PT86151B

PT86151B - Processo para a preparacao de composicoes de adenilciclase purificadas

Info

Publication number: PT86151B
Application number: PT86151A
Authority: PT
Inventors: Nicole Guiso-Maclouf; Daniel Ladant; Jean-Michel Alonso; Colette Brezin; Isabelle Crenon; Lisa Djavadi
Original assignee: Pasteur Institut; Inst Nat Sante Rech Med
Priority date: 1986-11-17
Filing date: 1987-11-17
Publication date: 1990-08-31
Also published as: JPS63267274A; DK601687D0; PT86151A; EP0272174A3; FR2606789B1; DK601687A; FR2606789A1; EP0272174A2

Description

Processo para a preparação de composições de adenilciclase purificadas

A presente invenção diz respeito a composições de AC purificadas, a um processo para a sua preparação e às suas aplicações biológicas.

Sabe-se que uma adenilciclase segregada e activada pela calmodulina, ou em abreviatura AC, é expressa por bactérias do género Bordetella ou Bacillus anthracis, responsáveis por infecções agudas nos vertebrados.

Diversos trabalhos apoiaram-se no estudo dos efeitos biológicos deste enzima sobre as células dos vertebrados.

Contudo, o estudo das suas características estruturais e das suas propriedades encontra-se limitado pelo carácter heterogéneo das preparações de AC descritas até hoje.

A utilização pelos inventores de um processo para a purificação de AC permitiu a obtenção de preparações de AC ten do uma actividade específica pelo menos duas vezes superior à das preparações conhecidas e evidenciar características própri as da AC. A obtenção de preparações de elevada pureza permitiu igualmente desenvolver aplicações biológicas de grande interesse para o diagnóstico, o tratamento e/ou a prevenção de doenças pro vocadas pelas bactérias referidas antes.

A presente invenção tem pois por objectivo fornecer novas preparações de AC de elevada pureza.

-2/ /

ί *

Visa igualmente fornecei? um processo cômodo para a obtenção destas preparações.

A presente invenção visa, alem disso, as aplicações biolõgicas destas preparações purificadas. Em particular, a presente invenção tem por objectivo fornecer anticorpos poli clonais formados contra estas preparações e, de acordo com um aspecto especialmente interessante, preparações de anticorpos monoclonais reconhecendo especificamente um epitope de AC e exercendo um papel protector em relação a infecções provocadas por Bordetella.

A presente invenção visa além disso os reagentes bio lõgicos elaborados a partir de anticorpos policlonais e, mais especificamente, monoclonais. As aplicações biolõgicas compreendem igualmente a elaboração de vacinas contra as doenças infecciosas provocadas por estas bactérias utilizando o epitope reconhecido especificamente pelas preparações de an ticorpo monoclonal.

As preparações enzimãticas de AC de acordo com a pre sente invenção caracterizam-se pelo facto de possuirem uma elevada pureza e de serem quase totalmente desprovidas de produtos contaminantes bacterianos, particularmente de toxi nas pertussis, de lipopolissacãridos (ou LPS) e de hemagluti nina filamentosa (ou FHA).

Estas preparações caracterizam-se igualmente pelo facto de a AC se apresentar sob uma forma homogénea sedimen tada sobre um gradiente de densidade em sacarose com um coe ficiente S igual a 3,6.

Nestas preparações homogéneas, a AC pode existir sob

duas formas moleculares de aproximadamente 45 e 43 KDa respec tivamente, estruturalmente aparentadas.

De acordo com um outro aspecto, estas preparações ca racterizam-se pelo facto de possuírem uma actividade que po . -1 -1 de atingir e mesmo ultrapassar 1600 yimoles de CAMP mm mg De notar que uma unidade de AC corresponde a umajumole de ade nosina 3’:5’ - monofosfato ou, em abreviatura CAMP, formada durante 1 minuto a 30°C a pH 8.

Nas preparações definidas antes, a AC está livre ou sob a forma de um complexo em associação com proteínas euca riotas, mais especificamente com a calmodulina.

A constante de associação da AC com a calmodulina nes. tes complexos, é de 10 nM aproximadamente.

As preparações de AC de acordo com a presente inven ção caracterizam-se igualmente pelo facto de a actividade ca talítica ser transportada por um fragmento de 25 KDa, coor denada de combinação com a calmodulina e protegido por esta contra as digestões trípsicas.

As preparações de AC de elevada pureza de acordo com a presente invenção são preparações elaboradas a partir de culturas de bactérias que exprimem a AC. Trata-se mais espe cificamente de bactérias patogénicas em que a AC é capaz de interferir com a AC das células eucariotas. Cita-se mais par ticularmente as do género Bordetella ou Bacillus anthraois¹¹.

As preparações de AC de Bordetella narticularmente pre feridas com respeito a aplicações terapêuticas consideradas incluem a AC resultante de Bordetella responsáveis por pa tologias respiratórias dos vertebrados tais como, no homem, _14_

Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis e no ani mal Bordetella bronchiseptica e Bordetella avium.

A presente invenção visa igualmente um processo para a obtenção de preparações de adenilciclase com elevada pure za.

Este processo caracteriza-se pelo facto de se mistu rar um sobrenadante previamente concentrado de culturas de bactérias que exprimem a adenilciclase, ou de um extracto des_ tas bactérias, com a calmodulina.

De acordo com um modo de realização que permite obter o enzima puro sob forma livre, utiliza-se a calmodulina fixa da a um suporte. 0 enzima presente no sobrenadante concentra do ou no extracto bacteriano, fixado à calmodulina quando da etapa de contacto, é recuperado em seguida com a ajuda de unq agente desnaturante, que é por sua vez eliminado para se ob ter a preparação enzimática livre.

suporte ao qual se fixa a calmodulina é constituí do por um material inerte em relação ã preparação que contém o enzima e é capaz de reter as moléculas de peso molecular elevado.

De acordo com uma variante, o suporte é constituído por um gel.

Utiliza-se com vantagem um produto sobre o qual jã se encontre fixada a calmodulina , tal como o produto comer ciai Affigel calmodulina .

Para se obter a fixação da AC conhecida no sobrenadante concentrado ou no extracto bacteriano, submete-se a mistura gel-calmodulina e :sobrenadante.ou extracto a uma agita ção a baixa temperatura.

-5/ /

De acordo com uma outra variante, o suporte sobre o qual está fixada a calmodulina é um material filtrante do tipo dos filtros Millipore^ , capaz de reter selectivamente pelo menos a maior parte do enzima.

De uma maneira geral, o material filtrante é de nitroce lulose ou de um material plástico e apresenta uma porosidade compreendida entre 0,45 e 0,22 jim.

