PT2301576E

PT2301576E - Utilização terapêutica de anticorpos anti-cs1

Info

Publication number: PT2301576E
Application number: PT101807485T
Authority: PT
Inventors: J Yun Tso; Marna Williams; Gao Liu; Nicolas F Landolfi
Original assignee: Abbott Biotherapeutics Corp
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2004-11-08
Publication date: 2012-12-20
Also published as: ES2393539T3; JP4758984B2; CY1115003T1; HK1099699A1; IL243687A0; DK2301576T3; HRP20120975T1; HK1155670A1; SI2301576T1; JP2007530675A

Description

ΕΡ 2 301 576/ΡΤ DESCRIÇÃO "Utilização terapêutica de anticorpos anti-CSl" A divulgação refere-se ao campo dos antagonistas e anticorpos no tratamento de doenças, incluindo doenças relacionadas com auto-imunidade e cancro. A divulgação refere-se ainda a métodos para detecção, identificação e modulação destas doenças.

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO A expressão aumentada de imunoglobulina é uma caracteristica de muitas doenças. Um nível elevado de secreção de imunoglobulina causa uma variedade de desordens, incluindo síndrome de hiperviscosidade, uma desordem debilitante que resulta em fadiga, cefaleias, falta de ar, confusão mental, dor no peito, danos e insuficiência nos rins, problemas de visão e fenómeno de Raynaud (fraca circulação sanguínea, particularmente, nos dedos das mãos e dos pés, nariz e orelhas). Doença por aglutinina fria, crioglobulinemia mista, hipergamaglobulinemia, síndrome de Sjogren, líquen mixedematoso e doença de Gaucher, são exemplos de doenças associadas à expressão aumentada de imunoglobulinas. A expressão aumentada de imunoglobulina direccionada para auto-proteínas é um marco das doenças auto-imunes. A doença auto-imune é uma insuficiência do sistema imunitário para reconhecer auto-antigénios como próprios. Nas doenças auto-imunes, o sistema imunitário erroneamente ataca-se a si próprio, atingindo células, tecidos e órgãos, eventualmente resultando na destruição de sistemas fisiológicos. A auto-imunidade e as doenças auto-imunes são de origem multifactorial, estando a predisposição genética, factores do hospedeiro (e.g. fraqueza de controlos imunorreguladores, defeitos em células T supressoras ou estimulação policlonal de células B resistentes a controlos), factores ambientais e mecanismos conduzidos por antigénios, implicados no desenvolvimento de auto-imunidade e produção de auto-anticorpos contra auto-antigénios. 2 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

As desordens gastrointestinais e o Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) são dois exemplos de doenças auto-imunes. A doença inflamatória do intestino (DII), um subgrupo de desordens gastrointestinais, é um grupo de desordens incuráveis que afectam aproximadamente 4 milhões de indivíduos em todo o mundo. A etiologia da doença inflamatória do intestino recorrente é presentemente desconhecida. As teorias incluem uma destruição com mediação auto-imune de células gastrointestinais, incluindo linfócitos. A agregação homotípica anormal em modelos de doença inflamatória do intestino hereditária foi anteriormente demonstrada, e mostrou-se que mutações em NOD2, um gene implicado em desordens auto-imunes, predispõem os pacientes para doença de Crohn. Ni, J. et al., "Immunological abnormality in C3R/HeJ mice with heritable inflammatory bowel disease", Cell Immunol. 169:7-15 (1996); Ogura, Y. et al., "A frameshift mutation in N0D2 associated with susceptibility to Crohn's Disease", Nature 411: 603-606 (2001).

As DII muito frequentemente afectam o intestino delgado e o cólon, mas podem envolver qualquer porção do tracto gastrointestinal. Há mais do que 1 milhão de pessoas diagnosticadas com DII só nos Estados Unidos, com mais de 10 000 novos casos diagnosticados anualmente. Devido ao drástico efeito sobre a qualidade de vida dos pacientes de DII, dezenas de milhares de horas perdidas são reivindicadas anualmente, correspondendo a até mil milhões de dólares em dias de trabalho perdidos por ano. A DII produz uma gama de sintomas gastrointestinais e extra-intestinais, incluindo diarreia, hemorragia rectal, dor abdominal, perda de peso, desordens cutâneas e oculares e atraso do crescimento e da maturação sexual nas crianças. Dois tipos de DII são a colite ulcerativa e a doença de Crohn, que partilham sintomas e manifestações fisiológicas similares, mas diferem na maneira em que afectam o tracto digestivo. A colite ulcerativa é caracterizada por inflamação ulcerativa da totalidade ou de parte da mucosa colónica, mais frequentemente incluindo o recto. Os seus sintomas incluem hemorragia rectal e urgência fecal, tenesmo e diarreia. A colite ulcerativa é acompanhada por graves complicações a curto e a longo prazo. As mais graves complicações a curto prazo são colite 3 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ fulminante, megacólon tóxico e perfuração. As complicações a longo prazo graves incluem osteoporose e cancro colorrectal. A doença de Crohn é uma inflamação transmural crónica gue pode afectar qualquer parte do tracto gastrointestinal, desde a boca ao ânus. A doença de Crohn é descontinua, com áreas não afectadas intercaladas entre uma ou mais áreas envolvidas. Mais tarde na doença, a mucosa desenvolve uma aparência de calçada de pedra, que resulta de ulcerações longitudinais profundas interlaçadas com mucosa normal interposta. A maioria dos pacientes de doença de Crohn apresentam sintomas de dor e sensibilidade abdominais, diarreia crónica ou nocturna, hemorragia rectal, perda de peso e febre. A doença de Crohn evolui ao longo do tempo desde uma doença principalmente inflamatória para um de dois padrões clínicos: estenosante (obstrutiva) ou penetrante (fistulizante). Na forma estenosante, a inflamação transmural produz proliferação fibromuscular na parede intestinal, seguida por estreitamento luminal. Os sintomas de obstrução tornam-se comuns à medida que a DC progride. Na forma penetrante, os tractos sinusais formam-se como túneis de inflamação através da parede intestinal e rompem a superfície serosa, fistulizando em tecidos adjacentes e mesmo através da pele. A colite ulcerativa e a doença de Crohn são geralmente diagnosticadas utilizando critérios clínicos, endoscópicos e histológicos. Contudo, até ao presente as técnicas tradicionais de diagnóstico estabeleceram que nenhum achado único é diagnóstico absoluto de uma doença ou da outra. Em adição, aproximadamente 20% dos pacientes apresentam um quadro clínico que cai entre a doença de Crohn e a colite ulcerativa. Os pacientes que encaixam neste perfil diz-se terem colite indeterminada.

Os sintomas de DII podem ter um grande impacto no bem-estar, qualidade de vida e capacidade de funcionamento dos pacientes. Os períodos inflamatórios são prolongados e frequentes e, dependendo da gravidade, incapacitantes. Porque a DII é crónica e tipicamente tem um início antes dos 30 anos de idade, os pacientes geralmente requerem tratamento ao longo de toda a vida. A elucidação de um papel para novas proteínas 4 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ e compostos em estados de doença para a identificação de potenciais alvos e marcadores de diagnóstico é valiosa para melhorar o presente tratamento de pacientes de doença inflamatória do intestino. O LES é caracterizado pela produção de auto-anticorpos contra uma variedade de moléculas ubíquas, o que pode ter consequências patogénicas incluindo danos em numerosos órgãos e tecidos, incluindo a pele, o rim, o cérebro e o coração. Os presentes tratamentos aprovados para LES envolvem imunossupressão não especifica e controlo dos sintomas através de esteróides, fármacos imunossupressores, imunomoduladores e fármacos antimaláricos. Contudo, estas abordagens de tratamento resultam em riscos de toxicidade renal e mortalidade precoce. Assim, é desejável desenvolver uma nova abordagem que interfira especificamente com a activação de linfócitos e a produção de auto-anticorpos.

Outras doenças auto-imunes em que a expressão aumentada de imunoglobulina e/ou células B desempenha um papel significativo incluem a trombocitopenia idiopática, a artrite reumatóide (AR), anemia hemolitica auto-imune e Miastenia grave. A evidência do papel das células B e/ou de imunoglobulina aumentada vem de estudos com pacientes tratados com esteróides, agentes imunossupressores e/ou anticorpos anti-CD20 (que têm como alvo células B). A melhoria dos sintomas nestas doenças correlaciona-se com uma diminuição nas células B e/ou na imunoglobulina sérica, sublinhando o papel crucial que as células B desempenham numa variedade de doenças auto-imunes.

Expressão aumentada de imunoglobulina pode também ser observada em doenças malignas. Tal como as desordens auto-imunes, a etiologia do cancro é similarmente de origem multifactorial. O cancro, que é a segunda principal causa de morte nos Estados Unidos, tem sido ligado a mutações no ADN que provocam crescimento não reprimido de células. A predisposição genética desempenha um papel importante no desenvolvimento de muitos cancros, combinada com factores ambientais, tais como o tabagismo e mutagénese química. 5 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ Ο cancro pode ocorrer em qualquer tecido ou órgão do corpo. Os neoplasmas de células plasmáticas, incluindo mieloma múltiplo, mieloma "solitário" do osso, plasmocitoma extramedular, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia (incluindo macroglobulinemia de Waldenstrom), doença das cadeias pesadas, amiloidose primária, gamopatia monoclonal de significado indeterminado (GMSI), estão associados a expressão aumentada de imunoglobulinas. A leucemia linfocitica crónica (LLC), um neoplasma de células não plasmáticas, está também associada a níveis elevados de expressão de imunoglobulinas.

Os mielomas são tumores de células plasmáticas derivados de um único clone, que tipicamente é originário em tecido linfóide secundário e depois migra para, e reside no tecido da medula óssea. Os mielomas normalmente afectam a medula óssea e estruturas ósseas adjacentes, com sintomas primários de dor óssea e fracturas ou lesões patológicas (lesões ósseas osteolíticas), sangramento anormal, anemia e susceptibilidade aumentada a infecções. Os estágios avançados da doença incluem insuficiência renal, deformações esqueléticas, compactação da medula espinal e hipercalcemia. O mieloma afecta células ósseas por indução da ressorção osteoclástica do osso, desse modo dizimando a estrutura óssea e aumentando a concentração de cálcio no plasma. A etiologia dos mielomas é presentemente desconhecida. Foi postulada a ligação a danos por irradiação, mutações em oncogenes, causas familiares e expressão anormal de IL6 .

Os mielomas múltiplos são tumores de células plasmáticas com múltiplas origens. Os mielomas múltiplos contam com aproximadamente 10% de todas as malignidades de células plasmáticas, e são o mais comum cancro de tumor ósseo nos adultos, com uma taxa de incidência anual de 3 a 4 casos por 100 000 pessoas. Nos Estados Unidos, os mielomas múltiplos são a segunda mais comum malignidade hematológica depois do Linfoma Não Hodgkiniano, com aproximadamente 50 000 casos só nos Estados Unidos, e aproximadamente 13 500 novos casos reportados por ano. As perspectivas de prognóstico para pacientes diagnosticados com mielomas múltiplos são impiedosas, sendo de apenas alguns meses a um ano para pacientes com formas avançadas da doença. 6 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

As regiões de tratamento tradicional para mieloma e mielomas múltiplos (doravante referidos como "mieloma") consistem em quimioterapia, terapia de radiação e cirurgia. Em adição, a transplantação de medula óssea é recomendada para pacientes que estão de resto de boa saúde. A taxa de cura para pacientes aproxima-se dos 30%, e é o único método conhecido que pode curar mielomas. Contudo, para indivíduos que são mais idosos ou não conseguem tolerar os procedimentos de transplantação de medula óssea, a quimioterapia é mais apropriada.

Os presentes procedimentos de diagnóstico incluem raios X, aspiração de medula óssea, testes ao sangue e urina (para detectar a presença da proteína Bence Jones), e o ensaio da velocidade de sedimentação de eritrócitos. Foram igualmente identificados potenciais marcadores da superfície celular em células plasmáticas mielomatosas, incluindo CD38, CD9, CD10, HLA-DR e CD20. Ruiz-Arugelles GJ e San Miguel JF, Cell Surface Markers in Multiple Myeloma, Mayo Clin. Proc. 69:684-90 (1994). Outros marcadores de linhagens de células não B incluem CD2, CD4, CD13, CD14, CD15, CD23, DC24, CD25, CD33, CD39, CDw40, CD41, CD45R, CD54, CD56 e CD71, assim como antigénios desagregados, Rl-3, PCA-1, PCA-2, PCI, 62B1, 8A, 8F6 e MM4) . Ruiz-Arugelles, supra; Leo R, et ai., Multiparameter analysis of normal and malignant human plasma cells, Ann. Hematol. 64:132-9 (1992). Em adição, o surgimento de anticorpos anormais, conhecidos como proteína M, constitui um indicador de mieloma múltiplo. A produção aumentada de proteína M foi ligada à síndrome de hiperviscosidade nos mielomas múltiplos, provocando efeitos secundários debilitantes, incluindo fadiga, cefaleias, falta de ar, confusão mental, dor no peito, danos e insuficiência nos rins, problemas de visão e fenómeno de Raynaud (fraca circulação sanguínea, particularmente dedos, dedos das mãos e dos pés, nariz e orelhas). A crioglobulinemia ocorre quando a proteína M no sangue forma partículas sob condições de frio. Estas partículas podem bloquear pequenos vasos sanguíneos e provocar dor e entorpecimento dos dedos das mãos e dos pés, e de outras extremidades durante o tempo frio. Foram também estudados indicadores de prognóstico, tais como deleções cromossómicas, níveis elevados de microglobulina beta-2, 7 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ níveis de creatinina no soro e isotipagem de IgA. Tricot G, et al., Poor prognosis in Multiple Myeloma, Blood 86:4250-2 (1995). A CS1 (SLAMF7, 19A; Número de Acesso no Genbank NM_021181.3, Ref. Boles e Mathew (2001) Immunogenetics 52:302-307; Bouchon et al., (2001) J. Immunol. 167:5517-5521; Murphy et al., (2002) Biochem. J. 361:431-436) é um membro do subconjunto CD2 da superfamília das imunoglobulinas. Moléculas da família CD2 estão envolvidas numa ampla de funções imunomoduladoras, tais como co-activação, proliferação da diferenciação, e adesão de linfócitos, assim como secreção de imunoglobulina, produção de citoquinas e citotoxicidade de células NK. Vários membros da família CD2, tais como CD2, CD58 e CD150, desempenham um papel ou foi proposto que desempenham um papel num número de doenças auto-imunes e inflamatórias, tais como psoríase, artrite reumatóide e esclerose múltipla. A CS1 (também conhecida como CRACC, 19A, APEX-1 e FOAP12) foi isolada e clonada por Boles, K. et al. (veja-se Immunogenetics 52: 302-307 (2001)). Foi reportado que a CS1 desempenha um papel na citotoxicidade mediada por células NK e na adesão dos linfócitos (Bouchon, A., et al., J. of Immuno. 5517-5521 (2001); Murphy, J. et al. , Biochem. J. 361: 431-436 (2002)) . A Publicação do PCT W001/46260 divulga um anticorpo monoclonal contra APEX-1 e a sua utilização para a detecção do domínio extracelular recombinante produzido de APEX-1. A publicação da patente U.S. 2003/0113332A1 divulga anticorpos monoclonais contra os péptidos de receptores da superfície celular de células assassinas naturais que se ligam a CS1 e conduzem à activação das células NK. Contudo, anticorpos capazes de inibir a produção de imunoglobulina por células B e/ou a proliferação e/ou o desenvolvimento de mielomas não foram desenvolvidos nem divulgados nas publicações acima referenciadas. Igualmente, a evidência de sobre-expressão de CS-1 na doença auto-imune ou no cancro não foi desenvolvida nem divulgada nas publicações acima referenciadas. A elucidação de um papel para novas proteínas e compostos em estados de doença para a identificação de potenciais alvos 8 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ e marcadores de diagnóstico é desejável para melhorar o presente tratamento de pacientes de doenças auto-imunes e de cancro, incluindo pacientes afectados com DII, LES, AR e mieloma. Deste modo, são aqui proporcionados alvos moleculares para o tratamento e diagnóstico destas doenças, particularmente CS1. Adicionalmente, são aqui proporcionados antagonistas que se ligam a, e neutralizam, CS1, incluindo anticorpos neutralizantes tais como anticorpos anti-CSl.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-CSl ou um fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para administração em combinação com Velcade para o tratamento de mieloma múltiplo, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl se ligam a uma proteína codificada por SEQ ID NO:l, inibem a secreção de imunoglobulinas e competem pela ligação à referida proteína com um anticorpo de controlo, em que o anticorpo de controlo compreende uma região VH compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma região VL compreendendo SEQ ID NO:6. A presente invenção também proporciona a utilização de (a) um anticorpo monoclonal anti-CSl ou um fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl e (b) Velcade, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de mieloma múltiplo, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou o fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl se ligam a uma proteína codificada por SEQ ID NO:l, inibem a secreção de imunoglobulinas e competem pela ligação à referida proteína com um anticorpo de controlo, em que o anticorpo de controlo compreende uma região VH compreendendo SEQ ID NO:5 e uma região VL compreendendo SEQ ID NO: 6. A presente divulgação proporciona um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio que se ligam a um epítopo de CS1 humana reconhecido por Luc90. O Luc90 e outros anticorpos que partilham o mesmo epítopo, incluindo Luc34, Luc69 e LucX, são capazes de inibir a secreção de imunoglobulinas e matar células que expressam CS1.

Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio utilizados na presente invenção ligam-se a um epítopo de CS1 9 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ humana reconhecido por Luc63. O Luc63 e outros anticorpos que partilham o mesmo epitopo, incluindo Luc4, Lucl2, Luc23, Luc29, Luc32 e Luc37, são capazes de inibir a secreção de imunoglobulinas e matar células que expressam CS1.

Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio utilizados na presente invenção desencadeiam efeitos citotóxicos em células que expressam CS1 ou aumentam a citotoxicidade mediada por células imunitárias, incluindo citotoxicidade mediada por ADCC de células que expressam CS1. A presente divulgação proporciona adicionalmente um método para a morte de células que expressam CS1 compreendendo o contacto das células com uma quantidade eficaz de anticorpo anti-CSl. As células que expressam CS1 incluem células cancerosas plasmáticas de, e.g. mieloma múltiplo e células cancerosas não plasmáticas de, e.g., leucemia linfocítica crónica. As células que expressam CS1 incluem ainda leucócitos tais como células B ou células T activadas, e leucócitos de pacientes que sofrem de LES e artrite reumatóide. A presente divulgação proporciona adicionalmente um método para tratamento de um indivíduo que sofre de cancros células plasmáticas, LES, artrite reumatóide ou doença inflamatória do intestino.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIGURAS A Figura IA mostra a inibição da produção in vivo de IgG humana no modelo de ratinho SCID-HuPBMC por anticorpos monoclonais anti-CSl. A Figura 1B mostra uma comparação de inibição da produção in vivo de IgG humana no modelo de ratinho SCID-HuPBMC por anticorpos monoclonais anti-CSl Luc90 e 63. A Figura 1C mostra um resumo da inibição da produção in vivo de IgG humana no modelo de ratinho SCID-HuPBMC por anticorpos monoclonais anti-CSl. A Figura 2 mostra volumes tumorais diminuídos em modelos de mieloma múltiplo em ratinho xenoenxertado tratados com 10 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ anticorpos anti-CSl Luc90 e Luc63 versus anticorpos de controlo de isotipo. A Figura 3 mostra o efeito de anticorpos anti-CSl Luc63 e Luc63 humanizados no crescimento de tumor OPM-2 in vivo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada em parte na nossa verificação de que não há expressão significativa de proteína CS1 detectada em plaquetas, glóbulos vermelhos do sangue, células endoteliais (HuVEC), células renais, células brônquicas das vias aéreas, células pequenas das vias aéreas, células da próstata, células hepáticas ou células mamárias. A expressão de CS1 é específica de linfóides, e é detectada em células de pacientes, incluindo células plasmáticas de pacientes de mieloma múltiplo e leucemia de células plasmáticas. A expressão é detectada apenas em células plasmáticas e não é detectável em níveis significativos em outros tipos de células de amostras de medula óssea. Deste modo, a presente invenção demonstrou a exequibilidade da utilização de anticorpos anti-CSl como agentes terapêuticos para o tratamento de cancro, incluindo, mas não se lhes limitando, neoplasmas de células plasmáticas, incluindo mieloma, mieloma múltiplo, mieloma "solitário" do osso, plasmocitoma extramedular, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia (incluindo macroglobulinemia de

Waldenstrom), doença das cadeias pesadas, amiloidose primária, gamopatia monoclonal de significado indeterminado (GMSI). Em adição, neoplasmas de células não plasmáticas associados a expressão aumentada de imunoglobulina, incluindo leucemia linfocítica crónica (LLC), irão também beneficiar da terapia anti-CSl.

Em adição, estudos anteriores não revelaram a expressão in vitro de proteína CS1 em células B de sangue periférico activadas por mitogénio de fitolaca americana (PWM), subconjuntos de linfócitos T e B de sangue periférico de memória/efectores versus naive, ou monócitos/macrófagos CD14+ de sangue periférico. Estudos anteriores também não revelaram o papel de CS1 na produção de imunoglobulinas. Em resultado, a correlação entre CS1 e doenças auto-imunes não foi anteriormente estabelecida. A presente invenção é também 11 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ baseada em parte na nossa verificação de que a expressão do ARN de CS1 e da proteína CS1 está fortemente supra-regulada em células B de sangue periférico activadas, o subconjunto de células responsáveis pela produção de auto-anticorpos e que se crê desempenharem um papel significativo no desenvolvimento de doenças auto-imunes. Adicionalmente, a presente divulgação revelou que a expressão do ARN de CS1 em linfócitos B de sangue periférico de pacientes de LES está aumentada em comparação com células B de adultos saudáveis com a mesma idade, assim como em pacientes afectados com DII. A presente invenção revela que a CS-1 é expressa em células plasmáticas infiltrantes no sinóvio da artrite reumatóide (AR). A presente divulgação revelou também que a CS1 está envolvida na produção de anticorpos e que os anticorpos contra CS1 diminuem a IgM e a IgG segregadas por células B de adultos saudáveis e pacientes com lúpus. Subsequentemente, os dados da presente divulgação sugerem que a CS1 desempenha um papel importante no estabelecimento de doenças auto-imunes, especialmente LES, DII e AR. Outras doenças associadas a um aumento na imunoglobulina, células B e/ou produtos de células B irão também beneficiar do tratamento anti-CSl, incluindo doença por aglutinina fria, doenças imunobolhosas (incluindo penfigóide bolhoso, pênfigo, dermatite herpetiforme, doença por IgA linear e epidermolise bolhosa adquirida), crioglobulinemia mista, hipergamaglobulinemia, síndrome de Sjogren, anemia auto-imune, asma, miastenia grave, esclerose múltipla, inflamação do miocárdio ou do pericárdio, dermatite atópica, psoríase, líquen mixedematoso e doença de Gaucher.

Além disso, não foram anteriormente conduzidos estudos para examinar a exequibilidade da utilização de anticorpos anti-CSl para o tratamento de doenças auto-imunes e cancros de células plasmáticas, incluindo mieloma e leucemia de células plasmáticas. Um anticorpo terapêutico ideal deverá ligar-se principalmente às células alvo. A ligação a outras células e tecidos pode provocar danos potenciais nessas células e tecidos e/ou esgotar o anticorpo terapêutico de modo que será necessário entregar uma quantidade em excesso do anticorpo ao paciente para se conseguir a eficácia de tratamento desejada. De forma mais importante, um anticorpo que liga a plaquetas pode ter efeitos secundários, tais como, activação das plaquetas (o que pode conduzir a coagulação excessiva), ou 12 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ esgotamento de plaquetas (o que pode conduzir a ausência de coagulação do sangue). Portanto, usualmente não é exequível a utilização de um anticorpo como agente terapêutico se o anticorpo se liga a múltiplas células e tecidos, especialmente quando se liga a plaquetas. A presente divulgação é baseada em parte na nossa constatação de que não há expressão significativa de proteína CS1 detectada em plaquetas, glóbulos vermelhos do sangue, HuVEC, células renais, células brônquicas das vias aéreas, células pequenas das vias aéreas, células da próstata, células hepáticas e células mamárias. Deste modo, a presente divulgação demonstrou a exequibilidade da utilização de anticorpos anti-CSl como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças auto-imunes, e cancros de células plasmáticas, incluindo mieloma e leucemia de células plasmáticas. A presente divulgação, portanto, é dirigida a antagonistas que se ligam a CS1. As concretizações exemplificativas destas concretizações incluem anticorpos e fragmentos de anticorpos neutralizantes anti-CSl. Os anticorpos neutralizam pelo menos uma actividade biológica de CS1, em que os referidos anticorpos se ligam a CS1 e são capazes de pelo menos uma das actividades seleccionadas do grupo que consiste em: (a) inibição da secreção e/ou da produção de imunoglobulinas por linfócitos; e (b) indução de lise de células que expressam CS1.

De acordo com os objectos acima delineados, a presente invenção proporciona novos métodos para o tratamento de várias desordens, e.g., desordens auto-imunes e várias condições cancerosas definidas, incluindo várias formas de mieloma. São também proporcionados métodos para a avaliação de diagnóstico e prognóstico destas desordens, assim como métodos para o rastreio de composições que modulam estas condições. A presente invenção também proporciona métodos de monitoração da eficácia terapêutica deste tratamento, incluindo a monitoração e o rastreio de marcadores que são expressos selectivamente nas referidas desordens.

Em particular, a identificação de marcadores expressos selectivamente em desordens auto-imunes, tais como LES, AR e DlI, e condições cancerosas, tais como mieloma e leucemia de células plasmáticas, permite a utilização dessa expressão em métodos de diagnóstico, de prognóstico ou terapêuticos. Como 13 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ tal, a invenção define várias composições, e.g., ácidos nucleicos, polipéptidos, anticorpos e agonistas/antagonistas de molécula pequena, que serão úteis para identificar selectivamente esses marcadores. Os marcadores podem ser úteis para a caracterização molecular de subconjuntos das doenças, subconjuntos estes que podem realmente requerer tratamentos muito diferentes. Além disso, os marcadores podem também ser importantes em doenças relacionadas com desordens auto-imunes, mieloma e leucemia de células plasmáticas, e.g., que afectam tecidos similares aos dessas condições, ou possuem mecanismos similares de indução/manutenção. Por exemplo, processos ou caracteristicas tumorais podem também ser o alvo. As utilizações em diagnóstico e prognóstico são tornadas disponíveis, e.g., para subdividir doenças relacionadas mas distintas, para diferenciar estágios de desordens auto-imunes, mieloma, ou leucemia de células plasmáticas ou para determinar a estratégia de tratamento destas condições. Os métodos de detecção podem ser baseados em ácido nucleico, e.g., PCR ou técnicas de hibridação, ou em proteínas, e.g., ELISA, imagiologia, IHC, etc. O diagnóstico pode ser qualitativo ou quantitativo, e pode detectar aumentos ou diminuições nos níveis de expressão.

Definições

As expressões "proteína CS1" ou "polinucleótido de CS1" ou "transcrito associado a CS1" referem-se a ácido nucleico e variantes polipéptídicas polimórficas, alelos, mutantes e homólogos inter-espécies que: (1) possuem uma sequência de nucleótidos que tem mais do que cerca de 60% de identidade de sequência de nucleótidos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferivelmente cerca de 92%, 94%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais, de identidade de sequência de nucleótidos, preferivelmente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais nucleótidos, com uma sequência de nucleótidos de, ou associada a, o gene de CS1 (Tabela 2), que liga o gene de CS1 (Tabela 2) a parceiros de ligação, e.g., anticorpos policlonais, criados contra um imunogénio compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleótidos de, ou associada a, o gene de CS1 (Tabela 2), e suas variantes modificadas de forma conservativa; (3) hibridam especificamente sob condições de hibridação rigorosas com uma sequência de ácido nucleico, 14 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ou ο seu complemento, de CS1 (Tabela 2) e suas variantes modificadas de forma conservativa; ou (4) possuem uma sequência de aminoácidos que possui mais do que cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, preferivelmente 90%, 91%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos, preferivelmente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais aminoácidos, com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleótidos de, ou associada a, o gene de CS1 (Tabela 2) . Uma sequência polinucleotidica ou polipeptidica é tipicamente de um mamifero incluindo, mas não se lhes limitando, primata, e.g.f ser humano; roedor, e.g., rato, ratinho, hamster; vaca, porco, cavalo, ovelha, ou outro mamifero. Um "polipéptido de CS 1" e um "polinucleótido de CS1", incluem tanto formas de ocorrência natural como recombinantes. TABELA 2 SEQ ID NO:1 PDL primekey: 433671 Sequência de ADN N.1 2 de Acesso do Ácido Nucleico: NM_021181 GI: 199235711ref|NM_021181.3| membro 7 da família SLAM (SLAMF7) de Homo sapiens, ARNm acatgcctca ccctcatcta tatcctttgg gtgaaagagc tggtcggttc cgttggtggg aagcaagttg actctattgt ctggaccttc gaagggggca ctatcatagt gacccaaaat ggaggctact ccctgaagct cagcaaactg gggatataca gctcatcact ccagcagccc gagcacctgt caaagcctaa agtcaccatg gtgaccaatc tgacatgctg eatggaacat gccctggggc aagcagccaa tgagtcccat t9999a9aaa gtgatatgac cttcatctgc tcaagcccca tccttgccag gaagctctgt atggtcctcc tgtgtctcct gttggtgccc tttctttggt ttctgaagag agagagacaa gacatttgtc gggaaactcc taacatatgc acaatccctc acactaatag aacaatccta actgtggaaa taccgaaaaa gatggaaaat ccaaggctat ttgcctatga gaatgttatc ctcaaaaaaa aaacaattct cggcccaaag tagaaacatc aaggaagaat gaagaacgtt gcttctttag atttaagagt tcataattcc gaaggtttaa tcacttcatc ccaaaaacgg gtgcttagaa gtattcctat agaaatgtaa gttgtattaa tgatggctcc aggtcagtgt tgtaaggatt ataccaagag tcttgctacc aagtccagca gaagcagatg cacctgacaa atgtgcccag cactatgctg agcttacact aaattggctc caaatgaatg aactactttc ttcccagagg gccaggtgtg gatccacagg aatcagggta gctgaccatg tttggcagat 1 cttccagaga gcaatatgge tggtteccca 2 61 cagctcacag ggtcagcagc ctctggaccc 121 gccgtgactt tccccctgaa gtccaaagta 181 aacacaaccc ctcttgtcac catacagcca 241 cgtaataggg agagagtaga cttcccagat 301 aagaagaatg actcagggat ctactatgtg 361 tccacccagg agtacgtgct gcatgtctac 421 ggtctgcaga gcaataagaa tggcacctgt 4BI ggggaagagg atgtgattta tacctggaag 541 aatgggtcca tcctccccat ctcctggaga 601 gttgccagga accctgtcag cagaaactte 661 gaaggtgctg ctgatgaccc agattcctcc 721 ctoctgctca gtctctttgt actggggcta 781 gaagagtaca ttgaagagaa gaagagagtg 341 ccccattctg gagagaacac agagtacgac 901 aaggaagatc cagcaaatac ggtttactcc 961 ccccactcac tgctcacgat gccagacaca 1021 tagacagcag tgcactcccc taagtctctg 1081 aaaacaatca gaagaattca ctgatttgac 1141 gacCtttttc eaggataaat tatctctgat 1201 atccactgct gagaaatctc ctcaaaccca 1261 gattgtgaat gtcagcaaac cataaaaaaa 1321 atgcaaggtc acacatatta atgacagcct 1381 ctggagtttc attccatccc agggcttgga 1441 aggagggcaa gaagaccaaa acagacagac 1501 aaatggatgt attaattggc tctataaact 1561 aattggtcag acgtgctgtc tgecctcatg 1621 aCgagcagtt gtagcaggcc tgaccacaga 1681 acttgaaggt caaagttcac aaagatgaag 15 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ 1741 actataatgg agacacagaa gtgtgcatgg cccaaggaca aggacctcca gccaggcttc 1801 atttatgcac ttgtgctgca aaagaaaagt ctaggtttta aggctgtgcc agaacccatc 1881 ccaataaaga gaccgagtct gaagtcacat tgtaaatcta gtgtaggaga cttggagtca 1921 ggcagtgaga ctggtggggc acggggggca gtgggtactt gtaaaccttt aaagatggtt 1981 aattcattca atagatattt attaagaacc fcatgcggccc ggcatggtgg ctcacacctg 2041 taatcccagc actttgggag gccaaggtgg gtgggtcatc tgaggtcagg agttcaagac 2101 cagcctggcc aacatggtga aaccccatct ctactaaaga tacaaaaatt tgctgagcgt 2161 ggtggtgtgc acctgtaatc ccagctactc gagaggccaa ggcatgagaa tcgcttgaac 2221 ctgggaggtg gaggttgcag tgagctgaga tggcaccact gcactccggc ctaggcaacg 2281 agagcaaaac tccaatacaa acaaacaaac aaacacctgt gctaggtcag tctggcacgt 2341 aagatgaaca tccctaccaa cacagagctc accatctctt atacttaagt gaaaaacatg 2401 gggaagggga aaggggaatg gctgcttttg atatgttccc tgacacatat cttgaatgga 2461 gacctcccta ccaagtgatg aaagtgttga aaaacttaat aacaaatgct tgttgggeaa 2521 gaatgggatt gaggattatc ttctctcaga aaggcattgt gaaggaattg agccagatct 2581 ctctccctac tgcaaaaccc tattgtagta aaaaagtctt cttbactatc ttaataaaac 2641 agatattgtg agattcaaaa aaaaaaaaas aa SEQ ID NO:2

Sequência de aminoácidos — CSl GI:19923571|ref|NM_021181.3| membro 7 da familia SLAM (SLAMF7) de Homo saplens MAGS PTCLTLIYI ItWQLTGS AASGPVKELVGSVGGAVTFPLKSKVKQ VDSIVWTPNTTPLVTIQPEGG T11VTQNKNRERVDF PDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYS S SLQQPSTQE WliHVYEHLSKPKVTMG LQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAANESHNGSILPISWRWGESDMTFICVARNPVSFN FSSPILARKLCEGAADDPDSSMVLLCIjLIjVPLLLSLFVLGLFLWFLKRERQEEYIEEKKRVDICRETP nicphsgenteydtiphtnrtilkedpaktvystveipkkmeítphslltmpdtprlpayenvi

Uma proteína ou um ácido nucleico de CSl de "comprimento completo" referem-se a uma sequência polipeptídica ou polinucleot ídica de CSl, ou uma sua variante, que contém elementos normalmente contidos em uma ou mais sequências polipeptídicas ou polinucleotídicas de CSl de ocorrência natural, de tipo selvagem. 0 "comprimento completo" pode ser anterior a, ou posterior a, várias etapas de processamento pós-tradução ou de splicing, incluindo splicing alternativo. "Amostra biológica", como aqui se utiliza, é uma amostra de tecido ou fluido biológicos que contém ácidos nucleicos ou polipéptidos, e.g., de uma proteína CSl, um polinucleotido ou um transcrito de CSl. Estas amostras incluem, mas não se lhes limitando, tecido isolado de primatas, e.g., seres humanos, ou roedores, e.g., ratinhos e ratos. As amostras biológicas podem também incluir secções de tecidos tais como amostras de biópsia e autópsia, secções congeladas tomadas para fins histológicos, amostras de arquivo, sangue, plasma, soro, saliva, fezes, lágrimas, muco, cabelo, pele, etc. As amostras biológicas também incluem explantes e culturas celulares primárias e/ou transformadas derivadas de tecidos de 16 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ pacientes. Uma amostra biológica é tipicamente obtida de um organismo eucariota, mais preferivelmente um mamífero tal como um primata, e.g., um chimpanzé ou um ser humano; vaca; cão; gato; um roedor, e.g., porquinho-da-índia, rato, ratinho; coelho; ou um pássaro; um réptil; ou um peixe. Animais de criação e domésticos têm interesse. "Proporcionar uma amostra biológica" significa obter uma amostra biológica para utilização em métodos descritos na presente invenção. Mais frequentemente, isto será realizado por remoção de uma amostra de células de um animal, mas pode também ser realizado utilizando células previamente isoladas (e.g., isoladas por outra pessoa, noutro momento, e/ou para outro propósito), ou realizando os métodos da invenção in vivo. Os tecidos ou materiais de arquivo, possuindo historial de tratamento ou de desenlaces, serão particularmente úteis.

