PT665292E - Determinacao da toxicidade da agua utilizando uma cultura de bacteria anaerobica - Google Patents

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DESCRIÇÃO “DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE DA ÁGUA UTILIZANDO UMA CULTURA DE BACTÉRIA ANAERÓBICA” A presente invenção refere-se a um processo biológico, o qual envolve o uso de uma bactéria anaeróbica, para medir a toxicidade provocada por substâncias poluentes na água ou em efluentes aquosos. As bactérias são conhecidas como sendo detectores eficazes da toxicidade química, já que reagem rapidamente às modificações no seu ambiente. E por esta razão que se desenvolveram muito ensaios biológicos para seguir e controlar substâncias tóxicas em água ou efluentes. Nestes ensaios compara-se a inibição do metabolismo de uma espécie de bactéria na presença de substâncias tóxicas com o metabolismo das mesmas espécies cultivadas num substrato padrão.

Utilizam-se espécies bacterianas diferentes e medem-se parâmetros vários (relativamente a isto veja-se Toxicity Testing Using Microorganisms vol 1 e 2, B. J. Dutka and G. Bitton publishers, CRC Press 1989).

Como exemplo, podem mencionar-se a bioluminescência de alguns microrganismos, a inversão de mobilidade de Spirillum volutans. a medida do oxigénio consumido e o ATP produzido, etc.

Os ensaios que utilizam espécies bacterianas simples são mais sensíveis, para a mesma toxicidade de molécula, do que os que envolvem flora mista, operando numa cadeia metabólica, tal como por exemplo lodo aeróbico e 2 anaeróbico.

Esta maior sensibilidade é tomada evidente por uma menor concentração de uma determinada substância tóxica necessária para reduzir de 50 % a medida padrão do parâmetro bioquímico-biológico que é um traçador específico do método (CE 50, a partir de “concentração eficaz que envolve 50 % da redução”).

Os ensaios realizados com flora mista que se distinguem pelos estados metabólicos subsequentes podem avaliar a toxicidade de uma substância para níveis diferentes. Normalmente, devido à razão de sintrofia entre as populações microbianas, determina-se a CE 50 de uma substância tóxica no metabolito final (por exemplo sobre metano no caso de agregados bacterianos anaeróbicos). A produção de metano é, de facto, em qualquer caso reduzida, quer directa ou indirectamente pela inibição dos precursores, pela presença de substâncias tóxicas.

Os processos que utilizam agregados microbianos, embora tendo menor sensibilidade num sentido absoluto, são particularmente versáteis para ensaiar a toxicidade total tal como a que é produzida por diversos compostos contemporaneamente presentes tal como se observa, por exemplo, no lixo industrial. Utilizaram-se principal mente ensaios que recorrem a biomassa bacteriana metanogénica para a prevenção de biodegradabilidade de efluentes ou lodo que contém substâncias tóxicas. Subsequentemente, desenvolveram-se ensaios que foram especificamente projectados para o grau de actividade metanogénica dos grupos tróficos individuais do agregado metanobacteriano. Os objectivos principais, contudo, referem-se à análise microbiológica da qualidade e conservabilidade dos inóculos a serem utilizados na activação de reactores anaeróbicos. Ao mesmo 3 3

tempo, elaborações da técnica aperfeiçoaram os processos ATA (ensaios de toxicidade anaeróbica) de modo a verificar a incidência de substâncias tóxicas presentes no lixo sobre a conversão anaeróbica em metano de substratos específicos sobre a parte de diferentes tipos de metanobactérias. Este tipo de processo envolve uma série de centros anaeróbicos (normal mente micro-reactores) em que se fazem reagir quantidades conhecidas, tanto de lodo anaeróbico como de substrato específico, na presença de e sem substâncias supostamente tóxicas. Os resultados eventualmente diferentes, produzidos nas mesmas condições operatórias após uma ou mais verificações, é considerado como sendo o índice de variação da actividade produtora do gás dos grupos bacterianos tóxicos individuais.