Recupera-se a adenilciclase fixada sobre o complexo suporte-calmodulina com a ajuda de um agente desnaturante. De pre ferência, utiliza-se ureia em meio tampão. Obtém-se uma dissolu ção satisfatória de AC em ureia com ureia 4 a 8,8 M. Elimina-se em seguida a ureia da preparação enzimãtica, por exemplo median te diálise ou filtração.

Obtém-se deste modo preparações enzimãticas de elevada pureza, tendo uma actividade específica atingindo ou mesmo ultrapassando 1100yi/mg de proteínas.

De salientar que quando se utiliza um sobrenadante concentrado, se purifica a adenilciclase extracitoplasmãtica. Com um extracto bacteriano, o processo de acordo com a presente invenção conduz ã obtenção de preparações de AC periplãsmica.

Observa-se as mesmas características para a AC de origem extracelular ou periplasmica.

De acordo com um outro modo de realização que permite obter o enzima sob a forma de um complexo de grande estabilida de com a calmodulina, adiciona-se calmodulina a uma preparação enriquecida de pelo menos 90 % em adenilciclase, faz-se depois contactar a mistura, de preferência realizando uma cromatografia de afinidade, com um permutador de iões de fraca porosida/

-6( ’

Cr ) -* de, tal como DEAE-Sephacel^ . Aumentando a força iónica do tam pão de lavagem, elui-se o complexo.

Esta variante permite obter com rendimentos de cerca de % preparações de AC fixada ã calmodulina, de grande estabilidade, cuja actividade específica pode atingir e mesmo ultrapas sar 1600 ji/mg de proteína.

A preparação enriquecida em adenilciclase utilizada e obtida a partir de um sobrenadante de cultura concentrada, cujo pH se levou a 7,0 e filtra-se com a ajuda de um permutador de iões, com vantagem DEAE-Sephacel sobrenadante concentrado utilizado no processo de acordo com a presente invenção obtém-se com vantagem submetendo um sobrenadante de culturas bacterianas que exprimem a AC a uma ou varias operações de filtração com a ajuda de filtros de nitrocelulose ou de material plástico, de porosidade compreendida, com vantagem, ' ' r

as do tipo Millipore um agente detergente para libertar a AC e eliminando-se da preparação de AC os materiais insolúveis presentes.

agente detergente é um detergente não iõnico, de pre

extracto bacteriano utilizável para purificação da adenilciclase obtém-se, por exemplo, mediante tratamento das células bacterianas que exprimem a adenilciclase com ureia e recuperação do sobrenadante.

As bactérias que exprimem a adenilciclase utilizadas para as culturas são escolhidas entre as bactérias patogénicas cuja AC é capaz de interferir com a AC das células eucariotas. Trata-se mais particularmente de ¹¹ Bordetella ou Bacillus an thracis.

Entre as Bordetella , citar-se-á: Bordetella pertussis, Bordetella bronchiséptica, Bordetella parapertussis e Bordetella avium, estudo efectuado sobre um modelo de murganho das infecções produzidas pelas bactérias que sintetizam a adenil ciclase com rendimentos elevados, permitiu evidenciar o papel protector de anticorpos policlonais ou ainda de anticor pos monoclonais formados contra as preparações enzimaticas purificadas definidas antes.

A presente invenção diz igualmente respeito, na qua lidade de produtos novos, aos anticorpos policlonais dirigi dos contra estas preparações enzimaticas.

Estes anticorpos são obtidos, por exemplo, mediante imunização de animais tais como o coelho ou o murganho com o auxílio das preparações de AC em questão em que a AC se en contra livre ou sob a forma de complexo com proteínas eucario tas, particularmente a calmodulina, e recuperação de acordo com as técnicas clássicas dos imunosoros comportando os anti corpos, depois os próprios anticorpos.

A presente invenção diz igualmente respeito aos anti corpos monoclonais tais como os obtidos mediante fusão, com um mieloma de murganho, de linfócitos esplénicos de murganho imunizados com adenilciclase purificada.

Estas preparações de imunoglobulinas monoclonais ca racterizam-se pelo facto de reconhecerem especificamente um epitope de AC purificado que permite a indução da síntese de anticorpos protectores.

A presente invenção visa particularmente a prepara-8-

ção de anticorpos monoclonais (8-25) que imunoprecipita, nos extractos brutos, e as preparações do enzima purificado a par tir de células bacterianas, um tripleto de 50, 45 e 43 KDa assim como uma proteína de peso molecular elevado superior a

100 KDa.

A estirpe de hibridoma produtora de anticorpos monoclonais entra igualmente no quadro da presente invenção.

Uma tal estirpe foi depositada na Collection Nationa le de Cultures de Microorganismes sob o n9 1-610 em 9 de Ou tubro de 1986.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção, exer cem com vantagem um efeito imunoprotector relativamente â AC. Estas propriedades são utilizadas com benefício para proteger o homem ou o animal dos efeitos patogénicos das bactérias re feridas antes. Nesta aplicação, recorre-se a uma administra ção local, no caso de infecções respiratórias por via intra nasal ou intratraqueal, ou por via parenteral. Utiliza-se ex cipientes clássicos tais como o fosfato de cálcio ou o hidrõ xido de alumínio. Os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção premitem efectuar uma so roberapia.e uma:' soroprofilaxia específicas.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção são igualmente utilizáveis para a purificação da AC, incluindo outras espécies no caso de reactividade cruzada, e para o diagnóstico precoce da doença. São com efeito particulamente apropriados para o rastreio de doentes e de portadores latentes.

Permitem igualmente o isolamento de bactérias e de mutantes o que lhes confere um interesse suplementar.

-9/ ( Estas aplicações na qualidade de reagentes de diagnõs_ tico utilizando radioimunoensaios, o teste ELISA, ou determi12 5nações com produtos marcados com I sao produtos novos que entram no campo da presente invenção.

De acordo com um outro aspecto de grande interesse, a presente invenção fornece igualmente,graças aos anticorpos monoclonais definidos antes, um epitope activo de AC reconhe eido especificamente. Os ensaios de toxilogia realizados so bre a AC purificada demonstraram a ausência de toxicidade des_ te enzima administrado por via intranasal no murganho, utilizando-se esta AC purificada com vantagem para a elaboração de princípios vacinantes, com a reserva de que ela nos dã reac ções cruzadas com a AC dos eucariotas tratados.

As vacinas de acordo com a presente invenção caracte rizam-se pois pelo facto de se tratar de vacinas moleculares comportando um epitope activo de AC em associação com um veí culo farmacêutico, capaz de induzir uma infecção e efeitos toxicos no homem ou no animal. Recorre-se com vantagem a do ses e formas de administração habituais.

