PT529995E - Receptor ka-2 humano um receptor de cainato com elevada afinidade da familia dos eaa2 (aminoacidos excitantes) - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"RECEPTOR KA-2 HUMANO, UM RECEPTOR DE CAINATO COM ELEVADA AFINIDADE DA FAMÍLIA DOS EAA2 (AMINOÁCIDOS EXCITANTES)"

Antecedentes da Patente

Campo da Patente

Esta patente diz respeito às aplicações da tecnologia de DNA recombinante no campo da neurobiologia. Mais particularmente, esta patente diz respeito à clonagem e expressão de DNA que contém o código de receptores de aminoácidos excitantes (EAA), especialmente de receptores humanos de EAA.

No sistema nervoso central dos mamíferos (SNC), a transmissão de impulsos nervosos é controlada pela interacção entre uma substância neurotransmissora libertada pelo neurónio “emissor” e um receptor superficial no neurónio “receptor”. O L-glutamato é o neurotransmissor mais abundante no SNC e serve de mediador no principal percurso de excitação dos vertebrados. O glutamato é por esta razão referido como um aminoácido excitante (EAA) e os receptores os quais respondam a este são vulgarmente designados por receptores de glutamato, ou mais vulgarmente de receptores de EAA.

Utilizando tecidos isolados do cérebro de mamíferos e vários agonistas sintéticos dos receptores de EAA, o conhecimento da farmacologia dos receptores de EAA aumentou significativamente. Os membros da família dos receptores de EAA são agora agrupados em três tipos principais com base nas diferentes ligações aos referidos agonistas. Um tipo de receptor de EAA o qual, além de se ligar ao glutamato também se liga ao agonista NMDA (N-metil-D-aspartato), é referido como o tipo NMDA dos receptores de EAA. Dois outros tipos de receptores de EAA, ligantes para com o glutamato, e os

J quais não se ligam ao NMDA, são referidos de acordo com a sua preferência para se ligarem a dois outros agonistas, nomeadamente AMPA (alfa-amino-3-hidróxi-5-metilisoxazolo-4-propionato), e cainato. Em particular, os receptores que se ligam ao glutamato mas não ao NMDA e os quais se ligam com maior afinidade ao cainato do que ao AMPA, são referidos como receptores de EAA do tipo cainato. De um modo semelhante, os receptores de EAA que se ligam glutamato mas não ao NMDA, e os quais se ligam ao AMPA com maior afinidade do que ao cainato são referidos como receptores de EAA do tipo AMPA. A família de receptores de EAA que apresentam afinidade para com o glutamato é de grande importância fisiológica e médica. O glutamato está envolvido em muitos aspectos de potenciação a longo prazo (aprendizagem e memória), no desenvolvimento da plasticidade sináptica, em ataques epilépticos, em danos neuronais causados por isquémia após um ataque de coração ou a outros eventos hipóxicos, bem como também a outras formas de processos neurodegenerativos. No entanto o desenvolvimento de terapêuticas as quais modulassem estes processos foi muito difícil devido à ausência de qualquer fonte homogénea de material de receptor com a qual seria possível descobrir moléculas de fármacos que se ligassem selectivamente e as quais interactuassem especificamente na interface do receptor de EAA. Os tecidos derivados do cérebro actualmente utilizados para avaliar os fármacos candidatos são fontes de receptor heterogéneas, apresentando na sua superfície muitos tipos de receptores o que interfere com os estudos da interface de interesse receptor de EAA /ligando. A procura de métodos terapêuticos para humanos é adicionalmente complicada pela limitada disponibilidade de tecido de cérebro de origem humana. Seria então desejável obter células as quais tivessem sido criadas por engenharia genética para produzir apenas o receptor de interesse. Através das linhas de células que expressam os genes de receptor clonados, fica disponível um substrato, o qual é homogéneo para o receptor desejado, para os programas de avaliação de fármacos.

Muito recentemente, foram descobertos os genes que codificam os polipeptídeos substituintes dos receptores de EAA a partir de fontes não humanas, principalmente de

gene referido originalmente como GluR-Kl (mas agora designado simplesmente por GluRl). Este gene codifica um membro da família de receptores de EAA de rato e originalmente suspeitava-se que pertencesse ao tipo cainato. Estudos subsequentes feitos por Keinanen et al., Science 249: 556, 1990, mostraram, novamente em ratos, que um gene designado como GluR-A, o qual na realidade era idêntico ao previamente isolado GluRl, de facto codifica não um receptor do tipo cainato, mas sim do tipo AMPA. Estes dois grupos de investigadores desde então relataram cinco genes relacionados e isolados tendo como fonte o rato. Boulter et al Science 249: 1033, 1990, revelaram que, além do GluRl, o rato continha 3 outros genes relacionados que eles designaram por GluR2, GluR3 e GluR4, e Bettler et al., Neuron 5: 583, 1990 descreveu o GluR5. Keinanen et al., supra, descreveu os genes designados por GluR-A, GluR-B, GluR-C e GluR-D que, por sua vez, correspondem precisamente ao GluRl, GluR2, GluR3 e GluR4, respectivamente, Sommer et al. , Science 249: 1580, 1990 também apresentaram, para cada um dos genes GluR-A, GluR-B, GluR-C e GluR-D duas formas alternadamente ligadas uma à outra. Estes autores, bem como também Monyer et al, Neuron 6:799, 1991 foram capazes de mostrar que as versões diferentemente ligadas destes genes eram expressos de um modo diferente no cérebro de rato. Adicionalmente ao isolamento destes genes receptores de AMPA, vários estudos tentaram mais recentemente determinar as propriedades dos referidos de servirem de para a captação iónica de misturas diferentes dos conhecidos receptores (Nakanishi et al., Neuron 5: 569, 1990; Hollmann et al., Science 252 ,851, 1991; Verdoom et al., Science 252: 1715, 1991; e 25 ver WO 91/06648).

No que respeita aos genes não humanos, os quais parecem codificar um receptor do tipo cainato também tem sido, recentemente, publicado algum trabalho. Egebjerg et al., Nature 351: 745, 1991, descreveram o isolamento de um gene de rato chamado GluR6, o qual embora relacionado em sequência com os genes receptores de AMPA, forma um receptor o qual não é activado pelo AMPA mas antes através do glutamato, quisqualato e, preferencialmente, pelo cainato. Têm sido descritas outras proteínas que apresentam afinidade para com o cainato nos sapos (Wada et al., Nature 342: 684, 1989), galinha / (Gregor et al., Nature 342: 689, 1989) e de rato (Wemer al de et., Nature 351: 742, 1991). Estes últimos genes codificam proteínas as quais se ligam ao cainato, mas as quais não formam prontamente canais iónicos funcionais quando apenas expressas por elas próprias. A partir destes avanços na clonagem molecular foi conseguida uma melhor compreensão das características estruturais dos receptores de EAA e das suas sub-unidades tais como existem no cérebro de rato. De acordo com o corrente modelo da estrutura do receptor de EAA, cada um deles é heteromérico em estrutura, sendo constituído por sub-unidades individuais ligadas à membrana, cada uma das quais apresentando quatro regiões trans-membranais e domínios extracelulares õs quais ditam, em alguma extensão, as propriedades de ligação ao ligando e contribuem para função de captação iónica disponibilizada pelo complexo receptor. Keinanen et al., supra, mostrou, por exemplo, que cada sub-unidade do receptor GluR de rato, incluindo as designadas por GluR-A, GluR-B, GluR-C e GluR-D, apresentam uma actividade orientadora do fluxo dos catiões captados pelo glutamato, pelo AMPA e pelo cainato, no seu estado unitário. No entanto, quando são expressos em combinação, como por exemplo o GluR-A em combinação com o GluR-B, são produzidos maiores fluxos nos canais de iões metálicos captados pelas células anfitriãs de mamífero.

Na procura de métodos terapêuticos úteis no tratamento de desordens do SNC em humanos, é altamente desejável, claro, utilizar um método de avaliação de compostos candidatos, o qual seja mais representativo da situação humana que é actualmente possível com os receptores de rato até agora isolados. É particularmente desejável utilizar genes clonados que codifiquem receptores humanos, e linhas de células que expressem esses genes, de modo a obter avaliação adequada para os compostos terapêuticos que se destinam a serem utilizados em humanos. Concordantemente, estes constituem um dos objectivos da presente patente.

Outro dos objectivos da presente patente é fornecer, na sua forma isolada, uma molécula de DNA a qual codifique um receptor de EAA humano. 3

Um outro objectivo da presente patente é fornecer uma célula a qual tenha sido criada, através de engenharia genética, para produzir um receptor de EAA humano do tipo que se liga ao cainato.