Todas estas técnicas e os seus diversos desenvolvimentos e aplicações são realizados principalmente no laboratório de investigação, na medida em que não podem ser efectuados de outro modo que não seja a análise cromatográfica gasosa dos espaços da cabeça dos micro-reactores. No caso de tentativas para obter sistemas analíticos que utilizam transdutores de pressão sobre a cabeça dos reactores, tiveram de se utilizar dispositivos complexos de tipo mecânico para a ligação com os dados das unidades de recolha.

Descobriu-se agora um processo, de acordo com a presente invenção, que envolve o uso de agregados metanogénicos mistos apropriadamente pré-cultivados, que são úteis para avaliar a toxicidade produzida por uma única substância ou uma ampla gama de substâncias em água ou efluentes aquosos.

De acordo com isto, a presente invenção diz respeito a um processo biológico para determinar a toxicidade de água e de água residual, que se exprime da 4 seguinte maneira: - preparação de uma cultura bacteriana anaeróbica metanogénica mista; - inoculação da cultura bacteriana numa variedade de reactores dos quais pelo menos um é um reactor de referência, que contém um substrato com água convencional e pelo menos um outro, um reactor de medição, que contém um substrato com água ou lixo cuja toxicidade se pretende medir; - sendo os referidos reactores de medida e de referência ligados a um sistema detector susceptível de medir o volume de biogás produzido por unidade de tempo; sendo o referido sistema detector ligado operativamente a um sistema de processamento de dados susceptível de determinar o decréscimo nas cinéticas de produção do biogás produzido pelo metabolismo anaeróbico sobre o substrato e susceptível de o correlacionar com a toxicidade da água ou lixo. A cultura bacteriana mista é um agregado anaeróbico metanogénico semelhante aos utilizados para a purificação de lixos urbanos em reactores de tipo UASB, condicionados apropriadamente para melhorar os requisitos da sua sensibilidade às substâncias tóxicas.

Esta maior sensibilidade encontra-se presente nas biomassas com reprodução celular intensa e, no caso de complexos mistos, principalmente nas metanobactérias. De facto, verificou-se que outras populações que catalisam transformações antes da redução do grupo metílo eram menos sensíveis. Além disso, 5 5

a sensibilidade de uma biomassa micróbica às substâncias tóxicas é devida, não só à idade média do complexo como um todo, mas também à idade específica média da população metanogénica.

Por consequência, variando apropriadamente as condições de operação dos reactores anaeróbicos destinados à produção de microrganismos, obtém-se uma biomassa mista, a qual é apropriada para a produção de sensores celulares com características de sensibilidade ampliada às substâncias tóxicas presentes em pequenas concentrações, caracterizada por : - um certo grau de agregação celular - uma elevada velocidade de reprodução celular por grupo trófico bacteriano individual (células jovens) - uma cadeia metabólica global não ainda equilibrada no componente metanogénico (metanogéneos em multiplicação). O processo, objecto da presente invenção, para medir a toxicidade, envolve o uso de uma série de micro-reactores anaeróbicos de 20 - 100 ml em volume, agitados, em que a água ou lixo supostamente tóxicos são ensaiados (eventualmente com diluições diferentes). Realiza-se a medida com base no resultado diferente que é registado nas mesmas condições operatórias de fermentação (pH, temperatura, agitação, quantidade de biomassa anareróbica, etc) em comparação com uma ou mais fermentações de referência convencionais. Os parâmetros sobre os quais se quantifica o resultado relativamente à fermentação convencional são a produção de metano e de biogás medidos tanto em termos quantitativos como cinéticos. 6 6

Conforme especificado anteriormente, como princípio, um reactor é geralmente suficiente para cada amostra, mas quando se requer uma maior precisão, pode ser conveniente utilizar dois ou mais reactores com diluições diferentes de água ou de água residual a serem ensaiadas.

Os agregados microbianos são utilizados de acordo com o processo e o equipamento ilustrado num diagrama de blocos representado na figura 1.