Outras características e vantagens da presente inven ção aparecerão nos exemplos seguintes, relativos ã obtenção de preparações purificadas de AC e ãs suas aplicações biologi cas, com referência às figuras, que representam, respectiva mente:

- as figuras IA a 1C, a variação da radioactividade e da actividade AC, para diferentes diluições de sobre nadantes de cultura concentrados, sendo estes sobrena / -10

-/125 dantes icubados com a I calmodulina, centrifugados depois segundo um gradiente de sacarose;

- as figuras 2a e 2b, as fotografias de preparações pu rificadas de acordo com a presente invenção submetidas a uma analise SDS-PAGE;

- A figura 3, um mapa peptídico mediante proteólise li mitada de ’''²^I-AC;

- as figuras 4a e 4b a variação da actividade em percen tagem em função do tempo;

- as figuras 5a e 5b, a analise em gradiente de sacaro se de produtos de digestão pela tripsina de um comple xo °IAC-calmodulma;

- a figura 6, um radioimunoensaio de AC;

I

- a figura 7, as cinéticas da infecção pulmonar induzi da pelos inoculados;

- a figura 8, uma fotografia de um alveolito hemorrãgi co no murganho produzido por clones de B. pertussis”;

- as figuras 9a e 9b, duas fotografias correspondendo respectivamente a uma analise segundo SDS-PAGE de so

-111

brenadante concentrado, de duas preparações de AC pu rifiçadas e de um extracto bacteriano, e a um imuno blot com o anticorpo monoclonal 8-25.

Nos exemplos seguintes, a iodação dos produtos reali za-se como segue.

Realiza-se à temperatura ambiente utilizando o meto do com a cloramina-T (Greenwood e colab., Biochem. J.” 89, 114-123, 1963).

A calmodulina iodada tem uma radioactividade especí fica de 20 Ci/mmol; é estável durante dois meses quando se armazena a -20°C.

Antes da iodação, submete-se o complexo AC-calmoduli na obtido após purificação sobre DEAE-Sephacel a uma cromato grafia sobre hidroxilapatite para eliminar o agnete detergen te. A preparação ^^^I-AC e estável durante dois meses a -20°C.

As analises dos produtos dos exemplos efectuam-se como segue.

Mede-se a actividade da AC de acordo com o método de

White A.A. em Methods Enzymol., 38C, 41-46, 1974 modifica do por Hanoune e colab. (J. Biol. Chem., 252, 2 039-2 046, 1977).

A reacção efectua-se no seio de um meio contendo 50 mM Tris-HCl, pH8, 6 mM de MgCl₂, 100 yig de albumina de soro bovino, 0 ₅ 12 mM de CaCl₂ e 0,1 de calmodulina logo que e_s ta foi adicionada.

Uma unidade de AC corresponde, como se indicou antes,

a 1 jamole de CAMP formado no decurso de um minuto a 3 0°C a pH 8. As proteínas medem-se quer segundo Bradford (Anal. Bio chem., 248-254) ou segundo Shultz e colab. (Anal. Biochem. 91, 354-356, 1978).

Efectua-se o método SDS-PAGE segundo Lemli (Nature, Londres, 227, 680-685, 1976). Os geles coram-se com prata co mo descrito por Morrissey (Anal. Biochem., 117, 307-310, 1981) ou autoradiografam-se apos exposição ãs películas X-omat AT a -70°C.

EXEMPLO 1:

Cultura de Bordetella pertussis e obtenção de um sobrenadante com elevada concentração em adenilciclase.

Efectua-se uma pré-cultura de Bordetella pertussis , 18323,fase I (estirpe ATCC 9797 ) e de uma variante avirulenta, fase IV, espontaneamente, estável desta estirpe, durante 48 horas a 36°C, sobre um meio de agar modificado Stainer-Schol te suplementado com ciclodextrina (segundo Imaizuni e colab. em J. Chim. Microbiol., 17, 781-786, 1983). Transfere-se em seguida a pré-cultura para um meio líquido modificado de Stainer-Scholte sem ciclodextrina.

Submete-se as culturas líquidas a agitação a 150 rpm durante 24 horas a 36°C, em um Erlenmeyer de 1 litro conten do 250 ml de meio. Prossegue-se a cultura até ã obtenção de uma densidade optica = 1,2 + 0,2. As bactérias são en tão eliminadas mediante centrifugação a 5 000 xg durante 25 min.

Os sobrenadantes de cultura conservam-se a -30°C até

-13ã utilização ou concentram-se directamente.

Terminada a concentração, filtra-se, sobre filtros de tipo MilliporeN^HAWP de 0,45 yim, 3 litros de sobrenadante de cultura contendo cerca de lOjig de proteínas e 0,1 uni dade de enzima por ml. Retém-se assim mais de 90% da activi dade enzimãtica sobre os filtros. Pode recuperar-se cerca de 80% desta actividade mediante incubação dos filtros em 40 ml de um tampão A constituído por Tris. HC1, 50 mM, pH 8 con tendo 6 mM de cloreto de magnésio e 0,1 % de Triton X. 10 Elimina-se o material insolúvel mediante centrifugação duran te 30 minutos a 15000 xg a 4°C. A actividade específica do sobrenadante de cultura concentrado é de 115 unidades por mi ligrama de proteína.

EXEMPLO 2

Processo para a preparação de adenilciclase extraci toplasmatica purificada sob forma livre.

Adiciona-se 40 ml de sobrenadante de cultura concen trado a 0,8 e 1 ml de Affigel-calmodulinae agita-se lenta mente a mistura a 4°C durante 18 horas. Mais de 2/3 da acti vidade enzimãtica são retidas sobre o gel.

Faz-se sedimentar o Affigel-calmodulina mediante cen trifugação a 300 xg durante 1 minuto, lava-se varias vezes com NaCl 0,5 M em tampão A. Recupera-se a adenilciclase a par tir do gel com 2,5 ml de ureia 8,8 M no tampão A. Elimina-se a ureia mediante filtração sobre uma coluna de Sephadex G-25^ç equilibrada com o tampão A.

Esta preparação enzimãtica possui uma actividade es.

pecífica de 1100 unidades/mg de proteína. Pode-se conservar esta preparação a -80°C sem perda de actividade ao longo de varias semanas.

EXEMPLO 3

Processo para a obtenção de adenilciclase purificada a partir de extractos bacterianos.

Submete-se uma cultura de bactérias que exprimem a AC activâvel pela calmodulina a um tratamento com ureia 8M durante cerca de 2 horas ã temperatura ambiente. Recupera-se o sobrenadante que constitui o extracto bacteriano e coloca-se em contacto com o gel Affigel-calmodulina nas condições refeeidas antes.