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou possuem uma percentagem especificada de resíduos de aminoácido ou de nucleótidos que são iguais (e.g., cerca de 70% de identidade, preferivelmente 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 93%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade ao longo de uma região especificada, quando comparadas e alinhadas para uma correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação ou região designadas) como medido utilizando, e.g., um algoritmo de comparação de sequências BLAST ou BLAST 2.0 com os parâmetros pré-estabelecidos descritos adiante, ou por alinhamento manual e inspecção visual. Estas sequências dizem-se então "substancialmente idênticas". Esta definição também se refere a, ou pode ser aplicada a, o complemento de uma sequência de teste. A definição também inclui sequências que possuem deleções e/ou inserções, substituições e variante de ocorrência natural, e.g., variantes polimórficas ou alélicas, e variantes criadas pelo Homem. Como descrito adiante, os algoritmos preferidos podem ter em conta hiatos e similares. Preferivelmente, existe identidade ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento, ou mais preferivelmente ao longo de uma região 17 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ que tem cerca de 50-100 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento.

Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência actua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas num computador, são designadas as coordenadas de subsequências, se necessário, e são designados os parâmetros do programa do algoritmo de sequências. Preferivelmente, podem ser utilizados os parâmetros pré-estabelecidos do programa, ou podem ser designados parâmetros alternativos. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidades de sequência para as sequências de teste relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

Uma "janela de comparação", como aqui se utiliza, inclui a referência a um segmento de posições contíguas seleccionadas entre o grupo que consiste tipicamente em de cerca de 20 a 600, usualmente de cerca de 50 a 200, mais usualmente de cerca de 100 a 150, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem alinhadas de forma óptima. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser conduzido, e.g., pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, pelo método de busca de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85:2444-2448, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspecção visual (veja-se, e.g., Ausubel, et ai. (eds. 1995 e suplementos) Current Protocols in Molecular Biology Wiley).

Os exemplos preferidos de algoritmos que são adequados para a determinação da percentagem de identidade de sequências e similaridade de sequências incluem os algoritmos BLAST e 18 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ BLAST 2.0, que estão descritos em Altschul, et al. (1977) Nuc.

Acids Res. 25:3389-3402 e Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 são utilizados, com os parâmetros aqui descritos, para determinar a percentagem de identidade de sequências para os ácidos nucleicos e as proteínas da invenção. O software para realização das análises BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de sequências com pontuação elevada (HSP) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência interrogada, que correspondem ou satisfazem uma pontuação limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra com o mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T é referido como o limiar de pontuação das palavras da vizinhança (Altschul, et al., supra). Estas correspondências de palavras na vizinhança iniciais actuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSP mais longas que as contenham. As correspondências de palavras são estendidas em ambos os sentidos ao longo de cada sequência tão longe quanto a pontuação cumulativa do alinhamento possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, e.g., para sequências de nucleótidos, os parâmetros M (pontuação recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, utiliza-se uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das correspondências de palavras em cada sentido é parada quando: a pontuação cumulativa do alinhamento cai a quantidade X desde o seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa cai para zero ou menos, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou é atingida a extremidade de uma das sequências. Os parâmetros do algoritmo BLAST, W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleótidos) utiliza como valores pré-estabelecidos um comprimento de palavra (W) de 11, uma espectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como valores pré-estabelecidos um comprimento de palavra de 3, e espectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (veja-se Henikoff & Henikoff (1992), Proc. Natl. 19 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)) alinhamentos (B) de 50, espectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (Veja-se, e.g., Karlin & Altschul, (1993) Proc. Nat '1. Acad. Sei. USA 90:5873-5787).

Uma medida da similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade com que uma correspondência entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos poderá ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade soma numa comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência é inferior a cerca de 0,2, mais preferivelmente inferior a cerca de 0,01, e o mais preferivelmente inferior a cerca de 0,001. Os valores logarítmicos podem ser números grandes negativos, e.g., 5, 10, 20, 30, 40, 40, 70, 90, 110, 150, 170, etc.

Uma indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente reactivo de modo cruzado com os anticorpos criados contra o polipéptido codificado pelo segundo ácido nucleico. Assim, um polipéptido é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipéptido, e.g., quando os dois péptidos diferem apenas por substituições conservativas. Outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas ou as suas complementares hibridam uma com a outra sob condições rigorosas. Ainda outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que se podem utilizar os mesmos iniciadores para amplificar as sequências.

Uma "célula hospedeira" é uma célula de ocorrência natural ou uma célula transformada que contém um vector de expressão e suporta a replicação ou a expressão do vector de expressão. As células hospedeiras podem ser células de cultura, explantes, células in vivo, e similares. As células hospedeiras podem ser células procariotas tais como E. coli, ou células eucariotas tais como células de levedura, insecto, 20 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ anfíbio ou mamífero tais como CHO, HeLa, de mieloma, e similares (veja-se, e.g., o catálogo ou web site da American Type Culture Collection).

Os termos "isolado", "purificado" ou "biologicamente puro" referem-se a um material que está substancialmente ou essencialmente isento de componentes que normalmente o acompanham na forma em que se encontra no seu estado nativo. Pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas utilizando técnicas de química analítica tais como electroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína ou um ácido nucleico que são a espécie predominante presente numa preparação estão substancialmente purificados. Em particular, um ácido nucleico isolado está separado de alguns quadros de leitura abertos que flanqueiam na natureza o gene e codificam proteínas outras que não a proteína codificada pelo gene. O termo "purificado" denota em algumas concretizações que um ácido nucleico ou uma proteína dão origem essencialmente a uma banda num gel electroforético. Preferivelmente, significa que o ácido nucleico ou a proteína são pelo menos cerca de 85% puros, mais preferivelmente pelo menos 95% puros, e o mais preferivelmente pelo menos 99% puros. "Purificar" ou "purificação" em outras concretizações significam a remoção de pelo menos um contaminante ou componente da composição a purificar. Neste sentido, a purificação não requer que o composto purificado seja homogéneo, e.g., 100% puro.

Os termos "polipéptido", "péptido" e "proteína" são aqui utilizados indiferentemente para referir um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente de ocorrência natural, assim como a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural, aos que contêm resíduos modificados, e polímeros de aminoácidos que não são de ocorrência natural. O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, assim como a análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles que são 21 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ codificados pelo código genético, assim como os aminoácidos que são posteriormente modificados, e.g., hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfosserina. Análogos de aminoácidos referem-se a compostos que possuem a mesma estrutura quimica básica que um aminoácido de ocorrência natural, e.g., um carbono que está ligado a um hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino e um grupo R, e.g., homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina-metilsulfónio. Estes análogos podem possuir grupos R modificados (e.g., norleucina) ou esqueletos peptidicos modificados, mas retêm a mesma estrutura quimica básica que um aminoácido de ocorrência natural. Mimético de aminoácido refere-se a um composto quimico que possui uma estrutura que é diferente da estrutura quimica geral de um aminoácido, mas que funciona de uma maneira similar a um outro aminoácido.

Os aminoácidos podem aqui ser referidos por qualquer um dos seus vulgarmente conhecidos simbolos três letras ou símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Os nucleótidos, do mesmo modo, podem ser referidos pelos seus códigos vulgarmente aceites de uma letra. "Variantes modificadas de forma conservativa" aplica-se a sequências tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Em relação a sequências de ácido nucleico particulares, as variantes modificadas de forma conservativa referem-se aos ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou quando o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas ou associadas, e.g., naturalmente contíguas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam a maioria das proteínas. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam, todos, o aminoácido alanina. Assim, em cada posição em que uma alanina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado para outro dos codões correspondentes descritos sem alteração do polipéptido codificado. Estas variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações modificadas de forma conservativa. Todas as sequências de ácido nucleico aqui que codificam um polipéptido também 22 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ descrevem as variações silenciosas do ácido nucleico. Em determinados contextos cada codão num ácido nucleico (excepto AUG, que é vulgarmente o único codão para metionina, e TGG, que é vulgarmente o único codão para triptofano) pode ser modificado para originar uma molécula funcionalmente similar. Deste modo, uma variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipéptido está implícita numa sequência descrita em relação ao produto de expressão, mas não necessariamente em relação às reais sequências sonda.

Quanto às sequências de aminoácidos, um perito reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais numa sequência de ácido nucleico, de um péptido, de um polipéptido ou de uma proteina, que alterem, adicionem ou eliminem um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada, constituem uma "variante modificada de forma conservativa" quando a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. São bem conhecidas tabelas de substituições conservativas que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares. Estas variantes modificadas de forma conservativa são em adição, e não excluem, variantes polimórficas, homólogos inter-espécies e de alelos da invenção. Tipicamente as substituições conservativas incluem, um pelo outro: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V); 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (veja-se, e.g., Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Proprerties Freeman).

As estruturas macromoleculares tais como estruturas polipeptídicas podem ser descritas em termos de vários níveis de organização. Para uma discussão geral desta organização, veja-se, e.g., Alberts, et ai. (eds. 2001) Molecular Biology of the Cell (4th ed.) Garland; e Cantor e Schimmel (1980) Biophyslcal Chemlstry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules Freeman. "Estrutura primária" refere-se à sequência de aminoácidos de um péptido particular. "Estrutura secundária" refere-se a estruturas tridimensionais, localmente ordenadas, no interior de um polipéptido. Estas estruturas são 23 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ vulgarmente conhecidas como domínios. Os domínios são porções de um polipéptido que frequentemente formam uma unidade compacta do polipéptido e têm tipicamente de 25 a aproximadamente 500 aminoácidos de comprimento. Os domínios típicos são constituídos por secções de menor organização tais como trechos de folha β e hélices a. "Estrutura terciária" refere-se à estrutura tridimensional completa de um polipéptido monomérico. "Estrutura quaternária" refere-se à estrutura tridimensional formada, usualmente pela associação não covalente de unidades terciárias independentes. Os termos anisotrópicos são também conhecidos como termos energéticos. "Ácido nucleico" ou "oligonucleótido" ou "polinucleótido" ou equivalentes gramaticais aqui utilizados significam pelo menos dois nucleótidos covalentemente ligados entre si. Os oligonucleótidos têm tipicamente de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50 ou mais nucleótidos de comprimento, até cerca de 100 nucleótidos de comprimento. Os ácidos nucleicos e polinucleótidos são polímeros de qualquer comprimento, incluindo comprimentos mais longos, e.g., 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10 000, etc. Um ácido nucleico da presente invenção conterá geralmente ligações fosfodiéster, embora em alguns casos sejam incluídos análogos de ácido nucleico que podem ter pelo menos uma ligação diferente, e.g., ligações fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato ou O-metilfoforoamidito (veja-se Eckstein (1992) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach Oxford Univ. Press); e esqueletos e ligações de péptido-ácido nucleico. Outros análogos de ácidos nucleicos incluem os que possuem esqueletos positivos; esqueletos não iónicos e esqueletos sem ribose, incluindo os descritos nas Patentes U.S. 5,235,033 e 5,034,506, e Capítulos 6 e 7 de Sanghvi e Cook (eds. 1994) Carbohydrate Modifications in Antisense Research ACS Symposium Series 580. Os ácidos nucleicos contendo um ou mais açúcares carbocíclicos estão também incluídos numa definição de ácidos nucleicos. As modificações do esqueleto de ribose-fosfato podem ser realizadas por várias razões, e.g., para aumentar a estabilidade e a semivida destas moléculas em ambientes fisiológicos ou como sondas num biochip. Podem ser feitas misturas de ácidos nucleicos ocorrência natural e análogos; alternativamente, podem ser 24 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ feitas misturas de diferentes análogos de ácidos nucleicos, e misturas de ácidos nucleicos de ocorrência natural e análogos.

Uma variedade de referências divulgam análogos de ácidos nucleicos, incluindo, e.g., ligações fosforamidato (Beaucage, et al. (1993) Tetrahedron 49:1925-1963 e suas referências;

Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800-3803; Sprinzl, et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81:579-589; Letsinger, et al. (1986)

Nucl. Acicts Res. 14:3487-499; Sawai, et al. (1984) Chem. Lett. 805, Letsinger, et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470-4471; e Pauwels, et al. (1986) Chemica Scripta 26:141-149), fosforotioato (Mag, et al. (1991) Nucleic Acicts Res. 19:1437-441; e Patente U.S. 5,644,048), fosforoditioato (Brill, et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321-2322), O-metilfoforoamidito (veja-se Eckstein (1992) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford Univ. Press), e esqueletos e ligações de péptido-ácido nucleico (veja-se Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897; Meier, et al. (1992) Chem. Int.

Ed. Engl. 31:1008-1010; Nielsen (1993) Nature 365:566-568; Carlsson, et al. (1996) Nature 380:207). Outros análogos de ácidos nucleicos incluem os que têm esqueletos positivos (Denpcy, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:6097-101; esqueletos não iónicos (Patentes U.S. 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141 e 4,469,863; Kiedrowski, et al. (1991)

Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423-426; Letsinger, et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470-4471; Letsinger, et al. (1994) Nucleoside and Nucleotide 13:1597; Capítulos 2 e 3 em Sanghvi e Cook (eds. 1994) Carbohydrate Modifications in Antisense Research ACS Symposium Series 580; Mesmaeker, et al. (1994) Bioorganic and Medicinal Chem. Lett. 4:395-398; Jeffs, et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Horn, et al. (1996)

Tetrahedron Lett. 37:743) e esqueletos sem ribose, incluindo os descritos nas Patentes U.S. 5,235,033 e 5,034,506, e Capítulos 6 e 7 em Sanghvi e Cook (eds. 1994) Carbohydrate Modifications in Antisense Research ACS Symposium Series 580. Os ácidos nucleicos contendo um ou mais açúcares carbocíclicos estão também incluídos na definição de ácidos nucleicos (veja-se Jenkins, et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp 169-176). Vários análogos de ácidos nucleicos estão descritos em Rawls (página 35, 2 de Junho, 1997) C&E News. 25 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ São particularmente preferidos os péptido-ácido nucleico (PAN) que incluem análogos de péptido-ácido nucleico. Os péptido-ácido nucleico possuem esqueletos feitos de unidades N-(2-aminoetil)glicina repetidas ligadas por ligações peptidicas. As diferentes bases (purinas e pirimidinas) estão ligadas ao esqueleto por ligações metilenocarbonilo. Estes esqueletos são substancialmente não iónicos sob condições neutras, em contraste com o esqueleto de fosfodiéster altamente carregado dos ácidos nucleicos de ocorrência natural. Isto resulta em pelo menos duas vantagens. 0 esqueleto de PAN exibe uma cinética de hibridação melhorada, resultando numa mais forte ligação entre as cadeias de PAN/ADN, do que entre as cadeias de PAN e as cadeias de ADN. Os PNA têm maiores alterações na temperatura de fusão (Tm) para pares de bases mal emparelhados versus perfeitamente emparelhados. O ADN e o ARN tipicamente exibem uma queda de 2-4°C na Tm para erros de emparelhamento internos. Com o esqueleto de PAN não iónico, a queda é mais próxima de 7-9°C. Similarmente, devido à sua natureza não iónica, a hibridação das bases ligadas a estes esqueletos é relativamente insensível à concentração salina. Em adição, os PNA não são degradados por enzimas celulares, e assim podem ser mais estáveis.

Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, conforme especificado, ou conter porções de ambas as sequências, de cadeia dupla ou cadeia simples. Uma representação de uma cadeia simples também define a sequência da cadeia complementar; assim, as sequências aqui descritas também proporcionam a complementar da sequência. O ácido nucleico pode ser ADN, tanto ADN genómico como ADNc, ARN ou um híbrido, onde o ácido nucleico pode conter combinações de desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos, e combinações de bases, incluindo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina, isoguanina, etc. "Transcrito" refere-se tipicamente a um ARN de ocorrência natural, e.g., um pré-ARNm, ARNnh ou ARNm. Como aqui se utiliza, o termo "nucleósido" inclui nucleótidos e análogos de nucleósidos e de nucleótidos, e nucleósidos modificados tais como nucleósidos modificados com amino. Em adição, "nucleósido" inclui estruturas análogas que não são de ocorrência natural. Assim, e.g., as unidades individuais de um 26 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ peptido-ácido nucleico, cada uma contendo uma base, são referidas aqui como um nucleósido.

Um "marcador" ou uma "porção detectável" é uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquimicos, bioquímicos, imunoquímicos, fisiológicos, químicos, ou outros meios físicos. Em geral, os marcadores caiem em três classes: a) marcadores isotópicos, que podem ser radioactivos ou isótopos pesados; b) imunomarcadores, que podem ser anticorpos, antigénios ou marcadores epitópicos; e c) corantes coloridos ou fluorescentes. Os marcadores podem ser incorporados em ácidos nucleicos, proteínas e anticorpos de CS1. Por exemplo, o marcador deverá ser capaz de produzir, quer directa quer indirectamente, um sinal detectável. A porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 1251, reagentes electronicamente densos, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina, ou uma enzima (e.g., como vulgarmente utilizado num ELISA), biotina, digoxigenina, ou haptenos e proteínas ou outras entidades que possam ser tornadas detectáveis tais como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano. São conhecidos métodos para a conjugação do anticorpo ao marcador. Veja-se, e.g., Hunter, et al. (1962) Nature 144:945; David, et al. (1974) Biochemistry 13:1014-1021; Pain, et al. (1981) J. Immunol. Meth. 40:219-230; e Nygren (1982) J. Histochem. and Cytochem. 30:407-412.

Um "efector" ou "porção efectora" ou "componente efector" é uma molécula que está ligada (ou fixada, ou conjugada), quer de forma covalente, através de um ligante ou de uma ligação química, quer de forma não covalente, através de ligações iónicas, de van der Waals, electrostáticas ou de hidrogénio, a um anticorpo. O "efector" pode ser uma variedade de moléculas incluindo, e.g., porções de detecção incluindo compostos radioactivos, compostos fluorescentes, enzimas ou substratos, marcadores tais como marcadores epitópicos, toxinas; porções activáveis, agentes quimioterapêuticos; lipases; antibióticos; porções quimioatractivas, imunomoduladores (micA/B), ou radioisótopos, e.g., emissores de radiação beta "forte". 27 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Uma "sonda de ácido nucleico ou oligonucleótido marcada" é uma que está ligada, e.g., de forma covalente, através de um ligante ou de uma ligação química, ou não covalente, através de ligações iónicas, de van der Waals, electrostáticas ou de hidrogénio, a um marcador, de modo que a presença da sonda possa ser detectada por detecção da presença do marcador ligado à sonda. Alternativamente, os métodos que utilizam interacções de elevada afinidade podem conseguir os mesmos resultados quando um de um par de parceiros de ligação se liga ao outro, e.g., biotina, estreptavidina.

Como aqui se utiliza, uma "sonda de ácido nucleico ou oligonucleótido" é um ácido nucleico capaz de ligação a um ácido nucleico alvo de sequência complementar através de um ou mais tipos de ligações químicas, usualmente através de emparelhamento de bases complementares, e.g., através da formação de ligações de hidrogénio. Como aqui se utiliza, uma sonda pode incluir bases naturais (e.g., A, G, C ou T) ou modificadas (7-desazaguanosina, inosina, etc.). Em adição, as bases numa sonda podem ser unidas por uma ligação outra que não uma ligação fosfodiéster, preferivelmente uma que não interfira funcionalmente com a hibridação. Assim, e.g., as sondas podem ser peptido-ácido nucleico em que as bases constituintes estão unidas por ligações peptídicas em vez de ligações fosfodiéster. As sondas podem ligar-se a sequências alvo sem completa complementaridade com a sequência sonda dependendo do rigor das condições de hibridação. As sondas são preferivelmente marcadas directamente, e.g., com isótopos, cromóforos, lumiforos, cromogénios ou marcadas indirectamente, e.g., com biotina a que mais tarde se poderá ligar um complexo de estreptavidina. Através do ensaio quanto à presença ou ausência da sonda, pode-se detectar a presença ou ausência da sequência ou subsequência seleccionadas. O diagnóstico ou o prognóstico podem ser baseados quer ao nível genómico, quer ao nível da expressão do ARN ou da proteína. O termo "recombinante", quando utilizado com referência, e.g., a uma célula, ou um ácido nucleico, uma proteína ou um vector, indica que a célula, o ácido nucleico, a proteína ou o vector, foram modificados pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heterólogos ou pela alteração de um ácido nucleico ou uma proteína nativos, ou que a célula é derivada de uma 28 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ célula assim modificada. Assim, e.g., células recombinantes expressam genes que não se encontram na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outro modo anormalmente expressos, sub-expressos ou não expressos de todo. A expressão "ácido nucleico recombinante" significa aqui um ácido nucleico, originalmente formado in vitro, em geral, pela manipulação de ácido nucleico, e.g., utilizando polimerases e endonucleases, numa forma normalmente não encontrada na natureza. Desta maneira, é conseguida a ligação operativa de diferentes sequências. Assim, um ácido nucleico isolado, numa forma linear, ou um vector de expressão formado in vitro por ligação de moléculas de ADN que não estão normalmente unidas, são ambos considerados recombinantes para os fins da presente invenção. Entende-se que uma vez preparado um ácido nucleico recombinante e reintroduzido numa célula ou organismo hospedeiros, este irá replicar de forma não recombinante, e.g., utilizando a maquinaria celular in vivo da célula hospedeira em vez de manipulações in vitro; contudo, estes ácidos nucleicos, uma vez produzidos recombinantemente, embora subsequentemente replicados de forma não recombinante, são ainda assim considerados recombinantes para os fins da invenção.

Similarmente, uma "proteína recombinante" é uma proteína preparada utilizando técnicas recombinantes, e.g., através da expressão de um ácido nucleico recombinante como representado acima. Uma proteína recombinante distingue-se da proteína de ocorrência natural por pelo menos uma ou mais características. A proteína pode ser isolada ou purificada de algumas ou da maioria das proteínas e compostos com que está normalmente associada no seu hospedeiro de tipo selvagem, e assim pode ser substancialmente pura. Uma proteína isolada não está acompanhada de pelo menos algum do material com que está normalmente associada no seu estado natural, preferivelmente constituindo pelo menos cerca de 0,5%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 5% em peso da proteína total numa determinada amostra. Uma proteína substancialmente pura compreende pelo menos cerca de 75% em peso da proteína total, sendo preferido pelo menos cerca de 80%, e sendo particularmente preferido pelo menos cerca de 90%. A definição inclui a produção de uma proteína CS1 de um organismo num organismo ou célula hospedeiros diferentes. Alternativamente, 29 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ a proteína pode ser preparada numa concentração significativamente superior à normalmente observada, através da utilização de um promotor indutível ou de um promotor de elevada expressão, de modo a que a proteína seja preparada em níveis de concentração superiores. Alternativamente, a proteína pode estar numa forma normalmente não encontrada na natureza, como na adição de um marcador epitópico ou substituições, inserções e deleções de aminoácidos, como discutido adiante. O termo "heterólogo", quando utilizado com referência a porções de um ácido nucleico, indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não se encontram normalmente na mesma relação umas com as outras na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de forma recombinante, possuindo duas ou mais sequências, e.g., a partir de genes não relacionados arranjados para preparar um novo ácido nucleico funcional, e.g., um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. Similarmente, uma proteína heteróloga frequentemente referir-se-á a duas ou mais subsequências que não se encontram na mesma relação umas com as outras na natureza (e.g., uma proteína de fusão).

Um "promotor" é tipicamente um arranjo de sequências de controlo de ácido nucleico que dirige a transcrição de um ácido nucleico. Como aqui se utiliza, um promotor inclui sequências de ácido nucleico necessárias próximas do local de início da transcrição, tais como, no caso de um promotor do tipo da polimerase II, um elemento TATA. Um promotor também inclui opcionalmente elementos potenciadores ou repressores distais, que podem estar localizados até vários milhares de pares de bases do local de início da transcrição. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é activo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "indutível" é activo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. A expressão "operativamente ligado" refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de controlo da expressão de ácido nucleico (tal como um promotor, ou arranjo (array) de locais de ligação a factores de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, e.g., em que a sequência de controlo da expressão dirige a transcrição do ácido nucleico correspondente à segunda sequência. 30 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Um "vector de expressão" é uma construção de ácido nucleico, gerada de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular numa célula hospedeira. O vector de expressão pode ser parte de um plasmideo, um vírus ou um fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, o vector de expressão inclui um ácido nucleico a transcrever em ligação operativa a um promotor. A frase "híbrida selectivamente (ou especificamente) com" refere-se à ligação, formação de dúplices ou hibridação de uma molécula, selectivamente, com uma sequência de nucleótidos particular sob condições de hibridação rigorosas quando essa sequência está presente numa mistura complexa (e.g., ADN ou ARN celular total ou de uma biblioteca). A frase "condições de hibridação rigorosas" refere-se a condições sob as quais uma sonda irá hibridar com a sua subsequência alvo, tipicamente numa mistura complexa de ácidos nucleicos, mas não com outras sequências. Condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas hibridam especificamente a temperaturas superiores. Encontra-se um guia extensivo da hibridação de ácidos nucleicos em "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" em Tijssen (1993) Hybridation with Nucleic Probes (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) (vol. 24) Elsevier. Geralmente, as condições rigorosas são seleccionadas de modo a serem cerca de 5-10°C inferiores ao ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica a um pH e força iónica definidos. A Tm é a temperatura (sob a força iónica, pH e concentração nucleica definidos) a que 50% das sondas complementares ao alvo hibridam com a sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). As condições rigorosas serão aquelas em que a concentração salina é inferior a cerca de 1,0 M de ião de sódio, tipicamente cerca de 0,01-1,0 M de concentração de ião de sódio (ou outros sais) a pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (e.g., cerca de 10-50 nucleótidos) e de pelo menos cerca de 60°C para sondas 31 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ longas (e.g., superiores a cerca de 50 nucleótidos). As condições rigorosas podem também ser conseguidas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Para hibridação selectiva ou especifica, um sinal positivo é tipicamente de pelo menos duas vezes a hibridação de fundo, preferivelmente 10 vezes a hibridação de fundo. Condições de hibridação rigorosas exemplificativas podem ser as seguintes: formamida a 50%, SSC 5x e SDS a 1%, incubação a 42°C, ou, SSC 5x, SDS a 1%, incubação a 65°C, com lavagem com SSC 0,2x, e SDS a 0,1% a 65°C. Para a PCR, é típica uma temperatura de cerca de 36 °C para amplificação de baixo rigor, embora as temperaturas de hibridação possam variar entre cerca de 32 o-48°C dependendo do comprimento do iniciador. Para amplificação por PCR de elevado rigor, uma temperatura de cerca de 62°C é típica, embora as temperaturas de hibridação de elevado rigor possam variar de cerca de 50-65°C, dependendo do comprimento e especificidade do iniciador. Condições de ciclos típicos para amplificações de rigor elevado e baixo incluem uma fase de desnaturação de 90-95°C durante 30-120 s, uma fase de hibridação que demora 30-120 s, e uma fase de extensão a cerca de 72°C durante 1-2 min. Protocolos e orientações para reacções de amplificação de baixo e elevado rigor estão proporcionados, e.g., em Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY.

Os ácidos nucleicos que não hibridam uns com os outros sob condições rigorosas são ainda substancialmente idênticos se os polipéptidos que codificam forem substancialmente idênticos. Isto ocorre, e.g., quando uma cópia de um ácido nucleico é criada utilizando a degenerescência máxima de codões permitida pelo código genético. Nestes casos, os ácidos nucleicos tipicamente hibridam sob condições de hibridação moderadamente rigorosas. Os exemplos de "condições de hibridação moderadamente rigorosas" incluem uma hibridação num tampão de formamida a 40%, NaCl 1 M, SDS a 1%, a 37°C, e uma lavagem com SSC IX a 45°C. Uma hibridação positiva é tipicamente de pelo menos duas vezes a hibridação de fundo. Podem ser utilizadas condições de hibridação e de lavagem alternativas para proporcionar condições de rigor similar. Orientações adicionais para a determinação dos parâmetros de hibridação são proporcionados em numerosas referências, 32 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ e.g., Ausubel, et al. (eds. 1991 e suplementos) Current Protocols in Molecular Biology Wiley.

As frases "alterações na morfologia celular" ou "alterações em características celulares" referem-se a qualquer alteração na morfologia celular ou em caracteristicas de proliferação in vitro ou in vivo, tais como viabilidade celular, crescimento celular, secreção de factores de crescimento ou quimioquinas, alterações na morfologia celular, ganho ou perda de marcadores específicos de inflamação, capacidade para induzir ou suprimir a inflamação quando injectadas em hospedeiros animais adequados, e/ou indução de um estado de doença em hospedeiros adequados, e.g. desordens auto-imunes e condições cancerosas. Veja-se, e.g., pp. 231-241 em Freshney (1994) Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (2d ed.) Wiley-Liss. "Células doentes" refere-se a alterações fenotípicas espontâneas ou induzidas que não envolvem necessariamente a assimilação de novo material genético. Por exemplo, embora a formação de mieloma possa surgir de infecção com um vírus transformante e incorporação de novo ADN genómico, ou de assimilação de ADN exógeno, pode também surgir espontaneamente ou após exposição a um agente, desse modo induzindo a expressão ou alteração de um gene existente. O crescimento tumoral está associado a alterações fenotípicas e de expressão de proteínas, tais como alterações morfológicas, crescimento de células aberrantes, e/ou alterações não morfológicas. Veja-se, Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (4th ed.) Wiley-Liss. Similarmente, as células afectadas por processos de doença auto-imune estão também associadas com alterações fenotípicas e de expressão de proteínas.

Uma "quantidade eficaz" de uma molécula, ou de um anticorpo, ou de um fármaco ou de um agente farmacologicamente activo ou de uma formulação farmacêutica, significa uma quantidade suficiente da molécula, do anticorpo, do fármaco, do agente ou da formulação, para proporcionar o efeito desejado. 33 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Um "indivíduo" ou um "paciente" são aqui utilizados indiferentemente, e referem-se a um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ser humano.

Como aqui se utilizam, os termos "anticorpo" ou "imunoglobulina" referem-se a uma proteína consistindo em um ou mais polipéptidos substancialmente codificados por genes de imunoglobulinas. Os genes de imunoglobulinas reconhecidos incluem os genes das regiões constantes capa, lambda, alfa, gama (IgGi, IgG2, IgG3, IgG4) , delta, épsilon e mu, assim como a miríade de genes da região V variável das imunoglobulinas (como indicado adiante, existem genes V para ambas as cadeias, pesada -He leve - L). As "cadeias leves" das imunoglobulinas de comprimento completo (cerca de 25 Kd ou 214 aminoácidos) são codificadas por um gene da região variável, V-capa ou ν'-lambda, no terminal NH2 (cerca de 110 aminoácidos) e, respectivamente, um gene da região constante capa ou lambda no terminal COOH. As "cadeias pesadas" das imunoglobulinas de comprimento completo (cerca de 50 Kd ou 446 aminoácidos) , são similarmente codificadas por um gene da região variável (cerca de 116 aminoácidos) e um dos outros genes da região constante supramencionados, e.g., gama (que codifica cerca de 330 aminoácidos).

Uma forma de imunoglobulina constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina, cada par possuindo uma cadeia leve e uma pesada. Em cada par, as regiões variáveis das cadeias leve e pesada são todas responsáveis pela ligação a um antigénio, e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efectoras do anticorpo. Em adição aos anticorpos tetraméricos, as imunoglobulinas podem existir numa variedade de outras formas incluindo, por exemplo, Fv, Fab e (Fab')2f assim como anticorpos híbridos bifuncionais (e.g., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) e em cadeias únicas (e.g., Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) e Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988)). (veja-se, genericamente, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed. (1984), e Hunkapiller e Hood, Nature, 323, 15-16 (1986) ). 34 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Uma região variável da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina consiste numa região de "esqueleto" ("framework") interrompida por três regiões hipervariáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR). A extensão da região de esqueleto e das CDR foi definida precisamente (veja-se, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)). As sequências das regiões de esqueleto de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas entre uma espécie. Como aqui se utiliza, uma "região de esqueleto humana" é uma região de esqueleto que é substancialmente idêntica (cerca de 85% ou mais, usualmente 90-95% ou mais) à região de esqueleto de uma imunoglobulina humana de ocorrência natural. A região de esqueleto de um anticorpo, ou seja, as regiões de esqueleto combinadas das cadeias leve e pesada constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDR. As CDR são principalmente responsáveis pela ligação a um epítopo de um antigénio.

Os anticorpos também existem, e.g., na forma de vários fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases. Assim, e.g., a pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações dissulfureto na região de charneira para produzir F(ab) '2, um dimero de Fab que, ele próprio, é uma cadeia leve unida a VH-CH1 através de uma ligação dissulfureto. O F(ab)'2 pode ser reduzido sob condições moderadas para quebrar a ligação dissulfureto na região de charneira, desse modo convertendo o dimero F(ab)'2 num monómero Fab'. O monómero Fab' é essencialmente Fab com parte da região de charneira (veja-se Paul (ed. 1999) Fundamental Immunology (4th ed.) Raven. Embora vários fragmentos de anticorpos sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um perito na especialidade notará que estes fragmentos podem ser sintetizados de novo quer quimicamente, quer utilizando metodologia de ADN recombinante. Assim, o termo anticorpo, como aqui se utiliza, também inclui fragmentos de anticorpos quer sejam produzidos pela modificação de anticorpos completos, quer sejam sintetizados de novo utilizando metodologias de ADN recombinante (e.g., Fv de cadeia única) quer sejam identificados utilizando 35 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ bibliotecas de exibição em fagos (veja-se, e.g., McCafferty, et al. (1990) Nature 348:552-554).

Um "anticorpo quimérico" é uma molécula de anticorpo em que (a) a região constante, ou uma sua porção, é alterada, substituída, ou permutada, de modo a que o local de ligação ao antigénio (região variável) esteja ligado a uma região constante de uma classe diferente ou alterada, e/ou espécie, ou a uma molécula completamente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, e.g., uma enzima, uma toxina, uma hormona, um factor de crescimento, um fármaco, uma função efectora, um quimioatractor, um imunomodulador, etc.; ou (b) a região variável, ou uma sua porção, é alterada, substituída, ou permutada, com uma região variável possuindo uma especificidade para com o antigénio diferente ou alterada. A expressão "anticorpo humanizado" ou "imunoglobulina humanizada" refere-se a uma imunoglobulina compreendendo um esqueleto humano, pelo menos uma e preferivelmente todas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um anticorpo não humano, e em que qualquer região constante presente é substancialmente idêntica a uma região constante de imunoglobulina humana, i.e., pelo menos cerca de 85-90%, preferivelmente pelo menos 95% idêntica. Portanto, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, excepto possivelmente as CDR, são substancialmente idênticas a partes correspondentes de uma ou mais sequências nativas de imunoglobulina humana. Veja-se, e.g. Queen et al., Patentes U.S. 5,5301,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; e 6,180,370

Para a preparação de anticorpos, e.g., anticorpos recombinantes, monoclonais ou policlonais, são conhecidas muitas técnicas. Veja-se, e.g., Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, et al. (1983) Immunology Today 4:72; Cole, et al. (1985) pp. 77-96 em Reisfeld e Sell (1985)

Monoclonal Antibodies and Myeloma Therapy Liss; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Lippincott; Harrow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; e Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed.) Academic Press. As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente U.S. 4,946,778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos contra polipéptidos da presente invenção. 36 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Também, ratinhos transgénicos, ou outros organismos tais como outros mamíferos, podem ser utilizados para expressar anticorpos humanizados. Alternativamente, a tecnologia de exibição em fagos pode ser utilizada para identificar anticorpos e fragmentos Fab heteroméricos que se ligam especificamente a antigénios seleccionados. Veja-se, e.g.f McCafferty, et al. (1990) Nature 348:552-554; Marks, et al. (1992) Biotechnology 10:779-783. O termo "epítopo" refere-se a qualquer porção (determinante) de uma proteína que é capaz de eliciar uma resposta imunitária e susceptível de ser especificamente ligada por um anticorpo. Os determinantes epitópicos usualmente consistem em agrupamentos de moléculas activas na superfície tais como aminoácidos ou cadeias laterais GAG e que usualmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Dois anticorpos dizem-se ligar-se a substancialmente o mesmo epítopo de uma proteína (ou o epítopo sobreposto de uma proteína) se mutações de aminoácidos na proteína que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo também reduzem ou eliminam a ligação de outro anticorpo, e/ou se os anticorpos competem pela ligação à proteína, i.e., a ligação de um anticorpo à proteína reduz ou elimina a ligação do outro anticorpo. A determinação se dois anticorpos se ligam substancialmente ao mesmo epítopo é realizada pelos métodos conhecidos na especialidade, tais como um ensaio de competição. Ao conduzir um estudo de competição com anticorpos entre um anticorpo de controlo (por exemplo, um dos anticorpos anti-CSl aqui descritos) e qualquer anticorpo de teste, pode-se primeiro marcar o anticorpo de controlo com um marcador de detectável, tal como, biotina, um marcador enzimático, um marcador radioactivo ou um marcador fluorescente, para permitir a subsequente identificação. Um anticorpo de teste (não marcado) que se liga a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo de controlo (marcado) deverá ser capaz de bloquear a ligação do anticorpo de controlo e desse modo deverá reduzir a ligação do anticorpo de controlo.

