PT90091B - Processo para a seleccao de fragmentos grandes de dna - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

Do registo de patente europeu com o numero de publicação (EP-A) 0 2^3 θ5θ conhece-se um processo para a pre paraçao de mutantes, no qual se isola o DNA total a partir da estirpe de partida, se transforma este em fragmentos curtos, se integram estes num plasmideo que contêm um marcador, que ê sensível ã temperatura e replicâvel na estirpe de partida, se transforma a populaÇao de plasmídeos híbridos obtida na estir pe de partida, se seleccionarem os transformantes por meio de uma selecçao no marcador, se eliminarem os plasmídeos híbridos por meio de uma elevaçao de temperatura para alem do limi te de dilataçao do plasmideo sensível a temperatura e se sele ccionarem os mutantes por meio de nova^Aselecçao no marcador. Neste ultimo passo de selecçao obtem—se apenas as células que incorporaram no cromossoma o DNA plasmideo com o marcador. Uma vez que a integração do DNA plasmideo numa região de DNA homô Ioga adequada da célula hospedeira ocorre de preferencia atra

N, vês do DNA clonado no plasmideo, este processo conduz a uma inactivaçao de um gene nessa região homologa, quando o fragmen to de DNA clonado no plasmideo nao contêm nem a região promotora nem os sinais para o fim de translacçao. Transferindo en tao o genoma dos mutantes assim obtidos para um banco genetiΛ ** co obtem-se directamente por selecção no marcador os clonos que contêm o gene mutacionado.

Ao contrário dos processos desde bá muito conhecidos, utilizando o fago 0C31, com os quais se podem apenas isolar fragmentos de DNA curtos, o processo de acordo com a EPA 0 243 θ56 possibilita o isolamento de fragmentos de DNA um pouco mais compridos, que podem conter por exemplo, para alem do gene mutacionado, genes vizinhos nao mutacionados. A condição para isso e que existam posiçoes de corte apropriadas para enzimas de restrição e que os genes desejados estejam ordenados do modo esperado no fragmento de DNA clonado.

Μ «V

Descobriu-se então que as limitações referidas em relaçao ao comprimento e ao ordenamento de posiçoes de corte de restrição do fragmento de DNA mutacionado e das suas regiões vizinhas, se podem ultrapassar quando neste processo se escolhe um marcador que seja seleccionável em E, coli. Po— de então, nomeadamente, seleccionar-se o gene mutacionado directamente a partir de um banco genético de cosmídeos em E. coli. Para isso estabelece-se um banco genético de cosmídeos dos mutantes em E. coli. Apês selecção no marcador integrado, por conveniência simultaneamente a selecção no marcador pro— prio do cosmídeo, selecciona-se imediatamente o cosmídeo que interessa. Torna-se assim desnecessário o moroso “screening” por hibridação, normalmente necessário.

termo cosmídeo” designa neste caso, para além dos próprios cosmídeos, também os plasmódeos de E. coli de idêntico efeito, que *— como os cosmídeos -* sao capazes de integrarem e de replicarem de forma estável fragmentos de DNA de cerca de 4θ-5θ kb. Sao particularmente apropriados os

plasmideos que existem na célula num pequeno número de cêpias.

processo de acordo com a invenção permite deste modo o isolamento de grandes regiões de DNA (na ordem de grandeza de 40 kb), tal como sao integráveis em cosmídeos de modo em si conhecido. Este processo ê assim particularmente apropriado para o isolamento do clusters (aglomerados) de genes e facilita a identificação de mecanismos biossinteticos completos cujos genes se encontram frequentemente na forma de clusters.

marcador seleccionavel em E. coli nao preci sa de coincidir com o marcador utilizado para os primeiros pas sos de selecção do processo conhecido. Pode-se, de contrario, utilizar para o processo de acordo com a invenção plasmideos sensíveis à temperatura ou tornados sensíveis à temperatura» que por um-lado possuam marcadores seleccionaveis em E. coli e que, por outro lado, possuam regiões de DNA que possam ser replicados e seleccionadas na estirpe a mutacionar. A constru çao desses vectores e conhecida.