Coloca-se um substrato apropriado e um inoculo de agregado anaeróbico nos micro-reactores 1, os quais são pelo menos em número de dois (um para o padrão e o outro para a água a ser examinada), em uma quantidade em peso compreendida entre 20 e 60 mg VSS (sólidos suspensos voláteis) correspondendo a concentrações específicas compreendidas entre 1 e 3 g VSS/1. Agitam-se os micro-reactores a 200 rpm e regulam-se termostaticamente à temperatura de 35°C. A saída dos micro-reactores encontram-se cilindros de água fechados 4 sobre os quais se encontra inserido um sistema óptico 3, que por exemplo pode ser um fotodiodo 2, alimentado apropriadamente. As vedações de água são as mesmas para cada reactor ambas com respeito às dimensões do cilindro e à altura do líquido e ao comprimento e ao diâmetro da capilaridade a partir da qual se descarrega o biogás (metano). O sistema óptico conta as bolhas de biogás emitidas por cada micro-reactor e envia os sinais relativos para uma memória 3. A memória encontra-se ligada a um computador pessoal para o processamento matemático da cinética de inibição da actividade metabólica sobre o substrato presente no reactor individual. 7

Comparam-se os valores tomados para uma amostra dada com os valores correspondentes de um padrão de referência e tanto a percentagem de inibição (bacteriostase) como a inibição total e irreversível (efeito bactericida) são estabelecidos de uma substância tóxica dada que actua em determinadas concentrações. A duração do ensaio encontra-se compreendida entre cerca de 3 e 6 horas. O processo e o equipamento descritos podem ser “robotizados” por atomatização do processo em estudo e as amostras a serem analisadas podem ser injectadas nos reactores com um sistema de recolha automático das amostras comerciais. O método descrito pode ser aplicado não só à água destinada a consumo como também a água superficial e do solo mas também aos efluentes e lixos industriais. A sensibilidade do ensaio é da ordem de ppm.

Numa outra forma de realização da presente invenção, enviam-se os sinais do sistema de detecção óptica por cabo ou por via rádio para um sistema de processamento de sinal à distância. Deste modo, o sistema de controlo analítico descrito anteriormente pode funcionar como um sinal de alarme no caso de toxicidade acidental ou variações súbitas nas características padrão de um dado lixo.

Os exemplos que se seguem proporcionam uma melhor compreensão da presente invenção mas não a limitam de modo algum.

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Exemplo 1

Utilizaram-se agregados anaeróbicos metanogénicos do tipo vulgarmente utilizado para a purificação de lixo urbano.

Realizaram-se as fermentações em reactores à escala de bancada com uma configuração de UASB inoculados com 2,5 g de biomassa VSS por litro e mantidos com a temperatura constante de 35°C. O substrato de alimentação era constituído por uma solução de soro de leite (5 g de soro de leite em forma de pó por litro) a que foram previamente adicionados sais inorgânicos tais como NH4HCO3, (NH4)2S04, CaCl2, MgCl2, FeCl3, KH2P04, K2HP04 com um COD final de 5000 ppm de 02 e um pH final de 6,8 - 7,2.

As características do agregado bacteriano anaeróbico misto obtido num total de 25 dias, alimentando os fermentadores em regime contínuo com três ciclos de tempo de retenção hidráulica HRT (Hydraulic Retention Time) (1,2; 1; e 0,85 dias) encontram-se indicados a seguir : PH 6,8