Outro objectivo da presente patente será aparente a partir da seguinte descrição da patente.

Resumo da Invenção

Até agora já foram identificados e caracterizados os genes que codificam uma família de receptores de EAA endógenos do cérebro humano. Um membro representativo desta família de receptores de EAA humanos, designado por EAA2a humano, codifica uma proteína receptora que além de se ligar ao glutamato com uma afinidade típica dos receptores de EAA, também exibe propriedades características de ligação a um ligando dos receptores de EAA do tipo cainato. Também foram identificados genes relacionados pela sequência que codificam para variantes, que existem na natureza, do receptor de EAA2a humano, e constituem membros adicionais desta família de receptores, aqui referenciada como a família de receptores de EAA2 humanos. A presente patente disponibiliza assim, numa das suas vertentes, um polinucleótido isolado, constituído ou por DNA ou por RNA, o qual codifica um receptor de EAA2 humano ou para um seu fragmento que se liga ao cainato, tal como é definido na reivindicação 1.

Noutro aspecto da presente patente, é disponibilizada uma célula que foi criada através da engenharia genética para produzir um receptor de EAA humano que se ligue ao cainato que pertence à, aqui definida, família de EAA2 tal como é explanado na reivindicação 11. Nos aspectos relacionados da presente patente são disponibilizadas estruturas de DNA recombinante tal como é definido na reivindicação 7 e composições de membranas tal como são definidas na reivindicação 13. A presente patente também disponibiliza proteínas e fragmentos de proteínas tal como são definidos nas

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Noutro aspecto da presente patente, é disponibilizado um método para avaliar a afinidade de um composto seleccionado para se ligar a um receptor que apresente as características de um receptor de EAA2 humano, o que compreende os passos de incubar o composto com uma célula, criada através de engenharia genética, da presente patente ou com uma composição de membrana dela derivada, de um modo adequado para determinar a afinidade de ligação ao receptor do composto em teste, tal como é definido nas reivindicações 17 e 18.

Outros aspectos da presente patente, os quais compreendem várias aplicações das descobertas aqui descritas, serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada bem como das ilustrações que a acompanham.

Breve Descrição das Ilustrações A Figura 1 descreve a sequência de nucleótidos de DNA que codifica um receptor de aminoácidos excitantes da presente patente bem como a sequência de aminoácidos daí deduzida; A Figure 2 ilustra esquematicamente uma estratégia baseada em PCR para amplificar a sequência de DNA ilustrada na Figura 1;

As Figuras 3(1) e 3(2) ilustram com mapas de plasmídeos lineares a estratégia utilizada para construir os vectores de expressão que compreendem a sequência de DNA apresentada na Figura 1;

As Figuras 4(1), 4(2) e 4(3) mostram, com referência à Figura 1, o DNA e as sequências de aminoácidos de variantes que existem na natureza do receptor de EAA apresentadas na Figura 1; e

As Figuras 5 e 6 ilustram graficamente as propriedades de ligação ao ligando do receptor de EAA expresso a partir da região de código fornecida na Figura 1. j t

Descrição Detalhada das Configurações Preferidas A patente diz respeito a receptores de aminoácidos excitantes (EAA) de origem humana, e é dirigida, mais particularmente, a uma nova família de receptores de EAA do tipo cainato humanos, aqui designada pela família de receptores EAA2 humanos. Tal como é aqui utilizado, o termo " receptor de EAA2 humano” deve ser entendido como incluindo o receptor de EAA2a humano e variantes, que se liguem ao cainato, do receptor de EAA2a que estejam estruturalmente relacionadas ao mesmo, ou seja, apresentem, pelo menos uma homologia de 95% com o referido, incluindo as variantes derivadas do receptor de EAA2a que existem na natureza bem como as sintéticas. As variantes do receptor de EAA2a humano que existem na natureza incluem, particularmente, os receptores aqui designados por receptores de EAA2b humanos e receptores de EAA2c humanos. Tal como é aqui utilizado, o termo "ligante para com o cainato" diz respeito a variantes do receptor e a fragmentos do receptor que exibam maior afinidade para se ligarem ao cainato do que para quer ao glutamato quer,ao AMPA ou NMDA, tal como esta é determinada em ensaios convencionais, tais como os ensaios aqui descritos.

Em particular o receptor de EAA humano designado por EAA2a é uma proteína caracterizada estruturalmente como uma única cadeia de polipeptídeos que é inicialmente produzida na sua forma de precursor apresentando um resíduo de peptídeo sinalizante com um terminal N 18 e é transportado até à superfície da célula na sua forma madura, apresentando a falta do peptídeo sinalizante e constituído por 962 aminoácidos organizados na sequência ilustrada através de uma sigla de letra única na Figura 1. A menos que caso seja declarado o contrário, os resíduos de aminoácido do receptor de EAA2a são numerados com referência à sequência da proteína madura. Com respeito aos domínios estruturais do receptor, uma análise hidropática revela quatro domínios trans-membranais putativos, um situado entre os resíduos 528 -547, inclusivamente, (TM-1), outro situado entre os resíduos 572-590 (TM-2), um terceiro situado entre os resíduos 601-619 (TM-3) e um quarto situado entre os resíduos 786-806 (TM-4). Com base nesta atribuição, é provável que a estrutura do receptor de EAA la humano, na sua forma natural envolvido por uma membrana, consista num domínio extracelular com um terminal N e contendo 527 aminoácidos, seguido por uma região hidrófoba que contém quatro domínios de trans-membranais e um extracèlular, o domínio com terminal C e com 156 aminoácidos.

Tal como é apresentado na Figura 4, também foram identificadas variantes do receptor de EAA2a estruturalmente relacionadas que existem na natureza em tecido de cérebro humano. Tal como é deduzido a partir das sequências de nucleótido dos genes que as codificam, estas variantes diferem então, estruturalmente, pela inserção de um aminoácido adicional entre posições 473 e 474 do EAA2a, no caso do EAA2b. Outra variante designada por EAA2c, difere do EAA2a em quinze aminoácidos na região terminal N (Figura 4). Uma outra variante adicional, designada por EAA2d, também difere do EAA2a na região terminal N, e apresenta uma falha de sete aminoácidos (Figura 4).

Nas bibliotecas de cDNA do hipocampo humano, a fonte a partir da qual o DNA que codifica o receptor de EAA2 foi isolado, o receptor de EAA2a é codificado pela sequência de nucleótidos apresentada na Figura 1. Em relação às sequências de ácidos nucleícos que codificam para os receptores de aminoácidos excitantes descobertos em tecido de rato, tal como é descrito nas publicações aqui previamente mencionadas, o receptor de EAA2a humano apresenta uma limitada identidade da sequência de ácidos nucleícos, que no seu limite superior é de aproximadamente 60%. Esta grande diferença estrutural sugere que os equivalentes não humanos dos EAA2a até agora ainda não foram descobertos, ou talvez não existam.

Tal como outros membros da família de receptores de EAA2 humanos, o subtipo de receptor EAA2a é caracterizado por um perfil farmacológico, ou seja uma “assinatura” de ligação ao ligando que aponta fortemente para uma farmacologia do tipo cainato, diferente de outro tipos de receptores de aminoácidos excitantestais como o NMDA e o AMPA. Apesar do facto de que os receptores que se ligam ao cainato necessitarem de uma estrutura de sub-unidade multi- e talvez heteromérica para funcionar no sentido farmacológico, foi descoberto que as células que produzem o receptor de EAA2a unitário fornecem, independentemente da associação com outras sub-unidades de 9 9

f receptor, uma indicação segura da ligação aos aminoácidos excitantes. Deste modo, num aspecto fundamental da presente patente, o receptor de EAA2a humano é utilizado com a finalidade de avaliar compostos candidatos quanto à sua capacidade para competir com ligandos de receptores de EAA endógenos bem como com os seus análogos sintéticos conhecidos para se ligarem aos receptores de EAA.

