PT789778E

PT789778E - Aparelho detector de material celular e respectivo metodo

Info

Publication number: PT789778E
Application number: PT95910682T
Authority: PT
Inventors: David Squirrell James
Original assignee: Secr Of S F D I H B M O Of The
Priority date: 1994-03-18
Filing date: 1995-03-13
Publication date: 2001-11-30
Also published as: GR3035961T3; DE69521140T2; ES2156937T3; CA2195956A1; RU2142016C1; CA2195956C; DK0789778T3; US5918259A; EP0789778A1; DE69521140D1; WO1995025811A1; AU699575B2; GB9405392D0; ATE201715T1; AU1858895A; US5773710A; EP0789778B1

Description

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DESCRIÇÃO “Aparelho detector de material celular e respectivo método” O presente invento refere-se a um método e aparelho para monitorização de um ambiente gasoso quanto à presença de material celular; mais em particular, refere-se a um aparelho capaz de fornecer uma medida da presença e/ou números de microrganismos celulares, tais como células bacterianas, dentro de um grande volume de ar, tal como num armazém ou instalação de produção ou num local ao ar livre onde se suspeite da presença de bactérias. O método e o aparelho do invento são fornecidos, em particular, para determinação da probabilidade de estar presente material patogénico ou alergénico num ambiente, através de medição contínua em tempo real do número de células. Este último formato proporciona uma monitorização contínua do ambiente.

Existe uma necessidade militar de detecção da incidência do ataque utilizando materiais biológicos, incluindo o ataque utilizando bactérias, por exemplo, sob a forma de células ou esporos. Esta necessidade inclui a capacidade de monitorizar o ar do lado do vento a alguma distância de um local de assentamento de modo a poder ser enviado ao pessoal o aviso suficiente no local em que está iminente um ataque com bactérias. Em tais circunstâncias, pretende-se que a monitorização seja executada continuamente, ou seja, por um período contínuo de tempo para cada dispositivo de monitorização, e.g. de várias até várias dezenas de horas.

Existe uma outra necessidade de determinação da presença de agentes patogénicos em instalações tais como hospitais, e em estabelecimento fabris, nos quais são colocados em recipientes antes de serem utilizados produtos alimentares, suplementos fisiológicos ou farmacêuticos esterilizados. Antes de se iniciar a produção é conveniente que seja verificada a esterilidade do ambiente de embalagem quanto à presença de agentes patogénicos ou bactérias menos prejudiciais, que possam ser utilizados como indicadores de uma possível presença de agentes patogénicos ou alergénios.

Em ambas as situações é necessário processar um grande volume de ar, tanto devido à natureza contínua da medição, como devido à necessidade de recolher amostras de um montante significativo de ar de uma sala de limpeza ou de um armazém esterilizado. Além disso, em ambas as situações é necessário filtrar

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 2 do seu tipo, pois a ameaça uma vasta gama de bactérias, independentemente poderá vir de um género ou espécie desconhecida. É conhecido utilizar a reacção de luminol para analisar a presença de hematina no ar, mas esta tecnologia é susceptível de fornecer leituras com materiais inorgânicos e é limitada a um limite de detecção de 103 de células bacterianas, e em teoria só é possível extrair 10'16 gramas de hematina de uma célula bacteriana média. A sensibilidade metálica que fornece radiações de fundo muito altas, tornam este sistema na prática pouco fiável. É conhecido identificar a possível presença de bactérias analisando a presença de trifosfato de adenosina nas amostras. Isto é facilmente executado utilizando luciferase e um agente de luciferina, em que a presença de ATP (trifosfato de adenosina) permite à luciferase catalisar a oxidação da luciferina com a resultante emissão de luz. As amostras são carregadas num luminómetro e a quantidade de luz emitida é utilizada como medida da quantidade de bactérias existente. De modo a libertar a maior quantidade possível de ATP de qualquer célula existente, é comum adicionar um detergente à amostra de modo a destruir as células e desprender o ATP.

Apesar desta bioquímica ter sido largamente utilizada com amostras individuais derivadas de amostragem directa das superfícies líquidas e sólidas, não houve grande desenvolvimento no equipamento de lumonometria, adequado para a monitorização de bactérias no ar.

Em JP 62093634 é descrito um contador para microrganismos que introduz uma amostra de ar, retira os microrganismos do mesmo e extrai deles o ATP antes de analisar o ATP, utilizando uma reacção luminescente. Este dispositivo utiliza um filtro de membrana de 0,2μ para retirar os microrganismos do ar de uma forma por lotes, sendo a membrana periodicamente analisada sendo passada para uma estação de extracção. Não são fornecidos pormenores sobre a sensibilidade deste equipamento, mas o seu desempenho é limitado pela capacidade da bomba de ar de aspirar ar de amostra suficiente através da membrana, e pelo tempo que leva a processar o conteúdo em microrganismos da membrana.

Em JP 60016598 é descrito um método para detecção de bactérias no ar utilizando novamente reagentes luminescentes para analisar o ATP. Este método extrai o ATP utilizando um tampão líquido Tris-EDTA aquecido a 100°C de

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 amostras de dezenas de litros de ar por minuto, em lotes de amostra de 10 minutos. São necessários filtros para eliminar a sujidade e a poeira, sendo estes considerados essenciais a este método. É necessário um tubo de refrigeração para evitar o aumento de ruído de fundo devido ao aumento de temperatura de tubos fotomultiplicadores utilizados para monitorizar a luminescência. Este aparelho utiliza também um “extractor” para lhe aspirar o ar até às dezenas de litros por minuto. Não é muito clara a natureza exacta deste “extractor”. É conhecido utilizar dispositivos de ciclone para a captura de partículas do ar, sendo em geral estes dispositivos accionados electricamente, produzindo fracções desprovidas de partículas e com partículas concentradas. É conhecido utilizar estes dispositivos com o fim de se obterem aerossóis e outras partículas do ar para análise posterior. Por exemplo, em GB 2245024 é descrito um ciclone para recolha de um grande volume de amostras de materiais biológicos do ar; em SU 1546481 e SU 11911460 é descrito a utilização de ciclones para fornecimento de uma amostra de partículas, a qual é utilizada para separar para análise vasos ou placas que contém nutrientes, enquanto em SU 916535 são recolhidas bactérias desse ciclone numa banda de filtro, e vírus numa secção inferior de onde são utilizados para infectar animais de experiência. É também conhecido utilizar dispositivos de impacto virtuais para recuperar partículas suspensas no ar, ver, por exemplo, US 4942297 e US 4670135.

