PT831797E - Carotenóides farmacêuticamente activos. - Google Patents

Description

1 ΡΕ0831797

DESCRIÇÃO "CAROTENÓIDES FARMACEUTICAMENTE ACTIVOS" A invenção refere-se à utilização da meso-zeaxan-tina a qual aumenta a deposição do pigmento macular no olho humano. A invenção está particularmente mas não exclusivamente interessada nas composições farmacêuticas que contêm meso-zeaxantina para utilização no tratamento terapêutico ou profilático da doença da mácula e em particular da degeneração macular relacionada com a idade (AMD). A mácula é a região anatómica da retina que no homem é responsável pela visão central. Centrada na fóvea, onde o eixo visual se encontra com a retina, extende-se radialmente para o exterior para uma distância de cerca de 2.75 mm (Davson, 1990). A mácula está dividida em mácula interna e mácula externa. A mácula interna estende-se radialmente para fora a uma distância de 1,5 mm enquanto que a mácula externa é definida pelo anel anular circundante. A parte central da mácula é facilmente reconhecida devido à sua coloração amarelada que resulta da presença do pigmento macular.

Apesar do seu pequeno tamanho a mácula é dotada do mais alto grau de acuidade visual. Por isso não surpreende que seja dedicado um esforço considerável para 2 ΡΕ0831797 compreender e, quando possível, para tratar doenças que interrompam o funcionamento normal da mácula. Uma tal doença é a degeneração macular relacionada com a idade (AMD) que ocorre em aproximadamente 20% da população acima dos 65 anos de idade e que é a principal causa de insuficiência visual nos EUA e no Reino Unido. A AMD tem sido até à data uma condição irreversível.

Extractos removidos do pigmento macular foram descobertos ter um espectro de absorção carotenóide semelhante ao encontrado no da luteína, Wald (1945). Trabalhos adicionais nos anos 80 demonstraram que consistia na luteína e na zeaxantina (Bone et al 1985).

Um trabalhos mais recente (Bone et al 1993) demonstrou que o componente da zeaxantina encontrado na retina humana é ele próprio composto por todos os três dos possíveis estereómeros. A Figura 1 mostra as estruturas estereoquímicas dos componentes maculares do pigmento. Os grupos hidroxílicos 3' na luteína e na meso-zeaxantina têm a mesma configuração absoluta fazendo a interconversão possível por um movimento de dupla ligação do 4'-5' (luteína) à posição 5'-6' (meso-zeaxantina). Dos três estereómeros, SSZ está somente presente como um componente relativamente pequeno. RRZ é de origem dietética enquanto que a RSZ (meso-zeaxantina) não é comum na dieta e não é detectado no soro humano. Foi sugerido que a presença de RSZ pode ser o resultado da isomerização da luteína a RSZ por um enzima. 3 ΡΕ0831797 WO 91/03571 divulga um método de preparação da zeaxantina. A função do pigmento macular não foi inequivocamente determinada. Propôs-se que urna função possa ser a de reduzir o efeito adverso da aberração cromática no meio ocular aumentando desse modo a acuidade (Walls 1967; Readíng e Weale 1974) , Actuaimente, a opinião ma is usualmente defendida é que o pigmento age de uma forma protec-tora contra os efeitos prejudiciais da luz azul (Dicthburn 1973, Kirshfeld 1982, Bcne et ai 1984) a qual pode induzir a formação de radicais livres reactivos dentro da retina e a formação de tais espécies pode ser extremamente reduzida nos indivíduos que têm um elevado nível de pigmentação macular. O pigmento macular pode também, servir passivament^ como um filtro e proteger tecidos sensíveis da prejudioia]_ luz azul excessiva. A AMD è uma doença que se desenvolve gradu^j mente, ao longo de um período de muito* ano* sendo a r..... u«rd de visão o resultado final, o tecido danificado um índ ice i nvu 1 ga. mente elev ado de conteúd ío iip í d: ico que . J-Οχ sug erido oxi da r para forrt ;ar lípofuscina um pr odui :o fluo- res eente de ox. idação lipí· dica. Postulou· -se qu ίθ a e. xposi-çào da retír ia à 1 uz azul ex cessiva pode ; iument ar a taxa da for mação oe 1.1. pofuscina { Feeney-Burns e t al j. Q } r ^ ^ S q}\ ot al 19 90) .

Até ao momento, pouco sabido sobre os fa; -°te< 4 ΡΕ0831797 que influenciam o consumo de carotenóides na mácula e há nenhuma cura eficaz ou prevenção para a AMD ; Os es tudos de c arotenóides no plasr na em estu de controlo de casos de - &MD foram ambíguos, No estudo Oih o de Beaver Dam (Maix ns-Per l.man et ai 19 95), não ob s ervada nenhui Tici d±jLereric. :a entre 16 7 casos e 167 contro de soro incluindo a luteina ou a zeaxantina. Resultados de 421 ca S 0 s Θ c le 615 Est udo de C 3, o-Conti com ní ve i. s elevados ao (j L LI ipo eiev ado ti AMD rpi odos 3 C· caro tu zeaxan tina ; 0 beta xan tin a fo .ti aro. implic et al 0 L-tf 0 lut eín a e zea .xan l i.a ntrolos foram relatados no Grupo de e da Doença do Olho (1993) . Pessoas carotenóides no soro no grupo médio :am um meio a um terço de risco da )dos os carotenóides medidos incluindo a luteina, a roteno, o alfa caroteno e a cripto->s, Numa publicação adicional (Seddon tores descobriram que o consumo de (que sâo obtidos principalmente dos vegetais de folha verde escura) foram fortemente associados a um risco reduzido da AMD, Contudo, algumas pessoas com um consumo elevado de vegetais de folha verde sofrem também da AMD,