Obtém-se uma preparação enzimãtica de elevada pureza que apresenta sensivelmente a mesma actividade específica.

EXEMPLO 4

Processo para a obtenção de AC purificada sob a for ma de um complexo com a calmodulina.

Utiliza-se um sobrenadante de cultura concentrado.

Ajusta-se este sobrenadante a pH 7,0 com imidazol 1,5 M (pH 6,5) e faz-se passar 40 ml deste material sobre uma coluna de 5 ml de DEAE-Séphacel, equilibrada com tampão A com um cau

-15- / '7<

dal de 10 ml/h. Adiciona-se a calmodulina ao fluente (0,2 ^um concentração final). Faz-se passar a mistura sobre uma coluna de 5 ml de DEAE-Sephacel. Fixa-se assim 95 °/° da actividade de AO sobre a coluna. Após lavagem com NaCl 0,1 M no tampão A, elui-se o complexo AC-calmodulina com NaCl 0,5 M em tampão A, com um débito de 5 ml/h.

A actividade específica de AC é de 1600 yi/mg de proteínas.

Este enzima pode conservar-se a -80°C sem perda da sua actividade no decurso de várias semanas.

EXEMPLO 5

Estudo das preparações enzimáticas de AC purificadas.

- Estudo das propriedades de ligação com a calmodulina:

Faz-se incubar diferentes quantidades de enzima com uma quantidade constante de (1^5) calmodulina, separa-se de. pois a mistura mediante centrifugação segundo um gradiente de densidade de sacarose.

Realiza-se esta operação como se segue:

Faz-se incubar 0,5 ml do tampão A contendo 20 nM de (^q) calmodulina de cérebro de boi (20 Ci/mmol) e 5 dilui ções de sobrenadante de cultura concentrado (A: 5 ju/ml B: 1 yi/ml, c: 0,2 )u/ml). A incubação realiza-se a 4°C durante uma hora. Efectua-se em seguida uma centrifugação com gradiente em sacarose compreendido entre 5 e 20 % durante 16 horas a

35θθθ rpm em um rotor SW41

se analisa a radioactividade e a actividade AC (medida na presença ]_Q—z de calmodulina e expressa em 'ju/ml). Para cada operação utiliza.

-se como referência, a: a piruvato-quinase ^^S20,W“ ^10S)’ b:

a lactato-desidrogenase (S^q y= 7S); c: a criatinina-quinase (S^q W⁼

Os resultados obtidos estão reunidos nas figuras IA a 1C em que se indica por um lado a radioactividade (curva A - À) e por outro lado a actividade AO ( curva Δ - —Δ) para as fracções recolhidas.

As curvas A, B, 0 correspondem às adições dos sobrenadantes indica, dos antes.

exame destas figuras demonstra que quando se utiliza a AC em excesso em relação à calmodulina radiomarcada (figura IA) 80 % da radioactividade são deslocados de um coeficiente de sedimentação de 2S correspondendo ao da calmodulina a 3,9S. 0 enzima medido pela sua actividade, sedimenta sob a forma de um pico não simétrico tendo um valor S de 3,6 que corresponde ao da AC livre e de um pia. nalto a 3,9 S. Este planalto corresponde ao complexo AC-calmodulina.

Quando a relação da AC com a calmodulina é de 1:1 (figura 1B) ou 1:5 (figura 1C) recupera-se respectivamente 70 % da radioaç. tividade no pico 3,9S. A proporção de (^^1) calmodulina livre com a ligada nas três condições, permite calcular uma constante de associação com a AC de 10 nM. Este valor é muito próximo do calculado de 5 nM a partir da curva de activação da actividade da AC para a calmodulina.

- Estudo pelo método SDS-PAGE (electroforese sobre gel de do. decilsulfato de sódio-poliacrilamida).

Estuda-se segundo o método SDS-PAGE (10% de acrilamida) com coloração do gel com prata, a AC purificada com a)

-17/ -, *

Affigel-calmodulina, ou b) DEAE-Sephaeèl.

Os resultados obtidos estão reunidos nas figuras 2a e 2b. Na figura 2a, a pista 1 corresponde ao sobrenadante de cultura concentrado, a pista 2 corresponde ãs proteínas não ligadas ã Affigel-calmodulina e a pista 3 ãs proteínas eluí^ das a partir de Affigel-calmodulina.

Na figura 2b, a pista 1 corresponde ao sobrenadante de cultura concentrado, a pista 2 ãs proteínas não ligauas ã primeira coluna de DEAE-Sephacel, a pista 3 ãs proteínas não ligadas ã segunda coluna de DEAE-Sephacel, a pista 4 ãs proteínas eluídas durante a lavagem do DEAE-Sephacel, a pis ta 5 as proteínas eluídas a partir da 2v coluna de DEAE-Se- ~ 125 phacel e a pista 6 a preparaçao de ( I) AC purificada sobre DEAE-Sephacel. Como se verifica mediante exame da figura 2a, pista 3, a preparação do enzima purificado contém quatro proteínas de 50 KDa, 45 KDa, 43 KDa e 40 KDa. As bandas suplementares observadas são devidas a artefactos de coloração da prata.

exame da figura 2b, mosta que uma preparação puri ficada com DEAE-Sephacel contém 2 polipeptidos de peso mole cular respectivo de 45000 e 43000 e calmodulina em excesso. Apos tratamento com iodo, os dois polipeptidos e a calmodu lina são marcados (figura 2b, pista 6).

- Estabelecimento de um mapa dos peptidos mediante pro teolise limitada da ^1) AC.

Os 2 polipetídos marcados de 45 KDa e 43 KDa são obti dos a partir de um gel SDS (5,5 % de acrilamida) sobre o qual

5 se aplica um complexo ( I) de AC-calmodulina. Efectua-se uma autoradiografia do gel para visualizar as posições dos 2 polipeptidos e os cortes de gel são aplicados sobre um se gundo gel SDS (15 % de acrilamida) na presença de uma protea se de Staphylococcus aureus (protease Vg) como descrito por Cleveland e colab., J. Biol. Chem., 262 , 1 102-1 106, 1977).

Reporta-se para a figura 3 os resultados obtidos:

A, C e E correspondem aos perfis de digestão de pêptidos de 45 KDa e B, D e F aos perfis de digestão da proteí na de 43 KDa com respectivamente 0,07 5 ^jig, 0,7 5 yig e 7,5 jug de protease.

Como mostra esta figura, os dois polipeptidos apresentam perfis de digestão proteolítica semelhantes, o que in dica que eles são estruturalmente aparentados.