Novamente, nenhum destes sistemas é capaz da monitorização contínua da presença de bactérias no ar, em particular, de pequenas quantidades de bactérias patogénicas. Um problema particular é a variação em concentração da saída de fluido do ciclone, com alterações na humidade do ar a ser amostrado. Com uma quantidade de passagem muito alta, o ciclone pode funcionar quase a seco e produzir leituras elevadas a partir de uma entrada de fundo relativamente normal.

Em JP 5184350 é descrito um sistema de contagem de células bacterianas suspensas no ar, o qual tem como objectivo diminuir o tempo de determinação e melhorar a exactidão dos resultados. Em JP 60016598 é descrito um dispositivo alternativo para detecção de bactérias numa certa quantidade de ar. Em JP 3112495 é descrito um sistema de filtragem para a detecção de diferentes microrganismos que flutuam no ar. Nenhum destes dispositivos é adequado para uma operação contínua.

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 É agora proporcionado um método e aparelho luminométrico de fluxo verdadeiramente contínuo, que são capazes de uma monitorização contínua ou por lotes de bactérias num ambiente gasoso, em particular, no ar atmosférico, de modo a poderem ser feitas medições em tempo real do conteúdo de bactérias do ar. Tal aparelho está, em particular, direccionado para a monitorização contínua, sendo também adequado para retirar para amostra grandes volumes de ar, como os existentes dentro de um hospital, numa sala de limpeza de uma instalação de produção ou num armazém esterilizado, antes de se iniciar a produção.

Num primeiro aspecto o presente invento proporciona um método para determinação a presença e/ou quantidade de material celular existente num ambiente gasoso, compreendendo: (a) a recolha contínua de uma fracção em partículas desse ambiente, durante um certo período de tempo; (b) a transferência contínua dessa fracção em partículas para uma corrente de fluido de processamento; (c) a libertação contínua de conteúdo intracelular, incluindo ATP de células de microorganismos ou esporos presentes na referida corrente de fluido de processamento, contendo a fracção em partículas; d) a adição contínua de reagentes luminescentes, dependentes da presença de ATP, na corrente do fluido de processamento, para produzir luminescência; e) a medição da luz emitida da corrente de fluido de processamento produzido em (d) num luminómetro em que um sinal indicativo desta luz é produzido pelo luminómetro e a presença e a grandeza do sinal é equacionado para a presença e/ou quantidade de material celular presente no gás. O gás é, de preferência, ar atmosférico, o material bactérias, e os passos (b), (c), (d) e/ou (e) são executados continuamente. De preferência o passo (b) é executado utilizando um detergente, mas pode também ser executado utilizando calor, som ou outra fonte de energia ou agente lítico, por exemplo, uma enzima, com um efeito de arrefecimento adequado, aplicado se foi gerado calor em excesso.

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 5 A fim de executar continuamente todos estes passos, é preferido passar o fluido de processamento desde o passo de recolha até aos passos a jusante, utilizando uma conduta, pelo que o tempo que leva para as bactérias recolhidas no passo (a) serem identificadas pelo seu conteúdo de ATP é só limitado pelo tempo que o fluido leva a passar da conduta para os passos de luminometria.

Mais de preferência, a passagem para baixo do fluido na conduta é controlada pelos meios de accionamento, tal como uma ou mais bombas, pelo que uma corrente constante de fluido de recolha pode ser analisado por luminometria.

Com o fim de recolher a amostra de partículas é preferido aspirar ar para um dispositivo de recolha, depositar o material celular, por exemplo, bactérias sob a forma de partículas para uma zona de recolha do dispositivo de recolha e descarregar o ar desprovido de partículas do colector. Esta recolha é, de preferência, feita à velocidade de algumas dezenas a milhares de litros de ar por minuto de modo a retirar uma amostra útil; convenientemente de 100 a 1000 litros por minuto. A fim de fazer a diferenciação entre as bactérias e outros materiais celulares tais como células eucarióticas, por exemplo, pólens ou esporos fúngicos, é possível dividir as partículas que contêm fluido de processamento em duas correntes, ou utilizar dois colectores para produzir dois fluxos de fluido de processamento, e adicionar um detergente capaz de libertar o conteúdo de células, incluindo ATP de todas as células e esporos, para um fluxo de fluido, e um fluxo que é apenas capaz de libertar o conteúdo do material das células eucarióticas e esporos fúngicos para o outro. Para tal fim, é possível adicionar, por exemplo, detergente não-iónico para libertar materiais de células eucarióticas e esporos fúngicos e por exemplo, detergente catiónico para o libertar de todas as células.

Subtraindo o sinal do luminómetro de fluxo de detergente não-iónico do sinal do luminómetro de fluxo de detergente catiónico, é possível produzir um sinal contínuo indicador da presença e número de bactérias.

Num método ainda mais preferido do invento, as bactérias são detectadas através de detecção da quantidade de actividade adenilato-quinase no fluido de processamento, que contém as partículas recolhidas, em que o difosfato de adenosina (ADP) é adicionado ao fluido de processamento, e é convertido por qualquer adenilato-quinase existente em trifosfato de adenosina, o qual, por sua

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 6 vez, é detectado da forma acima descrita. Desta forma a sensibilidade do método vai aumentar devido ao efeito de cascata da actividade enzimática que conduz à amplificação efectiva do sinal. Um tal método, quando aplicado na detecção de bactérias constitui, em geral, o objecto do pedido de patente pendente PCT/GB94/00118 do requerente e do mesmo inventor. O ADP pode ser incluído no fluido de processamento, uma vez que entra no passo de recolha de fracções em partículas, ou pode ser adicionado a jusante, por exemplo, com a adição de qualquer reagente antes dos reagentes luminescentes. A pureza do ADP adicionado deverá, de preferência, ser de modo a que a proporção do ADP em relação ao ATP no reagente seja de 2000:1 ou mais; de preferência 6000:1 ou mais. A concentração de ADP no fluido de processamento pode, em teoria, ser a qualquer nível que esteja em excesso em relação ao ATP já existente nos organismos, se for produzir uma sensibilização significativa. É preferido utilizar, pelo menos, 0,01 mM ou mais de ADP, de preferência de 0,01 a 1mM de ADP ou mais, como a concentração final no fluido de processamento.