Adicionalmente, Seddon et al (1995) investigaram a relação entre o risco de desenvolver a AMD e o consumo alimentar de carotenóides e vitaminas A, C ε E, Um elevado consumo alimentar de carotenóides foi associado com um menor risco da AMD,

Schalch (1992) stiaou a ideia aue a concen- 5 ΡΕ0831797 traça o de c arotenóides alimentar* as n; a mácula não é aci- denta .1 f ΓΠ8. S que a sua presença ] pode prevenir ou ]. l.n \ 1 ΐ cl d- danos devido às suas propriedade s fi sioquímio, as e a unia capac idade p rara reprimi li: os radie 3 S livres de oxigén .ío e oxigé nio sir nples, que odO prOOUZ idos na retir. ia como rima conse quência da presenç a simultâne a da luz e do oxiaénd .0 . W096/19215 divulga um método para a prevenção ou tratamento de arteriosclerose num mamífero, em que o método engloba a administração de uma quantidade eficaz de um tocoferol natural e de um caroteno natural para prevenção ou tratamento da arteriosclerose num mamífero que precise de tal prevenção ou tratamento.

Os autores da DE4020974 (e a correspondente patente EU 5,290,605} divulgam um refrigerante nutricional para protecção contra o perigo de exposição à luz UV, em que a bebida engloba carctenóides, opcionalmente em conjunto com a vitamina C e/ou vitamina E e/ou outros antí-oxidantes fisioiogicamente aceitáveis.

Num resumo publicado na edição de Março de 1995 do "Investigative Ophthalmology and Visual Science” (36, suppl, 3v2} , rol. relatada a analise de caror.enoid.es de 8 olhos normais e de 3 olhos de pacientes com AMD. Qs resultados sugeriram que uma correlação positiva existiu entre a redução do pigmento macular e a prevalência da AMD, mas foi recomendado cuidado nesta interpretação porque o reduzido pigmento macular poderia ser um resultado, em vez 6 ΡΕ0831797 de uma causa da doença. Quando o conteúdo do resumo acima mencionado foi suba retido para publ: Lcação num a revista cientifico, os peri tos recomendaram rej eição porque o número de amostras a n v r j_ s a d a s e r a dema siado pequeno.

Resultados adicionais foram consequentemente necessários antes que qualquer conclusão pudesse ser tomada do possível papel preventivo da luteína/zeaxantina na AMD. E objecto da actual invenção aumentar o pigmento macular e prevenir ou curar a AMD pela administração de um composto farmacêutico englobando meso-zeaxantina em combinação com um veiculo farmacêutico ou diluente. E ainda objecto desta invenção providenciar a utilização da meso-zeaxantina na fabricação de um medica- mento para utii ização no tratamento da depreciação do pigmento ar; iarel.0 da mácula, na mácula de um. olho de um paciente hu: mano.

Dentro do contexto acima descobrimos com alguma surpresa que através da selecção de um tipo particular de carotenóide, nomeadamente meso-zeaxantina é possível aumentar o pigmento macular na mácula humana a qual poderia levar á prevenção e/ou tratamento da AMD nessas pessoas de risco ou sofrendo da doença.

Além disso a dose eficaz é supreendentemente, bastante maior que aquela que é normalmente conseguida através da quantidade de zeaxantina nos vegetais de folha 7 ΡΕ0831797 verde, embora possa ser suspeito, já que a mácula contem seaxanti: ia, que a adminí st ração d> e zeaxantína em quant ic- dades se melhantes à que ocorre eu n vegetais ve rdes possa subir a concentração do pi cimento macular, foi descoberto com alguma surpresa que quando o earotenóide é admmistraao oralmente numa forma concentrada o valor necessário para ser eficaz a curto prazo é consideravelmente maior que o

Além disso, foi descoberto, numa amostra suficientemente grande para garantir conclusões, que o conteúdo de luteína/zeaxantina nas retinas dos olhos de pessoas com AMD era 30% menor que o das pessoas com olhos normais. e, num suple-gmento iacul ar-agente a do em 10-50

Da mesma forma, a presente invenção fornec aspecto, a meso-zeaxantina para uso como fármaeo ou mento alimentar, partículamente na elevação do pi macular e na prevenção ou controlo da degeneração m relacionada com a idade. De uma forma geral, o activo (por exemplo a meso-zeaxantina) pode ser as; regime de dosagem, diária total até 100 mg tipicamente mg diários com urna dosagem ideal de 30 mg por dia. A dose depende do tempo de administração. Quando a mácula tem um pigmento macular reduzido, uma dose elevada (cerca de 30 mg/dia) é normalmente utilizada. As utilizações, de acordo com a invenção, são principalmente direccionadas a uma dose elevada do paciente (por exemplo valores de 10 mg/dia ou superiores) e estão especialmente ΡΕ0831797 preocupados com a corporização ideal para alcançar níveis de carotenóide no soro de pelo menos 0,7 ou 0,8 mm/ml.