Numa concretização exemplificativa, se um anticorpo se liga substancialmente ao mesmo epítopo de um anticorpo 37 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ monoclonal Luc (anticorpos monoclonais Luc referem-se aos anticorpos monoclonais anti-CSl produzidos da presente invenção), o anticorpo deverá ligar-se a um epitopo de CS1 que se sobrepõe ao epitopo de CS1 a que o anticorpo monoclonal Luc também se liga. A região de sobreposição pode variar desde um residuo de aminoácido até várias centenas de residuos de aminoácido. Este anticorpo deverá então competir com, e/ou bloquear, a ligação do anticorpo monoclonal Luc a CS1 e desse modo diminuir a ligação do anticorpo monoclonal Luc a CS1, preferivelmente em pelo menos cerca de 50% num ensaio de competição.

Um epitopo é reconhecido por um anticorpo quando o epitopo se liga ao anticorpo com uma afinidade de ligação de pelo menos 105 ΝΓ1, preferivelmente 106 a ΙΟ7 ΝΓ1, mais preferivelmente 108 a ΙΟ9 M_1, ainda mais preferivelmente IO10 M-1 ou mais forte. A expressão "derivado de" significa "obtido a partir de" ou "produzido por" ou "descendente de".

Antigénios e Anticorpos de CS1 SEQ ID NO: 2 representa as sequências de aminoácidos da CS1 humana de tipo selvagem de comprimento completo. Um fragmento ou derivado de CS1 "funcionalmente activo" exibe uma ou mais actividades funcionais associadas a uma proteína CS1 de tipo selvagem e de comprimento completo, tais como actividade antigénica ou imunogénica, capacidade para ligar substratos celulares naturais, etc. A actividade funcional de proteínas CS1, seus derivados e fragmentos, pode ser ensaiada por vários métodos conhecidos de um perito na especialidade (Current Protocols in Protein Science, Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Somerset, New Jersey (1998)). Para os presentes fins, os fragmentos funcionalmente activos também incluem os fragmentos que compreendem um ou mais domínios estruturais de um polipéptido de CS1, tais como um domínio de ligação. Os domínios da proteína podem ser identificados utilizando o programa PFAM (Bateman A., et al., Nucleic Acids Res. 27: 260-2 (1999)) .

Os derivados de polipéptidos de CS1 tipicamente partilham um certo grau de identidade de sequência ou similaridade de 38 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ sequência com SEQ ID NO:2 ou um seu fragmento. Os derivados de CS1 podem ser produzidos por vários métodos conhecidos na especialidade. As manipulações que resultam na sua produção podem ocorrer ao nivel dos genes ou das proteínas. Por exemplo, uma sequência génica de CS1 clonada (e.g. SEQ ID NO:l) pode ser clivada em locais apropriados com endonuclease(s) de restrição (Wells et al., Philos. Trans. R. Sot. London SerA 317: 415 (1986)), seguida de modificação enzimática adicional, se desejado, e depois pode ser isolada, e ligada in vitro, e expressa para produzir o derivado desejado. Alternativamente, um gene de CS1 pode ser mutado in vitro ou in vivo para criar e/ou destruir sequências de tradução, iniciação e/ou terminação, ou para criar variações em regiões de codificação e/ou para formar novos locais de endonucleases de restrição ou destruir os preexistentes, para facilitar modificação in vitro adicional. São conhecidas na especialidade uma variedade de técnicas de mutagénese tais como mutagénese química, mutagénese in vitro dirigida ao local (Cárter et al. , Nucl. Acids Res. 13: 4331 (1986)), ou utilização de ligantes TAB (disponível de Pfizer, Inc.).

Num aspecto, os anticorpos utilizados na presente invenção neutralizam pelo menos uma, ou preferivelmente todas, as actividades biológicas de CS1. As actividades biológicas de CS1 incluem: 1) actividades de ligação dos seus substratos celulares, tais como os seus ligandos (por exemplo, estes anticorpos neutralizantes deverão ser capazes de competir com, ou bloquear completamente, a ligação de CS1 a pelo menos um, e preferivelmente a todos, os seus ligandos); 2) actividades de transdução de sinal; e 3) respostas celulares induzidas por CS1 . A presente divulgação proporciona as linhas celulares de hibridomas: Luc2, Luc3, Lucl5, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63, Luc69, LucX.l, LucX.2 ou Luc90. A linha celular de hibridoma Luc90 foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) em P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, com o número de acesso PTA 5091. O depósito desta linha celular de hibridoma foi recebido pela ATCC em 26 de Março, 2003. A linha celular de hibridoma Luc63 foi também depositada na ATCC no endereço 39 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ acima indicado. Ο depósito do anticorpo Luc63 foi recebido pela ATCC em 6 de Maio, 2004. A presente divulgação proporciona anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares de hibridomas: Luc2, Luc3, Lucl5, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63, Luc69, LucX.l, LucX.2 ou Luc90 (Número de acesso na ATCC: PTA 5091) . Estes anticorpos monoclonais são doravante denominados como os anticorpos: Luc2, Luc3, Lucl5, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63, Luc69, LucX.l, LucX.2 e Luc90, respectivamente. A presente divulgação proporciona anticorpos, preferivelmente anticorpos monoclonais, que se ligam substancialmente ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos monoclonais Luc aqui descritos. A presente divulgação proporciona anticorpos, preferivelmente anticorpos monoclonais, que não se ligam substancialmente ao mesmo epítopo que um ou mais dos anticorpos monoclonais Luc aqui descritos.

Podem ser utilizados uma variedade ensaios de rastreio imunológico para a determinação da competição de anticorpos para identificar os anticorpos que se ligam a substancialmente o mesmo epítopo de um anticorpo utilizado de acordo com a presente invenção ou se ligam a um epítopo diferente de um anticorpo utilizado de acordo com a presente invenção.

Ao conduzir um estudo de competição de anticorpos entre um anticorpo de controlo e qualquer anticorpo de teste (independentemente da espécie ou do isotipo), pode-se primeiro marcar o controlo com um marcador detectável, tal como, biotina ou um marcador enzimático (ou mesmo radioactivo) para permitir a identificação subsequente. Neste caso, pré-mistura-se ou incuba-se o anticorpo não marcado com células que expressam a proteína CS1. O anticorpo marcado é então adicionado às células pré-incubadas. A intensidade do marcador ligado é medida. Se o anticorpo marcado compete com o anticorpo não marcado pela ligação a um epítopo sobreposto, a intensidade irá diminuir relativamente à ligação pelo 40 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ anticorpo de controlo negativo não marcado (um anticorpo conhecido que não se liga a CS1). O ensaio pode ser qualquer um de uma gama de ensaios imunológicos baseados na competição de anticorpos, e os anticorpos de controlo serão detectados por meio de detecção do seu marcador, e.g., utilizando estreptavidina no caso de anticorpos biotinilados ou utilizando um substrato cromogénico em ligação a um marcador enzimático (tal como substrato 3,3'5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) com enzima peroxidase) ou simplesmente por detecção de um marcador radioactivo ou um marcador fluorescente. Um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que os anticorpos de controlo será capaz de competir eficazmente pela ligação, e assim irá reduzir significativamente (por exemplo, em pelo menos 50%) a ligação do anticorpo de controlo, como evidenciado por uma redução no marcador ligado. A reactividade dos anticorpos de controlo (marcados) na ausência de um anticorpo completamente irrelevante seria o valor elevado de controlo. O valor baixo de controlo seria obtido por incubação dos anticorpos de teste não marcados com células que expressam CS1 e depois incubação da mistura célula/anticorpo com anticorpos de controlo marcados exactamente do mesmo tipo, quando a competição irá ocorrer e reduzir a ligação dos anticorpos marcados. Num ensaio de teste, uma redução significativa na reactividade do anticorpo marcado na presença de um anticorpo de teste é indicativa de um anticorpo de teste que reconhece substancialmente o mesmo epitopo.

Os anticorpos contra CS1 de todas as espécies de origens estão incluídos para utilização na presente invenção. Exemplos não limitantes de anticorpos naturais incluem anticorpos derivados de seres humanos, galinha, cabras e roedores (e.g., ratos, ratinhos, hamsters e coelhos), incluindo roedores transgénicos geneticamente manipulados para produzir anticorpos humanos (veja-se, e.g., Lonberg et al., W093/12227; Patente U.S. 5,545,806; e Kucherlapati, et al., WO91/10741; Patente U.S. 6,150,584. Os anticorpos naturais são os anticorpos produzidos por um animal hospedeiro após ser imunizado com um antigénio, tal como um polipéptido, 41 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ preferivelmente um polipéptido humano. Numa concretização preferida, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo natural isolado que se liga a, e/ou neutraliza, CS1.

Os anticorpos anti-CSl geneticamente alterados deverão ser funcionalmente equivalentes aos anticorpos naturais acima mencionados. Os anticorpos modificados que proporcionam estabilidade ou/e eficácia terapêutica melhoradas são preferidos. Os exemplos de anticorpos modificados incluem os que têm substituições conservativas de resíduos de aminoácido, e uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alteram de modo significativamente prejudicial a utilidade de ligação ao antigénio. As substituições podem variar desde a alteração ou modificação de um ou mais resíduos de aminoácido até ao completo re-desenho de uma região desde que a utilidade terapêutica se mantenha. Os anticorpos da presente invenção podem ser modificados após a tradução (e.g., acetilação, e/ou fosforilação) ou podem ser modificados sinteticamente (e.g., a fixação de um grupo marcador). Os anticorpos geneticamente alterados preferidos são anticorpo quiméricos e anticorpos humanizados. O anticorpo quimérico é um anticorpo possuindo uma região variável e uma região constante derivadas de dois anticorpos diferentes, preferivelmente derivados de espécies separadas. Preferivelmente, a região variável do anticorpo quimérico é derivada de murino e a região constante é derivada do ser humano.

Numa concretização, as regiões variáveis murinas são derivadas de qualquer um dos anticorpos monoclonais aqui descritos. De modo a produzir os anticorpos quiméricos, as porções derivadas de duas espécies diferentes (e.g., região constante humana e região variável ou de ligação murina) podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais ou podem ser preparadas na forma de proteínas individuais contíguas utilizando técnicas de engenharia genética. As moléculas de ADN que codificam as proteínas de ambas as porções de cadeia leve e cadeia pesada do anticorpo quimérico podem ser expressas na forma de proteínas contíguas. O método para preparar anticorpos quiméricos está divulgado na Patente 42 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ U.S. 5,677,427; Patente U.S. 6,120,767; e na Patente U.S. 6,329,508.

Os anticorpos geneticamente alterados utilizados na presente invenção incluem anticorpos humanizados que se ligam a, e neutralizam, CS1. Numa concretização, os referidos anticorpos humanizados compreendendo as CDR de uma imunoglobulina de ratinho dadora e esqueletos de cadeia pesada e cadeia leve e regiões constantes de uma imunoglobulina humana aceitadora. Num exemplo, os anticorpos humanizados são as versões humanizadas de qualquer um dos anticorpos aqui descritos. O método para preparar o anticorpo humanizado está divulgado nas Patentes U.S. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693, 762; e 6, 180,370 .

Os anticorpos anti-CSl completamente humanos estão também incluídos na presente invenção. Numa concretização preferida da presente invenção, os referidos anticorpos completamente humanos são anticorpos humanos isolados que neutralizam as actividades de CS1 aqui descritas.

Os anticorpos completamente humanos contra CS1 são produzidos por uma variedade de técnicas. Um exemplo é a metodologia dos triomas. A abordagem básica e um exemplo de parceiro de fusão celular, SPAZ-4, para utilização nesta abordagem, foram descritos por Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente U.S. 4,634,664; e Engleman et al., Patente U.S. 4,634,666

Os anticorpos humanos contra CS1 podem também ser produzidos a partir de animais transgénicos não humanos possuindo transgenes que codificam pelo menos um segmento do locus da imunoglobulina humana. A produção e as propriedades de animais possuindo estas propriedades estão descritos em detalhe por, e veja-se, e.g., Lonberg et al., W093/12227;

Patente U.S. 5,545,806; e Kucherlapati, et al., WO91/10741; Patente U.S. 6,150,584. Várias tecnologias de bibliotecas de anticorpos

recombinantes podem também ser utilizadas para produzir anticorpos completamente humanos. Por exemplo, uma abordagem consiste em rastrear uma biblioteca de ADN de células B 43 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ humanas de acordo com o protocolo geral delineado por Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). São seleccionados anticorpos que se ligam a CS1 ou um seu fragmento. As sequências que codificam estes anticorpos (ou fragmentos de ligação) são então clonadas e amplificadas. O protocolo descrito por Huse é tornado mais eficiente em combinação com a tecnologia de exibição em fagos. Veja-se, e.g., Dower et al., WO 91/17271 e McCafferty et al., WO 92/01047; Patente U.S. 5,969,108. Nestes métodos, são produzidas bibliotecas de fagos em que os membros exibem diferentes anticorpos nas suas superfícies externas. Os anticorpos são usualmente exibidos na forma de fragmentos Fv ou Fab. Os fagos que exibem anticorpos com uma especificidade desejada são seleccionados por enriquecimento de afinidade para com CS1 ou seus fragmentos.

Ribossomas eucariotas podem também ser utilizados como meio para exibir uma biblioteca de anticorpos e isolar os anticorpos humanos que se ligam, por rastreio contra o antigénio alvo, tal como CS1, como descrito em Coia G, et al., J. Immunol. Methods 1: 254 (1-2):191-7 (2001); Hanes J. et al., Nat. Biotechnol. 18 (12):1287-92 (2000); Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (24):14130-5 (1998); Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94 (10):4937-42 (1997). O sistema de levedura é também adequado para rastreio de proteínas de mamífero da superfície celular ou segregadas, tais como anticorpos. As bibliotecas de anticorpos podem ser exibidas na superfície de células de levedura com a finalidade de obter os anticorpos humanos contra um antigénio alvo. Esta abordagem é descrita por Yeung, et al., Biotechnol. Prog. 18(2):212-20 (2002); Boeder, E.T., et al., Nat. Biotechnol. 15(6):553-7 (1997). Alternativamente, as bibliotecas de anticorpos humanos podem ser expressas intracelularmente e rastreadas através do sistema de dois híbridos de levedura (WO 0200729A2).

Os fragmentos dos anticorpos anti-CSl, que retêm a especificidade de ligação a CS1, estão também incluídos na presente invenção. Os exemplos destes fragmentos de ligação ao antigénio incluem, mas não se lhes limitando, cadeias pesadas ou cadeias leves parciais ou completas, regiões variáveis, ou 44 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ regiões de CDR de quaisquer anticorpos anti-CSl aqui descritos.

Numa concretização preferida da invenção, os fragmentos de anticorpos (fragmentos de ligação ao antigénio) são cadeias truncadas (truncadas na extremidade carboxilo).

Preferivelmente, estas cadeias truncadas possuem uma ou mais actividades de imunoglobulina (e.g., actividade de fixação do complemento). Os exemplos de cadeias truncadas incluem, mas não se lhes limitando, fragmentos Fab (consistindo nos domínios VL, VH, CL e CHI); fragmentos Fd (consistindo nos domínios VH e CHI); fragmentos Fv (consistindo nos domínios VL e VH de uma única cadeia de um anticorpo); fragmentos dab (consistindo num domínio VH); regiões CDR isoladas; fragmentos (Fab')2 , fragmentos bivalentes (compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfureto na região de charneira). As cadeias truncadas podem ser produzidas por técnicas convencionais de bioquímica, tais como clivagem enzimática, ou técnicas de ADN recombinante, ambas conhecidas na especialidade. Estes fragmentos polipeptídicos podem ser produzidos por clivagem proteolítica de anticorpos intactos por métodos bem conhecidos na especialidade, ou por inserção de codões stop nas localizações desejadas nos vectores utilizando mutagénese dirigida ao local, tal como após CHI para produzir fragmentos Fab ou após a região de charneira para produzir fragmentos (Fab')2 · Os anticorpos de cadeia única podem ser produzidos por união de regiões de codificação de VL e VH com um ADN que codifica um ligante peptídico que liga os fragmentos de proteína VL e VH.

Como os genes relacionados com imunoglobulinas contêm regiões funcionais separadas, cada uma possuindo uma ou mais actividades biológicas distintas, os genes dos fragmentos de anticorpo podem ser fundidos com regiões funcionais de outros genes (e.g., enzimas, Patente U.S. 5,004,692, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade) para produzir proteínas de fusão (e.g., imunotoxinas) ou conjugados possuindo novas propriedades.

Os anticorpos utilizados na presente invenção compreendem anticorpos anti-CSl em imunotoxinas. Os conjugados que são imunotoxinas incluindo anticorpos foram amplamente descritos 45 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ na especialidade. As toxinas podem ser acopladas aos anticorpos por técnicas convencionais de acoplamento ou imunotoxinas contendo porções de proteínas de toxinas podem ser produzidas na forma de proteínas de fusão. Os conjugados da presente invenção podem ser utilizados de uma maneira correspondente para obter estas imunotoxinas. São ilustrativas destas imunotoxinas as descritas por Byers, B.S. et ai., Seminars Cell Biol 2:59-70 (1991) e por Fanger, M.W. et al.,

Immunol Today 12:51-54 (1991).

As técnicas de ADN recombinante podem ser utilizadas para produzir os anticorpos anti-CSl recombinantes, assim como os anticorpos anti-CSl quiméricos ou humanizados ou quaisquer outros anticorpos anti-CSl geneticamente alterados e os seus fragmentos ou conjugados, em quaisquer sistemas de expressão incluindo sistemas de expressão tanto procariotas como eucariotas, tais como bactérias, leveduras, células de insecto, células vegetais e células de mamífero (por exemplo, células NSO).

Uma vez produzidos, os anticorpos completos, os seus dimeros, cadeias leves e pesadas individuais, ou outras formas de imunoglobulinas da presente invenção, podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da especialidade, incluindo precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, electroforese em gel e similares (veja-se, genericamente, Scopes, R., Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)). São preferidas imunoglobulinas substancialmente puras com pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade, e são mais preferidas com 98 a 99% ou mais de homogeneidade, para utilizações farmacêuticas. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade conforme desejado, os polipéptidos podem então ser utilizados terapeuticamente (incluindo extracorporeamente) ou no desenvolvimento e realização de procedimentos de ensaio, colorações imunofluorescentes, e similares. (Veja-se, genericamente, Immunological Methods, Vols. I e II (Lefkovits e Pernis, eds., Academic Press, NY, 1979 e 1981) . Os anticorpos anti-CSl isolados ou purificados podem ser adicionalmente rastreados quanto à sua capacidade para neutralizar as actividades biológicas de CS1 como descrito nos Exemplos. 46 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Modelo estrutural de CS1 O quadro de leitura aberto do gene de CS1 humana (SEQ ID NO:l) codifica um polipéptido de 335 resíduos de aminoácido (SEQ ID NO:2). A sequência da proteína prevista tinha uma sequência de péptido de sinal putativa e um domínio extracelular de cerca de 225 resíduos de aminoácido, seguido por um único domínio transmembranar de cerca de 25 resíduos de aminoácido e um domínio intracelular de cerca de 85 resíduos de aminoácido. O domínio extracelular continha sete locais de glicosilação ligada a N putativos. A homologia da sequência da proteína prevista de CS1 indica que esta é um membro da superfamília de Ig. O alinhamento da sequência da proteína CS1 indica uma estrutura similar com muitos resíduos conservados comparativamente com outros receptores do subconjunto CD2. A região citoplasmática contém dois dos motivos de tirosina novos observados em 2B4 e SLAM.

Prevê-se que um modelo estrutural do domínio extracelular de CS1 consiste em dois domínios semelhantes a imunoglobulina. 0 domínio 1 N-terminal (domínio V) é um membro do subconjunto V, e o domínio 2 (domínio C2) um membro do subconjunto C2 de domínios semelhantes a imunoglobulina, como em CD2 (código PDB: 1HNF). O domínio extracelular está ligado na sua extremidade C-terminal ao domínio transmembranar que começa aproximadamente no resíduo de aminoácido 226.

No domínio V (de cerca do resíduo de aminoácido 23 até cerca do resíduo de aminoácido 122), Trp-53 no centro do domínio é conservada, e todos os resíduos na vizinhança imediata, ou são idênticos aos de CD2 (Leu-90 e Val-105), ou estão substituídos de forma conservativa (Tyr-120 por Phe em CD2) . Como em CD2, não existe ponte de dissulfureto intra-domínio no domínio V. No domínio C2 (de cerca do resíduo de aminoácido 128 até cerca do resíduo de aminoácido 225), as duas ligações dissulfureto intra-domínio são conservadas (Cys-151 - Cys-195; Cys-145 - Cys 215), e todos os resíduos na vizinhança imediata do primeiro, no centro do domínio, ou são idênticos aos de CD2 (Pro-131), ou estão substituídos de forma conservativa (Val-133, Ile-161, Leu-180 em CS1, por Ile, Leu e Ile respectivamente em CD2). A região ligante inter-domínios (de cerca do resíduo de aminoácido 123 até cerca do resíduo de 47 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ aminoácido 127) é também idêntica em comprimento entre CS1 e CD2 e apresenta alguma conservação (Val-Tyr-Glu-His-Leu em CS1 versus Ile-Gln-Glu-Arg-Val em CD2).

Existem sete potenciais locais de glicosilação ligada a N, dois no dominio V (Asn-56 e Asn-98), e cinco no domínio C2 (Asn-142, Asn-148, Asn-172, Asn-176 e Asn-204). A similaridade estrutural no contexto de sequências e motivos entre CS1 e proteínas definidas por antigénios CD sugere que as proteínas CS1 podem ser um alvo potencial para doenças tais como inflamação, cancro e desordens imunitárias. As utilizações terapêuticas de anticorpos anti-CSl, tais como anticorpos Luc, incluem inibição da produção de imunoglobulinas, inibição da função de leucócitos em doenças auto-imunes e em cancros que expressam proteínas CS1.

Utilização de ácidos nucleicos de CS1

Como descrito acima, as sequências de CS1 são inicialmente identificadas por homologia substancial da sequência de ácido nucleico e/ou de aminoácidos ou por ligação às sequências de CS1 da Tabela 2. Esta homologia pode ser baseada na globalidade da sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos, e é geralmente determinada utilizando programas de homologia ou condições de hibridação. Tipicamente, as sequências ligadas num ARNm são encontradas na mesma molécula. A percentagem de identidade de uma sequência pode ser determinada utilizando um algoritmo tal como BLAST. Um método preferido utiliza o módulo BLASTN de WU-BLAST-2 regulado para os parâmetros pré-estabelecidos, com extensão de sobreposição e fracção de sobreposição estabelecidas em 1 e 0,125, respectivamente. O alinhamento pode incluir a introdução de hiatos nas sequências a alinhar. Em adição, para sequências que contêm mais ou menos nucleótidos do que os dos ácidos nucleicos descritos, a percentagem de homologia pode ser determinada com base no número de nucleósidos homólogos em relação ao número total de nucleósidos. Assim, e.g., a homologia de sequências mais curtas do que as das sequências identificadas será determinada utilizando o número de nucleósidos na sequência mais curta. 48 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Numa concretização, a homologia do ácido nucleico é determinada através de estudos de hibridação. Assim, e.g., os ácidos nucleicos que hibridam sob elevado rigor com um ácido nucleico descrito, ou o seu complementar, ou é também encontrado nos ARNm de ocorrência natural, é considerado uma sequência homóloga. Em outra concretização, utilizam-se condições de hibridação menos rigorosas; e.g., podem utilizar-se condições de rigor moderado ou baixo; veja-se Ausubel, supra, e Tijssen, supra.

As sequências de ácido nucleico de CS1 da divulgação, e.g., as sequências na Tabela 2, podem ser fragmentos de genes maiores, e.g., são segmentos de ácido nucleico. "Genes" neste contexto inclui regiões codificantes, regiões não codificantes, e misturas de regiões codificantes e não codificantes. Deste modo, utilizando as sequências aqui proporcionadas, podem ser obtidas sequências alongadas, em qualquer dos sentidos, dos genes de CS1, utilizando técnicas bem conhecidas para clonagem quer de sequências mais longas quer de sequências de comprimento completo; veja-se Ausubel, et al., supra. Muito pode ser feito pela informática e muitas sequências podem ser agrupadas para incluir múltiplas sequências correspondentes a um único gene, e.g., sistemas tais como o UniGene.

Os ácidos nucleicos de CS1 da presente divulgação são utilizados de várias maneiras. Numa concretização, sondas de ácido nucleico para CS1 são preparadas e ligadas a biochips para serem utilizadas em métodos de rastreio e de diagnóstico, como delineado adiante, ou para administração, e.g., para aplicações em terapia génica, vacinas, ARNi e/ou anti-sentido. Alternativamente, os ácidos nucleicos de CS1 que incluem regiões codificantes de proteína CS1 podem ser colocados em vectores de expressão para a expressão de proteína CS1, novamente para fins de rastreio ou para administração a um paciente. serem para

Em outra concretização, nucleico para ácido nucleico ácido nucleico delineadas complementares). As sondas biochip são desenhadas são preparadas sondas de ácido de CS1 (tanto as sequências de nas figuras como/ou as suas de ácido nucleico fixadas ao substancialmente 49 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ complementares ao ácido nucleico de CS1, e.g., à sequência alvo (quer à sequência alvo da amostra quer a outras sequências de sondas, e.g., em ensaios em sanduíche), de modo que ocorre a hibridação da sequência alvo e das sondas da presente invenção. Como delineado adiante, esta complementaridade não precisa de ser perfeita; pode haver qualquer número de erros de emparelhamento de pares de bases que irá interferir com a hibridação entre a sequência alvo e os ácidos nucleicos de cadeia simples da presente divulgação. Contudo, se o número de mutações for tão grande que não possa ocorrer hibridação mesmo sob as condições de hibridação menos rigorosas, a sequência não é uma sequência alvo complementar. Assim, "substancialmente complementar" significa aqui que as sondas são suficientemente complementares às sequências alvo para hibridar sob condições reaccionais normais, particularmente condições de elevado rigor, como aqui delineado.

Uma sonda de ácido nucleico é geralmente de cadeia simples mas pode ser parcialmente de cadeia simples e parcialmente de cadeia dupla. O tipo de cadeia da sonda é ditado pela estrutura, pela composição e pelas propriedades da sequência alvo. Em geral, as sondas de ácido nucleico variam de cerca de 8-100 bases de comprimento, sendo preferido de cerca de 10-80 bases, e sendo particularmente preferido de cerca de 30-50 bases. Ou seja, geralmente não são utilizados genes completos. Em algumas concretizações, podem ser utilizados ácidos nucleicos muito mais longos, até centenas de bases.

Em outra concretização, utiliza-se mais do que uma sonda por sequência, sendo utilizadas, ou sondas sobrepostas, ou sondas para diferentes secções do alvo. Ou seja, são utilizadas duas, três, quatro ou mais sondas, sendo preferidas três, para construir uma redundância para um alvo particular. As sondas podem ser sobrepostas (e.g., possuir alguma sequência em comum), ou separadas. Em alguns casos, podem ser utilizados iniciadores de PCR para amplificar o sinal para uma maior sensibilidade.

Os ácidos nucleicos podem ser fixados ou imobilizados a um suporte sólido de várias maneiras. Por "imobilizado" e seus 50 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ equivalentes gramaticais, entenda-se aqui que a associação ou ligação entre a sonda de ácido nucleico e o suporte sólido é suficiente para ser estável sob as condições de ligação, lavagem, análise e remoção, como delineado. A ligação pode tipicamente ser covalente ou não covalente. Por "ligação não covalente" e equivalentes gramaticais entende-se aqui uma ou mais entre interacções electrostáticas, hidrófilas e hidrófobas. Está incluida na ligação não covalente a fixação covalente de uma molécula, e.g., estreptavidina ao suporte e a ligação não covalente da sonda biotinilada à estreptavidina. Por "ligação covalente" e equivalentes gramaticais entende-se aqui que as duas porções, o suporte sólido e a sonda, são fixados através de pelo menos uma ligação, incluindo ligações sigma, ligações pi e ligações de coordenação. As ligações covalentes podem ser formadas directamente entre a sonda e o suporte sólido ou podem ser formadas através de um reticulante ou por inclusão de um grupo reactivo específico no suporte sólido ou na sonda, ou em ambas as moléculas. A imobilização pode também envolver uma combinação de interacções covalentes e não covalentes.

Em geral, as sondas são fixadas ao biochip de várias maneiras. Como aqui descrito, os ácidos nucleicos podem ser primeiro sintetizados, com subsequente fixação ao biochip, ou podem ser directamente sintetizadas sobre o biochip. O biochip compreende um substrato sólido adequado. Por "substrato" ou "suporte sólido" ou outros equivalentes gramaticais entende-se aqui um material que pode ser modificado para a fixação ou associação das sondas de ácido nucleico e é susceptível a, pelo menos, um método de detecção. Frequentemente, o substrato pode conter locais discretos individuais apropriados para partição e identificação individuais. O número de substratos possíveis é muito grande, e estes incluem, mas não se lhes limitando, vidro e vidro modificado ou funcionalizado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon J, etc.), polissacáridos, nylon ou nitrocelulose, resinas, sílica ou materiais à base de sílica incluindo silício e silício modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos, plásticos, etc. Em geral, os substratos permitem 51 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ a detecção óptica e não fluorescem apreciavelmente. Veja-se WO 0055627.

Geralmente o substrato é planar, embora possam também ser utilizadas outras configurações de substratos. Por exemplo, as sondas podem ser colocadas sobre a superfície interior de um tubo para análise da amostra em fluxo contínuo para minimizar o volume da amostra. Similarmente, o substrato pode ser flexível, tal como uma espuma flexível, incluindo espumas de célula fechada feitas de plásticos particulares.

Numa concretização, a superfície do biochip e a sonda podem ser derivatizadas com grupos químicos funcionais para subsequente fixação das duas. Assim, e.g., o biochip é derivatizado com um grupo químico funcional incluindo, mas não se lhes limitando, grupos amino, grupos carboxi, grupos oxo e grupos tiol, sendo os grupos amino particularmente preferidos. Utilizando estes grupos funcionais, as sondas podem ser fixadas utilizando grupos funcionais nas sondas. Por exemplo, ácidos nucleicos contendo grupos amino podem ser fixados a superfícies compreendendo grupos amino, e.g., utilizando ligantes; e.g., ligantes homo- ou hetero-bifuncionais como é bem conhecido (veja-se o catálogo de 1994 de Pierce Chemical Company, secção técnica sobre reticulantes, páginas 155-200). Em adição, em alguns casos, podem ser utilizados ligantes adicionais, tais como grupos alquilo (incluindo grupos heteroalquilo e substituídos).

Nesta concretização, os oligonucleótidos são sintetizados, e depois fixados na superfície do suporte sólido. Quer o terminal 5' quer o 3' podem ser fixados ao suporte sólido, ou a fixação pode ser através de ligação a um nucleósido interno. Em outra concretização, a imobilização no suporte sólido pode ser muito forte, e no entanto não covalente. Por exemplo, podem ser preparados oligonucleótidos biotinilados que se ligam a superfícies covalentemente revestidas com estreptavidina, resultando a fixação.

Alternativamente, os oligonucleótidos podem ser sintetizados na superfície. Por exemplo, utilizam-se técnicas de fotoactivação utilizando compostos e técnicas de fotopolimerização. Em outra concretização, os ácidos nucleicos 52 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ podem ser sintetizados in situ, utilizando técnicas fotolitográficas conhecidas, tais como as descritas em WO 95/25116; WO 95/35505; Patentes U.S. 5,700,637 e 5, 445, 934; e referências ai citadas; estes métodos de fixação formam a base da tecnologia Affymetrix GENECHIP® (DNA Microarray chip).

Frequentemente, são realizados ensaios à base de amplificação para medir o nivel de expressão de sequências associadas a CS1. Estes ensaios são tipicamente realizados em conjunto com transcrição inversa. Nestes ensaios, uma sequência de ácido nucleico associada a CS1 actua como molde numa reacção de amplificação (e.g., Reacção em Cadeia pela Polimerase, ou PCR) . Numa amplificação quantitativa, a quantidade de produto de amplificação será proporcional à quantidade de molde na amostra original. Uma comparação com controlos apropriados proporciona uma medida da quantidade de ARN associado a CS1. Os métodos de amplificação quantitativa são bem conhecidos. São proporcionados protocolos detalhados de PCR quantitativa, e.g., em Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press.

Em algumas concretizações, utiliza-se um ensaio baseado em TAQMAN® (uma sonda oligonucleotídica fluorogénica) para medir a expressão. Os ensaios baseados em TAQMAN® utilizam uma sonda oligonucleotídica fluorogénica que contém um corante fluorescente a 5' e um agente extintor a 3'. A sonda híbrida com um produto de PCR, mas não pode ser, ela própria, alongada devido a um agente bloqueante na extremidade 3' . Quando o produto de PCR é amplificado em ciclos subsequentes, a actividade de 5'-nuclease da polimerase, e.g., AMPLITAQ® (ADN-polimerase), resulta na clivagem da sonda TAQMAN®. Esta clivagem separa o corante fluorescente a 5' e o agente extintor a 3', desse modo resultando um aumento de fluorescência em função da amplificação (veja-se, e.g., a literatura proporcionada por Perkin-Elmer).

Outros métodos de amplificação adequados incluem, mas não se lhes limitando, a reacção em cadeia pela ligase (LCR) (veja-se Wu e Wallace (1959) Genomics 4:560-569, Landegren, et al. (1988) Science 241:1077-1080, e Barringer, et ai. (1990) Gene 89:117-122), amplificação da transcrição (Kwoh, et al. 53 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173-1177), replicação de sequências auto-sustentada (Guatelli, et al. (1990) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 8 7:1874-1878), dot PCR, PCR com ligando adaptador, etc.

Expressão de proteína CS1 a partir de ácidos nucleicos

Numa concretização, o ácido nucleico de CS1, e.g., que codifica proteína CS1, é utilizado para preparar uma variedade de vectores de expressão para expressar proteína CS1 que pode então ser utilizada no desenvolvimento de reagentes para ensaios de diagnóstico como descrito adiante. Os vectores de expressão e a tecnologia de ADN recombinante são bem conhecidos (veja-se, e.g., Ausubel, supra, e Fernandez e Hoeffler (eds. 1999) Gene Expression Systems Academic Press) para expressar proteínas. Os vectores de expressão podem ser vectores extracromossómicos auto-replicantes ou vectores que se integram no genoma do hospedeiro. Geralmente, estes vectores de expressão incluem ácido nucleico regulador da transcrição e da tradução operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica a proteína CS1. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN utilizadas para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, e.g., incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucariotas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores.

Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, ADN para uma pré-sequência ou um comando de secreção estão operativamente ligados a ADN para um polipéptido se são expressos na forma de uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou um potenciador estão operativamente ligados a uma sequência de codificação se afectam a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se está posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a serem ligadas são contíguas, e, no caso de um comando de secreção, contíguas e em fase de leitura. Contudo, os potenciadores não precisam de 54 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ser contíguos. A ligação é tipicamente realizada por ligação em locais de restrição convenientes. Se estes locais não existirem, utilizam-se adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional. O ácido nucleico regulador da transcrição e da tradução será geralmente apropriado para a célula hospedeira utilizada para expressar a proteína CS1. São conhecidos numerosos tipos de vectores de expressão apropriados e sequências reguladoras adequadas para uma variedade de células hospedeiras.

Em geral, as sequências reguladoras da transcrição e da tradução podem incluir, mas não se lhes limitando, sequências promotoras, locais de ligação ao ribossoma, sequências de inicio e paragem da transcrição, sequências de inicio e paragem da tradução e sequências potenciadoras ou activadoras. Numa concretização, as sequências reguladoras incluem um promotor e sequências de início e paragem da transcrição.