Embora o material celular contenha magnésio suficiente para a conversão, dependente de magnésio, de ADP para ATP, os especialistas na técnica verificarão que o reagente de ADP deveria ser utilizado, de preferência, na presença de iões de magnésio, para que o ATP fosse produzido de forma perfeita. Assim, o reagente de ADP é, de preferência, reunido num tampão contendo magnésio suficiente para proporcionar níveis de magnésio, pelo menos, duas ou mais vezes a molaridade, tal como no ADP. De preferência, a conversão de ADP para ATP dá-se numa solução tamponada com pH entre 5,5 e 8,5, de preferência com pH de 7,8. O fornecimento de magnésio é particularmente preferido onde o ADP é estabilizado usando EDTA ou outros agentes quelantes semelhantes.

Os peritos na arte verificarão que o período de tempo tal como é continuamente aplicado no passo (a) pretende aqui cobrir a recolha contínua de partículas durante um período de tempo operacional.

Este período pode ir de vários minutos até várias horas, ou pode ser um período de tempo determinado tipicamente anterior à operação de uma linha de processamento de esterilização. Para utilizar num espaço interior esterilizado, este período será suficiente para o aparelho ter já recolhido partículas de um volume igual a uma proporção significativa do ar desse espaço, potencialmente e substancialmente em todo ele, e pode ser recolhido em lotes. 7 85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8

Numa forma preferida do método onde está a ser monitorizado um espaço esterilizado tai como um edifício hospitalar, uma sala de limpezas ou uma instalação de empacotamento esterilizada, o método recolhe continuamente partículas do ar, enquanto vários ventiladores que fornecem ar condicionado são postos a funcionar ou são desligados. O fluido de processamento correspondente ao ar recolhido durante a operação de cada ventilador de ar e o fluido de processamento recolhido com o sistema de condicionamento desligado, são monitorizados utilizando a capacidade de medição em tempo real do ATP do método do invento, pelo que é fornecida uma indicação rápida da localização de qualquer contaminação no caso de algum dos grupos de fluido apresentar um aumento da presença de bactérias. Onde se está a fazer a recolha e produção de fluido de processamento durante todo o período do teste, em oposição à mera recolha de grupos de partículas, é unicamente possível correlacionar a saída do luminómetro, num determinado tempo, com a presença de bactérias.

Num segundo aspecto do presente invento é proporcionado um aparelho adequado à execução do método do presente invento. O aparelho do segundo invento compreende: (a) meios para recolha contínua de uma fracção de partículas de um ambiente gasoso; (b) meios para transferência contínua da fracção de partículas para uma corrente de fluido de processamento; (c) meios para libertação contínua de conteúdos intracelulares incluindo ATP do material celular presente na corrente de fluido de processamento; (d) meios para adição contínua de reagentes luminescentes, dependentes da presença de ATP para efectuar luminescência, na corrente de fluido de processamento; (e) meios detectores de luz, adaptados para serem alimentados com o fluido de processamento do passo (d) e capazes de emitirem um sinal indicativo da ocorrência e da quantidade de luminescência detectada desse modo; e

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 8 (g) meios de transmissão de sinal para alimentarem o sinal do luminómetro para meios processadores e/ou de exibição, para indicarem a presença e/ou quantidade de células de microorganismos ou esporos. O meio de recolha contínua (b) terá convenientemente a forma de um ciclone ou dispositivo de impacto virtual, de preferência um dispositivo de impacto virtual de elevado volume. Onde é exigida uma monitorização contínua do ar exterior, ou seja, no exterior dos edifícios, é preferível utilizar um ciclone, de preferência um que possa processar entre 100 e 1000 litros ou mais de ar por minuto, e fornecendo a partir daí uma fracção em partículas numa base contínua; no entanto não é necessário nenhum limite superior, pois os peritos na arte têm conhecimento de ciclones com capacidades mais elevadas. De preferência, o ciclone será um hidrociclone de paredes húmidas e a fracção fragmentada é fornecida sob a forma de um fluido de processamento líquido contendo partículas, quando se afasta do ciclone. Onde é necessário retirar a amostra de um volume de gás limitado, por exemplo, numa unidade de produção esterilizada, será preferível utilizar um dispositivo de impacto virtual de alta velocidade para retirar partículas do ar; um tal dispositivo de impacto poderá convenientemente retirar amostras de cerca de 50 a 150 litros de ar por minuto.

Com ambas estas opções, os meios de transferência da fracção em partículas para o fluido de processamento compreende, de preferência, um abastecimento de fluido de processamento dentro do qual fica depositada a fracção. O fluido de processamento é, de preferência, um líquido, tal como água ou um tampão, contendo facultativamente iões de magnésio, ADP e/ou reagente para libertar das células conteúdos intracelulares incluindo ATP.

Quando são retirados para amostra grandes volumes de gás com variações na humidade, é preferido adicionar qualquer detergente a jusante do colector, e utilizar uma interface de gás e líquido capaz de manter a diluição de partículas no fluido de processamento a um nível substancialmente constante e retirar o excesso de ar como bolhas. Uma interface de gás e líquido adequada é a descrita na patente copendente EP-A-668095.

Uma modificação preferida desta interface recebe fluido de processamento líquido sob a influência de uma bomba entre o colector e a interface. Quando o nível de líquido na interface desce abaixo de um dado nível, um sensor de nível transmite à bomba um sinal para provocar o aumento caudal do fluido. Ao mesmo

85 863 EP 0 789 778/PT8 9 tempo, o ar que entrou no líquido sob a forma de bolhas poderá escapar para a atmosfera, assegurando desta forma um fornecimento razoavelmente constante de líquido para os passos a jusante do aparelho.

Uma modificação adicional deste dispositivo coloca a bomba a jusante da interface, e a bomba é abrandada quando o nível de líquido da interface cai abaixo do nível estabelecido, de tal modo que o nível do líquido pode recuperar. Um caudal do fluido de processamento através do ciclone poderá ser um fluxo qualquer, ao qual se pode fornecer uma quantidade adequada de detergente, ADP, fosfato ou reagente luminescente, sem criar problemas logísticos. Um caudal conveniente será entre 0,1 e 10 ml de fluido de processamento por minuto onde entram 1000 litros de ar por minuto no colector, por exemplo, ciclone, ao mesmo tempo.