Para ser utilizada em ensaios de ligação ao receptor, é desejável construir, através da aplicação de técnicas de engenharia genética, uma célula de mamífero que produza o receptor de EAA2a numa forma funcional tal como na forma de um produto heterólogo. A construção de tais linhas de células é conseguida introduzindo numa célula anfitriã seleccionada uma construção de DNA recombinante na qual o DNA que codifica o receptor de EAA2a humano numa forma transportável para a superfície da célula, ou seja, apresentando seu peptídeo de sinal original ou um seu equivalente heterólogo funcional, esteja associado com elementos que controlam a expressão que são funcionais no anfitrião seleccionado para orientar a expressão do DNA que codifica o receptor, elaborando deste modo a desejada proteína receptora de EAA2. Tais células são aqui caracterizadas como apresentando o DNA que codifica o receptor incorporado “expressamente” nelas próprias. O DNA que codifica o receptor é referido como “heterólogo” com respeito a um anfitrião celular particular se esse DNA não é encontrado naturalmente nesse anfitrião particular. O tipo de célula específico seleccionado para servir como anfitrião para produção do receptor de EAA2a humano pode ser qualquer um dos vários tipos de células usualmente disponíveis neste campo, mas não deve, claro; ser um tipo de célula que no seu estado natural elabore um receptor de superfície que se possa ligar a aminoácidos de excitantes confundindo desse modo os resultados dos ensaios que vão ser feitos com a linha de células criada. Geralmente, tais problemas são evitados seleccionando como anfitrião um tipo de célula que não as neuronais e podem ainda ser evitados utilizando linhas de células de origem não-humana, tal como é vulgar fazer. Será, no entanto, apreciado que células neuronais e de origem humana possam não obstante servir como anfitriãs de expressão, desde que a ligação “residual” com o ligando em teste seja considerada e descontada nos resultados dos ensaios.

De acordo com uma das configuração da presente patente, a linha de células seleccionada para servir como anfitriã para a produção do receptor de EAA2 é uma linha de célula de mamífero. Vários tipos das referidas linhas de células estão actualmente disponíveis para os ensaios de engenharia genética, e estas incluem as células do ovário de hamster chinês (CHO) da, por exemplo, linhagem Kl (ATCC CCL 61) incluindo a variante Pro5 (ATCC CRL 1281); as células semelhantes a fibroblastos derivadas de rim de macaco verde africano transformado com SV40 da linhagem CV-1 (ATCC CCL 70), da linhagem COS-1 (ATCC CRL 1650) e da linhagem COS 7 (ATCC CRL 1651); L-células de murino, células 3T3 de murino (ATCC CRL 1658), células de murino Cl27, células de rim embrionário humanas da linhagem 293 (ATCC CRL 1573), células de carcinoma humano que incluem as da linhagem HeLa (ATCC CCL 2), e células de neuroblastoma das linhas IMR-32 (ATCC CCL 127), SK-N-MC (ATCC HTB 10) e SK-N-SH (ATCC HTB 11).

Foram adaptados e estão agora comercialmente disponíveis uma grande variedade de sistemas de expressão de genes para serem utilizados com os referidos anfitriões e qualquer um destes sistemas pode ser seleccionado para orientar a expressão do DNA que codifica o receptor de EAA2. Estes sistemas, tipicamente disponíveis na forma de vectores plasmídicos, incluem conjuntos de expressão cujos os componentes funcionais incluem sequências de controle de expressão constituintes do DNA, as quais são reconhecidas pelo anfitrião e possibilitam a expressão do DNA que codifica o receptor quando unidos ao referido na posição 5’. Os sistemas incluem ainda sequências de DNA as quais terminam a expressão quando unidas na posição 3’ da região que codifica o receptor. Assim, para a expressão no anfitrião de célula de mamífero seleccionado, é gerada uma construção de expressão de DNA recombinante na qual o DNA que codifica o precursor de receptor transportável é unido com sequências de DNA que controlam a expressão reconhecidas pelo anfitrião, e as quais incluem uma região 5’ de DNA que codifica o receptor para orientar a expressão, e uma região 3’ para terminar a expressão. O vector plasmídico que contém a construção de expressão engloba, tipicamente, outros componentes funcionais tais como uma fonte de replicação, normalmente derivada de um vírus, para permitir a replicação do plasmídeo nb anfitrião de expressão e, desejavelmente, também para amplificar o plasmídeo num anfitrião bacteriano, tal como E. coli. De modo a fornecer uma selecção que permita a marcação de células recombinantes transformadas estáveis, o vector também vai incluir um gene que confira alguma vantagem no que respeita à sobrevivência dos transformados, tais como um gene que codifique a resistência à neomicina caso no qual os transformados são revestidos num substrato que apresenta como suplemento a neomicina.

Incluído entre os vários sistemas de expressão do DNA recombinante que podem ser utilizados para alcançar expressão numa célula de mamífero do DNA que codifica o receptor, estão aqueles que exploram os promotores de vírus que infectam as células de mamífero, tais como o promotor do citomegalovirus (CMV), do vírus do sarcoma de Rous (RSV), do vírus de símio (SV40), do vírus de tumor mamário de murino (MMTV) e outros. Também úteis para orientar a expressão são promotores tais como o LTR de retrovírus, os promotores de células de insectos tais como aqueles que são regulados pela temperatura, e isolados da Drosofila, bem como também os promotores de genes mamíferos tais como aqueles que são regulados por metais pesados, como por exemplo, o promotor de gene metalotioneína e outros promotores induzíveis por esteróides.

Para ser integrado no vector de expressão do DNA recombinante, o DNA que codifica o receptor de EAA2 desejado, ou seja o receptor de EAA2a ou uma sua variante que se ligue ao cainato, pode ser obtido aplicando técnicas seleccionadas de isolamento de genes ou síntese de genes. Tal como vai ser descrito em maior detalhe nos exemplos aqui referidos, o receptor de EAA2a, bem como as suas variantes EAA2b e EAA2c, são codificados dentro do genoma do tecido de cérebro humano e podem então ser obtidos por cuidadosa aplicação de técnicas convencionais de isolamento e clonagem de genes. Estes processos vão tipicamente requerer a extracção total do RNA mensageiro a partir de uma fonte fresca de tecido de cérebro humano, preferivelmente de tecido de cerebelo ou de hipocampo, seguida por conversão da mensagem a cDNA e formação de uma biblioteca num, por exemplo, plasmídeo bacteriano, ou mais tipicamente num bacteriofago. Tal bacteriofago contendo fragmentos de DNA humano é tipicamente 12

feito crescer colocando-o num substrato de bactérias de E. coli susceptíveis de modo a que possam ser isoladas ou em placas de fagos individuais ou em colónias. O DNA transportado pela colónia de fagos é então imobilizado tipicamente numa membrana de hibridação de nitrocelulose ou com base de nylon, e então hibridizado, sob condições cuidadosamente controladas, até obter uma sonda de oligonucleótido etiquetada radiactivamente (ou de qualquer outro modo) com uma sequência apropriada para identificar especificamente a colónia de fagos que transporta o DNA que codifica o receptor ou seu fragmento. Tipicamente, o gene ou uma sua parte identificada deste modo, é sub-clonada para formar um vector de plasmídeo útil na análise da sequência de ácidos nucleícos.

Após ter aqui fornecido a sequência de nucleótidos de vários receptores de EAA2 humanos, será decerto apreciado que possam ser executadas técnicas automatizadas de síntese e/ou amplificação de genes de modo a produzir DNA que os codifique. Devido ao comprimento do DNA que codifica o receptor de EAA2, a aplicação da síntese automatizada pode obrigar à construção de genes passo a passo, na qual as regiões do gene com até aproximadamente 300 nucleótidos de comprimento são sintetizadas individualmente e só depois são ligadas na sequência correcta para a construção final. As regiões de gene individualmente sintetizadas podem ser amplificadas antes de serem juntas, utilizando a tecnologia da reacção em cadeia da polimerase (PCR). A aplicação de técnicas de síntese automatizada de genes fornece uma oportunidade para gerar variantes de sequência de membros da família de genes EAA2 que existem na natureza. Será, por exemplo, apreciado que os polinucleótidos que codificam os receptores de EAA2 aqui descritos possam ser gerados através da substituição por códons sinónimos aos representados nas sequências de polinucleótido que existem na natureza aqui identificadas. Adicionalmente, podem ser produzidos polinucleótidos que codificam variantes sintéticas dos receptores de EAA2 aqui descritos os quais, por exemplo, compreendem uma ou mais substituições, subtracções ou adições de um aminoácido individual. Considerando que, quando se pretendem realizar avaliações, em maior parte dos casos será desejável manter o perfil natural de ligação ao ligando, é /

desejável limitar as substituições de aminoácido, por exemplo, às substituições normalmente designadas por conservadoras nas quais são substituídos os aminoácidos de carga semelhante, e limitar as substituições apenas aos locais menos críticos para a actividade de receptor, como por exemplo, dentro dos aproximadamente 20 primeiros resíduos com terminal N do receptor maduro, e às outras regiões tais como são identificadas no mapeamento do domínio do receptor.

