PT85572B - Processo para a preparacao de polipeptidos da estirpe de rhinovirus hrv89 assim como de moleculas de dna que os codificam e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

Memória descritiva referente â patente de invenção de BOEHRIN-GER ING3LHEIM INTERNATIONAL GMBH, alemã, industrial e comercial , com sede em D-6507 Tngelheim am Rhein, República Federal Alemã, (inventores; Markus Duechler , Tim Skem, Wolfgang So mmergru-ber, Christoph Neubauer, Peter Grundler, Dieter Blaas , Ernst Kuechler, Ljerka Frasel e Man-fred Zorn, residentes na Alemanha Ocidental), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE POLIPÉPTI-DOS DA ESTIRPE DE RHINOVIRUS HRV89 ASSIM COMO DE MOLÉCULAS DE DNA QUE OS CODIFICAM E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS C ONTÊM" .

MEMÓRIA DESCRITIVA A presente invenção refere-se a peptidos, que correspondem completa ou parcialmente às proteínas virais da estirpe de Rhinovirus 89 (HRV89) humano, às moléculas de acido desoxirribonucleico que codificam para estes peptidos, assim como à preparação e utilização destas substâncias.

Os rinovírus são vírus de RNA e constituem,de acordo com a subdivisão usual dos vírus, uma espécie dentro da Família dos vírus Picoma (p· D. Cooper, A. J» Agol, H. L. 1

Bachrach, F. Brown, Y. Ghendon, A. J. Gibbs, J. H. Gillespie, K. Lonberg-Holm, 8. ^andel, J. L. Melnick, S. B. Mohanty, R. C. Povey, R. R. Rueckert, F. L. Schaffer e D. A. Tyrrell 1978, Intervirology, 10, 165 - 180; H. R. MacNaughton, 1982, Cur-rent Top. Microbiol. Immunol., £2.» 1 - 26).

Eles estão largamente disseminados, atacam o canal respiratório superior do homem e originam infecções agu das que provocam constipações, toése, rouquidão, etc. e, em geral, se designam como resfriados (e. J. Stott e R. A. Kil-lington, 1972, Ann. Rev. Microbiol., 26, 503 - 524). As infec ções provocadas por rinovárus contam-se entre as doenças mais frequentes no homem. Não obstante o decurso destas doenças ser, na maior parte dos casos, de natureza inofensiva, os ree friados originam no entanto um enfraquecimento subsequente do organismo. Por consequência, podem verificar-se infecções secundárias por outros vírus ou bactérias que têm então como consequência o estabelecimento de estados de doença graves. Além disso, os prejuizos provocados por rinovírus são importantes do ponto de vista económico mundial. Calculou-se que, nos Estados Unidos da América, se percam anualmente mais do que 200 milhões de dias de trabalho ou de dias de escola provocados por infecções por rinovírus (b. D. Davis, R, Dulbecco, Η. N. Eisen e H. S. Ginsberg, 1980, Microbiology, Terceira Edição, Harper & Row Publ., Nova Iorque, página 1114).

Nos últimos anos, verificou-se adicionalmente um aumento considerável de infecções provocadas por Rhinovz-rus nos centros de dança. Enquanto na maior parte das outras doenças infecciosas se consegue obter uma imunidade de longa duração ou mesmo permanente contra os germes que provocam as respectivas doenças, as infecções provocadas por rinovírus po dem aparecer sempre. A razão para a falta de uma imunidade permanente é a grande multiplicidade de estirpes de Rhinovirus. Até agora, isolaram-se para cima de cem estirpes de rinovírus, que não apresentam qualquer reacçao cruzada imunológiea umas . com as outras ou apenas uma pequena reacçao imunológiea (J.P. 2 1

Fox, 1976» American J. Epidemiol. 103» 3^5 - 354; J· L. Mel-nick, I98O, Proc. Med. Virol. 26, 214 - 232). Depois de reali zada a infecção, na verdade, podem detectar-se anticorpos con tra a estirpe de vírus respectiva, embora estes não garantam protecção contra outras estirpes de Rhinovirus. Devido ao gran de námero de estirpes, que circulam na população, são possíveis infecções repetidas por Ehinovirus. O objectivo da presente invenção foi proporcionar composições que possibilitem a protecção contra infecções provocadas por rinovírus.

Com o emprego de soros hiper-imunes, foi possível subdividir cinquenta dos tipos de soro do total de noventa Ehinovirus em dezasseis grupos (Μ. K. Conney, J. P. Fox e G. E. Kenny, 1982, Infect. Immun. J2Z» 642 - 647)· Uma outra forma de subdivisão é possível com base na ligação a recepto-res celulares. Não obstante a heterogeneidade evidente das propriedades imunológicas, os Rhinovirus comportam-se de maneira semelhante entre si em relação à ligação aos receptores das superfícies celulares.

Com o auxílio de experiências de competição, pôde verificar-se que, para oitenta e oito estirpes de rinoví rus ensaiadas sobre células HeLa (clone R-19), há apenas dois receptores diferentes (G, Abraham e R. J. Colonno, 1984, J. Virol. 5i, 34o - 344; R. J. Colonno, P. L. Callahan e ¥. J. Long, 1986, J. Virol. J5JZ, 7 - 12). De maneira restritiva deve, no entanto, dizer-se que estes resultados foram obtidos com células de HeLa e não têm validade necessariamente também para os receptores nas células de hospedeiros naturais do canal respiratório superior do homem.

Um outro objectivo da presente invenção consistiu em proporcionar oligopéptiflos que correspondem parcial ou totalmente às proteínas dos vírus, que se podem usar ou pa ra o estímulo de uma resposta imune dirigida contra os vírus - 3 -

intactos ou para a ligação ou o bloqueio de receptores célula res.

Como vírus Picorna típicos, os Rhinovirus con têm um RNA de hélice única, que ê envolvida por uma cápside que consiste em quatro polipéptidos que são designados como VP1 (PIO), VP2 (P1B), VP3 (PIC) e Vp4 (PIA) (k. C. Medappa, C. McLean e R. R. RuecKert, 1971, Virology 44, 259 - 270)í as designações entre parêntesis correspondem às novas designações de acordo com a proposta de nomenclatura de R. R. Rue-ckert e E. Wimmer» 1984, em J. Virol. 5Q, 957 - 959· Uma partícula individual do vírus contém sessenta cópias de cada um destes polipéptidos. As massas moleculares relativas em diver sos Rhinovirus são, para VP1 34 000 - 36 000; para VP2, 27000 - 30 000} para VP3, 24 000 - 28 000 e para VP4, 7 000 - 8 000 (m. R. MacNaughton, 1982, loo. cit.). Além disso, é típico dos Rhinovirus que sejam inactivados rapidamente a valores de pH inferiores a 5 e que sejam sensíveis contra soluções de sal de elevadas concentrações. Além disso, a maior parte dos Rhinovirus apresenta um crescimento óptimo a 33 - 34°C (S. E. Lu ria, J. E. Darnell Jr, D. Baltimore e A. Campbell, 1978, Gene ral Virology, Terceira Edição, John Wiley & Sons, Nova Iorque, pagina 308 e seguintes). 0 RNA de uma única hélice com um comprimento de cerca de 7100 nucleótidos constitue o genoma do vírus e po de simultaneamente também servir como matriz para a síntese das proteínas do vírus. Para o efeito, traduz-se uma grande parte da sequência de nucleótidos primeiramente para uma poli proteína longa, a partir da qual se obtêm as proteínas do vírus prontas, mediante separação proteolítica (B. E. Butterwor th, 1973» Virology %6, 439 - 453? C. Mclean e R. R. Rueckert, 1973, J· Virol. 11, 341 - 344; C. McLean, T. J. Matthews e R. R, Rueckert, 1976, J. Virol. 1£, 903 - 9l4). Como produtos deste processamento, formam-se, além das proteínas do revesti mento dos vírus VP1, VP2, VP3 e VP4, ainda uma série de proteínas como P2A, P2C, P3B, PeC e P3D. A proteína P3B, na maior parte das vezes designada como VPg, está ligada covalentemen- - 4 -

te ao nucleótido 5’-terminal do RNA do vírus. De maneira aná Ioga ao poliovírus, pode admitir-se que P2A e P3C são protea-ses que são, em parte, responsáveis pelo processamento da po-liproteína do vírus (M. R. MacNaughton, M. G. Murray, G. ¥. Andersor, J. J. Dunn, F. ¥. Studier e E. Witnmer, 1986, Cell 4$, 761 - 770).

Correspondentemente, P3D é a polimerase para a replioação do RNA do vírus. Sobre a função da proteína P2C, até agora pouco se sabe.

No processamento da poliproteítia do vírus, se param-se partes da sequência de aminoácidos e, em seguida, de gradam-se (C. McLean, T. J. Matthew e R. R. Rueckert, 1976, loc. cit.). Presentemente, não se pode afirmar que estes pé-ptidos não tenham uma função até agora ainda não descoberta.

Os conhecimentos sobre os Rhinovirus, nos últimos tempos, têm experimentado um intenso alargamento que possibilita determinar a sequência de nucleátidos de dois tipos de soro de Rhinovirus humano e, na verdade, a saber HRV2 (Pedido de Patente Alemã P 35 05 148.5» T. Skem, ¥. Sommer-gruber, D. Blaas, P. Gruendler, P. Fraundorfer, C, Pieler, I. Pogy e E. Kuechler, 1985, Nucleic Acids Res. 12, 2111 - 2126) e HRV14 (G. Stanway, P. J. Hughes, R. C. Mountford, P. D. Mi-nor e J. V. Almond, 1984, Nucleic Acids Res. 12, 7859 - 7875; P.L. Callahan, S. Mizutani e R. J. Colonno, 1985* ^roc. Natl. Acad. Sei. USA 8,2, 732 - 736; Pedido de Patente Europeia Niime ro 85 401 465.1).

Também se esclareceu a estrutura de HRVl4 com o auxílio da análise de estruturas por raios X, com uma resolução de 3 angstrò'm (M. G. Rossmann, E. Amold, J. ¥. Erickson, E. A. Frankenberger, J.P. Griffith, H. J. Hecht, J. E. Johnson, G. Kramer, M. Luo, A. G. Mosser, R. R. Rueckert, B. Sherry e G. Vriend, 1985» Nature (londres) 212» 145 - 153) e identifi-. cou-se a posição de quatro epítopos em HRV14, que são respon- - 5 -

sáveis pela neutralização, com o auxílio de mutantes de HRV14 que são resistentes a anticorpos monoclonais (B. Sherry, A. G. Mosser, R. J. Colonno e R. R. Rueckert, 1985» J. Vi rol, JL2» 246 - 257)· Todas estas descobertas apontam para uma grande semelhança em relação ao poliovírus.

Isso refere-se tanto ás sequências dos ácidos nucleicos ou às proteínas, como também à estrutura dos ví rus, como se pode concluir da comparação com a análise da estrutura de poliovírus por raios X (j. M. Hogle, M. Chow e D. J. Filman, 1985» Science 229. 1358 - 1365). Isto permite chegar a uma designação dos Hhinovirus próxima da dos enteroví-rus. Não obstante, esperava-se que os dois Rhinovirus humanos apresentassem mais semelhança do que os Poliovírus. Mas I um facto que a homologia entre HRV2 e HRV14 em alguns genes não é maior do que a dos Poliovirus. Um esclarecimento possível para o pequeno grau de comparatividade do parentesco entre os dois Rhinovirus foi o facto de os vírus HRV2 e HRVl4 se ligarem a diferentes receptores celulares e, assim, significarem protótipos para o respectivo grupo. De acordo com esse facto, outros Rhinovirus que se ligam ao mesmo receptor que HRV14 de vem ser homólogos com este também na sequência.

Por esta razão, escolheu-se para os trabalhos de sequénciamento a estirpe de Rhinovirus 89 (HRV89) humano que pertence ao mesmo grupo receptor que HRV14 (G. Abraham e R. J. Colonno, 1984, loc. cit.). para obtenção do material de partida de vírus, infectaram-se células de HeLa num meio de infecção apropriado com HRV89 e incubou-se durante várias horas em condições ópti mas de desenvolvimento.

Foi possível obterem-se vírus tanto a partir das células como também a partir do meio.

Diversas operações de purificação originaram - 6 - %

uma preparação de vírus cujo modelo da proteína se represente tipicamente, como se refere na Figura 1. O RNA do vírus foi obtido a partir da prepara ção dos vírus, por exemplo, por extracção com fenol e foi purificado; ele foi, em seguida, transcrito com o auxílio de transcriptase inversa e de Oligo dT como "primer" em cDNA. Os híbridos RNA/cDNA assim obtidos foram alongados homopolimèri-camente e inseridos num plasmídeo apropriado, por exemplo, o pBR322. A utilização de métodos para a transcrição inversa de RNA, para a integração de híbridos RNA-cDNA em plasmídeo s e para a transformação de bactérias, foi descrita su-ficientemente na literatura (N. Kitamura e E. Wimmer, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 22» 3196 - 3200; T. Nelson e D. Brutlag, 1979» Methods in Enzymology 68, 4l - 50; S. Zain, J. Sambrook, J. J. Roberts, ¥. ICeller, M. Fried e A. Dunn, 1979» Cell l6, 851 - 861; R, Roychoudhury e R. ¥u, 1980, ^ethods in Emzymology 65.» 42 - 62; N. Iíitamura, B. L. Semler, P. G. Ro-thberg, G. R. Larsen, C. J. Adler, A. J. Dorner, E. A. Emini, R. Hanecak, J. L. Lee, S. van der Werf, C. ¥. Anderson e E. ¥immer, 1981, Nature (Londres) 291. 5^7 - 553* S. van der ¥erf, F. Bregegere, H. Kopecka, N. Kitamura, P. G. Rothberg, P. Kourilsky, E. ¥immer e M. Girard, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. UAS 78. 5983 - 5987» A. Namoto, T. Omata, H, Toyoda, S. Kuga, H. Hosie, Y, Kataoka, A. Genba, Y. Nakano e N. Imura, 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. UAS 2£. 5793 - 5797í G. Stanway, A. J. Cann, R. Hauptmann, P. Hughes, L. D. Glarke» R. C. Moun tford, P. D, Minor, G. C. Schild e J. ¥. Almond, 1983» Nucleic Acids Res. 11, 5629 - 5643* T. Skern, ¥. Sommergruber, D.Blaas, P. Gruendler, F. Fraundorfer, C. Pieler, I. Fogy e E. Kuech-ler» 1985» loo. cit.).

Depois de realizada a transformação dum organismo hospedeiro apropriado, por exemplo, E. ooli HB101, iso-• lou-se o plasmídeo-DNA, de acordo com a "técnica de miniprepa . ração de plasmídio" e determinou-se o tamanho do DNA recombi- - 7 -

nante. Para o efeito» cortaram-se os plasmídios recombinantes com o auxílio da endonuclease de restrição PstI separaram-se electroforeticamente os fragmentos resultantes do corte e com pararam-se com DNA marcador lambda-HindIII conhecido.

Para a subclonação do DNA* foram obtidos e pu rifiçados fragmentos de DNA por digestão com PstI dos clones recombinantes pBR322 num vector apropriado, inseriram-se num vector apropriado, por exemplo, num plasmídio pUC9 e transformaram-se os vectores recombinantes num hospedeiro apropriado, por exemplo E. coli JM101# Os subclones que foram transformados com vectores recombinantes com êxito foram cultivados e o seu plasmídio-DNA isolado e purificado. A partir de três subclones isolaram-se e puri ficaram-se três fragmentos primários de comprimentos diferentes / 5^ nucleátidos (Fragmento A), 122 nucleotidos (Fragmento b) e 139 nucleátidos (Fragmento C)7· Adicionalmente, utili zou-se ainda um primário sintético (d) 20 nucleotidos mais longo. Com o auxílio deste DNA de hélice unica complementar, 32 preparou-se um transcrito inverso de HRV89-HNA marcado com p.

Para comprovar a presença de sequências de HRV89 em DNA reconíbinante, digeriu-se o plasmídio DNA com PstI, analisou-se por electroforese e transferiram-se os fragmentos de DNA do gel para um filtro de nitrocelulose e fixou -se· Estes filtros de suporte de DNA foram hibridados com o HRV89-cDNA marcado radioactivamente e, em seguida, expôs-áe o filtro. A partir dos fragmentos de DNA recombinante assim determinados, que correspondem ao HRV89-ENA, foram cartografadas as posições de restrição e o DNA foi sequenciado. Obtiveram-se clones que representam o genoma de HRV89· A sequência do genoma HRV89 está representada na Figura h. Ela está representada sob a forma do DNA que se obteve a partir do sequenciamento do DNA recombinante. Para . se determinar a sequência, utilizaram-se vinte e um clones 8

que estão mencionados na Figura 3 e, adicionalmente, cinco ou tros clones. A sequência abrange 7152 nucleátidos, em que não se entra em consideração com o pali-A do terminal 3'· Ela con têm um quadro de leitura aberto que codifica para uma polipro teína com o comprimento de 2164 aminoácidos. 0 quadro de leitura começa com um grupo AUG na posição 619 e termina num Co-dão de Xnterupção UAA de quarenta e dois nucleátidos antes do início do poli-A. A sequência da extremidade 5' foi obtidaapar tir dos clones números 5 e 10, em que se utilizou como prima-rio o fragmento D (veja-se Figura 3)· A divisão do PstX origi nou um fragmento de comprimento constante. Por sequenciamento, comprovou-se que ambos os clones continham a sequência TTAAMC imediatamente a seguir ao oligo-G que deriva da posição de in tegração no plasmídio. Daqui tirou-se a conclusão de que estes clones representam a extremidade 5' do genoma HRV89. Esta sequência corresponde aos primeiros sete nucleótidos dos três tipos de poliovírus: vírus de Coxsackie BI (M. J. Hewlett e R. Z. Florkiewicz, 1980, Pro. Natl. Acad. Sei., USA 21* 303 -307; G. Stanway, A. J. Cann, R. Hauptman, P. Hughes, L. D. Clarke, R, C. Montford, P. D. Minor, G, C. Schild e J. ¥. Almond,1983, loc. cit.). HRV2 (t. Skern, ¥. Sommergruber, D. Blaas, P. Gru endler, F. Fraundorfer, C. Pieler, I. Fogy e E. Kuechler,1985» loc. cir.) e HRV14 (G. Stanway, P. J, Hughes, R. C. Mountford, P. D. Monor e J. ¥. Almond, 1984, loc. cit.). A análise dos seiscentos e dezoito nucleáti-dos entre a extremidade 5' e o início do quadro de leitura aberto comprido mostra a existência de vários quadros de leitura mais curtos. Uma comparação da sequência de núcleotidos da região da extremidade 5’ do vírus HRV89 com a do vírus HRV2 mostra - tendo em consideração as inserções - um grau acentua damente elevado de homologia igual a 79%* enquanto a homolo-gia em relação ao vírus HRV14 ê igual a 67$ e ao poliovírus do tipo 1 é igual a 62%, Nestes casos, a homologia é especial • mente grande em algumas zonas. Ao todo, existem nove blocos - 9 -

diferentes com dezassete ou mais nucleótidos idênticos, que estão a seguir uns aos outros, na região da extremidade 5' do genoma HRV89 e do genoma HRV2. A comparação das sequências dos aminoácidos mostrou que as zonas da homologia continuam também na região que codifica para a poliproteána (Figura 5). Ê especialmente saliente a homologia manifestada entre HRV89 e HRV2, enquanto surpreendentemente - ao contrário do que era de esperar - a homologia em relação a HRV14 é muito menor. Os segmentos for-temente conservantes abrangem tanto as proteínas do revestimento como também a zona das proteínas não estruturais (p2A -- p3D). A Figura 18 mostra, por exemplo, uma comparação das sequências entre uma sequência parcial de HRV2 com uma sequên cia parcial do HRV89» que deriva da região dos genes para p3A e p3B (VPg). A continuada homologia da sequência dos aminoáci dos pode reconhecer-se fàcilmente. Mesmo nos sátios em que existem outros aminoácidos isolados, encontra-se, na maior parte das vezes, uma substituição por aminoácidos utilizados quimicamente muito próximos, em que a arginina (η) I trocada por lisina (k), a valina (v) por isoleicina (I). a leucina(L) por isoleucina (i), etc. Também a posição da separação é completamente conservada entre p3A e p3B (VPg), como se pode reconhecer fàcilmente com base na homologia. Frequentemente, existe, pelo contrário, uma diferença numa pequena zona (que corresponde à sequência entre os nucleotidos 5018 e 5029 em HRV2), a qual origina uma pequena divergência da sequência dos aminoácidos na correspondente região em p3A. A significância desta descoberta não foi ainda, até hoje, esclarecida. Sobre a função do p3A não foi ainda nada conhecido até hoje. Não se pode, portanto, excluir a possibilidade de que existam subtx-pos de HRV2 que nesta zona possuam uma maior homologia em relação a HRV89 do que se representa neste exemplo. Isto significa, evidentemente, que não obstante o facto de HRV89 perten cer ao mesmo grupo receptor que HRV14, o parentesco com HRV2 é maior. Por causa da sequência, HRV2 e HRV89 formam assim um grupo conjunto que se diferencia nitidamente de HRV14 e de Po - 10

liovírus. Esse facto poderá possivelmente significar que os Rhinovirus humanos possuem* no entanto* maiores semelhanças entre si do que seria de concluir até agora com base na compa ração das homologias de HRV2 e HRV14. Por consequência, parece também existir a possibilidade de os Rhinovirus e os Ente-rovírus, conjuntamente* se reunirem numa unica espécie dentro da família dos Picomavirus (G. Stanway, P. J. Hughes* R. C. Montfort, P. D. Minor e J. W. Álmond, 1984, loc. cit.).

As proteínas virais obtêm-se a partir da poli proteína por separação proteolítica. Para determinar os sítios da separação, isolaram-se as proteínas dos revestimentos virais e determinou-se a sequência dos aminoácidos N-terminais (pigura 6). Desta forma, foram identificados de modo inequívo co não só os sítios de separação das proteínas dos revestimen tos virais, mas também se confirmou o retículo de leitura que derivou da sequência de nucleotidos. Da comparação com a sequência de aminoácidos derivada da sequência de nucleátidos conclui-se que se realiza a separação VP4/VP2 entre glutamina e serina, a separação VP2/VP3 entre glutamina e glicina e a separação VP3/VP1 entre glutamina e asparagina. Estes sítios de separação são surpreendentemente idênticos aos de HRV2*mas são diferentes dos de HRV14 (g. Stanway, P. J. Hughes, R. C. Mo un tf o rd, P, D» Minor e J. ¥. Álmond, 1984, loc. cit.). A presente invenção possibilita preparar um DNA que contém a informação para o SNA virai do HRV89.

No entanto, são objecto da presente invenção não sá as sequências de genes que codificam especificamente para as proteínas virais mas também as modificações que se po dem obter, por exemplo, por mutação, demolição, transposição ou adição. Cada sequência que é degenerada em relação à mencionada é igualmente incluida. Também são incluidas assequên cias que, em condições estringentes, por exemplo* em condições que seleccionam mais do que 85$, de preferência mais do que 90$ de homologia* se hibridizam com as mencionadas sequên 11

*0%.. cias ou partes ou codificam para as proteínas com o espectro de actividade virai. As hibridizações são realizadas a 65°, em 6 x SSC/5 x solução de Denhardt/0,1% de SDS. 0 grau de es-tringência é assegurado na fase de lavagem. Isso acontece com as condições que são apropriadas para um seleccionamento da sequência de DNA com cerca de 85% ou mais de homologia, são como se seguei 0,2 x SSC/0,1$ de SDS/ó5°C, e para o seleccionamento de sequências de DNA com cerca de 90% ou mais de homo logia são as seguintes 0,1 x SSC/0,01$ SDS/65°C.

Este DNA pode, como se referiu, ser inserido não sá completamente como também em fragmentos em vectores de plasmídios apropriados para conseguir depois da transformação de organismos hospedeiros apropriados ou que o DNA se reprodu za ou a expressão das próprias proteínas. Os hospedeiros, vectores e as condições apropriadas para estas operações são muito bem conhecidas pelos peritos no assunto. Igualmente, es tão publicados muitos trabalhos em que se descreve a síntese de proteínas estranhas em bactérias com o auxílio dos métodos da tecnologia genética (artigo de revisão geral, veja-se T.J. R. Harris, em "Genetic Engineering", R. Williamson, Editor, 1983» Vol. 4, Academic Press, Londres, página 127 e seguintes). Para esta finalidade, o DNA é inserido nas proximidades de re giões de controlo bacteriano apropriadas (promotores, sítios de ligação de ribosomas) de plasmídios, o que possibilita exprimir esta informação - na maior parte das vezes sob a forma de proteínas de fusão - com elevados rendimentos e, assim, obter as correspondentes proteínas. Também no domínio dos Pi-comavírus, já há uma série de publicações em que se descreve a expressão dos genes virais em bactérias (H. Kupper, ¥. Kel-ler, C. Kurz, S. Porss, H. Schaller, R. Pranzel, K Strohmaier, 0. Marquardt, V. G. Zaslavsky e P. H. Hofschneider, 198I, Na-ture (Londres) 28J>, 555 - 559? D. G. Kleid, D. Yansura, D. Small, D. Darbenko, D. M. Moore, M. J. Grubman, P. D. McKer-cher, D. D. Morgan, B. H. Robertsnn e H. L. Bachrach, 1981» Science 214» 1125 - 1129; C. Wychovrski, S. van der Werf, 0 Siffert, R. Crainic, P. Bruneau e M. Girard, 1983, EMBO J. 11, 12

2019 “ 2024; ¥. Klump, 0. Marquardt e P* H. Hofschneider*1984, Proc. Nat. Acad, Sei. USA 8l, 3351 - 3355# R. Hanecak, B. L. Seraler, H. Ariga, G. ¥. Anderson e E. ¥immer, 1984, Cell 37« 1063 ~ 1073» T· Skem, ¥· Sommergruber, D. Blaas, P, Gruen-dler, F. Praimdorfer, C. Pieler# I. Fogy e E. Kuechler, 1985» loc. oit.; K. Strebel, E. Beck, K. Strohmaier e Ή. Schaller, 1985» Virol. 52» 983 - 9915 H. Toyoda e col., 1986, loc. cit·).