Os meios para libertar conteúdo intracelular incluindo ATP podem incluir um calefactor, um dispositivo sónico ou um dispositivo para adicionar um agente lítico tal como uma enzima ou detergente, tal como é acima descrito na descrição do método. Onde o meio conta com o efeito físico para libertar o conteúdo das células, este efeito deverá ser produzido em ou a jusante do meio para transferir partículas para o líquido de processamento. Onde o meio adiciona um agente lítico, este poderá ser colocado a montante, em ou a jusante dos meios de transferência. Poderá ser incluído um dispositivo de arrefecimento antes dos passos de luminescência a jusante, se for utilizado aquecimento. O fluido de processamento é feito passar do seu abastecimento, ou seja, de um reservatório, através dos meios de transferência de partículas e para quaisquer meios de libertação de conteúdos intracelulares a jusante, por meio de um percurso de fluxo de fluido. De preferência, o mesmo é proporcionado sob a forma de uma conduta de líquido ou, melhor ainda, sob a forma de uma tubagem. O fluido de processamento é, de preferência, líquido que se movimenta através da conduta por meio de uma ou mais bombas, sendo as mesmas, de preferência, bombas peristálticas que actuam no líquido através da parede de conduta; as condutas preferidas serão do tipo de tubagem flexível, de preferência tubagem plástica transparente flexível adequada para enviar líquido sob a influência de bombas peristálticas.

Utilizando caudais entre 0,1 a 10 mi de fluido de processamento por minuto para o ciclone, é de esperar que a evaporação reduza ainda mais o fluxo, de modo 85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 10

que, por exemplo, entre 0,05 e 10 ml por minuto ou, melhor ainda, entre 0,5 a 5 ml por minuto, entrem na interface. Com tais caudais, o aparelho pode convenientemente utilizar tubagem peristáltica na ordem de 0,25 a 3 mm de diâmetro interno, apesar de aqui não ser colocado qualquer limite em particular, para além do facto da tubagem não deverá ser demasiado larga com o perigo de reter um fluxo livre de ar através do aparelho. Uma tubagem de borracha de silicone adequada para este fim encontra-se disponível em Autoclude, com 0,8mm de diâmetro; uma tubagem alternativa encontra-se disponível em Watson Marlow-UK ou Ismatec-Switzerland.

Quando é adicionado um agente lítico a jusante dos meios de transferência de partículas é, de preferência, fornecida uma junção, pela qual uma bomba peristáltica simples actua num ou mais tubos, que transportam o fluido de processamento dos meios de transferência, e um ou mais tubos que transportam o agente lítico, de preferência, uma solução de agente lítico; pelo menos, um tubo de cada tipo entrará num tubo simples a jusante, numa junção entre os dois. É proporcionada uma disposição semelhante, de preferência, com uma bomba peristáltica separada, para a adição opcional de qualquer reagente com ADP no aspecto do método baseado na adelinato-quinase, pelo que quantidades elevadas de ATP são derivadas de um dado número de bactérias e, do mesmo modo, para os meios de adição de reagentes lumínescentes. Neste último caso, a junção entre a conduta que transporta o fluido de processamento do passo (c), com a conduta que transporta os reagentes lumínescentes, é efectuada, de preferência, no próprio dispositivo de medição de luz, por exemplo, uma câmara luminométrica de medição de luz.

Quando o fluido de processamento de líquido mais as partículas é dividido em dois fluxos para processamento com diferentes agentes líticos, é possível que estes sejam produzidos por ciclones ou dispositivos de impacto separados, na saída de fluido de processamento de um ciclone ou dispositivo de impacto simples, na interface de ar e líquido ou a jusante desta. Uma concretização do aparelho do invento proporciona estas correntes por meio da utilização de um colector a jusante da interface, e utiliza, de preferência, este colector para misturar os dois agentes líticos com os respectivos agentes destas correntes. Assim, colector tem, tipicamente, uma entrada central da interface que suporta, por exemplo, aproximadamente 50% da entrada de fluxo de líquido e, de preferência, 80% para o colector (dependente da evaporação no ciclone ou dispositivo de impacto) e que é 11 85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 flanqueado pelas respectivas entradas dos abastecimentos dos dois reagentes detergentes, utilizada a, por exemplo, 25% de cada fluxo de entrada central. Duas saídas do colector proporcionam fluxos combinados cima de misturas de 50:50 do fluxo central e do respectivo fluxo de detergente. Tipicamente, isto poderá ser da ordem de 75% a 125% do volume do fluxo da interface de cada uma das saídas do colector.

Numa concretização preferida do aparelho do invento, em particular, adequada para monitorização no exterior, tal como seria exigido na protecção de qualquer possessão militar, é preferido ter dois fluxos de fluido de processamento e tratá-los com dois meios diferentes de libertação do conteúdo intracelular de modo a fazer a distinção entre células eucarióticas e esporos fúngicos, por um lado, e bactérias por outro. Estes fluxos podem emanar de um colector simples de partículas ou de dois colectores separados que operam no mesmo local. Os detergentes preferidos utilizados para estes fluxos são os acima descritos para o método do invento e descritos em PCT/GB94/00118.

Numa concretização alternativa do invento um dos agentes luminescentes, de preferência, a luciferase, é imobilizado próximo do detector de luz do luminómetro dentro da câmara de medição de luz onde são misturados o fluido de processamento e os reagentes luminescentes, contendo neste caso uma solução de luciferina. Sendo imobilizado próximo do detector, pode ser aumentada a eficiência de detecção de luz. De modo a manter a actividade da luciferase, esta pode ser fixa num substrato semelhante a uma fita que é enrolada de um carreto para o outro, de modo a que, nos fluidos que entram, possa existir luciferase fresca com uma proporção desejada. Pode ser conseguida uma imobilização ligando química ou fisicamente a enzima, utilizando, por exemplo, um grupo químico de ligação, tal como glutaraldeído, para um substrato plano derivado adequado, e a natureza de impermeável aos líquidos da câmara pode ser mantida, introduzindo a fita deste substrato através de, por exemplo, cilindros, que são impermeáveis ao líquido ou que estão acima do nível do líquido.