Com o modelo apropriado o DNA disponível, a técnica de amplificação por PCR também pode ser utilizada para produzir directamente todo ou parte do gene final. Neste caso, são sintetizadas as bases as quais vão ser utilizadas na amplificação por PCR do produto final, ou num único fragmento, ou em vários fragmentos que podem ser ligados em conjunto. Esta ligação pode ser feita por ligação passo a passo de fragmentos de DNA amplificados com terminais simples, ou, preferencialmente, por ligação passo a passo de fragmentos que contenham locais de endonuclease restringida que ocorram na natureza. Nesta aplicação, é possível utilizar ou o cDNA ou o DNA genómico como modelo para a amplificação por PCR. No caso anterior, o modelo de cDNA pode ser obtido a partir de bibliotecas de cDNA disponíveis comercialmente ou construídas de vários tecidos de cérebro de humano, incluindo o hipocampo e cerebelo.

Uma vez obtido, o DNA que codifica o receptor é incorporado, para posterior expressão, em qualquer vector de expressão adequado e as células anfitriãs são aí transfectadas utilizando procedimentos convencionais, tais como a transformação mediada por DNA, a electroporação, ou a transformação com canhão de partículas. Podem ser seleccionados vectores de expressão de modo a obter linhas de células transformadas que expressem o DNA que codifica o receptor ou transitoriamente ou de uma maneira estável. Para uma expressão transitória, as células anfitriãs são tipicamente transformadas com um vector de expressão compreendendo uma origem de replicàção funcional numa célula de mamífero. Para uma expressão estável, as referidas origens de replicàção são desnecessárias, mas os vectores vão compreender tipicamente um gene que codifica um produto que confere aos transformados vantagem na sua sobrevivência, de modo a promover a sua selecção. Os genes que codificam para tais marcadores seleccionáveis incluem o gene gpt da E. coli o qual confere resistência ao ácido micofenólico, o neo-gene de translocador Tn5 o qual confere resistência ao antibiótico G418 e à neomicina, a sequência dhfr de células de murino ou de E. coli as quais mudam o fenótipo das células DHFR- para células DHFR+, e o gene tk do vírus da herpes simplex, o qual toma, fenotipicamente, as células TK- em células TK+. Ambas as expressões transitória e expressão estável podem produzir linhas de células transformadas, e composições de membrana delas derivadas, para serem utilizadas em ensaios de avaliação de ligandos.

Para serem utilizadas em ensaios de avaliação, as células que expressam transitoriamente o DNA que codifica o receptor podem ser congeladas e armazenadas para serem posteriormente utilizadas, mas devido ao rápido aumento da replicação de plasmídeo que conduzirá no final à morte das células, normalmente em poucos dias, as células transformadas devem ser utilizadas o mais cedo que seja possível. Os referidos ensaios podem ser executados ou em células intactas, ou em composições de membrana derivadas das referidas células. As composições de membrana fornecem tipicamente um substrato mais adequado para as experiências de ligação ao ligando, e são por isso preferidas como substratos para ligação. Para preparar as composições de membrana para ensaios de avaliação, ou seja para experiências de ligação ao ligando, são homogeneizadas células intactas congeladas enquanto se encontram numa suspensão de água fria e após centrifugação é recolhido um agregado de membrana. Esse agregado é então lavado em água fria, e sofre diálise de modo a remover os ligandos de EAA endógenos tais como o glutamato que, caso contrário, competiria nos ensaios de ligação. Para os ensaios de ligação ao ligando, as membranas dializadas podem ser utilizadas imediatamente ou então após terem sido armazenadas na sua forma liofilizada. Altemativamente, podem ser utilizadas células intactas, frescas e colhidas aproximadamente dois dias depois da transfecção transitória ou depois de aproximadamente o mesmo período após fixar células transfectadas estáveis, para realizar os ensaios de ligação ao ligando pelos mesmos métodos que foram utilizados para as composições de membrana. Quando forem utilizadas células, as células devem ser colhidas através de uma centrifugação mais suave para não as danificar, e todas as 15

lavagens devem ser feitas num substrato tamponado, por exemplo em água salgada tamponada com fosfato, de modo a evitar o choque osmótico e a consequente ruptura das células. A ligação de um ligando candidato a um receptor seleccionado de EAA2 humano desta patente é tipicamente avaliada utilizando uma quantidade previamente determinada de membrana derivada de células (mensurada, por exemplo, por determinação de proteínas), geralmente de cerca de 25 ug a 100 ug. Normalmente, os ensaios de ligação competitivos serão úteis para avaliar a afinidade de um composto em teste relativamente ao cainato. Este ensaio de ligação competitivo pode ser executado incubando a composição de membrana com cainato etiquetado radiactivamente, por exemplo 3H-cainato, na presença de composto de teste não etiquetado adicionado em várias concentrações. Após as incubações, o cainato etiquetado radiactivamente deslocado ou ligado pode ser recuperado e avaliado para determinar as afinidades de ligação relativas do composto teste e do cainato pelo receptor específico utilizado como substrato. Deste modo, podem ser determinadas as afinidades de várias compostos para com os receptores de EAA humanos do tipo cainato.

Como alternativa à utilização de células que expressam o DNA que codifica o receptor, a caracterização dos ligandos também pode ser executada utilizando células de, por exemplo, oócitos Xenopus, que apresentam receptores ligados à membrana, funcionais após a introdução do RNA mensageiro que codifica o receptor de EAA2. Neste caso, o gene receptor de EAA2 da patente é tipicamente subclonado num vector de plasmídeo de tal modo que o gene introduzido possa ser facilmente transcrito para o RNA através de um promotor de transcrição de RNA adjacente fornecido pelo vector de plasmídeo, por exemplo os promotores bacteriofagos T3 ou T7. O RNA é então transcrito do gene inserido in vitro, e pode então ser injectado nos oócitos Xenopus. Após a injecção de nL volumes de uma solução de RNA, os oócitos são deixados então incubar durante vários dias, e só depois são testados quanto à sua capacidade para responder a uma molécula de ligando específica fornecida por uma solução em que estão mergulhados. Considerando que receptores de EAA funcionais actuam em parte através da operação de um canal de 16 *

» membrana pelo qual os iões podem selectivamente passar, o funcionamento do receptor como resposta a uma molécula de ligando específica numa solução onde está mergulhado pode sér tipicamente medido como uma corrente eléctrica utilizando micro-eléctrodos inseridos na célula.

Além de se utilizar o DNA que codifica o receptor para construir linhas de células úteis para a avaliação de ligandos, a expressão do DNA pode, de acordo com outro aspecto da patente, ser executada para produzir fragmentos do receptor numa forma solúvel para a investigação da sua estrutura, de modo a produzir anticorpos para outros fins experimentais. É esperado que a parte do receptor de EAA2 responsável pela ligação a uma molécula de ligando se encontre no lado de fora da célula, ou melhor, seja extracelular. É por isso desejável numa primeira aproximação para facilitar a caracterização da interacção receptor-ligando, disponibilizando este domínio de ligação ao ligando extracelular em quantidade e na sua forma isolada, ou seja, sem o resto do receptor. Para conseguir isto, o comprimento total do DNA que codifica o receptor pode ser modificado através de mutagénese local dirigida, de modo a introduzir um códon de parar translational dentro da região do terminal N extracelular, imediatamente antes da sequência que codifica o primeiro domínio transmembranal (TM1), ou seja, antes do resíduo 528 tal como é apresentado na Figura 1. Dado que deste modo já não será produzido nenhum domínio(s) transmembranal para servir de “âncora” ao receptor na membrana, a expressão do gene modificado resultará na secreção, na sua forma solúvel, de apenas o domínio extracelular de ligação ao ligando. Podem então ser executados ensaios de ligação ao ligando padrão para averiguar o grau de ligação de um composto candidato ao domínio extracelular assim produzido. Pode ser, no entanto, necessário, utilizando mutagénese local dirigida, produzir várias versões diferentes das regiões extracelular de modo a aperfeiçoar o grau de ligação do ligando aos domínios isolados.

Altemativamente, pode ser desejável produzir um domínio extracelular do receptor que não seja derivado do terminal amina da proteína madura, mas antes do terminal carboxílico, como por exemplo, nos domínios que estão imediatamente após o quarto domínio transmembranal (TM4), ou seja , que estão entre os resíduos de aminoácido / 806 e 962 da Figura 1. Neste caso, as técnicas de mutagénese local dirigida e/ou amplificação baseada em PCR, podem ser imediatamente utilizadas de modo a produzir um fragmento de gene que codifique o domínio de interesse do receptor. Uma tal sequência de DNA pode ser utilizada para dirigir a expressão do fragmento de receptor desejado, ou intracelularmente ou na sua forma segregada, desde que o DNA que codifica o fragmento de gene seja inserido adjacentemente a um códon inicial de translação fornecido pelo vector de expressão e que o quadro de leitura da translação exigida seja cuidadosamente conservado.

Será apreciado que a produção dos referidos domínios de ligação ao ligando extracelulares possa ser feita numa grande variedade de células anfitriãs. Podem ser utilizadas células de mamífero tais como as células CHO para este propósito, sendo a expressão tipicamente dirigida por um promotor de expressão capaz de expressão num nível alto, como por exemplo o promotor CMV (citomegalovirus). Altemativamente, podem ser utilizadas células de um não-mamífero, tais como as células de um insecto Sf9 (Spodoptera frugiperda), sendo a expressão tipicamente dirigida por promotores de expressão do baculovirus, por exemplo o forte e recente promotor proteico de polihedrina. Também podem ser utilizados os sistemas de expressão de fungos filamentosos para secretar grandes quantidades dos referidos domínios extracelulares do receptor de EAA. Por exemplo, o Aspergillus nidulans, sendo a expressão dirigida pelo promotor de alcA, constituiria um tal sistema aceitável. Àdicionalmente aos referidos anfitriões de expressão, será ainda apreciado que qualquer outro sistema de expressão eucariótico ou procariótico capaz de expressar genes ou fragmentos de genes de heterólogos, quer intracelularmente ou extracelularmente sejam igualmente adequados. A disponibilidade de domínios de ligação a ligandos extracelular isolados da proteína receptora toma possível determinar as estruturas tridimensionais destas regiões de ligação a ligandos, com ou sem um ligando candidato aí complexado, através de uma combinação de métodos de cristalografia de Raios-X e técnicas avançadas de NMR 2D. Deste modo, podem ser desenvolvidos e testados novos candidatos adicionais que se 18

preveja apresentarem as interacções necessárias com a estrutura tridimensional do receptor.

Com grandes domínios, a cristalografia é o método escolhido para a determinação estrutural de tanto o domínio isolado como do co-complexo com o ligando natural (ou com um adequado antagonista ou molécula de agonista). Se puder ser feito um domínio específico pequeno, por exemplo com aproximadamente 100 a 130 aminoácidos de comprimento, então a poderosa técnica de NMR 2-D também pode ser aplicada para a determinação estrutural. Isto não só possibilita a determinação da estrutura do domínio, mas também fornece uma informação dinâmica sobre a interacção fármaco-receptor.

Quando a finalidade é determinar especificamente a presença e/ou a localização de um receptor de EAA2, por exemplo no tecido cerebral, pode ser utilizado um anticorpo etiquetado para um receptor de EAA2 humano. Para produzir os referidos anticorpos, pode ser utilizado como imunogénio ou o receptor intacto, solúvel ou um fragmento imunogénico seu derivado, produzido numa célula anfitriã microbiana ou de mamífero tal como foi acima descrito ou através de técnicas de síntese de peptídeos padrão. As regiões do receptor de EAA2a particularmente adequadas para utilizar como fragmentos imunogénicos incluem as correspondentes em sequência a uma região extracelular do receptor, ou uma parte da região extracelular, tais como os peptídeos compreendidos nos resíduos 1-527, incluindo particularmente os resíduos 107-121 ou 179-192 ou 464-510, e peptídeos correspondentes as regiões entre os domínios transmembranais Tm-2 e TM-3, tais como um peptídeo que consiste nos resíduos 464-510. Os peptídeos constituídos pelo domínio terminal C (resíduos 807-962) ou um seu fragmento tal como um peptídeo constituído pelos resíduos 927-942, também podem ser utilizados para aumentar a produção de anticorpos. Substancialmente, as mesmas regiões dos receptores EAA2b e EAA2c humanos também podem ser utilizadas para a produção de anticorpos contra estes mesmos receptores. A produção de anticorpos para o receptor de EAA2 ou para os fragmentos imunogénicos desejados pode ser conseguida através da produção de anticorpos / 19 19

policlonais utilizando protocolos de imunização convencionalmente desenvolvidos e qualquer um de entre vários anfitriões mamíferos, tais como ovelhas, cabras e coelhos. Altemativamente, para a produção de anticorpos monoclonais podem ser retirados imunócitos tais como os esplenócitos do animal imunizado e depois podem ser fundidos a algumas células de mieloma, utilizando tecnologia de hibridoma. Os produtos da fusão são então avaliados através de cultura num substrato de selecção, e as células que produzem anticorpo são recuperadas para um crescimento contínuo e para a recuperação dos anticorpos. Os anticorpos recuperados podem então ser acoplados covalentemente a uma etiqueta detectável, tal como uma etiqueta radioactiva, uma etiqueta de enzima, uma etiqueta luminescente ou semelhantes, utilizando a tecnologia de ligante -“Linker”-estabelecida para este fim.

Na sua forma etiquetada detectável, por exemplo na sua forma radiactivamente etiquetada, o DNA ou o RNA que codificam para a sub-unidade receptora de EAA2 humano, e para as suas regiões seleccionadas, também podem ser utilizados, de acordo com outro aspecto da presente patente, como sondas de hibridação para, por exemplo, identificar os genes relacionados pela sequência residentes no genoma humano ou de outro mamífero (ou em bibliotecas de cDNA) ou para localizar o DNA que codifica os EAA2 numa amostra, tal como em tecido cerebral. Isto pode ser feito utilizando ou a região de codificação intacta ou um seu fragmento que apresente nucleótidos radiactivamente etiquetados, por exemplo, 32P, neles incorporados. Para identificar a região do DNA que codifica os EAA2 num espécime, é desejável que se utilize o comprimento completo do cDNA de codificação, ou um fragmento que lhe seja único. Com referência à Figura 1 e à numeração correspondente ao nucleótido que nela aparece, os referidos fragmentos de nucleótido incluem os correspondente em sequência às seguintes regiões: 176-1580, 548-592, 1295-1376, 2844-2927, 3007-3120, 1856-1880, 1908-1929, 1998-2021 e 2298-2328. Estas sequências e o próprio gene intacto, também podem, claro, ser utilizadas para clonar os genes relativos aos EAA2 através de técnicas de hibridação padrão.

Exemplo 1 - Isolamento do DNA que codifica o receptor EAA2a humano /

Como um primeiro passo no isolamento do DNA que codifica um receptor de EAA humano, as sequências de nucleótido publicadas de receptor GluRl de rato e as proteínas ligantes a cainato de galinha e de rã foram comparadas para identificar as regiões espaçadas de homologia capazes de servir como locais para as ligações base e amplificação baseada em PCR. Em seguida foram sintetizadas bases de oligonucleótido putativamente capazes de se hibridizar com regiões relacionadas pela sequência no cDNA humano, e apresentando flancos não hibridizáveis contendo locais de restrição HindIII para subsequentes experiências de clonagem, com base na sequência publicada do gene GluRl de rato utilizando técnicas convencionais de síntese de genes, para gerar bases com seguinte sequência: 5’ GGGGTTTAAGCTTGAGCGTCGTCCTCTTCCTGGT 3’ 5’ GGGGTTTAAGCTTGTGAAGAACCACCAGACGCCG 3’

Utilizando como modelo o CDNA de hipocampo humano (obtido na forma de uma biblioteca de gtlO lambda com base em EcoRI a partir dos Laboratórios de Clontech, (Paio Alto, Califórnia, E.U.A.)) as bases foram então utilizadas numa tentativa para amplificar sequências homólogas no cDNA humano, através da aplicação da técnica de reacção em cadeia da polimerase. As misturas reaccionais continham^ em lOOul, lOOng de cDNA de hipocampo humano, 125pmol de cada base e 2U de Taq polimerase (em 10 mM de Tris-HCl, pH 9,0, 50mM KCI, l,5mM MgCl2, e com 0,2 mM de cada uma das espécies de deoxiribonucleótido). Em seguida foram executados trinta ciclos de 94C/lmin; 58C/lmin; 72C/2min, após o que se fez um ciclo final de 72C/30min.

Deste modo foi produzido um produto de amplificação que apresentava um comprimento de nucleótidos esperado (239bp). O produto da amplificação foi então libertado do gel e subclonado para sequenciação na zona HindIII do vector fagemídeo pTZ19 (Pharmacia). A sequência de nucleótidos do produto de amplificação (sem bases) é representada, retrospectivamente, a partir do nucleótido #1867 até ao nucleótido #2037 inclusivamente (Figura 1). Uma comparação da sequência ampliada a partir do modelo de cDNA humano com a região correspondente ao gene GluR do rato na qual as

bases de oligonucleótido foram baseadas apenas revelou uma identidade de aproximadamente 60%, indicando que um fragmento de um gene humano não relacionado tinha sido identificado.