- Estudo da sensibilidade ã digestão pela tripsina da

AC livre e da AC ligada ã calmodulina.

Estuda-se as eventuais diferenças de conformação en tre a AC livre e a AC ligada á calmodulina investigando a sua sensibilidade ã digestão pela tripsina.

Os resultados obtidos são reportados nas figuras 4a e 4b.

As experiências cujos resultados são reportados na figura 4a realizam-se como segue:

Incuba-se a 50°C com 50 jul de tripsina TPCK (um micrograma por ml no tampão A) 50 jul de AC purificada sobre Af-19/

X z

/ * figel-calmodulina (0-0) ou de um complexo AC-calmodulina pu rifiçada sobre DEAE-Sephacel (·-·) (1,5 yi/ml 1 yig/ml no tam pão A). A tempos determinados, dilui-se partes alíquotas de

10^11 em 2 0jum de inibidor de tripsina de soja (0,2 mg/ml err.

tampão A) e mede-se a actividade na presença de calmodulina.

As experiências cujos resultados são reportados na figura 4b realizam-se como segue:

5

Trata-se um complexo ( I) AC-calmodulina (1,5 yu/ml) nas condições descritas antes. Partes alíquotas são determi nadas para a sua actividade AC ou examinadas de acordo com o método SDS-PAGE (10 % de acrilamida).

Os resultados obtidos demonstram que a incubação da AC livre com a tripsina a 0°C (1:1, p:p) leva a uma inactiva ção completa do enzima nos 2 minutos (ver figura 4b). Nas mes. mas condições, o complexo de AC-calmodulina aparece muito mais resistente ã inactivação proteolítica. Após 30 minutos de in cubação mantém-se 70 % da actividade enzimãtica.

SDS-PAGE dos produtos do complexo AC-calmodulina

5 ~ marcada com ( I) demonstra uma conversão rapida do polipejj tido de 45 KDa em polipeptiio de 43 KDa, que se cliva progres_ sivamente em péptido de 25 KDa. Esta ultima forma aparece mui to mais resistente ã proteolise ulterior.

5

A calmodulina marcada com ( I) em excesso em rela η 2 r ção ao complexo ( °I) enzima-calmodulina é rapidamente degradada pela tripsina como mostra a figura 4a.

Para estudar a função catalítica do péptido de 25 KDa, analisa-se sobre um gradiente de sacarose os produtos de di12 5.

gestão pela tripsina do complexo ( I) AC-calmodulina. Os

resultados obtidos reportam-se nas figuras 5A e 5B operando-se como segue:

Apos 16 horas de centrifugação a 5200 rpm em um rotor SW60®a 4°C, sobre gradientes de sacarose compreendidos entre 5 e 20 %, recolhe-se fracções de 120^1.1 em que se mede a actividade AC (na presença de calmodulina) e a radioactividades. Nas partes inseridas sobre as curvas, indica

-se a autoradiografia de acordo com uma analise SDS-PAGE (10 % de acrilamida) das fracções indicadas.

A figura 5A corresponde ao complexo não tratado de ¹²⁵I AC-calmodulina (12 x 10 ³; 6,8 χ 10⁵ cpm) e a figura

125

5B corresponde ao complexo ( I) AC-calmodulma digerido pela tripsina durante 30 minutos a 0°C ( a actividade inicial na ausência de tripsina ê de 22 x 10 yi; 1,15 x 10 cpm).

Apos 30 minutos de digestão: 11 x 10 iu; 1,15 x 10 cpm. Os

cos distintos correspondentes ao complexo enzimaticamente ac tivo e ã calmodulina livre (figura 5a).

Apos 30 minutos de incubação na presença de tripsina, recupera-se 55 % da actividade original. A analise do enzima digerido pela tripsina mostra que ela tem o mesmo valor S aparente que o enzima não tratado (figura 5b). Contudo, a analise das fracções correspondente ao pico da actividade so bre o gel SDS revela somente um polipeptido de 25 KDa. Parece

-21assim que, embora a tripsina corte as ligações péptidicas da molécula de AC, os fragamentos possuem ainda unidade pelas interacções não covalentes segundo a mesma conformação acti va que no complexo não digerido de AC-calmodulina.

EXEMPLO 6

Estudo radio-imunolágico da AC purificada utiliza-se o complexo de AC-calmodulina para formar anticorpos anti-en zímas no murganho.

Utiliza-se murganhos fêmeas BALB/C com 4 semanas que se imunizam por via sub-cutânea com 3 passagens, com uma se mana de intervalo, com 10jul de preparação de AC purificada sobre Affigel-calmodulina. Efectua-se uma renovação 1 mês mais tarde utilizando uma preparação de AC purificada com DEAE-Se phacel. Recolhe-se os soros 3 dias apos a renovação.

Os anticorpos anti-AC detectam-se utilizando o radio -imunoensaio realizado como se indicou antes. Todas as reacções imunologicas são efectuadas no tampão A. A mistura reac cional contém 100 yil de (^^I) AC (2 x 10⁴ cpm e 4 x 10 ⁴ju de actividade enzimâtica), 100 ^il de imunosoro de murganho anti-AC diluído e 100 jdl de AC não marcada ou de sobrenadan te de cultura concentrado. Apos 18 horas de incubação a 4°C, adiciona-se 100 jul de anticorpo de coelho, anti-imunoglobulina de murganho e 100 yil de polietilenoglicol a 8 %, diluído em um soro de murganho pré-imune. Apos ter efectuado uma outra incubação no decurso de 30 minutos a 4°C centrifuga-se os tu

22+&·? ' » ' .₄ bos a 2 000 x g durante 3 0 minutos^ elimina-se os sobrenadantes e a radioactividade do precipitado ê medida em um conta dor gama.

Os resultados do rádio-imunoensaio são reportados na figura 6.

Nesta figura, Bo corresponde ã fixação inicial de 50 % 125 . . -.

de ( I) AC ligada ao antisoro na ausência de AC nao marca _125 da e B a percentagem de ( I) AC residual, ligada na presen ça de diferentes quantidades de AC não marcadas (# -) ou de sobrenadantes de cultura concentrado da estirpe 18323 ( » -« ou de um sobrenadante de cultura da variante fase IV a virulenta ( I - 1 ), as jartes inseridas correspondem aos re

125 sultados obtidos com uma preparaçao ( I) AC incubada com um soro pré-imune ou antisoro anti-AC de murganho 18 horas o 12 5 a 4°C precipitando-se depois os complexos de anticorpo ( °I)

AC como descrito antes. Solubiliza-se o precipitado em um tam pão e estuda-se de acordo com o método SDS-PAGE (10 % de acri

5 lamida): A pista 1 representa a preparaçao testemunha de ( I)

AC, a pista 2 a imunoprecipitação com o soro antes da imuni zação e a pista 3 a imunoprecipitação com o antisoro de mur ganho anti-AC.

Como mostra a figura 6, o antisoro de murganho preci

5 ~ pita especificamente o enzima marcado com ( I) e nao a cal

5 modulina marcada com ( I).

Desenvolvendo um rádio-imunoensaio para determinar a concentração de AC nos sobrenadantes brutos ou os extractos bacterianos de Bordetella pertussis”, obtém-se os seguin tes resultados:

Uma curva dose-resposta típica é dada na figura 6 e e obtida com uma diluição de soro anti-AC de 1: 2000. Utili zando este rádio-imunoensaio₇ é possível detectar uma quantidade tão pequena como 5 mg. A curva de inibição obtida com o sobrenadante concentrado ê paralela ã curva de referência determinada com o enzima purificado. Não ê possível detectar qualquer AC no sobrenadnate de cultura desprovido de actividade enzimãtica, obtido a partir do derivado fase IV avirulento da estirpe. Conclui-se que a variante fase IV produz níveis de AC que não se podem detectar e não produz proteínas activas.

EXEMPLO 7

Estudo da inibição da actividade de AC pelo antisoro anti-AC.

Incuba-se 300 ^j.1 de AC (60 x 10 ^^/ml) purificada sobre Affigel-calmodulina na ausência ou na presença de 250 ^ug de albumina de soro bovino ou de 5 0yil de soro. Após 18 horas a 0°C, as partes alíquotas são recolhidas e determina -se a actividade AC na presença de calmodulina. Os complexos antigénio-anticorpo são precipitados como se descreveu antes e determina-se a actividade enzimãtica no sobrenadan te. Os resultados obtidos estão reunidos no quadro 1 adiante.

QUADRO 1

Adições	Actividade Adenil- ciclase	(10 3yi/ml)
antes da precipitação	após precipitação
Albumina de soro bo-	62	62
vino	100	64,5
Soro prê-imuno	92	66
Soro anti-adenilci-
clase	9	0,7

Verifica-se que a incubação da AC com a soroalbumina ou soro pre-imune, conduz a um aumento de 30 a 40 % da ac tividade, enquanto a incubação do enzima com um anti-soro específico conduz a uma inibição de 90 % da actividade. Alem disso, os anticorpos anti-AC precipitam 99 % do enzima activo sucedendo que menos de 1 % da actividade inicial se en contra no sobrenadante.

EXEMPLO 8

Estudo dos efeitos protectores de anticorpos anti-AC.

Cultiva-se a estirpe Bordetella pertussis 18323 sobre agar a Bordet Gengou, suplementado com 15 % (V/V) de san gue de cavalo desfibrinado (BGB) a 36°C durante 72 horas.

! *

Efectua-se uma sub-cultura de uma colónia hemolítica (hly +) em uma infusão Stainer-Scholte durante 20 a 24 horas até ã obtenção de Αθ^θ de 1,0 que corresponde a unidades que formam colónias (CFU) de 2(+ 1) x 10θ ml-1. Injecta-se 50 yul desta cultura nos orifícios externos das narinas de murganhos fêmeas Swiss com 3 semanas. A partir de uma cultura de Bordetella pertussis sobre BGB a partir de homogeneizados de pulmões de murganhos infectados 48 horas, selecciona-se as colónias em relação ã estabilidade do fenotipo hly⁺, efectuan do vãrios ensaios, parece que a frequência da obtenção das variantes hly é de aproximadamente 10 . Isola-se dois cio • -* . + . · nes isogenicos: 1 clone hly designado adiante VIIIA7 e um segundo clone, hly , designado 7-1. 0 clone VIIIA7 e a estir pe análoga são positivas em relação aos efeitos do factor ge_ rador da leucocitose (LPF) e os efeitos de aglomeração sobre as células de ovários de hamsters chineses (CHO) do Ptx, os efeitos de hemaglutinação de FHA e a produção de AC extracelular. 0 clone 7-1 é negativo em relação ã expressão de Ptx e de AC mas retém a actividades FHA.

A estirpe análogae os seus dois derivados isogénicos cultivados sobre um meio de agar Stainer-Scholte suplementa do com ciclodextrima, são cultivados em seguida em sub-culturas de caldo de meio Stainer-Scholte para injecção aos mur ganhos.

Para calcular a virulência (em termos de quantidades de CFU capaz de se estabelecer e de se replicar nos pulmões), e a patogenicidade ( em termos de capacidade de induzir lesões

tissulares) da estirpe anãloga 18323 e dos seus derivados iso gênieos VIIIA7 e 7-1, utiliza-se um modelo murino quantitati vo descrito por Alonso J.M. e colab. em FEMS Microbiol. Letter, no prelo. Na figura 7, reporta-se as cinéticas da infec ção pulmonar induzida pelos 3 inoculados: a estirpe anãloga e o clone VIIIA7, exprimem um virulência equivalente enquan to o clone 7-1 ê eliminado dos pulmões nos 3 dias.

Ainda que a intensidade da infecção induzida pareça equivalente ã da estirpe análoga, o clone VIIIA7 ê letal pa ra o murganho fêmea produzindo uma alveolite hemorrágica com pleta (figura 8). Tendo em conta este resultado, procurou-se identificar o factor responsável pela letalidade e para dis tinguir o clone patogênico VIIIA7 da estirpe anãloga.

Titulando as actividades AC e Ptx nos sobrenadantes de cultura dos 3 inoculados, parece que o clone VIIIA7 segre ga aproximadamente 10 vezes mais AC activável pela calmodulina do que a estirpe anãloga.

clone 7-1 não segrega quantidades detectãveis des_ te enzima. A produção de Ptx, estimada a partir· dos efeitos LPF no murganho fêmea em que se efectuou uma injecção por via intravenosa e dos efeitos de aglomeração CHO, é igualmente cerca de 2 vezes superior em VIIIA7 do que na estirpe anãlo ga e não ê detectável no clone 7-1.

Parece que a alveolite hemorrágica letal aguda que se segue á infecção intranasal do murganho fêmea com a varian te VIIIA7, ê devida a uma libertação maior de AC e de Ptx,

agindo as duas como agentes de aumento do CAMP intracelular.

Nas experiências descritas adiante determinou-se os efeitos inibidores específicos dos anticorpos formados con tra antigênios de células inteiras, FHA, Ptx ou AC.