Verifica-se que tanto o método como o aparelho do invento podem operar à temperatura ambiente, mas também podem operar a temperaturas mais altas, em que a estabilidade ao calor do reagente o permita. Assim, a tubagem da câmara de medição de luz do luminómetro pode ser aquecida, de modo a aumentar a quantidade de ATP produzida pelo agente de ADP ou a luz emitida pelos reagentes luminescentes, como resposta à presença de ATP. Para este fim podem ser 12 85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 utilizadas as luciferases termostáveis do pedido de patente PCT/W095/25798 (que substitui os pedidos de patente ingleses n°s. 940570.2, 9501170.6 e 9500660.7).

Os especialistas na técnica poderão verificar que, depois de saírem da câmara luminométrica, por exemplo, por outra tubagem peristáltica, os fluxos poderão seguir para outros dispositivos analíticos, tais como os que utilizam a ligação específica para determinar mais especificamente a natureza de quaisquer bactérias presentes, ou qualquer outro agente tal como vírus, DNA ou agentes químicos. É também proporcionado pelo método do invento um elemento ou rede de tubagem de tais elementos, adequado para utilização no aparelho do invento, compreendendo um elemento ou rede de tubagem peristáltica de tais elementos, em que o elemento ou rede tem um primeiro comprimento de tubagem com uma extremidade livre, a qual é adequada para fixação à saída de fluido de um aparelho para recolha contínua de uma fracção de partículas de um ambiente gasoso, um comprimento de tubagem adicional, que tem uma extremidade livre, a qual é adequada para ligação aos meios de entrada de uma câmara luminométrica, sendo as outras extremidades dos referidos primeiro e segundo comprimentos de tubagem interligadas através de um comprimento de tubagem, que inclui duas ou mais junções, sendo cada junção ligada a um recipiente com reagente por meio de um comprimento de tubagem, sendo todos os comprimentos capazes de uma acção peristáltica sob a influência de uma bomba peristáltica, caracterizado por cada recipiente de reagente conter um reagente para utilizar no método descrito abaixo, sendo a quantidade e concentração dos referidos reagentes de tal modo que a rede de tubagem pode ser incluída dentro de um aparelho descrito abaixo, e os vários reagentes nos recipientes terão durações semelhantes de tempo de operação, quando o aparelho é utilizado para executar o método. O elemento ou rede do invento pode compreender ainda mais junções entre o primeiro e o segundo comprimentos de tubagem, tendo estes comprimentos de tubagem extremidades livres adequadas para ligação a mais fontes de reagentes.

Assim, quando é utilizado o detergente para destruir material celular e é adicionado a jusante do colector de partículas, e quando o ATP bacteriano é directamente medido, pode ser utilizado um elemento de tubagem, que junta simplesmente a interface à câmara de medição de luz do luminómetro. Quando é adicionado detergente a jusante do colector e é empregue a variante com 13 85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 adenilato-quinase do método, serão necessárias duas junções para permitir a ligação com comprimentos de tubagem de um detergente e de uma fonte de reagente de ADP, respectivamente. Uma fonte de reagente luminescente e uma tubagem separadas podem ser incluídas no elemento ou rede, como parte de um conjunto de reabastecimento de reagente.

Em cada caso é preferido, pela própria natureza do aparelho, que as extremidades livres da tubagem, incluindo as que conduzem a garrafas de reagente, sejam cobertas para impedir a entrada de bactérias e outros materiais celulares, de preferência por uma cobertura de extremidade perfurável ou removível, por exemplo, removível por arrancamento, corte ou tracção. As extremidades livres para os reagentes são, na realidade, ligadas aos reagentes exigidos, de modo que uma rede de tubagem de substituição esterilizada pode ser toda substituída de uma só vez, sendo as quantidades e concentrações dos vários reagentes coincidentes entre si, de modo a terem durações de tempos de operação semelhantes. O método, aparelho e elemento e redes de tubagem do presente invento serão agora exemplificados por meio de ilustrações, apenas com referência aos seguintes exemplos e figuras não limitativos. Aos especialista da técnica ocorrerão outras concretizações do invento dentro do âmbito das reivindicações e à luz das mesmas. FIGURAS:

Figura 1: mostra uma representação em diagrama de um aparelho do invento, compreendendo um ciclone e uma interface de gás líquido, que alimenta linhas duplas com alimentações de detergente não iónicos e catiónicos, alimentações de reagentes luminescentes, luminómetros e uma unidade de processamento central.

Figura 2: mostra um corte transversal através de um ciclone e de uma interface de gás e líquido, tal como utilizado no aparelho da Figura 1.

Figura 3: mostra um elemento de tubagem e uma rede de recipientes de reagente, adequados para a substituição de reagentes como uma unidade para um aparelho descrito no Exemplo 2. 85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 14

Figura 4: é um gráfico de uma saída de contagem por minuto de um luminómetro tal como é descrito no Exemplo 1, quando várias quantidades de ATP são adicionadas na tubagem, directamente a jusante da interface ar/líquido.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Aparelho de luminómetro de fluxo contínuo. O aparelho de luminómetro de fluxo contínuo do invento foi construído utilizando uma unidade de ciclone (1) capaz de remoção de partículas de aproximadamente 1000 litros de ar por minuto, utilizando água como líquido de processamento, ligado a jusante a um dispositivo interface de gás e líquido (2), para extrair o gás do fluido e separar o fluxo em dois fluxos de processamento paralelos. Deste modo o líquido recolhe as partículas, incluindo quaisquer aerossóis, e transporta-os sob a influência da acção de bombas peristálticas (4), via condutas de tubagem peristálticas (3) de borracha de silicone com 0,8 mm (Autoclude), para junções (5) onde a influência das bombas (5) aspira um fluxo de detergente (ou 0,2% de solução aquosa de CTAB ou 0,4% de Triton X-100 aquoso) de recipientes (6) para o fluxo de líquido de processamento (dando uma concentração de fluxo de 0,1% de CTAB ou 0,2% de Triton X-100). Bombas adicionais (7) aspiram o fluxo de fluido e fornecem o mesmo com o mesmo caudal como uma solução contendo uma mistura cinética súbita de luciferase, luciferina e tampão (Biotrace pic Bridgend, UK) dos recipientes (8) para uma câmara de medição de luz (não mostrada) dentro de uma caixa de luminómetro (9) onde são misturados os respectivos fluxos e reagentes. As bombas (7) atingem uma distribuição síncrona ao actuarem simultaneamente nas linhas de distribuição (10) e (11), e as quantidades relativas de ATP libertas pela mesma amostra de partículas sob a influência de detergentes, proporcionam quantidades de luz e, assim, sinais indicativos das células/esporos e células eucarióticas/esporos totais. O ciclone é mostrado com mais pormenor na Figura 2, onde (12) é uma entrada para o gás (ar atmosférico) a ser separado em fracções enriquecidas com partículas e fracções desprovidas de partículas, (13) é um abastecimento de líquido de processamento de água bombeado a 1 ml/minuto, que é arrastado com o fluxo de ar, após o que passa para o volume principal do corpo do ciclone (14) quando o ar desprovido de partículas sai sob a influência de um motor de ar (15), enquanto o fluido de processamento e as partículas capturadas passam para baixo para uma saída (16) na parte de baixo do ciclone. Uma bomba peristáltica (17) passa o fluido

