PT89032B

PT89032B - Processo para a preparacao de um eter policiclico acidico util como agente anticoccidico e como promotor de crescimento

Info

Publication number: PT89032B
Application number: PT89032A
Authority: PT
Inventors: Hiroshi Maeda; John Philip Dirlam; Junsuke Tone; Walter Patrick Cullen
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1987-11-20
Filing date: 1988-11-18
Publication date: 1993-02-26
Also published as: DE3882490D1; DK644288A; WO1993012800A1; EP0317231B1; IE883464L; US5147858A; ES2058310T3; ATE91687T1; DE3882490T2; JPH0588719B2; PT89032A; EP0317231A3; EP0317231A2; JPH01165392A; DK644288D0; IE61964B1

Description

PFIZER INC.

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM ETER POLICICLICO ACDICO ÚTIL COMO AGENTE ANTICOCCÍDICO E COMO PROMOTOR DE CRESCIMENTO ί

t

em que Me é metilo.

processo de preparação consiste em se proceder à fermentação do referido microorganismo, sob condições aerábicas submersas num meio nutriente aquoso compreendendo uma fonte assimilável de carbono e azoto ate .se formar uma quantidade recuperável do referido composto.

I

-30 presente invento diz respeito a um novo antibiótico de éter policiclico aic.idico tendo a fórmula estereoquimica absoluta

OMe

em que Me=CH^; seus sais catiónicos farmaceuticamente aceitáveis; composições alimentares nutrientes compreendendo o referido antibiótico para galinhas, vacas ou porcos; o seu uso como um agente antieoccidial nas galinhas, ou como um promotor do crescimento em vacas ou porcos; um método de fermentação para a sua preparação; e o microorganismo Actinomadura sp o qual produz o referido antibiótico no referido método de fermentação.

composto (I) grupo de antibióticos de éter policiclico lia inclui agentes bem conhecidos tal como Merck Index, 10th Ed., Merck and Co., Inc. 1983, monografo ns. 6100), nigericina (loc ηδ. 6271 ), lasalocid (loc? cit. , monografo micina (loc. cit., manografo na. 8193). 0 ê um novo membro do acídico. Esta famimonensina (The , Rahway, N.J., .· cit · > monografo ηδ 5204) , e salino assunto foi revisto

I • 4-

por Westley, Polyether Antibiotics, Adv. Appi'. Microbiol., vol. 22, pp 177-223 ( 1977). Estes compostos são geralmente conhecidos como coccidiostatos e/ou aditivos da ração-promotores do crescimento.

Uma cultura de Actinomadura sp., ATCC 53676, quando fermentada sob condições aeróbicas em meio aquoso produz um novo antibiótico de éter policiclico acidico, um composto tendo a fórmula (I), como acima especificado.

presente invento ê dirigido ao referido composto de fórmula (I), incluindo os seus sais catiónicos farmaceuticamente aceitáveis, e a um processo para a sua preparação o qual compreende e fermentação da referida Actinomadura sp. ATCC 53676 num meio nutriente aquoso compreendendo uma fonte de carbono e azoto asimilável até se formar uma quantidade reeuperável do referido composto de fórmula (I), preferivelmente sob condições aeróbicas submersas. Por uso como um agente anticoccidial e/ou um promotor do crescimento, o composto (I) não é necessariamente separado da fermentação e isolado na forma substancialmente pura, mas é alternativamente usado na forma em bruto, quer na forma precipitada misturado com o micêlio (recolhido por filtração do meio de fermentação), ou em sólidos obtidos por secagem por atomização ou por congelação do meio de fermentenção global.

Os referidos sais eatiónieos farmacêuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados aos, de sódio, potássio, cálcio, amónia, N-N’-dibenziletilenediamina, N-metilglucamina (meglumina) e dietanolamina. Os sais eatiónieos preferidos são os de potássio e sódio.

presente invento é também dirigido a composições alimentares nutrientes, uma para vacas ou porcos a qual compreende o composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para promover o crescimento e/ou melhorar a utilização da alimentação das referidas vacas ou porcos, e a outra para as galinhas a qual compreende o composto de fórmula (I) numa quantidade efectiva para controlar a infecção coccidial nas referidas galinhas.

presente invento ê ainda dirigido a um método para promover o crescimento e/ou aumentar a eficiência de utilização da racção em porcos ou vacas, o qual compreende a administração aos referidos porcos ou vacas de uma quantidade promotora do crescimento ou promotora da eficiência de utilização da ração do composto de fórmula (I), particularmente na forma de uma composição alimentar nutriente; e a um métodos para o control de infecções coccidiais nas galinhas o qual compreende a administração às referidas galinhas de uma quantidade anticoccidialmente efectiva do composto de fórmula (I), particularmente na forma de uma composição alimentar nutriente.

Finalmente, o presente invento é dirigido a uma cultura biologicamente pura de Aetinomadura sp ATCC 53676, sendo a referida cultura capaz de produzir 0 composto de fórmula (I) numa quantidade recuperável após fermentação num meio nutriente aquoso compreendendo fontes de carbono e azoto assimilável; incluindo a referida cultura na forma de seca por congelação.

A cultura capaz de produzir o presente antibiótico de éter policiclico de fórmula (I) ê designada Actinomadura sp., e foi depositada na The American Type culture eolleetion, Rockville, Maryland como a cultura tipo sob 0 seu nómero de acesso ATCC 53676. A permanência do depósito desta cultura na The American Type culture Collection em Rockville, Maryland e a sua pronta acessibilidade ao públi co são conseguidas através da vida efectiva da patente no caso da patente ser garantida.