Durante o período inicial de administração, é preferível usar uma dose maior, de cerca de 30 mg/dia durante várias semanas. Contudo, quando é alcançado um patamar na concentração do pigmento macular, uma dose de manutenção de por exemplo cerca de 7,5 mg/dia é preferível. A razão para isto é que, numa dose elevada, a pele pode ficar amarela devido à cor amarelada da meso-zeaxantina. Isto é um efeito secundário indesejável. Mesmo que este efeito possa ser tolerado por um curto espaço de tempo, uma dose mais baixa de manutenção é preferível já que é suficiente para manter o nível da pigmentação macular a um nível desejável e não causa pigmentação da pele.

Uma forma de dosagem unitária como por exemplo um comprimido de 750 mg ou uma cápsula de 800 mg utilizada numa base diária pode conter 0,1% a aproximadamente 12,5% por peso de zeaxantina e outros ingredientes podem incluir:

Beta Caroteno cerca de 2 a cerca de 20 mg e.g. cerca de 5 mg

Licopeno cerca de 2 a cerca de 20 mg e.g. cerca de 5 mg

Vitamina A cerca de 400 a Cerca de 600 RE e.g.

cerca de 500 RE

Vitamina C cerca de 75 a cerca de 250 mg e.g. cerca de 100 mg ΡΕ0831797 - 9 -

Vitamina E Selénio Cobre Zinco Manganésio Ubiquinona (Coenzima Q10) Veiculo cerca de 50 a cerca de 250 mg e.g. cerca de 100 mg cerca de 80 a cerca de 120 mcg e.g. cerca de 90 mcg cerca de 2 a cerca de 4 mg e.g. cerca de 3 mg cerca de 10 a cerca de 20 mg e.g. cerca de 15 mg cerca de 2 a cerca de 5 mg e.g. cerca de 4 mg cerca de 10 a cerca de 100 mg e.g. cerca de 50 mg cerca de 150 a cerca de 250 mg e.g. cerca de 175 mg ou cerca de 200 mg

Da mesma forma, pode ser desejável empregar uma dose elevada de meso-zeaxantina seguida de uma dose mais baixa, quando o pigmento macular alcançar um patamar. Para aqueles hábeis na arte, a pigmentação macular pode ser medida por um fotómetro de chama (ver exemplo 2). A composição da invenção é especialmente útil no aumento do pigmento macular na mácula humana e no tratamento preventivo da degeneração macular relacionada com a idade.

Como pode ser visto na Figura 1 dos desenhos, a luteina e a zeaxantina são estereómeros. Os diastereómeros da zeaxantina podem existir em três formas diferentes na 10 ΡΕ0831797 natureza, nomeadamente a zeaxantina (o 3R, a forma 3'R) a meso-zeaxantina (o 3R, a forma 3'S) e 3S, 3'S zeaxantina. A meso-zeaxantina é um isómero que não ocorre naturalmente (pelo menos em alguma abundância) sem ser no olho do primata, e pensa-se ser sintetizado no olho por conversão enzimática.

No decorrer da invenção, pode ser utilizado um composto, como definido na sua forma livre. A invenção fornece uma composição farmacêutica que engloba a composição da meso-zeaxantina em conjunto com um diluente ou veiculo farmacêutico aceitável.

Tal composição pode ser utilizada em forma bruta, ou de preferência, em de forma de dosagem unitária. Assim, por exemplo, a composição pode ser formulada como um comprimido, cápsula, pó, solução ou suspensão.

As composições de acordo com a invenção podem ser preparadas utilizando um agente activo carotenóide de acordo com a prática convencional de suplementos alimentares ou farmacêutica. Os diluentes, excipiente ou veículos que podem ser utilizados são bem conhecidos na arte de formulação e a forma escolhida para qualquer regime específico dependerá do contexto dado e da escolha do formu-lador. 11 ΡΕ0831797

Na realização desta invenção, o carotenóide acti-vo pode ser utilizado em conjunto com outros agentes activos. Entre outros tais agentes, podem ser mencionados, por exemplo os que se seguem, nomeadamente outro carotenóide tal como o licopeno ou alfa-caroteno, beta-caroteno, gama-caroteno ou delta-caroteno, ou um ou mais dos seguintes antioxidantes, nomeadamente a vitamina A, vitamina C, vitamina E (α-tocoferol e outros tocoferóis activos), selénio, cobre, zinco, manganésio e ubiquinona (coenzima Q10) . 0 uso de uma mistura contendo um tocoferl tal como o α-tocoferol é preferido já que se acredita que tal mistura proporciona um efeito sinergistico.

Os carotenóides são destruídos parcialmente por oxidação no tracto gastrointestinal. Pela adição da vista-mina E e/ou vitamina C, este processo é inibido e mais carotenóide é absorvido. 0 inibidor pode ser incluído como parte de uma composição, como parte de uma invenção ou administrado separadamente.

Além dos aspectos acima, a invenção incluí oa utilização de um carotenóide meso-zeaxantina na fabricação de um medicamento para aumentar o pigmento na mácula do olho humano para tratamento ou prevenção de degeneração macular relacionada com a idade ou outras doenças de depreciação do pigmento macular. 12 ΡΕ0831797

Adicionamente, a invenção inclui um processo para o fabrico de um medicamento para os propósitos acima mencionados.