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 de processamento para uma interface de gás e líquido com a capacidade aproximada de 100 pl onde são retiradas as bolhas; o caudal de abastecimento do fluido de processamento pela bomba ou, alternativamente, a remoção de fluido por uma bomba a jusante, será determinado pelo nível de líquido na interface. O nível de líquido é determinado por um sensor de nível de líquido (não mostrado) e quando o nível cai abaixo de uma determinada altura, a bomba é programada para enviar mais líquido de processamento até estar restaurado o nível desejado. O excesso de líquido e as partículas densas da interface são periodicamente retiradas da saída (18), o ar que sai do líquido como bolhas é retirado através a saída (19) e o liquido de processamento passa sob a influência de uma bomba peristáltica (20) para a tubagem a jusante para adição de reagentes.

Quando o líquido de processamento com partículas e detergente se mistura com os reagentes luminescentes na câmara de medição de luz do luminómetro, um sensor de luz (não mostrado) mede qualquer luz emitida na câmara, resultante da presença de ATP; sendo a emissão rápida devido ao reagente de relação cinética súbita conter excesso de luciferase, comparado com a luciferina, sobre a velocidade exigida para a cinética de brilho (em que a medição é de vários minutos). O luminómetro transmite um sinal representativo da luz emitida a um processador de computador, o qual por seu lado nos mostra isto numa unidade de exibição ou o compara com os níveis de controlo.

Os detergentes utilizados podem ser produtos químicos normalizados, tal como é descrito acima, como podem também ser proporcionados sob a forma de extractantes produzidos por especialistas, tais como agente de libertação de ATP Enzymatics, extractante Biotrace XM (Biotrace, Bridgend, UK) ou Lumac NRM (de Lumac BV, Holanda). Os reagentes luminescentes podem ser reagentes normalizados disponíveis em fornecedores tal como Biotrace pic e Celcis pic na GB entre outros; a luciferase pode ser natural ou recombinada. As concentrações de reagentes são as necessárias para produzir cinéticas súbitas e a sua razão relativamente à quantidade de líquido de processamento tratado com brometo de cetiltrimetilamónio é a recomendada pelos fabricantes para processamento em lotes, tendo em conta as dimensões relativas da tubagem de cada linha que entra na câmara do luminómetro. A velocidade das bombas peristálticas pode também ser ajustada de modo a manter proporções onde bombas separadas fornecem cada fluxo.

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 16 EXEMPLO 2: luminómetro de fluxo contínuo de medição de adenilato-quinase. É proporcionada uma segunda concretização do luminómetro do presente invento, na qual um fluxo adicional de reagente para alimentar um reagente de difosfato de adenosina (ADP) muito puro, em relação ao ATP, é incluído no fluido de processamento a jusante da junção (5), em que é adicionado o detergente, mas a montante do luminómetro. O reagente de ADP (99,95% de pureza em relação ao ATP) é adicionado com um fluxo e concentração tal que produz uma concentração de 0,5 mM no fluxo final. O fluido de processamento é salino tamponado com fosfato com pH 7,4 ou TrisHCI com pH 7,8, incluindo iões de magnésio 0,2 mM. EXEMPLO 3: rede tubaaem e de reagentes para o aparelho do Exemplo 2. A Figura 3 mostra um conjunto de reabastecimento tubagem/reagentes concebido para o aparelho do Exemplo 2. Toda a tubagem é de borracha de silicone com um diâmetro interno de 0,8 mm, unida por junções de plástico elásticas e duráveis, dimensionadas para receber a mesma. A tubagem tem extremidades seladas perfuráveis para ligação a uma das saídas da interface numa primeira extremidade (21) e à entrada da câmara de medição de luz do luminómetro na outra (22). O recipiente (6) contém reagente detergente e tem uma entrada de ar que pode ser selada, para permitir que o ar de compensação que entra como reagente seja extraído, sob a influência da bomba peristáltica (como 4 na Figura 1) na tubagem, do recipiente para a junção (5); actuando esta bomba simultaneamente na tubagem (3). Uma outra peça da tubagem liga a junção (5) à junção (5a) onde um tubo de um segundo recipiente de reagente (6a) transporta reagente com ADP sob influência de uma outra bomba peristáltica (não mostrada na Figura 1). A tubagem entre a junção (5a) e a extremidade é ainda seguida de uma outra bomba peristáltica (como 7 na Figura 1) que também é seguida de um reagente luminescente de alimentação do tubo até à câmara do luminómetro.

Num aparelho preferido, as células de fluxo estão incluídas no conjunto da tubagem e estão também disponíveis; as mesmas serão feitas de policarbonato ou polistireno.

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 17 EXEMPLO 4: Aferição e modo de funcionamento do aparelho do Exemplo 1 ou 2. A quantidade de ATP existente numa célula bacteriana típica é da ordem de 10‘18 Mole, equivalente a cerca de 10‘15 gramas (ver em Lundin A (1989) “ATP Luminescence-Rapid Methods” in Microbiology editado por Stanley P E et a/; Blackwell, Oxford págs.11 a 30; e Stanley P E (1989) J.Biolumin. Chemilum, 4, págs. 375 a 380). Os níveis poderão ser reduzidos em organismos aeróbicos quando privados de oxigénio, e a concentração intracelular pode variar normalmente entre 2 e 10 mM. A aferição dos luminómetros de fluxo contínuo dos exemplos 1 e 2 pode ser realizada colocando quantidades conhecidas de ATP no fluido de processamento ou no ciclone, enquanto o aparelho está em funcionamento e construindo uma curva de aferição traçando um gráfico das contagens por minuto da saída do detector de luz do luminómetro em função à quantidade de ATP (ver Figura 4). Em alternativa, as concentrações conhecidas de bactérias, tais como o Bacilo de Calmille Guerre ou E.coli. podem ser pulverizados a uma determinada distância, por exemplo, 1 a 10 metros, longe da entrada do ciclone, e estas quantidades então traçadas de novo em função da saída do luminómetro, como anteriormente. Ambas as câmaras de medição de luz do luminómetro serão expostas a quantidades semelhantes de ATP, em que o ATP é utilizado para calibrar, enquanto a câmara de detergente não iónico receberá significativamente menos, onde são utilizadas as bactérias; assim, pode ser preferível uma aferição utilizando ATP e bactérias e talvez células eucarióticas ou esporos fúngicos, para determinar se tudo está a funcionar devidamente.