Para a expressão, preferem-se hospedeiros pro carióticos, por exemplo, E. coli K 12» Estirpe 294 (ATCO N9 31 446). Outras estirpes que são apropriadas compreendem E. coli XI 1778 (ATOO N- 31 537)· Igualmente como as estirpes an teriormente mencionadas, podem também usar-se E. coli ¥ 3110 F , Lambda , Prototroph (ATCO NS 27 325)* bacilos tais como Bacillus subtilis e outras Enterobactereáceas, como Salmonel-la tvnhimurium ou Serratia marcescens e diferentes Pseudomina das.

Em geral, os vectores do plasmídio podem conter o replicão e as sequências de controlo que derivam da espécie que são compatíveis com as células hospedeiras, em liga ção com estes hospedeiros. 0 vector geralmente possui, além de uma posição de replicação, sequências de reconhecimento que permitem seleccionar fenotipicamente nas células transfor madas. Por exemplo, usualmente E. coli é transformado com pBR322, um plasmídio que deriva da espécie E. coli (Bolivar e col., Gene 2, 95 (1977)). 0 plasmídio pBR322 contém genes para a resistência à Ampicilina e à Tetraciclina e, por consequência, for nece meios simples para identificar as células transformadas. 0 plasmídio pBR 322 e também outros plasmídeos devem conter, além disso, promotores derivados de si proprios ou devem ser modificados de tal maneira que contenham promotores que podem ser utilizados pelo organismo microbiano para a expressão das suas proteínas próprias. Os promotores que são mais frequente mente utilizados para a preparação de DNA recombinante contêm - 13 -

a beta-lactamase (penicilinase) e os sistemas promotores da lactose (Chang e col·, Nature 275. 615» (1978)? Itakura e col.» Science lg8, 1056 (1977)? Goeddel e col., Nature 281, 5^ (1979)) e sistemas triptofano (trp)-promotor (Goddel e col., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (ΐ98θ)} Pedido de Patente Europeia, Publicação Námero OO36 776).

Enquanto os promotores mencionados são os mais usuais, também se desenvolveram e se utilizam outros promotores microbianos. A sequência de gene de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, ser inserida sob o controlo do promotor do lado esquerdo do bacteriófago lambda (PjJ · Este promotor é um dos promotores conhecidos como especialmente in tensos e que é controlável. 0 controlo é possível por meio do repressor lambda, do qual se conhecem os sítios de corte de restrição vizinhos.

Um alelo sensível â temperatura deste gene po de ser introduzido num vector que contém uma sequência de DNA virai. Se a temperatura subir até 42°C, o repressor ê inacti-vado e o promotor é expresso ate à sua concentração máxima. A quantidade dos mRNA, que se produz nestas condições, deve ser suficiente para se obter uma célula que* nos seus novos ácidos ribonucleicos sintéticos, contém aproximadamente 10$ que deri va do promotor Pj^.

Desta forma, é possível estabelecer um banco de clones em que uma sequência de DNA virai funcional é placa da na vizinhança dum sítio de ligação do ribosoma e, na verda de, as distâncias que variam em relação ao promotor lambda-F^. Estes clones podem depois ser examinados e seleccionados com o máximo rendimento. A expressão e a translação de uma sequência de DNA virai podem também realizar-se sob o controlo de outros sistemas de regulação que podem ser válidos como "homólogos" , para o organismo na sua forma não transformada. Assim, por *_ exemplo, o DNA cromossómico de um E. coli dependente de uma - Ik -

lactose contém um operão da lactose ou um Lac-operão que possibilita a degradação da lactose mediante o despejo da enzima b eta-galacto sidas e·

Os elementos de Lac-controlo podem ser obtidos a partir do bacteriófago lambda-pLac5» que e infeccioso para E. coli. 0 Lac-operão do fago pode derivar por transdu-ção a partir da mesma espécie de bactérias. Os sistemas de re gulação que podem ser utilizados no processo de acordo com a presente invenção podem derivar de DNA plasmídico que é próprio do organismo. 0 sistema Lac-promotor-operador pode ser induzido por IPTG.

Podem utilizar-se outros sistemas de promotor -operador ou suas partes de maneira igualmente boaí por exemplo, operador de arabinose, operador de colicina, operador de galactose, operador de fosfatase alcalino, operador de trp, operador de xilose A, promotor de tac, etc..

Os genes podem ser exprimidos, de preferência, no plasmídio de expressão pER103 (Hastl-Dworkin e col·, Gene 21, 237 - 2h8 (1983); compare-se também com o Pedido de Paten te Europeia Número 83 112 812.9» depositado na DSM 2773» de 20 de Dezembro de 1983) ou de plasmídios dele derivados, por exemplo, pRHlOO (Figura 7)« Estes vectores contém todos os elementos de regulação que originam uma boa taxa de expressão dos genes clonados. 0 âmbito da presente invenção compreende não só a integração do DNA total dos Rhinovirus humanos dos tipos 2 e 89» e a integração de partes deste DNA, mas também combinações variáveis destes fragmentos de DNA em vectores de pias mídio apropriados, os próprios vectores de plasmídio, os microrganismos hospedeiros transformados com eles e ainda a sín tese das referidas proteínas, as próprias proteínas e a sua utilização.

Como já se referiu, para a preparação de pro- - 15 -

teínas por métodos de tecnologia genética de proteínas nos or ganismos hospedeiros utilizam-se usualmente os mencionados ve ctores de expressão. Estes contêm as assim chamadas sequências de regulação que são responsáveis por uma transcrição e trans lação áptimas do DNA heterálogo. Nestas sequências de regulação contam-se promotores intensos, de preferência, promotores reguláveis e, no sentido da transcrição do promotor, um ou vá rios sítios de corte singulares para as enzimas de restrição que devem ficar a uma distância apropriada em relação ao promotor. Âlguns vectores de expressão são construidos de modo que, antes dos primeiros sítios de corte singulares "a jusante" (dovrastream) do promotor, seja introduzido um eo-dão de início (codão de iniciação). No caso da utilização de vectores sem codão de iniciação, dota-se o DNA a exprimir com um codão de iniciação e insere-se. Além disso, o DNA a exprimir no vector deve seguir um assim chamado codão de interrupção ou de acabamento. Na construção de um vector de expressão que contém um gene éstrutural é importante que este gene estrutural seja inserido em fase em relação com o codão de iniciação. A inserção do DNA heterálogo no vector de expressão pode realizar-se de acordo com uma maneira de proceder conhecida. Porque nos casos mais raros, o início do DNA possui os mesmos sítios de reconhecimento que os sítios de corte singulares do vector de expressão, os sítios de corte devem ser feitos compatíveis na maior parte dos casos.

Isso é possível, por exemplo, por completamen to ou por digestão das extremidades de hélice unica salientes ou por junção de correspondentes ligadores. Se o vector de ex pressão escolhido não possui codão de iniciação, pode também adicionar-se o codão de iniciação simultaneamente com a adição dum ligador.

Em todas estas operaçães, deve garantir-se - 16 -

que ο ΏΝΑ heterálogo está em fase com o codão de iniciação.

Para se atingir o objectivo da presente inven ção» ê especialmente apropriada a utilização do vector pRHlOO (Figura ?) e dos plasmídios de expressão dele derivados para o DNA ou fragmentos de DNA do HRV2 ou HRV89· Este vector - um derivado de pBR322 - contém como característica estrutural es sencial o promotor de triptofano de Serratia mareescens, 0 qual significa uma sequência de sinais activa para a realização prática da síntese da proteína e pode ser activado com ácido 3-^-indol-acrílico (=IAA; indutor do operão trp).Depois do promotor trp encontra-se um sítio de ligação de ribosomas sintético e o codão de iniciação ATG. Imediatamente depois do codão de iniciação, encontra-se um sítio de corte com Saci (veja-se Figura 8).

Para a finalidade da presente invenção, as ex tremidades de hélice simples deste sítio de corte foram elimi nadas com uma nuclease específica de hélice ânica. Se se ligar o plasmídio assim modificado com um DNA ou com um fragmen to de DNA (blunt-end). por exemplo, com o "blunt-end" XhoH--Fragmento 969/1 do HRV2-cDNA (veja-se Figura 9)» então obtêm -se plasmídios de expressão que» nas células do hospedeiro com ele transformados, por exemplo, originam sistemas de células procariéticas ou eurocarioticas para a produção de proteínas sem componente de fusão. A expressão dessas proteínas tem. em relação a uma proteína de fusão, a vantagem de colocar à disposição a proteína exprimida na sua estrutura natural e de poder ser submetida a ensaios imunolágicos ou enzima ticos.

Mediante o conhecimento da sequência de DNA completa do HRV2 e do HRV89» ê de acordo com a presente inven ção, possível inserir cada fragmento pretendido do DNA de acor do com a maneira de proceder acima referida nos plasmídios de expressão apropriados, por exemplo, no plasmídio de expressão • pRHlOO e provocar a expressão se se atender a que os fragmen-. tos estejam na distância correcta em relação às sequências de 17 - *

regulação e nos quadros de leitura próprios em relação ao co-dão de iniciação ATG. Os fragmentos pretendidos podem nesse caso preparar-se ou por síntese de oligonucleótidos completamente química ou por fragmentação dos plasmídios obtidos de acordo com a Patente Europeia EPA 0 192 175 ou de Patente Ale mã DE 3^ 28 658.3* Ê também possível a combinação dos dois processos. Assim» por exemplo» pode-se fragmentar a molécula de DNA representada na Figura 9» por exemplo, a partir do pias mídio pHRV2-969» por digestão dupla com as enzimas de restrição Bali e BssHII na posição 930 ou 1581» para então, por exem pio, levar o VP2 maduro a realizar a expressão, são precisos dois fragmentos de oligonucleótidos que representam os nuçleó tidos 818 a 931 ou 1582 a l600 + TAG da Figura 9» Os oligonucleótidos podem preparar-se quimicamente de acordo com uma ma neira de proceder em si conhecida, por exemplo, com auxílio de um bio-sistema aplicado Modelo 38IA de sintetizador de DNA. Depois de se acoplar este fragmento (Figura 12) e se inserir nos sítios de corte "obtusos" Saci do Plasmídio pRHlOO, obtém -se o plasmídio de expressão pRH969/2 (Figura 15) apropriado para a expressão do VP2 maduro. A estratégia mencionada é, como já se mencionou acima, também utilizável para as outras proteínas virais do HRV2 ou do HRV89.

Com utilização dos três sítios de corte H3ndIEI no cDNA do HRV89» pode construir-se um plasmídio de expressão que contém os nucleotidos de 2251-^703 do HRV89. Para isso, corta-se a molécula de DNA que codifica o domínio de proteína virai total com HindIII, isola-se e purifica-se o fragmento H-H com cerca de 3860 bp de tamanho e, em seguida, corta-se com Sphl· A este fragmento S-H, que representa os nucleótidos 2273-^703» adiciona-se, eventualmente, numa ou nas duas extre midades, um ligador que possibilita a inserção do fragmento num vector de expressão linearizado apropriado no quadro de leitura correcto. A escolha do ligador ou dos ligadores realiza 18

-se de acordo com as posições de restrição disponíveis no ve-ctor de expressão. De maneira especialmente vantajosa, utilizam-se os ligadores que, em fase com a sequência de DNA que ex prime, possuem um codão de iniciação como ATG e codões de aca bamento come, por exemplo, TAA, se estes não estão já postos à disposição pela sequência que exprime»

Um vector de expressão apropriado é, por exem pio, o vector pKK233-2 (4602 bp) (E. Amann e J. Brosius, Gene 4o (1985), 183 - 190), que se pode obter na firma Pharmacia, sob o Número de Catálogo 27-4935-01. Este vector I digerido duplamente com Ncol e HindIII, isola-se o fragmento grande e purifica-se. ^ara se poder inserir o fragmento S-H no vector linearizado, dota-se este com um ligador Ncol-Sphl de formula

CATGGTGTGCATGGTTTCTGCATG

CACACGTACCAAAGAC 0 fragmento S-H, dotado com este ligador, é li gado com o vector linearizado. Os reagentes necessários para as correspondentes operações são conhecidos pelos peritos no assunto e são empregados de acordo com uma maneira de proceder conhecida. 0 plasmídio de expressão pKK89/2A assim obtido (Figura 16) é regulável por indução de XPTG e possibilita em E. coli. por exemplo, na estirpe JM205» a expressão da pro teína madura representada na Pigura 17 (os aminoácidos adicio nais derivam do vector).

Esta proteína é então exprimida se se utilizar como início dos ribosomas ATG que se encontra à distância áptima das regiões de regulação para a Met na posição 545. Ê, no entanto, também imaginável que se utilize apenas a.ATG para Met na posição 548 como sinal de iniciação; obtém-se como con sequência uma proteína encurtada em três aminoáeidos.

Além dos hospedeiros procariáticos, podem tam - 19 “

bém utilizar-se microrganismos eucarióticos. De entre os microrganismos eucariúticos, utiliza-se, na maior parte das vezes, Saccharomvces cerevisiae. não obstante se possa obter,em geral, um certo número de outras espécies. Para a expressão em Saccharomvces, utiliza-se, geralmente, o plasmídio YRp7 (Stinchcomb e col·, Nature 282. 39 (1979), Kingsman e col», Gene 2» l4l (1979)» Tschumper e col·, Gene 10, 157 (l98o)) e o plasmídio YEpl3 (Bwach e col., Gene 8, 121 - 133 (1979)). O plasmídio YRp7 contém o gene TRP1. que pãe à disposição uma marcação de seleccionamento para uma mutação de levedura, que é incapaz de se desenvolver em meio que contenha triptofano, por exemplo ATCC N* kk 076. A existência do prejuizo de TRP1 como caracte rística do genoma do hospedeiro de levedura significa então um meio auxiliar activo para proporcionar a transformação, no qual se cultiva sem triptofano. Se se proceder de maneira com pletamente semelhante, com o plasmídio YEpl3» obtém-se o gene de levedura LEU2. que se pode utilizar para a obtenção dum mu tante de LEU-2. As sequências de promotor apropriadas para ve ctores de leveduras contêm a região do flanqueamento 5' do ADH 1 (G. Ammerer, Methods of Enzymology 101. 192 - 201 (l983)X 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman e col., J. Biol. Chem. 255« 2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas (Kawasaki e Fraen kel, Biochem. Biophys. Res. Comm·, 108. 1107 - 1112 (1982), como por exemplo enolase, glicerinaldeído-3-fosfato-desodroge nase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase e glucoquinase.

Na construção de plasmídios de expressão apro priados, podem inserir-se sequências de acabamento associadas com estes genes igualmente no vector de expressão na extremidade 3' da sequência que origina a expressão para a poliadeni lação e o acabamento do mRNA.

Outros promotores que, além disso, têm ainda a vantagem da transcrição controlada pelas condiçdes de desen volvimento, são as regiões promotoras da álcool-desidrogena- 20

se-2» isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas de degradação que são acopladas com o metabolismo do azoto, a gliceraldeído -3-fosfato-desidrogenase acima mencionada e enzimas que são responsáveis pelo processamento de maltose e de galactose*Pro motores que são regulados pelo locus do tipo que se adapta a leveduras, por exemplo, promotores dos genes BARX« ME1. STE2. STB3 e STE5» podem ser inseridos nos sistemas regulados pela temperatura, mediante a utilização de mutações sir dependentes da temperatura (Rhine, Tese de Doutoramento, Universidade do Oregon, Eugene, Qregon (1979)» Herskowitz e Oshima, The Mo lecular Biology of the Yeast Saccharomvces« parte I, 181 -209 (1981) Cold Springs Harbor Laboratory). Estas mutações influenciam a expressão das cassetes do tipo de adaptação em repou so de leveduras e, dessa forma, indirectamente, os promotores que dependem do tipo de adaptação. No entanto, geralmente, é apropriado todo o vector de plasmídio que contém um promotor compatível com a levedura e sequências de replicação e de aca bamento originárias.

Além dos microrganismos, são apropriadas também igualmente culturas de organismos multicelulares. Em prin cípio, pode empregar-se cada uma destas culturas quer sejam culturas de animais vertebrados ou invertebrados. No entanto, o maior interesse consiste nas células de desenvolvimento com agitação, de modo que a multiplicação de células de animais vertebrados tornou-se um método rotineiro na cultura (cultura de tecidos) dos últimos anos (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson Editors (1973))· São exemplos dessas linhas de células hospedeiras uteis as células VERO e HeLa, as células de ovulos de criceto (CHO) e as linhas de células WI38, BHK, GOS-7 e MDCK. Os vectores de expressão para estas células contêm, usualmente (se necessário) um sítio de replicação, um promotor antes do qual está localizado o gene de expressão, conjuntamente com cada posição de ligação de ribosomas indispensável, RNA-sítios de Spleiss, sítios de poliadeniliação e sequências de acabamento de transcrição.

Se se utilizarem nas células de mamíferos,pre 21

vêm-se muitas vezes as funções de controlo sobre o vector de expressão de material virai. Por exemplo, os promotores usual mente empregados derivam de Polioma, Adenovírus 2 e, de manei ra especialmente frequente, de vírus ko de símio (SV 4θ). Os promotores de iniciação e de acabamento do SV 4o são especial mente úteis porque ambos se obtêm facilmente a partir do vírus como fragmento, o qual também contém ainda as posições de replicação virais do SV ko (Piers e col,, Nature 273, 113 (l978))· Também se podem empregar fragmentos maiores ou menores do SV 4o, pressupondo-se que eles contêm a sequência com cerca de 230 bp de comprimento, que vai desde a posição de cor te HindlII até à posição de corte Bgll, nas posições de repli cação virais· Além disso, é igualmente preferível e aconselha vel usar sequências de promotores e de controlo que normalmen te estão ligados com as sequências de genes pretendidas, desde que estas sequências de controlo sejam compatíveis com os sistemas das células hospedeiras.

Pode proporcionar-se um sítio de replicação ou por correspondente construção do vector para constituir uma posição exógena, por exemplo, a partir de SV 4o ou de outras fontes de vírus (por exemplo, Polioma, Adeno, VSV, etc.) ou pelo mecanismo de replicação cromossomica das células hospedeiras. Se se integrar o vector no cromossoma das células hospedeiras, basta tomar esta última medida na maior parte dos casos. A transformação das células com os veículos pode conseguir-se por meio de um grande número de processos. Por exemplo, pode realizar-se por meio de cálcio, caso em que ou as células são lavadas em magnésio e o DNA é adicionado a células suspensas em cálcio ou as células são colocadas num coprecipitado de DNA e fosfato de cálcio. Na subsequente expressão de genes, passam-se as células para meios que selec-cionam as células transformadas. * Depois de realizada a transformação do hospe- • deiro, a expressão do gene e a fermentação ou a cultura de cé 22

lulas em condições em que se exprime a proteína» pode extrair -se o produto correntemente por métodos de separação cromato-gráficos conhecidos para se obter um material que contémapro teína do vírus com ou sem as sequências da parte da frente e da parte de trás. A proteína pode ser expressa como a sequência leader na extremidade N (pré-proteína) que pode ser elimi nada de algumas células hospedeiras. Caso contrário» então é necessário realizar uma separação do poliplptido leader (quan do existente) para se obter a proteína madura. Como alteraati va, a proteína madura pode ser produzida directamente no microrganismo. Para esse efeito» pode utilizar-se a sequência precursora da feromona de adaptação d« leveduras MF-alfa-1, para se garantir um correcto "amadurecimento" da proteína fusionada e a separação dos produtos no meio de crescimento ou no espaço periplástico. A sequência de DNA para a proteína funcional ou madura pode ser ligada com MF-alfa-1 nos sítios de corte pressupostos. Além da utilização do DNA de acordo com a presente invenção para a preparação das correspondentes proteínas em bactérias ou células eucarioticas, ele também po de servir para preparar, a partir da sequência de nucleotidos, as sequências de aminoácidos sinteticamente, completamente ou em parte, por exemplo, por utilização do sintetizador de pé-ptidos automático (por exemplo, Beckman Modelo 990).

Estes oligopéptidos podem então, igualmente como as proteínas preparadas por tecnologia- genética, ser uti lizados ou para o estímulo de uma resposta imune dirigida con tra vírus intactos ou para a ligação e o bloqueio de recepto-res celulares. Publicaram-se estudos sobre a utilização de oligopéptidos para o estímulo de una resposta imune dirigida contra poliovírus (e. A. Emini, B. A. Jameson e 1. Wimmer, 1983» Nature (Londres) £0, 669 - 703); realizaram-se também ensaios semelhantes com vírus da febre aftosa (j. L. Bittle , R. A. Houghton, H. Alexander, T. M. Shinnick, J, G. Sutcliffe, R. A. Lemer, D. J. Rowlands e F. Brown, 1982» Nature (Londres) 298, 30 - 33; E. Pfaff, M. Mussgay, H. 0. Bohm, G. E. , Schulz e H. Schaller, 1982, EMBO J. 1, 869 - 87¾). a presente 23 -

invenção compreende no seu âmbito também as partes de oligopé ptidos e de polipéptidos de proteínas de HRV89 que estão liga das com outros oligopéptidos ou polipéptidos em consequência da síntese ou com a finalidade de aplicação, por exemplo,como vacina·

Um outro objecto da presente invenção é constituído pelos anticorpos monoclonais e a sua preparação, anti corpos que são dirigidos contra as proteínas virais estruturais e não estruturais (na forma natural e desnaturada). A li gação de anticorpos monoclonais a receptores celulares para HRVl4 e o seu bloqueio já foi descrito por Colonno e col. (Pe dido de Patente Europeia 0 169 l46). A propriedade de os anticorpos poderem ligar antigenes específicos encontra utilização prática fora do cor po na determinação qualitativa e quantitativa (ensaio de imunidade) e na purificação dos antigenes (cromatografia de imu-no-afinidade). 0 soro de animais imunizantes contém normalmen te um grande número de diferentes anticorpos que reagem com o mesmo antigene em diferentes posições de ligação com diferentes actividades, mas também anticorpos contra outros antigenes· A utilização coroada de êxito de anticorpos para a deter minação e a purificação de antigenes necessita, no entanto,de elevada especificidade e reprodutibilidade.

Podem-se preparar anticorpos homogéneos que satisfazem estes requisitos por meio da técnica do hibridoma, descrita por Kohler e Milstein· Em princípio, a técnica consiste em B-linfocitos que segregam anticorpos, por exemplo, provenientes do baço, de animais imunizados serem fundidos ("fusionados") com células de tumor. As células de hibridomas assim formadas combinam a capacidade de multiplicação ilimita da por subdivisão com a capacidade de formarem e segregarem um anticorpo do tipo uniforme. Mediante a cultura num meio se lectivo, em que as células de tumor não fusionadas morrem, as células de hibridoma, no entanto, multiplicam-se e, por apropriada manipulação, podem obter-se e cultivar-se clones, isto - 24 -

é, populações de células que derivam de uma única célula de hibridoma e são geneticamente idênticas e isolar os anticorpos monoclonais produzidos pelas células. A presente invenção refere-se a anticorpos mo noclonais contra Bhinovirus da estirpe HRV2 e da estirpe HRV89» a células de hibridomas que produzem esses anticorpos, ao pro cesso para a sua preparação e à sua utilização. Refere-se ain da a anticorpos monoclonais que se dirigem contra proteínas virais de acordo com a presente invenção, às células de hibri domas que as produzem, assim como ao processo para a sua preparação e à sua utilização. São preferidas as linhas de células de hibridoma e os anticorpos monoclonais que são segregados por estas, que reagem especificamente com as mencionadas proteínas virais ou com os seus fragmentos. 0 processo para a preparação de anticorpos monoclonais Anti-HRV2 e Anti-HRV89 caracteriza-se pelo facto de se imunizarem ratos com os Rhino virus ou as proteínas virais, fusionarem-se B-linfocitos de animais imunizados desta maneira com células de mieloma, clo-narem-se as células de hibridoma assim formadas, cultivarem-se depois in vitro ou por injecção em ratos e isolarem-se os anticorpos das culturas, A invenção refere-se ainda a colunas de croma tografia de imuno-afinidade e a estojos de ensaio para ensaios de imunidade, os quais contêm estes anticorpos.

De acordo com a presente invenção, imunizam--se ratos por exemplo, ratos Balb/c, procedendo de maneira em si conhecida. De acordo com a forma de realização preferida, injectam-se os rinovírus aproximadamente semanalmente ou também em intervalos de tempo maiores, durante várias semanas, por exemplo cinco a doze semanas, até se ter formado o número suficiente de linfácitos B, que produzem anticorpos.

Os 6rgãos que contêm linfocitos B, por exem-, pio, células do baço, dos ratos imunizados são retirados e fu 25

sionados com células de mieloma que não se desenvolvem no meio de cultura selectivo em virtude de uma mutação. Essas células de mieloma são conhecidas e são» por exemplo, as que têm as designaçdes de X63-Ag8, X63-Ag8.6.5«3» MPC-11, NSl-Ag^/l, MOPC-21 NS/l, NS/l (ATCC TIB 18) ou SP 2/0. De acordo com uma forma de realização preferida, fusionam-se células de baço de ratos imunizados com células de mieloma da linha de células NS-1 (ATCC TIB 18). A fusão das células realiza-se de acordo com processos em si conhecidos, por mistura dos linfácitoá B com as células de mieloma, com adição de um agente de fusão de cl lulas, como por exemplo polietilenoglicol, vírus Sendai, cloreto de cálcio ou lisolecitina. De preferência, a fusão reali za-se em presença de polietilenoglicol, por exemplo, com o pe so molecular compreendido entre 1 000 e k 000. Depois da fusão, os híbridos obtidos são cultivados de acordo com um processo em si conhecido, num meio de cultura selectivo, que é complementado com hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). As células de mieloma não fusionadas não se podem desen volver neste meio e morrem, assim como os linfácitos normais.