Os seguintes Exemplos destinam-se a ilustrar a invenção unicamente como forma de exemplo. As referências nos Exemplos é feita para as Figuras 2 a 4 dos desenhos, em que: A Figura 2 mostra a razão de L:Z para ambos olho normal e olho AMD para cada disco ou anel de tecido retinal representado contra a razão MZ:Z. As razões de luteina para zeaxantina e meso-zeaxantina estão consistentemente reduzidas para olhos com AMD quando comparadas com olhos normais. A Figura de Referência 3a mostra o aumento de tempo-dependente no nivel de luteina no soro do Indivíduo JTL (Exemplo 2) . As barras de erro representam os desvios padrão nas medições. Dia "0" representa o início do suplemento de luteina. A Figura de Referência 3b mostra o aumento de tempo-dependente no nível de luteina no soro do Indivíduo RAB (Exemplo 2) . As barras de erro representam os desvios padrão nas medições. Dia "0" representa o início do suplemento de luteina. A Figura de Referência 4a mostra a medição da 13 ΡΕ0831797 densidade do pigmento macular óptico diário para o Individuo JTL (Exemplo 2) com começo 7 dias antes do inicio (dia "0") do suplemento de luteina até ao dia 72. Olho esquerdo - círculos sólidos; olho direito - círculos abertos. A linha a cheio é o ajustamento linear dos mínimos quadrados para os dados do olho esquerdo e tem um declive de 15,3 x 103 unidades de absorvância de por semana. A Figura de Referência 4b mostra a medição da densidade do pigmento macular óptico diário para o Indivíduo RAB (Exemplo 2) com começo 7 dias antes do início (dia "0") do suplemento de luteina até ao dia 83. A linha a cheio é o ajustamento linear dos mínimos quadrados para os dados do olho esquerdo e tem um declive de 3,1 x 103 unidades de absorvância de por semana. A linha tracejada é o ajustamento dos dados do olho direito e tem uma inclinação de unidades de absorvância de 2,3 x 103 por semana. A Figura de Referência 4c mostra a medição da densidade do pigmento macular óptico diário para o mesmo indivíduo como no caso da Figura 4b, para um período mais longo de administração de luteina que inclui o período representado na Figura 4b.

As Figuras de Referência 5a, 5b e 5c mostram as medições da densidade do pigmento macular óptico diário para o mesmo indivíduo como no caso da Figura 4a, para um período mais longo de administração de luteina que inclui o 14 ΡΕ0831797 período representado na Figura 4a, Figura 5a relativo ao olho direito do indivíduo, Figura 5b relativo ao olho esquerdo e Figura 5c representando a média de E-D.

Exemplo 1 1.1 Análise de carotenóides nos olhos

Foi conduzida uma análise por HPLC das retinas obtidas de indivíduos normais e com AMD utilizando uma amostra suficientemente grande para garantir conclusões da importância da luteína e da zeaxantina na prevenção macular da AMD. Foram determinadas e comparadas as quantidades e a distribuição dos carotenóides maculares, incluindo os estereómeros para 15 olhos normais e 22 olhos com AMD a fim de determinar se existe evidência a favor ou contra a hipótese de que a protecção da exposição à luz conferido pelo pigmento macular tem um papel significativo na redução da AMD.

Para cada olho normal e olho com AMD, foi cortada a retina neural num disco central e 2 anéis concêntricos utilizando trefinas de 3, 11 e 21 mm. Para extrair os carotenóides, os tecidos foram moídos em etanol/água (1:1) ao qual foi adicionado 10 ng de éster de monometilo de luteína como padrão interno. A separação e a quantificação das fracções de zeaxantina e de luteína foi realizada por Cromotografia Liquida de Alta Resolução (HPLC) de fase reversa utilizando uma coluna Phenomenex. 15 ΡΕ0831797

Os derivativos de carbamato de estereómeros individuais quer da zeaxantina quer da luteina foram separados numa coluna de HPLC de fase normal utilizando os métodos de Ruttiman et al (1983) e Schiedt et al (1995) e os resultados foram traçados na Figura 2. 1.2 Resultados e Conclusões

Como representado na tabela 1, os olhos com AMD tinham aproximadamente uma média de 70% do carotenóide total encontrado nos controlos, um número que foi muito consistente através da retina. Dezassete (77%) dos vinte e dois olhos com AMD tiveram valores totais de luteina e zeaxantina nos 3 mm centrais da retina, números que estiveram abaixo da média (5.9 pmole/mm2) para o grupo de controlo. Para os dois anéis, com diâmetros externos de 11 e 21 mm respectivamente, foi descoberto que 15 (68%) do grupo com AMD tinha um total de carotenóides menores que os das regiões correspondentes no grupo de controlo.

As diferenças observadas nos anéis internos entre os olhos do grupo de controlo e os olhos com AMD descobriu--se serem estatiscamente significantes (num teste simples p<0,05); as diferenças foram quase significativas no anel médio e exterior (p<0,l).