Em operação, o ciclone fornece uma amostra de partículas à interface de onde é separada em dois fluxos de igual volume e velocidade pelo colector, contendo cada fluxo um dos dois detergentes, não iónico ou catiónico. Os fluxos são misturados com a quantidade apropriada de ATP/ reagente de fosfato, tal como é exigido, e passam para as câmaras de medição de luz do luminómetro onde os reagentes luminescentes se misturam com os mesmos e a luz é emitida. Estes reagentes são de preferência do tipo cinético súbito e permitem uma emissão de luz quase instantânea, que é detectada pelos sensores de luz, associados às câmaras, os quais por seu lado enviam os sinais eléctricos indicativos da quantidade de ATP detectada a um processador de computador, e onde os dois sinais são utilizados para determinar a diferença de sinal, portanto ATP, e portanto células bacterianas e esporos, entre os dois fluxos; sendo isto realizado pela 18 85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 produção de uma saída para uma unidade de exibição ou impressora, indicativa da saída grosseira do luminómetro ou, utilizando suporte lógico, uma estimativa directa das bactérias existente quando derivada pela referência à curva de aferição armazenada na memória associada do processador.

Toda a operação das bombas pode ser controlada pelo processador de acordo com um regime previamente programado. Assim, se as condições são muito secas, pode ser desejado alterar a velocidade do ciclone de recolha de ar ou a velocidade a que a amostra passa por ou através da interface. Em alternativa, e se requerido, pode ser adicionado um fluido de recolha suplementar no ciclone para diluir a amostra. Outros controlos, envolvendo velocidades de operação de uma ou de todas as bombas peristálticas e a velocidade do movimento da luciferase imobilizada accionada por fita, pode também ser controlada deste modo, tal como será apreciado pelos especialistas da técnica. O aparelho preferente do invento tal como se pode ver na Figura 2, utiliza a realimentação da interface para controlar a adição de líquido no ciclone.

Por SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE IN HER BRITANNIC MAJESTY GOV. OF THE UNITED KINGDOM OF GREAT BRITAIN AND NORTHERN IRELAND - O AGENTE OFICIAL -

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA

Claims

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REIVINDICAÇÕES 1 - Método para determinação a presença e/ou a quantidade de material celular existente num ambiente gasoso, compreendendo: (a) a recolha contínua de uma fracção em partículas desse ambiente, durante um certo período de tempo; (b) a transferência contínua dessa fracção em partículas para uma corrente de fluido de processamento; (c) a libertação contínua de conteúdo intracelular, incluindo ATP de células de microorganismos ou esporos presentes na referida corrente de fluido de processamento, contendo a fracção em partículas; d) a adição contínua de reagentes luminescentes, dependentes da presença de ATP, na corrente do fluido de processamento, para produzir luminescência; e) a medição da luz emitida da corrente de fluido de processamento produzido em (d) num luminómetro (9) em que um sinal indicativo desta luz é produzido pelo luminómetro (9) e a presença e a grandeza do sinal é equacionado para a presença e/ou quantidade de material celular presente no gás.
2 - Método de acordo com a reivindicação 1, em que o material compreende células bacterianas ou células eucarióticas.
3 - Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o gás é o ar atmosférico.
4 - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo (b) é executado utilizando um agente lítico.
5 - Método de acordo com a reivindicação 4, em que o agente lítico é um detergente ou uma enzima.
6 - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o passo (b) é executado utilizando uma fonte de energia.

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7 - Método de acordo com a reivindicação 6, em que a fonte de energia é fonte de calor ou sonora.
8 - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a corrente de fluido de processamento passa do passo de recolha para os outros passos via uma ou mais condutas (3).
9 - Método de acordo com a reivindicação 8, em que o fluido de processamento é um líquido.
10 - Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que o fluido passa ao longo da conduta ou condutas (3) por meio de bombas (6, 8).
11 - Método de acordo com a reivindicação 10, em que as bombas (6, 8) são bombas peristálticas e a conduta (3) compreende tubagem peristáltica onde actuam as bombas.
12 - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo (b) produz fluido de processamento em duas correntes separadas e o passo (c) é realizado utilizando meios diferentes em cada fluxo; em que no primeiro fluxo todo o material celular tem os seus conteúdos intracelulares libertados, e no segundo fluxo as células eucarióticas e os esporos fúngicos têm o seu conteúdo intracelular libertado; o sinal transmitido peio detector de luz do luminómetro (9) no segundo fluxo é subtraído do sinal do primeiro e relacionado com o número de bactérias existentes no gás compreendido no passo de recolha.
13 - Método de acordo com a reivindicação 12, em que o primeiro dos fluxos é tratado com detergente catiónico e o segundo dos fluxos é tratado com detergente não-iónico.
14 - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que é adicionado difosfato de adenosina (ADP) ao fluido de processamento, de modo a ser convertido por qualquer adenilato-quinase existente no conteúdo intracelular libertado no passo, (c) em trifosfato de adenosina que, por seu lado, é detectado no passo (e).
15 - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que é monitorizado um espaço iimpo ou esterilizado, em que o método recolhe