Os líquidos sobrenadantes das culturas do hi-bridoma podem ensaiar-se relativamente ao seu teor em anticor pos específicos, de acordo com processos em si conhecidos,por exemplo, por meio do ensaio de rádio-imunidade ou de aglutina ção. Dessa forma verificou-se surpreendentemente que se podem preparar células de hibridoma com o processo descrito, que se gregam especificamente anticorpos contra os Bhinovirus. As cé lulas de hibridoma que produzem anticorpos com a especificida de pretendida são seleccionadas a partir da mistura provenien te do fusionamento das mais diversas células de hibridoma por clonagem. Para esse efeito, preparam-se culturas a partir de uma ánica célula em desenvolvimento, de acordo com um processo em si conhecido, que é designado por processo de "diluição limitante". • Para a produção em massa, os clones de célu- 26 -

las de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade pretendida, ou são cultivados in vitro em meios em si conheci dos ou são injectados em ratos para multiplicação. De acordo com uma forma de realização preferida, injectam-se as células \ de hibridoma em ratos previamente tratados com Pristan, retira-se o líquido dos ascites e isolam-se os anticorpos por pre cipitação com solução de sulfato de amónio.

Os anticorpos monoclonais de acordo com a pre sente invenção dirigidos contra as proteínas dos rinovírus, por exemplo o anticorpo 8P5» podem empregar-se terapeuticamen te.

Os anticorpos dirigidos contra os Rhinovirus, obtidos com o auxílio destas células de hibridoma, podem ser utilizados de maneira em si conhecida para a preparação de co lunas de cromatografia de imuno-afinidade. De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, mistura--se um material de suporte apropriado (suspenso numa solução de tampão) com uma solução dos anticorpos, lavam-se em seguida os componentes não ligados e bloqueia-se a posição não ocu pada do material de suporte. Os anticorpos específicos, obtidos com auxílio das células do hibridoma, podem ser utilizados de maneira em si conhecida para a preparação de estojos de ensaio. Estes estojos de ensaio podem basear-se em vários métodos, como, por exemplo, no ensaio de rádio-imunidade, na aglutinação de látex , no ensaio de pontos, no ensaio de enzi ma-imunidade, no ensaio de imuno-fluorescência ou no ensaio imunoquímico da enzima. Estes estojos podem conter, além dos anticorpos correntes de diferentes origens, conjugados de anticorpos com enzimas ou veículos de fluorescência, por exemplo, de HRV2 ou de HRV89» marcado com isótopos radioactivos, como 125 I ou conjugado com enzimas, por exemplo, com peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina e, ainda, substractos de enzimas, tampões apropriados, geles, látex, polistireno ou outros mate riais de cargas e veículos.

Outras propriedades e características especí- 27 -

ficas da presente invenção são descritas nos seguintes Exemplos, que se referem a exemplos de realização da presente invenção e não limitam o respectivo âmbito de qualquer forma.

Se, no âmbito do presente Pedido de Patente , se fala de propriedades e/ou de actividade biológica em relação com proteínas (polipêptidos), então isso significa que a referida proteína (polipéptido) estimula, no ensaio biológico, uma resposta imune e/ou uma reacção de qualquer outro tipo com os receptores celulares para os Hbinovirus. Em resumo,são objecto da presente invençãos moléculas de DNA que codificam, pelo menos, uma proteína virai da estirpe de Hbinovirus HRV89» - que correspondem ao RNA virai total ou a partes do SNA virai da estirpe de Hbinovirus HRV89, - que codificam para uma proteína virai que se constitui a partir das proteínas virais VP1, VP2, VP3» VP^, P2A, P2B, P2C, P3A, P3B e P3C; - que codificam para uma proteína virai que consiste em, pelo menos, duas das proteínas acima mencionadas, ligadas uma com a outra em qualquer combinação; - ou moléculas de DNA que em si próprias codificam para as proteínas virais individuais.

As formas degeneradas e as moléculas de DNA que codificam alelos são igualmente objecto da presente inven ção. São preferidas as moléculas de DNA que corres pondem completamente ou em parte às sequências de acordo com a Pigura h e de acordo com a Pigura 19· São igualmente objecto da presente invenção . moléculas de DNA que codificam para, pelo menos, uma proteína 28

virai da estirpe de Rhinovirus HRV89, que, em condições estrin gentes que permitem reconhecer uma homologia que e maior do que 85%, se hibridizam com uma das moléculas de DNA indicadas ou com variações degeneradas destas moléculas. As moléculas de DNA de acordo com a presente invenção podem ser inseridas num veículo de expressão apropriado, por exemplo, num plasmí-dio que é replicável em microrganismos, de preferência, microrganismos procarioticos, microrganismos eucarióticos ou em células de mamíferos. Também são objecto da presente invenção as moléculas de DNA que codificam para proteínas que possuem a actividade biológica de, pelo menos, uma das proteínas de acordo com a presente invenção. São ainda objecto da presente invenção organismos hospedeiros transformados que contêm as informações ge néticas que codificam para as proteínas virais de acordo com a presente invenção, de preferência, organismos procarióticos, organismos eucarióticos ou linhas de células de mamíferos, em especial, E. ooli.

Nese caso a informação genética é de preferên cia contida em veículos que são replicáveis no organismo hospedeiro respectivo. São ainda objecto da presente invenção plasmí dios de expressão, por exemplo, pRH9ó9/l, pRH969/2 e pKK89/2A, que contêm inserido o DNA de polipéptidos que possuem a actividade biológica de, pelo menos uma das proteínas virais das estirpes de Rhinovirus HRV2 ou HRV89» em especial, de polipéptidos com a sequência de aminoácidos para VP1, VP2, VP3, VP4, P2A, P2B, P2C, P3A, P3B ou P3C, de preferência, com a sequência de aminoácidos de acordo com as Figuras k ou l4, ou suas partes, de polipéptidos que correspondem em parte ou totalmen te a pelo menos uma das proteínas virais das estirpes de Rhinovirus HRV2 ou HRV89» de polipéptidos que contêm acopladas, pelo menos, duas das proteínas virais em uma combinação qualquer e em uma sequência qualquer e de polipéptidos que deri- - 29 -

vam da sequência de aminoácidos de acordo com a Figura 4 ou Figura l4 ou de partes delas derivadas e/ou se ligam a recep-tores celulares, de preferência, com a sequência de aminoáci-dos de acordo com a Pigura 4 ou suas partes e/ou bloqueiam es tes, assim como os correspondentes poliplptidos. São ainda objecto da presente invenção polipe ptidos que possuem a actividade biológica de pelo menos uma das proteínas virais da estirpe dos Rhinovirus HRV89 e/ou são modificados por uma das moléculas de DNA descritas, em especial, poliplptidos com a sequência dos aminoácidos para VP1, VP2, VP3, VP4, P2A, P2B, P2C, P3A, P3B ou P3C, de preferencia com a sequência dos aminoácidos de acordo com a Pigura 4 ou partes deles derivados, poliplptidos que em partes ou totalmente correspondem a pelo menos uma das proteínas virais da estirpe de Rhinovirus HRVS9, poliplptidos que contêm acoplados pelo menos duas das proteínas virais em qualquer combinação e sequência e poliplptidos que são derivados da sequência de aminoácidos de acordo com a Figura 4 ou das suas partes e/ /6u se ligam aos receptores celulares para os Rhinovirus da es tirpe HRV89 e/ou bloqueiam estes.

As moléculas de DNA de acordo com a presente invenção ou são preparadas, para o que se isola o RNA virai da estirpe de Rhinovirus HRV89» se prepara o DNA complementar para ele, se insere o híbrido cDNA/RND num vector replicável apropriado e se transforma um organismo hospedeiro apropriado com este vector ou são preparadas por degradação enzimática de partes ou de cDNA completo e, eventualmente, por reacções de acoplamento com ligantes apropriados por síntese química de DNA ou por combinação de reacções enzimáticas e químicas.

Obtêm-se os poliplptidos de acordo com a presente invenção codificando um organismo hospedeiro apropriado, de preferência um organismo procariótico, um organismo euca-riático ou uma célula de mamífero, em especial, E. coli. com m • as informações genéticas de acordo com a presente invenção, 30 -

codificando para um polipéptido virai de acordo com a presente invenção, transformando e exprimindo a informação e isolan do um polipéptido virai de acordo com a presente invenção.

Os polipéptidos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para o tratamento terapêutico«por exemplo, para estimulação do sistema imune, para a ligação e/ou para o bloqueio dos receptores celulares para a estirpe de Rhinovirus HRV89 e para a preparação de anticorpos monoclo nais ou de anti-soros policlonais.

Os polipéptidos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados na preparação de composições com a forma de medicamentos que, juntamente com as substâncias au □ciliares ou veiculares farmaceuticamente inertes, contêm uma quantidade activa de, pelo menos, um dos polipéptidos de acor do com a presente invenção. São ainda objecto da presente invenção linhas de células híbridas que se obtêm por imunização com HRV2, HRV89 ou partes das suas proteínas virais, os anticorpos que se podem obter a partir destes híbridos, assim como a utiliza ção destes anticorpos não só para finalidades terapêuticas ou de diagnóstico mas também para a purificação das proteínas a que estão ligados.

Legendas das Figuras Figura 1 A Figura 1 representa a separação por electro forese das proteínas das membranas de HRV89 por um gel conten do 12,5% de poliacrilamida em presença de dodecil-sulfato de sódio. VPk não é visível porque esta proteína se desloca com a frente ao longo do gel. * Figura 2 31

-HNA num gel to de sõdio. dores de HNA A Figura 2 representa a electroforese de HRV89 de agarose a 1,2$, em presença de dodecil-sulfa-λ direitat estão indicadas as posições dos marca do ribosoma* A Figura 3 representa a carta de restrição do genoma de HRV89· Indicam-se vinte e um clones que se sobrepõem, que se empregam para o sequenciamento. Estão indicados os locais de corte característicos de algumas enzimas de restrição. As setas (a-d) indicam fragmentos representativos que foram utilizados como primários para a transcrição inversa.

Figura h

Esta Figura representa a sequência do genoma de HRV89 clonado e a sequência de aminoácidos dele derivada.

Os pontos de separação na poliproteína estão representados por setas. As setas a cheio ( φ ) indicam os locais de separação experimentalmente determinados; as setas abertas (φ) indicam, com base na homologia com outros Picoraavirus, os sítios de se paração previstos na poliproteína.

Figura 5 A Figura 5 mostra a comparação da homologia na sequência de aminoácidos (em percentagem) de genes individuais entre HRV89» HRV2, HRVl4 e Poliovirus do tipo 1.

Figura 6

Esta Figura representa as sequências de amino ácidos N-terminais das proteínas da membrana de HRV89.

Figura 7 • A Figura 7 representa o esquema de construção . para o plasmídio de expressão pRHlOO. 32 -

Figura 8 A Figura 8 representa a região de promotor/oge rador do triptofano, os sítios de ligação de ribosomas sintéticos (RBS) e o codão de iniciação do vector de expressão pRHlOO. Esta igualmente indicado o primário sequenciador (com dezassete monómeros) que foi empregado para a sequenciação do plasmídio de expressão pRH969/l· As letras pequenas e a numeração caracterizam a sequência de pBR322; as letras grandes representam a sequência inserida entre os nucleátidos de pBR322 número 1 e número 29·

Figura 9

Esta Figura representa um segmento da sequência do HRV2-cDNA entre os nucleotidos com os números 700 e 2 000* As srtas espessas curtas caracterizam a sequência de VP2 e as setas finas indicam os sítios de restrição mais importantes deste segmento.

Figura 10

Esta Figura representa o esquema de construção para o plasmídio de expressão pRH9í>9/l (NCR = "região não codificante" região não trasladada; trpp/o * região de promotor-operador de triptofano).

Figura 11

Esta Figura representa o resultado da expressão de 969/1 no sistema de maxicélulas GSR603» Os vestígios AI a Ak representam uma experiência "Western Blot", depois da coloração com NBT e BCIP. No vestígio AI, separou-se, como con trolo» a partícula HRY2 total desnaturada (cerca de 50 ng de HRV2). Nos vestígios Al e A^i separaram-se os lisados celulares das células CSRÓ03 da estirpe E. coli. transformada com o plasmídio pRH 969/1 (obtido a partir dos clones 307 e 319). , Como controlos negativos, no vestígio A3» separou-se o lisado 33 - da estirpe CSR603 de E. coli que se tinham transformado com o plasmídio do clone 224 (orientação invertida do insefrto 969/1)· 0 vestígio M mostra a coloração com azul-de-Coomassie das pro teínas marcadoras. Os vestígios B2 - B4 representam o auto-ra diograma dos vestígios A2 - a4. A Figura 12 representa o inserto do plasmídio pRH969/2.

Figura 13

Esta Figura mostra os sítios de ligação de 8F5 à proteína de revestimento virai VP2. Os números 1 - 261 da li nha superior referem-se à sequência de aminoácidos de VP2» os que se encontram por baixo da linha inferior referem-se às se quências de DNA do HRV2. 0 DNA e as sequências de aminoácidos no domínio dos sítios de ligação são representados com a indi cação exacta de cada anulação.

Figura l4

Esta Figura representa a sequência do genoma HRV2 clonado e a sequência de aminoácidos daí derivada. Os sí tios de separação na poliproteína são indicados por meio de setas. As setas a cheio indicam os sítios de separação determinados experimentalmente» as setas abertas designam» com base na homologia com outros Picornavirus, os sítios de separação previstos na poliproteína. A Figura 15 representa o esquema de constru ção para o plasmídio de expressão pRH969/2.

Figura 16 A Figura 16 representa o esquema de constru- - 34 -

ção para o plasmídio de expressão pKK89/2A. Figura 17

Esta Figura representa o polipêptido expresso pKK89/2A.

Figura 18

Esta Figura representa a comparação das sequências de aminoácidos e de nucleótidos da região dos genes para P3A e P3A (VPg) de HRV2 e HRV89. A posição do sítio de separação anteriormente mencionado com base na homologia com outros PicorUavirus é marcada com uma seta aberta.

Figura 19 A Figura 19 representa a comparação das sequências de nucleótidos da região 5' não trasladada de HRV2 e HRV89.

Figura 20

Esta Figura representa a comparação das sequências de aminoácidos no domínio das proteínas virais de HRV2 e HRY89.

Esclarecimentos sobre as Abreviaturas ABTS: AMPrs BCIPí BME : BPB : BSA : cccPlasmídio: . DE-81-papel j * DMEM í 2,2'-azino-di-(3-etil-benzotiazolino-sulfona to ) resistente a Ampicilina 5-cromo-4-cloro-3-indolil-fosfato B-mercapto-etanol azul de bromofenol albumina de soro de vitelo plasmídio "circular covalentemente fechado" papel de celulose-dietilaminoetilo Meio de Eagle modificado de Oulbecco - 35 -

dNTPs ί DTT J EDTA: FKS : g * HAT -Meio : HIFKS j HRV2 í mvik: IAA í kb : kd í Kl enow ( enz ima): Meio LB : M *. MEM : mM : ml : NBT : nm : OD600 * PBS : solução equimolar de todos os quatro desó xi-trifosfatos ditiotritol ácido etilenodiaminotetracético soro de feto de vitelo aceleração da gravidade meio de hipoxantina-timidina soro de feto de vitelo inaetivado pelo calor

Rhinovirus humano do tipo 2 Rhinovirus humano do tipo 1^ ácido /^-indol-acrílico quilobases quilodalton fragmento de Klenow da polimerase I de DNA meio de LB: meio de Luria-Bertani, que consiste em 1$> de uma digestão com suco pancreático de caseína de leite (Baeto-trypton), 0,5$> de extracto de levedura e 1% de NaCl em água destilada, que foi aque eido durante vinte minutos a 120°C em au-toclave. concentração da solução aquosa que contém, por litro, 1 mole da respectiva substância . meio essencial mínimo concentração duma solução aquosa que contém por litro 1 milimole da respectiva substância mililitro azul de nitro-tetrazolio nanometro densidade optica a 600 nm mistura aquosa de tampões, que contém,por litro, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1, 8 mM de NagHPO^, 1,5 mM de KH^PO^, 0,5 mM de MgCl„.6H 0 e 1 mM de CaCl e possui um - 36 -

PBS def · : PEG í PPU í rATP : RPMI-Meioí SDS j TE í T4-PNK : Tris : T¥EEN 20 s U ϊ pCi s pg t μΐ i p.M : VP1, 2, 3, b t YPO í XC s valor de pH igual a 7»^ como PBS, mas sem sais de Ca e de Mg poli etilenoglicol "unidades que formam placas"

ribo-ATP meio de Roswell Park Memorial Xnstitute dodecil-sulfato de sódio mistura aquosa de tampão, que contém, por litro, 10 milomoles de TrisHCl, pH = 7»^ e

1 mM de EDTA T4-polinuc1eõtidoquinase tris-hidroximetilamino-metano monolaurato de polioxietileno (20)-sorbi- tano unidad e microcurie micro grama microlitro concentração duma solução aquosa que contém, por litro, um micromole da substância referida proteína do revestimento virai VP1, 2, 3» 4. proteína preliminar virai das proteínas dos revestimentos VP2 e VP4 xilenocianol.

Exemplo 1

Preparação de HRV89

Cultivaram-se células HeLa (estirpe HeLa-Ohio, 03-1^7» Plov Laboratories, Inglaterra) em suspensão a 37°C. 0 meio de suspensão (Thomas, D. C., Conant, R. M. e Hamparian, V. U. 1970, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 122, 62 - 65J E. J. Stott e G. F. Heath, 1970, J. gen. Yirol, 6, 15 - 24) consis-' tia numa modificação de Joklic de MEM para suspensão (Gibco • 072-1300) e T/ο de soro de cavalo (Seromed 0135)· A densidade 37

— k , . da inoculação foi igual a 5 - 10 x 10 celulas/ml e o volume igual a 500 ml. Com uma densidade de células de 1 x 10^ célu-las/ml» centrifugou-se a suspensão em condições estéreis a 300 g durante dez minutos. Filtrou-se sob sucção o sobrenadan te e ressuspenderam-se as células em 100 ml de meio de infec-ção (modificação de Joklic de MEM para a cultura em suspensão com 2*/> de soro de cavalo e 2 níM de MgClg). Por cuidadosa aspi ração realizada várias vezes com uma pipeta de 20 ml» distribuíram- se as células homogeneamente no meio de cultura. Segui damente» diluiu-se até perfazer 500 ml. Em seguida» aqueceu--se a suspensão de células a 3^°C e infectou-se com HRV89(pia ca purificada duas vezes) com uma multiplicidade de 0,1 vírus/ /célula. A estirpe de HRV89 foi depositada na American Type Culture Colletion (aTCC VR-1199). Neutralizou-se a estirpe utilizada com anti-soro contra HRV89 (American Type Culture Collection, Cat. N* ATCC VR-1199 AS/GP).

Como soro de controlo, serviu um anti-soro HRV2 (Cat. NS ATCC VR-1112 AS/GP), que não demonstrou neutralização. Depois de sessenta horas a 3^°C, recolheu-se o vírus.

Obteve-se o vírus tanto a partir das células e dos fragmentos de células, como também a partir do meio. Pa ra esta finalidade, separou-se o meio de células infectadas e de fragmentos de células mediante centrifugação durante 10 mi nutos a 1500 g e filtrou-se sob sucção. Congelou-se o precipi tado a -70°C.

Juntaram-se os precipitados de células de 12 litros da cultura em suspensão, ressuspendeu-se em 40 ml de tampão TM (20 mM de Tris/HCl, pH = 7,5, 2 mM de MgCl^), colocou-se em gelo durante quinze minutos e, em seguida, abriram--se as células num homogeneizador Dounee e centrifugou-se a mistura durante trinta minutos a 6000 g. Lavou-se o precipita do em seguida ainda mais uma vez com 10 ml de tampão de TM. Reuniram-se os dois sobrenadantes e centrifugaram-se a 110000 . g durante três horas, para peletizar o vírus. Retomou-se o pe ] lete de vírus em 10 ml de tampão de KTMP (50 mM de KC1, 50 mM - 38 -

de Tris/HCl, pH = 7*5» 5 mM de MgClg, 2 mM de mercaptoetanol, 1 mM de puromicina, 0,5 mM de GTP) e, depois da adição de X50 g de DNase I (Sigma* isenta de ribonuclease), incubou-se durante uma hora em gelo· A partir do meio de infecção, precipitou-se o vírus sob agitação a 4°C com polietilenoglicol 6000 (PEG 6000{ Merk), a uma concentração de 7% e adicionou-se NaCl ate 450 mM (a· D. Korant, K. Lonberg-Holm, J. Noble e J. T· Stasny, 1972, Yirology 48, 71 - 86). Depois de quatro horas a frio, centrifugou-se o vírus durante trinta minutos a 1500 g, res-suspendeu-se o precipitado em 10 ml de tampão de KTMP que con tinha 75 PS de DNase X, incubou-se a mistura durante uma hora em banho de gelo e, em seguida, congelou-se a -70°C.

Reuniram-se as suspensões de vírus que foram obtidas a partir das células e a partir do meio, incubaram-se a 37 0 durante cinco minutos, arrefeceu-se por adição de 60 ml de tampão de TE frio (10 mM de Tris/HCl, pH == 7*4, 1 mM de EDTA) e, em seguida, em banho de gelo submeteu-se à acção de ultra-sons durante cinco minutos.

Em seguida, centrifugou-se a 6000 g durante trinta minutos. Ao resíduo adicionaram-se 920 ml de tampão de TE que continha 7$ de PEG e 450 mM de NaCl, agitou-se cuidado samente a 4°C durante quatro horas e peletizou-se o precipita do assim obtido durante trinta minutos a 6000 g. Retomou-se o precipitado de novo em 100 ml de tampão de TE, precipitou-se 0 vírus mediante adição de PEG 6000 e NaCl, como se referiu acima e peletizou-se. Ressuspendeu-se o precipitado em 40 ml de tampão de TM, centrifugou-se a suspensão a 6000 g durante trinta minutos e peletizou-se o vírus a 110 000 g durante três horas. Dissolveu-se o precipitado em 40 ml de tampão de TM, incubou-se durante uma hora a 4°C.depois da adição de 50 μg de DNase I e, em seguida, adicionou-se 1 ml de tampão de TE. Para posterior purificação, centrifugou-se a suspensão de ví-• rus usando gradientes de sacarose (10 - 30% em peso/peso em - 39 -

tampão de TE) durante quatro horas a 4°C e a 110 000 g. A par tlr da extinção a 260 nm, determinaram-se as fracções que con têm o vírus e diluiram-se com tampão de TM* de modo que a con centração final fosse igual a 10% em sacarose# Em seguida,cen trifugaram-se durante oito horas a 85 000 g. Retomou-se a pe-lete do vírus em 1 ml de tampão de TM e guardou-se a -70°C. Para se ensaiar a pureza da preparação de vírus» realizou-se um ensaio de electroforese usando um gel contendo 12,5% de po liacrilamida, em presença de 0,1% de dodecil-sulfato de sódio (Laemmli, U. K., 197°, Nature (Londres) 277♦ 680 - 685) e coloriram-se as bandas de proteína com azul brilhante de Coomas sie. Uma figura típica do modelo de coloração da proteína de uma preparação de HRV89 está representada na Figura 1,

Exemplo 2

Clonagem do Híbrido cDNA-RNA Extracção de RNA da Preparação de HRV89

Suspendeu-se o vírus num tampão de NTES (l ml) (lOO mH de NaCl, 10 mM de Tris/HCl, pH * 9. 1 mM de EDTA e 0,1% de dodecil-sulfato de sódio) e extraiu-se com fenol. Para se conseguir uma melhor separação de fases, adicionou-se clorofórmio. À fase aquosa adicionaram-se 20 jul de NaCl e 20 pl de acetato de sódio 3 M (pH « 5»6) e precipitou-se o RNA com um volume duplo de etanol.

Para eliminar VPg ligada covaientemente na ex tremidade 5’ do RNA virai, digeriu-se em seguida o RNA em tam pão de NTES com 1 mg/ml de proteinase K (Merck) durante quin-ze minutos a 37 0. Para eliminar contaminações de ribonuclea-se, prl-incubou-se a solução de proteinase K (50 mg/ml) antes de esta ser usada durante quinze minutos a 37°C· Depois de se terminar a digestão da proteinase K, extraiu-se a solução com fenol/clorofórmio, como se descreveu acima e precipitou-se o RNA por adição de etanol. Uma pequena parte do RNA foi, em se - kO -

guida, separada por electroforese num gel de agarose a 2ηο com tampão de TAE (10 mM de acetato de sódio» 40 mM de Tris/aceta to, pH = 8,2, 2 mM de EDTA) com 0,1 ήο de dodecil-sulfato de só dio. Depois de se corar com brometo de etídio, a banda do HRV89-RNA intacto tornou-se visível (Pigura 2). Uma banda difusa, pouco intensa, que fica por baixo indicou uma ligeira decomposição do RNA.

Transcrição Inversa do HRV89-RNA com Oligo-dT como Primário

Dissolveram-se 4 pg de HRV89-RNA em 10 ^μΐ de Η^Ο, adicionaram-se 5 /il de 10 x RT-tampão (l x RT-tampão=100 mM de KC1, 10 mM de MgCl2, 50 mM de Tris/HCl, pH = 8,3), 5 με de oligo-dT (12 - 18) (Pharmacia P-L Biochemicals), 10 μ0± de l pç p_7-dCTP (3000 Ci/mM, Amersham International, Inglaterra), 100 U de transcriptase inversa (Anglian Biotechnology Co.,Cam bridge) e respectivamente 20 nmoles de cada um de dATP, dGTP, dTTP, dCTP e incubou-se num volume total de 50 11I durante duas horas a kZ°C.

Depois de se adicionarem 2 μΐ de solução 250 mM de EDTA (pH « 8), extraiu-se com fenol/clorofórmio e intro duziu-se a fase aquosa numa coluna de p30 Biogel (ou Sephadex G-25) com uma pipeta de Pasteur. Para eluir, utilizou-se um tampão de TE. Separou-se o híbrido cDNA-RNA assim formado do excesso de / p_/-dCTP e depois de se adicionar l/lO partes em volume de acetato de sódio 3 M (pH =5,6) e duas partes em volume de etanol, precipitou-se.

Prolongamento com Homopolímero do Híbrido HRV89-RNA-cDNA ("Cauda”) 0 prolongamento do híbrido HRV89-RNA-CDNA rea lizou-se de acordo com o método de Roychoudhury e Wu (1980, loc. cit.). Para isso, inGUbou-se o híbrido HRV89-RNA-cDNA em 50 ;ul de tampão TT (200 mM de cacodilato de potássio, 25 mM l de Tris/HCl, pH =6,9, 2 mM de MnCl9, 2 mM de ditiotritol, em ^ presença de 2 nmole / of p_7*dCTP (5 Ci/mMole) com 25 U de - 4l -

transferase terminal (Pharmacia P-L Biochemicals), durante cinco minutos a 37°C (G. R» Deng e R. Wu» 1983, Methods Enzy-mol.» Vol. 100, Parte B, 96 - ll6). Depois de se adicionarem 2 pl de EDTA 0,25 M (pH 8), extraiu-se com f enol/clorof érmio que em seguida se cromatografou numa coluna Biogel P30, como se descreveu acima, e precipitou-se com etanol o híbrido RNA--cDNA que possuia o oligo-dC.