De modo a isolar o cDNA que codifica o receptor de EAA2a humano completo, uma biblioteca lambda com base gtlO de cDNA de hipocampo humano foi sondada utilizando uma versão produzida por PCR, etiquetada (alfa-j2P-dCTP) do produto de amplificação 239bp. De 106 clones avaliados, a sondagem identificou 60 clones putativos nas seguintes condições de hibridação muito severas: 6xSSC, 50% formamida, 5% de solução de Denhardt, 0,5% SDS, lOOug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. As hibridações foram realizadas durante a noite a 37C, e os filtros foram lavados com 2xSSC contendo 0,5% de SDS a 25C durante 5 minutos, seguido por uma lavagem de 15 minutos a 50C com 2xSSC contendo 0,5% de SDS. A lavagem final foi feita com lxSSC contendo 0,5% de SDS a 50C durante 15 minutos. Os filtros foram expostos a filme de Raio-X (Kodak) durante a noite.

Foram executados estudos de hibridação em duplicado e, para análise adicional, apenas foram seleccionados os clones que hibridizaram bem em ambos os duplicados. Após uma segunda avaliação, foram seleccionados 50 dos 60 clones putativos originais. Todos os 50 clones putativos foram purificados em placa, foram feitas preparações de DNA em grande escala e em seguida os suplementos de DNA delas libertados foram subclonados no local EcoRI dos vectores pTZ18, para uma análise da sequência. A sequenciação revelou um clone apresentando, interiormente, uma região com uma sequência de nucleótidos semelhante à sequência do subclone 239bp original. Foi então determinada a sequência inteira do clone isolado (442bp). Retrospectivamente, este subclone 442bp é representado a partir do nucleótido 1776 até ao nucleótido 2217 inclusive (Figura 1).

Dado ser provável por analogia com os outros genes receptores que o 442bp não apresentaria o comprimento completo, foi produzida uma biblioteca de cDNA de hipocampo humano alternativa construída num sistema de fagos lambda conhecido

comercialmente como lambda ΖΑΡ II (Sistemas de Clonagem Stratagene, La Jolla, Califórnia, E.U.A.) e foi avaliado utilizando uma versão radiactivamente etiquetada, produzida por PCR, do subclone 442bp. A avaliação dos 106 clones desta biblioteca através de hibridação sob as severas condições acima descritas levou inicialmente à selecção de 47 clones possíveis. Para a sequenciação, foram cortados fagemídeos que continham os suplementos, para produzir variantes que carregassem o suplemento do vector fagemídeo comercialmente conhecido como Bluescript-SK. A análise da Sequenciação identificou dois clones de fagemídeo que partilhavam uma sobreposição de sequência. Um clone que apresentava um suplemento l,8kb EcoRI/EcoRI, e que aparentemente representava uma região 5’ do quadro de leitura aberto foi designada por pBS/RKLS311. O clone de sobreposição que apresentava um suplemento de 2,4kb EcoRI/EcoRI e aparentemente representando a restante região 3’ do quadro de leitura aberto, foi designado por pBS/RKLS151. Para construir o quadro de leitura aberto completo, foi utilizada a estratégia apresentada na Figura 3 para produzir o fagemídeo pHS/HumEAA2a o qual transporta o DNA que codifica EAA2a na forma de um suplemento 3,7kn EcoRI/EcoRI (recuperável intacto na forma de um suplemento 3,7kb NotIHindIII) num fundo de fagemídeo Bluescript-SK 3,0kb. A sequência completa do suplemento de EcoRI é apresentada na Figura 1. O fagemídeo 6,7kb pBS/humEAA2a foi depositado, sob as condições definidas no Tratado de Budapeste, na Colecção Americana de Tipos de Culturas em Rockville, Maryland, EUA, no dia 21 de agosto de 1991, e foi-lhè atribuído como número de acesso o ATCC 75065

Exemplo 2 - Estratégia alternativa para obter o DNA que codifica o receptor EAA2a

Tendo aqui apresentado a sequência de nucleótido do DNA que codifica o EAA2a, será apreciado que o seu isolamento feito através dos procedimentos há pouco descritos seja desnecessário, e possa ser substituído por aplicação de técnicas automatizadas de síntese e amplificação de genes. Utilizando como modelo uma biblioteca de cDNA adequada, por exemplo uma biblioteca de cDNA de hipocampo humano cuidadosamente preparada, a técnica de reacção em cadeia de polimerase pode ser aplicada para

amplificar o produto de cDNA desejado. Embora os protocolos de PCR actuais tomem improvável a amplificação directa do gene 3,7kb inteiro, a amplificação por regiões de modo a produzir fragmentos de gene passíveis de serem ligados, é uma possível aproximação na construção do gene.

Com referência, especificamente, ao DNA que codifica o EAA2a, a construção de genes facilitada por PCR pode ocorrer, por exemplo, tal como é ilustrado na Figura 2. Mais especificamente, as regiões do modelo de cDNA clonado são amplificadas na forma de fragmentos que contêm na ordem de várias centenas de nucleótidos utilizando bases que apresentem flancos 5 ’ não-hibridizantes os quais constituem locais de restrição úteis nos subsequentes passos de construção do gene. No exemplo ilustrado na Figura 2, o gene é amplificado na forma de 4 fragmentos individuais que podem ser interligados, devido à cuidadosa selecção de locais de restrição, num passo de modo a formar o DNA que codifica o receptor de EAA2a completo. Também será apreciado que possam ser aplicadas técnicas automatizadas de síntese de genes para fornecer fragmentos de gene os quais possam, por PCR, ser amplificados e subsequentemente ligados. Utilizando protocolos actuais tais como, por exemplo, os descritos por Bamett et al., Nucl. Acids Res., 18(10):3094 (1990), podem ser sintetizados fragmentos com até aproximadamente 300 bases de comprimento e podem então ser novamente amplificados utilizando bases com locais de restrição de modo a facilitar a montagem das novas regiões de gene sintetizadas.

Exemplo 3 - Construção de linhas de célula que produzem o receptor de EAA2a humano

Para expressão transitória em células de mamífero, o cDNA que codifica o receptor de EAA2a humano foi incorporado no vector de expressão mamífero pcDNAI que está disponível comercialmente a partir da Invitrogen Corporation (São Diego, Califórnia, E.U.A.; número de catálogo V490-20). Este é um vector de plasmídeo 4,2kb multifunctional projectado para a expressão do cDNA em sistemas eucarióticos, e para a

análise do cDNA em sistemas procarióticos. Incorporados no vector estão o promotor e o ajudante de CMV, o segmento corte e o sinal de poliadenilação, um vírus Polioma e SV40 origem da replicação, e uma origem de Ml 3 para resgatar o DNA de estirpe única para sequenciação e mutagénese, promotores de RNA Sp6 e T7 para a imposição de sentido e sentido contrário e cópias de RNA de sentido contrário e uma cópia de origem de plasmídeo semelhante a Col El. Um ligante múltiplo deve ficar apropriadamente localizado a jusante do promotor de CMV (e na posição 3’ do promotor de T7).

Para a incorporação do cDNA que codifica um receptor de EAA2a num vector de expressão, o fagemídeo fonte de cDNA, pBS/humEAA2a, foi primeiramente modificado de modo a fornecer um local Notl na posição 3’ do suplemento de cDNA. Isto foi alcançado restringindo o fagemídeo, com HindIII e EcoRV, e inserindo depois uma sequência adaptável HindIII/Notl no local do HindIII após o que se realizou uma ligação terminal em bruto de modo a recircularizar o fagemídeo, de modo a obter o pBS/humEAA2a-NotI. Esta modificação permitiu que o cDNA na sua completa extensão fosse libertado como um fragmento NotI/Notl 3,7kb, o qual foi então incorporado no local Notl no ligante múltiplo pcDNAI. Foi feita a sequenciação através da junção de Notl de modo a confirmar a adequada orientação do suplemento no pcDNAI. O plasmídeo resultante, designado por pcDNAI/humEAA2a, foi então introduzido para a expressão temporária numa célula anfitriã de mamífero seleccionada, neste caso uma das células semelhantes a fibroblastos derivadas de macaco da linhagem COS-1 (disponível a partir da Colecção de Cultura de Tipo Americano, Rockville, Maryland e designadas como ATCC CRL 1650).