85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 3/6 continuamente partículas do ar enquanto os vários ventiladores, que fornecem ar condicionado são postos a funcionar ou desligados, e em que é medido o conteúdo de ATP ou conteúdo de adenilato-quinase de um lote ou amostra de fluido de processamento, correspondente ao período de funcionamento, utilizando a capacidade de medição em tempo real de ATP do método do invento.
16 - Aparelho compreendendo: (a) meios (1) para recolha continua de uma fracção de partículas de um ambiente gasoso; (b) meios (2) para transferência contínua da fracção de partículas para uma corrente de fluido de processamento; (c) meios (5, 6) para libertação contínua de conteúdos intracelulares incluindo ATP do material celular presente na corrente de fluido de processamento; (d) meios (7, 8) para adição contínua de reagentes luminescentes, dependentes da presença de ATP para efectuar luminescência, na corrente de fluido de processamento; (e) meios detectores de luz (9), adaptados para serem alimentados com o fluido de processamento do passo (d) e capazes de emitirem um sinal indicativo da ocorrência e da quantidade de luminescência detectada desse modo; e (g) meios de transmissão de sinal para alimentarem o sinal do luminómetro para meios processadores e/ou de exibição, para indicarem a presença e/ou quantidade de células de microorganismos ou esporos.
17 - Aparelho de acordo com a reivindicação 16, em que os meios de recolha contínua (1) são constituídos por um ciclone ou um dispositivo de impacto virtual.
18 - Aparelho de acordo com a reivindicação 17 em que os meios de recolha são constituídos por um ciclone (1) capaz de processar mais de 100 litros de ar por minuto.
19 - Aparelho de acordo com a reivindicação 18, em que o ciclone (1) é capaz de processar entre 500 e 2000 litros de ar por minuto.

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20 - Aparelho de acordo com a reivindicação 19, em que o ciclone (1) processa cerca de 1000 litros de ar por minuto.
21 - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 20, em que o ciclone (1) é um hidrociclone de paredes húmidas.
22 - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 21, em que a fracção em partículas é fornecida sob a forma de um fluido de processamento líquido contendo partículas.
23 - Aparelho de acordo com a reivindicação 17, em que os meios de recolha (1) são constituídos por um dispositivo de impacto virtual de alta velocidade, capaz de processar entre 50 e 150 litros de ar por minuto.
24 - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 23, que compreende ainda um fluido que é um líquido.
25 - Aparelho de acordo com a reivindicação 24, em que o líquido é água ou um tampão.
26 - Aparelho de acordo com a reivindicação 25, em que a água ou tampão contém ADP e/ou reagente para libertar o conteúdo intracelular incluindo ATP das células.
27 - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 26, compreendendo ainda uma interface de gás e líquido (2) capaz de manter a diluição das partículas no fluido de processamento a um nível substancialmente constante e/ou remover o excesso de ar como bolhas.
28 - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 27, em que os meios (c), para libertação do conteúdo intracelular incluindo ATP, incluem um calefactor, um dispositivo sónico ou um dispositivo para adicionar um agente lítico (6).
29 - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 28, em que o fluido de processamento é transferido entre os meios para uma conduta (3).

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30 - Aparelho de acordo com a reivindicação 29, em que o fluido é um líquido, a conduta compreende uma tubagem peristáltica e o aparelho inclui bombas peristálticas para actuarem sobre o mesmo, para accionarem o líquido de processamento de uns meios para os outros.
31 - Aparelho de acordo com a reivindicação 30, em que os meios para libertar o conteúdo intracelular e/ou fornecerem ADP compreendem um abastecimento de agente lítico e/ou reagente ADP, o qual é misturado com o líquido de processamento numa junção da tubagem peristáltica, desde os meios de recolha, com a tubagem desde o abastecimento de agente lítico e/ou reagente ADP.
32 - Apareiho de acordo com a reivindicação 31 em que a junção se encontra num colector ou numa junção entre peças da tubagem peristáltica.
33 - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 32, em que os reagentes luminescentes são misturados com o fluido de processamento no dispositivo de medição de luz do luminómtero.
34 - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 33, em que o fluido de processamento é fornecido como dois fluxos, em que cada fluxo passa através de respectivos meios de libertação de conteúdo intracelular capazes de libertar ATP ou adenilato-quinase das células eucarióticas e esporos fúngicos ou de todo o material celular, e passando subsequentemente estes fluxos dentro das respectivas câmaras de medição de luz do luminómetro, onde os meios de adição de reagente luminescente fornecem a emissão de luz na presença de ATP; a quantidade de luz detectada nas câmaras de medição será detectada por detectores de luz, os quais emitem sinais eléctricos para meios processadores, de exibição ou de impressão.
35 - Aparelho de acordo com a reivindicação 34, em que o sinal da linha de células eucarióticas ou esporos fúngicos é retirado do sinal da linha de material celular e o valor deixado indicado em meios de exibição ou de impressão.
36 - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 35, em que os reagentes luminescentes incluem luciferase, sendo esta imobilizada junto do detector de luz do luminómetro dentro da câmara de medição de luz, onde é misturado o fluido de processamento com os reagentes luminescentes. 85 863 ΕΡ Ο 789 778/ΡΤ8 6/6
37 - Elemento ou rede de tubagem de tais elementos, adequado para utilizar no aparelho do invento, compreendendo um elemento ou rede de tubagem peristáltica de tais elementos, em que o elemento ou rede tem um primeiro comprimento de tubagem com uma extremidade livre (21), a qual é adequada para fixação à saída de fluido de um aparelho para recolha contínua de uma fracção de partículas de um ambiente gasoso, um comprimento de tubagem adicional, que tem uma extremidade livre (22), a qual é adequada para ligação aos meios de entrada de uma câmara de luminómetro (9), sendo outras extremidades dos referidos primeiro e comprimento adicional de tubagem interligados através de um comprimento de tubagem, o qual inclui duas ou mais junções (5, 5a), sendo cada junção ligada a um recipiente de reagente (6, 6a) por meio de um comprimento de tubagem, caracterizado por cada recipiente de reagente conter um reagente para utilizar no método da reivindicação 1, sendo a quantidade e concentração dos referidos reagentes de tal modo que a rede de tubagem poderá ser incluída dentro de um aparelho de qualquer uma das reivindicações de 16 a 36, e os vários reagentes nos recipientes (6, 6a) têm durações semelhantes de tempo de operação, quando o aparelho é usado para executar um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15.
38 - Elemento ou rede de tubagem de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por as extremidades livres da tubagem serem cobertas por uma cobertura de extremidade perfurável ou removível, para impedir a entrada de materiais celulares.

Por SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE IN HER BRITANNIC MAJESTY GOV. OF THE UNITED KINGDOM OF GREAT BRITAIN AND NORTHERN IRELAND - O AGENTE OFICIAL -

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA