descritos nor la geral ^_i-(0_1>1, _SU; cárter e Ts’c nas Patentes forte-Americanas 4 130 641 e 4024222

BAD ORIGINAL

cujas descobertas sac acui incorporadas per referência, is ds aPJ·; ali descritos sao geralmente adecuadcs para utilização de acordo coe a cresente invenção.

Gutr .nvenoão	os exemplos de ds APS? inclui
poli (I)	. poli (0₄,U)
poli (I)	. poli (Cy,U)
poli (I)	. poli (C₁₅,U)
poli (I)	. poli (C₉₂,U)
poli (I)	. poli (C_2o,G·)
poli (I)	. poli (C₂₉,G)
poli (I)	. poli Cp23 9;>p

rente cara .liOC.Se j C OilZ Θ TÍÍIClO r

solventes ou a·’

Ás moléculas de ds ÁPdi oligcnucleótido pedem tamz bem ser utilizados quando os terminais moleculares sao dobra dos para evitar o deslizamento dos pare assim numa bioactividade esoecífioa em vário íucsos que existem nos fluidos biológicos humano ~ concentracao e tamanho molecular de e auroL pressão podem ser erminar a j.uncionalmaúe oioicgica (activi— dem sor quantificado por cromatografia liquida (ZPIO). Gs'ensaios de clivagem do ribossoma de utilizados para de dade biológica) do 2’-5’Á sintetizado pelo paciente in vive e determinar o nível de Rhase 1 activada ma amostras do paciente, is células m.ononucleares do sangue periférico são as células prc_erijas para ananse emoora se possam ananzar outras celu~ Z . . . n r u_ ^z ias se a iniecyao crónica oo vírus a o sequestrada on outros or Γ C C S 'J. 0 0 0 0 *

Gs cadentes com o Síndroma de fadiga Crónica tra intravenosas de 2GG a GGG mg de π · χ (vη ,ι, t ) duaí ou

S V£ •s ncr semana ou

BAD ORIGINAL

níveis de 2’-5’A aumentem sa associaçao com a melhoria clinica e correcçao dos níveis de sintetase e aberração de RNase L. A quantidade de ds ARN administrado e a frequência dc- administração serão ditadas por parâmetros laboratoriais medidas em ligação con a melhoria clínica do paciente. As quantidades de ds ARN administradas proporcionarão um nível transiente de 0,01 a 1,000 raicrogramas de ds ARN por mililitro do sangue sistémico do paciente imediatamente após administração medidos num ponto distai do ponto de infusão. Os fragmentos bioactivos de ds ARN, produtos de desintegração do ds ARN macromolecular de infusão, servem para manter a melhoria das vias enzimáticas 2-5A, acelerando assim o orocesso de recuneração clínica.

Claims

- lã Método de diagnóstico para a presença de uma in fecoão virai crónica como por exemplo c síndroma de fadiga cro nica, num paciente humano, caracterizado por se determinar o ní vel de 2'-5’ A olimonucleótidos celulares e enzimas sintetase e RNase 1 relacioradas numa amostra sangue perizen;

ciente e comparar-se esse nível com mvei 2'-5' A oligonucleótidos sintetase e RNase L em sere sauaaveis, indicanro cs valores rsouzicos ae n:

í í . '•Λ · 4 .- -'g ' ·] o~) nm».

tidcs sintetase e moléculas enzimicas alteradas, quando compara das com os correspondentes a seres saudáveis, a presença do sin droma ce fadiga crónica.

_ ea _

Método cara distinguir o síndroma da fadiga cro nica induzida por vírus de problemas psicológicos ou neuropsiquiátricos primários parecidos numa pessoa, caracterizado por sc- determinar o nível de 2^J-5’A sintetase, 2’-5’A cligonucleótidos intracelulares e RNase 1 aberrante numa amostra de san-zue i

BAD ORIGINAL periférico do paciente e c o;mparar en· veis predeterminados de componentes ressoas saudáveis«.

se esses valores com os nímolccalares semelhantes em

- 3 = Método de acordo com a reivindicação 1 oa reivindicação 2, caracterizado por o 2’-5’ A oligonacleótido ser 0 2'-5'-oligoadenilato.

- 4ê Método de acordo com a reivindicação 1 oa reivindicação 2, caracterizado por a diagnose ser presumivelmente positiva para a sindroma da fadiga crónica associada com infecções virais quando o 2*-4' oligonacleótido na amostra retirada do paciente e superior a 1,0 nanamcles de 2’-5’A por grama de proteína de linfccito associado com pelo menos am sintoma clínico .