Como mostra o quadro 2, o ensaio respiratório letal com o clone VIIIA7 é fortemente reprodutível e induz a morte dos murganhos em 4 dias. Os sobrevientes ao 59 dias estão to talmente curados.

Pré-incubando o inoculo do ensaio com vários soros, verifica-se que somente os anticorpos anti-FHA e anti-AC são protectores em relação ã alveolite hemorrágica aguda observa da constantemente em testemunhas não imunizadas. Os anticor pos anti-Ptx não permitem proteger o murganho fêmea contra um ensaio experimental possuindo contudo todos os efeitos pro tectores contra os efeitos citopatogénicos sobre células em cultura.

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Considera-se que os efeitos protectores dos anti-FHA são devidos a uma inibição eficaz da aderência bacteriana para es. tes anticorpos, conduzindo a um rápido desaparecimento de B. pertussis da superfície do epitélio alvo.

A eficácia dos anticorpos policlonais anti-AC, ini bindo a actividade catalítica do enzima, sugere que a AC de Bordetella pertussis intervêm na patogênese da coqueluche como toxina principal responsável pelo síndroma citopatogênico local no tracto respiratório.

Os efeitos protecotres do anticorpo monoclonal 8-25 obtido a partir da estirpe de hibridoma I são evidenciados mediante análise SDS-PAGE do sobrenadante concentrado, de ex tracto bacteriano e de preparações de AC purificada e imuno blot com uma fracção com 18 % de sulfato de sódio da ascite 8-25 diluída a 1/100 (35 mg de proteínas totais/ml).

As fotografias da análise SDS-PAGE e de imunoblot são reportadas nas figuras 9a e 9b, respectivamente.

As pistas A,B,C e D na figura 9a correspondem, respectivamente, a um sobrenadante concentrado 115 vezes (acti vidade 9267 yi/ml), com AC pura (1590 ^μ/ml), a uma outra pre paração de AC pura (795 yi/ml) e com um extracto (8,8 M) (231 ji/ml). As pistas A’, B’, C’ e D’ da figura 9b correspondem aos produtos das preparações anteriores transferidas e imuno precipitadas uma preparação de IgGl de anticorpo monoclonal exame destes resultados mostra que estes anticor

-31pos monoclonais reconhecem especificamente o composto 43-45

KDa da AC de B. pertussis .

Estas experiências demonstram que a AC de B. pertussis ê um factor;patogênico maior e um antigênio protector contra a coqueluche.

EXEMPLO 9 i Poder imunoprotector da adenilciclase de ^TlBordetella pertussis”.

Reune-se adiante os resultados obtidos mediante estu do das condições de indução de uma imunidade especificamente protectora contra os efeitos citopatogênicos desta adenilci clase.

1. METODOLOGIA

1.1. Protocolos de imunização:

Injecta-se, por via subcutânea, a murganhos Swiss (ou tbred Secific Pathogen-Free”), femeas, com a idade de 3 se manas, preparações imunogênicas ou não.

Purifica-se a adenilciclase sobre Affi-Gel calmoduli na (Biorad) segundo o método descrito por D. Ladant e colab. J. Biol. Chem. 1986, 261:16264-16269. As relações de pure za e de especificidade antigênica praticam-se mediante análise electroforêtica e imunoquímica.

Diversos ensaios preliminares demonstram que a molécula, administrada so, não é imunogénica injectando-se a /

l * mistura adenilciclase + Affi-Gel calmodulina.

As suspensões bacterianas preparam-se mediante cultura em meio sintético definido de Stainer e Scholte e ajustamse às concentrações escolhidas por medida da densidade õptica a 650 nm e do numero de unidades formando colonia (CFU), sobre meio de Bordet-Gengou com sangue.

As suspensões bacterianas vacinais são inactivadas mediante aquecimento quer a 56°C (vacina classica) quer a 80°C (inactivação completa dos efeitos imunomoduladores da toxina-pertussis).

A neutralização do epitope adenilciclase realiza-se mediante incubação da suspensão bacteriana com o anticorpo monoclonal 8-25 durante 18 horas, a 4°C.

1.2. Ensaio

Instilação intranasal, a cada murganho, de um ino culo bacteriano preparado a partir de uma variante da estir pe de B. pertussis 18323, hemolítica e produtora de adenil ciclase (7 0-100 yi/ml, para uma suspensão titulando 2 a 5 x x 10 CFU/ml), quinze dias apos a ultima injecção.

Observa-se os murganhos durante vinte dias. As anãlises estatísticas efectuam-se apos estabelecimento da sobre vivência media de acordo com a conversão de Liddel (F.D.K. . Liddel. Microbiol. Rev. 1978, 42: 237-249) com 6=0,1 e T= = /0.

/

2. RESULTADOS E COMENTÁRIOS:

Os resultados da experiência, figurando no quadro 1, demonstram que B. pertussis, produtora de adenilciclase (BP AC +) induz uma imunidade protectora contra o ensaio infeccioso letal e que a pré-incubação desta suspensão bacteriana imunogénica com o anticorpo monoclonal reconhecendo específi camente a adenilciclase reduz o seu poder imunoprotector a valores tão baixos como os conferidos pela variante não pro dutora de adenilciclase (BP AC-).

Os resultados da experiência, reunidos no quadro 2, demonstram que a injecção de adenilciclase associada ao gel de agarose-calmodulina confere uma protecção tão elevada co mo a que as bactérias que exprimem este antigénio (BP 18323 e BP 8132) e significativamente eficaz por comparação com os resultados observados apos injecção do gel de agarose-calmo dulina so ou de uma suspensão de vacina comercial (DTCP).

QUADRO 1

Poder imunoprotector de ⁿB. pertussis 18323, produ tora de adenilciclase (BP AC⁺) e anulação deste poder imunopro tector mediante incubação da suspensão imunogênica com o anticorpo monoclonal anti-adenilciclase (anti-AC), estudado com parativamente com uma variante isogénica não produtora de ade nilciclase (BP AC-) e diversas outras Bordetella.

imunogénio	n9 de sobreviventes	sobrevivência media + - SN
BP AC+ BP AC+ +anti-AC BP AC- BPP63-2 BB530 BB552 BA Não	7/12 4/17 4/11 6/12 4/12 5/12 5/12 3/12	0,635+-0,11 0,37 +-0,09 0,46 +-0,11 0,32 +-0,10

BPP~'B. parapertusis

B B =’’ B. bronchiseptica

BA=¹¹B. avium¹¹ * suspensão aquecida durante 10 min. a 80°C (inibição comple ta do efeito imunoestimulante da toxina pertussis) ~ + -5 ** protecçao altamente significativa de BP AC , p 10 (en saio tde Student).