As sequências promotoras podem ser promotores constitutivos ou indutíveis. Os promotores podem ser promotores de ocorrência natural ou promotores híbridos. Os promotores híbridos, que combinam elementos de mais do que um promotor, são também conhecidos, e são úteis na presente invenção.

Um vector de expressão pode compreender elementos adicionais. Por exemplo, o vector de expressão pode ter dois sistemas de replicação, o que desse modo lhe permite ser mantido em dois organismos, e.g., em células de mamífero ou de insecto para expressão e num hospedeiro procariota para clonagem e amplificação. Adicionalmente, para integração de vectores de expressão, o vector de expressão frequentemente contém pelo menos uma sequência homóloga ao genoma da célula hospedeira, e preferivelmente duas sequências homólogas que flanqueiam a construção de expressão. O vector integrante pode ser dirigido a um locus específico na célula hospedeira por selecção da sequência homóloga apropriada para inclusão no vector. Estão disponíveis construções para vectores integrantes. Veja-se, e.g., Fernandez e Hoeffler, supra; e Kitamura, et al. (1995) Proc. Nat '1 Acad. Sei. USA 92:9146- 9150 . 55 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Em adição, em outra concretização, o vector de expressão contém um gene marcador seleccionável para permitir a selecção de células hospedeiras transformadas. Os genes de selecção são bem conhecidos e variarão dependendo da célula hospedeira utilizada.

As proteínas CS1 da presente divulgação são usualmente produzidas por cultura de uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão contendo ácido nucleico que codifica uma proteína CS1, sob as condições apropriadas para induzir ou provocar a expressão da proteína CS1. As condições apropriadas para expressão da proteína CS1 variarão dependendo da escolha do vector de expressão e da célula hospedeira, e serão facilmente determinadas através de experimentação ou optimização de rotina. Por exemplo, a utilização de promotores constitutivos no vector de expressão irá requerer optimização do crescimento e da proliferação da célula hospedeira, enquanto a utilização de um promotor indutível requer as condições de crescimento apropriadas para indução. Em adição, em algumas concretizações, o momento da colheita é importante. Por exemplo, os sistemas de baculovirus utilizados em expressão em células de insecto são vírus líticos, e desse modo a selecção do momento da colheita pode ser crucial para o rendimento do produto.

As células hospedeiras apropriadas incluem levedura, bactérias, arqueobactérias, fungos e células de insecto e de animais, incluindo células de mamífero. Têm particular interesse a Saccharomyces cerevisiae e outras leveduras, E. coli, Bacillus subtilis, células Sf9, células C129, células 293, Neurospora, BHK, CHO, COS, células HeLa, HUVEC (células endoteliais humanas da veia umbilical), células THPl (uma linha celular de macrófagos), e várias outras células e linhas celulares humanas.

Numa concretização, as proteínas CS1 são expressas em células de mamífero. Podem ser utilizados sistemas de expressão de mamífero, e incluem sistemas retrovirais e adenovirais. Um sistema vector de expressão é um sistema vector retroviral tal como é geralmente descrito em PCT/US97/01019 e PCT/US97/01048. São particularmente úteis 56 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ como promotores de mamífero os promotores de genes virais de mamífero, pois os genes virais são frequentemente altamente expressos e possuem uma ampla gama de hospedeiros. Os exemplos incluem o promotor precoce de SV40, o promotor LTR de vírus de tumor mamário de ratinho, o promotor tardio principal de adenovírus, o promotor do vírus herpes simplex, e o promotor de CMV (veja-se, e.g., Fernandez e Hoeffler, supra). Tipicamente, sequências de terminação da transcrição e de poliadenilação reconhecidas por células de mamífero são regiões reguladoras localizadas a 3' do codão de paragem da tradução e assim, juntamente com os elementos promotores, flanqueiam a sequência de codificação. Os exemplos de terminadores da transcrição e sinais de poliadenilação incluem os que são derivados de SV40. Métodos de introdução de ácido nucleico exógeno em hospedeiros mamíferos, assim como em outros hospedeiros, estão disponíveis, e variarão dependendo da célula hospedeira utilizada. As técnicas incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, infecção virai, encapsulação do(s) polinucleótido(s) em lipossomas, e micro-injecção directa do ADN nos núcleos.

Em outra concretização, a proteína CS1 é expressa em sistemas bacterianos. Promotores de bacteriófagos podem também ser utilizados. Em adição, são igualmente úteis promotores sintéticos e promotores híbridos; e.g., o promotor tac é um híbrido das sequências promotoras trp e lac. Adicionalmente, um promotor bacteriano pode incluir promotores de ocorrência natural de origem não bacteriana que têm a capacidade de se ligarem a ARN-polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Em adição a uma sequência promotora em funcionamento, é desejável um local de ligação ao ribossoma eficiente. O vector de expressão pode também incluir uma sequência de péptido de sinal que proporciona a secreção da proteína CS1 em bactérias. A proteína é segregada para o meio de crescimento (bactérias Gram-positivas) ou para o espaço periplasmático, localizado entre a membrana interna e a externa da célula (bactérias Gram-negativas). O vector de expressão bacteriano pode também incluir um gene marcador seleccionável para permitir a selecção das estirpes bacterianas que foram transformadas. Os 57 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ genes de selecção adequados incluem genes que tornam as bactérias resistentes a fármacos tais como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina, neomicina e tetraciclina. Os marcadores seleccionáveis também incluem genes biossintéticos, tais como os das vias biossintéticas da histidina, do triptofano e da leucina. Estes componentes são montados em vectores de expressão. Os vectores de expressão para bactérias são bem conhecidos, e incluem vectores para Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris e Streptococcus lividans, entre outros (e.g., Fernandez e Hoeffler, supra). Os vectores de expressão bacterianos são transformados em células hospedeiras bacterianas utilizando técnicas tais como tratamento com cloreto de cálcio, electroporação, e outros.

Numa concretização, a proteína CS1 é produzida em células de insecto utilizando, e.g., vectores de expressão para a transformação de células de insecto, e em particular, vectores de expressão baseados em baculovírus.

Em outra concretização, a proteína CS1 é produzida em células de levedura. Os sistemas de expressão em levedura são bem conhecidos, e incluem vectores de expressão para Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans e C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis e K. lactis, Pichia guillerimondii e P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. A proteína CS1 pode também ser preparada na forma de uma proteína de fusão, utilizando técnicas disponíveis. Assim, e.g., para a criação de anticorpos monoclonais, se o epítopo desejado for pequeno, a proteína CS1 pode ser fundida com uma proteína transportadora para formar um imunogénio. Alternativamente, a proteína CS1 pode ser preparada na forma de uma proteína de fusão para aumentar a expressão, ou por outras razões. Por exemplo, quando a proteína CS1 é um péptido de CS 1, o ácido nucleico que codifica o péptido pode ser ligado a outro ácido nucleico para fins de expressão. A fusão com marcadores epitópicos de detecção pode ser feita, e.g., com FLAG, His6, myc, HA, etc. 58 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Em ainda outra concretização, a proteína CS1 é purificada ou isolada após expressão. A proteína CS1 pode ser isolada ou purificada de várias maneiras dependendo de que outros componentes estão presentes na amostra e dos requisitos para o produto purificado, e.g., conformação natural ou desnaturada. Os métodos padrão de purificação incluem precipitação com sulfato de amónio, técnicas electroforéticas, moleculares, imunológicas e cromatográficas, incluindo cromatografia de permuta iónica, hidrófoba, de afinidade e HPLC de fase inversa, e cromatofocagem. Por exemplo, a proteína CS1 pode ser purificada utilizando uma coluna padrão com anticorpo anti-proteína CS1. Técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunto com concentração de proteínas, são também úteis. Veja-se, e.g., Walsh (2002) Proteins: Biochemistry and Biotechnology Wiley; Hardin, et al. (eds. 2001) Cloning, Gene Expression and Protein Purification Oxford Univ. Press; Wilson, et al. (eds. 2000) Encyclopedia of Separation Science Academic Press; e Scopes (1993) Protein Purification Springer-Verlag. O grau de purificação necessário variará dependendo da utilização da proteína CS1. Em alguns casos não será necessária purificação.

Uma vez expressos e purificados se necessário, as proteínas CS1 e os ácidos nucleicos de CS1 são úteis em várias aplicações. Podem ser utilizados como reagentes de imunosselecção, como reagentes de vacinas, como agentes de rastreio, como entidades terapêuticas, para a produção de anticorpos, como inibidores de transcrição ou tradução, etc.

Variantes de proteínas CS1

Estão também incluídas numa concretização de proteínas CS1 as variantes de aminoácidos das sequências de ocorrência natural, como aqui determinado. Preferivelmente, as variantes são preferivelmente mais do que cerca de 75% homólogas à sequência de tipo selvagem, mais preferivelmente mais do que cerca de 80%, ainda mais preferivelmente mais do que cerca de 85%, e o mais preferivelmente mais do que 90%. Em algumas concretizações a homologia será tão elevada quanto cerca de 93-95% ou 98%. Tal como para os ácidos nucleicos, homologia neste contexto significa similaridade ou identidade de sequência, sendo preferida identidade. Esta homologia será 59 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ determinada utilizando técnicas padrão, como delineado acima para as homologias do ácido nucleico. A proteina CS1 da presente divulgação pode ser mais curta ou mais longa do que as sequências de aminoácidos de tipo selvagem. Assim, estão incluídas na definição de proteínas CS1 as porções ou fragmentos das presentes sequências de tipo selvagem. Em adição, como acima delineado, o ácido nucleico de CS1 da invenção pode ser utilizado para obter regiões codificantes adicionais, e desse modo uma sequência de proteina adicional.

Numa concretização, as proteínas CS1 são proteínas CS1 derivadas ou variantes em comparação com a sequência de tipo selvagem. Ou seja, como delineado adiante mais completamente, o péptido de CS1 derivado irá frequentemente conter pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácidos, sendo particularmente preferidas substituições de aminoácidos. A substituição, inserção ou deleção de aminoácidos pode ocorrer em muitas posições de resíduos no interior do péptido de CS1. possuem

Estão também incluídas numa concretização de proteínas CS1 da presente divulgação as variantes de sequência de aminoácidos. Estas variantes caiem tipicamente em uma ou mais de três classes: variantes de substituição, de inserção ou de deleção. Estas variantes vulgarmente são preparadas por mutagénese especifica do local de nucleótidos no ADN que codifica a proteína CS1, utilizando mutagénese por cassete ou por PCR ou outras técnicas, para produzir ADN que codifica a variante, e posteriormente expressão do ADN em cultura de células recombinantes como acima delineado. Contudo, podem ser preparados fragmentos de proteína CS1 variantes possuindo até cerca de 100-150 resíduos por síntese in vitro utilizando técnicas estabelecidas. As variantes de sequência de aminoácidos são caracterizadas pela natureza predeterminada da variação, uma caracteristica que as diferencia da variação alélica ou inter-espécies de ocorrência natural da sequência de aminoácidos da proteína CS1. As variantes tipicamente exibem uma actividade biológica qualitativa similar à de um análogo de ocorrência natural, embora possam também ser seleccionadas variantes que possuem caracteristicas modificadas. 60 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Embora ο local ou a região para introdução de uma variação na sequência de aminoácidos seja frequentemente predeterminada, a mutação per se não precisa de ser predeterminada. Por exemplo, de modo a optimizar o desempenho de uma mutação num determinado local, pode ser conduzida mutagénese aleatória no codão ou região alvo e as variantes de CS1 expressas podem ser rastreadas quanto à combinação óptima de actividade desejada. As técnicas para fazer mutações de substituição em locais predeterminados em ADN possuindo uma sequência conhecida são bem conhecidas, e.g., mutagénese por iniciador Ml3 e mutagénese por PCR. O rastreio de mutantes é frequentemente realizado utilizando ensaios de actividades da proteína CS1.

As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos únicos; as inserções usualmente serão da ordem de cerca de 1-20 aminoácidos, embora possam ser toleradas inserções consideravelmente mais longas. As deleções variam geralmente de cerca de 1-20 resíduos, embora em alguns casos as deleções possam ser muito mais longas.

Podem ser utilizadas substituições, deleções, inserções, ou suas combinações, para chegar a um derivado final. Geralmente, estas alterações são realizadas em poucos aminoácidos para minimizar a alteração da molécula. Contudo, podem ser toleradas alterações maiores em certas circunstâncias. Quando são desejadas pequenas alterações nas características da proteína CS1, as substituições são geralmente realizadas de acordo com as relações de substituição de aminoácidos descritas.

Tipicamente, as variantes exibem essencialmente a mesma actividade biológica qualitativa e eliciarão a mesma resposta imunitária que um análogo de ocorrência natural, embora também sejam seleccionadas variantes para modificar as características de proteínas CS1 conforme necessário. Alternativamente, a variante pode ser desenhada de modo a que uma actividade biológica da proteína CS1 seja alterada. Por exemplo, podem ser adicionados, alterados ou removidos locais de glicosilação. 61 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Alterações substanciais na função ou na identidade imunológica são por vezes realizadas por selecção de substituições que são menos conservat ivas do que as acima descritas. Por exemplo, podem ser feitas substituições que afectam mais significativamente: a estrutura do esqueleto polipeptídico na área da alteração, por exemplo a estrutura alfa-helicoidal ou de folha beta; a carga ou a hidrofobicidade da molécula no local alvo; ou o volume da cadeia lateral. As substituições que se espera geralmente que produzam as maiores alterações nas propriedades dos polipéptidos são aquelas em que (a) um resíduo hidrófilo, e.g., serina ou treonina, é substituído por (ou substitui) um resíduo hidrófobo, e.g., leucina, isoleucina, fenilalanina, valina ou alanina; (b) uma cisteína ou uma prolina é substituída por (ou substitui) outro resíduo; (c) um resíduo possuindo uma cadeia lateral electropositiva, e.g., lisina, arginina ou histidina, é substituído por (ou substitui) um resíduo electronegativo, e.g., ácido glutâmico ou aspártico; (d) um resíduo possuindo uma cadeia lateral volumosa, e.g., fenilalanina, é substituído por (ou substitui) um que não possui uma cadeia lateral, e.g., gl icina; ou (e) um resíduo de prolina é incorporado ou substitui outro, o que altera o grau de liberdade rotacional da ligação peptidilo.

As variantes tipicamente exibem uma actividade biológica qualitativa similar e irão eliciar a mesma resposta imunitária que o análogo de ocorrência natural, embora também sejam seleccionadas variantes para modificar as características das proteínas CS1 da pele conforme necessário. Alternativamente, a variante pode ser desenhada de modo a que a actividade biológica da proteína CS1 seja alterada. Por exemplo, podem ser alterados ou removidos locais de glicosilação.

Modificações covalentes de polipéptidos de CS1 estão incluídas no âmbito da presente invenção. Um tipo de modificação covalente inclui a reacção de resíduos de aminoácido alvo de um polipéptido de CS1 com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos N- ou C-terminais de um polipéptido de CS1. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticulação de polipéptidos de CS1 com uma matriz de suporte ou superfície 62 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ insolúveis em água para utilização num método para purificação de anticorpos anti-polipéptido de CS1 ou ensaios de rastreio, como é mais completamente descrito adiante. Os agentes reticulantes vulgarmente utilizados incluem, e.g., 1,1- bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeido, ésteres de N-hidroxissuccinimida, e.g., ésteres com ácido 4-azidos-salicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidilo tais como 3,3'-ditiobis(succinimidil-propionato), maleimidas bifuncionais tais como bis-N- maleimido-1,8-octano e agentes tais como metil-3-((p-azidofenil)ditio)propioimidato.

Outras modificações incluem desamidação de resíduos glutaminilo e asparaginilo nos correspondentes resíduos glutamilo e aspartilo, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serinilo, treonilo ou tirosilo, metilação dos grupos amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (e.g., pp. 79-86, Creighton (1992) Proteins: Structure and Molecular Properties Freeman), acetilação da amina N-terminal, e amidação de um grupo carboxilo C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente do polipéptido de CS1 compreende a alteração do padrão de glicosilação nativo do polipéptido. "Alteração do padrão de glicosilação nativo" significa para os presentes fins a deleção de uma ou mais porções hidrato de carbono encontradas num polipéptido de CS1 de sequência nativa, e/ou a adição de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no polipéptido de CS1 de sequência nativa. Os padrões de glicosilação podem ser alterados de muitas maneiras. Diferentes tipos de células para expressar sequências associadas a CS1 podem resultar em diferentes padrões de glicosilação. A adição de locais de glicosilação a polipéptidos de CS1 pode também ser realizada por alteração da sua sequência de aminoácidos. A alteração pode ser feita, e.g., pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina ao polipéptido de CS1 de sequência nativa (para locais de glicosilação ligada a O) . A sequência de aminoácidos de CS1 pode opcionalmente ser alterada através de alterações ao nível do ADN, particularmente por mutação do ADN que codifica o 63 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ polipéptido de CS1 em bases pré-seleccionadas de modo que sao gerados codões que se irão traduzir nos aminoácidos desejados.

Outro meio para aumentar o número de porções hidrato de carbono no polipéptido de CS1 é por acoplamento quimico ou enzimático de glicósidos ao polipéptido. Veja-se, e.g., WO 87/05330; pp. 259-306 em Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. A remoção de porções hidrato de carbono presentes no polipéptido de CS1 pode ser realizada química ou enzimaticamente ou por substituição, por mutação, de codões que codificam para resíduos de aminoácido que servem como alvos para glicosilação. São aplicáveis as técnicas de desglicosilação química. Veja-se, e.g., Sojar e Bahl (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52-57 e Edge, et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131-137. A clivagem enzimática de porções hidrato de carbono em polipéptidos pode ser realizada por utilização de uma variedade de endo- e exoglicosidases. Veja-se, e.g., Thotakura, et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350-359.

Outro tipo de modificação covalente de polipéptidos de CS 1 compreende a ligação do polipéptido de CS1 a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, e.g., polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, da maneira apresentada nas Patentes U.S. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ou 4,179,337. por

Os polipéptidos de CS1 da presente divulgação podem também ser modificados de maneira a formar moléculas quiméricas compreendendo um polipéptido de CS1 fundido com outro polipéptido ou sequência de aminoácidos heterólogos. Numa concretização, esta molécula quimérica compreende uma fusão de um polipéptido de CS1 com um polipéptido marcador que proporciona um epítopo ao qual um anticorpo anti-marcador pode ligar-se selectivamente. 0 marcador epitópico é geralmente colocado no terminal amino ou carboxilo do polipéptido de CS1. A presença destas formas marcadas com o epítopo de um polipéptido de CS1 pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Do mesmo modo, proporcionar o marcador epitópico permite que o polipéptido de CS1 seja prontamente purificado por purificação por afinidade 64 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao marcador epitópico. Numa concretização alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão de um polipéptido de CS1 com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica, esta fusão pode ser com a região Fc de uma molécula de IgG.

Estão disponíveis vários polipéptidos marcadores e seus anticorpos respectivos. Os exemplos incluem marcadores de poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly) ; marcadores de HIS6 e de quelação de metais, o polipéptido marcador HA da gripe e o seu anticorpo 12CA5 (Field, et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165); o marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan, et al. (1985) Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616); e o marcador glicoproteína D (gD) do vírus herpes Simplex e seu anticorpo (Paborsky, et al. (1990)

Protein Engineering 3(6):547-553). Outros polipéptidos marcadores incluem o péptido Flag (Hopp, et al. (1988)

BioTechnology 6:1204-1210); o péptido epitópico KT3 (Martin, et al. (1992) Science 255:192-194); o péptido epitópico tubulina (Skinner, et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:15163-15166); e o marcador peptídico de proteína do gene 10 de T7 (Lut z-Freyermuth, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6393-6397).

Estão também incluídas proteínas CS1 de outros organismos, tais como de chimpanzé, macaco cinomolgo e macaco rhesus, que são clonadas e expressas como delineado adiante. Assim, podem ser utilizadas sequências de sondas ou de iniciadores de Reacção em Cadeia pela Polimerase (PCR) degeneradas para encontrar outras proteínas CS1 relacionadas de seres humanos ou de outros organismos. As sequências de sondas e/ou de iniciadores de PCR particularmente preferidas incluem as áreas únicas da sequência de ácido nucleico de CS1. Os iniciadores de PCR preferidos têm cerca de 15- 35 nucleótidos de comprimento, sendo preferido cerca de 20-30, e podem conter inosina conforme necessário. As condições para a reacção PCR foram bem descritas (e.g., Innis, PCR Protocols, supra). 65 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Estão ainda incluídas proteínas CS1 quiméricas construídas de forma a conter segmentos de aminoácidos de diferentes organismos. Por exemplo, as proteínas CS1 quiméricas são construídas por fusão dos aminoácidos 1-67 de CS1 humana com os aminoácidos 68-224 de CS1 de ratinho, ou alternativamente fusão dos aminoácidos 1-151 de CS1 humana com os aminoácido 149-224 de CS1 de ratinho, ou ainda alternativamente fusão dos aminoácido 1-169 de CS1 humana com os aminoácidos 167-224 de CS1 de ratinho. Inversamente, as proteínas CS1 quiméricas são também construídas por fusão dos aminoácidos 1-67 de CS1 de ratinho com os aminoácido 68-227 de CS1 humana, ou alternativamente fusão dos aminoácido 1-131 de CS1 de ratinho com os aminoácido 135-227 de CS1 humana, ou ainda alternativamente fusão dos aminoácidos 1-166 de CS1 de ratinho com os aminoácido 170-227 de CS1 humana.

Em adição, as proteínas CS1 podem ser feitas de modo a serem mais longas do que as que são codificadas pelos ácidos nucleicos da Tabela 2, e.g., pela elucidação de sequências alongadas, a adição de marcadores epitópicos ou de purificação, a adição de outras sequências de fusão, etc.

As proteínas CS1 podem também ser identificadas como sendo codificadas por ácidos nucleicos de CS1. Assim, as proteínas CS1 são codificadas por ácidos nucleicos que irão hibridar com as sequências da listagem de sequências, ou suas complementares, como delineado adiante.

Parceiros de Ligação para Proteínas CS1 Anticorpos contra CS1

Os anticorpos contra CS1 da invenção ligam-se especificamente a proteínas CS1. "Ligar especificamente" significa aqui que os anticorpos se ligam à proteína com uma Kd de pelo menos cerca de 0,1 mM, mais usualmente pelo menos cerca de 1 μΜ, preferivelmente pelo menos cerca de 0,1 μΜ ou melhor, e o mais preferivelmente, 0,01 μΜ ou melhor. A selectividade da ligação ao alvo especifico e não a sequências relacionadas é frequentemente também importante.

Numa concretização, quando a proteína CS1 se destina a utilização para gerar parceiros de ligação, e.g., anticorpos para imunodiagnóstico, a proteína CS1 deverá partilhar pelo 66 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ menos um epítopo ou determinante com a proteína de comprimento completo. Por "epítopo" ou "determinante" entenda-se aqui tipicamente uma porção de uma proteína que irá gerar e/ou ligar um anticorpo ou receptor de células T no contexto do MHC. Assim, na maioria dos casos, os anticorpos criados contra uma proteína CS1 mais pequena serão capazes de se ligar à proteína de comprimento completo, particularmente epítopos lineares. Em outra concretização, o epítopo é único; ou seja, anticorpos gerados contra um epítopo único apresentam pouca ou nenhuma reactividade cruzada. Em ainda outra concretização, o epítopo é seleccionado entre a sequência de uma proteína estabelecida na tabela.

Existem métodos de preparação de anticorpos policlonais (e.g., Coligan, supra; e Harlow e Lane, supra). Os anticorpos policlonais podem ser criados num mamífero, e.g., através de uma ou mais injecções de um agente imunizante e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou o adjuvante serão injectados ao mamífero através de múltiplas injecções subcutâneas ou intraperitoneais. O agente imunizante pode incluir uma proteína codificada por um ácido nucleico da Tabela 2 ou um seu fragmento ou uma sua proteína de fusão. Pode ser útil conjugar o agente imunizante com uma proteína que se sabe ser imunogénica no mamífero que está a ser imunizado. Os exemplos destas proteínas imunogénicas incluem, mas não se lhes limitando, hemocianina de lapa Fissurella, albumina sérica, tiroglobulina bovina e inibidor de tripsina de soja. Os exemplos de adjuvantes que podem ser empregues incluem adjuvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (monofosforil-Lípido A, dicorinomicolato de trealose sintético). Podem ser utilizados vários protocolos de imunização.

Os anticorpos podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridomas, tais como os descritos por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. Num método de hibridoma, um ratinho, um hamster ou outro animal hospedeiro apropriado, é tipicamente imunizado com um agente imunizante para eliciar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão ligar-se especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser 67 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ imunizados in vitro. O agente imunizante incluirá tipicamente um polipéptido codificado por um ácido nucleico da tabela ou um seu fragmento, ou uma sua proteína de fusão. Geralmente, utilizam-se linfócitos de sangue periférico ("PBL") quando se pretendem células de origem humana, ou utilizam-se células do baço ou células dos nódulos linfáticos quando se pretendem fontes de mamífero não humanas. Os linfócitos são então fundidos com uma linha de células imortalizadas utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (e.g., pp. 59-103 em Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice Academic Press). As linhas de células imortalizadas são usualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de origem murina, bovina ou humana. Usualmente, empregam-se linhas celulares de rato ou de ratinho. As células de hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Por exemplo, se as células progenitoras não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias estas que previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

Numa concretização, os anticorpos são anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, preferivelmente humanos ou humanizados, que possuem especificidades de ligação para com pelo menos dois antigénios diferentes ou que possuem especificidades de ligação para com dois epítopos no mesmo antigénio. Numa concretização, uma das especificidades de ligação é para com uma proteína codificada por um ácido nucleico da tabela ou um seu fragmento, a outra é para com outro antigénio, e preferivelmente para com uma proteína ou um receptor ou subunidade de receptor da superfície celular, preferivelmente um que seja específico de CS1. Alternativamente, a tecnologia do tipo tetrâmeros pode criar reagentes multivalentes.

Em outra concretização, os anticorpos possuem níveis baixos ou nulos de fucose. Os anticorpos que não possuem fucose foram correlacionados com actividade de ADCC 68 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ (citotoxicidade celular dependente de anticorpos) aumentada, especialmente em doses baixas de anticorpo. Shields, R.L., et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa, T. et al., (2003), J. Biol. Chem. 278:3466. Os métodos de preparação de anticorpos sem fucose incluem crescimento em células YB2/0 de mieloma de rato (ATCC CRL 1662). As células YB2/0 expressam baixos níveis de ARNm de FUT8, que codifica uma enzima (a 1,6-fucosiltransferase) necessária para a fucosilação de polipéptidos.

Os métodos alternativos para aumentar a actividade de ADDC incluem mutações na porção Fc de um anticorpo contra CS1, particularmente mutações que aumentam a afinidade do anticorpo para com um receptor FcyR. Uma correlação entre ligação aumentada de FcyR e Fc mutado foi demonstrada utilizando ensaios à base de células de citoxicidade direccionada. Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem 276:6591-6604; Presta et al. (2002), Biochem Soc. Trans. 30:487-490. Os métodos para aumentar a actividade de ADCC através de mutações específicas na região Fc incluem as variantes de Fc compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido numa posição seleccionada do grupo que consiste em: 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 e 332, em que a numeração dos resíduos na região Fc é a do índice EU como em Kabat. Numa concretização preferida, as referidas variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição seleccionada do grupo que consiste em L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239T, S239H, S239Y, V240I, V240A, V240T, V240M, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L, F243Y, F243R, F243Q, P244H, P245A, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M, V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264Y, V264E, D265G, D265N, D265Q, D265Y, D265F, D265V, D265I, D265L, D265H, D265T, V266I, V266A, V266T, V266M, S267Q, S267L, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E, A298H, T299I, T299L, T299A, T299S, T299V, T299H, T299F, T299E, W313F, N325Q, N325L, N3251, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, A327N, A327L, L328M, L328D, L328E, L328N, L328Q, L328F, L328I, L328V, L328T, L328H, L328A, P329F, A330L, 69 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ Α330Υ, A330V, Α330Ι, A330F, A330R, Α330Η, I332D, Ι332Ε, Ι332Ν, I332Q, Ι332Τ, Ι332Η, Ι332Υ e Ι332Α, em que a numeração dos resíduos na região Fc é a do índice EU como em Kabat. As variantes de Fc podem também ser seleccionadas do grupo que consiste em V264L, V264I, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V264I, F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/ V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264P, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, I332E, L3238M/I332E, P244H, P245A, P247V, W313F, P2 4 4H/P2 45A/P2 4 7V, P247G, V264I/I332E, F241E/F243R/V262E/ V264R/I332E, F241E/F243Q/V262T/V264E/1332E, F241R/F243Q/V262T/ V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239B, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T299I, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, A330Y, 1332D, N297S, N297D, N297S/I332E, N297D/I332E, N297E/I332E, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, D265F/N297E/I332E, L328I/I332E, L328Q/I332E, I332N, I332Q, V264T, V264F, V240I, V263I, V266I, T299A, T299S, T299V, N325Q, N325L, N325I, S239D, S239N, S239F, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/ I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239N/1332N, S239N/I332Q, S239Q/I332D, S239Q/ I332N, S239Q/I332Q, Y296D, Y296N, F241Y/F243Y/V262T/V264T/ N297D/T332E, A330Y/I332E, V2641/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239T, S239H, S239Y, V240A, V240T, V240M, V263A, V263T, V263M, V264M, V264Y, V266A, V266T, V266M, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, A298H, T299H, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, L328D/I332E, L328E/I332E, L328N/I332E, L328Q/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328H/ I332E, L328I/I332E, L328A, I332T, I332H, I332Y, I332A, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E, 5239D/N297D/I332E, S239E/ N297D/I332E, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E, S23 9D/D265L/N2 9 7D/I332E, S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/D265Y/ N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, S239D/D265T/N297D/I332E, V264E/N297D/I332E, Y296D/N297D/I332E, Y296E/N297D/I332E, Y296N/N297D/I332E, Y296Q/IV297D/I332E, Y296H/N297D/I332E, Y296T/N297D/I332E, N297D/T299V/1332E, N297D/T299I/1332E, 70 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ N297D/T299L/I332E, N297D/T299F/I332E, N297D/T299H/I332E, N297D/T299E/I332E, N297D/A330Y/I332E, N297D/S298A/A330Y/1332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, e S239D/264I/A330L/I332E, em que a numeração dos resíduos na região Fc é a do índice EU como em Kabat. Veja-se também PCT WO 2004/029207, 8 de Abril, 2004. A actividade de ADCC associada a anticorpos pode ser monitorada e quantificada através da medição da libertação de lactato-desidrogenase (LDH) no sobrenadante, que é rapidamente libertada após danos na membrana plasmática.

Outras concretizações alternativas para a promoção da citotoxicidade de células com tratamento com anticorpos incluem estimulação mediada por anticorpos de cascatas de sinalização que resulta em morte celular para a célula ligada pelo anticorpo. Em adição, a estimulação mediada por anticorpos do sistema imunitário inato (e.g. através de células NK) pode também resultar na morte de células tumorais ou células viralmente infectadas.

Detecção da sequência de CS1 para aplicações em diagnóstico

Num aspecto, os niveis de expressão de ARN de genes são determinados para diferentes estados celulares no fenótipo da desordem auto-imune ou cancerosa, e.g. mieloma. Os níveis de expressão de genes em tecido normal (e.g., que não têm uma desordem) e em tecido doente (e em alguns casos, para várias gravidades de desordens que se relacionam com prognóstico, como delineado adiante) são avaliados para proporcionar perfis de expressão. Um perfil de expressão de um gene de um estado celular ou ponto de desenvolvimento particulares, é essencialmente uma "impressão digital" do estado da célula. Embora dois estados possam ter um gene particular similarmente expresso, a avaliação de vários genes simultaneamente permite a geração de um perfil de expressão génica que é reflectivo do estado da célula. Por comparação dos perfis de expressão de células em diferentes estados, obtém-se informação sobre que genes são importantes (incluindo supra- e infra-regulação de genes) em cada um destes estados. Então, pode ser realizado ou confirmado o diagnóstico para determinar se uma amostra de 71 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ tecido possui ο perfil de expressão génica do tecido normal ou doente. Isto irá proporcionar o diagnóstico molecular de condições relacionadas. "Expressão diferencial" ou equivalentes gramaticais, como aqui se utilizam, referem-se a diferenças qualitativas ou quantitativas nos padrões temporais e/ou celulares de expressão génica dentro e entre células e tecido. Assim, um gene expresso diferencialmente pode ter qualitativamente a sua expressão alterada, incluindo uma activação ou uma inactivação, e.g., em tecido normal versus doente. Os genes podem ser "ligados" ou "desligados" num estado particular, relativamente a outro estado, desse modo permitindo a comparação de dois ou mais estados. Um gene qualitativamente regulado irá exibir um padrão de expressão dentro de um estado ou tipo celular que é detectável por técnicas padrão. Alguns genes serão expressos num estado ou num tipo celular, mas não em ambos. Alternativamente, a diferença na expressão pode ser quantitativa, e.g., na medida em que a expressão é aumentada ou diminuída; e.g., a expressão do gene é supra-regulada, resultando uma quantidade aumentada de transcrito, ou infra-regulada, resultando uma quantidade diminuída de transcrito. O grau em que a expressão difere apenas precisa de ser suficientemente grande para quantificar através de técnicas de caracterização padrão como delineado adiante, tal como por utilização de arrays de expressão Affymetrix GENECHIP® (DNA microchip array). Veja-se, Lockhart (1996) Nature Biotechnology 14:1675-1680. Outras técnicas incluem, mas não se lhes limitando, PCR quantitativa com transcritase inversa, análise de Northern e protecção de ARNase. Como delineado acima, preferivelmente a alteração na expressão (e.g., supra-regulação ou infra-regulação) é de pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 150%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 200%, sendo especialmente preferido de 300 a pelo menos 1000%. A avaliação pode ser ao nível do transcrito do gene ou ao da proteína. A quantidade de expressão génica pode ser monitorada utilizando sondas de ácido nucleico para o ARN ou o ADN equivalente do transcrito do gene, e a quantificação dos níveis de expressão génica, ou, alternativamente, do próprio 72 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ produto génico final (proteína) pode ser monitorada, e.g., com anticorpos para a proteína CS1 e imunoensaios padrão (ELISA, etc.) ou outras técnicas, incluindo ensaios por espectroscopia de massa, ensaios de electroforese em gel 2D, etc. As proteínas que correspondem a CS1, e.g., as identificadas como sendo importantes num fenótipo de doença, podem ser avaliadas num teste de diagnóstico da doença. Em outra concretização, a monitoração da expressão génica é realizada simultaneamente em vários genes. Pode também ser realizada a monitoração da expressão de múltiplas proteínas.

Nesta concretização, as sondas de ácido nucleico de CS1 são fixadas em biochips como aqui delineado para a detecção e quantificação de sequências de CS1 num célula particular. Os ensaios são adicionalmente descritos adiante no exemplo. Podem ser utilizadas técnicas de PCR para proporcionar maior sensibilidade.

Numa concretização são detectados ácidos nucleicos que codificam CS1. Embora possam ser detectados ADN ou ARN que codificam a proteína CS1, têm particular interesse os métodos em que é detectado um ARNm que codifica uma proteína CS1. As sondas para detectar ARNm podem ser uma sonda nucleotídica/desoxinucleotídica que é complementar a, e híbrida com, o ARNm e incluem, mas não se lhes limitam, oligonucleótidos, ADNc ou ARN. As sondas também deverão conter um marcador detectável, como aqui definido. Num método, o ARNm é detectado após imobilização do ácido nucleico a examinar num suporte sólido tal como membranas de nylon e hibridação da sonda com a amostra. Após lavagem para remover a sonda ligada não especificamente, é detectado o marcador. Em outro método, a detecção do ARNm é realizada in situ. Neste método, amostras de células ou tecido permeabilizadas são colocadas em contacto com uma sonda de ácido nucleico marcada de forma detectável durante tempo suficiente para permitir que a sonda hibride com o ARNm alvo. Após lavagem para remover a sonda não especificamente ligada, o marcador é detectado. Por exemplo uma ribo-sonda (sonda de ARN) marcada com digoxigenina que é complementar ao ARNm que codifica uma proteína de mieloma é detectada por ligação da digoxigenina a um anticorpo secundário anti-digoxigenina e revelação com nitro-azul de tetrazólio e fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo. 73 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Em outra concretização são utilizadas em ensaios de diagnóstico várias proteínas das três classes de proteínas aqui descritas (proteínas segregadas, transmembranares ou intracelulares). As proteínas, anticorpos, ácidos nucleicos, proteínas modificadas de CS1, e células contendo sequências de CS1, são utilizados em ensaios de diagnóstico. Isto pode ser realizado ao nivel do gene individual ou do correspondente polipéptido. Numa concretização, utilizam-se os perfis de expressão, preferivelmente em conjunto com técnicas de rastreio de alto rendimento, para permitir a monitoração do perfil de expressão de genes e/ou dos polipéptidos correspondentes.