Inserção do Híbrido HRV89-RNA-CDNA que Possui o Oligo-dC no Plasmídio pBR322 ("Recogimento" ) e Transformação de Escheri-chia coli HB101

Em 100 pl de tampão de NTE (100 mM de NaCl, 10 mM de Tris/HCl, pH = 7*6, 1 mM de EDTA) cortou-se o híbrido RNA-cDNA que possui oligo-dC com 0,3 pmole de plasmídio pBR322 (que foi cortado com PstI e polimerizado com radicais oligo-dG; Bethesda Research Laboratories) e aqueceu-se primei ramente durante cinco minutos a 65°C e depois durante duas ho ras a h2°Q, deixou-se arrefecer lentamente ate à temperatura ambiente durante a noite e guardou-se a 4°C,

Para a transformação das células, cultivou-se a estirpe HB101 (DSM 1607) em 5o ml de meio LB (lO gramas de triptona, 5 gramas de extracto de levedura, 10 gramas de NaCl em 1 litro) (m. Mandei e A» Higa, 1979* J· Mol. Biol. 53, 159“ - 162). para se obter a transformação das células apropriadas ("células competentes") peletizaram-se as bactérias e retomaram-se com 25 ml de tampão TR (l50 mM de KC1, 50 mM de CaClg, 1 mM de Tris/HCl, pH = 7» 3 mM de MgClg), colocou-se durante trinta minutos em gelo, centrifugou-se de novo, ressuspendeu--se novamente em 2 ml de tampão TR e colocou-se em gelo duran te uma hora, A 200 pl da suspensão de células, adicionaram-se 100 pl da mistura que continha pBR322 com o híbrido HRV89-RNA--cDNA inserido e adicionaram-se 5 yal de CaCl^ 1 M e incubou--se durante uma hora a 0°C e, em seguida, durante noventa segundos a 42°C. Em seguida, adicionaram-se 2 ml de mexo de LB frio e incubou-se a 37°C durante quinze minutos. Colocou-se a - kZ -

suspensão de células sobre placas de LB-agar (l,5$ de agar em meio de LB) que continha 10 jig/ml de Tetraciclina (Sigma) e incubou-se durante a noite.

Em seguida, os clones resistentes a tetraciclina foram ensaiados em placas de Ampicilina-agar (lOO μg de Ampicilina/ml; Sigma) relativamente à sensibilidade à Ampici-1Í.Q&. ·

Caracterização e Isolamento das Moléculas de DNA Recombinanfces

Cultivaram-se clones de bactérias resistentes a Tetraciclina e sensíveis a Ampicilina em 6 ml de meio LB (lO jJLg de Tetraciclina/ml) durante a noite, isolou-se o plasmídio de DNA de acordo com a "técnica de preparação de miniplasmí-dio" (H, C. Bimboim e J. Doly, 1979» Nucleic Acids Res. 2.f 1195 - 12.0b) e determinou-se o tamanho do DNA recombinante por digestão com a enzima de restrição PstX. Incubou-se o pLas mídio-DNA em 25 pl de tampão RE (6 mM de MgCl^» 10 mM de Tris/ /HC1, pH 7*5» 6 mM de mercaptoetanol) com NaCl 50 mM, em presença de 2 U da enzima de restrição PstI (Bethesda Research Laboratories) e 5 pg de ribonuclease A durante duas horas a 37°C. Em seguida, separaram-se as amostras por electroforese em gel de agarose a 1,4$. Por còramento com brometo de etídio e comparação com DNA lambda-HindIII-marcador, foi possível de terminar os tamanhos das inserções. Estas estavam compreendidas entre 300 e 3300 pares de bases.

Para se isolarem maiores quantidades dos DNA--insertos, obtiveram-se plasmídios, procedendo como acima se descreveu, a partir de 200ml de culturas de clones de bactérias resistentes a Tetraciclina e sensíveis a Ampicilina e di geriram-se com PstI, Separaram-se os fragmentos de DNA recom-binantes, como se descreveu acima, sobre gel de agarose prepa rativo, cortaram-se as bandas, electro-eluiu-se o DNA em 0,5x tampão TBE (l x TBE-tampão = 100 mM de Tris/borato, pH = 8,3» ] 2 mM de EDTA) e precipitou-se com etanol. - 43 -

Subclonagetn em Células de Esch.erich.ia coli Estirpe JM101, co_!!? o Auxílio do Vector pUC9 0 plasmídio pUC9 (J. Vieisa e J. G. Messing, 1982, Gene 3j), 259 - 268) contém um gene para a resistência a Ampicilina, uma região para o começo da replicação, que derivam do plasmídio pBR322 e uma parte do Lac-Z-gene de E. coli». Um segmento de DNA mais pequeno, que contém uma série de sítios de restrição encontra-se nesta região Lac-Z, de modo que a clonagem de DNA num destes sítios de oorte acomoda a região do gene Lac-Z. As colónias que contêm os insertos de DNA são, portanto, evidenciadas em X-Gal *» 5~Lromo-^-cloro-3-indolil-- /$ -D-galactósido, Bethesda Research Laboratories) como placas indicadoras como brancas e aquelas sem insertos aparecem de cor azul (u. Ruther, 1980, Mol. Gen. Genet. 178« 475 - **78). Para se subclonar insertos de DNA em pUC9» digeriram-se clo-nes pBR322 recombinantes (cerca de 7 J&g) com PstI e, depois da separação em gel de agarose (l,2$ - 1,4$), separaram-se os insertos de DNA do vector-DNA. 0 DNA foi obtido a partir de um gel, como se descreveu acima, por electro-eluição e precipitação com etanol. 0 DNA-inserto isolado foi incubado com 0,4 p.g de pUC9-vector (cortado com PstI e previamente tratado com fosfatase alcalina bacteriana), em presença de ATP 1 mM e 3 U de T^-ligase (Bethesda Research Laboratories) durante uma hora a 15°C e guardou-se a 4°C (j. Vieisa e J. G. Messing, 1982, loc* cit.). Simultaneamente, obtiveram-se células de E. coli estirpe JM101, que eram competentes para a transformação, pro cedendo como se descreveu acima. Misturaram-se 200 μΐ da suspensão de células competentes com 20 μΐ de mistura da reacção pUC9~ligase e incubaram-se a 0°C durante uma hora.

Depois de um choque térmico (noventa segundos 42° C), as células foram incubadas com 10 μΐ de isopropil-tio -galactósido 200 mM (sigma), 50 μΐ de uma solução de 20 mg de X-Gal em 1 ml de dimetil-formamida e misturaram-se com 1 ml de meio de LB e incubou-se a 37°C durante uma hora. Transferi ram-se 200 μΐ desta suspensão de células, em seguida, cada uma - 44 -

para uma placa de Ampicilina-RB-agar (lOO jig/ml) e incubou-se durante uma noite a 37° C numa estufa Brut. Identificaram-se os transformantes positivos como colónias brancas que são ensaiadas relativamente aos insertos de DNA com o auxílio da ntécnica de preparação de miniplasmídio11.

Preparação de Plasmídios pUC9 com Insertos de DNA Recombinante

Cultivaram-se os subclones assim obtidos deE. coli JM101 que foram transformados com pUC9 e continham inser tos de DNA, em 200 ml de meio de LB (com 100 pg de Ampicilina/ ml) e isolou-se o plasmídio-DNA (H. C. Birnboim e J. Doly, 1979» loc. cit.). Em seguida, dissolveu-se o plasmídio-DNA em 100 pl de tampão TE e cromatografou-se a solução numa coluna contendo Sephacry1-1000 (l x 20 em) com tampão TE. As fracções que continham o plasmídio purificado foram localizadas com ba se na extinção, reunidas e liofilizadas. 0 plasmídio foi reto mado em 500 μΐ de tampão de TE, incubando a 65°C durante cinco minutos e extraiu-se mais uma vez com fenol/clorofórmio e precipitado em etanol.

Obtenção de Fragmentos Primários a partir dos Plasmídios pHRV89-100, pHRV89-136, pHRV89-193 e Processos de Síntese

Subclonaram-se em pUC9 clones 100, 136 e 193 que continham os correspondentes insertos de DNA, cultivaram--se em 200 ml de meio LB (com 100 pg de Ampicilina/ml) e isolaram-se os plasmídios como se descreveu acima. 0 fragmento primário (com cinquenta e quatro nucleótidos) do clone 100 fod obtido por digestão com as enzimas de restrição Ncol e PvuII (o fragmento primário é designado na Figura 3 como fragmento A). Para esta finalidade, incubaram-se 200 pg de plasmídio pu rificado do clone 100 em 200 pl de tampão de RE, em presença de 50 mM de NaCl com 30 U de Ncol (New England Biolabs.) durante quinze horas a 37°C. Depois de a reacção terminar, precipitou-se com etanol e incubou-se o plasmídio cortado em 100 yl de tampão de RE em presença de 50 mM de NaCl com 20 U de - 45 -

PvuIX (New England Biolabs.) durante quinze horas, a 37°C. 0 prosseguimento da digestão com as enzimas de restrição foi seguido por electroforese em gel de agarose a 1,4%, O fragmen to de Ncol/PvuII foi retomado em 100pl de solução de OG (l% de Ficoll, 1 mM EDTA, 0,01% de Laranja G) e o DNA foi separado num gel de poliacrilamida a 15% preparativo (acrilamida/ bis-acrilamida =19 * 1» espessura de gel = 1,2 mm) em 1 xtam pão de TBE. As bandas que correspondiam à peça de corte com cinquenta e quatro bases Ncol/PvuII foi cortada depois de coloração com brometo de etídio, electro-eluiu-se o fragmento com tampão 0,5 x TBE e o DNA foi precipitado com etanol.O fra gmento de DNA foi, em seguida, incubado em 50 μΐ de solução 100 mM de Tris/HCl, pH 8, com 200 U de fosfatase alcalina ba-cteriana (Bethesda Research Laboratories) durante uma hora, a 65°C. Depois de a reacção ter terminado, adicionaram-se 2,5 f* de 0,5 EDTA M, pH 8, extraiu-se a fase aquosa por duas vezes com fenol/clorofórmio e precipitou-se o DNA por precipita ção com etanol. Dissolveu-se o DNA em água e incubou-se em 50 ul de tampão de K (lO mM de MgCl_, 50 mM de Tris/HCl, pH 8, 5 ' » ^ΛΛ ^ mM de ditioeritrite) com 20 /iCi de P_7*ATP (actividade específica 5000 Ci/mmole; Amersham International) e 5 U de po llnucleotidoquinase (Pharmacia-PL Laboratories) a 37°C durante trinta minutos. Em seguida, precipitou-se o fragmento mar-cado com P e retomou-se em 30 jql de sulfáxido de dimetilo a 30% que continha 1 mM de EDTA e 0,01% de xilenocianol/azul de bromofenol. Incubou-se esta solução a 90°C durante dois minutos, arrefeceu-se em gelo, introduziu-se sobre gel de poliacrilamida a 15% (acrilamida/bis-acrilamida =59 : 1, espessura do gel = 1,2 mm) em tampão de TBE e separaram-se as duas hélices de DNA uma da outra por electroforese (quinze horas a 200 volt). Com base no auto-radiograma, localizaram-se ambas as hélices, cortaram-se e electro-eluiram-se, A hélice hibri-dada com HRV89-RNA foi determinada por uma experiência de "dot--blot" . *ara esse efeito, utilizaram-se duas friras de nitroce lulose com 2 x 2 cm de tamanho (Schleicher & Schull, BA 85» 0,45 jim) humedecidas com água, la vou-se uma vez com 20 x SSC (l x SSC = 150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de sádio, pH 7,4) e secou-se ao ar. Sobre cada fita, colocou-se uma amostra com - 46 -

o tamanho de um ponto de cerca de 1 ^íig de HRV89-HNA e incubou -se a 80°C durante duas horas. Em seguida, humedeceram-se as duas fitas com 2 x SSC e desnaturaram-se numa folha de plásti co em conjunto com 1 ml de tampão de H (hoo mM de NaCl, 4o mM de PIPES, pH * 6,k, 1 mM de EDTA, 8C$> de formamida) com h jig de Lachsspermien-DNA (Sigmaj incubou-se a 100°C durante dois minutos e arrefeceu-se a 0°C) e incubou-se a h2°C durante uma hora. Em seguida, soldaram-se as duas fitas de nitrocelulose com cada uma 0,5 rol de tampão H, k μΐ de Lachsspermien-DNA desnaturado, cada um com uma alíquota da hélice isolada (20000 cpm) em folhas de plástico e hibridizou-se durante a noite a ^2°C. Depois desta incubação, lavaram-se os filtros duas vezes com 2 x SSC durante dez minutos a 50°C e duas vezes com 0,1 x SSC, 0,1 °/o de dodecil-sulfato de sádio a 50°C durante trinta minutos e determinou-se a radioactividade.

Isolaram-se de igual maneira os fragmentos primários de HRV89-136 e HRV89-193· 0 fragmento de pHRV89-136 (designado na Figura 3 como Fragmento B) fica entre um sítio de restrição com Dral e um sítio de restrição com HindlII (cen to e vinte e dois nucleotidos) e foi obtido por digestão com estas enzimas de restrição· Isolou-se o fragmento C de pHRV--I93» o qual tem um comprimento de cento e trinta e nove nu-cleátidos e fica entre dois sítios de restrição Rsal (Figura 3). A separação das hélices e a hibridização realizaram-se co mo se descreveu acima· Sintetizou-se quimicamente o primário D, de acordo com métodos estabelecidos, num aparelho de Applied Biosystems.

Transcrição Inversa de HRV89-RNA com o Auxílio de Fragmentos Primários

Isolaram-se 5 pmoles do DNA de hélice única complementar de HRV89-RNA, como se descreveu acima, a partir dos clones 100 (Fragmento a), 136 (Fragmento B) e 193 (Fragmento C) ou sintetizaram-se quimicamente e foram respectiva- • mente precipitados em conjunto com 0,25 pmole do HRV89-BNA a • partir de uma solução aquosa com etanol. Retomou-se o precipi - k? -

tado em 20 μΐ de tampão de H, soldou-se num capilar, incubou--se a 72°C durante dez minutos, transferiu-se a 50°C, arrefeceu-se lentamente até 35° C e em seguida colocou-se em gelo. A solução foi então incubada a 42°C durante duas horas no seio de 100 jil de tampão de ET em presença de l4o TJ de transcripta se inversa (Anglian Biotechnolõgy Co., Cambridge), 8 U de ini bidor de ribonuelease (RNasin, Bethesda Research Laboratories) e respectivamente com solução 0,2 mM de cada uma de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 30 /íCi /^32P_7“dCTP e 5 mM de ditioeritrite. Processou-se o transcrito inverso assim obtido como se descre veu acima.

Detecção das sequências de HRV89 em DNA Recombinante e Formação da Carta de Restrição

Isolou-se plasmídio-DNA dos recombinantes de 3 ml de cultura (H. C. Bimboim e J. Doly, 1979» loc. cit.). Incubou-se o DNA, em seguida, com a enzima de restrição PstI e analizaram-se as amostras por electroforese em gel de agaro-se a 1,4$. Os geles foram corados com brometo de etídio. Em seguida, transferiu-se o DNA do gel para o filtro de nitroce-lulose (Southern, E. M., 1975, J· Mol. Biol., <?8, 503 - 517) e fixou-se sobre a nitrocelulose por meio de uma incubação a 80° C durante duas horas. Prê-incubaram-se os filtros em 50$ de formamida, 1 x solução de Denhardt (D. T. Denhardt, 1966, Biochem. Biophys. Res. Comm., 22, 64l - 646), 900 mM de NaCl, 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,4, 5 mM de EDTA com 80 fig/ml de Lachsspermien-DNA, a 42°C durante duas horas, numa folha de plástico. Preparou-se HRV89-cDNA radioactivo, como se descreveu acima; a mistura reaccional continha apenas 50 ;uCi de 7~0(-^2p 7”dCTP. Desnaturou-se o híbrido cDNA-HRV89-ENA a 100° C durante noventa segundos. Para a hibridação, incubaram-se os filtros com HRV89-CDNA radioactivo, como se descreveu acima, a 42°C durante dezoito horas e, em seguida, lavou-se por duas vezes em 2 x SSC e duas vezes em dodecil-sulfato de sódio a 0,1$ a 50°C durante trinta minutos, secou-se ao ar e ex . pôs-se a -70°C (Kodak XAR-5» com folha espessa, durante 18-40 - 48

horas)· 0 aparecimento de uma banda radioactiva mostrou a exis tência de DNA recombinante que era complementar em relação a HRV89-RNA.

Para o estabelecimento da carta» digeriram-se os insertos de DNA com a utilização de enzimas de restrição (New England Biolabs e Bethesda Research Laboratories), tendo -se usado as condições de incubação indicadas pelos fabricantes. 0 resultado da formação da carta de restrição está repre sentado na Figura 3· Os plsmídios pHRV89-80 e pHRV89“82 continham - imediatamente a seguir ao oligo-C, que é dirigido pa ra o alongamento da cadeia por meio da reacção com transfera-se terminal - uma sequência mais longa de radicais A, que representam uma parte do poli-A do terminal 3' õe HRV89-RNA. Os outros plasmldios foram ordenados relativamente a pHRV89-80 e pHRV89-82, com o auxilio de enzimas de restrição individuais de sítios de separação caracterlsticos. Os insertos de DNA que eram menores do que quinhentos pares de bases foram ordenados não por meio da formação da carta das enzimas de restri ção mas foram imediatamente subclonados em pCU9 e sequência-dos (veja-se Exemplo 3)· Obtem-se a identificação dos restantes clones por hibridização das colánias com utilização de in sertos de DNA já encartados como amostra de "translação de Nick", de acordo com o método de Grunstein e Hogness (M. Grun stein e D. S. Hogness, 1975» Proc· Natl. Acad. Sei. USA 72.

Op 3961 - 3965). Obt êm-se amostras de DNA marcadas com J P com.o auxilio de um estojo de "Translação de Nick" da firma Amersbam International (Inglaterra} estojo Amersham N* 5000), de acordo com as indicações do fabricante com / ρς-·^Ρ_7**<30ΤΡ (3000 Ci/mmole). Separou-se o DNA marcado com uma coluna Biogel-p--30 com uma pipeta de Pasteur em tampão de TE. Reuniram-se as fraeções que correspondiam ao volume de exclusão, aqueceram--se a 100°C durante dois minutos e despejaram-se rapidamente em água com gelo. Realizou-se a hibridização como se descreveu acima. Das colónias que apresentaram sinal positivo de hi bridização, prepararam-se culturas de 50 ml (durante a noite,

* em meio de LB com 10 jig de Tetraciclina/ml) e do plasmldio-DNA • isolaram-se os insertos de DNA com PstI. Estas, em seguida, - b9 - ersimesar;

foram caracterizadas por digestão com diferentes enzimas de restrição e por sequenciamento. Desta maneira, obtiveram-se clones que representam o genoma de HRV89,

Exemplo 3

Sequenciamento de DNA

Sequenciaram-se clones de cDNA procedendo de acordo com uma modificação do método de Maxam e Glibert (A.Ma xam e V. Gilbert, 1980, Methods Enzymol. 65., 499 - 56θ) e de acordo com o método de interrupção da cadeia M13» de acordo com Sanger e col. (p. Sanger, S. Nicklen e A. R. Coulsen, 1977» Proc. Natl. Acad. Sei. USA £4, 5463 - 5467).

Para o sequenciamento de acordo com o método de Maxam e Gilbert, subclonaram-se em bCU9 insertos de DNA, como se descreveu acima, e, com isso, transformaram-se células competentes de E. coli JM101. Isolaram-se os transforman-tes positivos sob a forma de colánias brancas e cultivaram-se em meio de LB (com lOOpg/ml de Ampicilina). Digeriram·;·se 10-- 20 pg de DNA em 100 pl durante a noite sob as condições nor mais de realização da reacção com enzimas de restrição que pos suem um sítio de separação no plasmídio, por exemplo, na região poliligante de pCU9 (por exemplo, BamHI, EcoRI, Accl, HindIIl). Desfosforilou-se em seguida o fragmento restringido. Para a digestão de restrição, adicionaram-se 5 pl de solução 2 M de Tris/HCl, pH 8, e 100 U de fosfatase bacteriana alcali na (Bethesda Research Laboratories) e incubou-se a 65°C duran te três horas. Depois de se adicionar EDTA até uma concentração de 20 mM, extraiu-se por duas vezes com fenol/clorofórmio e precipitou-se o DNA com etanol. Em seguida, incubou-se o DNA em 50 pl de solução 50 mM de Tris/HCl, pH8, 10 mM de MgCl^, 5 mM de ditioeritrite com 25 pCi / |Je-'*2P_7“ATP (5000 Ci/mMole, Amersham International) e 4 U de T^-polinucleotidoqiiinase (Pharmacia-P.L. Biochemicals) a 37°C durante trinta minutos e • precipitou-se o DNA marcado com etanol. Com o auxílio de uma - 50 -

outra enzima de restrição, que corta na região do poliligante de pCU9, obteve-se DNA recombinante que estava marcado numa das hélices com ^2P, por electrofores» em gel de agarose (l»2-- 1,4$) com electro-eluição subsequente e precipitação com eta nol, como se descreveu acima.

Sequenciamento de DNA, de acordo com uma Modificação do Méto-do de Maxam e Gilbert

Realizou-se a reacção de sequenciamento com a seguinte modificação, de acordo com Maxam e Gilbert (a. Maxam e W. Gilbert, 1980, loc» cit.) í Não se adicionou veículo-DNA. A solução de DNA foi subdividida em partes alíquotass reacção específica para a guanina (g) 7»5 μ1> reacção específica para a guanina e adenina (g/a) 10 μΐ; reacção específica para a citosina e timina (c/T) 10 jil} reacção específica para a citosina (C) 6 μΐ. Ã amostra para a reacção de (g/a) adicionaram-se 25 μΐ de ácido fórmico a 96$ e incubou-se a mistura a 19° C durante 4,25 minutos. Para se interromper a reacção, adicionaram--se 200 |xl de solução de interrupção de hidrazina e 750 ;ul de etanol a 96$· Efectuaram-se depois as reacções de (g/a) de maneira igual â das outras três reacções, - Em vez de hidrazina, utilizou-se hidróxido de hidrazina (Merck) nas reacções (c/τ) e C. Os tempos de reacção foram de 7,5 minutos.

Incubaram-se as misturas reaccionais de piperidina durante trinta minutos a 95°C. Depois da liofilização, aqueceram--se a 95°C durante noventa segundos os fragmentos em 3-20^il de tampão (80$ de formamida desionizada, 1 x TBE, 0,05$ de azul de bromofenol e 0,05$ de xileno-cianol) e arrefeceu--se rapidamente até 0°C. 51

Para o sequenclamento empregaram-se geles de poliacrilamida a 6% (40 x 20 cm x 0,4 mm) com ureia 8 M e 1 x TBE que foram submetidos a uma electroforese durante uma hora a 50 Watt antes da aplicação da amostra. Aplicaram-se entre 1 pl e 3 pl de cada mistura reaccional ao gel. Normalmente, rea lizaram-se dois carregamentos do gel distanciados no tempo. 0 primeiro tratamento do gel na mistura reaccional durou até se atingir o marcador de azul de bromofenòl e o segundo até o marcador de xileno-cianol ter atingido a extremidade do gel. Em seguida, os geles foram fixados durante vinte minutos em ácido acético a 10% e 10% de metanol (cerca de dois litros), transferidos para papel de filtro 3 MM e secos a 80°C até se ohter o gel seco. Em seguida, expuseram-se os geles sem folha de reforço a -70°C, com utilização de uma pelxcula XAR (Kodak) (cerca de 18 a 36 horas).

Sequenciamento ML3

Sequenciaram-se os insertos de DNA com um tamanho maior do que 1000 bp, de acordo com o método de "shot-gun" (P. L. Deininger, 1983» Anal. Biochem. 129, 216 - 223)· Para isso, digeriram-se clones recombinantes com enzimas de restrição apropriados, isolaram-se os insertos de DNA como se descreveu acima, por separação em gel de agarose preparativo (l,2 - 1,4%) com subsequente electro-eluição e precipitação com etanol.

Em 20 pl de tampão de RE, incubaram-se os insertos de DNA em presença de 1 mM de ATP e 3 U de T^-DNA-liga se (New England Biolabs), a l4°C durante quinze horas. Diluiu -se o DNA circularizado com tampão de TE (10 mM de Tris/HCl, pH 7» 5» 1 mM de EDTA) até um volume final de 500 jil, submeteu -se à acção de ultra-sons sob arrefecimento com gelo (quatro vezes durante quinze segundos com o máximo de energia} unidade de potência de ultra-sons MSE) e precipitou-se com etanol. . Xncubaram-se as extremidades dos fragmentos de | DNA assim obtidos em 20 pl de tampão de RE, que era respecti- 52 -

vamente 50 uM em dATP» dCTP» dGTP e dTTP e continha 2 U de fra gmento de Klenow (Boehringer Nannheim) a lk°G durante duas ho ras. Depois de separação em gel de agarose (l,4$) , os fragmen tos de DNA com tamanho de 400 - £00 bp foram recuperados por electro-eluição e precipitação com etanol. Inseriram-se estes fragmentos de DNA no vector Ml3 mp9, que se tinha linearizado com a enzima de restrição Smal e tratado com fosfatase bacte-riana alcalina (inserto : vector =5 8 l)» em presença de solução 1 mM de ATP e 1 U de T^-DNA-ligase (quinze horas a 15°C).