As distribuições relativas dos carotenóides 16 ΡΕ0831797 através da retina normal e de olhos com AMD foram descobertas ser essencialmente as mesmas. Ambos os grupos foram caracterizados por uma diminuição na quantidade de meso-zeaxantina e um relativo aumento de luteina com um aumento da distância da fóvea. Os valores relativos da luteina e da meso-zeaxantina em comparação com a zeaxantina são consistentemente mais baixos nas retinas com AMD do que nas retinas normais. CAROTENÓIDE TOTAL/ÁREA DE UNIDADE ( pmoles/mm2) Dador # INTERNO MEDIANO EXTERNO (7,1 mm2) (93 mm2) (343 mm2) 1 GO CN τ—1 0,88 0,19 2 10,5 0,51 0,10 3 10,4 0,89 0,18 4 9,3 1,35 0,36 5 8,4 0,38 0,07 6 5, 8 0,19 0,06 7 5, 3 0,23 0,43 CONTROLO 8 5,1 0,48 0,21 OLHOS 6 4,7 0,15 0,05 9 4,6 0,21 0,06 9 4,3 0,18 0,05 10 2,5 0,07 0,03 10 2,2 0,08 0,03 11 2,0 0,26 0,20 12 1,0 Oh O o 0,02 17 ΡΕ0831797

Média do 5,9+3,4 0,04+0,36 0,14+0,12 controlo ± dp 13 9,5 0,47 0,19 13 9,4 O co 0,23 14 8,4 0,30 0,12 14 7,7 0,56 0,13 15 6,7 0,17 0, 09 16 5,7 0,24 0, 08 17 4,8 0,47 0,15 18 4,5 0,34 0, 07 16 4,5 0,20 o o 19 4,5 0,14 LO o o 17 4,0 0,24 0, 11 19 3,8 LO O o 07 o o 20 3,4 0,45 0,19 21 3,4 0,20 07 o o 20 2,4 0,46 0,13 22 2,3 0,13 0, 05 22 1,9 0,11 0, 06 23 1,2 0,03 0, 02 1 0, 71 0,47 0,19 23 0,46 0,03 0, 02 24 0,43 0,10 0, 03 24 0,32 0,07 O o hO 18 ΡΕ0831797

Exemplo de Referência 2 - Absorção de luteína em adultos humanos (Fora do âmbito da invenção) 2.1 Absorção de Soro

Um ensaio foi conduzido para determinar se o suplemento dietético com luteina e zeaxantina pode mudar de forma eficaz os níveis do pigmento na mácula. A densidade óptica do pigmento macular foi medido para cada indivíduo utilizando o método de cintilação fotométrica (Bone e Sparrock 1971; Bone et al 1992) . A concentração do pigmento na mácula é proporcional à sua densidade óptica e o valor do pigmento foi assumido ser proporcional à concentração. Assim, a densidade óptica foi tomada como uma medida do valor total do pigmento. A luteína e a zeaxantina no soro foi medida por Cromotografia Liquida de Alta Resolução (HPLC)convencional.

Dois adultos saudáveis do sexo masculino (de idade/peso 42 anos/60 kg e 51 anos/61 kg) injeriram o equivalente a 30 mg de luteína por dia na forma de éster de luteína (fonte: flores de calêndula) suspenso em 2ml de óleo de canola. Isto foi continuado por um período de 138 dias altura em que foi interrompida a dose de luteína. Análises químicas mostraram que o produto contem aproxi-madamente 97% de luteína e 3% de zeaxantina. Os níveis de 19 ΡΕ0831797 abstenção de luteína/zeaxantina do soro de ambos indivíduos foram determinados por Cromotografia Liquida de Alta Resolução (HPLC) convencional na manhã da primeira dose como medida de linha de base. Foram efectuadas análises de sange em intervalos de 2-3 horas durante o primeiro dia a ambos indivíduos e depois diariamente nos três dias seguintes. Após a primeira semana de suplemento foram efectuadas análises ao sangue semanalmente. 0 sangue foi guardado num tubo padrão separador de soro Vacutainer não contendo anticoagulantes. Após permitir cerca de 30 minutos para coagulação, a amostra foi centrifugada durante 10 minutos e o soro removido com uma pipeta. As amostras de soro foram guardadas a -20°C antes de analizadas. Foram retirados carotenóides do soro por uma pequena modificação de métodos amplamente utilizados (Gjiliano et al, 1993; Handelmann et al, 1992) . Alíquotas de 200μ1 de soro foram diluídas com 2ml de 50% etanol/água para assegurar a precipitação dos componentes proteicos. Neste ponto foi adicionado à solução 20μ1 de um padrão interno, éter monohexílico de luteína, contendo cerca de 90 ng, para quantificação dos carotenóides por HPLC. Esta solução foi extraída 3 vezes com porções de 2ml de hexano por vórtice da amostra durante 1 minuto seguido de centrifugação durante 5 minutos e remoção da camada de hexano com pipeta. As três porções de hexano foram secas sob uma corrente de gas de azoto e guardadas sob azoto a -20°C até a análise estar completa.

Os soros extraídos foram dissolvidos em 40 μΐ de 20 ΡΕ0831797 etanol antes de injeção. As amostras foram vigorosamente agitadas num misturador de vórtice durante 1 minuto para assegurar a dissolução da amostra. Duas réplicas da análise foram realizadas utilizando 20 μΐ de aliquotas. Os carotenóides do soro foram eluídas a uma razão de fluxo de 1 ml/min através de uma coluna 3 ym HS Adsorbosphere ODS de 15 cm x 4,6 mm (Alltech) em conjunto com uma coluna de 5 ym Spehrisorb ODS de 25 cm x 4,6 mm (Keystone Scientific) com detecção dos carotenóides a 451 nm.