Como aqui descrito e definido, a proteína CS1 é útil como um marcador de doença para desordens auto-imunes, tais como LES, AR e Dl I, e condições cancerosas, tais como mieloma e leucemia de células plasmáticas. Adicionalmente, a CS1 é útil como um marcador para fins de prognóstico ou diagnóstico. A detecção destas proteínas em tecido doente putativo permite a detecção, o prognóstico ou o diagnóstico destas condições, e a selecção da estratégia terapêutica. Numa concretização, utilizam-se anticorpos para detectar CS1. Um método preferido separa proteínas de uma amostra por electroforese num gel (tipicamente um gel desnaturante e redutor de proteínas, mas pode ser outro tipo de gel, incluindo géis de focagem isoeléctrica e similares). Após a separação das proteínas, a CS1 é detectada, e.g., por imunotransferência com anticorpos criados contra CS1.

Em outro método, os anticorpos contra CS1 são úteis em técnicas de imagiologia in situ, e.g., em histologia. Veja-se, e.g., Asai, et al. (eds. 1993) Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology (vol. 37) Academic Press. Neste método, as células são colocadas em contacto com, de um a muitos, anticorpos contra a(s) proteína(s) de mieloma. Após lavagem para remover ligação não específica do anticorpo, a presença do anticorpo ou dos anticorpos é detectada. Numa concretização o anticorpo é detectado por incubação com um anticorpo secundário que contém um marcador detectável. Num outro método o anticorpo primário contra CS1 contém um marcador detectável, e.g., um marcador enzimático que pode 74 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ actuar sobre um substrato. Em outra concretização cada um de múltiplos anticorpos primários contém um marcador detectável e distinto. Este método é particularmente útil no rastreio simultâneo de CS1 juntamente com outros marcadores das condições supramencionadas. Muitas outras técnicas de imagiologia histológica são também proporcionadas pela divulgação.

Numa concretização o marcador é detectado num fluorómetro que tenha a capacidade para detectar e distinguir emissões de diferentes comprimentos de onda. Em adição, pode ser utilizado no método um selector de células activadas por fluorescência (FACS).

Em outra concretização, os anticorpos são úteis no diagnóstico de desordens auto-imunes, tais como LES, AR e DII, e do cancro, tal como mieloma e leucemia de células plasmáticas, a partir de sangue, soro, plasma, fezes e outras amostras. Estas amostras, portanto, são úteis como amostras a analisar ou testar quanto à presença de CS1. Os anticorpos podem ser utilizados para detectar CS1 por técnicas de imunoensaio previamente descritas incluindo ELISA, imunotransferência (Western blotting) , imunoprecipitação, tecnologia BIACORE e similares. Pelo contrário, a presença de anticorpos pode indicar uma resposta imunitária contra uma proteína CS1 endógena.

Em outra concretização é realizada a hibridação in situ, de sondas de ácido nucleico de CS1 marcadas, a arranjos ("arrays") de tecidos. Por exemplo, são preparados arrays de amostras de tecidos, incluindo tecido doente e/ou tecido normal. É então realizada a hibridação in situ (veja-se, e.g., Ausubel, supra). Quando se comparam as "impressões digitais" entre um indivíduo e um padrão, pode-se basear um diagnóstico, um prognóstico ou uma previsão nas verificações. Entenda-se ainda que os genes que indicam o diagnóstico podem diferir daqueles que indicam o prognóstico e a determinação do perfil molecular da condição das células pode conduzir a distinções entre condições responsivas ou refractárias ou pode ser preditiva de desenlaces. 75 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Numa concretização, proteínas, anticorpos, ácidos nucleicos, proteínas modificadas de CS1, e células contendo sequências de CS1, são utilizados em ensaios de prognóstico. Como acima, podem ser gerados perfis de expressão génica que se correlacionam com um estado de doença, informação clínica, patológica, ou outra informação, em termos de prognóstico de longo termo. Novamente, isto pode ser realizado quer ao nível da proteína quer ao nível do gene, sendo preferida a utilização de genes. Genes únicos ou múltiplos podem ser úteis em várias combinações. Como acima, sondas de CS1 podem ser fixadas em biochips para a detecção e quantificação de sequências de CS1 num tecido ou num paciente. Os ensaios prosseguem como delineado acima para o diagnóstico. O método de PCR pode proporcionar uma quantificação mais sensível e precisa.

Os genes úteis em ensaios de prognóstico são genes que são diferencialmente expressos de acordo com o estágio da doença do paciente. Numa concretização, os genes podem ser expressos de forma única de acordo com o estádio do paciente. Em outra concretização, os genes podem ser expressos em níveis diferenciais de acordo com o estágio do paciente. Por exemplo, no mieloma, os pacientes são atribuídos a três estádios diferentes de acordo com a extensão e a localização da doença: Estádios I, II e III. No Estádio I, os sintomas são moderados a não existentes, com muitos pacientes apresentando ausência de sintomas de mieloma. Um diagnóstico positivo é a presença de células tumorais; contudo, o número de glóbulos vermelhos do sangue é normal ou ligeiramente abaixo da gama normal, não há aumento detectável do cálcio no sangue, existem níveis muito baixos de proteína M no sangue ou na urina, e não é possível observar danos detectáveis nos ossos com raios-X. No Estádio II, as células cancerosas são prevalecentes em números maiores. A função renal pode estar afectada, o que agrava o diagnóstico do prognóstico para a maioria dos pacientes. O Estádio III revela anemia, hipercalcemia, danos avançados nos ossos e níveis elevados de proteína M no sangue e na urina. A correlação entre a expressão de proteína e os diferentes estádios na desordem auto-imune pode também provar-se útil para a determinação do prognóstico destas desordens. A correlação entre os genes expressos nos diferentes estádios, quer expressos de forma única quer tendo níveis de expressão 76 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ diferenciais de acordo com o estádio, pode ser utilizada para determinar a viabilidade da indução de remissão num paciente. Isto seria especialmente útil nos estádios iniciais da doença, onde pacientes de mieloma exibem menos sintomas. Em adição, os genes que são expressos indicando o inicio de complicações de longo termo, tais como o da beta-2 microglobulina (indicador de danos nos rins), assim como níveis séricos elevados de albumina e lactato-desidrogenase, podem também ser úteis como ferramenta de prognóstico. A correlação entre os genes expressos em diferentes estádios, quer expressos de forma única, quer possuindo níveis de expressão diferenciais de acordo com o estádio, pode também ser monitorada para determinar a eficácia do tratamento utilizando a terapêutica divulgada na presente invenção. Por exemplo, os pacientes tratados com antagonistas da presente invenção podem ser monitorados quanto à eficácia terapêutica dos referidos antagonistas através da monitoração de marcadores, incluindo por exemplo, CS1 ou CS1 em combinação com marcadores específicos da desordem (e.g. a monitoração de proteína M para o tratamento do mieloma. A monitoração destes marcadores específicos será importante na determinação da eficácia da terapêutica da invenção, assim como na determinação de considerações sobre a dosagem e o método de tratamento para as diferentes indicações da presente invenção.

Indução de desordens de doença como sistemas modelo in vivo Doença inflamatória do intestino

Foram desenvolvidos modelos experimentais in vivo para a investigação de processos patológicos de doença inflamatória do intestino. Sartor RB, Aliment. Pharmacol. Ther. 11:89-96 (1997). Por exemplo, podem ser criados ratinhos transgénicos knock-out, em que o gene da doença inflamatória do intestino está corrompido ou em que um gene de doença inflamatória do intestino é inserido. Os ratinhos transgénicos knock-out podem ser criados por inserção de um gene marcador ou outro gene heterólogo no local do gene endógeno da doença inflamatória do intestino no genoma do ratinho por via de recombinação homóloga. Estes ratinhos podem também ser criados substituindo o gene endógeno da doença inflamatória do intestino por uma versão mutada do gene da doença inflamatória do intestino, ou 77 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ por mutação do gene endógeno da doença inflamatória do intestino, e.g., por exposição a carcinogéneos.

Uma construção de ADN é introduzida nos núcleos de células estaminais embrionárias. As células contendo a lesão genética recém-manipuladas são injectadas num embrião de ratinho hospedeiro, que é reimplantado num beneficiário fêmea. Alguns destes embriões desenvolvem-se em ratinhos quiméricos que possuem células germinais parcialmente derivadas da linha celular mutante. Portanto, fazendo reproduzir os ratinhos quiméricos é possível obter uma nova linha de ratinhos contendo a lesão genética introduzida (veja-se, e.g.,

Capecchi, et ai. (1989) Science 244:1288-1292). Os ratinhos quiméricos alvo podem ser derivados de acordo com Hogan, et ai. (1988) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual CSH Press; e Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, Washington, D.C.

Outros modelos podem ser construídos utilizando manipulação não genética de modelos animais. Um modelo em particular foi utilizado extensivamente em rastreio de moléculas pequenas. Este modelo induz colite em ratos ou ratinhos através de uma única provocação intracolónica com uma solução do hapteno ácido 2,4,-trinitrobenzenossulfónico (TNBS). Morris GP et ai., Gastroenterology 96:795-803 (1989);

Boughton-Smith NK, Br. J. Pharmacol. 94:65-72 (1988). O tratamento com TNBS produz uma intensa resposta inflamatória local que atinge o ser nadir após 2 a 3 dias, e pode durar até 21 dias, dependendo da gravidade da provocação.

Considera-se que a resposta inflamatória produzida pelo tratamento com TNBS reproduz muitos dos marcadores macroscópicos, histológicos e imunológicos da doença de Crohn. Grisham MB et ai., Gastroenterology 101:540-547 (1991); Yamada Y et al., Gastroenterology 102:524-534 (1992); Torres MI et al., Dig. Dis. Sei 44:2523-29 (1999); Neruath M, Fuss I, Strober W, Int. Rev. Immunol. 19:51-62 (2000). Observa-se ulceração aberta, com inflamação transmural e espessamento da parede intestinal. As características histológicas incluem arquitectura da cripta distorcida, atrofia da cripta, 78 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ granulomas, células gigantes, agregados linfóides basais e a presença de um infiltrado inflamatório. O modelo foi utilizado para estudar e validar inflamação colónica, e abordar aspectos da doença inflamatória do intestino. Hoffman P et al., Gut 41:195-202 (1997); Jacobson K, McHugh K, Collins SM, Gastroenterology 112:156-62 (1997).

Outros modelos animais incluem ratos transgénicos HLA-B27 (Hammer RE et al., "Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and Human b2M: An animal model of HLA-B27 associated human disorders", Cell 63:1088-1112 (1990)), ratinhos transgénicos deficientes em IL-2 (Baumgart DC et al., "Mechanisms of intestinal epithelial cell injury and colitis in interleukin 2 deficient mice", Cell Immunol. 187:52-66 (1998)), ratinhos deficientes em mdrla (Panwala CM et al., "A Novel Model of Inflammatory Bowel Disease: Mice deficient for the multiple drug resistance gene, mdrla, spontaneously develop colitis", J. Immunol. 161:5733-44 (1998)), e ratinhos deficientes em IL 10 (Freeman HJ, "Studies on the interleukin-10 gene in animal models of colitis", Canadian Gastroenterology (2003)).

Mieloma

Foram desenvolvidos modelos experimentais in vivo para a investigação de processos patológicos de mieloma. Sartor RB, Aliment. Pharmacol. Ther. 11:89-96 (1997). Por exemplo, podem ser criados ratinhos transgénicos knock-out, em que o gene do mieloma está corrompido ou em que um gene de mieloma é inserido. Os ratinhos transgénicos knock-out podem ser criados por inserção de um gene marcador ou outro gene heterólogo no local do gene endógeno de mieloma no genoma do ratinho por via de recombinação homóloga. Estes ratinhos podem também ser criados substituindo o gene endógeno de mieloma por uma versão mutada do gene de mieloma, ou por mutação do gene endógeno de mieloma, e.g., por exposição a carcinogéneos. É introduzida uma construção de ADN nos núcleos de células estaminais embrionárias. As células contendo a lesão genética recém-manipuladas são injectadas num embrião de ratinho hospedeiro, que é reimplantado num beneficiário fêmea. Alguns destes embriões desenvolvem-se em ratinhos quiméricos 79 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ que possuem células germinais parcialmente derivadas da linha celular mutante. Portanto, fazendo reproduzir os ratinhos quiméricos é possível obter uma nova linha de ratinhos contendo a lesão genética introduzida (veja-se, e.g., Capecchi, et ai. (1989) Science 244:1288-1292). Os ratinhos quiméricos alvo podem ser derivados de acordo com Hogan, et al. (1988) "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual" CSH Press; e Robertson (ed. 1987) "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach" IRL Press, Washington, D.C.

Outros modelos podem ser construídos utilizando manipulação não genética de modelos animais. Por exemplo, injectando ratinhos C57BL/6J com tumores de células B (e.g. células LLC) pode-se induzir metástase nos pulmões. Outros modelos animais utilizam ratinhos SCID e injectam linhas tumorais de células B (e.g. células HsSultan (ATCC) ou linhas de mieloma múltiplo, (por exemplo mas não se lhes limitando, L363, LP-1, OPM-2 ou RPMI 8226) para induzir características do tipo do mieloma. Ainda outros modelos animais incluem um modelo de ratinho NOD/SCID para mieloma múltiplo humano gerado por implantação de ossos fetais humanos (FB) em locais subcutâneos de ratinhos NOD/SCID, seguida por inoculação com células mononucleares de medula óssea primárias obtidas de pacientes com mieloma múltiplo nos FB. Veja-se Shang-Yi H., et al., Amer. J. Invest. Pathol. 164:747-756 (2004). Podem também ser utilizados modelos de plasmocitoma de ratinho, cuja formação é induzida através de tratamento com óleo pristano (2,6,10,12-tetrametilpentadecano). Em adição, podem também ser utilizados modelos de ratinho em que a injecção de células de mieloma é directa na medula óssea (modelo de injecção ortotópica) de ratinhos SCID, SCID/bege ou NOD/SCID.

As células que sofrem transformação, como nas células de mieloma, libertam uma quantidade maior de determinados factores (doravante "marcadores específicos de mieloma") do que as suas contrapartidas normais. Por exemplo, CD38, CD9, CD10, HLA-DR e CD20 têm expressão acrescida em células de mieloma. Ruiz-Arugelles GJ e San Miguel JF, "Cell Surface Markers in Multiple Myeloma", Mayo Clin. Proc. 69:684-90 (1994). 80 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ Várias técnicas que medem a libertação destes factores estão descritas em Freshney (1998), supra. Vejam-se também, Unkeless, et al. (1974) J. Biol. Chem. 249:4295-4305;

Strickland e Beers (1976) J. Biol. Chem. 251:5694-5702; Whur, et al. (1980) Br. J. Câncer 42:305-312; Gullino "Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumour growth" pp. 178-184 em Mihich (ed. 1985) Biological Responses in Câncer Plenum; Freshney (1985) Câncer Res. 5:111-130. Métodos Terapêuticos Tratamento de doença auto-imune

Num aspecto, a presente divulgação é dirigida a um método de redução da proliferação, adesão, diferenciação, activação e/ou co-activação de leucócitos, compreendendo o contacto dos leucócitos com um antagonista de CS1 aqui descrito.

Noutro aspecto, a presente divulgação é dirigida a um método de redução da secreção (ou produção) de imunoglobulina por linfócitos (tais como células B), compreendendo o contacto dos linfócitos com um antagonista de CS1 aqui descrito. Os antagonistas da presente invenção podem reduzir a produção de imunoglobulina (tal como, IgM, IgG, IgD, IgA e IgE) em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%. A percentagem de alteração é calculada subtraindo a concentração de imunoglobulina antes da administração da primeira dose do anticorpo (dia 0) da concentração de imunoglobulina após a dose (dia x) , dividindo pela concentração de imunoglobulina anterior à primeira dose (dia 0), e multiplicando por 100, e.g., [(dia x - dia 0)/ dia 0] X 100.

Em ainda outro aspecto, a presente divulgação é dirigida a um método de indução de apoptose ou citólise de células que expressam CS1 compreendendo o contacto das células com um anticorpo contra CS1 aqui descrito. Numa concretização preferida, a indução é conseguida por via de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Em geral, os anticorpos da presente divulgação ligam-se a antigénios na superfície de células alvo (células que expressam CS1) na presença de células efectoras (tais como células assassinas naturais ou macrófagos). Os receptores de Fc em células efectoras reconhecem anticorpos ligados. A ligação cruzada de receptores de Fc assinala as células efectoras para matar as 81 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ células alvo por citólise ou apoptose. A citólise pode ser detectada por via da detecção da libertação de marcador ou de lactato-desidrogenase pelas células lisadas, ou por detecção de viabilidade reduzida das células alvo (e.g. ensaio com anexina). Os ensaios para a apoptose podem ser realizados pelo ensaio TUNEL de marcação de extremidade por cortes com digoxigenina-11-dUTP mediada por desoxinucleotidil-transferase terminal (terminal dUTP-mediated nick end labeling) (Lazebnik et ai., Nature: 371, 346 (1994). A citotoxicidade pode também ser detectada directamente por kits de detecção conhecidos na especialidade, tais como o Kit de Detecção de Citotoxicidade da Roche Applied Science (Indianapolis, IN). Preferivelmente, os anticorpos da presente divulgação induzem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou 80% de citotoxicidade das células alvo. A percentagem é calculada pelos métodos divulgados nos Exemplos.

Os antagonistas podem entrar em contacto com os leucócitos in vitro (tal como, por adição dos antagonistas num ambiente de cultura celular onde os leucócitos são cultivados), ex vivo, ou in vivo (por exemplo, por administração dos antagonistas a um indivíduo).

Numa concretização preferida, os leucócitos são a) linfócitos activados, tais como células B e/ou células T, preferivelmente células B CD19+ e/ou células T CD3+; b) células CD14+ activadas e/ou naive; c) células dendríticas activadas e/ou não activadas; e/ou c) células NK CD56+ e/ou NKT.

Num aspecto preferido, a presente divulgação proporciona um método de redução da secreção de imunoglobulina por células B, num indivíduo disso necessitado, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de CS1 ao referido indivíduo

Em outro aspecto preferido a presente divulgação proporciona um método de indução de citotoxicidade, citólise, e/ou apoptose de células que expressam CS1 num indivíduo disso necessitado, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo contra CS1 ao referido indivíduo 82 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Os antagonistas, preferivelmente anticorpos da presente divulgação, podem ser utilizados para a prevenção ou tratamento de doenças auto-imunes, incluindo, mas não se lhes limitando, doença de Addison, doenças auto-imunes do ouvido, doenças auto-imunes do olho tais como uveite, hepatite auto-imune, doença de Crohn, diabetes (Tipo I), epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, sindrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolitica, lúpus eritematoso sistémico (LES), esclerose múltipla, miastenia grave, pênfigo vulgar, psoriase, artrite reumatóide, sarcoidose, esclerodermia, psoriase, sindrome de Sjogren, espondiloartropatias, tiroidite, colite ulcerativa e/ou vasculite.

Numa concretização preferida, a doença auto-imune que pode ser prevenida e/ou tratada com os métodos da presente divulgação é LES, AR ou DII. Após administração a um indivíduo que desenvolveu os sintomas de LES, AR ou DII, os anticorpos anti-CSl deverão ser capazes de reduzir a gravidade dos sintomas. Alternativamente, os anticorpos anti-CSl podem ser administrados a um indivíduo antes do indivíduo ter desenvolvido quaisquer manifestações clínicas de LES, AR ou DII. Esta administração preventiva dos anticorpos deverá prevenir completamente o desenvolvimento no indivíduo de quaisquer sintomas de LES, AR, ou DII ou pelo menos prevenir o desenvolvimento no indivíduo de sintomas tão graves como na condição sem o tratamento com o anticorpo. A gravidade dos sintomas de LES, AR ou DII pode ser medida pelo teste clínico padrão para LES, AR ou DII conhecido na especialidade, tal como nível sérico de anticorpos anti-ADN, proteinúria e a taxa de mortalidade dos pacientes.

Os métodos terapêuticos são usualmente aplicados a pacientes humanos mas podem ser aplicados a outros mamíferos.

Tratamento do cancro

Estão também incluídos métodos terapêuticos para a redução da proliferação de células de mieloma, compreendendo o contacto de células mieloma com um antagonista de uma proteína de mieloma, preferivelmente um anticorpo ou outro antagonista, tais como os anticorpos CS1 aqui descritos. Por exemplo, os anticorpos podem entrar em contacto com células de mieloma 83 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ in vitro (tal como, por adição dos antagonistas num ambiente de cultura celular onde as células de mieloma são cultivadas), ex vivo, ou in vivo (por exemplo, por administração dos antagonistas a um indivíduo). Noutro aspecto, as utilizações da presente invenção permitem um método de redução da proliferação de células de mieloma, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de proteínas de mieloma ao referido indivíduo.

Os anticorpos utilizados na presente invenção, previnem ou tratam mieloma. Após serem administrados a um indivíduo que tenha desenvolvido os sintomas de mieloma, os anticorpos deverão ser capazes de reduzir a gravidade dos sintomas. Alternativamente, os anticorpos utilizados na presente invenção podem ser administrados a um indivíduo antes do indivíduo desenvolver quaisquer manifestações clínicas de mieloma. A gravidade dos sintomas de mieloma pode ser medida pelo teste clínico padrão para o mieloma conhecido na especialidade, tal como análise da densidade óssea por raios-X, níveis de microglobulina beta-2 ou hipercalcemia. Os métodos terapêuticos são usualmente aplicados a pacientes humanos mas podem ser aplicados a outros mamíferos.

Em ainda outro aspecto, a presente divulgação é dirigida a um método de indução de apoptose ou citólise de células que expressam CS1 compreendendo o contacto das células com um anticorpo contra CS1 aqui descrito. Numa concretização preferida, a indução é conseguida por via de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Em geral, os anticorpos da presente invenção ligam-se a antigénios na superfície de células alvo (células que expressam CS1) na presença de células efectoras (tais como células assassinas naturais ou macrófagos). Os receptores de Fc sobre as células efectoras reconhecem anticorpos ligados. A ligação cruzada de receptores de Fc assinala as células efectoras para matar as células alvo por citólise ou apoptose. A citólise pode ser detectada através da detecção da libertação de marcador ou de lactato-desidrogenase pelas células lisadas, ou por detecção de viabilidade reduzida das células alvo (e.g. ensaio com anexina). Os ensaios para a apoptose podem ser realizados pelo ensaio TUNEL de marcação de extremidade por cortes com digoxigenina-ll-dUTP mediada por desoxinucleotidil-transferase 84 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ terminal (terminal dUTP-mediated nick end labeling) (Lazebnik et al., Nature: 371, 346 (1994). A citotoxicidade pode também ser detectada directamente por kits de detecção conhecidos na especialidade, tais como o Kit de Detecção de Citotoxicidade da Roche Applied Science (Indianapolis, IN). Preferivelmente, os anticorpos da presente divulgação induzem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou 80% de citotoxicidade das células alvo. A percentagem é calculada pelos métodos divulgados nos Exemplos. Os antagonistas podem também entrar em contacto com leucócitos in vitro (tal como por adição dos antagonistas num ambiente de cultura celular onde os leucócitos estão cultivados), ex vivo ou in vivo (por exemplo, por administração dos antagonistas a um indivíduo).

Num aspecto preferido, a presente divulgação proporciona um método de redução da secreção de imunoglobulina por células B, num indivíduo disso necessitado, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de CS1 ao referido indivíduo. Esta redução da secreção de imunoglobulinas por células B pode auxiliar no alívio de complicações de mieloma, incluindo a síndrome de hiperviscosidade.

Em outro aspecto preferido a presente divulgação proporciona um método de indução da citotoxicidade, da citólise e/ou da apoptose de células que expressam CS1 num indivíduo disso necessitado, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo contra CS1 ao referido indivíduo.

Administração de Agentes Terapêuticos

Existem vários métodos de administração dos antagonistas, por exemplo, anticorpos de acordo com a presente invenção. Prefere-se a administração parentérica. O anticorpo pode ser administrado a um paciente por via intravenosa na forma de um bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo; 85 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ou pelas vias intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intra-cerebrospinal. As vias oral, tópica, de inalação, ou outros meios de entrega conhecidos dos peritos na especialidade estão também incluídos na presente invenção.

As composições farmacêuticas da presente divulgação vulgarmente compreendem uma solução de antagonistas (por exemplo, anticorpos), ou um seu cocktail dissolvido num transportador aceitável, preferivelmente um transportador aquoso. Podem ser utilizados uma variedade de transportadores aquosos, e.g., água para injecção (WFI), ou água tamponada com fosfato, citrato, acetato, etc. a um pH tipicamente de 5,0 a 8,0, mais frequentemente de 6,0 a 7,0, e/ou contendo sais tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio, etc. para ficar isotónico. O transportador pode também conter excipientes tais como albumina sérica humana, polissorbato 80, açúcares ou aminoácidos para proteger a proteína activa. A concentração de um antagonista (por exemplo, anticorpo) nestas formulações varia amplamente de cerca de 0,1 a 100 mg/ml mas está frequentemente na gama de 1 a 10 mg/ml. O anticorpo monoclonal formulado é particularmente adequado para administração parentérica, e pode ser administrado na forma de uma infusão intravenosa ou por injecção subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Os métodos actuais para a preparação de composições administráveis parentericamente são conhecidos ou evidentes para os peritos na especialidade e estão descritos em maior detalhe, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Science (15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980). A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos aqui descritos.

As composições podem ser administradas para tratamentos profilácticos e/ou terapêuticos, compreendendo a inibição das interacções entre uma CS1 e o seu substrato celular, inibição da adesão de células doentes ou prevenção e/ou redução dos sintomas clínicos das desordens acima. Uma quantidade adequada para conseguir qualquer um destes efeitos desejados é definida como uma "quantidade eficaz". Os anticorpos podem ser entregues a um paciente por administrações únicas ou múltiplas. 86 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Para a finalidade de tratamento da doença, a dosagem apropriada dos antagonistas (por exemplo, anticorpos) irá depender da gravidade e do decorrer da doença, do historial clinico e da resposta do paciente, da toxicidade dos anticorpos, e da discrição do médico assistente. Os

antagonistas são adequadamente administrados ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos. A dosagem inicial candidata pode ser administrada a um paciente. A dosagem e o regime de tratamento correctos podem ser estabelecidos por monitoração da progressão da terapia utilizando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na especialidade.

Adicionalmente, o antagonista (tal como anticorpos) pode ser utilizado sozinho numa forma substancialmente pura, ou conjuntamente com agentes terapêuticos para doenças auto-imunes conhecidas dos peritos na especialidade. Outras terapias que podem ser utilizadas em conjunto com o tratamento com os anticorpos incluem a administração de moléculas de ácido nucleico anti-sentido ou produtos biológicos, tais como anticorpos terapêuticos adicionais. Assim, o tratamento da presente divulgação é formulado de uma maneira que lhe permita ser administrado em série ou em combinação com outro agente para o tratamento de doenças auto-imunes. Para o tratamento de desordens auto-imunes e mieloma, o anticorpo será frequentemente administrado após, ou em combinação com, um ou mais outros fármacos imunossupressores e imunomoduladores.

Kits para Utilização em Aplicações de Diagnóstico e/ou de Prognóstico

Para utilização em aplicações de diagnóstico e de investigação acima sugeridas, são também proporcionados kits pela divulgação. Em aplicações de diagnóstico e de investigação, estes kits podem incluir pelo menos um dos seguintes: reagentes de ensaio, tampões, ácidos nucleicos ou anticorpos específicos de CS1, sondas de hibridação e/ou iniciadores, polinucleótidos anti-sentido, ribozimas, polipéptidos ou polinucleótidos de CS1 negativos dominantes, inibidores de molécula pequena de sequências associadas a CS1, etc. 87 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Em adição, os kits podem incluir materiais de instruções contendo as instruções (e.g., protocolos) para a prática dos métodos da presente divulgação. Embora os materiais de instruções tipicamente compreendam materiais escritos ou impressos, não lhes estão limitados. Está contemplado pela presente invenção um meio capaz de armazenar estas instruções e as comunicar a um utilizador final. Estes meios incluem, mas não se lhes limitando, meio de armazenagem electrónica (e.g., discos magnéticos, fitas magnéticas, cartuchos, chips), meios ópticos (e.g., DC ROM), e similares. Estes meios podem incluir endereços de sites na internet que proporcionam esses materiais de instruções. A presente divulgação também proporciona kits para o rastreio de moduladores de sequências associadas a CS1. Estes kits podem ser preparados a partir de materiais e reagentes prontamente disponíveis. Por exemplo, estes kits podem compreender um ou mais dos seguintes materiais: um polipéptido ou um polinucleótido associado a CS1, tubos de reacção e instruções para o teste da actividade associada a CS1. Opcionalmente, o kit contém proteína CS1 biologicamente activa. Uma ampla variedade de kits e componentes podem ser preparados de acordo com a presente invenção, dependendo do utilizador destinado ao kit e das necessidades particulares do utilizador. O diagnóstico envolverá tipicamente a avaliação de uma pluralidade de genes ou produtos. Os genes serão tipicamente seleccionados com base em correlações com parâmetros importantes na doença que podem ser identificados em dados históricos ou de desenlace.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Isolamento e Identificação de CSl

Foi identificada CSl a partir de uma biblioteca de subtracção de ADNc de subconjuntos de células B (células B naive vs. de memória + plasmáticas) de sangue periférico de adulto saudável normal. A CSl era preferencialmente expressa entre as células B de memória e plasmáticas. As bibliotecas de subtracção foram produzidas seguindo o protocolo descrito adiante: 88 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Isolamento de subconjuntos de células B:

Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de nove dadores adultos saudáveis com gradientes padrão Ficoll-hypaque. As células B foram isoladas a partir das PBMC seguindo um protocolo de selecção negativa padrão. As PBMC foram incubadas num cocktail de anticorpos de ratinho purificados anti-CD2, CD3, CD4, CD14, CD16, CD56, CD66 e glicoforina A humanas. Após incubação e lavagem, adicionaram-se contas magnéticas Dynal de cabra anti-ratinho a 7-10 contas por célula. Subsequentemente, as células ligadas aos anticorpos foram isoladas com um suporte magnético Dynal padrão para enriquecer de células B os sobrenadantes. Os sobrenadantes recolhidos foram então lavados com RPMI + soro fetal bovino (FBS) a 10%.

Selecção de subconjuntos de células B (células B Naive vs. de Memória + Plasmáticas):

Coraram-se as células B enriquecidas em Dynal com IgD-FI TC, CD38-citocromo, CD19-APC e CD27-PE seguindo os protocolos de coloração padrão. As duas populações separadas de células B naive (IgD+CDl 9+CD3 8int/”CD2 7”) versus células B de memória e plasmáticas (IgD“CDl 9+CD3 8int/+CD2 7 + ) foram separadas num citómetro de fluxo de alto desempenho MoFlo-MLS, que é equipado com um laser de árgon arrefecido a ar de espectros físicos (488 nm) e um laser de díodos de 635 nm e com filtros para detecção de FITC a 530/40mn, PE a 580/30 nm, APC a 670/20 nm, e cicromo (PE-Cy5) a 670/30 nm. As células B separadas foram analisadas no citómetro MoFlo quanto à pureza e verificou-se terem 97% (células B de memória e plasmáticas) e 98% (células B naive) de pureza. As células seleccionadas foram colocadas em Trizol e armazenadas a -70°C.

Produção de Bibliotecas de ADNc:

As bibliotecas de subtracção de ADNc foram preparadas a partir dos subconjuntos de células B seleccionadas utilizando um protocolo de hibridação subtractiva de análise da diferença de representação padrão. As bibliotecas de subtracção incluíam a biblioteca de ADNc de células B de memória + plasmáticas, onde o ADNc naive foi subtraído duas vezes, e a biblioteca de ADNc de células B naive, onde o ADNc de memória + plasmáticas 89 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ foi subtraído duas vezes. Com técnicas padrão de biologia molecular, a biblioteca de subtracção de ADNc foi ligada num vector plasmídico padrão e transformada em células de E. coli (DH-10B) electrocompetentes. As células de E. coli transformadas foram plaqueadas em placas de ágar LB na presença de antibióticos de selecção. Colónias bacterianas individuais, cada uma representando uma inserção específica, foram amplificadas utilizando PCR padrão de colónias.

Rastreio e Confirmação de Expressão Diferencial:

As inserções da biblioteca de subtracção de ADNc foram desnaturadas e transferidas para 2 filtros de nylon idênticos e hibridadas separadamente com duas sondas marcadas, desnaturadas diferentes - ADNc (de memória + plasmáticas) naive (subtraído duas vezes) e ADNc naive - (memória + plasmáticas) (subtraído duas vezes). Uma inserção de ADN da biblioteca de subtracção era considerada positiva se a inserção hibridava selectivamente e preferencialmente com uma das duas sondas. Os clones de ADNc para CS1 hibridaram preferencialmente com a sonda de ADNc (memória + plasmáticas) - naive (subtraído duas vezes).

Identificação de CS1: Células bacterianas transformadas com clones positivos foram crescidas e o ADN foi isolado com um kit Mini-Prep Qiagen® (preparações diagnóstico in vitro) seguindo o protocolo do fabricante (Qiagen, Valência, Califórnia). Os plasmídeos purificados foram sequenciados e a identidade da sequência ADN foi determinada por pesquisa em bases de dados NCBI.

Caracterização e Confirmação da Expressão do Gene de CS1: A expressão preferencial dos clones positivos seleccionados, incluindo CS1, foi confirmada por análise dot blot. Quantidades iguais de ADNc (não subtraído) (20 ng) isolado de células B seleccionadas naive versus de memória + plasmáticas foram colocadas em pontos de filtros de nylon e hibridadas com inserção de ADNc marcada para o clone positivo. Para estes ensaios, o ADNc foi sintetizado a partir de subconjuntos de células B de sangue periférico obtidas de 2 selecções separadas (n=9 adultos saudáveis e n=10 adultos 90 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ saudáveis, pureza >97% e >98%, respectivamente). Lavaram-se os filtros e detectou-se o sinal de sondas hibridadas por autorradiografia. Um clone era considerado positivo se o ADNc hibridava preferencialmente com o ADNc de células B de memória + plasmáticas em ambos os conjuntos de células B seleccionadas naive versus de memória + plasmáticas. Os dados indicaram que a CS1 é expressa predominantemente em células B plasmáticas e de memória. CSI é expressa principalmente em tecido linfóide:

Prepararam-se dot blots de ADNc sintetizado a partir de ARN poli A+, que foi adquirido a Clontech (Paio Alto, Califórnia) e preparado a partir dos seguintes tecidos: baço, nódulos linfáticos, medula óssea, intestino delgado, cérebro, pulmão, músculo-esquelético, coração, rim e fígado. Sondaram-se os dot blots com ADN de CSI marcado com digoxigenina (DIG) e visualizaram-se por quimioluminescência (anticorpo anti-DIG marcado com fosfatase alcalina e CDP-Star) seguindo as recomendações do fabricante (kit DIG da

Boehringer-Mannheim). Os resultados indicam que a CSI é expressa principalmente em tecidos linfóides (baço, nódulos linfáticos, medula óssea e intestino delgado — possivelmente devido a linfócitos residuais em placas de Peyer) e está ausente ou em baixa quantidade em outros órgãos não linfóides (cérebro, pulmão, músculo esquelético, coração, rim e fígado).