Esta nova cultura foi derivada de uma amostra de terra recolhida em Hongo Town, Toyama City,

-6Toyama Perfeeture, Japan, e identificada na colecção cultura da Pfizer Ine. como N742-34. A sua descrição e classifieação foram fornecidas por Dr. L. H. Huang. Esta cultura foi observado produzir dimensões estreitas das hifas dos actinomicetes, ura micélio aéreo sobre que se produzem cadeias de esporos, e um substracto micélio não fragmentado. Os resultados da análise global da célula indicam ainda que ela pertence ao género Actinomadura.

Numa cultura slant do microorganismo foi plantada num caldo ATCC 172 e cresceu durante quatro dias a 28SC num agitador. Foi a seguir centrifugada durante 20 minutos, lavada três vezes com água destilada estéril, e plantada num meio vulgarmente usado para identificação de membros de Actinomicetais.

As culturas foram incubadas a

28sc e os resultados lido várias vezes, mas mais vulgarmente aos quatorze dias. As cores foram descritos na terminologia usual, mas as cores exactas foram determinadas por composições com bocados de cor do The Color Harmony Manual, quarta edição Os métodos das análises do amino ácidoe açúcar de toda aacêlula são os descritos em Becker et al., Appl. Microbiol., vol. 12, pp 421-423 (1964), e em Staneck et al., Appl. Microbiol., vol. 28, pp. 226-231 (1974) e Lechevalier, J. Lab. Clin. Med., Vol. 71, pp. 934-944 (1968), respectivamente. Para fins de comparação, usamos Actinomadura citrea ATCC 27887, A. cremea ATCC 33577 e A. macra ATCC 31286.

A cultura foi identificada como se segue:

Agar de Extrato de Fermento-Extracto de Malte (meio ISP 8 2, Difco) - Bom crescimento, amarelo acinzentado, cinzento a preto acizentado (2 gc, 2 li, 2 ie, nl); elevado, enrugado; micélio aéreo escasso, branco a cinzento pálido (séries 3 dc quase cinzentas); reverso cinzento

amarelado, cinzento a preto acizentado (2 de, 2 li, 2 nl); pigmento amarelado solúvel (2 1c).

Agar de Farinha de Aveia (meio ISP 3, Difco) - erescimento moderado, amarelo esverdeado pálido (1 1/2 ca, 1 ca, 1 ea); ligeiramente elevado, suave, nenhum micélio aéreo; reverso o mesmo que superfície; pigmento solúvel nenhum a creme (1 1/2 ca).

Sais Inorgânicos-Agar de Amido (meio ISP # 4, Difco) - Crescimento pobre, verde pálido amarelo (1 1/2 ea, 1 ea), fino, suave, nenhum ou escasso micélio aéreo incolor; reverso o mesmo que superfície; nenhum pigmento solúvel.

(meio rosa nenhum nenhum

Glicerol-Agar de Asparagina Crescimento pobre a moderado, cor de a levemente elevado; micélio aéreo ; reverso cor de rosa pálido (3 ea);

ISP # 5, Difco) elaro (3 ca); fino a escasso, incolor pigmento solúvel.

Czapek - Agar de Sacarose (Waksman, The Aetinomyeetes v. 2, meio &1, p. 328_y 1961)-Crescimento moderado, Creme (1 1/2 ca); leveraente elevado, suave; mieêlio aéreo nenhum a escasso, incolor; reverso incolor a creme (1 1/2 ca); nenhum pigmento solúvel.

Glicose-Agar Asparagina (ibid·._r meio ^2)- Crescimento moderado; quase branco, creme, am'arelado a castanho amarelado (2 ca, 1 Ic, 3 1c); levemente elevado, suave, micélio aéreo quase branco; reverso amarelado a castanho amarelado (2 ga, 3 lc); pigmento solúvel amarelado pálido (2 ea).

Agar de Tirosina Gordon e Smith (Gordon and Smith, J. Bacteriol., 69: 147-150, (1955) - Crescimento moderado, castanho (3 le, 3 lg); fino mas pode ser

X

elevada para o extremo da faixa, suave, nenhum micélio aéreo, reverso castanho (3 le); pigmento amarelado solúvel (2 lc).

Agar de Malato de cálcio (W a ks ma η, Bacteriol. Rev. 21, 1-29, 1957). Nenhum crescimento.

Agar de Caseína (Gordon and Smith, ibid.) - Crescimento moderado, castanho amarelado a castanho (3 ic, 3 le); levemente elevado, suave, nenhum micélio aéreo; reverso amarelado a castanho amarelado ( 2 nc, 3 lc); pigmento solúvel castanho amarelado ( 3 lc).

Agar de Bennett (Waksman, loc. cit., meio $ 30, P· 331) - Crescimento bom a excelente, castanho amarelado a castanho (3 ic, 4 lg, 3 ni); elevado, enrugado; micélio aéreo, branco a quase branco, produzido em direcção à margem; reverso castanho escuro (3 li, 3 ni); pigmento amarelado solúvel (2 lc).

Agar de Emerson (ibid., meio #28, p. 331) - Crescimento bom, cinzento amarelado (2 ie, 2 lg, ni), elevado, enrugado; micélio aéreo cinzento pálido (séries quase cinzentas 3 dc); reverso cinzento amarelado e cinzento esverdeado (2 ng, 11/2 ng); pigmento solúvel castanho amarelado (3 ne).