Para a transformação de células competentes E. ooli estirpe JM101, incubaram-se com a mistura de reac-ção de ligase a 0°, pelo menos durante duas horas. Depois de um choque de aquecimento (noventa segundos, 42°c), temperaram -se as células com 40 p.1 de 100 mM de IPTG, 40 pl de uma solu ção de 2$ X-Gal em DMP e 3 ml de Top-agar (lO gramas de trip-ton, 8 gramas de NaCl, 8 gramas de agar em 1 litro), que se fundiu e se temperou a 42°C» misturou-se e aplicou-se sobre placas H prèviamente aquecidas (lO gramas de tripton, 8 gramas de NaCl, 12 gramas de agar em 1 litro). Depois de o Top--agar começar a solidificar, incubaram-se as placas a 37° 0 du rante a noite.

Para o isolamento dos fagos de DNA de hélice única, transferiu-se uma placa incolor por sua vez para um tu bo de ensaio com 1,5 ml de uma cultura diluída de E. coli JM101 (l ml de cultura estacionária em 100 ml de meio 2 x Ty diluído) (l6 gramas de tripton, 10 gramas de extracto de levedura, 5 gramas de NaCl em 1 litro). Depois de uma incubação durante seis horas a 37°C, centrifugaram-se as bactérias e preeipita-ram-se os fagos do liquido sobrenadante por adição de 200 pl numa solução a 20$ de PEG 8000, 2,5 M de NaCl, durante quinze minutos â temperatura ambiente. Peletizou-se o precipitado e separou-se o resíduo sem deixar resto. Dissolveu-se a pelete em 100 pl de tampão de TE, extraiu-se com fenol/clorofúrmio, como já se descreveu - e precipitou-se o DNA de hélice única a partir da fase aquosa com acetato de Na/etanol. 0 tamanho - 53 -

de cada DNA de hélice única foi determinado por electroforese em gel de agarose a 0,8$ relativamente a DNA-fagos do tipo selvagem. 0 sequenciamento realizou-se sem modificações, de acordo com o método de interrupção da cadeia (F. Sanger, S. Nicklen e A. S. Coulsen, 1977» loc. cit.).

Análise dos Dados de Sequenciamento

Analisaram-se os resultados do sequenciamento com o auxílio de um computador Cyber 170. Neste, utilizou-se o programa de Staden (r. Staden, 1980, Nucleic Acids Res. 8, 3673 - 369^) e as formas de programa modificadas por Isono (k. Zsono, 1982, Nucleic Acids Res. 10, 85 - 89)·

Exemplo 4

Posições de Corte Proteolíticas na Região da Proteína PI da Membrana da Poliproteína

Obtêm-se as proteínas virais por separação pro teolítica a partir da poliproteína. Para identificar os sítios de corte, isolaram-se as proteínas da membrana virai e determinou-se a sequência de aminoácidos N-terminais. Para esta fi nalidade, separaram-se as proteínas de 2 mg de HRV89 por electroforese num gel de poliacrilamida a 12,5$ (Laemmli, U. K., 1970, loc. cit.). Os geles foram corados com uma solução satu rada de azul-brilhante-de-Coomassie em solução 50 mM de Tris/ CHI, pH a 7,4 e cortaram-se as bandas das proteínas. As proteínas individuais foram electro-eluidas num aparelho de elui ção ISCO, a 50 V durante dezasseis horas e precipitadas com ácido tricloro-acético. Determinaram-se os aminoácidos N-ter-minais com o auxílio de um seccionador de proteínas AB-470A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA). Para o sequenciamento, utilizaram-se, de cada vez, 2 nmoles de VP1 e "VP2 e 1 nmole de VP3· Analisaram-se os aminoácidos derivatizados por meio de cromatografia em fase líquida sob alta pressão,As sequências N-terminais das proteínas individuais são as indicadas na Figura 6. - 54 -

Exemplo 5

Construção do plasmídio de Expressão pKHlOO

Realizaram-se todas as reacções enzimáticas de acordo com as condições indicadas pelos fabricantes.

Linearizaram-se 7 PS do plasmídio pER103 (Eva Dworkin-Rastl e col., 1983» Gene 21, 237 " 248; Pedido de Patente Europeia A-0 115 613) em 50 jil de meio reaccional com a endonuclease de restrição HindIII. Depois de uma incubação a 37°C durante uma hora, adicionaram-se 50 pl de 2 x tampão de ClP (2 x tampão de CIP = 20 mM de Tris, pH =9,2, 0,2 mM de EDTA). Por adição de 2 U de fosfátase alcalina de intestino de vitelo (CIP), eliminaram-se os radicais de fosfato 5'-terminais; incubaram-se a 45° durante trinta minutos. Interrompeu-se a reacção por adição de 4 ^1 de solução 0,5 M de EDTA, assim como por adição de 10 pl de solução 1 M de Tris, pH = 8.0. As proteínas foram eliminadas por extracção por duas vezes com fenol e por uma vez com fenol/clorofórmio. Precipitou -se o DNA da fase aquosa por adição de 0,1 volume de solução 3 M de acetato de sódio, pH =* 5,5 e 250 pl de etanol, lavou--se o precipitado de DNA depois da centrifugação, uma vez com solução a 7Cf}o de etanol. Secou-se o DNA e, em seguida, dissol veu-se a pelete em 20 pl de tampão de TE (lO mM de Tris, pH = 8.0, 1 mM de EDTA).

Fosforilou-se respectivamente 1 pg de cada oH gonucleótido preparado sinteticamente d(AGCTTAAAGATGAGCT) e d(CATCTTTA) em respectivamente 10 pl de solução reaccional, com adição de 10 U de Tj^-PNK, assim como 1 mM de rATP. A reacção realizou-se a 37°C e durou quarenta e cinco minutos. Interrompeu-se a reacção por aquecimento a 70°C durante dez minutos.

Misturaram-se respectivamente 5 pl da solu-. ção de plasmídio e dos oligonucleótidos fosforilados e aque-# ceu-se a 70°C durante cinco minutos. Em seguida, arrefeceu-se - 55 -

a solução até 0°C e adicionaram-se 2 μΐ de 10 x tampão de li-gase (500 mM de Tris, pH = 7*51 100 mM de MgClg, 200 mH de DTT, 1 mM de rATP, 500 }ig/ml de BSa), assim como 2 pl de água e 10 U de T4-DNA-ligase. A reacçâo demorou quarenta horas e realizou-se a h°C. Poi interrompida por aquecimento a 70°C durante dez minutos.

Digeriram-se 2 jil desta solução reaccional de ligase em no total 30 jil de solução com 10 U da endonuclease de restrição Saci (New England Biolabs) a 37°C durante três horas. Interrompeu-se a reacção por aquecimento a 70°C durante dez minutos. Lizaram-se 5 pl desta mistura reaccional no total de 3® μΐ por adição de 10 U de T^-PNK a l4°C durante de zasseis horas.

Misturaram-se 200 μΐ de E. coli HB101 competentes com 10 μΐ desta mistura reaccional da ligase. Mantiveram-se as bactérias em gelo durante quarenta e cinco minutos e, em seguida, aqueceram-se a k2°C durante dois minutos, para possibilitar a recolha de DNA. Em seguida, incubou-se a sus-pensão de bactérias novamente a 0 C durante 10 minutos. Por fim, repicaram-se as bactérias transformadas numa placa de agar de LB, que continha 50 yig/ml de Ampicilina.

Das colánias de bactérias assim obtidas escolheram-se arbitrariamente doze colánias de bactérias e isolaram-se os plasmídios à escala micrométrica (H. C. Bimboim e J. K. Doly, 1979» Nuol. Acids. Res. 2» 1513 - 1523). Cortou--se o DNA resultante com a endonuclease de restrição Sacie se parou-se o DNA num gel de agarose (l%, 1 x tampão de TBE). A migração de DNA como uma molécula linear de tamanho de cerca de ^400 bp demonstrou a inserção dum sítio de reconhecimento de Saci no plasmídio. Escolheu-se arbitrariamente um destes plasmídios. Transformou-se mais uma vei E. coli HB101 com o DNA da respectiva minipreparação. Das bactérias transformadas resultantes, escolheu-se uma colonia e cul - 56 -

tivou-se em grande escala. 0 plasmídio assim isolado foi corta do com as endonucleases de restrição EcoRI e BAMHI, separou-se o DNA num gel de agarose a 1$ e isolou-se o fragmento mais pequeno a partir do gel por electro-eluição.

Sequenciou-se este fragmento de DNA com EcoRI--BamHI e com cerca de h60 bp, de acordo com Sanger (F. Sanger, S. Nicklen e A. R. Coulson, 1977» Proc. Natl. Acad. Sei. 2Í* 5^63 - 5^67)· ® plasmídio assim analisado foi designado como pRHlOO (Pigura 7).

Exemplo 6

Isolamento do Fragmento XhoII (969/l) e Preparação do Plasmí-dio de Expressão pRH969/l A partir, por exemplo, do DNA representado na Pigura 9, cortou-se um fragmento do genoma HRY2, obtido de acordo com a Patente Europeia A 192 175» que se encontra como inserto num vector, por exemplo, pTJC9» por dupla digestão com as enzimas de restrição HindIII (Biolabs) e EcoRI (Boehringer Mannheim) em 100 jil de tampão Eco-Hind (7*5 mM de %C12» 75 mM de Tris/HCl, pH = 7»5» 50 mM de NaCl) com respectivamente 15 U de EcoRI e HindIII, a 37°C durante quinze horas. A separação do inserto de DNA do vector linearizado realizou-se por separa ção em gel de agarose a 1$. Para isso, misturaram-se os 100 μΐ com 11 jpl de 10 x gel de agarose-1'tampão de carregamento" (0,1 $ de azul de bromofenol, 0,1$ de xileno-cianol, 35$ de Ficoll, 0,5$ de SDS). 0 fragmento EcoRI-HindIII separado de pHRV2-969 (cerca de 1,1 kb) foi isolado com o auxílio de papel DE81 (Whatman) a partir do gel de agarose (G. M. Dretzen, P. Bel-lard, Sassone-Corsi e P. Chambon, 1981, Anal. Biochem, 112» 295 - 298). Para isso, depois da separação dos fragmentos de DNA no gel de agarose cortou-se um segmento antes e depois das bandas de DNA a isolar, na qual se inseriu uma fita de papel DE81. Prosseguiu-se a electroforese (o gel não deve ser reco-« berto com tampão) até que o fragmento de DNA pretendido se ti- - 57 -

vesse ligado completamente à parte anterior da fita de DE81. As fitas posteriores de DE81 evitavam a impurificação por fra gmentos de DNA maiores. Transferiu-se o papel DE81 com o fragmento de DNA ligado para um pequeno tubo de Eppendorf de 1,5 ml (com uma abertura de saida no fundo do reservatório com lã de polialómero colocada por cima) e lavou-se por duas vezes durante cinco minutos com 500 pl de tampão de lavagem de cada vez (solução 0,2 M de NaCl, 25 mH de Tris/HCl, pH * 8,0, 1 mM de EDTA), em que, por curta centrifugação (cerca de 1 segundo), a solução de lavagem foi recolhida no segundo frasco de Eppendorf, que se encontrava colocado por baixo. Em seguida, lavou-se o DNA ligado, como se descreveu acima por duas vezes mediante incubações que duraram quinze minutos em 200 ^il de tampão de eluição (solução 1 mM de NaCl, 25 mM de Tris/HCl, pH » 7»5» 1 mM de EDTA) do papel DE81 (o brometo de etídio permanece absorvido). Centrifugaram-se os 4θΟ pl de eluído du rante dez minutos na centrífuga de Eppendorf (15000 g) para separar as partículas de papel. Transferiu-se o líquido sobre nadante cuidadosamente para um novo balão de Eppendorf, mistu rou-se com 800 pl de etanol a 96% e precipitou-se a -20°C (cer ca de duas horas), lavou-se por duas vezes com etanol a 7Ofo, secou-se e cortou-se em 50 pl (10 mM de Tris/HCl, pH » 8, 10 mM de Mgd2) com 10 U de XhoII (Boehringer) , durante duas horas a 37°C. Para se inactivar a enzima de restrição, incubou--se durante dois minutos a 70°C e, em seguida, arrefeceu-se a mistura reaccional lentamente até à. temperatura ambiente. A estes 50 pl, adicionaram-se 6 pl de 10 x tampão de Klenow(660 mM de Tris/HCl, pH = 7»5» 66 mM de MgClg» 3 mM de dNTPs, 1 mM de DTT, 0,1 mg/ml de BSa)» 2 pl de enzima de Klenow (U υ/μΐ; Amersham) e 2 pl de H^O e incubou-se a 22°C durante trinta mi nutos. Interrompeu-se a reacção por adição de 2 pl de EDTA 0,5 M, pH = 8, extraiu-se a fase aquosa uma vez com o mesmo volume de fenol/CHCl^/alcool isoamílico (25 s 2h i l) e uma vez com igual volume de CHCl^ e misturou-se com 7 pl de 10 x gel de agarose-tampão de "loading". Para realizar a separação do fragmento XhoII com 1092 bp de comprimento dos oligonueleó tidos assim obtidos, isolou-se com o auxílio de papel DE81 - 58 -

que estava dotado com uma estrutura da extremidade "blunt" (969/I) dum gel de agarose a 1%. 0 veetor de expressão utilizado pHHlOO consis tia essencialmente num derivado de pBR322, cuja modificação consiste em se ter inserido as bases 4362/0 (sitio de EcoRI em pBR322) e 29 (posição de HindIII em pBR322) um fragmento com 123 bp de comprimento, que possui a região promotora de triptofano de Serratia marcescens. uma posição de ligação de ribosomas sintética e um codão de iniciação ATG (veja-se a Fi gura 8). A construção do plasmídio de expressão pRH96$/l está representada esquematicamente na Figura 10. Cerca de 10 jig do veetor de expressão pHHlOO foram digeridos em 200 μΐ (6 mM de Tris/HCl, pH = 7»5» 6 mM de BME, 6 mH de MgClg) com 100 U de Saci (Biolabs) a 37°C durante a noite. 0 plasmídio-DNA foi precipitado, de acordo com a maneira de proceder corrente, com etanol, lavado, seco e retomado em 200 μΐ (200 mM de NaCl, 1 mM de ZnCl^, 30 mM de acetato de sádio, pH « 4,75* 5$> de glicerina) e tratou-se com 150 U de nuclease de feijão mungo. Dividiu-se a mistura reaccional em duas porçães de 100 ^il e incubou-se uma delas durante duas horas a l4°C e a outra a 37^ C durante trinta minutos. A reacção foi interrompida por adição de 5 pl de solução de EDTA 0,5 M e extraeção com fenol/ CHCl^/álcool isoamílico (25 í 24 ; l) ou com CHCl^ e as duas misturas reaccionais foram reunidas. Precipitou-se o plasmídio linearizado, de acordo com a maneira de proceder corrente, com acetato de sádio e etanol, lavou-se e secou-se. Em seguida, incubou-se o DNA em 100 μΐ (100 mM de Tris/HCl, pH » 8) com 4o U de fosfatase alcalina (Boehring Mannheim) a 37°C durante uma hora. Depois de se adicionar EDTA ate perfazer a concentração de 20 mM, extraiu-se de acordo com a maneira cor rente, por duas vezes, com fenol/CHCl^/álcool isoamílico (25*. 24 j l) e, por duas vezes, com CHCl^ e precipitou-se o DNA com etanol. Para a ligação, precipitou-se por cada mistura reaccional com cerca de 50 - 175 ng de pRHlOO (linearizado com Saci; tratado com nucleas de feijão mungo e fosfatase alcali- 59 -

na) e cerca de 1 - 2 jig do fragmento Xho do subcloce pHRV2--969 (tratado com enzima de Klenow) conjuntamente com etanol, secou-se e retomou-se em 10 yul de tampão de 1 x ligase recen-temente preparado (50 mM de Tris/HCl» pH a 7»5» 10 mM de tfeClg, 20 mM de DTT, 0,1 mM de rATP e 50 pg/ml de BSA). A ligação realizou-se a l4°C durante setenta horas com 1 U de T4-ligase (Boehringer Mannheim).

Para se obterem as células competentes para a transformação, utilizou-se uma maneira de proceder modificada, descrita por Mandei e Higa (m. Mandei e A. Higa, 1970, J, Mol. Biol. £2, 159 - 162). Para esse efeito, vacinou-se 0,5 ml de uma "cultura durante a noite" de E. coli estirpe HBIOI em 50 ml de meio de LB (lO g/l de trípton, 5 g/1 de extracto de levedura, 10 g/l de NaCl), cultivou-se até se obter uma °^οθ igual a cerca de 0,4 e, em seguida, peletizou-se durante cinco minutos a 5 k e 4°C. Suspenderam-se cuidadosamente as bactérias em 25 ml de MgCl^ 0,1 M (arrefecido com gelo), colocou -se em gelo durante cinco minutos e centrifugou-se a 4 C durante cinco minutos a 5 k. Ressuspendeu-se o pelete em 25 ml de CaClg 0,1 M (arrefecido em gelo), conservo.u-se durante qua tro horas em gelo e c entrif ugou-se durante cinco minutos a 5k e a 4°C, Retomaram-se as células em 2,5 ml de 1 x tampão de armazenagem (θ,1 M CaClg/glicerina = 4/1$ em volume/volume), manteve-se em gelo durante vinte minutos, dividiu-se em partes alíquotas de 100 pl cada uma e congelou-se em azoto líqui do e guardou-se a -80°C. A 100 pl de suspensão de células com petentes mergulhada em gelo, adicionaram-se 5 pl da mistura de ligação descrita, incubaram-se as células durante uma hora em gelo e, durante dois minutos, a 42°C e, em seguida, coloca ram-se em gelo durante cinco minutos. Antes da placagem das células, adicionaram-se 900 pl de meio de LB, incubou-se a 3"f C durante dez minutos e colocaram-se cada 200 jxl de suspensão de células em placas de agar de LB (agar a 1,5$ em meio de LB com 100 mg/1 de Ampicilina) e incubou-se durante a noite. No total, foi possível isolarem-se 351 clones Amp , dos quais se , isolou o plasmídio-DNA, de acordo com a "técnica de prepara-*_ ção de plasmídio mínima" (h. C. Bimboim e J. Doly, loc. cit.). - 60 -

Por digestão com HindIII do plasmídio-DNA, foi possível deter minar oito clones com um dos tamanhos do inserto corresponden te ao fragmento XhoII. Porque nesta construção foi necessária uma ligação "blunt end" de ambos os lados e, portanto, se con feriram em princípio duas possibilidades de orientação do inserto, realizou-se uma análise de restrição. Por digestão com 3,5 U de Ball/100 ng de plasmídio-DNA em solução 10 mM de Tris/HCl, pH = 7»5» 10 mM de MgCLg, 10 mM de BME e por dupla digestão com 8 U de BssHIl/lOO ng de plasmídio-DNA em solução 25 mM de NaCl, 6 mM de Tris/HCl, pH =s 7*5, 6 mM de MgClg, 20 mM de BME (duas horas a 50°c) ou com 20 XJ de BamHI/100 ng de plasmídio-DNA em 150 mM de NaCl, 6 mM de Tris/HCl, pH = 7i5» 6 mM de MgClg, 20 mM de BME (duas horas a 37°C)i identificaram-se seis clones (Numeros : 156, 165, 289, 301, 307 e 319) com a orientação do inserto correcta e dois clones (Números j 1 e 22*0 com a orientação do inserto invertida.

Para verificar se o fragmento XhoII de 969 es tá em fase com o codão de iniciação ATG, determinou-se a sequência das bases da região de transição entre o segmento não codificante e o segmento codificante com o auxílio de um primário de sequência com 17 nucleotidos directamente no plasmí-dio ccc. 0 primário da sequência é complementar das dezassete primeiras bases da hélice não codogénica da região promotora de Trp (veja-se Pigura 8).

Para esse efeito, misturou-se o plasmídio-DNA proveniente dos clones acima mencionados, obtidos de acordo com a "técnica de mini preparação" , respectivament e em 100 jal de tampão de TE com 100 pl de LiCl 5 M e incubou-se a 0°C durante cinco minutos. Depois da centrifugação na centrífuga de Eppendorf (15OOO g, cinco minutos, h°C), misturou-se o sobre-nadante com 400 p.1 de etanol a 96%, centrifugou-se de novo du rante dois minutos à temperatura ambiente, lavou-se o pelete uma vez com etanol a 70% e secou-se. Dissolveu-se em seguida o plasmídio-DNA em 11 jil de H^O, da qual se misturaram 5 da solução aquosa de plasmídio com 5 pl de 1 x solução de des - 61

naturação (267 mM de NaOH, 0,267 tnM de EDTA). Depois de uma incubação durante quinze minutos à temperatura ambiente, adicionou-se 1 ^il da sequência de dezassete pares de base (50 ng/ ul) e 2 |il de CH^COONH^ (pH = 4,5) e incubou-se â. temperatura ambiente durante cinco minutos. Depois da adição de 75 /*1 de etanol a 96% e de precipitação a -70°C (quinze minutos), pele tizou-se durante cinco minutos a 15000 g, lavou-se este com etanol a 70%* secou-se e retomou-se o plasmídio-DNA hibridiza do com o primário em 8,5 de H^O. A estes 8,5 jil de solução, adicionaram-se 1 ^il de 10 x tampão de ligação (lOO mM de Tris/ H01, pH = 8, 50 mM de >%C12) , 3 71I de 35S-ATP (lOOO Ci/mmole} Amersham) e 1 jul de enzima de Klenow (4 U/jil; Biolabs), 0 pos terior decurso do sequenciamento realizou-se de acordo com o método de interrupção da cadeia de Sanger e col. (p. Sanger, S. Nieklen e A. R. Coulson, 1977# Proc. Natl. Acad. USA 74, 5463 - 5467)· No plasmídio de expressão pRH969/l do clone 307 e 319 foi detectado um inserto que se encontra em fase com o ATG.

Exemplo 7

Expressão do Domínio da Proteína de Revestimento Virai 969/1 de HRV2 em Células de E. coli Estirpe CSR603

Para se poder reconhecer a expressão de proteínas codificadas pelo plasmídio em E. coli, utilizou-se um sistema de maxicélulas desenvolvido por Sanear (a. Sanear, A, M. Hack e ¥. D. Rupp, 1979» J. Bacteriol. 122, 692 - 693). A estirpe de maxicélulas de E. coli CSRÓ03 (CGSC 5830; P , thr--1, leuB6, proA2, phr-1, recAl» argE3> thi-1, uvr-A6, ara-l4, lacYl, galK2, xyl-5» mtl-1, gyrA98 (nalA98), rps31, tsx-33» lambda", supE44) possuem mecanismos para a reparação dos prejuízos do DNA resultantes da irradiação com raios ultravioletas. Para a experiência, optimiza-se a dose de radiação de mo do que o cromossoma das bactérias que é encontrado muitas vezes, o plasmídio-DNA comparativamente muito pequeno exista em . mais copias por células, permaneça na sua maior parte não pre - 62 -

judicado. 0 DNA cromossómico danificado é degradado pelas células, ao contrário dos plasmádios que não são atingidos pela radiação de ultravioletas, se replicam mais e constituema par te principal do DNA que permanece. Depois da morte de todas as células não danificadas e que se multriplicam, por acção do antibiótico D-ciclo-serina e consumo do mRNA endogénico, so/ são transcritos e trasladados os genes ainda codificados no plasmídio nas células restantes. Depois da transformação das bactérias num meio isento de sulfato, as proteínas formadas 35 podem ser marcadas radioactivamente pela inserção de S-me-tionina e a sua presença posta em evidência. Células da estirpe CSR603 de E. coli foram transformadas com o plasmádio de expressão apropriado pRH969/l do clone 307 e 319 ou ZZk (com orientação invertida de 969/l) como se descreveu acima. As células transformadas foram culti vadas em 15 ml de meio de expressão isento de triptofano, até uma densidade óptica a 600 nm de 0,5 “ 0,7 a 37°C. 0 meio de expressão utilizado foi preparado de acordo com a seguinte ma neira de proceder (indicaçães por litro de meio) : a) 10 g de (NH^HPO^, 3,5 g de KHgPO^ e 0,5 g de NaCl foram dissolvidos em 500 ml de Η,,Ο, alcalinizou-se a solução a pH - 7,3 com NaOH e diluiu-se até perfazer cerca de 800ml» b) dissolveram-se 21 gramas de ácidos casamínicos (hidrolisa dos em meio ácido, isento de vitamina) (Merck) em 100 ml de H20; c) 50 ml de glucose a 20$>; d) 1 ml de MgSQ^ l molar; e) 1 ml de CaClg 0,1 M; e f) dissolveu-se 1 mg de tiamina-HCl e 20 mg de L-cistedfna em 1 ml de HgO.

Misturaram-se estas soluçSes esterilizadas em - 63 - autoclave ou filtradas para esterilização imediatamente antes da utilização, diluiu-se até perfazer 1000 ml e misturou-se com 100 mg/litro de Ampicilina. Transferiram-se 10 ml da cultura de bactérias recolhida para uma cápsula de Petri de 13»5 centímetros, aberta, irradiou-se com uma lâmpada germicida de radiações ultravioletas (l5 Watt) colocada à distância de 50 cm, durante cinco segundos, com ligeiras sacudidelas e incubou-se a 37°C. As culturas foram misturadas com 100 μg/ml de D-ciclo-serina (recente, solução 100 x concentrada em tampão de fosfato 50 mM, pH « 8) e incubou-se a 37°C durante l4 - 16 horas no sacudidor. Separaram-se as bactérias por centrifugação (cinco minutos, 5 k, à temperatura ambiente), lavaram-se por duas vezes com 5 »1 de solução de sal de Hershey, suspenderam-se em 5 ml de meio de Hershey com 20 Jig/ml de ácido 3-- /9-indol -acrílico (=XAA5 indutor do operão de triptofano) e sacudiu-se a 37°C durante uma hora.