Total de sólidos suspensos : 24,1 g/1 Sólidos suspensos voláteis (VSS) : 8,8 g/1

Velocidade de sedimentação : 29 m/h COD (solúvel): 256 ppm

Velocidade de crescimento (μ): 0,05 h'1

Actividade específica : 0,25 g CH4-COD/g VSS/d igual a 7,72 pmol de CHVg VSS/min

Utilizou-se a biomassa assim obtida para inocular, numa quantidade em peso de 58 g de VSS, quatro micro-reactores (cada um com 35 ml dos quais 20 ml de volume operacional) constituídos por garrafas de Wheaton para serologia com uma tampa de borracha e um anel metálico para manter os gases e equipadas com agitadores magnéticos. O substrato orgânico dos quatro reactores era soro de leite em pó em uma quantidade de 50 mg por reactor. Carregou-se o triclorofenol (2,4,6--triclorofenol - TC1F) em três dos quatro reactores para uma concentração de 50, 5 e 1 ppm, respectivamente. Manteve-se o quarto reactor, nas mesmas condições e com o mesmo substrato mas sem TC1F, como um controlo. A duração total do ensaio era de três horas a uma temperatura de 35°C e com uma velocidade de agitação de 200 rpm. O Quadro 1 (em que 0 indica o padrão e 1, 2, 3, as três diluições de TC1F) mostra esquematicamente o ensaio de toxicidade de TC1F medido como uma redução da cinética de produção do biogás gerado pelo metabolismo anaeróbico. QUADRO 1 0 1 2 3 - biomassamg VSS 58 58 58 58 - TC1F ppm / 50 5 . 1 - Soro de leite mg 50 50 50 50 - H20 (até ml) 20 20 20 20

Os espaços da cabeça dos micro-reactores foram ligados com vedações de água num suporte especial equipado com um sensor óptico, neste caso especifico uma célula fotoeléctrica com um fotodiodo alimentado apropriadamente. Deste modo, para cada passagem de uma bolha de biogás na vedação de água activou-se um sinal eléctrico. 10

Totalizaram-se os eventos para cada micro-reactor e processaram-se apropriadamente por ligação com um PC. Realizou-se o processamento estatístico matemático (utilizando o programa “Four” Borland Int. nc. Scotts Valley Ca USA) por regressão linear da linha aproximadamente recta das curvas de cinética das frequências dos eventos.

No caso de cinética diferencial entre a amostra e o padrão, a toxicidade podia ser expressa significativamente como uma percentagem de inclinação menor da linha processada do primeiro com respeito à inclinação assumida pelo segundo. Obteve-se o valor quantitativo pelo complemento para 100 da razão entre os coeficientes angulares da linha padrão e os da linha relacionada com os reactore s de medição.

Os resultados relacionados com o TC1F encontram-se apresentados graficamente na Figura 2 e, tal como elaborado durante 3 horas, no quadro 2.

Pode notar-se como a sensibilidade para a substância tóxica a ser ensaiada sobre a parte do agregado anaeróbico pode ser avaliada significativamente para baixo até concentrações de 1 ppm (EC 37) e como com 5 ppm de TC1F há uma toxicidade de 46 % (CE 46) com relação ao padrão.

Exemplo 2

Utilizaram-se o mesmo processo e o mesmo aparelho que foram descritos no exemplo 1 para avaliar a toxicidade exercida por catiÕes bivalentes de metais tais como Co e Zn.

As diferenças são as seguintes.

Concentrações de agregados anaeróbicos de 43,8 mg por reactor; concentrações de iões CoeZnde20e lOppm respectivamenle; duração do ensaio 3 horas. 11 A figura 3 e o quadro 3 mostram os resultados obtidos. A toxicidade exercida sobre a biomassa por 20 ppm do ião Co e 10 ppm do ião Zn são de 34 % e 9 %, respectivamente.

Exemplo 3

Ensaiou-se a toxicidade de 20 mg de tetracloroetileno (C2C14) utilizando o mesmo equipamento e as mesmas condições que no exemplo 1.

Neste caso, utilizaram-se 20 mg de VSS por reactor de ãgregados anaeróbicos, caracterizados por uma actividade metanogénica de 0,11 g CH4-COD por g VSS por dia.

Como se pode ver no quadro 4 há uma toxicidade de 17,4 % (CE 17) por 20 ppm de tetracloroetileno. QUADRO 2

Toxicidade de 2,4,6-triclorofenol (T Cl P) I ensaio com (N° de fotodiodo casos/h) h . Padrão T Cl P 50 DDm T Cl P 5 ppm T Cl P 1 ppm 1 251 97 224 159 2 520 160 386 353 3 810 204 524 515 4 848 224 560 576 5 938 242 599 682 Regr. Durante 3 horas (I -III) Padrão T Cl P 50 ppm T Cl P 5 ppm T Cl P1 Dom Constante -32 46,66667 78 -13,6667 Erro padrão estimado de Y 8,573214 7,756718 9,797959 13,06395 | R Quadrado 0,99953 0,989599 0,997871 0,997314 N° de observações 3 3 3 3 Graus de liberdade I 1 1 1 Coeficiente(s) X 279,5 58,5 150 178 Erro padrão de Coef. 6,062178 5,484828 6,928203 9,237604 Tox. (%) — 80,8 46,3 37,2 12 QUADRO 3