-35Poder imunoprotector da adenilciclase purificada de

B. pertussis (AC), estudado comparativamente com diversas vacinas clássicas.

QUADRO 2

imunogénio	dose n9 de injecções	n9 de sobrevi- ventes	sobreviver cia média +-.SD
AC+CaM-
-Affigel	5 yig	2	9/12	0,75 +-0,10*
I!	H	4	9/12	0,76 +-0,09
CaM-Affi
gel		2	5/12	0,49 +-0,11*
!T		4	4/12	0,45 +-0,10
BP18323 :	2xl0⁸ CFU	1	9/12	0,76 +-0,095
BP8132	Π	1	9/11	0,80 +-0,09
DTCP
lot M5342	1/5 **	1	4/12	0,445 +-0,10

CaM-Affigel = Affi-Gel calmodulina Biorad * protecção altamente significativa de AC+CaM-Affigel, p ¢10 (teste t de Student).

g ** teoricamente equivalente a 2 xlO CFU.

Claims

1. - Processo para a preparação de composições de adenilciclase ou AC, possuindo uma elevada pureza, praticamente ou totalmente desprovidas de compostos contaminantes bacterianos, particularmente de toxinas pertussis, lipopolissacaridos (ou LPS) e de hemaglutinina filamentosa (ou FHA), caracterizado pelo facto de se promover o contacto de um sobrenadante previamente concentrado de culturas de bactérias que exprimem a adenilciclase, ou de um extracto destas bactérias, com calmodulina.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a AC se apresentar sob uma forma homogénea que sedimenta sob um gradiente de densidade em sacarose com um coeficiente S igual a 3,6.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac terizado pelo facto de a AC se apresentar sob duas formas molécula res de 45 e 43 kDa, respectivamente, estruturalmente aparentadas.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de as composições obtidas possuirem uma actividade que pode atingir e mesmo ultrapassar 1600 yzmole de cAMP min mg

5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de a AC se encontrar livre ou sob a forma de um complexo, em associação com proteínas eucariotas e mais especialmente com a calmodulina.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a constante de associação com a calmodulina ser de cerca de 10 nM.

7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de a actividade catalítica ser transportada por um fragmento de 25 kDa, sítio de combinação com a calmodulina e protegido por esta contra as digestões trípsicas.

8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de se utilizarem culturas de bactérias que exprimem a AC, mais especialmente bactérias pato genicas cuja AC é capaz de interferir com a AC das células eucariótas.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de as bactérias pertencerem ao género Bordetella ou Bacillus anthracis.

10. - Processo de acordo.com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a AC provir de Bordetella responsáveis por patologias respiratórias dos vertebrados tais como o homem, Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis e no animal Bordetella bronchiseptica e Bordetella avium.

11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de para se obter o enzima sob forma livre, se utilizar a calmodulina fixada a um suporte, de se recuperar depois o enzima adsorvido por meio de um agente desnaturante, que é por sua vez eliminado, e de se recolher a composição com o enzima livre.

12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o suporte ser constituído por um material inerte em relação ã composição que contêm o enzima e ser capaz de reter as moléculas de peso molecular elevado, tal como um gel ou um material filtrante.

13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o material filtrante ser a nitrocelulose ou um material plástico e apresentar uma porosidade compreendida entre 0,45 e 0,22 ^um.

14. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente desnaturante ser ureia, de preferência 4 a 8,8 M.

15. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação do enzima sob a forma de um complexo com a calmodulina, caracterizado pelo facto de se adicionar calmodulina a uma composição enriquecida em AC e de se fazer contactar depois a mistura, de preferência mediante realização de uma cromatografia de afinidade, com um permutador de iões de fraca porosidade.

16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de se obter a composição enriquecida em AC a partir de um sobrenadante de cultura concentrado, cujo pH se leva a 7,0, e filtrado com um permutador de iões.

17. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 11 a 16, caracterizado pelo facto de se obter o sobrenadante concentrado submetendo um sobrenadante de culturas bacterianas exprimindo a AC, a uma ou várias operações de filtração, por meio de filtros de nitrocelulose ou de material plástico de porosidade com vantagem compreendida entre 0,45 e 0,22 yum, de se in- z

cubar depois os filtros com um agente detergente a fim de libertar a AC e de se eliminar da composição de AC os materiais insolúveis presentes.

18. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o agente detergente ser um agente detergente não iõnico, de preferência Triton ou NP4O.

19. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 1 e 11 a 17, caracterizado pelo facto de se obter o extracto bacteriano mediante tratamento das células bacterianas que exprimem a adenilciclase com ureia e recuperação do sobrenadante.

20. - Processo de acordo com uma.qualquer das reivindica ções 1 e 11 a 19, caracterizado pelo facto de as bactérias que exprimem a adenilciclase utilizadas para as culturas serem escolhidas entre as bactérias 'atogénicas cuja AC é capaz de interfe rir com a AC das células eucariotas, mais particularmente de Bordetella ou Bacillus anthracis e entre as Bordetella, mais especialmente Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica”, Bordetella parapertussis e Bordetella avium.

21. - Processo para a obtenção de composições de anticorpos policlonais, caracterizado pelo facto de se utilizar na respectiva formulação as preparações enzimaticas purificadas obtidas pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 19.

22. - Processo para a obtenção de anticorpos monoclonais, caracterizado pelo facto de se promover a fusão, em um mieloma de murganho, de linfécitos esplénicos de murganhos imunizados com a adenilciclase purificada.

23. - Processo para a preparação de composições de imunoglobulinas monoclonais, ctracterizado por estas reconhecerem especificamente um epitope de AC purificada que permite a indução da síntese de anticorpos protectores.

24. - Processo para a preparação de composições de anticorpos monoclonais (8-25) , caracterizado pelo facto de estes imunoprecipitarem, nos extractos brutos e nas preparações do enzima purificado a partir das células bacterianas, um tripleto de 50, 45 e 43 kDa assim como uma proteína de peso molecular elevado superior a 100 kDa.

25. - Estirpe de hibridoma, caracterizada pelo facto de produzir anticorpos monoclonais de acordo com a reivindicação 24 e se encontrar depositada na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sob o n? 1-610 (data do depósito: 9 de Outubro de 1986).

26. - Epitope activo de AC, caracterizado pelo facto de ser reconhecido especificamente pelas composições de anticorpos monoclonais obtidas de acordo com a reivindicação 23 ou 24.

27. - Processo para a preparação de vacinas, caracterizado pelo facto de se associar vacinas moleculares comportando um epitope activo de AC com um veículo aceitável sob. o ponto de vista farmacêutico, capaz de induzir uma protecção contra uma infecção e os efeitos tóxicos no homem ou em animais.