Solução de Sal de Hershey (por litro) i

5Λ g de NaCl 15 mg de CaClg·2HgO 87 mg de kh2po^ 3,o g de KC1 0,2 g de MgClg.όΗ^Ο 12,1 g de Tris + HC1 pH=7,4 1,1 g de NH^Cl 0,2 mg de PeCl^.óHgO

Meio de Hershey (por 100 ml de solução de sal de Hershey)i 2.0 ml de glucose a 20% 0,5 ml de treonina a 2% 1.0 ml de leucina a 1% 1.0 ml de prolina a 2% 1.0 ml de arginina a 29° 0,1 ml de tiamina-HCl a 0,1% A cada cultura adicionaram-se cerca de 15 Ci/ 35 ml de JS-metionina (1000 Ci/mmoles; Amersham) e incubou-se esta cultura a 37°C durante meia hora. Em seguida, recolheram • -se as células por centrifugação (5 k, cinco minutos à tempe- • ratura ambiente) e lisaram-se em 200 μΐ de tampão de ensaio - 6h -

SDS (10 mM de Tris/HCl, pH » 7,4, 125 mM de BME, 2% de SDS, lO/ó de sacarose, 0,05% de azul de bromofenol). Incubaram-se as amostras a 95°C durante cinco minutos e centrifugaram-se a 15000 g durante dois minutos* Ensaiou-se o resíduo relativamente à presença de proteínas segregadas.

Separaram-se 20 - 6θ p.1 do sobrenadante das células em tampão de amostras-SDS (veja-se acima) num gel de poliacrilamlda contendo 10% de SDS (u. K. Laemmli, 1970, Natu re 277, 680 - 686) de aeordo com as suas dimensões. Os geles com uma espessura de 1,5 mm consistiam num gel de separação a 10% com cerca de 10 cm de comprimento e um gel de reunião a 3% com 3 cm de comprimento. A electroforese realizou-se no gel de reunião a 3 watt (constante) e no gel de separação a 12 watt (constan te) (duração total 4,5 horas). Como marcador dos tamanhos, se parou-se simultaneamente uma mistura de proteínas que consistia em BSA (66 kd), albumina de ovo (45 kd), pepsina (34,7 kd), /9-lactoglobulina (l8,4 kd) e lisázima (l4,3 kd). 0 vestígio de gel das proteínas marcadoras foi separado do restante gel por electroforese e incubou-se durante trinta minutos na solu ção de coloração (50% de metanol, 10% de ácido acético, 0,1% de azul-brilhante-de-Coomassie 2250), sacudiu-se durante anoi te na solução de descòramento (5% de metanol, 10% de ácido acético), colocou-se durante trinta minutos num banho de glicerina (7% de ácido acético, 2% de glicerina) e secou-se em secador de gel durante cerca de 1,5 horas a 6o°C sobre papel Whatmann 3MM (veja-se a Figura 11, Vestígio M).

As proteínas do lisado de células foram trans feridas de acordo com o método da mancha "blot de Western" por transferência el.ectrica do gel para filtro de nitrocelulose (Schleicher e Schull, BA85 * 0^5 jim) (w. N. Burnette» 1981,Ana lyt. Biochem. 112, 195 - 203). A transferência realizou-se no seio de tampão de transferência (20 mM de Tris, 150 mM de gli . cina, 20% de metanol p. a.; pH = 8,8) a 60 volt durante cinco - 65 -

horas num aparelho de transferência de proteína Biorad,em pre sença de 0,1$> de empigénio (Marchon Italiana S.P.A.) (R. E. Mandrell e ¥. D. Zollinger, 1984, I1 Immunol. Meth. 62.» l-ll). A expressão das proteínas exclusivamente codi ficadas pelo plasmídio foi demonstrada por formação de J^S-me tionina. Na Figura 11, está representado o auto-radiograma (Vestígios B2 até B3) da mancha ou "blot de Western" depois da exposição sobre película radiográfica Kodak X-Omat S. 0 vestígio B2 (corresponde ao vestígio A2 da mancha de Western) e o vestígio, B4- (corresponde ao vestígio Ak) apresentam tanto sinais do inserto exprimido 9^9/1 como também do gene do plasmí dio para resistência à Ampicilina que codifica a /9-lactamase, enquanto o vestígio B3 (corresponde ao vestígio A3) com o inserto investido 969/1 não apresenta nenhum sinal a 40 kd, não obstante apresente para a /9-lactamase. Portanto, conclui-se que, se no início da região que codifica a inversão estão pre sentes vários codães de acabamento, não se exprime quaisquer proteínas.

Exemplo 8

Produção e isolamento de Anticorpos Monoclonais Esclarecimento das Soluções e Meios Utilizadoss ÍOO x Aminopterina

Dissolvem-se 1,8 mg de aminopterina em 50 ml de HgO, por adição de NaOH 1 molar e dilui-se ate perfazer 100 ml (armazenagem a -20° no escuro).

Mistura 100 x OPI

Dissolvem-se 715 gramas de ácido oxálico e 2,5 gramas de piruvato em 450 ml de H^O e mistura-se com lOOQUde insulina (dissolvida em alguns ml de HCl). Em seguida, dilui- -se com ELO até perfazer 500 ml. • 1 66 - 1

Mistura 100 χ HT

Dissolve-se 0,6805 gramas de hipoxantina em 200 ml de HgO e regula-se a pH = 10 com NaOH, mistura-se com 200 ml de uma solução aquosa de timidina (θ,1937 g em 200 ml) e dilui-se até perfazer 500 ml.

Meio de HT 500 ml de meio de Eagle modificado com meio de Dulbecco (DMEM; Flow Laboratories; elevado teor de glucose)

6 ml de L-glutamina 200 mM

6 ml de mistura 100 x HT

6 ml de mistura 100 x OPI 50 ml de HIFKS (soro de feto de vitela inactivado pelo ca lor) 0,6 ml de Gentamicina (50 mg/ml).

Meio de HAT

100 ml de meio de HT 1 ml de 100 x aminopterina.

Solução de ABTS

Solução aquosa contendo 10 mg/ml. de 2,2*-azi-no-di-(3-etil-benzotiazolino-sulfonato), m. 137 mM de NaCl 2,7 mM de KC1 8 mM de Na2HP0^ 1.5 mM de kh2po4 0,5 mM de MgCl2.6H20 1 mM de CaCl2-2H20 PBS def.

Como PBS, apenas sem sais de Ca e de Mg. - 67 -

BwVinlii

Solução de Lavagem de PBS

Solução de PBS def. com 0*05$ de Tween 20.

20$ de FKS - DMEM kh5 ml de meio Eagle modificado com meio de Dulbecco (Fio Laboratories) 50 ml de HIFKS (soro de feto de vitela inactivado pelo calor) 5 ml de penicilina/estreptomicina (lO 000 U/ml) Complexo de RPMI 500 ml de meio de RPMI lóko (Flow Laboratories; NS 12- -6ob-5l0 50 ml de FKS 5 ml de L-glutamina 200 mM 5 ml de penicilina/estreptomicina (lO 000 U/ml).

Solução de PEG-^000

Dissolvem-se 20 gramas de PEG em 28 ml de PBS e incuba-se em banho-maria (60°C) até o PEG se dissolver (cer ca de trinta minutos).

Solução de Lavagem de RPMI 500 ml de meio de RPMI l64o 5 ml de penicilina/estreptomicina (lO 000 U/ml) 5 ml de L-glutamina 200 mM,

Meio de Timóoitos HAT

Transfere-se para um peneiro o timo retirado em condições estéreis de um rato Balb-c, com a idade de 3 - ^ meses (o mais possível sem tecido de ligação) e passa-se atra # vés do peneiro por acção dum pilão com pontas, esterilizado, • (lentamente, movimentos cruzados; agitar eerca de um minuto no 68

peneiro). Centrifuga-se a suspensão de células em 25 ml de so lução de lavagem de RPMI durante dez minutos à temperatura am biente e a 300 g. Com um pipeta de Pasteur, aspira-se o sobre nadante e ressuspende-se em 20 ml de complexo de RPMI e dilui -se até cerca de 5 x 10 células/ml. Este meio que contém ti-mócitos é guardado em estufa de desenvolvimento com CO^, a 37° C, em pequenos balões de cultura (armazenável durante cerca de catorze dias). Para a preparação do meio de timocitos HAT, centrifugam-se as células, lavam-se com a solução de lavagem de RPMI acima descrita, centrífuga-se de novo e retoma-se o pelete das células em meio de HAT.

Em ratos Balb-c com a idade de 2 - 3 meses,in-jectaram-se intraperitonealmente 5-1° fig de HRV2 purificado ou emulsionado em meio auxiliar de Freund completo. Seguidamente, administraram-se, depois de 27, ^9» 100, 117 e 118 ddas, as mesmas quantidades de HRV2 (emulsionado em meio auxiliar de Freund completo). Um dia depois da última inoculação, reti rou-se o baço e fusionaram-se as células com células de mielo ma, por exemplo, NS-1 (ATCC TIB 18), em que se procedeu essen cialmente de acordo com a maneira de proceder descrita por G. Galfre e C. Milstein, 1981, Methods Enzymol. 23* 3 - ^6.

Para esse efeito, lavou-se o baço retirado em condições estéreis numa cápsula de Petri com cerca de 5 ml de solução de lavagem de RPMI. 0 baço foi desfeito em 5 ml de so lução de lavagem de RPMI e foi feito passar através dum penei ro com um pilão com bicos (deslocações lentas em redondo). Em seguida, deixou-se repousar a suspensão de células em gelo pa ra os grupos de células e partes do tecido de ligação sedimen tarem. Com uma pipeta, aspiraram-se as células em suspensão fina e transferiram-se para um tubo de centrifugação de 50 ml com o fundo redondo, diluiu-se até 50 ml com solução de lavagem de RPMI recentemente preparada e oentrifugou-se à tempera tura ambiente durante cinco minutos a 300 g. Separou-se o so-brenadante e suspendeu-se o pelete em 5 ml de tampão de lise 1 (155 mM de NH^Cl, 10 mM de KHCO^ e 1 mM de EDTA; pH =7,2) e - 69 -

incubou-se a 0°C durante dois minutos. Diluiu-se a suspensão com solução de lavagem de RPMI até perfazer 50 ml e agitou-se cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur. Os compostos conten do lípidos e as gorduras ficaram assim agarrados à pipeta e puderam ser facilmente eliminados. Centrifugou-se a suspensão durante cinco minutos a 300 g e à temperatura ambiente. Res-suspendeu-se o pelete em 10 ml de solução de lavagem de RPMI e misturou-se com cerca de 5 x 10' células de mieloma de rato, por exemplo, NS-1 (proveniente de quatro balões de cultura de tecidos de 75 cm confluentes em 50$. As células foram prévia mente lavadas por três vezes com 50 ml de solução de lavagem de RPMI e centrifugadas a 300 g (durante cinco minutos e à temperatura ambiente), para eliminar todo o soro. Ressuspen-deu-se a mistura de células de baço e de mieloma em 50 ml de solução de lavagem de RPMI e centrifugou-se como se descreveu acima. Eliminou-se o resíduo cuidadosa e completamente, mistu rou-se o pelete imediatamente, a 37°C, com 1,5 ml de solução de PEG-4000 termostatizada e fez-se bater o tubo cuidadosamen te durante cinco minutos no rebordo da mesa até o pelete e a solução de PEG-4000 estarem misturados (”consistência de fare lo”), Em seguida, incubou-se durante dois minutos a 37°C com ligeiras sacudidelas e, simultaneamente, adicionou-se gota a gota 20 ml de solução de lavagem de RPMI, deixando-se escorrer individualmente as gotas ao longo da parede do recipiente. Adicionaram-se cuidadosamente mais 30 ml de solução de lavagem de RPMI. Depois da centrifugação das células (300 g, cinco minutos a temperatura ambiente), separou-se o líquido so-

A brenadante e ressuspendeu-se o pelete cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur em 10 ml de meio de timõcitos de HAT. Repar tiu-se esta suspensão em partes alíquotas de 0,1 ml colocadas em cavidades duma placa de microtitulação (96 cavidades/placa) e incubou-se a 37°C e 5$ de CO^ (as placas não se deslocam na estufa de desenvolvimento). Depois de três dias, adicionou-se cerca de 0,1 ml de meio de HAT. Depois de decorridos mais três dias, adicionou-se cerca de 0,05 ml de meio de HAT. Depois de decorridos dez dias apés a fusão, eliminou-se 70$ do meio e , adicionou-se 0,2 ml de meio de HT. Doze dias depois da fusão, - 70 -

ensaiaram-se microscopicamente as placas, retirou-se o meio para um ensaio de ELISA e de neutralização e adicionou-se cer ca de 0,3 ml de Ζθήο FKS-DMEM por cavidade. Seleccionaram-se os híbridos positivos aos dois ensaios acima mencionados e se pararam-se os híbridos nas proporções de 1í3 até 1*10, isto 4, o teor de uma cavidade foi distribuido por três a dez cavidades da placa de microtitulação. Depois do desenvolvimento, en saiaram-se mais uma vez os híbridos e escolheram-se aqueles que apresentavam o título maior. Os híbridos foram clonados duas vezes por "diluição do ponto final", em que, por meio de microscópio, se verificou que as células híbridas derivavam de uma célula individual. A clonagem realizou-se em presença de células de timo e de 20$. de FKS. Os clones individuais foram cultivados até 50% de confluência em balões de cultura de células de 75 cm . As células de um tal frasco de cultura de tecidos foram injectadas num rato que tinha sido prèviamente tratado por injecções intraperitoneal de Pristanina (0,5 ml). Recolheu-se o líquido de ascites, depois de duas até seis semanas, através da pele do abdómen,

ELISA

Por cavidade de uma placa de microtitulação, incubaram-se 50 jil de uma diluição de vírus (l - 2 jog de HRV2/ ml) em tampão de carbonato (l5 mM de Na_C0o/35 mM de NaHC0o),

* J J durante uma noite, à temperatura ambiente. Dessaturou-se por adição de 100 μΐ de PBS def., que continha 1 °j> de BSA e por in cubação durante uma hora a 37°C. Bateu-se a placa de microtitulação e adicionou-se o conteúdo de cada cavidade a 50 ml de sobrenadante contendo híbrido. Como controlo negativo, utilizou-se meio de HAT puro. Em seguida, incubou-se a 37°C durante uma hora, bateu-se de novo e lavou-se por três vezes com solução de lavagem de PBS (pBS def. + 0,05fo de Tween 20), Em seguida, adicionou-se por cada cavidade 50 p.1 duma diluição 1/500 dum anti-soro conjugado com peroxidase (RAM == "coelho anti-rato") em PBS def. (+ 1% de BSA e 2de Tween 20). Depois * da incubação (uma hora a 37°C) lavaram-se as cavidades por • cinco vezes com solução de lavagem de PBS, como se descreveu - 71 -

acima. Para o desenvolvimento do ensaio ELISA, adicionaram-se por cavidade, 50 pl de solução de desenvolvimento (l ml de tampão de citrato 50 mM de pH = k, 10 μΐ de solução de ABTS e 5 μΐ de peróxido de hidrogénio a 30%). 0 resultado positivo reconheceu-se pela cor verde.

Ensaio de Neutralização

Ensaiaram-se os sobrenadantes da cultura de células de colónias de hibridomas relativamente à presença de anticorpos que são neutralizados pelo vírus, por meio de micro titulação , procedendo da seguinte forma:

Introduziram-se respectivamente 50 jil do so-brenadante do hibridoma por cavidade e incubou-se com respectivament e 50 jil de MEM (meio essencial mínimo; Flow Laboratories), que contém 1000 PFU HRY2, 30 mM de MgCl e 2% de HIFKS, durante uma hora, a 3^ C, na presença de 5% de C0_. Em cada cavidade, adicionou-se cerca de 3 x 10 células de HeLa (estirpe HeLa-Ohio, 03-1^7» Flow Laboratories), incubaram-se as placas durante quarenta e oito horas a 3b°C em 5% de CO^ e cò raram-se com 0,1% de violeta cristalino em 20% de etanol. As cavidades que possuiam uma cultura de células intactas foram consideradas como positivas. Nas condições mencionadas, a uma diluição de 1/1000 do líquido de ascites, foi possível verifi car uma neutralização de 50%.

Do grupo de anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o HRV2 natural, desenvolveu-se um anticorpo monoclonal que, além das propriedades de neutralização, também liga à forma desnaturada do seu antigene - da proteína da cápside virai VP2 - o que se pode detectar com a mancha de Western (Figura ll). Um tal anticorpo é designado 8F5. Com es te anticorpo monoclonal 8F5» tem-se a possibilidade não só de neutralizar HRV2 ou os produtos de expressão que estão contidos em manchas de "Western" mas também se pode com estes anti corpos, por exemplo, caracterizar tnais completamente a posi-• ção imunogénica do HRV2 em VP2, como se pode verificar no sis 72 -

tema de poliovirus para VP1 (0. Wychowski e col., 1983» loc. cit ·).

Um anticorpo monoclonal com as propriedades mencionadas, por exemplo 8F5# foi utilizado para ensaiar as propriedades antigénicas da proteína exprimida por pRH969/l do clone 307 e 319.

Este anticorpo tem, como já se mencionou, a propriedade favorável para o estudo de expressão de reconhecer VP2 (e, por consequência, também 969/l) não sá no estado natural mas também no estado desnaturado. Este tipo de anticorpo monoclonal é frequente e foi até agora apenas encontrado nos sistemas de poliovirus (C. Wychowski e col., 1983» loc. cit.). Os filtros com as proteínas a eles ligados foram sujei tos a banho durante a noite, â temperatura ambiente, em 50 ml de "solução de bloqueio" que é constituida por PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1, 8 mM de NagHPO^, 1,5 mM de KHgpO^, 0,5mM de %C12.6H20, 1 mM de CaCl2.2H20) com lfo de BSA, 1% de Tween 20 e 10^> de soro de feto de vitela (HIFKS) inactivado pelo ca lor. Em seguida, realizou-se a incubação durante três horas em k ml de "solução de bloqueio" com anticorpo 8F5 (ascites de rato - sobrenadante 1/200, diluido em "solução de bloqueio") em que o filtro foi incubado entre folhas de conservação soldadas (fixadas de um dos lados). Em seguida, lavou-se bem o filtro com água da rede de distribuição a correr (cerca de vinte minutos), e por três vezes, durante quinze minutos cada, com 50 ml de PBS que contém ifo de Tween 20. Na áltima fase, o filtro foi incubado em 50 ml de "solução de bloqueio" com a fosfatase alcalina conjugada IgG anti-rato (diluida cerca de 1/3000 em "solução de bloqueio"), durante três horas à temperatura ambiente. 0 filtro foi de novo bem enxaguado num jacto de água da rede de distribuição e lavado por três vezes, como se descreveu acima, com 50 ml de PBS, de cada vez, que contém Vjo de Tween 20. A coloração realizou-se em 10 ml de tampão de fosfata se (100 mM de Tris/HCl, pH - 9» 5» 100 mM de NaCl, 5 mM . de MgClg), em presença do còrante azul-de-nitro-tetrazálio * (NBT; 165 ug/ml) e de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo 73 -

(BCIPj 82,5 jag/rnl). A IgG anti-rato conjugada com fosfatase alcalina assim como o corante NBT e BCXP foram retirados do sistema de proto-mancha TM de Promega Biotec. A reacção corada foi igualmente interrompida por lavagem sob jacto de água corrente, depois de cerca de cinco minutos.

Na Pigura 11, está resumido o resultado da ex pressão de 969/1 em sistema de maxi-células CSR603. Os vestígios AI e Ak mostram o resultado de uma experiência de mancha de "Westera", depois do tingimento com NBT e BCIP. No vestígio Al. separou-se como controlo e partícula HRV2 desnaturada total (cerca de 50 ng de HRV2). Como se deduz da Pigura 11, o anticorpo monoclonal 8F5 reage exclusivamente com VP2 (28,7 kd); as bandas de maiores ou menores pesos moleculares, sá mui to dificilmente reconhecíveis, representavam VPO (precursor das proteínas de revestimento) ou um produto da degradação proteolítica de VP2. No vestígio A2 e vestígio Ah, separaram--se os lisados de células da estirpe CSR603 de E.coli transformados com o plasmídio pRH9ó9/l, derivado do clone 307 e 3L9. Em ambos os vestígios, reconhece-se, depois da coloração da "mancha de Western", o sinal específico pretendido do produto da expressão 969/1» como bandas a cerca de hO kd (h0,2 kd). Como controlo negativo no vestígio A3, separou-se o lisado de células de estirpe CSR603 de E. coli que foram transformadas com o plasmídio do clone 22¾. Este plasmídio apresenta, como se descreveu acima, uma orientação invertida do inserto 969/1, Devido à perda da antigenicidade específica com ela ligada e ao facto de para o início da região de codificação invertida existirem vários codões de acabamento, pode obter-se a"mancha de Western" no vestígio AO nenhum sinal. O vestígio M mostra a coloração com azul-de-Coomassie das proteínas marcadoras (veja-se acima). O vestígio M mostra a coloração com azul-de--Coomassie das proteínas marcadoras. Os vestígios B2 a B^ representam o auto-radioprograma dos vestígios A2 até a4 (para as indicações exactas, veja-se o Exemplo 2, loc. cit.).

Em seguimento da estratégia de Wychowski e col., foi linearizado um plasmídio de expressão que contém o - 7k -

Claims (1)