Toxicidade de Co++ (Co Cl2) e de Zn+ + (ZnS04.7H20) Biomassa Tipo 2 ; Cultura IV N° de bolhas (Fotodiodo - fotodetector) h . Padrão (2) Co+ + 20 DDm Zn+ + 10 orim 1 131 126 121 2 242 199 219 3 323 252 296 4 365 288 340 5 400 314 369 Regr. Durante 3 horas (I - III) Padrão(2) 1 + s Zn++10 DDm Constante 40 66,33333 37 Erro padrão de Y estimado 12,24645 8,164966 8,573214 R Quadrado 0,991928 0,991672 0,995223 N° de observações 3 3 3 Graus de liberdade 1 1 1 Coeficiente(s) X 96 63 87,5 Erro padrão de Coef. 8,660254 5,773503 6,062178 Tox. (%) — 34,4 8,9 13 QUADRO 3

Toxicidade de C2 C14 20 ppm Biomassa V Cultura cons. a3°C de 13.05.93 N° de bolhas/h (fotodiodo - fotodetector)

20 mg VSS h . Padrão (2) C2 C14 1 52 49 2 92 86 3 178 149 4 296 277 5 339 342 Regr. Durante 3 horas (I -III) 20rmVSS

Constante Eito padrão de Y estimado R Quadrado N° de observações Graus de liberdade Coeficiente(s) X Erro padrão de Coef. Tox.í0/

Padrão -15,3333 16,73818 0,963139 3 1 60,5 11,83568 C2C14 -5,33333 10,61446 0,977963 3 1 50 7,505553 17,4

Lisboa, 30 de Março ¢3¾ f2000 •^'íOAgonts Oficie! ca Pr··

Claims (7)

1. ι REIVINDICAÇÕES 1. Processo biológico para a determinação da toxicidade da água e de descargas de água, consistindo a referida toxicidade em metais pesados e/ou compostos clorados, expresso da seguinte maneira: - preparação de uma cultura bacteriana anaeróbica metanogénica mista; - inoculação da cultura bacteriana em uma variedade de reactores dos quais pelo menos um é um reactor de referência, contendo um substrato com água convencional e pelo menos um outro, um reactor de medição, contendo um substrato com água ou resíduos cuja toxicidade se pretende medir; - sendo os referidos reactores de medição e de referência ligados a um sistema de detecção susceptível de medir o volume de biogás produzido por unidade de tempo; sendo o referido sistema de detecção ligado operativamente a um sistema de processamento de dados susceptível de determinar a redução na cinética de produção do biogás produzido pelo metabolismo anaeróbico no substrato e susceptível de o correlacionar com a toxicidade da água ou lixo.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o biogás produzido ser metano.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o sistema de detecção ser um fotodiodo. 2 I
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os reactores serem um reactor de referência e dois reactores de medição com concentrações diferentes de água ou lixo cuja toxicidade se pretende medir.
5. 5. Equipamento para a realização do processo de acordo com as reivindicações 1 a 4 composto por : uma variedade de reactores para fermentação anaeróbica dos quais pelo menos um é um reactor de referência e pelo menos um é um reactor de medição; sendo cada um dos reactores equipado com uma vedação em relação à água no espaço da cabeça do referido reactor, um sensor óptico susceptível de transformar o biogás produzido no reactor que passa através da referida vedação em relação à água, em sinais eléctricos, um sistema de processamento de dados susceptível de detectar e comparar os sinais eléctricos emitidos a partir do reactor de referência e do reactor de medição, determinando a redução na cinética de produção de biogás e correlacionando-a com a toxicidade da água ou do lixo.
6. 6. Equipamento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o sensor óptico ser um fotodiodo.
7. 7. Equipamento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de os reactores serem um reactor de referência e um reactor de medição.