Exemplo 2: Expressão Diferencial de CSI Células Humanas: Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram obtidas por isolamento a partir de gradientes padrão de Ficoll-hypaque. As PBMC isoladas foram então ressuspensas a 2 x 106 células/ml num meio de cultura fresco. As PBMC foram estimuladas com fito-hemaglutinina (PHA) numa concentração de 3 pg/ml durante 3 dias, ou com mitogénio de fitolaca (PWM, do inglês "pokeweed mitogen") numa concentração de 10 pg/ml durante 8 dias. Prepararam-se PBMC de controlo não estimuladas sem qualquer estímulo. As células foram cultivadas a 37°C em CO2 a 7% em meio RPMI com aditivos de FBS a 10%, penicilina, estreptomicina e glucose. 91 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ Células de Ratinho:

Os baços foram obtidos de dois ratinhos Balb/c. Os baços foram colocados num filtro de 100 micrones. As células foram desagregadas e lavadas com PBS, e centrifugadas a 1500 rpm durante 10 minutos. Os glóbulos vermelhos do sangue foram lisados com 2 ml de tampão de lise a 3 7°C durante 2 minutos. As células foram lavadas duas vezes, ressuspensas em 10 ml do meio e contadas. Uma porção das células não estimuladas foi congelada directamente. As células restantes foram estimuladas com con A numa concentração de 5 pg/ml durante 3 dias, ou com LPS numa concentração de 1 pg/ml durante 3 dias. As células foram cultivadas num meio DMEM com aditivos de FBS a 10%, antibióticos e glucose.

Linfócitos B de Paciente de Lúpus versus Indivíduos Saudáveis da Mesma Idade:

As células B foram seleccionadas a partir de células mononucleares de sangue periférico de pacientes de lúpus e indivíduos saudáveis, por coloração das células com anticorpo anti-CD19 humano marcado com FITC. As células foram seleccionadas num citómetro de fluxo de alto desempenho MoFLo-MLS como descrito no Exemplo 1. As células foram recolhidas em meio estéril para síntese de ARN.

Isolamento de ARN Total para PCR em Tempo Real:

As células foram lavadas uma vez e colocadas em Trizol” (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland), e o ARN total foi isolado seguindo o protocolo do fabricante. O ARN total foi tratado com ADNase isenta de ARNase (GenHunter, Nashville, Tennessee). O ARN digerido com ADNase foi extraído com fenol/clorofórmio e precipitado durante a noite com etanol. O ARN foi lavado com etanol a 75% e dissolvido em água isenta de nuclease. O ARN isolado foi quantificado e a sua integridade foi analisada num gel de agarose. PCR em Tempo Real: O ARN total (2 pg) foi transcrito de forma inversa a partir dos linfócitos B seleccionados de paciente de lúpus versus indivíduos saudáveis, em 100 μΐ de mistura reaccional 92 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ utilizando reagentes padrão de transcrição inversa Taqman (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). As reacções PCR foram montadas utilizando a mistura SYBR Green PCR Master Mix da Applied Biosystems. Os iniciadores de CS1 foram incorporados na mistura para examinar os niveis de expressão de CS1 em ADNc de paciente de lúpus e indivíduos saudáveis. Os iniciadores de CS1 foram desenhados a partir das sequências publicadas (Número de Acesso no Genbank XM-001635, AF390894). Utilizaram-se iniciadores de β-Actina e ARNr de 18S como controlos para normalização. Os iniciadores foram desenhados utilizando o software Primer Express adquirido a Applied Biosystems. Os produtos amplificados por PCR eram de 85pb para os iniciadores de CS1, 84pb para os iniciadores de β-actina e 61pb para iniciadores de ARNr de 18S. A PCR em Tempo Real foi realizada num sistema GeneAmp 5700 SDS da Applied Biosystems, utilizando o protocolo recomendado. PCR em Tempo Real de Novel Ly9 de Ratinho: O ARN total (2 pg) foi transcrito de forma inversa a partir de amostras estimuladas com conA, LPS e não estimuladas, em 100 μΐ de mistura reaccional utilizando reagentes padrão de transcrição inversa Taqman (Applied Biosystems). A reacção PCR foi montada utilizando a mistura SYBR Green PCR Master Mix da Applied Biosystems. Os iniciadores específicos para novel Ly9 de ratinho foram desenhados a partir da sequência publicada (Número de Acesso no Genbank AF467909) e incorporados na mistura para examinar os níveis de expressão em amostras de ADNc estimuladas vs. não estimuladas. Utilizaram-se iniciadores de ARNr de 18S para normalização. Os iniciadores foram desenhados utilizando o software Primer Express adquirido a Applied Biosystems. Os produtos amplificados por PCR eram de 65pb para os iniciadores de Ly9 de ratinho e 61pb para os iniciadores de ARNr de 18S. A PCR em Tempo Real foi realizada num sistema de Detecção de Sequências GeneAmp 5700 da Applied Biosystems, utilizando o protocolo recomendado.

Ensaios em Microarray: preparação da amostra, marcação dos microchips e "impressões digitais" ("fingerprints")

Os perfis de expressão de populações de leucócitos activados e não activados foram determinados e analisados utilizando chips de genes. 0 microarray de oligonucleótidos 93 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ personalizados Affymetrix GeneChip® permite a interrogação de aproximadamente 35 000 transcritos únicos de ARNm. O ARN foi isolado e a análise do chip de genes foi realizada como descrito (Veja-se Henshall et al. (2003) Câncer

Research 63:4196-4203; Henshall et al. (2003) Oncogene 22:6005-12; Glynne, et al. (2000) Nature 403:672-676; Zhao, et al. (2000) Genes Dev. 14:981-993). • Purificar ARNm poli A+ a partir de ARN total ou limpar ARN total com o kit RNEASY® da Qiagen (purificação de ARNm poli A+ a partir de ARN total) A suspensão Oligotex foi aguecida a 37°C e misturada imediatamente antes da adição ao ARN. O Tampão de Eluição foi incubado a 70°C. Note-se gue o Tampão de Ligação 2x pode ser aquecido até 65°C se houver precipitado no tampão. O ARN total foi misturado com água tratada com DEPC, Tampão de Ligação 2x, e Oligotex de acordo com a Tabela 2 na página 16 do Oligotex Handbook. A mistura foi incubada durante 3 minutos a 65°C, e depois foi incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente.

Os tubos foram centrifugados durante 2 minutos a de 14 000 a 18 000 g. Note-se que se a centrífuga tiver uma posição suave ("soft setting"), esta deverá ser utilizada. O sobrenadante foi removido sem perturbar a pelete de Oligotex. Uma pequena quantidade de solução pode ser deixada para reduzir a perda de Oligotex. O sobrenadante deverá ser reservado até haver certeza de que ocorreram ligação e eluição satisfatórias de ARNm poli A+. A pelete foi suavemente ressuspensa em Tampão de Lavagem OW2 e pipetada sobre a coluna de spin. A coluna de spin foi centrifugada à velocidade máxima (posição suave de possível) durante 1 minuto.

Após a centrifugação, a coluna de spin foi transferida para um novo tubo de colheita e suavemente ressuspensa em Tampão de Lavagem OW2 e novamente centrifugada como aqui descrito. A coluna de spin foi transferida para um novo tubo e eluída com 20 a 100 μΐ de Tampão de Eluição pré-aquecido 94 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ( 7 0 0 C). A resina Oligotex foi suavemente ressuspensa por pipetagem para cima e para baixo, e depois foi centrifugada como acima. Repetiu-se o procedimento de eluição com tampão de eluição fresco. De outro modo, se for necessário pequeno volume de eluição, pode ser utilizado apenas o primeiro eluato. A absorvância foi lida utilizando Tampão de Eluição diluido como branco. • Precipitação em Etanol

Antes de prosseguir com a síntese do ADNc, o ARNm foi precipitado. Algum componente que reste ou no Tampão de Eluição do procedimento de purificação Oligotex inibirá reacções enzimáticas a jusante do ARNm.

Adicionaram-se ao eluato 0,4 vol. de NH4OAc 7,5 M + 2,5 vol. de etanol a 100% frio. Precipitou-se a solução a -20°C de 1 hora até durante a noite (ou 20-30 min. a -70°C). A solução precipitada foi centrifugada a 14 000-16 000 x g durante 30 minutos a 4°C. A pelete foi lavada com 0,5 ml de etanol a 80% (-20°C) depois foi centrifugada a 14 000-16 000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. A lavagem com etanol a 80% foi repetida IX. A pelete foi seca sob o exaustor. (Não usar speed vac) . A pelete foi suspensa em H20 DEPC numa concentração de 1 ug/μΐ. • Limpeza de ARN total utilizando o kit RNeasy da Qiagen Não deverão ser adicionados mais do que 100 pg de ARN a uma coluna RNeasy. 0 volume da amostra foi ajustado para 100 μΐ com água sem ARNase, e adicionaram-se à amostra 350 μΐ de Tampão RLT e depois 250 μΐ de etanol (100%). A solução foi misturada por pipetagem (não centrifugar) e depois aplicou-se a amostra numa mini coluna de spin RNeasy. A mini-coluna de spin foi centrifugada durante 15 s a >10 OOOrpm. Se estiver em causa o rendimento, o fluxo pode ser novamente aplicado na coluna e novamente centrifugado. A coluna foi transferida para um novo tubo de recolha de 2 ml e adicionaram-se 500 μΐ de Tampão RPE e centrifugou-se durante 15 s a >10 000 rpm. Rejeitou-se o fluxo. Adicionaram-se 500 μΐ de Tampão RPE novamente à mini-coluna de 95 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ spin, e centrifugou-se durante 15 s a >10 000 rpm. Rejeitou-se novamente o fluxo, depois centrifugou-se durante 2 min à velocidade máxima para secar a membrana da coluna. A coluna foi transferida para um novo tubo de recolha de 1,5 ml e aplicaram-se 30-50 μΐ de água sem ARNase directamente sobre a membrana da coluna. A coluna foi centrifugada durante 1 min a >10 000 rpm, e repetiu-se a eluição.

Efeituou-se uma leitura de absorvância. Se necessário, o eluato pode ser precipitado com acetato de amónio e 2,5X o volume de etanol a 100%.

Preparação de ADNc utilizando o kit " SUPERSCRIPlf Choice System for cDNA Synthesis" da Gibco • Síntese da Primeira Cadeia de ADNc

Utilizaram-se 5 ug de ARN total ou 1 ug de ARNm poliA+ como material de partida. Para o ARN total, utilizaram-se 2 μΐ de SUPERSCRIPT® RT (kit com transcriptase inversa para a sintese de ADNc) (para ARNm poliA+, utiliza-se 1 μΐ de SUPERSCRIPT® RT) . O volume final da mistura de sintese da primeira cadeia deverá ser de 20 μΐ. O ARN tem que estar num volume não superior a 10 μΐ. O ARN foi incubado com 1 μΐ de oligo T7-T24 100 pmol durante 10 min a 70C. Em gelo, adicionaram-se 7 μΐ de: 4 μΐ de Tampão de Ia Cadeia 5X, 2 μΐ de DTT 0,1 M e 1 μΐ de mistura de dNTP lOmM. A mistura foi incubada a 37C durante 2 min, e depois adicionou-se SUPERSCRIPT® RT. A mistura foi incubada a 37°C durante 1 hora. • Síntese da Segunda Cadeia

As reacções da lst cadeia foram colocadas em gelo.

Adicionaram-se à mistura:

91 μΐ de H20 DEPC

30 μΐ de Tampão da 2a Cadeia 5X

3 μΐ de mistura de dNTP 10mM 1 μΐ de ADN-ligase de E.coli a 10 υ/μΐ 4 μΐ de ADN-polimerase de E.coli a 10 υ/μΐ 1 μΐ ARNase H a 2υ/μ1 96 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ Ο anterior deverá ser colocado numa mistura se houverem mais do que 2 amostras. A mistura adicionada foi incubada durante 2 horas a 16°C.

Adicionaram-se 2 μΐ de ADN-polimerase de T4 e incubou-se adicionalmente durante 5 min a 16°C. Adicionaram-se 10 μΐ de EDTA 0,5 M para parar a reacção. • Limpeza de ADNc O ADNc foi limpo utilizando purificação em

Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamilico (25:24:1) em tubos de gel:

Os tubos de PLG (gel de bloqueio de fase) foram centrifugados durante 30 s à velocidade máxima, e transferidos para um novo tubo PLG. Adicionou-se um volume igual de fenol:clorofórmio:álcool isamílico e agitou-se vigorosamente (não atingir vórtex). Os tubos foram centrifugados durante 5 minutos à velocidade máxima. A solução da camada aquosa do topo foi transferida para um novo tubo. A solução aquosa foi precipitada com etanol por adição de 7,5X o volume de NH4OAc 5M e 2,5X o volume de etanol a 100%. Os tubos foram centrifugados imediatamente à temp. ambiente durante 20 min., à velocidade máxima. Removeu-se o sobrenadante e lavou-se a pelete 2X com etanol a 80% frio. Remove-se tanto etanol de lavagem quanto possivel e depois deixa-se a pelete secar ao ar. A pelete foi ressuspensa em 3 μΐ de água sem ARNase. • Transcrição In Vitro (IVT) e marcação com biotina

Pipetaram-se 1,5 μΐ de ADNc para um tubo de PCR de paredes finas. Adicionou-se mistura de marcação de NTP à temperatura ambiente ao tubo de PCR.

Mistura de marcação de NTP: 2 μΐ Τ 7 1ΟχΑΤΡ (75 mM) (Ambion) 2 μΐ Τ 7 lOxGTP (75 mM) (Ambion) 1,5 μΐ Τ7 lOxCTP (75 mM) (Ambion) 1,5 μΐ Τ7 lOxUTP (75 mM) (Ambion) 3, 75 μΐ Bio-11-CTP 10 mM 0, 75 μΐ Bio-16-UTP 10 mM 2 μΐ tampão de transcrição T7 lOx (Ambion) 2 μΐ mistura de enzimas T7 lOx (Ambion) 97 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ Ο volume final da reacção total era de 20 μΐ. Os tubos foram incubados durante 6 horas a 37°C numa máquina de PCR.

Limpeza RNeasy de produto de IVT

Veja-se acima quanto ao procedimento. O ARNc marcado é precipitado em etanol e ressuspenso num volume compatível com o passo de fragmentação.

Fragmentação

Aproximadamente 15 ug de ARN marcado foram fragmentados utilizando a técnica seguinte. O volume da reacção de fragmentação foi minimizado para aproximadamente um volume de 10 μΐ, mas não mais do que 20 μΐ devido a problemas de precipitação de magnésio com o tampão de hibridação. O ARN foi fragmentado por incubação a 94°C durante 35 minutos em tampão de Fragmentação lx.

Tampão de fragmentação 5x:

Tris-acetato 200 mM, pH 8,1 KOAc 500 mM MgOAc 150 mM O transcrito de ARN marcado foi analisado antes e após a fragmentação. As amostras foram aquecidas a 65°C durante 15 minutos e submetidas a electroforese em géis de agarose a 1%/TBE para ter uma ideia aproximada da gama de dimensões do transcrito. • Array em Microchip O array de microchip EOS Hu03 utilizado em todas as experiências é um array de oligonucleótidos Affymetrix GENECHIP® personalizado compreendendo 59 680 conjuntos de sondas ("probesets") representando 46 000 sequências únicas incluindo tanto exões conhecidos como exões previstos por FGENESH que eram baseados no primeiro anteprojecto do genoma humano. Os conjuntos de sondas Hu03 consistem apenas em sondas de correspondência perfeita, a maioria dos conjuntos de sondas possuindo 6 ou 7 sondas. 98 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ • Hibridação sobre Array em Microchip

Pipetaram-se 200 μΐ (10 ug de ARNc) de mistura de hibridação sobre o chip. Quando se pretendem fazer múltiplas hibridações (tal como um ciclo ao longo de um conjunto de 5 chips), então recomenda-se que seja feita uma ou mais misturas de hibridação iniciais de 300 μΐ.

Mistura de Hibridação: ARN marcado fragmentado (conc. final de 50 ng/μΐ)

oligo de controlo de 948 b 50 pM

BioB 1,5 pM

BioC 5 pM

BioD 25 pM

CRE 100 pM ADN de esperma de arenque a 0,1 mg/ml BSA acetilado a 0,5 mg/ml até 300 μΐ com tampão de hibridação MES lx

Os sinais de hibridação foram visualizados utilizando estreptavidina conjugada com ficoeritrina. • Normalização dos Dados de Expressão Génica

Os dados de expressão génica foram normalizados por ajustamento dos dados de intensidade do nivel das sondas de cada array a uma distribuição γ fixada, utilizando uma função γ inversa para mapear a distribuição cumulativa empirica de intensidades à distribuição γ desejada. Este procedimento é semelhante a outros procedimentos de normalização per-chip, tais como fixação da média e do DP de cada chip a um valor padrão, excepto que é mais rigoroso na medida em que fixa a totalidade da distribuição de intensidades em vez de um ou dois parâmetros. 0 propósito da normalização per-chip é remover as variações entre chips, assumindo que esta é atribuível a factores não biológicos, i.e. ruido técnico. 0 parâmetro de escala para a distribuição foi escolhido para obter uma distribuição com um valor médio arbitrário de 300, e o parâmetro de formato de 0,81 foi escolhido para reproduzir o formato tipico da distribuição empirica observada em amostras boas. 99 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Foi calculada uma única medição de intensidade média para cada subconjunto de sondas utilizando a média tripla de Tukey da intensidade das sondas constituintes. A média tripla é uma medida da tendência central que é resistente aos efeitos de valores atípicos ("outliers"). Finalmente, aplicou-se uma subtracção do fundo para cada medição de intensidade média para corrigir quanto à hibridação não específica. A medição de intensidade média de um conjunto de condas "nulo" consistindo em 491 conjuntos de sondas com sequência misturada foi subtraída de todos os outros subconjuntos de sondas no chip.

Protocolo de Marcação Aqui Proporcionado Reacção de hibridação:

Começar com IVT não biotinilado (purificado por colunas RNeasy) (ver exemplo 1 quantos aos passos desde o tecido ao IVT) ARN anti-sentido de IVT; 4 pg: μΐ Hexâmeros Aleatórios (1 yg/yi): 4 μΐ H20: μΐ Volume Total: 14 1 - Incubar a 70°C, 10 min. Colocar em gelo. Transcrição inversa:

Tampão da Primeira Cadeia (BRL) 5X: 6 μΐ DTT 0,1 M: 3 μΐ mistura de dNTP 50X: 0,6 μΐ H20: 2,4 μΐ dUTP Cy3 ou Cy5 (1 mM): 3 μΐ SS RT II (BRL): 1 μΐ Volume Total: 16 μΐ - Adicionar à reacção de hibridação. - Incubar 30 min., 42°C. - Adicionar 1 μΐ de SSII e deixar decorrer durante mais uma hora. 100 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Colocar em gelo.

- Mistura de dNTP 50X (25mM de dATP, dCTP e dGTP frios, lOmM de DTTP: 25 μΐ de cada de dATP, dCTP e dGTP lOOmM; 10 μΐ de dTTP lOOmM até 15 μΐ de H20)

Degradação de ARN: incubar a 65°C, 86 μΐ 10 μΐ 4 μΐ

Adicionar 1,5 μΐ de NaOH 1M/EDTA 2mM, 10 min. H20

NaOH 10N EDTA 50mM U-Con 30 500 μΐ de TE/amostra centrifugar a 7000g durante 10 min, guardar o fluxo para purificação

Purificação Qiagen:

- suspender material recuperado u-con em 500μ1 de tampão PB - prosseguir com o protocolo Qiagen normal

Digestão com ADNase: - Adicionar 1 μΐ de dil 1/100 de ADNase/30pl de Rx e incubar a 37°C durante 15 min. - 5 min a 95°C para desnaturar a enzima

Preparação da amostra: - Adicionar: 10 μΐ 1 μΐ 2,3 μΐ 7,5 μΐ 1 μΐ de diluição 1/10 21,8 μΐ ADN Cot-1: dNTP 50X: SSC 20X: pirofosfato de Na: ADN de esperma de arenque a lOmg/ml Volume Final: - Secar em speed vac. - Ressuspender em 15 μΐ de H20. - Adicionar 0,38 μΐ de SDS a 10%. - Aquecer a 95°C, 2 min. - Arrefecer lentamente até à temp. ambiente durante 20 min. 101 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Colocar em lâmina e hibridar durante a noite a 64°C. Lavagem após a hibridação:

SSC 3X/SDS a 0,03%: 2 min. 37,5 ml de SSC 20X + 0,75ml de SDS a 10% em 250ml de H20 SSC IX: 5 min. 12,5 ml de SSC 20X em 250ml de H20 SSC 0,2X: 5 min. 2,5 ml de SSC 20X em 250ml de H20

Secar as lâminas numa centrífuga, 1000 RPM, 1 min.

Varrer com os conjuntos de tubos do fotomultiplicador e os canais de fluorescência apropriados. CS1 é sobre-expressa em leucócitos mas não em vários tipos de tecidos não linfóides

Para avaliar o perfil de expressão de CS1, ARNm isolado de leucócitos e outros tecidos foi analisado por PCR em tempo real. Os resultados indicam que o nível de expressão de ARNm foi muito maior em leucócitos do que na maioria dos outros tecidos normais de adulto. Os outros tecidos normais de adulto que não apresentaram expressão de CS1 acima dos níveis da linha de base incluíam adipose, glândula supra-renal, aorta, válvula aórtica, apêndice, artéria coronária, bexiga, osso, medula óssea, mama, brônquio, cérvix, cérebro, coluna vertebral, diafragma, endométrio, epidídimo, esófago, vesícula biliar, gânglios, coração, laringe, lábio, fígado, pulmão, músculo, miométrio, nervo vago, omento, mucosa oral, ovário, pâncreas, paratiróide, mucosa faríngica, placenta, próstata, retina, glândula salivar, pele, estômago, sinóvio, testículo, timo, tiróide, língua, traqueia, cordão umbilical, ureter, útero, vagina ou veia. O ARNm de CS1 foi expresso em amostras seleccionadas de cólon (2/11), rim (1/20), intestino delgado (1/3), baço e amígdala (2/4). Os resultados indicaram que a CS1 é principalmente expressa em leucócitos e deverá ser um bom alvo para doenças auto-imunes. A expressão de CS1 aumenta em múltiplas populações de leucócitos activados

Para avaliar a correlação entre a expressão de CS1 e a activação de leucócitos, analisou-se a expressão de ARNm de CS1 em múltiplas populações de leucócitos activados e não 102 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ activados. Os resultados indicam que a expressão de CS1 aumentou em células B activadas, células DC maduras, células CD3 activadas (aumento baixo a moderado), células CD4 activadas (aumento de baixo nivel), e células CD8 activadas (aumento baixo a moderado, dependendo do dador) em comparação com populações de controlo não activadas suas correspondentes. Estes resultados indicaram que a sobre-expressão de CS1 se correlaciona com a activação de vários subconjuntos de leucócitos.

Exemplo 3: Produção de Antigénios para a Geração de Anticorpos Monoclonais Contra CS1

Clonagem: O dominio extracelular (ECD) de CS1 humana foi isolado de células Raji utilizando iniciadores que flanqueiam o dominio extracelular de CS1 (ECD de CS1). O produto da PCR foi purificado em gel e ligado a um vector que codifica a região constante de IgG3 (Fc-y3 humana). O plasmídeo contendo ECD de CS1-Fcy3 foi purificado em larga escala e confirmado por sequenciação de ADN.

Transfecção Estável de ECD de CS1-Fcy3:

Linearizaram-se 50 pg de plasmídeo com ECD de CS1-Fcy3 com a enzima Fspl, e precipitou-se o ADN em etanol, lavou-se e ressuspendeu-se em 500 μΐ de PBS estéril. Lavaram-se células NSO duas vezes com PBS frio, e ressuspenderam-se a 2 x 107 por um ml de PBS. Utilizou-se uma quantidade de 1 x 107 células para a transfecção.

Combinaram-se 500 μΐ de células NSO com 500 μΐ de ADN em PBS. As células foram electroporadas a 1,5V e 3 pF num equipamento Gene Pulser da BioRad. As células foram adicionadas a 100 ml de meio completo DMEM e plaqueadas em dez placas de 96 poços. Adicionou-se meio de selecção micofenólico a 1 pg/ml, 24 horas após a transfecção. Rastrearam-se os transfectantes positivos após o 10° dia e expandiram-se em placas de 48 e 24 poços. Os transfectantes positivos foram novamente rastreados e os altos produtores foram expandidos para purificação da proteína. 103 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Purificação de Proteína ECD de CSl-Fcy3: ,

Os transfectantes estáveis que expressam a proteína de fusão ECD de CS1-Fcy3 foram expandidos em 600 ml de meio completo DMEM com aditivos de glucose durante cinco dias. A proteína de fusão foi purificada numa coluna de proteína G-Sepharose e dialisada contra PBS lx. As formas reduzida e não reduzida de ECD de CS1-Fcy3 foram analisadas por Coomassie. A ECD de CS1-Fcy3 foi também analisada por Western blot utilizando anti-HuIgG, e confirmada por sequenciação N- terminal. A proteína de fusão CS1-Fc-y3 purificada foi utilizada para imunizar ratinhos.

Produção de proteína de fusão ECD de CSl-myc-GPI: O domínio extracelular (ECD) de CS1 humana foi isolado de células Raji utilizando iniciadores que flanqueiam o domínio extracelular de CS1. 0 produto da PCR foi purificado em gel e ligado a um vector que expressa um marcador myc e ligação de glicosil-fosfatidilinositol para expressão na superfície celular (vector myc-GPI). O plasmídeo contendo ECD de CSl-myc-GPI foi purificado em larga escala e confirmado por sequenciação do ADN.

Transfecção Estável de ECD de CSl-myc-GPI:

Linearizaram-se 50 pg de plasmídeo com ECD de CSl-myc-GPI com a enzima Fspl, e precipitou-se o ADN em etanol, lavou-se e ressuspendeu-se em 500 μΐ de PBS estéril. As células NSO foram lavadas duas vezes com PBS frio e ressuspensas a 2 x 108 por um ml de PBS. Utilizou-se uma quantidade de 1 x 108 células para a transfecção.

Combinaram-se 500 μΐ de células NSO com 500 μΐ de ADN em PBS. As células foram electroporadas a 1,5 V e 3 pF num equipamento Gene Pulser da Biorad. As células foram crescidas a 37°C em C02 a 5% com 1 pg/ml de selecção micofenólica, e foram mais tarde subclonadas em placas de 96 poços. Rastrearam-se os transfectantes positivos com anticorpo anti-myc. Os altos produtores de transfectantes ECD de CSl-myc-GPI foram seleccionados e expandidos para ensaios in vitro. 104 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Exemplo 3: Produção de Anticorpos Monoclonais anti-CSl Imunogénios para CS1 Humana:

Utilizou-se a proteína de fusão ECD de CS1~y3 humana recombinante purificada para imunizar ratinhos Balb/c por via das almofadas das patas (ECD de CS1 refere-se ao domínio extracelular de CS1 descrito acima). Resumidamente, os ratinhos foram imunizados nas almofadas das patas traseiras com 10 pg de proteína com um volume igual de adjuvante Ribi num volume total de 25 μΐ. As imunizações nas almofadas das patas foram realizadas 4 vezes com intervalos de 4 ou 5 dias. a. Fusão Celular:

Sacrificaram-se dois ratinhos imunizados com ECD de CS1-γ3. Removeram-se os nódulos linfáticos popliteais femorais e sacros dos ratinhos. Os linfócitos foram isolados dos tecidos, e geraram-se hibridomas por procedimentos padrão. Resumidamente, geraram-se hibridomas por fusão mediada por polietilenoglicol (PEG) 1500 entre linfócitos e uma linha celular de mieloma murino (células NSO) . As células fundidas foram colocadas em placas de 96 poços a uma densidade de 107 células por placa. A selecção de células fundidas foi realizada utilizando meio HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). b. Rastreio de Hibridomas A especificidade de anticorpos segregados por hibridomas foi determinada por um ensaio de ligação a células que expressam CS1 baseado em citometria de fluxo (FACS). O ensaio FACS foi realizado utilizando protocolos padrão. Os transfectantes NSO estáveis que expressam o domínio extracelular de CS1 na superfície (2xl05) foram ressuspensos em 50 μΐ de PBS gelado com 50 μΐ de sobrenadante da cultura de hibridomas em gelo durante 1 hora. Após lavagem extensiva, incubaram-se as células com anticorpos de cabra específicos anti-IgG de ratinho conjugados com ficoeritrina durante 1 hora em gelo. Lavaram-se novamente as células e detectaram-se os anticorpos ligados na superfície celular por FACS utilizando um FACScan Becton Dickinson. Como mostrado na Tabela 1, os anticorpos: Luc2, Luc3, Lucl5, Luc20, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63 105 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ou Luc90, ligaram-se fortemente às células NSO-CS1 transfectadas com CS1, mas não a NSO-FcRn. Os anticorpos anti-CS1 humana ligaram-se às células K562 e Daudi (que se sabe expressarem CS1 nativa) mas não a células Jurkat de controlo negativo. Os resultados mostram que os anticorpos anti-CSl produzidos são capazes de ligar especificamente CS1. Também estão mostrados na tabela os resultados de ensaios (por ELISA) da ligação de anticorpos Luc a proteína de fusão CS1-y3 versus AR-G3 de controlo negativo (proteína de fusão γ3). Os anticorpos Luc ligam-se especificamente a CS1-y3 e não à proteína de fusão AR-y3 de controlo negativo.

Tabela 1. MAb anti-CSl humana gerados a partir da fusão 342 Resultados FACS (MFI) ELISA (captura) MAb NSO-CS1 NSO-FeRn K562 Daudi Jurkat CS1-G3 AR-G3 Subclones Ig de Ratinho ISO 1 Luc2 162 <5 13,4 10,5 <5 1,0 0,2 Luc2-1 IgGl 2 Luc3 377 <5 25, 7 7, 8 <5 0,9 0,5 Luc3-F IgGl, G2b 3 Lucl 5 110 <5 14,0 12,4 <5 1,1 0,3 Lucl5-1 ND 4 Luc20 89 <5 8,0 12,6 <5 1,2 0,2 Luc20—1 ND 5 Luc22 228 <5 14, 7 6,1 <5 0,6 0,2 Luc22-1 IgG2b 6 Luc23 164 <5 19,6 10,2 <5 0,6 0,2 Luc23-1 IgGl 7 Luc2 9 86 <5 24, 1 11,9 <5 0,9 0,2 Luc29-D6, C8 IgGl 8 Luc32 201 <5 9,8 10, 7 <5 0,8 0,2 Luc32-1 IqG2b 9 Luc3 4 127 <5 26,2 10,3 <5 1,2 0,3 Luc34-1, 34-3 IgGl 10 Luc35 184 <5 10,6 29, 7 <5 0, 7 0,2 Luc35-1 IgG2a 11 Luc3 7 366 <5 12,8 7,2 <5 0,6 0,2 Luc37-C12,F11 IqG2b 12 Luc3 8 112 < 5 31.4 11.6 < 5 0.8 0.2 Luc36-1 IgG2b 13 Luc3 9 117 < 5 12.0 17.5 < 5 0.4 0.2 Luc39-E10 IgG2a 14 Luc56 132 <5 12,6 9, 7 <5 1,0 0,2 Luc56-1 IgG2a 15 Luc6 0 230 <5 5 14,6 10,4 <5 0,9 0,3 Luc60-2 IgGb 16 Luc63 214 <5 15,8 12, 7 <5 0,6 0,2 Luc63-1 IgG2a 17 Luc9 0 237 <5 9, 7 10, 1 <5 0,8 0,1 Luc90-Hl, D9 IqG2b controlo ISO 14 3 5,41 6, 02 <5 0, 16 0, 14 Anti-Myc 193 335 6,62 6, 85 <5 0, 19 0, 15 A Sequência de Aminoácidoss dos Anticorpos Monoclonais Anti-CSl Produzidos

Regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpos foram clonadas utilizando técnicas padrão. Resumidamente, utilizou-se o ARN total de 1-5 x 106 células para preparar 106 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ADNc utilizando um Kit de Amplificação de ADNc SMART RACE (BD Biosciences Clontech) e as regiões variáveis foram amplificadas por PCR utilizando iniciadores específicos dos genes complementares às regiões constantes da cadeia pesada e leve de ratinho.

As sequências de aminoácidos da cadeia pesada madura e da cadeia leve madura dos anticorpos Luc90, Luc63 e Luc34 são mostradas na Tabela 4 que proporciona as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 3) e da região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:4) de Luc90; as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 5) e da região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:6) de Luc63; e as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:7) e da região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:8) de Luc34. As SEQ ID NOS:9 10 e 11 representam as sequências de aminoácidos das CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de Luc90, respectivamente. As SEQ ID NOS:12, 13 e 14 representam as sequências de aminoácidos das CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de Luc90, respectivamente. As SEQ ID NOS: 15, 16 e 17 representam as sequências de aminoácidos das CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de Luc63, respectivamente. As SEQ ID NOS: 18, 19 e 20, representam as sequências de aminoácidos das CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de Luc63, respectivamente. As SEQ ID NOS: 21, 22 e 23, representam as sequências de aminoácidos das CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de Luc34, respectivamente. As SEQ ID NOS: 24, 25 e 26 representam as sequências de aminoácidos das CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de Luc34, respectivamente.

Tabela 4: Sequências de Aminoácidos de Anticorpos contra CS1

Luc-90 VH — SEQ ID NQ:3 qvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgysfttywmnwvkqrpgqglewigmihpsdsetrlnq SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10

KPKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO:11

Luc-90 VL - SEP ID NO:4

DIVMTQSQKSMSTSVGDRVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTQVPDRF SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:13

TGSGSGTDFTFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK SEQ ID NO:14 107 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Luc-63 VH — SEOIDNQ.5 ΒνΚΙ^Ε30ΕΚ3ΡνθΡαθ5ΙΛα;3<^Α£ΟΕΡΕ5ΚΥΝ«3ΝνΗΟΑΡΟΚΟΡΕΝΙΟΚΧ»ΡΡ88ΤΙΝΥτΡ SEQ ID NO:15 SEQ W NO: 16

SLKDKFX X SRDNAKNTI/rLQMSKVRS EDTALYYCARPDGKYWFDVWQRGTTVTVSS SEQ ID NO:17

DIVMTQSHKFMSTSVGPRVSITCKASQPVGIAVAWYQQKPGQSPKLLXYWAETRHTGVPDRF SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19

TGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:20 .

Luc-34 VH - SEP IP NO:7

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQ SBQ ID NO:21 SEQ ID NO:22

KFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSIASEDSAVYYCARGKVYYGSNPFAYWGQGTDVTVSA SEQ ID NO:23

Luc-34 VL - SEP ID NO:8

DIQMTQSSSYIiSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRF SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25

SGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:26

Exemplo 4: Caracterização de Anticorpos contra CS1

Utilizou-se um ensaio de competição por citometria de fluxo para determinar a especificidade de epítopos de 15 anticorpos monoclonais anti-CSl diferentes. Incubaram-se em gelo transfectantes NSO estáveis que expressam na superfície CS1 (2xl05) durante 1 hora com 50 μΐ de anticorpos anti-CSl, incluindo combinações de pares de Luc23, Luc29 Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc 63 e Luc 90. Em paralelo, utilizou-se um anticorpo de controlo de isotipo (AIP-13) como controlo negativo. Incubaram-se anticorpos monoclonais biotinilados anti-CSl (Luc23, Luc34, Luc37, Luc38, Luc63 e Luc90) a 1 yg/ml com a mistura célula/anticorpo durante mais 30 minutos em gelo. Após lavagem extensiva, incubaram-se as células com estreptavidina conjugada com ficoeritrina durante 1 hora em gelo. Lavaram-se as células e detectaram-se os anticorpos biotinilados ligados na superfície celular por FACS utilizando um FACScan Becton Dickinson.

Os anticorpos não marcados: Luc23, Luc34, Luc37, Luc38, Luc63 e Luc90 foram testados quanto à capacidade para competir com cada um dos outros numa concentração de 15 pg/ml, 3 pg/ml 108 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ e 0,6 yg/ml, e adicionaram-se os anticorpos de competição ou de bloqueio a 1 pg/ml. Utilizou-se AIP-13 como controlo negativo, uma vez que este anticorpo não se liga a CS1 nem compete com nenhum dos anticorpos Luc. Uma diminuição significativa na MFI indicou competição pela CS1 da superfície celular por MAb anti-CSl biotinilado versus Mab anti-CSl não marcado, em pelo menos 50% comparativamente com a MFI do anticorpo de controlo.