As Figuras 3a e 3b mostram o aumento da concentração da luteina no soro nos dois indivíduos durante o curso de tempo da experiência de suplementação. A concentração de luteina em ambos indivíduos aumentou por um fac-tor de cerca de 10 vezes durante a primeira semana e continuou elevada daí para a frente. 2.2 Absorção macular A densidade óptica do pigmento macular foi medida para cada indivíduo utilizando o método de fotometria heterocromática de cintilação (Bone e Sparrock, 1971; Bone et al, 1992) . A concentração do pigmento na mácula é proporcional à sua densidade óptica e o valor real do pigmento foi assumido ser proporcional à concentração. Assim, a densidade óptica foi tomada como sendo uma medida do valor total do pigmento.

No método de cintilação, um pequeno estímulo 21 ΡΕ0831797 visual é apresentado ao olho que alterna em comprimento de onda entre 4 60 nm, o comprimendo de onda máxima de absor-vância do pigmento macular, e 540 nm onde a absorvância do pigmento é zero (Bone et al, 1992) . Acima de uma certa frequência, ocorre uma fusão de cor mas o estimulo continua a cintilar. A uma frequência elevada, pode ser alcançada uma condição critica onde a cintilação só pode ser eliminada se os dois componentes de comprimento de onda forem igualados em luminância. Se o estimulo é visto periféricamente de modo a que a imagem caia fora da mácula, nenhum comprimento de onda é atenuado pelo pigmento macular. Contudo, se 0 estímulo é visto centralmente, a intensidade da luz de 4 60 nm pode ser aumentada para compensar pela absorção do pigmento macular de forma a conseguir a igualdade de luminância. Assim é possível determinar a densidade óptica do pigmento macular de um indivíduo no pico do comprimento de onda ou, na realidade, qualquer outro comprimento de onda. A validade desta técnica depende da resposta relativa espectral dos receptores ser a mesma da utilizada nos locais centrais e periféricos. A cintilição, que o indivíduo procura eliminar, é de luminância e, assumindo condições fototópicas, a luminância é devida possivelmente a uma resposta adictiva de um cone sensitivo de comprimento de onda longo e médio (Guth et al, 1980). Há evidência que estes dois tipos de cones estão presentes em igual proporção nos dois locais utilizados (Wooten e Wald, 1973). Os cones de comprimento de onda curta, cuja abundância relativa diferem entre os dois locais, são assumidos 22 ΡΕ0831797 geralmente, não contribuir para a luminância (Guth et al, 1980), ainda que outros, utilizando técnicas de cintilação, procuraram eliminar a sua participação (Pease et al, 1987; Werner et al, 1987; Ha mmond et al, 1995) . A justificação final para o nosso procedimento é para ser descoberta na reprodução exacta do espectro de absorvância que gera o pigmento macular. (Bone et al, 1992) . O aparato consistiu num sistema de vista Maxwellian de dois canais baseado numa fonte de luz única, uma lâmpada de arco xenon de 75 W. Os comprimentos de onda dos dois canais foram determinados por filtros de interferência 460 nm e 540 nm respectivamente, tendo meia-largura de 7 e 9 nm. Os canais foram combinados por um espelho rotativo semi-circular e uma abertura circular num écran branco providenciava um estímulo de 1.5° de diâmetro. "Cross-hairs" facilitaram a fixação central do estimulo. O écran tinha 18° de diâmetro e foi iluminado com uma luz branca da mesma fonte. A iluminância do écran foi ajustada para fornecer o mesmo estímulo de iluminância da retina, 4 log Td. Isto foi considerado ser suficientemente elevado para minimizar problemas associados com a intrusão dos bastonetes que poderiam de outra forma, afectar diferencialmente as medições da mácula e da retina periférica (Wyszcki e Stiles, 1982) . Um pequeno LED vermelho foi colocado 8o acima do centro do estímulo para fornececer uma marca de fixação para a visão periférica do estimulo. A intensidade do canal 460 nm podia ser ajustada pelo indivíduo através de uma cunha compensada de densidade neutra cuja definição podia ser gravada por um botão de 23 ΡΕ0831797 pressão. A frequência de cintilação estava também sob controlo do indivíduo através de um potenciómetro. Uma impressão de mordida dental ajustável assegurava o posicionamento exacto e constante do olho do indivíduo relativamente à saída da pupila. A frequência de cintilação foi ajustada a um valor pre-determinado que, para a visão central do indivíduo, permitiria a eliminação da cintilação através apenas de uma muito pequena escala de ajustes da cunha. Esta frequência estava a um intervalo de 25 a 35 Hz. Tendo sido ajustada a cunha de forma a não haver uma condição de cintilação, o indivíduo adaptava-se às condições de visão através da fixação no estímulo de "cross-hairs" de um olho durante dois minutos. 0 outro olho do indivíduo estava tapado por uma venda. No final deste período, o indivíduo continuou a fazer series de 10 a 15 ajustamentos de cunha, tentando obter o centro de não cintilação da escala. A cunha foi deslocada aleatoriamente após cada ajuste. Em certas ocasiões, o indivíduo não conseguia eliminar inteiramente a cintilação mas procurava alternativamente uma condição de cintilação mínima. Isto foi seguido por um outra série de de 10 a 15 ajustes enquanto fixava o LED, tendo sido reduzida a frequência para 12 a 16 Hz de forma a reduzir a escala de não cintilação. O procedimento inteiro foi repetido então para o outro olho do indivíduo. A densidade óptica do pigmento macular do indivíduo foi medida diariamente por um período de uma semana antes do começo do suplemento de luteína e diariamente depois disso. 24 ΡΕ0831797