Os marcadores de resistência que se exprimem tanto em E. coli como em, por exemplo, estreptomycetenos, a partir do préprio promotor, sao por exemplo os genes para a resistência à canamicina e à gentamicina (EP-A 0 248 207)· ** A

Em relaçao a outros pormenores faz-se referen cia à EP-A 0 243 856.

Uma forma preferencial de execução da inven— çao refere-se a preparaçao e isolamento de mutantes estreptomycetenos. Para tal, pode empregar-se muito vantajosamente o plasmídeo pSG5, conhecido do registo de patente europeu (EP-B) 0 158 872 (ou do registo australiano 40599/85)· Mostrou-se por exemplo surpreendentemente que este plasmídeo ê sensível a tem peratura e que por isso, apés introdução de um marcador, se . pode utilizar imediatamente para o processo de acordo com a

- 3 ** % ** Λ Λ Λ invenção. A utilização do plasmídeo pSG3 como plasmídeo sensi vel a temperatura se refere também a patente registada no mes mo dia com a designação ‘'utilização do pSG5 como plasmídeo senxível à temperatura (Verwendung von pSG5 ais temperatursensitives Plasmid)(HOE 88/F 069» correspondente ao registo de patente alemao P 38 O¹/ 692.7 de 23· 3· 1988).

A figura mostra o plasmídeo pGM8, um derivado do pSG5 com dois marcadores.

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar mais de perto a invenção.

Exemplo 1

Construção do vector estreptomyceteno pGM8 vector pGM8 sensível à temperatura ê um derivado do plasmídeo pSG5, conhecido da EP—B 0 158 872 (e, se— gundo as condiçoes do acordo de Budapeste, registado no deposito alemao de microorganismos e de culturas celulares com o η^Ω DSM 2932). Nesta EP-B descrevem-se também dois vectores, derivados do pSGJ e que contêm genes resistentes a antibióticos. De modo analogo se efectua a construção do pGM8í

Em primeiro lugar isola-se, a partir do plasmídeo pIJ6 disponível no mercado, pelo processo descrito na EP-B 0 158 872, com Bell, um fragmento de 1,1 kb, no qual se encontra o gene da resistência a tiostreptona tsr. Este fragmento liga-se no vector pUC19 eomercial, que fora aberto com BamHI. Obtêm-se assim o plasmídeo pSLEóO.

Abre-se primeiro o pSLE6O com Hindiii» enchen do-se os extremos côncavos com polimerase de Klenow. Corta-se com EcoRI e isola-se o fragmento de 1,1 kb no qual se encontra o gene tsr.

Digere-se então totalmente o plasmídeo -SG5 com EcoRl e PvuII e isola-se o fragmento de 3,2 kb que contêm a origem de replicaçao. Liga-se agora este fragmento com o fragmento que contêm o gene tsr. Obtêm-se assim o plasmideo pGM5 de 4,3 kb.

No pGM5 introduz-se agora como segundo marcador de resistência um gene da resistência à gentamicina, acti vo em estreptomycetenos e em E. coli. Para*tal, a partir do plasmideo pSLE8O (vide EP-A 0 248 207> registado nas condiçoes do acordo de Budapeste com o n^fi DSM 3710), isola—se com Sall o fragmento de 2,3 kb que contem o gene Gm · Abre-se então o pGM5 com Xhol e liga-se com o fragmento de 2,3 kb, obtendo-se o vector pGM8. Neste vector existem posiçoes de corte para EcoRl, SstI, HindIII, Xbal, Ciai (inactivaçao de tsr) e BglII (inactivação de Gm^r).

A figura mostra a carta de restrição do pGM8.