Os ensaios de competição indicaram que vários dos anticorpos Luc contactam epítopos distintos. O Luc38 contacta com um epítopo distinto dos epítopos de Luc37, 23, 90 e 63. O Luc63 contacta um epítopo separado, não sobreposto, que é distinto dos epítopos de Luc37, 23, 90 e 38. O Luc90 contacta um epítopo diferente, não sobreposto, distinto dos epítopos de Luc 37, 23, 63 e 38. O Luc 23 contacta com outro epítopo não sobreposto, distinto dos epítopos de Luc90, 63 e 38. O Luc37 contacta com um epítopo não sobreposto adicional, distinto dos epítopos contactados por Luc90, 63 e 38. O Luc63 contacta um epítopo sobreposto com o de Luc34, enquanto o Luc90 contacta um epítopo sobreposto com o de Luc34. O Luc37 contacta um epítopo que é sobreposto com o epítopo de Luc23. O Luc34 bloqueia ou diminui significativamente a ligação de todos os anticorpos Luc, e pode contactar um epítopo amplo, exposto, ou pode ter maior afinidade para com CS1. Os Luc37, Luc23 e Luc38 não bloqueiam a ligação a CS1 pelo anticorpo Luc34. Os epítopos para Luc37, Luc23 e Luc38 podem estar "enterrados" no interior da estrutura secundária de CS1, ou a afinidade para com CS1 pode ser menor do que a afinidade do anticorpo Luc34.

As afinidades relativas de três anticorpos monoclonais foram também testadas por análise Biacore. A análise cinética dos MAb contra CS1 por medições SPRKinetics entre a proteína de fusão CSl-Fc humana e os anticorpos monoclonais de ratinho anti-CSl humana Luc34.1, 63.2 e 90H1, foi realizada utilizando o BIAcore 2000 (BIAcore, Suécia). A condição de regeneração foi estabelecida por imobilização sobre 10 000 UR de cada anticorpo sobre diferentes células em fluxo e injectando CSl-Fc sobre a superfície, seguindo-se o teste de uma série de diferentes tampões até ser encontrado o melhor para optimizar a depuração de CSl-Fc de cada anticorpo. Verificou-se que um tampão de Glicina 10 mM, pH2,0 é o tampão de regeneração 109 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ óptimo e foi imediatamente testado quanto à reprodutibilidade ao longo de 10 ciclos de injecção de CSl-Fc e regeneração de tampão. Verificou-se que o tampão era adequado para a regeneração da superfície do anticorpo reprodutivelmente. Portanto Glicina 10mM, pH2,0 foi o tampão de regeneração designado para as experiências BIAcore com CSl-Fc e anticorpo. O anticorpo contra CS1 produzido no laboratório (in-house) foi imobilizado com baixas unidades de resposta (UR) variando de 99,4 UR a 133,7 UR no chip sensor CM5 de qualidade para investigação pelos reagentes de acoplamento de amina BIAcore (N-etil-N'-dimetilaminopropilcarbodiimida, EDC; N-hidroxissuccinimida, NHS; e etanolamina HC1, pH 8,5). Os ensaios foram realizados a um caudal de 30 ul/min à temperatura ambiente. Uma fase de associação de CSl-Fc de três minutos foi seguida por injecção de dez minutos de tampão corrente (Hepes lOmM, cloreto de sódio 300mM, EDTA 3mM, P-20 a 0,05%, pH7,4) para monitorar a dissociação para cada ciclo de ligação, com diferentes concentrações de CSl-Fc por ciclo. A superfície de regeneração foi regenerada com Glicina lOmM, pH2,0. A cinética da ligação de cada par de CSl-Fc e anticorpo foi calculada a partir de uma análise global de dados de sensorgrama recolhidos de doze concentrações diferentes de CSl-Fc (10 2 4nM, 512nM, 25βηΜ, 128nM, 64nM, 32nM, 16nM, 8nM, 4nM, 2nM, lnM, 0,5nM) em duplicado, utilizando o programa BIAevaluate. Foi aplicada referenciação dupla em cada análise para eliminar as respostas de fundo da superfície de referência e controlo apenas com tampão. A afinidade (KD) de ligação foi obtida por ajuste simultâneo das fases de associação e dissociação do sensorgrama da série de concentrações de analito utilizando o modelo do analito bivalente do software BIAevaluate. A experiência foi realizada três vezes para estudar o desvio padrão dos dados.

As afinidades de ligação de Luc 90.Hl, Luc63.2 e Luc34.1 estão resumidas adiante. Luc90.Hl tem a afinidade de ligação mais elevada entre estes três anticorpos. A afinidade de ligação de Luc90.Hl é 5,5 vezes superior à de Luc63.2 e 28 vezes superior à de Luc34.1. 110 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M) Luc90.Hl 4,56e4 2,81e-4 6,29e-9 +/— 2,06e-9 Luc63.2 8,71e3 3,01e-4 3,46e-8 +/- 8,86e-9 Luc34.1 7,48e3 1,27e-3 1,73e-7 +/- 3,46e-8

Coloração Imuno-histológica com Anticorpos Anti-CSl:

As células transfectadas com CS1 foram também examinadas quanto a coloração imuno-histológica com anticorpos anti-CSl. Uma quantidade de 10 pg/ml de anticorpo monoclonal anti-CSl primário foi adicionada às células transfectadas com CS1. As células foram então bloqueadas com soro e incubadas com biotina-Ig anti-ratinho. Misturou-se então avidina-peroxidase com as células e revelou-se com AEC (um reagente padrão para peroxidase). A cor vermelha de ABC indicou a coloração positiva enquanto os núcleos das células testadas foram contrastados com hematoxilina (azul). Os resultados indicaram que as células transfectadas com CS1 foram coradas positivamente com os anticorpos anti-CSl Luc23, Luc38 e Luc63, mostrando que os anticorpos anti-CSl produzidos são capazes de se ligar a CS1 expressa na superfície celular. Assim, os anticorpos anti-CSl são adequados para utilização não apenas em detecção da expressão sobre a superfície de células de sangue periférico em solução, mas também em detecção por imuno-histoquímica (IHC), que é tipicamente utilizada para analisar secções de tecido (por exemplo, nódulos linfáticos do paciente ou biópsias de tecido). A coloração imuno-histológica de amígdala inflamada foi ilustrada com dois anticorpos anti-CSl, Luc90 e Luc63. A coloração com CD138 cora células plasmáticas e células epiteliais. Do padrão de sobreposição da coloração é evidente que os anticorpos contra CS1 coram células plasmáticas na amígdala inflamada. A coloração imuno-histológica de tecido sinovial da articulação de um paciente com artrite reumatóide foi demonstrada com o anticorpo anti-CSl Luc63. As células plasmáticas tinham infiltrado o sinóvio como observado pela 111 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ coloração com CD138. Do padrão de sobreposição da coloração, é evidente que os anticorpos anti-CSl coram células plasmáticas nas articulações de pacientes com artrite reumatóide.

Estes resultados indicam que estavam presentes células plasmáticas que expressam CS1 tanto na amígdala inflamada como nas articulações de pacientes com artrite reumatóide, sugerindo uma utilização viável de anticorpos anti-CSl no tratamento destas doenças.

Padrão de Expressão da Proteína CS1: A expressão da proteína CS1 foi adicionalmente examinada com os anticorpos Luc produzidos através de análise FACS. Isolaram-se PBMC de indivíduos saudáveis e de pacientes de lúpus através de um procedimento de centrifugação em gradiente padrão Ficoll Hypaque.

Coraram-se as PBMC com anticorpos conforme indicado seguindo procedimentos padrão. Para a activação pelo mitogénio de fitolaca (PWM) das PBMC, adicionou-se PWM numa diluição de 1:100 às PBMC, que foram subsequentemente colocadas a 37°C em CO2 a 7% durante 8 dias. As células estimuladas com PWM foram colhidas e lavadas antes da coloração com anticorpo. Os anticorpos anti-CSl de ratinho aqui utilizados são Luc90 (IgG2b), Luc63, Luc3 8 e outros anticorpos anti-CSl Luc produzidos. Os anticorpos de controlo de isotipo eram anticorpos IgG de ratinho de isotipo correspondente.

Os resultados indicaram que a CS1 foi positivamente expressa sobre células B activadas, células T CD8+ (tanto activadas como naive) , células NK (CD3-CD56 + ) , células NKT (CD56+CD3+) , leucócitos CD14+/1° (monócitos e/ou macrófagos), e células T CD4+ (baixo nível sobre células activadas in vitro) . A CS1 foi expressa sobre estas populações de células tanto de adultos saudáveis como de pacientes de lúpus. Não foi detectada expressão significativa de proteína CS1 sobre células T CD4+ não activadas de adultos saudáveis, plaquetas, HuVEC, células renais, células brônquicas das vias aéreas, células pequenas das vias aéreas, células da próstata, células hepáticas e células mamárias. 112 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ A coloração de células Β activadas é mostrada pela coloração de PBMC activadas por PWM, enquanto a coloração de controlo de isotipo e as PBMC não activadas foram mostradas como fluorescência de fundo. O padrão de expressão de CS1 é significativo, porque um anticorpo terapêutico idealmente liga-se principalmente a células alvo e não se liga a outras células e tecidos, especialmente plaquetas. Os resultados sugerem que anticorpos anti-CSl são anticorpos terapêuticos candidatos adequados.

Exemplo 5: Humanização de Anticorpos contra CS1

Este exemplo descreve a humanização do anticorpo monoclonal murino anti-CSl Luc63 (MuLuc63). A humanização de MuLuc63 foi realizada essencialmente de acordo com o procedimento de Queen, C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029-10033 (1989)). Primeiro, identificaram-se segmentos de VH e VL humanos com elevada homologia para com as sequências de aminoácidos de VH e VL de MuLuc63, respectivamente. Em seguida, as sequências de CDR juntamente com aminoácidos de esqueleto importantes para manter as estruturas das CDR foram enxertadas nas sequências de esqueleto humanas seleccionadas. O anticorpo monoclonal humanizado resultante (HuLuc63) foi expresso na linha celular de mieloma de ratinho NS0. O anticorpo HuLuc63 humanizado ligou-se a CS1 humana recombinante num ensaio ELISA com um valor de EC50 de 70,1 ng/ml, similar ao valor de EC50 de 66,1 ng/ml determinado para MuLuc63 no mesmo ensaio, indicando que HuLuc63 retinha elevada afinidade para com CS1 humana.

Clonagem e Sequenciação de ADNc da Região variável de MuLuc63

Extraiu-se o ARN total de aproximadamente 5 x 107 células de hibridoma produtoras de MuLuc63 utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies, Inc., Rockville, MD). Sintetizou-se ADNc de cadeia dupla utilizando o Kit de Amplificação de ADNc SMART RACE (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) seguindo o protocolo do fornecedor. Os ADNc da região variável para as cadeias pesada e leve foram amplificados por Reacção em Cadeia pela Polimerase (PCR) utilizando iniciadores a 3' que hibridam respectivamente com as regiões C da cadeia gama e capa de ratinho, e um iniciador a 5' universal proporcionado no Kit de Amplificação de ADNc SMART RACE. Para a PCR de VH, o iniciador a 3' possui a sequência 5'-AGCTGGGAAGGTGTGCACAC-3'. Para a PCR 113 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ de VL, ο iniciador a 3' possui a sequência 5'-TTCACTGCCATCAATCTTCC-3'. Os ADNc de VH e VL foram subclonados no vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) para determinação da sequência. A sequenciação do ADN foi realizada por reacções de sequenciação em ciclos de PCR com terminadores de cadeia didesoxi fluorescentes (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Foram sequenciados quatro clones de plasmídeos para cada uma das cadeias pesada e leve. Foram identificadas sequências únicas homólogas a regiões variáveis da cadeia pesada e leve de ratinho típicas. As sequências de ADNc, juntamente com sequências de aminoácidos deduzidas das regiões V da cadeia pesada e leve de MuLuc63 estão apresentadas nas Tabelas 5 e 6. A Tabela 5 proporciona sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:27) e da região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:28) de Luc63, incluindo respectivas sequências de péptidos de sinal (SEQ ID NOS:29 e 34) . As SEQ ID NOS :30-32 e 35-37 representam CDR da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve, respectivamente. A SEQ ID NO:33 representa a mutação de aminoácido único, de NYT para NYA (em itálico) , em CDR2 da região variável da cadeia pesada de Luc63. 114 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ TABELA 5: Local de Glicosilação Putativo da Região da cadeia Pesada Variável de Luc63 Anti-CSl

Luc-63 VH (SEQ XD KO;27) SÉQ ID NO;29 SEQ ID NO:30 LKWIGEXNPDSSTINYTPSLKDKPIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARPDGNYWYP SEQ IB NO:31 SEQ ID NO;32 DVWGAQTTVTVSS ^ NYA (SEQ ID NO;33) LUC-63 VL (SEQ ID NO.-28) METHSQVFVYMLLWLSGVEGPIVMTQSKKFMSTS VGDRVSITCKASQDVGIAV SEQ XB NO: 34 SEQ ID NO:35 AWYQQKPOQS PKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTlSNVQSEDLADYF SEQ ID NO:36 CQQYSSYPYTPGGGTKLEIK SEQ ID NO;37

A Tabela 6 proporciona as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada Luc63 de ratinho (SEQ ID

NO :38), da sequência de esqueleto da região variável da cadeia pesada humana (SEQ ID No:39), ADNc de JH1 humano (SEQ ID NO:40) e da região variável da cadeia pesada de Luc63 humanizado (SEQ ID NO:41). Também são proporcionadas as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve de ratinho (SEQ ID NO:42), do esqueleto da região variável da cadeia leve humana (SEQ ID NO:43) e da região variável da cadeia leve de Luc63 humanizado (SEQ ID NO:44). 115 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ TABELA 6: Humanização de Luc63 (NYA)

VH de MuLuc-63 EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMS ADNc de VH Humana EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS VH HuLuc-63 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMS VH de MuLuc-63 WVRQAPGKGLEWIG EINPDSSTINYTPSLKD ADNc de VH Humana WVRQAPGKGLEWVA VH de HuLuc-63 WVRQAPGKGLEWIG EINPDSSTINYAPSLKD VH de MuLuc-63 KFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCAR ADNc de JH1 Humana RF TISRDNAKNS LYLQMNSLRAEDTAVYYCAR VH de HuLuc-63 KFI_I S RDNAKN S L YL QMN S L RAE D T AVY YC AR VH de MuLuc-63 PDGNYWYFDV WGAGTTVTVSS ADNc de JH1 Humana VH de HuLuc-63 PDGNYWYFDV WGQGTLVTVSS VL de MuLuc-63 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVGIAVA ADNc de VL Humana DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC VL de HuLuc-63 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQDVGIAVA VL de MuLuc-63 WYQQKPGQSPKLLIY WASTRHT ADNc de VL Humana WYQQKPGKVPKLLIY VL de HuLuc-63 WYQQKPGKVPKLLIY WASTRHT VL de MuLuc-63 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFC ADNc de VL Humana GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC VL de HuLuc-63 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC VL de MuLuc-63 QQYSSYPYT FGGGTKLEIK ADNc de VL Humana FGQGTKVEIK VL de HuLuc-63 QQYSSYPYT FGQGTKVEIK

Desenho de regiões V de HuLuc63 A humanização das regiões V dos anticorpos foi realizada como delineado por Queen, C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029-10033 (1989)). Primeiro, construiu-se um modelo molecular das regiões variáveis de MuLuc63 com o auxilio de dos programas de computador ABMOD e ENCAD (Levitt, M., J. Mol. Biol. 168: 595-620 (1983)). Em seguida, com base numa busca de homologia contra sequências de ADNc de anticorpos humanos, seleccionaram-se a sequência de VH humana E55 3-14 (Cuisinier et al., Eur. J. Iim. 23:110-118 (1993)) e do segmento J JH1 (Ravetch, J.V. et al., Cell 21: 583-591 (1981)) para 116 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ proporcionar os esqueletos para a região variável da cadeia pesada de HuLuc63. Para a região variável da cadeia leve de HuLuc63, utilizou-se o ADNc da sequência VL III-2R (Manheimer-Lory et al., J. Exp. Med. 174:1639-1652 (1991)). A identidade dos aminoácidos do esqueleto entre VH de MuLuc63 e os esqueletos aceitadores humanos era de 81,6% (71/87), enquanto a identidade entre VL de MuLuc63 e os esqueletos aceitadores humanos era de 76,3% (61/80). Os alinhamentos de MuLuc63,

HuLuc63, e das sequências de aminoácidos aceitadoras humanas para VH e VL estão mostrados nas Tabelas 7 e 8, respectivamente. A Tabela 7 proporciona um alinhamento das sequências de aminoácidos da região VH. As sequências de aminoácidos das regiões VH de MuLuc63 e HuLuc63 (SEQ ID NOS:45 e 47, respectivamente), e dos segmentos E55 3-14 e JH1 humanos (SEQ ID NO: 46) estão mostradas no código de uma letra. As sequências de CDR são baseadas na definição de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) e estão sublinhadas na sequência de VH de MuLuc63; a numeração é também de acordo com Kabat. As sequências de CDR no segmento de VH humana estão omissas na figura. Previu-se que os aminoácidos individuais sublinhados na sequência de VH de HuLuc63 contactassem com as sequências de CDR e portanto foram substituídos pelos resíduos correspondentes de ratinho. A mutação de treonina (T) para alanina (A) efectuada em CDR2 para eliminar o potencial local de glicosilação ligada a N (NYT) está indicado com sublinhado duplo. A Tabela 8 proporciona um alinhamento das sequências de aminoácidos da região VL. As sequências de aminoácidos das regiões VL de MuLuc63 e HuLuc63 (SEQ ID NOS:48 e 50, respectivamente), e da sequência de III-2R humana (SEQ ID NO:49) estão mostradas no código de uma letra. As sequências de CDR baseadas na definição de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) estão sublinhadas na sequência de VL de MuLuc63; a numeração é também de acordo com Kabat. As sequências de CDR no segmento de VL humano estão omissas na figura. Previu-se que os aminoácidos individuais sublinhados na sequência de VL de HuLuc63 contactassem com as sequências de CDR e portanto foram substituídos pelo resíduo correspondente de ratinho. 117 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

TABELA 7: Alinhamento das regiões VH de MuLuc63 (SEQ ID NO: 45) , E55 3 14 (SEQ ID NO:46), HuLuc63 (SEQ ID NO:47) 12 3 4 0 0 0 0 EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPG EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS-----WVRQAPG EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPG

MuLuc63 E55 3-14 HuLuc63

MuLuc-63 E55 3-14 HuLuc-63

5 6 7 8 0 a 0 0 0 a KGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMS KGLEWVA-----------------RFTISRDNAKNSLYLQMN KGLEWIGEINPDSSTINYàPSLKDKFIISRDNAKNSLYLQMN

MuLuC-63 E55 3-14/JH1 HuLuc-63

1 1 9 0 1 bc 0 Oab 0 KVRSEDTALYYCARPDGNYWYFDVWGAGTTVTVSS SLRAEDTAVYYCAR -.........WGQGTLVTVSS SLRAEDTAVYYCARPDGNYWYFDVWGQGTLVTVSS TABELA 8: Alinhamento da região VL de MuLuc63 (SEQ ID NO:48), III-2R (SEQ ID NO:49) e HuLuc63 (SEQ ID NO:50)

MuLuc63 III-2R HuLuc63

12 3 4 0 0 0 0 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGIAVAWYQQKPGQ DIQMTQS PS S LS AS VGDRVTI TC-----------WYQQKPGK. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGIAVAWYQQKPGK MULUC63 III-2R HuLuc63

5 6 7 8 0 0 0 0 S PJCLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDPTLTISNVQSEDLA VPKLLIY-------GVPSRFS GSGSGTDFTLTISS LQP EDVA VPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVA MULUC63 III-2R HuLuc63

1 9 0 0 0 DYFCQQYS SYPYTFGGGTKLEIK TYYC---------FGQGTKVEIK TYYCQQYSSYPYTFGQGTKVEIK

Nas posições do esqueleto em que o modelo de computador sugeriu contacto significativo com as CDR, os aminoácidos das regiões V de MuLuc63 substituíram os aminoácidos de esqueleto humanos originais. Isto foi realizado nos residuos 28, 48, 49, 66 e 68 da cadeia pesada (Tabela 7) . Para a cadeia leve, a substituição foi efectuada no residuo 60 (Tabela 8). Note-se que o sistema de numeração utilizado aqui é o de Kabat 118 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Em adição, a inspecção da sequência de aminoácidos de MuLuc63 revelou um local para potencial glicosilação ligada a N em CDR2 da região VH. Estes locais de glicosilação ligada a N têm a sequência genérica N-X-T/S (onde N = asparagina, X = qualquer aminoácido e S/T = serina ou treonina). Como a presença de glicosilação ligada a N no domínio variável podia ter efeitos indesejáveis durante o desenvolvimento de HuLuc63 como anticorpo terapêutico, o potencial local de glicosilação em CDR2 (N-Y-T) foi eliminado pela mutação de substituição de treonina pela alanina (N-Y-A) no desenho humanizado.

Construção de genes de VH e VL de HuLuc63

Um gene que codifica cada uma de VH e VL de HuLuc63 foi desenhado na forma de um mini-exão incluindo um péptido de sinal, um sinal dador de splicing e locais para enzimas de restrição apropriadas para subsequente clonagem num vector de expressão de mamífero. Os sinais dadores de splicing nos mini-exões de VH e VL eram derivados das correspondentes sequências humanas de linha germinal JH6 e JK4, respectivamente. As sequências dos péptidos de sinal nos mini-exões de VH e VL de HuLuc63 eram derivadas das correspondentes sequências de VH e VL de MuLuc63, respectivamente. As sequências de nucleótidos de genes de VH e VL de Luc63 juntamente com as sequências de aminoácidos deduzidas estão mostradas nas Tabelas 5 e 6.

Os genes de VH e VL de HuLuc63 foram construídos por extensão de oligonucleótidos sintéticos sobrepostos que variavam em comprimento de 33 a 43 bases e amplificação por PCR. (Stemmer et ai., Gene 164:49-53 (1995)). Os fragmentos amplificados por PCR foram purificados com o kit de purificação por PCR Qiaquick (Qiagen) e digeridos com MluI e Xbal. O gene de VH de HuLuc63 foi subclonado em pHuHCgl.D para criar o plasmideo pHuHCgl. D-HuLuc63. O gene de VL de HuLuc63 foi subclonado em pHuCkappa.rgpt.dE, um derivado do vector de expressão da cadeia leve capa, pOKT3.Vk.rg (Cole, M.S. et ai., J. Immunol. 159: 3613-3621 (1997)), para criar o plasmideo pHuCkappa.rgpt.dE-HuLuc63. 119 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Expressão de HuLuc63 O anticorpo IgGl/κ HuLuc63 foi produzido por transfecção transiente de células em cultura de tecido. A linha celular de rim embrionário humano 293-H (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi mantida em DMEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) contendo 10% de FBS (HyClone, Logan, UT) e aminoácidos não essenciais (Invitrogen). As células 293-H foram plaqueadas a lxlO6 células por poço num volume de 2,5 ml numa placa de 6 poços no dia anterior à transfecção utilizando meio regular (DMEM + 10% de FBS + aminoácidos não essenciais) . No dia da transfecção, diluiram-se 4 pg de ADN plasmidico por poço em 250 μΐ de Hybridoma-SFM (H-SFM, Invitrogen). Diluiram-se 10 μΐ de Reagente Lipofectamine 2000 (LF2000, Invitrogen) por poço em 250 μΐ de H-SFM. O ADN diluido foi combinado com LF2000 diluído e incubou-se durante 20 minutos para permitir a formação dos complexos DNA-LF2000. Adicionaram-se 500 μΐ de complexos DNA-LF2000 a cada poço e misturou-se com movimentos da placa para trás e para a frente. As células foram incubadas durante 5 dias antes da colheita do sobrenadante para análise. A expressão de HuLuc63 foi medida por ELISA em sanduíche. Revestiram-se placas Immulon 4 HBX (Thermo Labsystems, Franklin, MA) durante a noite a 4°C com 100 μΐ/poço de 1,8 pg/ml de anticorpos policlonais de cabra anti-IgG humana específicos para a cadeia Fcy (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) em tampão de carbonato-bicarbonato de sódio 0,2 M, pH 9,4, lavaram-se com Tampão de Lavagem (PBS contendo 0,1% de Tween 20), e bloquearam-se durante 30 min à temperatura ambiente com 150 μΐ/poço de Tampão de Bloqueio SuperBlock em TBS (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) . Após lavagem com Tampão de Lavagem, amostras contendo HuLuc63 foram apropriadamente diluídas em Tampão de ELISA (PBS contendo 1% de BSA e 0,1% de Tween 20) e aplicaram-se 100 μΐ/poço nas placas de ELISA. Como padrão, utilizou-se anticorpo monoclonal humanizado anti-CD33 IgGl/κ HuM195 (Co, M.S. et ai., J. Immunol., 148: 1149-1154 (1992)). Após incubação das placas durante 1 h à temperatura ambiente e lavagem com Tampão de Lavagem, os anticorpos ligados foram detectados utilizando 100 μΐ/poço de uma diluição de 1:1000 de anticorpos policlonais de cabra anti-cadeia capa humana conjugados com HRP (SouthemBiotech, Birmingham, AL). Após incubação durante 1 h à temperatura ambiente e lavagem com 120 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Tampão de Lavagem, realizou-se o desenvolvimento de cor por adição de 100 μΐ/poço de substrato ABTS (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) . O desenvolvimento de cor foi parado por adição de 100 μΐ/poço de ácido oxálico a 2%. A absorvância foi lida a 415 nm utilizando um leitor de microplacas VersaMax (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA).

Propriedades de Ligação de MuLuc63 e HuLuc63

As afinidades de MuLuc63 e de HuLuc63 para com CS-1 humana foram analisadas por ELISA de ligação directa. Poços de placas de ELISA de 96 poços (placas Immulon 4 HBX, Thermo Labsystems, Franklin, MA) foram revestidas com 100 μΐ de proteína de fusão solúvel CS1 humana - Fcy3 humana a 1 pg/ml em PBS durante a noite à temperatura ambiente. Após lavagem com Tampão de Lavagem, bloguearam-se os poços com 150 μΐ de Tampão de Blogueio Superblock durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo HuLuc63 expresso transientemente ou o anticorpo MuLuc63 purificado foram apropriadamente diluídos em Tampão de ELISA e aplicados em placas de ELISA (100 μΐ por poço). As placas de ELISA foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente e os poços foram lavados com Tampão de Lavagem. Depois, adicionaram-se a cada poço das placas de HuLuC63 e MuLuc63, 100 μΐ de anticorpo de cabra anti-Cx humana conjugado com HRP ou anticorpo de cabra anti-Cx de ratinho conjugado com HRP (ambos de Southern Biotech) diluídos de 1:1000 em Tampão de ELISA, respectivamente, e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavagem com Tampão de Lavagem, adicionaram-se 100 μΐ de substrato ABTS (KPL) a cada poço. O desenvolvimento de cor foi parado por adição de 100 μΐ de ácido oxálico a 2% por poço. A absorvância foi lida a 415 nm utilizando um leitor de microplacas VERSAmax. Os resultados das experiências de ligação de ELISA mostraram gue o MuLuc63 e o HuLuc63 se ligam a CS-l-Fcy3 humana de uma maneira dependente da concentração. 0 valor de EC5o de HuLuc63, obtido utilizando o software de computador GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), foi de 70,1 ng/ml. Este é similar ao valor de EC50 de 66,1 ng/ml obtido para muLuc63, indicando gue a humanização do anticorpo monoclonal de ratinho anti-CSl, MuLuc63, foi bem-sucedida: o HuLuc63 reteve elevada afinidade de ligação para com CS1 humana. 121 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Exemplo 6: Papel de CS1 em Desordens Auto-imunes CS1 é altamente expressa em células T e B estimuladas, em comparação com células não estimuladas:

Para determinar a expressão de CS1, montou-se um ensaio in vitro para estimular linfócitos B e T de sangue periférico, utilizando os estimulantes mitogénio de fitolaca (PWM) e fito-hemaglutinina (PHA). Células mononucleares de sangue periférico de controlo, não estimuladas, foram preparadas em paralelo sem estimulação. 0 ARNm poliA+ foi isolado e o ADNc foi sintetizado a partir destas amostras utilizando técnicas padrão. O gene de CS1 foi amplificado por PCR utilizando iniciadores oligonucleotidicos específicos para CS1 (veja-se acima) e a expressão foi quantificada utilizando Gel Doc 2000 da Biorad. As intensidades dos sinais foram normalizadas relativamente ao controlo de β-actina humana. A análise por PCR em tempo real indicou que a CS1 apresentava uma supra-regulação de cerca de 23 vezes em células B de sangue periférico activadas e uma supra-regulação de cerca de 30 vezes em linfócitos T de sangue periférico activados, comparativamente com células não estimuladas. A CS1 está supra-regulada nos linfócitos B de sangue periférico de pacientes de lúpus comparativamente com os dos adultos saudáveis de idade correspondente:

Para avaliar a expressão de CS1 em pacientes de lúpus comparativamente com indivíduos saudáveis, isolaram-se linfócitos B de sangue periférico por selecção celular de células CD19+ de um paciente de lúpus versus um banco de adultos saudáveis. Isolou-se o ARNm poliA+ e sintetizou-se o ADNc utilizando técnicas padrão. A expressão de CS1 foi avaliada por PCR em tempo real utilizando iniciadores oligonucleotídicos específicos para CS1. Os resultados da PCR em tempo real indicaram que a CS1 está supra-regulada cerca de 2 vezes em linfócitos B do paciente de lúpus comparativamente com os indivíduos saudáveis. Após normalização com β-actina, o gene de CS1 estava aumentado 2,3 vezes no ADNc de linfócitos B de pacientes de lúpus comparativamente com o ADNc dos indivíduos saudáveis. Quando normalizada com iniciadores de ARNr de 18S, a CS1 estava aumentada 1,8 vezes nas amostras de ADNc respectivas. 122 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Supra-regulação de novel Ly9 de ratinho em células B activadas e células T activadas:

A novel Ly 9 de ratinho é um ortólogo proposto da CS1 humana (Tovar et al., Immunogenetics 54: 394-402 (2002)). A expressão de novel Ly9 de ratinho em células B activadas e T activadas foi examinada por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que a novel Ly9 de ratinho é supra-regulada em células B activadas e T activadas. A expressão de novel Ly9 de ratinho foi analisada com um Sistema de Detecção de Sequências ABI GeneAmp 5700 (veja-se o Exemplo 2). Após normalização com iniciadores de ARNr de 18S, o gene de Ly9 estava aumentado em 3 vezes no ADNc estimulado com conA, e supra-regulado em 6 vezes em ADNc estimulado com LPS em comparação com o ADNc esplénico não estimulado.

Supra-regulação de CS1 em Tecido de Doença Inflamatória do Intestino

Determinou-se a expressão de proteína(s) moduladora(s) de DlI em tecido de DII (tanto na doença de Crohn como na colite ulcerativa) versus tecido normal, em arrays em microchips como descrito acima. Os microarrays de oligonucleótidos foram interrogados com ARNc derivados de múltiplos tecidos. Mais especificamente, os ARNc foram gerados por ensaios de transcrição in vitro (IVT) de nove espécimes de DII e nove de intestino normal adjacente correspondente, e 24 amostras epiteliais colónicas. A hibridação de ARNc com os microarrays de oligonucleótidos foi medida pela intensidade média de fluorescência (AI), que é directamente proporcional ao nível de expressão do gene.

Os resultados foram analisados por comparação dos níveis de expressão dos genes na DII com tecidos e órgãos de adultos não patogénicos. Um dos genes identificados com um aumento significativo na expressão génica no tecido da doença inflamatória do intestino comparativamente com tecido normal é o da CS1. Uma análise de microarrays mostrou que a expressão do gene de CS1 está aumentada na colite ulcerativa e na doença de Crohn em comparação com células epiteliais colónicas de adulto saudável. 123 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Para adicionalmente avaliar a expressão de CS1 em pacientes da doença inflamatória do intestino comparativamente indivíduos saudáveis, amostras de secções doentes de intestino grosso de 2 pacientes de doença de Crohn e 3 pacientes de colite ulcerativa versus amostras de intestino grosso normal de 3 adultos saudáveis foram desagregadas, lavadas e colocadas em TRIZOL®. O ARN total foi isolado seguindo o protocolo do fabricante. O ARN total foi tratado com ADNase isenta de ARNase (GenHunter). O ARN digerido com ADNase foi extractado com fenol/clorofórmio, e precipitado durante a noite com etanol. O ARN foi lavado com etanol a 75% e dissolvido em água sem nuclease. O ARN foi quantificado e a integridade do ARN foi analisada num gel de agarose. Os resultados da PCR em tempo real indicaram que a CS1 está supra-regulated 7 vezes e 6 vezes em intestino grosso doente de pacientes da doença de Crohn (n=2) e 13 vezes, 14 vezes e 46 vezes em intestino grosso doente de pacientes de colite ulcerativa (n=3) comparativamente com intestino normal reunido de indivíduos saudáveis (n=3).

Exemplo 7: Expressão de CS1 em Células de Cancro Padrão de Expressão da Proteína CS1: A expressão da proteína CS1 foi adicionalmente examinada com os anticorpos Luc produzidos através de análise FACS. Incubaram-se linhas celulares com anticorpos anti-CSl Luc90.Hl ou anticorpos de controlo de isotipo IgG2b de ratinho durante 30 minutos em gelo. As células foram lavadas com PBS e adicionou-se Ig anti-ratinho conjugada com ficoeritrina (PE) às células e incubou-se durante 30 minutos em gelo. As células foram lavadas e analisadas por citometria de fluxo num FACS Caliber (Becton Dickinson). Os resultados mostram que a CS1 é expressa em linhas de células de leucemia ARH-77, linhas de células linfoblastóides B IM9 e CESS, e linhas de células de mieloma L363, LP1 e OPM2.

Amostras de pacientes com mieloma múltiplo (n=21 amostras de medula óssea), uma de pacientes com GMSI (gamopatia monoclonal de significado indeterminado; n=l), uma de pacientes com leucemia de células plasmáticas (n=l), células estaminais CD34+ mobilizadas da medula óssea (n=5), células da medula normais (n=3), tecido de nódulos linfáticos normais (n=l), de pacientes com Leucemia Linfoblástica Crónica (LLC; 124 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ η=15), de pacientes com leucemia mielógena aguda (LMA; n=ll), de um paciente com linfoma não hodgkiniano (LNH; n=l) e de um paciente com linfoma de Hodgkin (n=l), foram incubadas com anticorpos contra CS1 (Luc90 ou Luc63) conjugados com FITC, CD45-PerCP, CD38-PE e/ou CD138-PE e processados como detalhado acima para análise FACS de células de mieloma. Os anticorpos anti-CSl de ratinho aqui utilizados são Luc90 (IgG2b), Luc63 (IgG2a), Luc38 (IgG2b) e outros anticorpos Luc anti-CSl produzidos. Os anticorpos de controlo de isotipo eram de isotipo correspondente aos anticorpos IgG de ratinho.

Obtiveram-se aspirados de medula óssea de pacientes de mieloma múltiplo da clinica Cleveland Clinic. As linhas celulares de mieloma (LP1, L363, OPM2, NCI-H929, RPMI 8226 e U266 Bl), a linha celular de leucemia ARH-77, linhas linfoblastóides B (IM9, CESS), e células de medula óssea foram coradas com anticorpos monoclonais anti-CSl versus anticorpos de controlo de isotipo (Becton Dickinson) seguindo um protocolo de coloração padrão. As células foram lavadas, colocadas em tampão de coloração (RPMI, 10% de FBS para células humanas ou DMEM, FBS a 10%), e anticorpos anti-CSl versus anticorpos de controlo de isotipo foram adicionados a 0,5-1 ug de anticorpo por milhão de células em 0,1 ml de volume final. Para amostras de pacientes, lisaram-se glóbulos vermelhos do sangue, e formaram-se peletes de células numa centrífuga e ressuspenderam-se em tampão de coloração. Para anticorpos que não foram directamente conjugados a FITC, adicionaram-se anticorpos de segundo estádio a 0,5-1 ug de anticorpo por milhão de células em 0,1 ml de volume final. As células foram lavadas e ressuspensas em tampão de coloração para análise FACS num FACSCaliber Becton Dickinson utilizando software CellQuest. Para distinguir células plasmáticas, células de medula óssea de mieloma múltiplo foram coradas com anticorpos monoclonais anti-CD45, anti-sindecano-1 (CD138) e anti-CD38. O anti-sindecano-1 (CD138) cora especificamente células plasmáticas e não outros leucócitos.