As Figuras 4a e 4b mostram a absorvância do pigmento macular durante a duração das experiências nos dois indivíduos. Um aumento do nível do pigmento macular do indivíduo JTL foi observado pela primeira vez no 14° dia de suplemento. Este indivíduo tinha níveis de pigmento macular em ambos os olhos que foram determinados de forma experimental através de medições repetidas para igualarem (+-2%) os valores iniciais de 0,57 e 0,58 sendo determinados pela média de 15 medições obtidas num período de tempo de 17 dias. A comparação destes valores com a média de 15 medidas obtidas num período de 18 dias no final da experiência deu valores de 0,67 e 0,70 para o olho direito e esquerdo, respectivamente, mostrando que o aumento da densidade óptica do pigmento macular é altamente significativo p<0,0005 para ambos olho direito e esquerdo, baseado num teste t de unilateral. Após interrupção da dose de luteína no dia 138, a densidade óptica continuou a subir até ao dia 180 e então estabilizou.

Para o indivíduo RAB, foram encontradas diferenças significativas na densidade do pigmento macular do olho direito e esquerdo. O valor médio inicial do olho direito era 0,66 enquanto que o olho esquerdo era 0,76. Isto corresponde a uma diferença de 15% entre o olho esquerdo e direito do indivíduo. O aumento do pigmento macular determinado através da comparação média inicial para cada olho e a média final (0,70 direito, 0,79 esquerdo) foi descoberto ser altamento significativo (p<0,001). 25 ΡΕ0831797

Após interrupção da dose no dia 138, a densidade óptica continuou a subir em ambos os olhos até ao dia 200 e então estabilizou. Após diversas semanas de administração de luteina, as palmas ds mãos de cada indivíduo tomaram uma visível cor amarelada. Esta condição é semelhante à da induzida pelo beta-caroteno na mesma dosagem. O aumento da pigmentação macular demonstrou ser um processo vagaroso, apesar do elevado nível de luteina no plasma. Isto pode ser devido em parte à necessidade da luteina se espalhar na região avascular macular da retina. O ensaio estabeleceu uma relação entre o aumento dos níveis de luteina no soro e os aumentos correspondentes na concentração da luteina na mácula do olho humano. Suplementos de luteina a longo prazo em indivíduos com níveis baixos de pigmentação macular podem resultar num significativo aumento do nível de pigmentação na mácula.

Os nossos resultados sugerem que a pigmentação macular funciona para proteger a retina. Um aumento proporcional de foto-oxidação pode acompanhar níveis reduzidos de pigmento macular em alguns indivíduos e pode contribuir para um rápido aumento de lesões patológicas associadas com a AMD.

Exemplo de Referência 3

Foi preparada uma cápsula utilizando os seguintes 26 ΡΕ0831797 ingredientes por mistura simples e através do procedimento habitual de encapsulamento: mg por cápsula 200 50 200

Ingredientes por cápsula Reivindicação do Rótulo Éster de Luteina 30 mg de Luteina

Lecitina Óleo de Feijão de Soja É recomendada uma cápsula por dia/depois da refeição.

No exemplo acima, o éster de luteina pode ser substituído por uma mistura de isómeros de zeaxantina (zea-xantina normal, meso zeaxantina e 3S3'S zeaxantina). A utilização de meso-zeaxantina colocaria a cápsula resultante dentro do âmbito da presente invenção.

Exemplo de Referência 4

Foi preparada uma cápsula utilizando os seguintes ingredientes por mistura simples e através do prodecimento habitual de encapsulamento:

Ingredientes por cápsula Éster de Luteina Éster de Zeaxantina Lecitina Óleo de Feijão de Soja

Reivindicação do Rótulo 10 mg de Luteina 10 mg de Zeaxantina mg por cápsula 75 75 25 100 27 ΡΕ0831797 A mistura acima é uma mistura de 50% de cada carotenóide. Na cápsula acima, a zeazantina pode representar todos os seus isómeros (zeaxantina, meso zeaxantina e 3S3'S zeaxantina). A utilização de meso-zeaxantina colocaria a cápsula resultante dentro do âmbito da presente invenção.

Exemplo de Referência 5 (Fora do âmbito da invenção).

Foi preparada uma cápsula utilizando os seguintes ingredientes por mistura simples e através do procedimento habitual de encapsulamento:

Ingredientes por cápsula Reivindicação do Rótulo mg por cápsula Vitamina C (ácido ascórbico) 150 mg 160 a-tocoferal 100 mg 110 Éster de Luteina 15 mg de Luteina 90 Lecitina 25 Óleo de Feijão de Soja 75

Uma dose adequada para o tratamento da AMD seriam duas cápsulas diárias.