Agar Nutriente (ibid., meio # 14, p. 330) - Crescimento pobre a moderado, castanho amarelado a castanho (3 lc, 3 ic, 3 le), levemente elevado, suave mas granular nalgumas áreas, confluente ou aparecendo como colónias isoladas; nenhum micélio aéreo; reverso castanho amarelado (3 lc); nenhum pigmento solúvel.

Agar de Gelatina (Gordon and Mihm,

J. Bacteriol. 73, 15-27, 1957) - Crescimento moderado, castanho (3 nc, 3 le); moderadamente elevado, suave mas enrugado em direcção ao extremo da faixa, nenhum micélio aéreo; rever-9so castanho (3 le); nenhum pigmento solúvel.

to moderado, mas enrugada escasso, inc solúvel.

castanho (3 em direcção olor; revers

Agar de Amido (ibid.) - Crescimenne); moderadamente elevada, suave ao extremo; micêlio aéreo nenhum a o castanho (3 ie); nenhum pigmento

Agar de Batata e Cenoura (Lechevalier, Lab. Chim. Med., 71, 934-944, 1968, mas usamos sómente 30 g de batatas, 2,5 g de cenouras e 20 gr. de ágar) - crescjí mento pobre e moderado, creme (1 1/2 ca); fino a levemente elevado, suave, micêlio aéreo escasso, incolor; reverso incolor a creme (1 1/2 ca); nenhum pigmento solúvel.

crescimento pobre, lio aéreo eseasso, solúvel.

Agar de Agua da Torneira (2%) incolor a creme (2 ca); fino, suave, micêincolor; reverso incolor; nenhum pigmento

Meio Mineral 1 de Gauze (Gauze et al., Problems in the Classification of Antagonistie Actinomycetes, English Ed., p.13, 1957) - Crescimento moderado, verde amarelado (1 ie), fino, suave; micêlio aéreo eseasso, inco lor, reverso verde amarelado pálido a verde amarelo (1 ea, ic); pigmento creme pálido solúvel (1 1/2 ca).

Meio Mineral 2 de Gauze (ibid) Crescimento bom, castanho amarelado a 5 gc), elevado, enrugado, com micêlio castanho amarelado a castanho laranja pigmento solúvel.

cor de rosa (3 gc, 3 ic, aéreo braneo; reverso (3 gc, 4 lc); nenhum

Propriedades Morfológicas - As propriedades morfológicas foram observadas uma vez por semana até sete semanas. A cultura não produziu esporos em qualquer meio excepto para agar de sais inorgânicos - amido.

-10Apos sete semanas de incubação neste meio, produziram-se algumas pequenas áreas de cadeias de esporos. Eles eram curtos com 3 a 9 esporos por cadeia de esporos e eram lineares, sinuosos, curvos a em gancho. Os esporos eram esféricos, ovais a elípticos e mediam 0,9-1,3 um de diâmetro ou 1,0-1,6 χ 0,8 -1,1 um. Eles eram verrugosos como revelado por microscopia de varrimento eléetronico. Além dos esporos, a cultura tam bém produziu massas lifais castanho a castanho escuros sobre o agar de glieose-asparagina, agar de Bennett, agar de extra£ to de levedura-extracto de malte, agar de sais inorgânicos amido, e agar de glieerol-asparagina. Eles eram estruturas rigidamente entrançadas as quais eram de forma esférica, subesférica, elípticas, alongada ou irregular, e mediam 5-25 um de diâmetro ou 8-25 χ 7-20 um.

Propriedades Bioquimicas - Mela mina não produzida; gás sulfidrico não produzido; gelatina li quefeita; amido hidrolizado; nitrato reduzido a nitrito em banho de nitrato de dextrose; nenhum crescimento e nenhuma de composição quer em banho de Jensen ou Levine quer em Schoen heim; coagulação e clarificação em leite; digestão positiva da caseina; digestão positiva da tirosina. Utilização de carbohidrato: glicose, ramnose, secarose, amido e trehalose uti lizadas; arabinose, fructose, inositol, manitol, rafinose, xilose, adamitol, eelobiose, dulcitol, eritritol, galactose, glicerol, lactose, maltose, manose, melezitose, melibiose, alfa-metil-D-glucoside, ribose, salicina, sorbitol e sorbose não utilizados.

Os outros testes positivos incluem utilização de acetato, propionato e piruvato. Os testes seguintes eram negativos: de composição de adenina, xantina,hipoxantina, e urease; hidrólise de esculina e hipurato; e resistência a lisozima.

Relações de Temperatura -11-

21QÇ

Crescimento

Moderados

28QC

Crescimento

Bom

37^ÕC

Crescimento

Bom

45SC

Nenhum

Crescimento

Análise da célula global - Os hidrolizados da célula global continham ácido meso-diaminopimélico, glicose, galactose, madurose e ribose.

A cultura N742-34 ê caracterizada pelo micélio aéreo branco a cinzento pálido; o substraeto micélio verde-amarelo, amarelo-castanho a castanho; as cadeias de esporos de lineares curtos a sinuosos; e os esporos com uma superfície verrugosa. A presença nos hidrolisatos da célula global de ácido meso-diaminopimélico e madurose indica ainda que pertence ao genero Actinomadura.