Exemplo 2

Como material de partida utiliza-se a estirpe S. hygroscopicus ATCC 21705, mencionada nas EP-A 0 173 372,

242 236 e 0 242 246 e que ê facilmente acessível. Esta estirpe contêm um gene resistente contra o antibiótico fosfinotricil-alanil-alanina (PTT). De Thompson et al. , EMBO J. 6(9), **

2519-2523, 1987, sabe-se que por meio de uma digestão dupla com Sall e Kpnl se obtêm um fragmento de DNA que contêm parAr tes do gene resistente sem promotor e sem final de translaçao.

Para tal isola-se o DNA total de estirpe mencionada, cinde-se o DNA com Sall e Kpnl e isola—se um fragmen to de DNA com um tamanho de cerca de 250 bp. Amplifica—se este DNA no vector comercial pUCl8 que se abrira com Sall e Kpnl. Após amplificaçao corta-se o fragmento de DNA contendo o gene resistente com HindIII e EcoRl e, após introdução de um agente de lincagem apropriado, coloca-se na posição de cor te RcoRI ou HindIII do vector estreptomyceteno pGM8.

A mistura de ligaçao transforma-se em S. hygroscopicus. Seleccionam—se as células contendo plasmídeos em relaçao à resistência à tiostreptona e/ou à gentamicina. Incu bam-se os transformantes em meio nao selectivo a uma temperatura superior a 3$°C, de modo a eliminar todos os plasmídeos autónomos» Por nova selecção dos esporos formados no meio de selecção obtem-se apenas as colonias que integraram o DNA pias % ** nudeos no cromossoma. Devido as recombinaçoes preferenciais por meio das zonas homólogas clonadas trata-se, no caso das células resistentes à tiostreptona, de facto de mutantes a partir dos quais se podem agora seleccionar as células sensitivas ao PTT.

Exemplo3

Isolamento do gene resistente ao PTT mutacio— nado e das regiões de DNA vizinhas

A partir dos mutantes obtidos de acordo com o exemplo 2, por meio do cosmídeo comercial pHC79 (Boehringer Mannheim, vide E.—L. Winnacker, Gene und Klone, VCH Verlags— gesellqchaft, Weinheim, 19θ5, pêg. 150), «m banco de genes.

** A ** \ a V

Por meio de selecção simultânea em relaçao a resistência a gentamicina e à tetraciclina ou à ampicilina, obtêm-se direcA ** tamente os clonos que contem o gene mutacionados e as regiões de DNA limítrofes. Uma vez que se sabe, de Murakami et al., Mol. Gen. Genet. 205, 42-50, 1986, que o gene resistente ao PTT é uma parte do cluster” biossintêtico de l6 kb, obtêm-se assim directamente 15 cosmídeos que contêm o gene biossintéti co.

Claims (1)

1. REIVINDI CAÇOES

   Processo para a selecção de fragmentos de DNA a partir de mutantes, no qual se isola o DNA total a partir de uma estirpe inicial a mutacionar, se transformar o DNA em pequenos fragmentos, se integram estes num plasmideo que seja sensível à rempefcatura, que contenha um marcador de selecção e que seja replicavei na estirpe inicial, se transforma a po•Μ Λ Λ pulaçao de plasmídeos híbridos assim obtida na estirpe iniciai, se seleccionam os transformantes por meio de selecção com o marcador, se eliminam os plasmídeos híbridos por meio de elevaÇao da temperatura para alem do valor limite do plasmídeo sensível ã temperatura, se isolam os mutantes com o DNA plasmideo integrado no genoma por meio de nova selecção com o marcador, se constroi um banco de genes a partir do DNA dos mutantes, e se seleccionam clonos com o gene mutacionado por meio de selecção com o marcador, caracterizado por o plasmi— deo sensível a temperatura conter um marcador de selecção expressavel em E. coli e o banco de genes construído com o DNA dos mutantes ser um banco de cosmídeos.

   - 2a Processo de acordo com a reivindicação 1, ca** racterizado por o marcador de selecção expressavel em E. coli

   A ** ser idêntico ao utilizado para a selecção dos transformantes na estirpe inicial·

   Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se isolarem fragmentos de DNA que contêm •'cluster” (cachos) de genes.

   A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 23 de Março de 1988, sob o n^s P 38 09 691*9·