1. fragmento XhoXI da Figura 9> por exemplo» o plasmídio pR33969/L nos locais de corte próprios de BssHII e tratou-se com a exo-nuclease Bal-31* durante 2, k, 6, 8 e 10 minutos. Os plasmí-dios encurtados assim linearizados foram recirculados e trans -formados em células de E. coli competentes. As proteínas exprimidas foram então ensaiadas relativamente à sua capacidade para se ligarem ao anticorpo monoclonal 8F5· Por comparação das sequências dos plasmídios, as proteínas susceptíveis de ligação exprimidas com os plasmídios que exprimem proteínas não susceptíveis de ligação puderam ser detectadas, o que se deve à posição de imunogénio de HRV2 em VP2 para o anticorpo monoclonal 8F5 entre os aminoácidos, que são codificados pelos nucleótidos 127^ até 1309 do HRY2 (vejam-se as Figuras 9 e 13). REIVINDICAÇÕES - 1* - Processo para a preparação de um polipéptido da estirpe de Rhinovirus HRV89 que é codificado por uma molécula de DNA que contém uma sequência de aminoácidos que codifica uma proteína virai com a sequência de aminoácidos (l). - 75 TTA/WACTGGSASTGGGTTGTTCCCACTCACTCCACCCATGCSffTGnSTACTCTGTTATTACGCTAACrnSTACGCCASTTTTTCCCACCCTTCCCCA 10 20 30 40 $0 60 70 40 90 100 TMTSTAACTTA&WGrnSTACAATATGACCAATAGGTSACAATCATCCAGACTGTCAAAGGTCAAGCACTTCTSrnCCCCGGTCAAT&ASSATATSC 110 120 130 1« ISO 140 170 ISO 190 200 nTACCCAAGSCAAAAACCTTAGAGATCSTTATCCCCACACTGCCTACACAGAGCCCAOTACCArmTGArArMTTGGSTTGGTCGCTCCCTSCAAAC 210 220 230 240 2S0 240 270 2S0 290 300 CCA6CAGTAGACCT6GCAGATGAG5CTG5ACATTCCCCACTGGCSACAGTG5TCCAGCCTGCGTG5CTGCCTSCTCACCCTTCTTGGGTSAGAAGCCTM 310 320 330 340 350 360 370 340 390 400 TTATT6ACAA6STST5AA5A6CCSC5TGTGCTCA6TSTGCnCCTCCGGCCCCT5AATGTGGCTAACCTTAACCCTSCA5CCGrrGCCCATAATCCAAT5 410 420 430 440 450 440 470 440 490 -500 GGTTTGCGGT C6TAATGCGTAAGTGCGGGAT666ACCAACTACTTT66GTGT CCGTGTTTCCTb 1111TCIIΓ Γ GATTGCATTTTATGGTGACAATTTAT 510 520 530 540 550 540 570 540 590 400 MSAQVSR9NVGTHSTQNSVSN6SSLNY AGTGTATASATT5TCATCATG55T6CACAA6TATCTA6ACAAAATGTTGGGACACACTCCACACAAAATTCAGTGAGCAATGGATCTA6CTTAAATTATT 410 420 430 440 450 440 670 440 490 700 FNINYFKOAASSGASRLOFSQDPSKFTDPVKDVL TCAACATCMTTAnTTAAAGACGCAGCTTCAAGTéGTGCTTCrAGArTGGArmTCTCAAGACCCrA6TAMTT7ACTGA7CCTGrTAM5ArGTG7T 710 720 730 740 750 740 770 780 - 790 SOO I VP2 E K 6 1 P T L «»S P Γ V E A C G Y S 0 R L I ? I T R 6 D S T 1 T S A&AAAAGGGTAnCCAACAOTWTWCWÕ^G^CnGTGGTTÃnCAGACAGAcfAATACAGATAACCCSAGGAGATTCCACTATAACATCC 810 820 430 840 450 840 470 840 S90 900 «DTANAVVAYGVUPSYLTPDOATAIOKPTQPOT * CAA6ArACT6CAAATGCAGTTGT7GC7TATG5T6IGTG6CCATCATACnGACTCCAGATGATGCGACTGCTATTGACAAACCCACACAACCTGATACAT 910 920 930 940 950 940 970 980 990 1000 SSNRFYTLOSRSWTSAS. SGWUUKLP0ALKNHG1F CATCCAACAGAnCTACACCTTGGACAGTCGTTCTTGGACATCTGCCTCATCTGGATGGTGGTGGAMrrGCCTGATGCCCTTAAAAACATGGGTATATT 1010 1020 1030 1040 1050 1040 1070 1040 1090 1100 6 E.N «FYHFLGRSGYTIHVQCNSSKFHÇ6LLIVA TGGTGAAAATATGTTTTACCATTTTCTAGGGAGATCTGGATACACAATACArGTACAATGTMTTCTAGCAAGTTTCATCAGGGTTTArrAAIAGTTGCC 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 AÍPEHÍIASATSGNVSVGYNHTHPGEQGREVVP GCCATCCCAGiACATCAATTG6CATCTGCAACAAGT6GAMTGTATCAGTCGGGTACAATCACACCCACCCA5GTGAGCAA6GTAGA6AAGTAGTACCAT 1210 ' 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 SRTSSDNKRPS0DSWLNFDGTLL6N L P I Y P H Q Y I CACGGACATCTAGTSATAATAAAAGACCTAGTGATGACAGTTGGTTAAATTTTGATGGAACAITACTTGGTAACTTACCTATTTATCCCCACCAATACAT 1310 1320 1330 1340 1350 1340 1370 1380 1390 1400 NLR7NNSATLILPYVNAVPM0SHLRHNNWSLVI TAATCTAAGGACTAACAATTCAGCTACCCTTATTTTACCTTATGTCAATGCTGTACCAATGGACTCTATGCTTAGACATAATAATTGGAGCTTGGTTATA H10 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1440 1490 1500 76 IPICPIQVQP6GTQSIPITVSISPHFSEFSGPR ATCCCAATAT6CCCTCnCA6GTCCAACCT66G6GGACACAATCCATACCTATAACAGTATCAATTAGCCCTAT5TTTTCAGAATTTTCAGG6CCAAWA 1SÍ0 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 i m SKVVFSTTQl£LPVHLTP£S5«FLTT00TQSPSAF CTMGenCTíTn^ACCACTCAGanTTACCÃSTTATGTTMCÃCCTGGATCTGGGCAAnCTTAACAACTSATGATACTCAATCCCCATCASCSIT, 1610..·'· 1620 1630 1 640 1650 1 660 1670 1660 1690 1700 PYFHPTKEIFIPGQVRNIIEÍ1C9VD. TLIPVNNT T CCATACTT CCACCCGACCAÃG6AAATATTTATACCTG6ACAA6TTA6GAAnTAArTGAAAT G7 6C CAASTT6ACACACT CATT CCT6T7MCAATACA 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1 770 1780 1790 1800 QEHVRSVNMYTVOLRTQVDLAKEVFSIPVDIAS CAGGAAAATGTAAGATCTGTGAATATGTACACTGTTGArrTACSCACACAAGnGAnTASCTAAA&SiAGTCTTTTCTATACCAGTAGATATTGCCTCAC 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 QPIATTII6ELASYYTHUT6SIRFSF»1FC5SA'SS A4CCTTTA.5CCACTACTCICATAGG46AACTTGCAA6CIATTACACACACTGGACTGGTAGTCTGCGCrrTAGCnTATGnTTGTGGTTCTGCTAGCTC 1910 1920 1930 1940 19S0 1960 1970 1980 1990 2000 TLKLLIAYTPPSVGKPKSRREAHLGTHLVUDVG TACTTT&V.ACIATTAATTGCATACACTCCTCCTG5TGnGG*A4ACCTAAATCCAGGAG4GWGCCATGCITG5TACACATTTAGTGTG5SATGTG5G5 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 LQSTASLVVPHVSASHFRFTTPOTYSSAGYITC TTGCA6TCCACCSCCTCACTASTT&TACCATGG6TTA6TGCTAGCCATTTTASATTCACTACACCTSACACATATTCCTCA5CTSõTTATATTACAT5CT 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2}70 2180 2190 2200 WYUTNFVVPDSTPDNAKMVCHVSACKDFCLRLAR GOTACCA6ACCAAan5TAGTACaSATA6TACTCCASATMCGCCAAAATGGT5TGCATG5nTCTGCATGCAAAS4TTTrrGaTAASATTAGCCAG 2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300 I VPÍ DTNLHTQEGVlTQÍNPVENYj.OSVLNEVlVVPNI AGATACTMCCTAWCACAWASAAGGASTACTCACACAAAÃCCWOTsIvÃnATATASÃTACTSTAnAMTSMGTTCnGTGÇTSCCMATATC 2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 QPSTSVSSHAAPA10AAET6HTSSVQPEDM1ET CMCCTA6CACATCr6TGTCAAGTCATGCA6CSCCTGCATT66ATGCTGCGGAAACC6GACACACCAGCTCT677CAACCT&4AGATATGATTGAAACTA 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2S00 RYVITDQTRDETSI E.S FLGRSGCIAMIEFNTSSD GATATGTTATAACTGATCAAACAAGGGATGAAACAAGTATTGAGAGTTTCTTAGGTAGSTCAGGGTGTATCGCTATGATAGAAnTAATACAAGIAGTGA 2510 2520 2530 2540 2S50 2560 2570 . 2580 2590 2600 KTEHOKIGKGFKTWKVSLQEHAQIRRKYELFTY TAAAACTGAACAT6ATAAAATTGGTAAAG6ATTCAAAACAT6GAA6GTTAGTCTTCAA6AAAT6GCACAAATCAGAAGAAAATATGAATTATTCACATAT 2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700 TRFOSEITIVTAAAAQGNDSGHIVIQFNYVPPG ACAAGATT7GATTCAGAGATAACAATAGTCACTGCAGCCGCAGCTCAAGGAAATGATAGTGÓACATATAGTATTGCAATTTATGTATGTACCCCCAG6AG 2710 2720 273Q 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800 APVPEKRODYTUQSGTNASVFUQEGQPYPRFTIP CACCTGTCCCCGAAAAACG7GATGArTACACAT5GCAATCAGGAACAAATGCATCTGTGT7CTGGCAAGAAG5ACAACCATACCCCAGATTCACAATCCC 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 2890 2900 FMSIASAYYMFYDGYDGOSAASKYGSVVTNDHG TTTTATGAGCATTGCATCA6CCTATTACAT6TTTTATGATG6TTATGATGGTGATAGTGCAGCATCAAAATACGGTTCT6TA6TCACTAATGATATGG6A 2910 2920 2930 2940 2<Í0 2960 ,2970 2980 2990 3000 77 T1CVRIVTSHQKHDSHIVCRIYHKAKHIKAUCP ACCATAr5TSTTA6MrAST6ACATCCMCCMAMCACSAnCAMTAnGTCJ6CCSCAn7ACCACAA6GCCAMCATATAMA6CAT6ÕTSTCm 3010 3020 3030 3040 3QS0 3060 3070 3080 3090 3100 RPPRAVAYQHTHSTNYIPSN6EATTQIKTRPDVF 6CCCACCAAGGGCT6TT6CCTATCAACACACACACT€AACCAATTACATACCATCCAATGGT6AGSCCACAACTCAGATTAAAACCASACCT6ATSTTTT 3110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3120 3190 3200 I Ρ2-Λ TVTNVSPSSHF^VHVSNLIYRNLHLFNSOLOOSI TACCGTTACAAACGTCGWCCATCTASTATGnTGfACATOTSGGTMCnMTCTATAGMATCnCATCTCTTTAATTCTSATCTTSATGATTCrATT 3210 3220 3230 3240 32S0 3250 3270 3220 3290 3300 LVSYSSDIIIYRTNTE6N0VIPNCDCTECTYYC CTTGTATCATACTCCAGTGATCTAATCATATATCGAACAAACACT6AAGGTMT5ATGT&4TCCCTAATTGTGATTGCACTGAAT6TACATATTACT6CC 3310 3320 3330 3340 3350 3350 3370 3330 3390 3400 HHKORYFPIR. VTAH0UYE1QESEYYPKHI5YKLL ACCACAMSATASGTATTTTCCTATCASACTTACTSCACATSATTGoTArSAGATTCAASAATCASAATArTACCCAAAACATATCCAATATAATCTCCT 3410 3420 3430 3440 3450 3450 3470 3420 3490 3500 I6ESPCEPS0C6SKILCKH6V1SMITA66ESHV &4nGG46ASG5TCCTTffT&4ACCAai\GATTeTGGAaAAAACTAneT^\CAT6ErGTTATAGSTArSArrACA6CTeSAG5T&4AG5TCAC5TT 3510 3520 3530 3540 3550 3560 3570 3520 3590 3600 j P2S AF.IOLRKFQCAEE LSDYVEHLGQVFGV6FVD ecrrr AnGACCT6A5AAAAnCCAGT6T6CT6A6GA6CAAG(^ATCTGAnAT(n7^CATCTTGGTCAA6TCTTT65TGTA66CTTCSTA6ACA 3610 3620 3630 3640 3650 3660 3670 3620 3690 3700 SIKOOVNFINPTSKISSKVIKULLRIVSAMIIMV GCAT CAMCAACAGGTAAACTTT AT CAACCCCACTAETAAAATTSST7CAAAAGTWnAMTGOnGTTGAGEATASTTTCA6CTATGATAATAATE5T 3710 3720 3730 3740 3750 3760 3770 3780 3790 3500 R fí S S D P Q T V I A T L T L L 6 í ) 3 5 3 P W R r L K E K L C a w AAG6MrASTTCTEATCCACAAACTGTAATTECCACTCTCACCCTTCTAG6TTGTTCAEGCTCACCATEEAG6TTTCT7AAAEA6AAACICTST5CSTGE 3ai0 3220 3230 3240 3250 3260 3370 3220 3390 3900 X n* LQLSYVHKQVSOSULKKFTEACNAARSLEMIEOK CTCCASCTTA6CTATSTACATAASCAETCTGATTCATEECTCAAEAAATTTACTGAA5CGIGTMCGCA6CACGTGGECTA&4ETES4TTGGACAAAA6A 3910 3920 3930 3940 3950 3960 3970 3980 3990 4000 ISKFIDUIKSHIPQAQLKIDYlTKLKeLNLLEKQ TATCT.AAATTTATAGATTE6ATAAAGAGTATGTTACCACAGECTCAATTGAAAArTGATTACCTAACCAAATTAAAACAACTTAAICTCTTA6ASAAACA 4010 4020 4030 4040 4050 4060 4070 4020 4090 4100 ÍETIRLAPASVQEKIFIEINTLHDISLKFLPIY AATAGAMCMTTASACTTGCACCTSCTAGTGTTCAGGAGAAMTTTTCAn6AAATAMCACCCnCATSATTTATCCTTAAMTTCT7ACCACTGTAT 4110 4120 4130 4140 4150 4160 4170 4180 4190 4200 ASEARS IKNLY IKCSNV IKG6KRNEPVAVLIH6 GCATCTGAAGCACGTAGAATTAAGAATTTATATATCAAATGCAGTAATGTTATTAAAGGGGGAAA6AGGAATGAACCAGTT6CAGTTCTAATACATGGTT 4210 4220 4230 4240 4250 4260 4270 4280 4290 4300 SPGTGKSLATSVLAfl-HLTVETOlYSLPPOPKYFD CTCCTGGTACTGGAAAATCTCTTGCCACTTCTGTTCTTGCTCGAATGCTAACTSTT&AGACTGATATATATTCTTTGCCCCCAGATCCTAAATATTTTGA 4310 4320 4330 4340 4350 4360 4370 4330 4390 4400 GYOQQSVVIHDDIMQNPSGEDHTLFCQHVSSVP T5GGTATGATCAACA6AGTGTT6TTATCAT66ATGATATCATGCAAAATCCTAGTGGTGAAGACATGACnT6rrTTGCCAAATGGTATCGAGTGTCCCT 441C 4420 4 430 4440 4450 4460 4470 4480 4490 4500 78

   FIPPHADLPDKGKPFTSXFVLASTNHTLLTPPT TTCATACCTCCTATSSCASATCTTCCASATAMSGAAAACCATTTACATCCAAOTTTSTACTTGCAAGCACTAATCACACTCTACTAACACCACCAACAS «10 «20 «30 «40 4550 4560 4570 «60 4590 4600 VSSIPAMARRFYFDLOIQVKKEYLLDGKIDIAKS TATCTTCATTACCASCAATeSCAASAAGOTTTTACmSATCTAGACArrCAA&TTAAGAAAGASTATCTnrTASATSGCAAACTAGATATASCAAAAAõ 4610 4620 4630 4640 4650 4660 4670 4620 4690 4700 FRPCDVN1K16NAKCCPF1CGKAVEFKDRNSCT CTTTCSACCATOT6AT6TTy4ATATTAAAATAGGCAAT6CTAA6T6CT(jTCCAmATCT&T6GAAAA6CTGTA6A6TTTAAAGATAGAAA7TCAT(jTACA 4710 4720 4730 4740 4750 4760 4770 4760 4790 4600 I P3-A TLSLSQLYSHIKEEORRRSSAAQAMEAIFQVSID ACCITSTCTTTATCTCAAn'GTATA5rCATATAAA6GAA&4A6ATA6W6AA(jAAGCA6T6CAGCACAA6CAATGGAG6CrATATTTCAAG5IATA6ACC 4810 4620 4630 4640 4650 4660 4670 4680 4690 4900 LQSPPPPAIAOILRSVKTPEIIKYCQOKNUIVPA TCCAATCTCCTCCACCTCCAGCCATAfiCTGACCTCCTTAGETCT5TGAAMCACCASA6ATCATTAACTATTGCCAASATMTAATT65ATTGTTCCAGC 4910 4920 4930 4940 49S0 4960 4970 4980 4990 5000 .ECSIERDLGIANHTJ6IIANVVSIV6VIYIIYK A6AGTGTTCTATT6AAAGAGATTTAGGGATAGCAAATATGACTATAGGTATAATA6CTMT6T6gTCTCTATAGTAGGTGITATCTATATAATTTATAM 5010 5020 5030 5040 5050 5060 5070 5060 5090 5100 i VFg i ΡίΧΠΕλΣΕ l F CT L p y s 5 E P K P Π Π P E Π V V TFJ p E E E F TT6TTCT6TACACTTCAGG6TCCATACJCAGGGGAACCTAAACCCAAAAGCA6AGCTCCA6A6A&A6AGTAGinACTCAGG6CCCAEWi6AA6AGTTT6 5110 5120 5130 5140 5150 5160 5170 S180 5190 5200 SRSLLKHHCCVVTTDKSKFT5L6IY0QVNVLPTH ETC6CTCACTACTCAAACATMT76CTSTSrTGTGACAACCGACAMGGCAAATTCACAÊCTCTTGSCATATATGACCAAGTCATS5TACT7CCAACACA 5210 5220 5230 5240 5250 5260 5270 5260 5290 5300 S0P6SEILV0GVKVKVSDSYDLHNHE6VKLE1T nCTG4CCCA6GCTCTGAGATCrrGGrAGAT6GA6TAAAAGTTAAGGTCrCTGAnCCrATGATTT5CATAACCATGAGGGTGTTAA6CTAGAGATCACA 5310 S320 5330 5340 5350 5360 5370 5380 5390 5400 VVKLIRNEKFKOIRKYLPSREOOYPACHLALLA GTTGT&AAATTMnAGAAATGA&AAGrrTAAAGACATCAGAAMTATnACCCTCACGTGAAGATGACTATCCTGCrTGTAACCTTGCCTTACTAGCTA 5410 5420 5430 5440 5450 5460 5470 ' 5460 5490 5500 NCDEPTIISVGOAVSYGNILISGTNTARNIKYHY ATCAAGAT6AGC2AACAATMTAAGTGTT66TGATGCA6TATCTTAT6GTAACATCTTATTGA6T66TACCAATACTGCAC6AATGATCAA6TACCATTA 5510 5520 5530 5540 5550 5560 5570 5580 5590 5600 PTKA6YCGGVLYKVGSIL6IHVSGN6RPGFSAÍ1 CCCÊACAAAAGCTG6ATATTGrGGSGGTGTTTTGTACAA6ÇTTGGCrCTAT7CTTGáTATACATGTTGGTGGCAArGuTAGAGATGfflnTTCTGCAATG 5610 S62Q 5630 5640 5650 5660 5670 5660 5690 5700 I PCLVGIASE l U Π F 5 E r f s L ! I K E L P Π H N L P S V Η Π S Π CrTCTCAAATCTTATTTTGGTGAAACCCAGGGTTTAATCACTAAAGAACTTCCTGTATCTGTAAAGAACTTACCATCC6TACATGTTTCATCTAAAACCC 5710 5720 5730 S740 5750 5760 S770 S780 5790 5600 RLQPSVFHDVFPGTK. EPAVISSNOPRLETDFDSA GACT ACMCCT AGT STTTTT CAI GAT STTTT CCCT GSAACAAAASA6CCT GCA5TT CTT A6T A6T AAT GAT CCAASACT A6AAACT SACmGACT CA€C 5310 5320 5330 5640 5850 5860 5670 5860 5690 5900 LFSKYK6NPAC8VTPHMKIAVAHYAA0LSTLO1 ACmTCTCCAAATATAAAG6TAATCCTGCTTGTCAAGTGACCCCACACATGAAAAnGCT5TASCACAnATGCAGCACAGTTATCTACACTAGACATA 5910 5920 5930 5940 5950 5960 5970 5960 5990 6000 79

   , NPOPLSlEESVFGIEGLEAlDtNTSAGFPYVSL MTCCTCMCCCCTTTCATTG®AGAGA5TGrSTTTS5TATT&AGGSATTASAAGCTTTGSAnTAAATACTASTGCAGSAnTCCTTATETTTCACT55 6010 6020 6030 6Q4Q 6050 6060 6070 6030 6090 6100 SIKKKOLIDKKTKDITKIRKAIDEYGIDLPHVTF GAATAM6AA6AAASATCTTATA6ATAAAAA6A.CCAAA6ACArCACAMACTTAG0AAA6CAAnGATGAATATG6TATTGAnTGCCTATG6TTACTTT 6110 6120 6130 6140 6150 6160 6170 6180 6190 6200 Λ K 0 E t R K K E K I K D G K T R V I E A N S V N D T V L F R S V TdSAAA6AT6AACTTA&4M6AAG6AAAAAATAAAASATGSAAAGAdA5A£TCATAGAAGdMTAGT5TSAATGATAd(ãTGT7ATTCA6AA6T5TA 6210 6220 6230 6240 6250 6260 6270 6280 6290 6300 FGNtFSAFHKNPGIVTGSAVGCDPEVFHSTIPL TTTGSAAATCnTTCTCTGCrrTCCACAAAAACCCA66TATA6TCACTGGTTCASCAGTAG56TGTGACCCTGAAGrArTCIG5TCAACTATACCTCICA 6310 6320 6330 ' 6340 6350 6360 6370 6330 6390 6400 HLOGECIMAFDYSNYOGSIHPVUFKCISHILEDI T6CTASATGSA6AATGrnAATGG(n7TTGArrATTCAAACTATWTGGTA6CCTACATCCCGrrTG5ITTAAATGTCTTA5TATGCTCTTAWA6ACAT 6410 6420 6430 6440 6450 6460 6470 6480 < 6490 6500 GFSSQLINQICNSKHIYKSKYYEVEGGMPSGCA AGG7TTdCddCAACTTATTAACCAGATd6TAAddAAACATATATACAAATdAASTATTATGAASTG&4AS6A65TATGCCATdG6ATGTGd 6310 6520 6530 6540 6550 6560 6570 6580 6590 6600 GTSIFNTIINHIIIRTIVLOAYKNIDIDKIKIL GGTACTAGTATTTTTAATACAATAATCAACAATATTATCATTAõAACTTTGSTACTAoATGCTTATAAGAACATAGATCTASATAAACTGAAMTCTTAG 6610 6620 6630 6640 6650 6660 6670 6680 6690· 6700 AYGDDVIFSYNFKLDMAVLAKEGEKYGITITPAD CATAT5GGGATGAT5TCATCTTTTCTTATMTTTTAAACTT&4CAT65CAGTTCTTGCCA4AGAAGGAGAAAAATATGGACTAACAA7CACCCCTGCTGA 67i0 6720 6730 6740 6750 6760 6770 6780 6790 6800 KSOVFQELTYKHVTFLKRGFRADERHSFllHPT TAAGTCTGArsmTCCAAGAATTGACCTATAAAAATGTAACnTTCTTAAAA&AGGATTCAGAGCIGATGAGCGCCACTCnTCCTTATACACCCIACC 6810 6320 6830 6840 6850 6860 6870 6880 6890 6900 FPVAEIHDSIRWTKN.PSCMQEHVLSLCHIMWHN TTTCdGTWCTGAGAnCAfSAdCCATMGATGGACCAAAAACCCnCATGTATGCAGGMCACGTGCTATCnTGTGTCATTTAATGTGGCATAATG· 6910 6920 6930 6940 69S0 6960 6970 6980 6990 7000 GRHAYQEF1K6IRSVSA6RALYIPAYEVLEHEUY GTA6ACATGCATACCA66AATTCATTAAAGGTATACGCA5TGTATdGCCG5TCGGGCAdGTATATACCAGCTTATGAAGTTCTTGAACATGAATG5TA 701Q 7020 ’ 7030 7040 7050 7060 7070 7080 7090 7100 E K F * TGAAAAATTTTAGATATAAAAdGTTAAAIATAGdAGTTTATTAGTTTTAT pol* (A) 7110 7120 7130 7140 7150 80

   ou as suas partes ou alelos, caracterizado por se transformar um organismo hospedeiro ou uma cultura de células com informações genéticas que codificam para um polipéptido como se refere acima, de preferência» com informações genéticas que são contidas num vector de expressão replicável, se cultivar o organismo hospedeiro assim transformado ou a cultura de células assim transformadas em condições apropriadas e se isolar e purificar o polipéptido exprimido. Processo para a preparação dum polipéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser codificado por uma molécula de DNA ou por uma sequência de DNA contida em vectores de expressão replicáveis e possuir as pro priedades de pelo menos uma das proteínas virais com a sequên cia de aminoácidos (i) acima referida ou com a sequência de aminoácidos (li) TTAAAACTGGATCCAGuTTGTT CCCACCT GGATTTCCCACA666A6TGÍ5T ACT CTGTTATTAC66TAACTTTGTAC6CCAGTTTTAT CT CCCTT CCC CCA 10 20 30 40 50 60 70 80 90 |100 TSTMCTTA6AA6nTrrCACAAAGACCAATAGCCGGTAATCA0CCAGATTACTGAAGGTCMGCACTTCTGTTTCCCCG6TCAATGTT6ATAT6CTCCA 110 120 130 140 ' 150 160 170 160 190 200 ACAG6fiCWAAACAACTGCGATCGTTAACCGCAAA6CGCCTACGCAAASCTTAGTAGCATCTTTGAAATCGTTTGGCTG5TCGATCCGCCATTTCCCtTS 210 220 230 240 2S0 260 270 280 290 300 GTAGACCTGGCAGATGAGGCTAGAAATACCCCACTGGCGACAGTGTTCTAGCCTGCGTGGCT6CCTGCACACCCTATG6GTGTGAA6CCAAACAATGfeAC 310 320 330 340 350 360 370 360 390 400 AAGGTGTGAA5A6CCCCGTGTGCTCGCmGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGCAGCTAGA6CACGTAACCCAATGTGTATfTA 410 420 430 - 440 450 460 470 460 490 |S0O 81

   6Τ COTΑΑΤ 5AGCAATT6CGG6ATGG6ACCAACTAC7TT G66TGT C CGT βΤΊΓΤ CACTTTTTCCTrTATATTT SCTTATGST6ACAATAT ATACA VTATATA 510 M 520 m 6 A Q V 530 5« 550 560 570 560 590 SRQNVGTHSTQNSVSN6SSLNYF 600 N I TATT€SCACCATGGGT6CACAS6TTTCAA6ACAAAAT6TTGGAACTCACTCCACGCAAAACTCTGTATCAAATGSGTCTAGTTTAAATTATm AACATC 700 610 620 630 640 650 660 670 660 690 K NYF.KDAASN6ASKLEF7QDPSKFT0'PVK0VL: MTTATT7CAAAGAT6CTGCnCAAA76G76CATCAAMC7G6AAT7CACACAA6A7CCTAG7AAATTTACT6ACCCA6TTAAG5ATGT7TTG6iAAAG6 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 D V G 1 P T L CS P7VEAC6YSDRIIQÍ7R60S7I7SQ 6AATACCAACAC7ACAG7CCCCCACAGTGGA6GCTT6TG5ATAC7C7GA7AGGATTA7ACA6ATTACCASAGGAGATTCAACCATAACC7CACAAIGAT6T 900 810 820 830 840 850 860 870 880 690

   N TAAT 1000 ANAIVAYGVWPHYlSSKDASAIDKPSePDTSJ GGCTAATGCTA7C5TTGCGTATGGTGTT7GGCCACATTATCTATCCTCCAA5GATGCCTCTGCAATTGATAAACCCTC7CAACCA6ATACATCTTt 910 920 930 940 9S0 960 . 970 980 990 R'FYTLRSVTWSSSSKGHWUKLPDAIKDHGIFGE AGArTTTATACTCTAAGGAGTGTGACCTGGAGCAGTTCCTCAAAGGGTTGGTGGTGGAAACTACCTGATGCACTCAAGGACATGGGTATTTTTGGlGAAA 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 NrtFYHYLGRSGYTIHVQCNASKFHQGTllVALtP AÇATGrrrTATCATTACCTG5GTAGGA6TGGATACACAATACATGTGCAGTGTAATGCTAGTAAATTTCACCAG5GTACACTAAT76TT6CTCT6A 'ACC 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 EHQIASALH6-NVNVGYNY7HPGE76REVKAE7 TGAGCATCA6ArrGCAAGTGCCTTACATGGCMTGTGAATÉÍTTGGTTACAACTACACACACCCA6GT6AAACAGGCAGS6AAGTTAAAGCT6ASACdASA 1210 1220 1230 1240 12S0 1260 1270 1280 1290 1300 LNPOLQPTEtYWLNFOGTLLGNITlFPHQFIN. TTGAATCCTGATCTACAACCTACTGAA6AGTATTGGC7AAACTTTGATGGGACACTCCTTGGAAATATTACCATATTCCCTCATCAAT7TATCAACr’GA 1310 1320 . 1330 1340 1350 1360 1370 1360 1390 '400 ] 1 RSNNSATIIAPYVNAVPMDSHRSHNNUSLV1IPI G6AS7AA7AA77CTGCCACAATAAT7GCCCC77A767CAAT6MG77CC7A7G5A77CM7GCGGAGCCACAA7AATTGGAG7T7GG7AArAATACCA/T 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 CPIETSSAIN71PI7ISISPNCAEFSGARAKIM A7G7CCCCT7GA6ACATCAAG7GCAArrAACACAA7ACC7A7TACAA7A7C7A7AAGCCCCA7G7G7GCA6AG7T7TCCGGC6CGCGrGCCAA6CGTCAl 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 16» I VP3 'GLPVFITPGS6QFL7700FQSPCALPUYHP7KE 6GA77ACCAGT rrCA7CACACCAGG77CAG5ACAGTTTTTGACAACA5A75ATTTCCAATCCCCA75T5CAC77CCC7GGTATCACCCAAC7AAG6AA, 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1710 ISIPGEVKNLVEICQV&SLVPIHN707Y1HSEMÍ 777C7A77CCAGG75AG€TTAAAAATT7GG7TGAAATTTGTCAA5TAGACAGCCTAGTACCAA7AAA7MCAC7GACACCTACA7CAA7A67GAAAA7A7 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 18C3 82