Entre os mais de quarenta espécies da Actinomadura, cinco assemelham-se à cultura N742-34 nas propriedades morfológicas e/ou bioquímicas: A. citrea, A. cremes, k. flava, A. livida, e k. macra. Ambas A. citrea e k_. flava produzem um substraeto micélio amarelo-limão, como faz a cultura N743-34. A. flava produz longas cadeias de esporos com uma superfície suave enquanto a cultura N742-34 forma curtas cadeias de esporos e esporos com uma superfície verrugosa. Não como a cultura N742-34, k. citrea utiliza arabinose, xilose, manitol e fructose.

- Ά

12A. lívida forma cadeias de esporos na forma de ganchos ou espirais com um só passo, enquanto a cultura N742-34 forma cadeias de esporos lineares ou sinuosas Num agar de farinha de aveia e meio mineral 1 de Gause, A. lívida forma um pigmento solúvel violeta pálido, mas a cultura N742-34 forma um pigmento creme solúvel.

A. cremea difere da cultura N742-34 na utilização positiva de arabinose, fructose, manitol, xilose, adomitol, glicerol, lactose e succinato; utilização negativa de sacarose e amido; e de composição de esculina.

A. macra ê muito análoga à cultura N742-34 na maioria das propriedades bioquimicas. Notaram-se algumas diferenças. Diferentemente do primeiro, o ultimo ramnose e amido, hidroliza o amido, coagula o leite e decompõe a caseína. Além disso, a cultura N742-34 produz principalmente um substracto micêlio verde-amarelo, castanho-amarelo ou castanho e esporos com uma superfície verrugosa; enquanto que A. macra produz principalmente um substracto micêlio creme ou cinzento e esporos com uma superfície suave.

Com base na anterior, a cultura N742-34 ê considerada como um membro do gênero Actinomadura e designada Actinomadura sp. É o tipo de estirpe de Actinomadura sp. e foi depositada na American Type Culture Collection sob o número de acesso 53θ?6.

composto antibiótico (I) do presente invento é prontamente produzido pela cultura Actinomadu ra por crescimento de cerca de 242 a cerca de 36SC. Sob condições submersas com agitação e aeração num meio formado por fontes de carbohidrato tal como açucares, amidos, glicerol; substâncias orgânicas, azotadas tal como farinha de soja, áci dos casamino, extracto de fermento; substância de crescimento tal como cereais solúveis, farinha de peixe, farinha de semente de algodão; sais minerais contendo traços de elementos

tal como ferro, cobalto, cobre, zinco, etc. e carbonatos ou fosfatos de eáleio como agentes tampão. Após o crescimento estar completo, o antibiótico é rapidamente recolhido por extracção do banho global com um solvente orgânico tal como n-butanol, metilisobutilcetona, ou clorofórmio a gamas de pH de 4,0 a 8,0; por filtração do micêlio, o qual contem o antibiótico precipitado, sendo o filtrado rejeitado; ou por simples secagem por atomização ou secagem por congelação de todo o banho. Alternativamente, o micélio ou o banho global seco ê extraído com um dos referidos solventes orgânicos. 0 composto antibiótico purificado, se o desejarmos, é isolado do extracto orgânico por métodos de concentração padrão, formação de ácido livre ou sal, cromatografia, precipitação e/ou cristalização, como exemplificado a seguir.

Na maneira usual de efectuar a fermentação, preparamos primeiro um inoculo raspando as células vegetatlvas, crescendo num meio apropriado, a partir de Slants ou garrafas de Roux as quais foram inoculadas com Aetinomadura sp. ATCC 53676. As células vegetativas resultantes são por sua vez usadas para inocular frasco de agitação ou tanques de inoculação, também contendo meio de crescimento apropriado. Alternativamente, os tanques de inoculação são inoculadas a partir dos frascos de agitação. Seguindo ura período de crescimento apropriado (e.g., 120-196 horas), o fermentador, também contendo o meio de crescimento apropriado, é inoculado com a cultura vegetativa dos frascos agitados ou tanques de inoculação. Após crescimento completo (e.g., 120-196 horas), o composto antibiótico é recolhido na forma bruta ou pura, como desejado, por um ou outro dos métodos geralmente acima descritos, ou por métodos especificados os quais são exemplificados a seguir.

composto de fórmula (I) é testado para a actividade antibacteriana in vitro por métodos padrão nos quais se medem as concentrações inibidoras minimas (MICS) em mcg/ml contra um ou mais microorganismos. Um tal

-14processo é o recomendado pela International Collaborative Study on Antibiotic Sensitivity Testing (Ericcson and Sherris, Acta. Pathologica et Microbiologica Scandinav, supp. 217, Section B: 64-68 /1971/). e emprega agar de infusão do cérebro e coração (BHI) e um meio de duplicação da inoculação. Tubos de crescimento durante a noite são diluidos 100 vezes para uso como o inoculo padrão (20000 - 10000 células em aproximadamente 0,002 ml são colocadas na superficie agar; 20 ml de agar BHI/prato). Empregamos doze diluições duplas do composto de teste, sendo a concentração inicial da droga em teste de 200 mcg/ml. Rejeitamos colónias simples quando lemas os pratos após 18 horas a 37^QC. A susceptibilidade (MIC) do organismo de teste é aceite como a concentração mais baixa do composto capaz de produzir inibição completa do crescimento como julgado à vista desarmada. Como outros antibióticos de éter policiclico, o presente composto de fórmula (I) apresenta tipicamente actividade antibacteriana Gram positiva, bem como actividade contra Treponema hyodysenteriae. como ilustrado na Tabela (I) ,