Para expressão temporária do DNA que codifica os EAA2, as células de COS-1 foram transfectadas com aproximadamente 8ug DNA (como pcDNAl/humEAA2a) por 106 células de COS, através de transfecção de DNA mediada por DEAE e foram tratadas com cloroquina de acordo com os procedimentos descritos por Maniatis et al, acima referidos. Resumidamente, as células de COS-1 foram colocadas, com uma densidade de 5 x 106 células/prato e então cultivadas durante 24 horas num substrato de DMEM-F12 suplementado com FBS. O substrato foi depois retirado e as células foram lavadas / / em PBS e depois com o substrato. Em seguida foram aplicados nas células lt) ml de uma solução de transfecção que continha dextrano DEAE (0.4mg/ml), lOOuM, cloroquina, 10% NuSerum e DNA (0.4mg/ml) em substrato de DMEM/F12. Após serem incubadas durante 3 horas a 37°C, as células foram lavadas em substrato de PHS tal como foi acima descrito e foi depois provocado um choque durante 1 minuto com DMSO a 10% num substrato de DMEM/F12. As células foram deixadas crescer durante 2 a 3 dias em substrato suplementado com FBS a 10%, e no final da incubação os pratos foram colocados em gelo, lavados com PBS gelado e depois foram removidas por raspagem. As células foram então recolhidas através de centrifugação a 1000 rpm durante 10 minutos e depois o agregado celular foi congeládo em nitrogénio líquido para subsequente utilização nos ensaios de ligação a ligandos. A análise de manchas de “Northern” de uma alíquota descongelada de células congeladas confirmou a expressão de c-DNA que codifica o receptor em células armazenadas.

As linhas de células transfectadas foram também, de um modo semelhante, preparadas utilizando dois tipos de células diferentes como anfitriãs: CHO Kl e CHO Pro5. Para construir estas linhas de células, o cDNA que codifica os EAA2a humanos foi incorporado no local Notl de um derivado 7.1 kb do vector de plasmídeo pcDNAi, o qual contém o gene neomicina sob o controle do promotor LTR do vírus de Sarcoma de Rous e é designado por pcDNAl/NEO (também disponibilizado pela Invitrogen Corporation, XV492-20 no catálogo). De um modo semelhante e utilizando iguaímente um local Notl adequado para a inserção, o cDNA que codifica o receptor foi inserido no vector pRC/CMV mamífero de expressão (Invitrogen) o qual permite a expressão estável. A inserção neste local colocou o cDNA sob o controle de expressão do promotor do citomegalovírus e a montante do local de poliadenilação e do terminador do gene da hormona de crescimento bovino e num conjunto de vectores que inclui o gene de resistência à neomicina (dirigido pelo promotor 5V40 inicial) como marcador seleccionável.

Para introduzir plasmídeos construídos tal como foi descrito acima, as células de CHO anfitriãs foram primeiro “semeadas” com uma densidade de 5x105 num substrato de MEM com um suplemento de 10% de FBS. Após terem crescido durante 24 horas, foi 26

acrescentado substrato novo às placas e três horas depois as células foram transfectadas utilizando o procedimento de co-precipitação de DNA-fosfato de cálcio (Maniatis et al, acima). Resumidamente, foram misturadas e incubadas 3ug de DNA com solução tampão de cálcio durante 10 minutos à temperatura ambiente. Foi adicionado um volume igual de solução tampão de fosfato e a suspensão foi incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida a suspensão incubada foi aplicada às células durante 4 horas, foi retirada, e provocou-se um choque nas células com um substrato que continha 15% de glicerol. Três minutos mais tarde, as células foram lavadas com o substrato e incubadas durante 24 horas em condições de crescimento. As células resistentes à neomicina foram seleccionadas num substrato alfa-MEM com suplemento de FBS a 10% que continha G418 (lmg/ml). Após aproximadamente 2 a 3 semanas foram isoladas colónias individuais de células resistentes a G418, foram seleccionadas por clonagem e foram então cultivadas para serem utilizadas nos ensaios.

Exemplo 4 - Ensaios de ligação ao ligando

As células transfectadas e congeladas foram então de novo suspensas em água destilada em banho de gelo utilizando um homogenizador manual e foram centrifugadas durante .20 minutos a 50.000g. O sobrenadante foi eliminado e os agregados de membrana foram armazenados congelados a -70°C.

Os agregados de membrana de células COS foram suspensos em Tris-HCl 50mM em banho de gelo (pH 7,55, 5°C) e foram colocados dentro um aparelho de diálise Spectrapor 7 (tratados com EDTA, e isento de enxofre). A suspensão foi colocada em 4 litros de Tris-HCl 50mM em banho de gelo (pH 7,55, 5°C) e dializada durante 16 a 24 horas a 5°C de modo a remover o glutamato endógeno que competiria para se ligar. A suspensão de tecido foi removida do aparelho em conjunto com um pequeno volume de solução tampão que foi utilizada para lavar o aparelho. Esta preparação de membrana resultante foi utilizada como fonte de tecido para as experiências de ligação abaixo descritas. O teor em proteínas foi determinado utilizando o reagente de Pierce com BSA como padrão. / 27 \

Foram então executados os ensaios de ligação, utilizando uma quantidade de membrana resultante de COS equivalente a de 25 a lOOug tal como é indicado pelo método de determinação de proteínas e pelo ligando, radiactivamente etiquetado, seleccionado. Especificando, os ensaios de ligação ao glutamato necessitaram de uma formação prévia de uma mistura de incubação constituída por de 25 a lOOug de proteína de tecido e ácido [3,4-3H]L-glutâmico (47,3 Ci/mmole, lOnM final) em Tris-HCl 50mM (pH 7,55, 5°C) num volume final de 1 ml. A ligação não-específica foi feita na presença de L-glutamato lmM. As amostras foram incubadas em gelo durante 60 minutos em pequenos recipientes de plástico. O ligandos livres e ligados foram separados através de centrifugação durante 10 minutos a 50.000g (4°C). Os aglomerados de tecido foram superficialmente lavados com 2 x 6ml de tampão de incubação em banho de gelo. Os aglomerados foram solubilizados e contados em 5ml de uma mistura de cintilação de proteína activada de Beckman.

Para os ensaios de ligação ao cainato, as misturas de incubação eram constituídas por 25 a lOOug de proteína de tecido e ácido [vinilideno-3H]-caínico (58Ci/mmole, 5nM no final) no tampão de incubação frio com um volume final de lml. A ligação não-específica foi realizada na presença de L-glutamato lmM. As amostras foram incubadas tal como foi feito para os ensaios de ligação ao glutamato, e os ligandos livres e ligados foram separados por filtração rápida utilizando uma ceifeira de células Brandel e filtros GF/B previamente humidificados com polietilenoimina a 0,3% em banho de gelo. Os filtros foram lavados duas vezes em 6 ml da solução tampão de incubação fria, e depois colocados em frascos de cintilação com 5ml da mistura de cintilação pronta e fixa de Beckman para fazer a contagem.

Também foram executados ensaios de ligação a AMPA de uma maneira substancialmente igual à maneira acima descrita para a ligação ao cainato, mas utilizando como ligando o ácido D,L-alfa[5-metil-3H]amino-3-hidróxi-5-metilisoxazolo-4-propiónico (3H-AMPA, 27,6Ci/mmole, 5nM final) com KSCN 0,1M e CaCl2 2,5mM num volume final de lml. / 28

Os ensaios executados desta maneira revelaram uma especificidade de ligação ao [3H]-cainato a 5nM e de ligação ao [3H]-glutamato a lOnM, do ligando etiquetado. A análise de Scatchard indicou que o receptor de EAA2a humano recombinantemente expressado continha uma única classe de locais de ligação ao cainato etiquetada com [3H] com uma constante de dissociação (Kd) de 2,9nM (Figura 5), e uma ligação máxima (Bmax) de 691 fmol/mg de proteína. As células transfectadas simuladas não exibiram nenhuma especificidade de ligação a qualquer dos ligandos testados.

Também foram executados ensaios adicionais cujos resultados são apresentados na Figura 6. Os deslocamentos de ligação do cainato etiquetado em [3H] com os referidos ligandos selectivos apresentaram uma ordem gradativa de potência de: cainato > domoato > quisquilato > glutamato > DNQX > dihidrocainato > CNQX > AMPA. Não foi observado nenhum deslocamento de cainato com os NMDA ou 1S,3R-ACPD até concentrações delOOuM.