Exemplo de Referência 6 (Fora do âmbito da invenção). O procedimento do Exemplo 7 foi repetido à excepção da inclusão de 30 mg de Coenzima Q10 à mistura. 28 ΡΕ0831797

Exemplo de Referência 7 (Fora do âmbito da invenção).

Uma cápsula oval tamanho 12 de peso nominal 800 mg foi preparada dos seguintes ingredientes por mistura simples e através do procedimento habitual de encapsulamento:

Ingredientes por cápsula Reivindicação do Rótulo mg por cápsula Vitamina A Palmitato 1500 ui/gm 500 RE 1,277 Óleo Caroteno 15 mg BC 52,5 Éster de Luteína* 7.5 mg de Luteína 50 Vitamina C (Ácido Ascórbico) 100 mg 105 Tocoferóis mistos 1000 ui/gm 100 mg 149 Levedura de Selénio 90 mcg 90 Gluconato Cúprico para obter 3 mg Cu 22,26 Gluconato de Zinco para obter 15 mg Zn 117 Gluconato de Manganésio para obter 4 mg Mn 36,4 Redução de vegetais 56 Cera de Abelhas 23 Lecitina 72 Óleo de Feijão de Soja 75,563 *ésteres concentrados de luteína com um E (1%, lcm) de 300 a 340 em clorofórmio a 453 - corresponde a um conteúdo de luteína pura de 12 a 14.4%.

Para uma administração a longo prazo é adequada 29 ΡΕ0831797 uma cápsula por dia e tem, adicionalmente, valiosas propriedades antioxidantes.

Exemplo de Referência 8 (Fora do âmbito da invenção).

Uma dieta composta por uma fórmula de pó seco foi preparada pela mistura diária de 150 mg de éster de luteina com uma Dieta Cambridge (A Dieta Cambridge é uma Marca

Comercial Registada) produto obtido do "Cambridge Health Plan Ltd", Norwich, Inglaterra sob a identificação do produto.

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Lisboa, 23 de Maio de 2007

Claims (16)

1. ΡΕ0831797 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um medicamento que inclui meso-zeaxantina em combinação com um veiculo ou diluente farmacêutico.
2. 2. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, que inclui um outro constituinte biologicamente activo.
3. 3. Uma composição de acordo com a reivindicação 2, em que o outro constituinte biologicamente activo é um anti-oxidante.
4. 4. Uma composição de acordo com a reivindicação 3, em que o referido anti-oxidante é outro carotenóide ou é vitamina A, vitamina C, vitamina E, selénio, cobre, zinco, manganésio ou ubiquinona (Coenzima Q10).
5. 5. Uma composição de acordo com a reivindicação 4, em que o referido outro carotenóide é luteína; licopeno; ou alfa, beta, gama ou delta caroteno.
6. 6. Uma composição de acordo com qualquer reivindicação anterior, na forma de um suplemento alimentar, em que a meso-zeaxantina está contida como micronutriente.
7. 7. Uma composição de acordo com qualquer reivindicação anterior e em forma de unidade de dosagem contendo 10 a 100 mg de carotenóide(s) por dose. 2 ΡΕ0831797
8. 8. Uma composição de acordo com a reivindicação 7, contendo 20 mg a 50 mg de carotenóide(s) por dose.
9. 9. Uma composição de acordo com a reivindicação 7, contendo 30 mg de carotenóide (s) por dose.
10. 10. Uma composição de acordo com qualquer reivindicação anterior e em forma de comprimido, cápsula, pó ou suspensão por solução.
11. 11. Uma composição de acordo com qualquer reivindicação anterior e incluindo uma mistura de luteina e meso-zeaxantina compreendendo 10% a 90% por peso de luteina e 90% a 10% por peso de meso-zeaxantina.
12. 12. Uma composição de acordo com qualquer reivindicação anterior e na forma de uma mistura incluindo luteina e meso-zeaxantina em conjunto com lecitina e óleo de feijão de soja.
13. 13. Utilização da meso-zeaxantina para o fabricante de um medicamento para uso no tratamento da depreciação macular do pigmento amarelo na mácula de um olho de um paciente humano.
14. 14. Uma embalagem para programa de tratamento farmacêutico incluindo meios que definam a receptáculos individuais acessivelmente fechados que contêm as unidades 3 ΡΕ0831797 de dosagem respectivas de composições farmacêuticas que compreendam a meso-zeaxantina em conjunto com um veiculo, em que os referidos receptáculos são dispostos na embalagem num primeiro grupo de unidades de dosagem elevada e num segundo grupo de unidades de dosagem mais baixa, em que o primeiro grupo de receptáculos inclui pelo menos 14 e tem em cada um deles uma ou mais unidades do dosagem que proporcionam uma dosagem total de pelo menos 10 mg/receptáculo do carotenóide(s).
15. 15. Uma embalagem de acordo com a reivindicação 14, em que o segundo grupo de receptáculos inclui pelo menos 14.
16. 16. Uma embalagem de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que o segundo grupo de receptáculos tem em cada um deles uma ou mais unidades de dosagem que proporcionam uma dosagem total de não mais que 7,5 mg/receptáculo de carotenóides. Lisboa, 23 de Maio de 2007