TABELA I

ACTIVIDADE ANTIBACTERIANA IN VITRO D0 COMPOSTO DE FORMULA (I)

Organismo		Estirpe NS	MIC, meg/ml
Clostridium	perfringens	10A006	0.39
		10A009	<0,20
Actinomyces	pyogenes	14D002	< 0,20
		14D008	<0,20
		14D011	<0,20

Organismo	Estirpe NS	MIC, mcg/ml
Treponema hyodysenteriae	94A001	<0,20
	94A002	<0,20
	94A007	<0,20

Os dados de eficácia para o composto de fórmula (I) e seus sais contra infecções coccidiais em galinhas são obtidos pelo método seguinte. Grupos de 3-5 dias de idade de pintos galispo leghorn brancos sem patogênio são alimentados com uma dieta esmagada contendo o composto (I) ou o seu sal de sódio e/ou potássio uniformemente nele disperso. Após estar nesta ração durante 24 horas cada pinto ê inoculado per os com oocistos da espécie particular a de Eimeria ser testada. Outros grupos de 3-5 pintos com dez dias de idade são alimentados com uma dieta esmagada análoga sem o composto (I) ou os seus sais. Eles são também infectados após 24 horas e servem como controlos infectados. Ainda outro grupo de 3-5 pintos com dez dias de idade são alimentados com a mesma dieta esmagada sem antibiótico e não são infeetados com coccidia. Estes servem como controlos normais. Os resultados do tratamento são avaliados após cinco dias no caso de E. acervulina, e seis dias para todos os outros desafios.

critério usado para medir a actividade anticoccidial consiste em números ou marcas de lesão de 0 a 4 para E. tenella conforme J. E. Lynch, A New Method of the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity, Am. J_. Vet. Res. , 22, 324-326, 1961; e 0 a 3 para as outras espécies baseadas na modificação do sistema de marcação inventado por J. Johnson and W. H. Reid, Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in chiks, Exp. Parasit., 28, 30-36, 1970. A actividade é medida dividindo a marca de lesão de cada grupo tratado pela marea de lesão do control infectado. Neste teste, o composto (I) e os seus sais catiónicos apresentam excelente actividade contra infec-16-

ções Eimeria fcenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti e E. necafcrix na criação quando incorporadas na dieta esmagada de galinhas a níveis de cerca de 2,5 a 50 ppm.

Para a prevenção ou control de coccidiosis na criação, o composto deste invento é oralmente administrado a galinhas num suporte apropriado. Convenientemente, a medicação ê simplesmente efectuada ou administrada na água de beber ou na ração, de modo que a dosagem terapêutica do agente é ingerida com a água diária ou a ração da criação.

agente pode ser directamente medido para a água de beber, preferivelmente na forma de um liquido, concentrado solúvel em água, ou adicionando tal qual directamente à ração, ou na forma de um premix ou concentrado. Um premix ou concentrado do agente terapêutico num suporte é vulgarmente empregado para a inclusão do agente na racção. 0 agente terapêutico pode estar na forma substancialmente pura (e.g., o ácido livre, ou um seu sal farmacêutieamente aceitável), na forma de ensaio em bruto tal como mieélio húmido ou seco ou banho global seco. Suportes apropriados são liquidos ou sólidos, conforme desejado, tal como água, e várias farinhas; por exemplo, farinha de óleo de soja, farinha de óleo de linhaça, farinha de carolo de milho, e misturas minerais tal como são vulgarmente empregadas nas rações das galinhas. Um suporte particularmente efeetivo ê a própria ração para as galinhas. 0 suporte facilita a distribuição uniforme dos materiais activos na ração acabada com o qual o premix se mistura. Isto é importante porque sómente são necessários pequenas proporções dos presente agentes potentes. Ê importante que o composto seja vigorosamente misturado no premix e, subsequentemente, a ração. Neste aspecto, o agente pode ser disperso ou dissolvido num veiculo oleoso apropriado tal como óleo de soja, óleo de milho, óleo de semente de algodão, e análogos, ou num solvente orgânico volátil e a seguir misturado com ó suporte. Será apreciado que as proporções de material activo nosconcentrado sejam capazes de ampla variação uma vez que a quantidade do agente na ração aca bada pode ser ajustada por mistura da proporção apropriada de

-17<SHES=33SS=I=4Si

premix com a ração para obter um nível desejado de agente terapêutico .

Concentrados de alta potência são misturados pelo fabricante da ração com suporte proteináceo tal como farinha de óleo de soja e outras farinhas, como acima descrito, para produzir suplementos concentrados os quais são apropriados para alimentação directa da criação. Em tais casos, permite-se que a criação consuma a dieta usual. Alternativamente, tais suplementos concentrados são adicionados directamente à ração da criação para produzir uma ração acabada nutrieionalmente balanceada, contendo um nível terapêuticamente efetivo de um ou mais dos compostos deste invento. As misturas são vigorosamente misturadas por métodos padrão, tal como num misturador de dupla casca, paea assegurar homogeneidade .

Para uso na criação, os níveis usados do eomposto aqui deserito variarão sob circunstâncias diferentes. A medicação continua de baixo nível, durante o período de crescimento, isto é, durante as primeiras 5 a 12 semanas para galinhas, ê uma medida profiláctica eficaz. No tratamento de infeeções estabelecidas, níveis superiores podem ser necessários para ultrapassar a infecção. 0 nivel usado do composto (I) na ração será geralmente na gama de cerca de 2,5 a 50 ppm, preferivelmente na gama de cerca de 2,5 a 12,5 ppm. Quando administrado na água de beber, o nível será o que fornacerá a mesma dose diária de medicação multiplicado pela relação ponderai da dose diária média de ração consumida e do consumo diário médio de água.