Os dados obtidos nos ensaios de ligação aos ligandos demonstraram claramente que o receptor de EAA2a está ligado ao cainato com uma afinidade alta. Esta actividade, juntamente com o facto de que não existe nenhuma ou apenas uma pequena ligação demonstrável do AMPA ou do NMDA permite claramente designar o receptor de EAA2a como sendo um receptor de EAA do tipo cainato. Adicionalmente, este perfil de ligação, especialmente com a ligação ao cainato pertencendo à categoria de afinidade alta (ou seja da ordem nanomolar), indica que o receptor está a funcionar de uma maneira autêntica, e pode então servir para com confiança prever a “assinatura” de ligação ao ligando do seu semelhante não recombinante do cérebro humano intacto. Estas características tomam o receptor recombinante especialmente adequado para seleccionar e caracterizar compostos ligandos os quais se liguem ao receptor, e/ou para seleccionar e caracterizar compostos que possam actuar deslocando outros ligandos do receptor. Deste modo, o isolamento do gene receptor de EAA2a numa forma pura, capaz de ser expressado na forma de uma única, espécie de receptor homogéneo, liberta o ensaio de ligação ligando da falta de precisão introduzida quando são utilizadas

composições complexas, heterogéneas de receptor derivadas de cérebros humanos para tentar realizar as referidas caracterizações.

Exemplo 5 - Variantes do receptor de EAA2a humano que existem na natureza Utilizando a mesma sonda 442bp que conduziu à correcta identificação do receptor de EA.A2a humano, foram também identificadas duas suas variantes relacionadas por sequência após o que foram isoladas, de uma maneira substancialmente idêntica. Tal como é apresentado na Figura 4, uma variante designada por EAA2b é quase idêntica em todos os aspectos estruturais ao receptor de EAA2a humano, e apenas difere pela inserção precisa no EAA2b do tripleto CAG que codifica a glutamina entre as posições de nucleótido 1648 e 1649 do EAA2a. Do mesmo modo do DNA que codifica o EAA2a, o DNA que codifica o EAA2b foi isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de DNA de hipocampo humano. Para construir o cDNA, no seu completo comprimento, que contém a armação de leitura aberta completa, foram utilizados os clones de sobreposição pBSRKLS311 (representando a região 5’) e pBS/RKLS511 (representando a região 3’) da mesma maneira já descrita para o humEAA2a. Para os ensaios de ligação, o cDNA isolado foi primeiro modificado de modo a conter o local Notl na posição 3’ e foi depois introduzido em células da linhagem COS-1 para a sua expressão temporária, após a inserção no vector pcDNAÍ (expressão temporária) e em células CHO Kl ou CHO Pro5 e após a inserção nos vectores pcDNAi/NEO ou pRC/CMV tudo isto do mesmo modo já descrito acima para o EAA2a humano. Embora preliminares, os ensaios de ligação ao ligando, indicam o mesmo padrão de afinidade de ligação ao ligando, e demonstram assim que a variante EAA2b também é um receptor de EAA humano do tipo que se liga ao cainato.

Um plasmídeo, designado por pBS/humEAA2b, o qual transporta um implante de cDNA NotIHindIII a 3,7kb que codifica o receptor de EAA2b humano num fundo de Bluescript-SK 3,0kb, foi depositado, de acordo com os termos do Tratado de Budapeste, na Colecção Americana de Tipos de Culturas em Rockville, Maryland EUA, no dia 21 de agosto de 1991, com o número de acesso ATCC 75066. 30

O isolamento de duas variantes de EAA2a adicionais, designadas por EAA2c e EAA2d, demonstrou que a expressão de genes que codificam receptores de EAA humanos do tipo cainato não está limitada ao tecido de hipocampo. Mais especificamente, embora tanto a variante EAA2a humana e como a EAA2b humana tenham sido isoladas após ter investigado bibliotecas de cDNA de hipocampo, a variante EAA2c foi isolada utilizando a mesma sonda 442bp a partir de uma biblioteca de cDNA de cerebelo humano (disponível a partir de Stratagene Cloning Systems). Por outro lado, a variante EAA2d foi similarmente isolada mas a partir de uma biblioteca de cDNA de cérebro de feto humano. Embora a sequenciação de uma parte menor da posição 5' das regiões de codificação dos EAA2c e EAA2d ainda não esteja completa, é claro, tal como é apresentado na Figura 4, que tanto o EAA2c como o EAA2d diferem do EAA2a numa curta região que representa o peptídeo de sinal e na terminação N extracelular da proteína madura.

Lisboa, _ 5 JUL 2000

Dra. Maria Silvina Fbrreira

Agente Oficie! do Propriedade Industrial R. Castilho, 201-3.° E - 1070-051 LISBOA Telefs. 213851 339-213854613 /

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um polinucleótido isolado incluindo uma sequência de ácidos nucleícos que codifica a sequência de aminoácidos da figura 1 ou um seu fragmento que se ligue ao cainato ou uma sequência de aminoácidos a qual seja pelo menos 95% homóloga para com a sequência de aminoácidos de Figura 1 ou com um fragmento da referida que se ligue cainato.
2. 2. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 1 o qual codifica a sequência de aminoácidos da Figura 1 na qual um glutamina é inserida entre as posições 473 e 474, tal como é apresentado na Figura 4.
3. 3. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 1 o qual codifica a sequência de aminoácidos de Figura 1 na qual os primeiros 21 aminoácidos da proteína madura são substituídos por DEAQESLGPGGRSCS, tal como é apresentado na Figura 4.
4. 4. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 1 o qual codifica a sequência de aminoácidos da Figura 1 na qual os primeiros 29 aminoácidos da proteína madura são substituídos por SVWPCVG e na qual os aminoácidos 55 a 63 da proteína madura são substituídos por TA, tal como é apresentado na Figura 4.
5. 5. Um polinucleótido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, constituído por DNA.
6. 6. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 5, compreendendo uma sequência de DNA que codifica uma variante humana, que existe na natureza, da sequência de aminoácidos da Figura 1.
7. 7. Uma construção de DNA recombinante apresentando incorporado um polinucleótido tal como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.
8. 8. Uma construção de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 7, em que o referido polinucleótido codifica a sequência de aminoácidos tal como ela é definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.
9. 9. Uma construção de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 8, em que a referida construção é o plasmídeo pBS/humEAA2a (ATCC 75065).
10. 10. Uma construção de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 8, em que a referida construção é o plasmídeo pBS/humEAA2b (ATCC 75066).
11. 11. Uma célula que foi criada através de engenharia genética para compreender expressamente um polinucleótido heterólogo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 ou uma construção de DNA recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10.
12. 12. Uma célula de acordo com a reivindicação 11, em que a referida célula é uma célula de mamífero.
13. 13. Uma composição de membrana derivada de uma célula tal como é definido na reivindicação 11 ou na reivindicação 12.
14. 14. Uma proteína codificada pelo polinucleótido tal como é definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, na sua forma isolada.
15. 15. Um fragmento, que se liga ao cainato, de uma proteína de acordo com a reivindicação 14.
16. 16. Um polinucleótido etiquetado capaz de se hibridizar, sob condições severas, com o DNA que codifica uma proteína de acordo com a reivindicação 14 ou com um seu fragmento de acordo com a reivindicação 15. / /.

    J Jt
17. 17. Um método de analisar um composto quanto à sua afinidade para se ligar a uma proteína de acordo com a reivindicação 14 ou com um seu fragmento de acordo com a reivindicação 15, que inclui os passos de incubação de um análogo radiactivamente etiquetado do referido composto com uma célula tal como é definido na reivindicação 11 ou na reivindicação 12 ou com uma composição de membrana sua derivada, lavagem do análogo radiactivamente etiquetado livre da mistura de incubação e fmalmente a determinação da presença de análogo radiactivamente etiquetado ligado à membrana.
18. 18. Um método para determinar a afinidade para se ligar de um composto a uma proteína de acordo com a reivindicação 14 ou a um seu fragmento de acordo com a reivindicação 15, o qual inclui os passos de incubar uma célula tal como é definido na reivindicação 11 ou na reivindicação 12 ou uma composição de membrana sua derivada com um ligando etiquetado com uma proteína de acordo com a reivindicação 14 ou com um seu fragmento de acordo com a reivindicação 15 para formar um complexo de ligando/proteína, remoção do ligando livre, incubação do complexo ligando/proteína com o composto referido, e determinação da quantidade de ligando radiactivamente etiquetado deslocado de ou que permaneceu no complexo de ligando/proteína. Lisboa, „ 5 JUL. 2000 /O Λ- __Ί.— w-aJ Dra. Maria Silvina Fferreira Agente Oficiai de Propriedade Industrial R, C3Stilho, 201-3.° E- 1070-051 LISBOA Telets. 213 851339 - 213 854 613