   YSVVLQSS1NAPDKIFSIRTDVASQPLATTLIG 6TATTCT&nGT/íTTSCAATCATCAATTAATGCACCAGATAAGATCTTCTCTATTCGAACA6ATGTTGCTTCCCAACC7TTAGCTACTACTTTGMTGGT 1310 1820 1830 ' 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 EISSYFTHWTGSLRFSFNFCGTANTTVKLLLAY GA6ATATCTA6CTArrTCACCCACTG5ACA66GAOTCTCCGTTTCA6CTTCATGTTTTGTGGTACTGCCAACACTACTGTTAA6CmTGTTGGCATACA 1910 1920 1930 19^0 19S0 1960 1970 1980 1990 2000 TPPGIAEPTTRKDANL6THVIWDVGLQSTISHVV CACCACCTGGTATCGCAGAACCCACCACAASAAAGGATGCAATGCTAGGCAC7CATGTTATATGGGAT6TGGGGTTGCAGTCTACAATATCAATGGTAGT 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 PWISASHYRNTSPGRSTSGYITCUYQTRLVIPP 6CCATG6ATTAGC6CTA6TCATTATA6AAACACATCACCAGGTA6ATCTACATCT6G67ACATAACArGCT65TATCA6ACTA6ATTAGTCATTCCACCT 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200 QTPPTARLLCFVSGCK0FCLRMAR0TNLHL9SG CAGACCCCACCAACA€CTAGATTGTTATGmT6TATCTGGGTGCAAA6ACTmGCTTGCGCATGGCAC6A&4TACTAACCTACACCT6CAAA6T6CT6 2210 2220 2230 2240 22S0 2260 2270 2280 2290 2300 1 w. AlAQYNPVENYIOEVLNEVLVVPNINSSNPTTSNS CAATAGCACAGAACCCTGTTGAGAATTATATAGATGAAGTTCTTAATGAAGrnTAGrrGTCCCAAATATTAATAGTAGTAACCCCACAACATCAAATTC 2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 APAL0AAET6HTSSVQPEDVIETRYVQTSQTRD TGCCCCAGCATT AGATGCT G CAGAAACAGGGCA CACT AGT AõT GTT CAA C CA6AGGATGT CA 7 T GAAA CT AGST AT ST 6CA5ACAT CA CAAACAA6A6AT 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2S00 EMSLESFLGRSGCIHESKLEVTLANYNKENFTV &4AATGAGTTTA6ASAGTTTTCTTGGCASATCAG6ATGCATACATGAATCTAAATTAGAGGTTACACTTGCAAATTATAACAAG5A6AATTTTACAGT(iT 2S10 2520 2530 2S40 2S50 2560 2570 2580 2590 2600 UAINLQEMAQIRRKFELFTYTRFDSEITLVPCIS GGGCTATTAATCTACAA6AAATGGCTCAAATTA6AAGGAAATTTGAATTGTTCACCTATACTAGGnTGATTCT6AAATAACCCTAGrTCCATGCATTTC 2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700 * ALSQ0IGHITMQYHYVPP6APVPNSR00YAUQS CGCCCTTAGTCAGGACATTG6ACACATCACAAT6CAATACATGTAT6TTCCACCA6GTGCACC6GT6CCCAATAGTAGGGAC6ATTATGCATGGCA6TCT 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800 G1NASVFUQHGQAYPRFSLPFLSVASAYYMFY0 5GCACTMTGCCTCTGTTTTCT6GCAACATG6ACAG6CTTATCCAAGATTT7CCTTACCTTTCCTAA5TGT6GCATCT6CTTAT7ACATGnTTAT6ATG 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 2890 2900 GYDEQDQNYGTANTNNMGSLCSRIVTEKHIHKVH GGTATGATGAACAAGAT CAAAACT AT 6GT ACAGCAAACACAAATAACATGGGGT CACTATGCT CTAGGATAGTAACAGAGAAACACATT CATAAAGTACA 2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 3000 - 83 < *

   IHTRIYHKA.KHVKAMCPRPPRAIEYTRAHRTIÍF TATAAT6ACAAGAATCTATCACAAGGCTAAACAT6TCAAGGCATGGTGTCCACGCCCACCCAGAGCGCTTGAGTATACTCST6CTCATC5CACTAATTTT 3010 3020 3030 3040 30S0 3060 3070 3080 3090 3100 I ; Κ I Ε 0 R S I Q Τ A I V Τ R Ρ I I Γ 7 Α 6 Ρ S 0 Μ YVV Η V 6 Ν L I AAMTTGAGGATAGGAGTATTCAGACAGCAATTGTGACCAGACCAATTATCACTACASCTGoCCCCAGTGACATGTATSTTCATGTAGSTAACCTTATTT 3110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190 3200 h Ρ2-Α Υ R Ν L Η , F Ν S Ε Η Η Ε S I L V S YVS S D L I I Υ R Τ Ν 7 V 5 D D A ΓΑ6ΑΜΤ CTT CATC Γ TTT CAACT CT6A6AT SCATõAAT CTATTTTG6T AT CTTATT CAT CAGATTT ΑΑΤ CATTT ACCGAACAAACACTSTAeGT6ATGA 3210 3220 3230 3240 3250 3260 3270 3280 3290 3300 YIPSCDCTQATYYCKHKNRYFPirvrSHDUYEI 7TACA7TCCC7C77S Í5A7757ACCCAAGC7AC77AT7A7TGCAAACATAAAAA7AGA7AC7TCCCAA77ACAG77ACMGCCA7GAC76G7A7GAAA7A 3310 3320 3330 ' 3340 3350 3360 3370 3380 3390 3400 QESEYYPKHIQYNLLI6EGPCEPGDCG6KLICK CA66AAA6TGAGTACTATCCCAAACACATACAGTACMTTTGTTGATTGGTGAGGGCCCTTGTGAACCAGGTGACTGrGGTGGAAAGTTGCTAT6CAAAC 3410 3420 3430 3440 3450 3460 3470 3480 3490 3500 ! P2-B iGVIGIVTAGG0NHVAFI0LRHFHCAEEQV6VTDY iiTGGT5TCATAGG7A7A6TAACAGCT5GTGGT6A7AATCATGT5GCTT77ATTGACCTTAGACACTTCCA7TGTGCTGAAGAACAAGGGGTTACA6ATTA 3510 3520 3530 3540 3550 3560 3570 3580 3590 3600 IHMLGEAFGNG.FVOSVKEHIHAINPVGNISKKI A7ACA7A7GC7AG6AGAAGCATnGGAAA7GGA"mSTGGA7ACTS7AAAAGAACA7A7ACAT6CCATAAACCCA57AG5AAATATCAGCAAGAAAATT 3610 3620 3630 3640 3650 3660 3670 3680 3690 3700 IKUHLRIISAMVIIIRNSSDPQ7ILA717LI6C T7AAA7GSA7GT7GAGAATAATATCA6CAATS67CA7AA7AAT7A6AAAC7CT7C76ACCCCCAAAC7A7A77AGCAACAC7CACAC7GAT7G5G7GTT 3710 3720 3730 3740 3750 3760 3770 3780 3790 3800 ± P2-C : GSPWRFLKEKFCKUT9LNYIHKEYS0SHLKKFTE 76GATCACCC7GGAGA77TT7AAAG6AAAAA7TC7G7AAA7GGACACAGC77AA77A7A7ACACAAA6AATCAGATTCATGG77AAA6AAA7T7ACTGA 3810 3820 3830 3840 3850 3860 3870 3880 3890 3900 ACNAARGLEUlGNKlSKrlEUMKSML PQ A Q L Κ V ; jCATGCAA7GCAGCTAGAGGGC7TGAATG6A7AGGGAA7AAGATA7CTAAA7T7A77GAA7GGA7GAAG7CGA7GC7CCCGCAAGC7CAAT7GAAGG77 3910 3920 3930 3940 3950 3960 3970 3980 3990 4000 r (YLHELKKLNLYEKQVESLRVADMKTQEKIKME t tG7ACT7AAACGAGC77AAAAMC7CAACC7A7AC6AAAAGCAA6nGASA6C77GCGG67GGC7GACA75AAAACACAAGAAAAAA77AAAATGôíAA 4010 4020 4030 4040 4050 4060 4070 4080 4090 4100 1D7LH0LSRKFLPLYASEAKRIK7LYIKC0H1IK 1 tGACACTTTACA7GATT7G7CACG7AAATT7C7ACCTT7G7A76CAAG7GAGGCAAAAAG6A7AAAAACCC7A7ACATTAMT676ATAA7A7CA7CAA 4110 4120 4130 . 4140 4150 4160 4170 4180 4190 4200 QKKRCEPVAIVIHGPPGAGKS1T7NFIAKMITH £ AGAAGAAAA6ATGTGAACCAG7AGC7ATAG77A77CA7GGACCACCTGG7GC7G5CAAA7C7ATAACAACAAAT77CC7G6CCAAAATGATAACTAA7 4210 4220 4230 4240 4250 4260 4270 4280 4290 4300 SOIYSLPPDPKYFDGYDQ.QSVVIMDDIHÇNPA •6|i|TAG7ôACATATAC7C7CTACC7CC7GATCCAAAA7A77T75A7GG7TATGACCAACAGAGTGTAG7M7AA7G6A7GACA77ATGCAGAATCCAGCCG 4310 4320 4330 4340 4350 4360 4370 4380 4390 4400 - 8k -

   GDDfITLFCQMVSSVTFIPPrtADLPDKGKAFDSRF GG6AT6ACAT6ACACT6TTGT6CCAAAT6GTTTCTA6TCTTACATTTATACCACCAATG6CT6ATCTACCA6ATAAA66CAAG6CTTTT6ATrCTAGSIT «10 «20 «30 «AO 4450 «60 4470 4480 «90 4500 VICSTNHSLLT PPT I TSLPAfINRRFFLDIDIIV T6TATTAr5CAGCACAAATCATTCCCTTCTAACACCCCC5ACAATAACTTCACTACCTGCAATGAATA6AA6ATT7TTCCTAGATTTA6ATATAATA6TA 4510 4520 4530 4540 4550 4560 4570 4560 4590 4600 HDNFK0PQ6KINVAAAFRPCDVDNRIGNARCCP CATGATAACTTCAAAGATCCACAGGGCAAACTTAATGTGGCAGCAGCSnTCGACCATGTGATGTAGATAATAGAATAGGAAATGCACGrrGTTGTCCAT' 4610 4620 4630 4640 4650 4660 4670 4660 4690 4700 FVCGKAVSFKDRNSCMKYSLAQVVNIWIEEORRR TT6TGTGT6SAAAASCAGTTTCTTTCAAAGATCGTAACTCnGCAACAAATACAGCCTT6CGCAGGTGTACAACATAAT5ATT6AA6AASACAGACGGAG 4710 4720 4730 4740 4750 4760 4770 4780 4790 4800 ^ F3~A RQVVDVHTAIFQGPIOÍIKNPPPPAITDLLQSVR AAGACAAGTGGTTGATGTCATGACAGCTATATTCCAAGGGCCAATTGATATGAAAAACCCACCACCACCTGCTATTACTGACTTGCTCCAGTCTGTTAGA 4810 4820 4830 ' 4840 4850 4860 4870 4880 4890 4900 TPEVIKYCEGNRWIIPAECKIEKELNIANTIIT ACCCCTGAAGTTA7 rAAGTATTGTGAGGGTAATAGATGGATAATTCCAGCAGAATGCAAGATAGAAAAGGAGTTGAACTTGGCTAACACAATCATAACAA 4910 4920 4930 4940 4950 4960 4970 4980 4990 5000 V vpg IIANVIGMARIIYVIYKLFCTLQGPYSGEPKPKT TCATTGCAAATGT7-'>TT6GTATGGC6AGAATAATArATGTTATTTACAAACTTTTTT6CACATTACAGGGACCATATTCAGGA6AACCAAA6CCCAAGAC 5010 5020 5030 5040 5050 5060 5070 5080 5090 5100 X PROTEASE KIPErtRVVT QVG PEEEFGHSLIKHNSCVITTEMG íAAAATCCCA6AAAGGCGTGTA6TAACACAGGGACCA6AG5AGGAATTTGGGAT6TCTTTAATTAAACATAACTCATGTGTTATTACAACA6AAAATGGS 5110 5120 5130 5140 5150 5160 5170 5180 5190 5200 KFTGLGVYORFVVVPTHADPGKEIQVDGITTKV AATTCACAGGTCTTGGAGTATACGACASATTTGTGGTCGTACCAACACATGCAGATCCTGGAAAGGAAATTCAGGTTGATGGTATAACTACAAAAGTCA 5210 5220 5230 5240 5250 5260 5270 5280 5290 5300 DSYDLYNKNGIKLEITVIKLDRNEKFROIRRYI TGACTCATATGACCTATACAACAA6AAT6GGATAAAGCTAGAAATAACAGTACTTAAATTAGATAGAAATGAAAAATTTA6AGATATCAGGAGATATAT 5310 5320 5330 5340 5350 5360 5370 5380 5390 5400 FNNEODYPNCNLALLANQPEPTIINVGDVVSYG / CCTAACAAT6AA&ATGATTACCCCAATTGCAACTTA6CACTGCTAGCAAACCAGCCTGAACCAACTA7AArCAATGrTGGAGATGTTGTATCCTATGGC 5410 5420 5430 5440 5450 5460 5470 5480 5490 5500 •ÍILLSGNQTARHLKYSYPTKSGYCGGVLYKISQ ; lTATACTGCTCA6TG6CAACCMACGGCTAGAAT6CT7AAATACA6TTACCCAACTAAATCTGGnACTGTGGAG6T6TCTTATACAAAATTGGGCAA6 5510 5520 5530 5540 5550 5560 5570 5580 5590 5600 \j P0O3EPASE 4lGIHVGGNGRDGFSAMllRSYFTDV<rSQITLSK 1 íCTTGGAAT A CAT 6 ΓΤ SGGG6CAAT G6TAG66ATG6TTT CT CA6CTAT GTT ACT CAGAT CCTAT TT CACT GATGTT CAGG6CCAAATAACGTTAT CAAA . .5610 5620 5630 5640 5650 5660 5670 S680 5690 5700 85 KTSECNIPSIHTPCKTKLQPSVFY0VFP6SKEP GAAGACW6TGMT5TAACCTACCCA6TATACACACCCCAT6CAAAACCAMTT6CAGCCTAGTGTTTTCTAT6AT6TA7TCCCTG6TTCAAAAGAACCA 5710 5720 5730 5740 5750 5760 5 770 5760 5790 5300 AVISE kdarlqvdfnealfskykgmtdcsindh GCTGTGTT6TCTGAAAAA6ATSCCCGGTTACAASnGATTTCAATGAASCACTATTTTCTAAATACAAAÍãGGAATACA6ATT6CTCCATTAAT6ACCACA 5310 5620 5830 5840 5350 5860 5870 5880 5890 5900 IRIASSHYAAQLITLD10PKPITLEDSVFGTD61 TAA6MTTGCATCATCACATTATGCAGCACAACTCATTACCTTAGATATTGACCCAAAACCTATTACACTTGAGôACACTCTCTTTGGCACTGAT6SATT 5910 5920 5930 5940 59S0 5960 5970 5980 5990 6000 EAL0LMTSA6FPYIAMGVKKR0LINNKTKDISK A6A5GCTCTTGATTTGAACACTA6CGCAGGAnTCCATATATTGCAATGGGAGTTAAAAAGA6AGATTTAATAAACAACAAGACCAAG&1TATAAGCAAA 6010 6020 6030 6040 6050 6060 6070 6080 6090 6100 IKEAIDKYGVDLPHVTFIKDELRKHEKVIKGKT tnTAAAGAAGCAATTGACAAATACGGAGTTGACTTACCTATGGTCACCTTCrTGAAAGATGAACTCASAAAGCATSAAAAGGTAATTAAAGaTAAAACTA 6110 6120 6130 6140 6150 6160 6170 6180 6190 6200 RVIEASSVN0TLLFRTTFGNIFSKFHLNPGIVT6 5ACTTATT6AAGCTA6TA6TGT6AATGATACCCTATTATTTA6AACAACTTTTGGCAACCTCnTrCAAAGTTCCACTTGAATCCTGGAAnGTTACTGG 6210 6220 6230 6240 6250 6260 6270 6280 6290 ‘ 6300 SAVGCDPEVFHSKIPAHLDDKCIÍ1AF0YTNYD6 ATCAGCAGTTGGAT5TGATCCA6AGGT6nTT66TCAAAAATACCAGCAATGTTGGATGATAAATGTATTATGGCnTTGATTATACAAATTATGATGGT 6310 6320 6330 6340 6350 6360 6370 6380 6390 6400 SIHPIHFEALKQVLVDLSFNPTLIDRLCKSKHI iGTATACACCCTA^TGGTTTGAAGCTCTTAAACAGGTACTGGTAGATCTATCATTTAATCCAACArTAATAGATAGACTATGCAAGTCTAAACACATCT 6410 6420 6430 6440 6450 6460 6470 6480 6490 6500 :KNTYYEVEGGVPS6CSGTSIFNTHINNIIIRTL CAAAAATACATAC7ATGAAGTG5AG5GAGGTGTACCATCTG55TGTTCAGGTACTAGTATnTTAACACTAT6ATCAATAATATTATCATAAGGACCTT 6510 6520 6530 6540 6550 6560 6570 6580 6590 6600 VLOAYKHIOLOKLKIIAYGOOVIFSYIHELONE , GTGTTA6AT6CATACAA6AATATA^TCTA6ATAAGCTTAA6ATAATTGCCTATGGT6ATGATGTCATATTCTCATACATACAT&AACTG6ACAT55AG 6610 6620 6630 6640 6650 6660 6670 6680 6690 6700 _ AIAIEGVKYGITITPADKSNTFVKIDYSNVTFL irrATAGCAATAGAGuGTGTTAAATATGGmGACTATAACTCCTGCTGATAAATCTAACACATTTCTAAAATTAGACTATAGCMTGTTACTTTTTTAA 6710 6720 6730 6740 6750 6760 6770 6780 6790 6800 (RGFKQDEKYNFLIHPTFPEDEI.FESIRWTKKPS i \A6AGGGTTTAAGCAA6ATGA6AA6TATAACnTCTAATACATCCAACTTTCCCTGAAGATGAAATATTTGAATCCATCAGATG5ACAAAGAAACCATC 6810 6820 6830 6840 6850 6860 6870 6380 6890. 6900 86 A :gct 7000 Mim 7100 QHHEHVLSICHLH.UHNGHDAYKKFVEKIRSV ACAMTGCATGMCATGTS77GTCTCTGTGTCACTTAArG7GGCACAATGGACuT6ACGCATACAMAMn7GTG6A6AAGATACGCAGTGTAAG]ci 6910 6920 6730 6940 69S0 6960 6970 6960 6990 GRALY IPPYDILLHEUYEKF GGTCGTGCACT6TACATCCCTCCGTATGAnTGCTTTT6CAT6A6TGGTATGAAAAArnTAAAGATATAGAAATAGTAAACT6ATAGTTTATTA 7010 7020 7030 7040 7050 7060 7070 7050 7090 AT poly(A) 7110 7120 7130 7140 7150 7160 7170 7180 7190 '200 & - 3" - Processo de acordo com a reivindicação 2, ca-racterizado pelo facto de o polipeptido obtido corresponder a pelo menos uma das proteínas virais enumeradas na sequencia (i) sob os números 1 a 2164, suas partes ou alelos e ser isento doutras proteínas. _ _ Processo de acordo com a reivindicação 2, ca-racterizado pelo facto de o polipeptido obtido conter a sequência de aminoácidos da proteína virai VP1, VP2, VP3> P2A » P2B, P2C, P3A, P3B ou P3C ou partes delas e isento doutras pro teínas. - 5& - Processo de acordo com a reivindicação 4, ca- - 87 - raeterizado pelo facto de, no polipéptido obtido, pelo menos duas das proteínas virais mencionadas estarem acopladas uma com a outra numa combinação qualquer. Processo de acordo com a reivindicação 5» oa-racterizado pelo facto de o polipéptido obtido ser um derivado do polipéptido com a sequência de aminoácidos 1 a 2164 da sequência (i) ou suas partes, com as propriedades de pelo menos uma ou partes das proteínas virais da estirpe de Rhinovi-rus HRV8 9· - 7» - Processo para a obtenção dum organismo hospedeiro transformado ou duma cultura de células transformada,ca raeterizado pelo facto de o organismo ou a cultura de células transformadas poderem exprimir uma proteína virai codificada por uma sequência de aminoácidos como se indica na sequência (I) ou na sequência (j-l), um alelo ou parte das proteínas virais da estirpe do Rhinovirus HRV89 ou HRV2. - 8* - Processo para a obtenção dum organismo hospedeiro transformado ou duma cultura de células transformada de acordo com a reivindicação 7» caracterizado pelo facto de a se quência de DNA corresponder a uma das sequências mencionadas nas reivindicações 15 a 19. 88

   — — Processo para a obtenção dum organismo hospedeiro transformado ou duma cultura de células transformada de acordo com a reivindicação 7» caracterizado pelo facto de a sequência de DNA estar contida num vector de expressão repli-cável. - 10» - Processo para a obtenção dum organismo hospedeiro transformado ou duma cultura de células transformada de acordo com qualquer das reivindicaçães 7 a 9» caracterizado pelo facto de ser o microrganismo E. coli. - 11» - Processo para a obtenção dum vector de expres são replicável, caracterizado pelo facto de o vector obtido poder exprimir» num organismo hospedeiro transformado ou numa cultura de células transformada» uma sequência de DNA que codifica para uma proteína virai com a sequência de aminoácidos (l) ou (li) ou para suas partes ou alelos, com as propriedades de pelo menos uma ou partes das proteínas virais das estirpes de Rhinovirus HRV89 ou HRV2. - 12» - Processo de acordo com a reivindicação 11, ca • “1 - 8? - 1 racterizado pelo facto de a sequência de aminoácidos corres-

   ponder a uma das sequências mencionadas nas reivindicações 15 a 19. - 13a - Processo de acordo com a reivindicação 11, ca racterizado pelo facto de o vector obtido ser o vector pKK89/ /2A. - l4* - Processo de acordo com a reivindicação 11, ca racterizado pelo facto de o vector ser o vector pRH969/l ou pEH969/2. - 15a - Processo para a preparação duma moléculadeDNA, caracterizado pelo facto de a molécula de DNA obtida corresponder a todo ou a parte do DNA de estirpe de Rhinovirus HRV89 ou das suas formas degeneradas. - 16& - Processo de acordo com a reivindicação 15» ca racterizado pelo facto de a molécula de DNA obtida conter uma sequência de DNA que codifica para uma proteína virai com a sequência de aminoácidos 1 a 2164 indicada na sequência (X), suas partes ou alelos com as propriedades de pelo menos uma * ou partes das proteínas virais da estirpe de Rhinovirus HRV89 • assim como das suas formas degeneradas. 90 - - 17§

   Processo de acordo com uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo facto de a molécula de DNA obtida conter uma sequência de DNA que codifica para a proteína virai VP1, VP2, VP3* VP4, P2A, P2B, P2C, P3A, P3B ou P3C,suas partes ou seus alelos, com as propriedades de pelo menos uma ou partes das proteínas virais da estirpe de Rhinovirus HRV89 assim como das suas formas degeneradas. - 18S - Processo de acordo com a reivindicação 17, ca racterizado pelo facto de pelo menos duas das mencionadas pro teínas virais assim como das suas formas degeneradas serem piadas uma com a outra em qualquer combinação. - 19s - Processo para a preparação duma molécula de DNA, caracterizado pelo facto de se hibridar, em condições ri gorosas que permitem reconhecer uma homologia que é maior do que 85%, com uma molécula de DNA de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 18 e codificar para uma proteína virai que possui as propriedades duma ou de partes das proteínas virais da estirpe de Rhinovirus HRV89. - 20- - Processo para a obtenção dum vector de clona- 91

   gem recombinant e, caracterizado pelo facto de o vector obtido conter uma molécula de DNA de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 19· - 21 & - Processo para obtenção duma linha de células híbridas, caracterizado pelo facto de as células híbridas pro duzirem anticorpos contra um dos polipéptidos de acordo com uma das reivindicações 2 a 6, - 22& - Processo para a obtenção de anticorpos mono-clonais, caracterizado pelo facto de os referidos anticorpos neutralizarem de maneira específica, total ou parcialmente, a acção dos polipaptidos de acordo com uma das reivindicações 2 a 6 ou se ligarem especificamente a um dos referidos polipéptidos. - 23- - Processo de acordo com a reivindicação 22, ca racterizado pelo facto de os anticorpos, além de possuirem propriedades de neutralização, também ligarem a forma desnatu rada do seu antigene. - - Processo de acordo com as reivindicações 22 e - 92 -

   23» caracterizado pelo facto de se imunizarem animais hospedeiros com um dos polipéptidos obtidos de acordo com as reivindicações 1 a 6, se fundirem B-linfécitos destes animais hos pedeiros com células de mieloma, se subclonarem as linhas de células híbridas que segregam os anticorpos monoclonais e se cultivarem in vitro ou in vivo. - 25ft Processo para a preparação de composições far macêuticas caracterizado pelo facto de se incorporar,numa mis tura de substâncias veiculares e/ou auxiliares farmaceutica-mente inertes, uma quantidade activa de pelo menos um dos polipéptidos quando obtidos de acordo com as reivindicações la 6. - 26¾ - Estojo de ensaio para a determinação da presença de polipéptidos de acordo com uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo facto de conter anticorpos monoclonais de acordo com as reivindicações 22 ou 23. - 27& - Processo para a determinação qualitativa e/ou quantitativa dum dos polipéptidos de acordo com uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo facto de se utilizar os anticorpos monoclonais de acordo com a reivindicação 22 ou 23. - 28¾ - - 93 - Processo para a purificação dum dos polipepti dos de acordo com uma das reivindicações 2a 6, caracterizado pelo facto de se utilizar os anticorpos monoclonais de acordo com as reivindicações 22 ou 23· A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã» em 23 de Agosto de 1<?86 e em 17 de Janeiro de 1987» sob os n^s, P 36 28 658.3. e P 37 01 301.7» respectivamente. Lisboa, 21 de Agosto de 1987

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