A actividade do composto de fórmula (I) e seus sais na promoção do crescimento e/ou aumento da eficiência da utilização da ração em porcos ou vacas pode ser medida directamente por alimentação de grupos de teste de minerais com vários níveis do composto (I) ou um sal na ração.

No entanto, uma técnica mais conveniente é descrita na Especi-18-

ficação da Patente Britânica Ns. 1197826, a qual detalha um método de ruminação in vitro para a avaliação de rações. As mudanças que ocorrem na ração, provocadas pelos microorganismos, são assim prontamente medidas com grande precisão. Esta técnica envolve o uso de um aparelho no qual os processos digestivos dos animais são efectuados e estudados in vitro. As rações dos animais, a inoculação do rumen e vários promotores do crescimento são introduzidos em e retirados de uma unidade laboratorial sob condições cuidadosam.ente controladas e as mudanças que têm lugar são critica e progressivamente estudadas durante o consumo da ração pelos microorganismos. Um aumento no teor de ácido propiónico do fluído rumen indica que uma resposta desejável ao comportamento global do ruminante foi conseguida pelo promotor de crescimento na composição da ração. A variação no teor de ácido propiónico ê espressa como a percentagem do teor de ácido propiónieo observada no fluido rumen de control. Estudos de alimentação in vivo a longo prazo mostraram uma correlação de confiança entre o aumento de ácido propiónico no fluido rumen e o melhoramento do comportamento do animal, quer seja ruminante (e.g. vacas, ovelhas) ou monogástricos (e.g. suinos).

Em detalhe, o fluido rumen é recolhido a partir de uma vaca fistulada a qual ê alimentada com uma ração de engorda comercial mais feno. Ofluido rumen é imediatamente filtrado através de gaze dos queijos, e juntamos 10 ml a um frasco cónico de 50 ml contendo 400 mg de substrato padrão (68% de amido de milho +17% de celulose +15% de farinha de soja extraída), 10 ml de um tampão com pH 6,8 e o composto de teste. Os frascos são gasifieados com oxigénio sem azoto durante cerca de dois minutos e incubados num banho de água de água agitado a 39^QC. durante cerca de 16 horas. Todos os testes, são efectuados em triplicado. Após incubação, 5 ml da amostra são misturados com 1 ml de ácido metafosfórico a 25%. Após 10 minutos juntamos 0,25 ml de ácido fórmico e a mistura ê eentrifugada a 1500 rpm durante 10 minutos. As amostras são a seguir analizadas por cromatografia gás-líquido pe-19-

lo método de D.W. Kellogg, <J. Dairy Science, 52, 1 690, 1969. As alturas dos picos para os ácidos acético, propiónico e butirico são determinados para as amostras a partir de frascos de incubação não tratados e tratados.

Quando testados in vitro, o composto de fórmula (I) com um gramas por mililitro origina uma subida de produção de ácido propiónico em relação ao ção de control sem composto adicionado (I) por este nível de cerca de produzido processo micro 97% na na solu

Para uso na promoção do crescimento e/ou aumento da eficiência da utilização da ração em vacas ou suinos o composto de fórmula (I) ou um sal ê preferívelmen te administrado como um aditivo da ração. As rações são prepa radas de acordo com métodos completamente análogos aos acima detalhados para a preparação de ração das galinhas, com a mes ma preocupação para a produção de rações nas quais o agente terapêutico é uniformemente disperso. 0 nível usado do compos to (I) na ração das vacas ou porcos cairá geralmente na gama de 0,25 a 50 ppm. Nos ruminantes o composto de fórmula (I) pode também ser oralmente administrados na forma de uma pílula grande o qual é retido no saco rumenoretieular, libertando o agente terapêutico a um ritmo substanciaimente constante durante um periodo de tempo prolongado, e.g., 4-8 semanas, fornecendo uma dose equivalente à da dose diária anterior na ração, i.e.:

^rdose diária média' em miligramas

consumo médio da ração diária em kg

Exemplos de tais pilulas grandes de libertação controlada são as de Cardinal, Patente U.S.

4601893.

presente invento é ilustrado pelos exemplos seguintes. No entanto, deverá compreender-se que o invento não é limitado aos detalhes específicos destes exemplos .

- s

21EXEMPLO 1

Fermentação de Actinomadura sp. ATCC 53676

A Actinomadura sp. crescem inicialmente por inoculação do meio sólido em Slants ou garrafas Roux com a cultura ATCC 53676, usando o meio ATCC Ns 172, preparado e tendo a composição que se segue:

Gramas/litro

Glicose

Amido solúvel

Extracto de Fermento

Hidrolisato de Caseina Enzimática

Carbonato de cálcio

Agua destilada até 1000 ml; pH até 7,0 com KOH; juntar Agar

Entretanto, os fraseos agitados foram preparados usando um ou outro dos meios seguintes:

Cerelose

Farinha de soja

Milho Ferm Prod

Amido de Milho

Cloreto de Sódio

Cloreto de cobalto

Carbonato de Cálcio

Gramas/litro

JDYTT

Gramas/litro

Cerelose 10

Amido de milho 5

Licor de Infusão de Milho 5

Hidrolisato de Caseina 5

Enziraatica

0,002

Cloreto de Cobalto

Carbonato de Cálcio

0,002

Cem ml do meio foram distribuidos em frascos de 300 ml agitados e esterilizados a 1202c e 15 p.s.i. durante 30 minutos. Após arrefecimento, o meio foi inoculado com uma suspensão celular vegetativa raspada da cultura Slant Actinomadura sp anterior. Qs frascos foram agitados a 282C. num agitador tendo um -deslocamento de 1,5 a 2,5 polegadas e 150 a 200 ciclos por minutos (CPM) durante cinco a sete dias.

Entretanto, preparamos frascos de fermentação de 5 litros contendo 3 litros de ura dos seguintes meios:

C'	Gramas/litro	JDY TT . _; .	Gramas/litro:
Cerelose	10	Cerelose	10
Amido de Milho	10	Amido de milho	5
Farinha de Soja	10	Licor de Infusão de Milho	5
Sólidos de Milho Ferm	5	Cloreto de cobalto	0,002
Cloreto de sódio	5	Hidrosilato de Caseina Enzimática	5
Cloreto de cobalto	0,002	Carbonato de cálcio	3
Carbonato de cálcio	1

UK1-2

Gramas/litro

Cerelose

Farinha de soja

Licor de Infusão de milho

Cloreto de cobalto

Sulfato de magnésio

Carbonato de cálcio

Sulfato de manganésio

Sulfato férrico

0,002

0,10

Juntamos o agente anti-espumifero (polipropilenoglicol, P2000, contendo 10% em peso de oxido de etileno, 1 ml), e os vasos foram selados e esterilizados a 1202C e 15 p.s.i. durante 45 minutos. Os vasos foram a seguir inoculados com um frasco de agitação (ca. 3% de inoculo), fermentados durante 120 a 168 horas a 302C, agitando a 1700 revoluções por·, minuto (RPM) com um caudal de ar de um volume de ar por volume de liquido por minuto.

Quando a fermentação ficou completa (com base no ensaio do disco antibiótico em função de B. subtilis ATCC 6633) os fermentadores pararam e filtramos ao pH natural com a ajuda de uma terra de diatomáceas. 0 sólido filtrado foi empapado em metanol, concentrado in vaouo,diluido com 2-3 volumes de água e a seguir extraído 2 x com 1/3 a 1/2 volume de ou metilisobutil cetona ou n-butanol.

A camada de solvente foi separada da fase aquosa por aspiração ou centrifugação, borbulhada e concentrada in vacuo para obtermos o antibiótico da fórmula (I) na forma em bruto como um óleo viscoso.

A bioactividade da cultura e cau dais de recuperação subsequente podem ser seguidos pelo uso de uma estirpe sensitiva de Bacillus subtilis ATCC 6633 ou Staphylococcus aureus ATCC 6538. Os compostos no banho e fluxos de recuperação podem ser visualizados pelo uso de lamelas GF de sílica gel Analtech empregando acetato de etil como eluente. As lamelas desenvolvidas são atomizadas com reagente vanilina (3 g de vanilina em 75 ml de etanol e 25 ml de ácido fosfórico a 85%) e aquecemos a 80õC. 0 produto antibiótico de fórmula (I) aparece como uma mancha vermelha. A lamela tlc desenvolvida pode também ser coberta com agar semeado com ou S. aureus ou B. subtilis ao qual juntamos cloreto de 2,3,5trifenil-2H-tetrazólio monohidratado e incubamos a 37²C - durante 16 horas para visualizar o antibiótico (manchas brancas contra um fundo cor de rosa).

aumento proporcional em grandes fermentadores foi efectuada por preparação de frascos agitados contendo 0,7 litros de meio C' ou JDYTT. 0 inoculo de frasco agitado foi fermentado durante 5 a 7 dias a 282c, e

usado para inocular um vaso de fermentação de.200 litros contendo 100 litros do meio UK1-2. Usamos aproximadamente um litro de inóculo no tanque. A fermentação, após prosseguir du rante 7 a 10 dias, foi colhida. 0 banho global foi extraído com 1/3 do volume de metilisobutim cetona a pH natural, separado num separador DeLaval e o solvente concentrado in vacuo, inicialmente num forno ciclone e finalmente num evaporador rotativo para obtermos o antibiótico em bruto de fórmula (I) como um óleo, o qual foi todo usado no Exemplo 2 a seguir.

EXEMPLO 2

Isolamento do composto Antibiótico de Fórmula (I)

Todo o produto em bruto da fermentação em larga escala do Exemplo anterior foi cromatografado numa coluna de 500 g de silica gel empapada em hexano, e a coluna foi eluida com acetato de etil. Os eluatos foram examinados por cromatografia de camada fina sobre lamelas de si_ lica gel desenvolvidas eom clorofórmio-isopropanol (95:5), e a seguir atomizadas com 3,3% de vanilina dissolvida em eta nol-ácido fosfórico (2:1). Após aquecimento a 802C o antibiótico desejado de fórmula (I) aparece como uma mancha vermelha a rf0,30. As fracções contendo o produto desejado foram concentradas in vacuo, diluídas em acetato de etil, tratadas com carvão activado e filtradas. 0 solvente filtrado foi agitado primeiro com ácido fosfórico, a seguir com tampão de fos_ fato de sódio dibásico para formar o sal de sódio. Após secagem sobre sulfato de sódio, o solvente foi concentrado e o antibiótico cristalizado após a adição de heptano para obtermos 950 mg de um sólido branco. Purificação adicional foi con

-26seguida por cromatografia de expansão usandó uma coluna de 100 g de siliea gel, 32-63 microns, e empregando um gradiente de 95:5 a 50:50 de clorofórmio: acetato de etil. 0 produto foi eluido com 70:30 clorofórmio: acetato de etil, e obt£ mos 852 mg de produto purificado após a remoção de solvente.

sob vácuo; m.p. 175-177²C; AalfaJ²^ =+12,82 (c=1, metanol).

D

Anal. Calcd. para Ο^Ηθ^0₁ ?Na.H₂0: C, 59,75 ; H, 8,67. Observada : C, 59,47; H, 8,54.

C—13 nmr (substituição quimica (ppm) em CDCl^ com ⁰ número de hidrogénios ligados entre parêntesis):

180j 8 (0)	, 106,7(0)	, 99,6(0)	, 98,4(0)	, 96,6(1)	, 94,7(1) 80,3(1),
88,8 (1) ,	84,7(1) ,	83,4(1),	83,3(0) ,	80,3(0), 74,3(1),
80 _T 3 (1) ,	79,8(1) ,	79,3(1) ,	79,1(1),	74,0(1),
67,5(1) ,	61,7(3) ,	61,6(1),	60,2(3) ,	59,9(3) ,	58,9(3) ,
56,8(3) ,	46,3(1) ,	46,1(1),	45,5(1) ,	40,7(1), 29,2(2), 23,0(2), 11,5(3),	39,4(1) ,
36,9(1) ,	32,5(2) ,	31,9(2),	31,1(2),	28,4(3) ,
27,7(2) ,	26,6(3) ,	25,6(2) ,	24,2(2) ,	18,5(3) ,
13,1(3), 12,7(3) , anã 10,0(3).	12,5(3),	12,0(3) ,	11,5(3)

A forma ácido livre do composto an tibiótico (I) foi preparada por agitação vigorosa de uma solu ção de clorofórmio do sal de sódio com um volume igual de áci.

do clorídrico a pH 2 num funil de separação. As fases foram separadas e a camada de clorofórmio foi lavada com água e a seguir evaporada sob vácuo para obtermos o ácido livre; m.p.

95-102QC; /alfaj²^ ₌₊₂q ga (C=1, metanol);

D

Anal. Calcd. para Ο^^Ηθ^Ο^. HgO: C, 61 ,10; B,

Observada

C, 61,53; H,

Para reconverter no

9,00.

9,31 .

sal de sódio o ácido livre (a partir de 2,6 g do sal de sódio original) foi dissolvido em 500 ml de clorofórmio. Juntamos Na₂C0g (1g) em 500 ml de H^O e a mistura resultante foi vigorosamente agi. tada num funil separatório durante vários minutos. A camada de H₂0 foi separada e lavada com clorofórmio fresco. 0 conjun to das fases orgânicas foi seco e evaporado sob vácuo para obtermos 2,1 g do sal de sódio. As propriedades espectrais e os dados analíticos eram idênticos aos observados para o sal de sódio obtido directamente a partir da fermentação como aci. ma descrito.

Para preparar o sal rubidio do com posto antibiótico de fórmula (I), o áeido livre (100 mg) foi dissolvido em 100 ml de clorofórmio. Juntamos carbonato de ru bridio (150 mg em 100 ml de. água) ao clorofórmio e a mistura foi agitada vigorosamente num funil separatório durante aproximadamente 5 minutos. A fase orgânica foi separada e extraída uma vez com água, e a seguir evaporada para obtermos um sólido branco. 0 sal de rubidio foi recristalizado por eva poração lenta a partir de éter dietílico e a estrutura por raios X foi determinada nos cristais resultantes pelo Dr. J. Bordner.

Para preparar o sal de potássio do composto antibiótico de fórmula (I), 229 mg do ácido li vre foram dissolvidas em 100 ml de clorofórmio. Juntamos K? COg (75 mg) em 100 ml de H₂0 e a mistura resultante foi agitada durante 15 minutos e foi colocada num funil separatório e vigorosamente agitada durante vários minutos.

-28Observada 'tf tf;

A fase orgânica foi separada e eva porada sob vácuo para obtermos 224 mg do composto (I) como o sal de potássio:

m.p. 175-179^QC; falfa7²⁵=+13,8s (C = 1, metanol).

D

Anal. Cales, para C^gHg γ^Κ · Hg^{0: C}’ 58,78; H, 8,56.

C, 59,17; H, 8,89.

Claims

REIVINDICAÇÕES:

um composto de

1ã. - Processo para a preparação de fórmula estereoquímica absoluta em que MesCH^, ou um seu sal sal catiónico farmaceuticamente aceitável, caracterizado por compreender a fermentação de Actinomadura sp. ATCC 53676 sob condições aeróbicas submersas num meio nutriente aquoso compreendendo uma fonte assimilável de carbono e azoto atê se formar uma quantidade recuperável do referido composto.
2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser separado do meio de fermentação.
3^a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o composto ser separado na forma do seu sal de sódio'ou potássio.

t · ( *
4â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto na forma precipitada ser recolhido como uma mistura compreendendo micêlio, por filtração do meio de fermentação.
5^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por o referido composto ser recolhido na forma bruta por secagem por atomização ou congelação do meio de fermentação total.