Os resultados mostram que a CS1 é altamente expressa em células plasmáticas (eg células CD138+) de dez pacientes de mieloma múltiplo e células plasmáticas de um paciente de leucemia de células plasmáticas, assim como em várias linhas celulares de mieloma (L363, LP1, e OPM2) . Um total de 21 125 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ amostras de medula óssea diferentes de pacientes de mieloma múltiplo foram ensaiadas por fluxo e para todas as 21 de 21 amostras, virtualmente todas as células plasmáticas de medula óssea expressam CS1. A CS1 é também expressa em células de leucemia ARH-77 e linhas celulares linfoblastóides B (IM9 e CESS).

Exemplo 8 - Expressão de CS1 em Células Plasmáticas de

Paciente de Mieloma

Amostras de medula óssea de um paciente de mieloma múltiplo foram coradas com CD138-PE, CD45PerCP, Luc90-FITC, e/ou IgG2b-FITC (anticorpo de controlo de isotipo) e foram analisadas por FACS como detalhado acima (veja-se o

Exemplo 5). As células foram balizadas para conter linfócitos, monócitos, granulócitos, células eritróides, células plasmáticas e blastos. Os resultados mostraram que a CS1 é expressa em células plasmáticas (eg células CD138 + ) do paciente de mieloma múltiplo.

Exemplo 9: O Anticorpo Monoclonal Anti-CSl Diminui a Secreção de IgM por Células B de Sangue Periférico Activadas

As células mononucleares de sangue periférico de um adulto normal foram isoladas por um gradiente Ficoll padrão, incubadas com mitogénio de fitolaca a 10 pg/ml (GIBCO/BRL, Inglaterra, o Reino Unido), e plaqueadas numa placa de 24 poços num volume total de 1 ml. O anticorpo monoclonal (anti-CSl humano de ratinho (Luc63) ou de controlo de isotipo de IgG de ratinho) foi adicionado aos poços das amostras a 100 pg/ml ou 10 pg/ml. As células e o anticorpo foram incubados a 37°C em C02 a 7% durante 8 dias. Os sobrenadantes das culturas foram isolados e a IgM foi ensaiada por ELISA como descrito acima. O resultado mostrou que o anticorpo Luc63 a 100 pg/ml ou 10 pg/ml diminuiu a secreção de IgM das células mononucleares de sangue periférico comparativamente com a secreção de IgM por células incubadas com o controlo de isotipo a 100 pg/ml ou 10 pg/ml ou sem anticorpo. O Anticorpo Monoclonal Anti-CSl Diminui a Secreção de IgM por Células B de Sangue Periférico Activadas de Pacientes de Doenças Auto-imunes: 126 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Os sobrenadantes das culturas celulares de células mononucleares de sangue periférico foram isolados como detalhado acima e ensaiados por ELISA. Placas Immulon-1 foram revestidas com 100 μΐ de anticorpo monoclonal de ratinho anti-IgM humana a 1 pg/ml (n.° de catálogo 05-4900, Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, Califórnia) em PBS. As placas foram bloqueadas durante 1 hora com Tampão de ELISA ('EB' = PBS + BSA a 0,1% + Tween 20 a 0,05%). Os sobrenadantes das culturas foram adicionados em várias diluições (em EB) a 100 μΐ/poço. Os sobrenadantes e a IgM humana padrão (n.° de catálogo 009-000-012, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) foram incubados durante 1-2 horas à temperatura ambiente. A IgM humana capturada foi desenvolvida com anticorpo policlonal de cabra anti-IgM humana - HRP (n.° de catálogo 2020-05, Southern Biotech Association, Birmingham, Alabama) e substrato de HRP, seguindo o protocolo do fabricante. A IgM ligada foi visualizada por espectrofotometria (DO de 405 nm) num leitor de placas de ELISA padrão. Os resultados mostraram que a quantidade da IgM segregada pelas PBMC do paciente de lúpus foi reduzida de 0,18 ug/ml quando tratada com um anticorpo de controlo de isotipo para 0,10 ug/ml pelo tratamento com anticorpos anti-CSl (Luc90Hl). Um controlo positivo de anticorpo anti-CD2 que segregava IgM a 0,12 ug/ml mostrou que o anticorpo anti-CSl é ainda mais robusto na redução da produção de IgM do que o anticorpo anti-CD2. O Anticorpo Monoclonal Anti-CSl Diminui a Produção de IgG por Células B de Sangue Periférico de Adultos Saudáveis e de Pacientes de Doença Auto-imune. A produção de IgG por células B de sangue periférico de adultos saudáveis e pacientes de doença auto-imune (lúpus) foi analisada da mesma maneira que a produção de IgM. O resultado mostrou que a produção total pelas células mononucleares de sangue periférico de adulto saudável 9 dias após o tratamento com o anticorpo anti-CSl (Luc90H.l) diminuiu em cerca de 23% em comparação com o controlo de isotipo IgG2b. A produção total de IgG por células mononucleares de sangue periférico de pacientes de lúpus 9 dias após o tratamento com anticorpo anti-CSl (Luc90H.l) diminuiu em cerca de 56% em comparação com o controlo de isotipo IgG2b. As Tabelas 3A e B resumem a inibição da produção de IgG por vários anticorpos anti-CSl gerados. Como mostrado na Tabela 3A, o Luc90.Hl reduziu em 127 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ cerca de 40% a produção de IgG por PBMC activadas com lipopolissacárido ou mitogénio de fitolaca. O Luc34.1 reduziu em cerca de 38% a produção de IgG por PBMC activados com mitogénio de fitolaca. Como mostrado na Tabela 3B, o Luc 90.Hl reduziu a produção de IgG por PBMC de um adulto saudável e por uma linha de células B maduras (células IM9) em cerca de 48%. 0 Luc34.1 reduziu a produção de IgG por PBMC do adulto saudável em cerca de 53%. 0 Luc63.2 reduziu a produção de IgG por PBMC e células IM9 em cerca de 47%. Destas experiências é evidente que o Luc90H.l, o Luc34.1 e o Luc63.2 são os melhores anticorpos funcionais. Do mapeamento de epítopos, o Luc90 e o Luc63 possuem epítopos não sobrepostos.

TABELA 3A. ANTI-CS-1 DIMINUI A PRODUÇÃO DE IG POR CÉLULAS B ACTIVADAS IN VITRO

Percentagem Média da Diminuição Comparativamente Com o Controlo de Isotipo PBMC Activadas In Vitro MAB ANTI-CS-1 % Média de Diminuição HuIgG ± SE Lipopolissacárido Luc 90.Hl 41% ±8% (n = 3) Mitogénio de fitolaca Luc 90.Hl 39% ±9% (n = 4) Mitogénio de fitolaca Luc 34.1 38% ±7% (n = 4)

Tabela 3B. Sumário de Ensaios de Produção de Ig com vim Painel de Anticorpos Anti-CS-1

PERCENTAGEM MÉDIA DA ALTERAÇÃO DE IG COMPARATIVAMENTE COM CONTROLO DE ISOTIPO MAB ANTI-CS1 PMBC DADOR 55 PMBC DADOR 705 IM9 % MÉDIA DE ALTERAÇÃO DE IG LUC90H.1 -44% -56% -43% -48% LUC37 + 11% -43% -11% -14% LUC23 -13% -4% +6% -4% LUC63.2 -55% -51% -36% -47% LUC34.1 -64% -49% -45% -53% LUC38.1 -22% -44% -21% -29% LUC29D6 -43% -44% -25% -37% DIMINUIÇÃO RELATIVA NA PRODUÇÃO DE IG: GRUPO A (>45% DIM): LUC90, 63, 34 GRUPO B (29-37% DIM): LUC38, 29D6 GRUPO C (4-14% DIM): LUC37, 23 128 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Os resultados experimentais indicaram que os anticorpos anti-CSl diminuem a produção tanto de IgG como de IgM por células B de sangue periférico in vitro.

Exemplo 10: Redução de IgG In Vivo por Anticorpos

Monoclonais Contra CS1 num Modelo de Ratinho SCID-HuPBMC.

Modelo de ratinho SCID-HuPBMC Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humanas foram isoladas por gradientes de densidade padrão Ficoll-paque (Amersham Biosciences) e ressuspensas em solução tamponada com fosfato (PBS) a 2 X 107 PBMC/ml. As PBMC ressuspensas (1 ml) foram injectadas intraperitonealmente (i.p.) em ratinhos C.B-17 SCID. Duas a três semanas após a injecção das PBMC, foram colhidas amostras de soro dos ratinhos e ensaiaram-se quanto a IgG humana por ELISA. Os ratinhos enxertados (que produzem >1 pg/ml de IgG humana no soro) foram distribuídos aleatoriamente nos grupos de tratamento e depois foram tratados com anticorpos monoclonais de ratinho anti-CSl humana (Luc90.Hl ou Luc63.2.22), anticorpos de controlo de isotipo de ratinho (IgG2b ou IgG2a, respectivamente), ou PBS. Os ratinhos receberam doses de 200 ug de anticorpo em 500 μΐ de PBS a cada 3-4 dias com 3 ou 4 doses de anticorpo. O soro dos ratinhos foi analisado quanto a IgG humana por ELISA utilizando protocolos padrão. A percentagem de alteração da IgG humana no soro foi calculada para cada ratinho subtraindo a concentração de IgG humana antes da primeira dose de anticorpo (dia 0) da concentração de IgG humana após a dose (dia x), dividindo pela concentração de IgG humana anterior à primeira dose (dia 0), e multiplicando por 100, e.g., [(dia x - dia 0)/ dia 0] X 100.

Os resultados estão mostrados como a percentagem média de alteração com o erro padrão para cada grupo de ratinhos. As concentrações de IgG humana são a concentração média com o erro padrão para cada grupo de ratinhos. Utilizou-se o teste t de Welch de 2 amostras para comparar a percentagem de alteração da IgG humana nos grupos de tratamento.

Os anticorpos anti-CSl reduziram a produção de IgG humana in vivo 129 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Os resultados mostram que os anticorpos anti-CSl da presente invenção reduzem substancialmente a produção de imunoglobulina humana no modelo de transferência SCID-HuPBMC. Como mostrado na Figura IA, Luc90.Hl reteve o aumento na produção de IgG em PBS e controlo de isotipo logo ao Dia 4 (4 dias após o tratamento com a primeira dose do anticorpo). Esta redução continuou ao longo das 7 semanas (Dia 32) do período de teste. Por exemplo, no Dia 18, a produção de IgG humana aumentou em 225% em controlo de isotipo IgG2b, em 181% no controlo de PBS, enquanto a produção de IgG humana diminuiu em 14% com tratamento com Luc90H.l. O Luc90H.l não apenas aboliu o aumento de 181-225% na produção de IgG humana nos grupos de controlo, como também resultou numa diminuição adicional de 14% na produção de IgG. No Dia 25, o Luc90H.l não apenas aboliu o aumento de 3 vezes na produção de IgG humana nos grupos de controlo, como também originou uma diminuição adicional de 24% na produção de IgG humana. O Luc63.2 também reduziu eficazmente a produção de IgG in vivo. Como mostrado na Figura 1B, o Luc63.2 aboliu o aumento de 3 7 - 46% na produção de IgG humana nos grupos de controlo (PBS e controlo de isotipo IgG2a) e originou uma diminuição adicional de 59% na produção de IgG. Neste mesmo estudo, o Luc90.Hl foi comparado com Luc63.2 e Luc90.Hl e aboliu o aumento de 37-114% nos grupos de controlo (PBS e controlo de isotipo IgG2b) e originou uma diminuição adicional de 14% na produção de IgG por ratinhos enxertados com células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humanas. A Figura 1C resume adicionalmente a redução na produção de Ig por tratamento com Luc90 e Luc63 no modelo SCIDHuPBMC. Embora abolisse o aumento de produção de IgG em ratinhos tratados com controlos de isotipo e de PBS, o Luc90 provocou uma diminuição adicional na produção de IgG de 14%, 22%, 24% e 39%, e o Luc63 teve uma diminuição adicional de 40% e 59%. Assim, podemos concluir que o tratamento anti-Luc de ratinhos SCID enxertados com PBMC humanas (SCID-HuPBMC) não apenas aboliu completamente o aumento na imunoglobulina humana normalmente observado no soro destes animais, como também origina uma diminuição adicional em comparação com os níveis pré-tratamento. 130 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Exemplo 11: Actividades de ADCC de Anticorpos Anti-CSl Preparação de células efectoras:

As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humanas (células efectoras) foram isoladas de sangue completo utilizando gradientes de densidade padrão Ficoll-Paque (Amersham Biosciences). Lavaram-se as células e ressuspenderam-se em meio RPMI suplementado com 1% de albumina sérica bovina (BSA).

Preparação de células alvo:

Lavaram-se células transfectantes estáveis que expressam CS-1 na superfície celular (células alvo) e ressuspenderam-se em meio RPMI suplementado com 1% de BSA. As células foram plaqueadas a 100 000 células/poço em 50 μΐ de volume total. Adicionaram-se anticorpos monoclonais de ratinho anti-CS-1 humana (Luc90.Hl ou Luc63.2.22) ou anticorpos de controlo de isotipo (IgG2b ou IgG2a de ratinho, respectivamente), em várias concentrações, às células alvo, num volume final de 100 μΐ, e incubaram-se durante 30 minutos à temperatura ambiente.

Após incubação, adicionaram-se 100 μΐ de PBMC efectoras às células alvo numa razão de 20:1 em 200 μΐ de volume final. Incubaram-se células alvo e efectoras a 37°C durante 5 horas ou durante a noite. Centrifugaram-se as células a 350 X g durante 5 minutos, e recolheram-se 100 μΐ/poço de sobrenadante e transferiram-se para uma placa de microtitulo de fundo plano de 96 poços opticamente transparentes.

Ensaio de Lactato-desidrogenase:

Para determinar a actividade de lactato-desidrogenase (LDH) contida nos sobrenadantes, adicionaram-se 100 μΐ de mistura reaccional do Kit de Detecção de Citotoxicidade (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a cada poço, e incubaram-se as amostras durante até 30 minutos a 15-25°C. Durante este período de incubação, protegeu-se a placa de microtitulo da luz. Mediu-se a absorvância das amostras a 490 nm utilizando um leitor de ELISA.

Para determinar a percentagem de citotoxicidade mediada por células, calculou-se a absorvância média das amostras e 131 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ subtraíram-se os controlos de fundo utilizando a equação seguinte:

Citotoxicidade (%) = libertação de LDH,---- LEefeetor-LEaivo x 100 LMalvo — LEaivo LE: Libertação espontânea LM: Libertação máxima

Os controlos experimentais foram libertação espontânea das células alvo sozinhas ou das células efectoras sozinhas. As células alvo foram ensaiadas em solução de Triton-X100 a 2% (1:1).

Anticorpos Anti-CSl Induzem Citotoxicidade Derivada de Anticorpos (ADCC) A experiência mostrou que os anticorpos anti-CSl Luc63.2 e Luc90 induziram citotoxicidade derivada de anticorpos (ADCC) de células que expressam CS1 na presença de PBMC (as células efectoras). Os resultados mostraram que o Luc90 induz citotoxicidade de uma maneira dependente da dosagem. Uma quantidade de 50 yg/ml de Luc90 induziu quase 50% de citotoxicidade das células alvo. O Luc63.2 geralmente induzia 60-80% de citotoxicidade das células alvo com uma gama de doses de 10-50 yg/ml. Obtiveram-se resultados similares de experiências conduzidas com dois dadores adicionais.

Exemplo 12: Actividade de ADCC com Anticorpos contra CS1 de Baixo Teor de Fucose

Clonagem de ADNc da Região Variável de Luc90

As regiões variáveis murinas (sequência ID N.° 3 e N.° 4) foram clonadas a partir da linha celular de hibridoma Luc90 por métodos padrão. Resumidamente, o ARN total foi extraído e foi sintetizado o ADNc de cadeia dupla utilizando o Kit de Amplificação de ADNc SMART 5'-RACE (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) seguindo o protocolo do fornecedor. Os fragmentos de PCR dos ADNc da região variável foram clonados no vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) para determinação da sequência. Foram sequenciados vários clones plasmídicos para cada uma das cadeias pesada e leve. Foram identificadas sequências únicas homólogas às regiões variáveis da cadeia pesada e leve típicas de ratinho. 132 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Construção de Vectores de expressão de VH e VL de Luc90 Quiméricos

Um gene que codifica cada uma de VH e VL de Luc90 foi desenhado na forma de um mini-exão incluindo um péptido de sinal, um sinal dador de splicing, uma sequência de iniciação de Kozak e locais para enzimas de restrição apropriadas para subsequente clonagem num vector de expressão de mamífero. Os iniciadores foram desenhados para conter os locais de restrição e complementaridade apropriados para PCR a partir dos vectores TOPO contendo cada um dos genes de VH ou VL. Os fragmentos amplificados por PCR foram purificados pelo kit de purificação por PCR Qiaquick (Qiagen) e digeridos com MluI e Xbal. O gene de VH de Luc90 foi subclonado em pHuHCgl.D (tipo selvagem) ou pHuHCgl.D.AA (mutante BS) para criar os plasmídeos pChiHuHCgl.D-MuLuc9OVH e pChiHuHCgl.D.AA-MuLuc9OVH, respectivamente. O mutante BS contém duas alterações de aminoácidos (L234A/L235A) na região CH2 de IgGl, de modo que é abolida a ligação a receptores de Fc (Xu et al., (2000) Cell Immunol. 200:16-26). O gene de VL de Luc90 foi subclonado em pVk para criar o plasmídeo pChiVk-MuLuc90VL. Criaram-se vectores de expressão plasmídicos individuais de modo a que os genes das cadeias pesada e leve pudessem ser expressos a partir de um único plasmídeo. Os vectores da cadeia pesada foram digeridos com EcoRI para remover a totalidade da região da cadeia pesada e subclonados num único local EcoRI no vector da cadeia leve. A cadeia pesada do mutante BS foi combinada com o fragmento do vector pChiVk-MuLuc90VL para criar o plasmídeo pChiLuc90-BSK enquanto a cadeia pesada de tipo selvagem foi subclonada no vector pChiVk-MuLuc90VL para criar o plasmídeo pChiLuc90-glK.

Expressão de Luc90 Quimérico

Produziram-se anticorpos quiméricos Luc90 IgGl/κ de tipo selvagem e BS por transfecção estável de células Sp2/0 com os vectores pChiLuc90-glK e pChiLuc90-BSK, respectivamente. Foi produzido um anticorpo de baixo teor de fucose por transfecção estável de células YB2/0 com o vector pChiLuc90-glK. Os clones positivos foram seleccionados com meios de ácido micofenólico e rastreados por ELISA. O clone de tipo selvagem AH4, o mutante BS HG12 e o clone de baixo teor de fucose 5E4 foram seleccionados pela elevada expressão, adaptados a meios 133 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ isentos de soro Gibco Hybridoma com 2% de Soro Bovino Fetal de baixo teor de Ig. Cresceram-se culturas de dois litros em balões rolantes para purificação. Putrificaram-se os anticorpos por cromatografia em coluna de afinidade de Proteina-G padrão.

Os resultados mostraram que os anticorpos quiméricos anti-CSl Luc90 estimulam citotoxicidade celular dependente de anticorpos de células que expressam CS1 numa linha celular estável que expressa CS1 humana e duas linhas celulares de mieloma humanas, OPM2 e L363. Em cada caso, a citotoxicidade é significativamente melhorada por anticorpos que possuem baixos níveis de fucose (através de crescimento em células YB2/0 como detalhado acima).

Exemplo 13: Tratamento de Mieloma com Anticorpos Anti-CSl O tratamento com anticorpo anti-CSl in vivo foi realizado num modelo de tumor de mieloma de ratinho por injecção intraperitoneal do anticorpo no indivíduo de teste. Como mostrado na Figura 2, o tratamento com anticorpo anti-CSl (Luc63 e Luc90) diminui a dimensão do tumor comparativamente com os animais tratados com controlo de isotipo. Neste estudo, injectaram-se i.p. 1 X 107 células de mieloma (linha celular de mieloma L363) em ratinhos CB.17 SCID. Duas semanas mais tarde, quando a dimensão do tumor atingiu ~80 mm3, distribuíram-se aleatoriamente os ratinhos por 4 grupos com 8 ratinhos por grupo. Trataram-se os ratinhos com anticorpos anti-CSl (Luc63 ou Luc90) ou anticorpos de controlo de isotipo (IgG2a de ratinho ou IgG2b de ratinho). Os ratinhos receberam doses de 200 pg de anticorpo/ratinho durante 8 doses a 3 doses por semana. Os resultados mostram que os ratinhos tratados com anticorpos anti-CSl possuem volumes tumorais significativamente reduzidos comparativamente com ratinhos tratados com o anticorpo de controlo de isotipo. No dia 25 do estudo (após 5 doses), os ratinhos tratados com Luc63 apresentam uma dimensão tumoral média de -100 mm3 comparativamente os ratinhos tratados com anticorpo de controlo de isotipo IgG2a (dimensão tumoral média de -800 mm3). Os ratinhos tratados com Luc90 apresentam uma dimensão tumoral média de -400 mm3 comparativamente com os ratinhos tratados com o anticorpo de controlo de isotipo IgG2b (que possuem uma dimensão tumoral média de -950 mm3.) Os 134 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ratinhos tratados com Luc63 anti-CSl não têm tumores mensuráveis durante até 2,5 semanas após o tratamento, apontando para a impressionante eficácia do anticorpo a eliminar células tumorigénicas.

Os sistemas modelo adicionais para o mieloma incluem ratinhos SCID implantados intravenosamente (i.v.), intraperitonealmente (i.p.) ou directamente injectados no osso (ortotopicamente) com linhas de células B maduras ou de mieloma marcadas com fluorescência ou não marcadas, e.g. ARH77, CESS, IM9, L363, LP1 e OPM2. Estas linhas serão utilizadas para testar os efeitos de tratamento com antagonista nos sistemas animais modelo de mieloma. Estas linhas celulares expressam o antigénio reconhecido por anticorpos anti-CSl humana. Os animais foram distribuídos aleatoriamente por grupos e submetidos a um regime de tratamento com anticorpos anti-CSl humana ou anticorpos de controlo (por exemplo, anticorpos de controlo de isotipo). Os anticorpos são administrados em vários níveis de dosagem, por exemplo numa dose de 1-10 mg/kg durante um total de 9-10 doses dadas intraperitonealmente a cada 3-4 dias. A dimensão do tumor é medida duas vezes por semana durante 35-40 dias para cada grupo de tratamento. São anotadas as manifestações clínicas de mieloma. São registadas as datas de morte para cada ratinho. Serão igualmente iniciados estudos com animais para determinar a potencial sinergia entre tratamento com anticorpo anti-CSl e quimioterapia. Deixam-se os tumores xenoenxertados crescer até atingirem uma dimensão aproximada entre 50-100 mm3, e para ratinhos injectados i.v., i.p. ou ortotopicamente, deixam-se as células cancerosas enxertar em animais. Nesse momento, os animais são distribuídos aleatoriamente por grupos e submetidos a um regime de tratamento com anticorpos anti-CSl humana ou anticorpos de controlo (por exemplo, anticorpos de controlo de isotipo). Alternativamente, os animais podem ser submetidos a tratamento com anticorpos anti-CSl humana ou anticorpos de controlo (por exemplo, anticorpos de controlo de isotipo) em combinação com agentes padrão de quimioterapia, incluindo tratamento com combinações de prednisona e melfalano ou outros agentes alquilantes (e.g. ciclofosfamida ou clorambucilo), ou vincristina, doxorubicina e dexametasona em dose elevada (VAD), ou outros regimes de quimioterapia conhecidos dos 135 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ peritos na especialidade. Os anticorpos são administrados em vários níveis de dosagem, por exemplo uma dose de 1-10 mg/kg durante um total de 9-10 doses dadas intraperitonealmente a cada 3-4 dias. A quimioterapia é administrada intraperitonealmente a cada 3-4 dias numa concentração eficaz, por exemplo 1 mg/kg ou outra dose eficaz que seja conhecida dos peritos na especialidade. A dimensão tumoral (para animais injectados s.c.) é medida duas vezes por semana durante 35-40 dias para cada grupo de tratamento. São anotadas as manifestações clínicas de mieloma, incluindo a imunoglobulina no soro em ratinhos injectados com linhas celulares que segregam imunoglobulina humana (IM9, CESS, ARH-77, e LP-1). As datas de morte são registadas para cada ratinho. Será avaliada a eficácia do tratamento com anticorpos na presença e na ausência de quimioterapia.

Exemplo 14: Tratamento de Mieloma Múltiplo com Anticorpo anti-CS1 Humanizado O tratamento com um anticorpo anti-CSl humanizado in vivo foi realizado num modelo de tumor de mieloma múltiplo de ratinho por injecção de anticorpo intraperitonealmente no indivíduo de teste, similar ao exemplo descrito no Exemplo 13. Implantaram-se ratinhos ICR/SCID fêmea subcutaneamente (no flanco) com a linha de mieloma múltiplo OPM-2 (10 milhões de células/animal). Deixaram-se os tumores estabelecer e depois dos tumores atingirem uma média de 100 mm3 distribuíram-se os ratinhos aleatoriamente por 8 grupos (8 grupos de 8 ratinhos cada, volume tumoral médio de 100 mm3) .

Os ratinhos foram então tratados com os seguintes anticorpos, doseados intraperitonealmente 3 vezes por semana.

Grupo 1 Controlo de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)

Grupo 2 Anticorpo Murino Luc63 a lOmg/kg (MULuc63)

Grupo 3 Um anticorpo IgGl humanizado irrelevante como controlo a lOmg/kg (cHUIgGl)

Grupo 4 Luc63 Humanizado a 10 mg/kg (HULuc63)

Grupo 5 Luc63 Humanizado a 3 mg/kg (HULuc63)

Grupo 6 Luc63 Humanizado com mutações de alanina nos resíduos 234 e 235 a 10 mg/kg (HuLuc63a,a) - sabe-se que esta mutação afecta a ligação do IgGlFc aos FcR e assim tem impacto sobre a 136 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ capacidade dos anticorpos para conferir funções dependentes de Fc incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). O resultado desta experiência está mostrado na Figura 3. Como observado previamente, o anticorpo MULuc63 a 10 mg/kg foi eficaz na redução do crescimento tumoral in vivo. No dia 46 (5 dias após a última de 9 doses de anticorpo) 5/8 dos animais não tinham tumores mensuráveis. Enquanto o HULuc63 tanto a 3 mg/kg como a 10 mg/kg foi eficaz na redução do crescimento tumoral, o anticorpo humanizado não funciona tão eficientemente em ratinhos como o anticorpo murino. Tem interesse o facto de que o anticorpo Luc63 humanizado que tinha sido mutado nos resíduos 234 e 235 não demonstrou qualquer eficácia neste modelo. De facto, como os dois grupos de controlo, PBS e IgGl humanizada (cHUIgGl), os animais tratados com o mutante HULuc63a,a tiveram que ser sacrificados no dia 39 (o dia da 8.a dose de anticorpo) porque os tumores se tinham tornado demasiado grandes (e de acordo com os regulamentos IACUC, os animais tinham que ser sacrificados). Os resultados gerados com o mutante HULuc63a,a indicam que a porção Fc do anticorpo é importante neste modelo e sugerem que um dos mecanismos através dos quais o anticorpo Luc63 (e as suas versões humanizadas) funcionam é através de uma função efectora mediada por Fc importada tal como ADCC (ou possivelmente ligação cruzada ao receptor).

Os resultados sugerem que a eficácia de um anticorpo contra CS1 em terapia humana pode ser melhorada pelo aumento da actividade de ADCC do anticorpo. Os métodos para aumentar a actividade de ADCC incluem proporcionar um anticorpo de baixo teor de fucose do Exemplo 12 e gerar a mutação na porção Fc de um anticorpo contra CS1, particularmente mutações que aumentam a afinidade do anticorpo por um receptor FcyR como proporcionado na Patente U.S. 6,737,056B1 e no Pedido de Patente U.S. 2004/0132101A1.

Os pacientes podem também ser submetidos a tratamento com anticorpos anti-CSl humana em combinação com agentes padrão de quimioterapia, incluindo tratamento com combinações de prednisona e melfalano ou outros agentes alquilantes (e.g. ciclofosfamida ou clorambucilo), ou vincristina, doxorubicina 137 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ e dexametasona em dose elevada (VAD), talidomida, velcade ou outros regimes de quimioterapia conhecidos dos peritos na especialidade.

Exemplo 15: Redução In Vivo de IgG por Anticorpo anti-CSl Humanizado num Modelo de Ratinho SCID-HuPBMC

Modelo de ratinho SCID-HuPBMC

Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humanas por gradientes de densidade padrão Ficoll-paque (Amersham Biosciences) e ressuspenderam-se em solução tamponada de fosfato (PBS) a 2 X 107 PBMC/ml. Injectaram-se as PBMC ressuspensas (1 ml) intraperitonealmente (i.p.) em ratinhos C.B-17 SCID. Duas a três semanas após a injecção das PBMC, recolheram-se amostras de soro dos ratinhos e ensaiaram-se quanto a IgX humana por ELISA. Os ratinhos enxertados (que produzem >1 pg/ml de IgX humana no soro) foram distribuídos aleatoriamente por grupos de tratamento e depois foram tratados com Luc63 humanizado (HuLuc63), ou anticorpos de controlo de isotipo de IgGl humana. Os ratinhos receberam doses de 200 pg de anticorpo em 500 μΐ de PBS a cada 3-4 dias com 4 doses de anticorpo. Analisou-se o soro dos ratinhos quanto a IgX humana por ELISA utilizando protocolos padrão. Através da detecção de IgX humana, medimos a imunoglobulina produzida pelas células B humanas injectadas, em oposição aos anticorpos humanos de controlo e humanizados utilizados para tratar os ratinhos, pois os anticorpos humanizados possuem cadeias leves capa e não cadeias leves lambda. A percentagem de alteração da IgX humana no soro foi calculada para cada ratinho subtraindo a concentração de IgX humana antes da primeira dose de anticorpo (dia 0) da concentração de IgX humana após a dose (dia x), dividindo pela concentração de IgX humana anterior à primeira dose (dia 0), e multiplicando por 100, e.g., [(dia x - dia 0)/ dia 0] X 100.

Os resultados estão mostrados como a percentagem média de alteração com o erro padrão para cada grupo de ratinhos, comparando o dia 0 com o dia 14 do estudo. O anticorpo anti-CSl humanizado reduziu a produção de imunoglobulina humana in vivo 138 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Os resultados mostram que os anticorpos anti-CSl da presente invenção reduzem substancialmente a produção de imunoglobulina humana no modelo de transferência SCID-HuPBMC. No modelo, há um aumento de -300% na produção de imunoglobulina intrínseco ao modelo como observado nos ratinhos tratados com controlo de isotipo. O HuLuc63 aboliu o aumento de -300% na produção de imunoglobulina e resultou numa diminuição adicional de 2% na imunoglobulina. Assim, podemos concluir que, similarmente ao tratamento com o anticorpo anti-CSl humana de ratinho, o tratamento com anticorpo anti-CSl humanizado Luc63 de ratinhos SCID enxertados com PBMC humanas (SCID-HuPBMC) não apenas aboliu completamente o aumento da imunoglobulina humana normalmente observado no soro destes animais, como também origina uma diminuição adicional em comparação com os níveis pré-tratamento. Portanto, um anticorpo anti-CSl humanizado irá proporcionar um agente terapêutico útil num paciente humano com uma doença associada à produção de imunoglobulinas humanas.

Exemplo 16: Anticorpos monoclonais anti-CSl e anti-CSl humanizados adicionais

Regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpos foram clonadas utilizando técnicas padrão. Resumidamente, utilizou-se o ARN total de 1-5 x 106 células para preparar ADNc utilizando um Kit de Amplificação de ADNc SMART RACE (BD Biosciences Clontech) e amplificaram-se as regiões variáveis por PCR utilizando iniciadores específicos dos genes complementares às regiões constantes da cadeia pesada e leve de ratinho.

As sequência de aminoácidos da cadeia pesada madura e da cadeia leve madura dos anticorpos Luc69, LucX.l e LucX.2 estão mostradas na Tabela 9 que proporciona sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:51) e da região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:52) de Luc69; as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:59) e da região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:60) de LucX.l, as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO:66) e da região variável da cadeia leve (SEQ ID NO:67) de LucX.2. As SEQ ID NOS: 53, 54 e 55 representam as sequências de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de Luc69, respectivamente. As SEQ ID 139 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ NOS: 56, 57 e 58 representam as sequências de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de Luc69, respectivamente. As SEQ ID NOS: 61, 62 e 63 representam as sequências de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de LucX.l, respectivamente. As SEQ ID NOS: 64, 65 e 66, representam as sequências de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de LucX.l, respectivamente. As SEQ ID NOS: 69, 70 e 71 representam as sequência de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de LucX.2, respectivamente. As SEQ ID NOS: 72, 73 e 74, representam as sequências de aminoácidos das CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve de LucX.2, respectivamente.

Tabela 9. Sequências de Aminoácidos dos Anticorpos Contra CS1 Luc69 e LucX

Luc69 VH - SEQ ID NO: 51

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASQYAFSNSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTKSNG

KF SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54

KGKATLTADKSSRAAYMQLSSLTSVDSAVYFCARSTMIMTGAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 55

Luc69 VL - SEQ ID NO: 52

DlVMTQSHKFMSTSVGDRVIITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASFRYTGVPDRF TG SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57

SGSGTDFTFTVS S VQAEDIAVYYCQQHYSTP PYTFGGGTKL EIK SEQ ID NO: 58

LucX.l VH - SEQ ID NO: 59

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTKYNG

KF SEQ ID NO: SEQ ID NO: 61 62

KGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARSTMIATGAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 63 140 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

LucX.l VL- SEQID NO: 60

ETTVTQSPASLSMAIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRF ss SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 65

SGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPLTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: 66

LucX.2 VH - SEQ ID NO: 67

QVQLQQSGPELVKPGASVKIS CKASGYAFS SSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTKYNG KF SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 70

KGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARSTMIATGAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 71

LucX.2 VL - SEQ ED NO: 68

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQS PKLLIYSASYRYTGVPDRF TG SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 73

SGSGTDFTFTI5SVQAEDLAVYYCQQHYSTPPYTFGGGTKLEIK SEQ ED NO: 74

Os anticorpos Luc69, LucX.l e LucX.2 na Tabela 9, e Luc90 e Luc34 na Tabela 4 serão humanizados de acordo com os métodos ensinados em Queen et al., Patentes U.S. 5, 5301,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; e 6,180,370.

Resumidamente, o método envolve proporcionar uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) de uma imunoglobulina dadora (de ratinho) e uma região de esqueleto de uma imunoglobulina humana. Os métodos preferidos compreendem primeiro a comparação das sequência de aminoácidos do esqueleto ou da região variável da imunoglobulina dadora com as sequências correspondentes numa colecção de cadeias de imunoglobulinas humanas, e a selecção como imunoglobulina humana de uma das sequências mais homólogas da colecção. A sequência da imunoglobulina humana, ou imunoglobulina aceitadora, é tipicamente seleccionada entre uma colecção de pelo menos 10 a 20 ou mais sequências de regiões variáveis de imunoglobulinas, e usualmente terá a maior homologia com a sequência da imunoglobulina dadora de qualquer sequência na colecção. A sequência de esqueleto da imunoglobulina humana terá tipicamente cerca de 65 a 70% de homologia ou mais com as sequências de esqueleto das imunoglobulinas dadoras. A 141 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ imunoglobulina dadora pode ser uma cadeia pesada ou uma cadeia leve, e a colecção humana conterá o mesmo tipo de cadeia. Podem ser utilizadas uma cadeia leve e uma pesada humanizadas para formar uma imunoglobulina ou anticorpo humanizados completos, possuindo dois pares cadeia leve/pesada, com ou sem regiões constantes humanas parciais ou de comprimento completo.

Para formar a região variável humanizada, os aminoácidos na sequência aceitadora humana serão substituídos pelos aminoácidos correspondentes da sequência dadora se estiverem na categoria: (1) o aminoácido está numa CDR. Quer em conjunto com o passo anterior de comparação, quer separadamente, aminoácidos adicionais na cadeia da imunoglobulina aceitadora podem ser substituídos por aminoácidos da cadeia da imunoglobulina aceitadora de CDR. Mais especificamente, serão efectuadas outras substituições opcionais de um aminoácido do esqueleto humano da imunoglobulina aceitadora pelo aminoácido correspondente de uma imunoglobulina dadora, em posições que caiem numa ou mais das seguintes categorias: (2) o aminoácido na região de esqueleto humana da imunoglobulina aceitadora é raro nessa posição e o aminoácido correspondente na imunoglobulina dadora é comum nessa posição em sequências de imunoglobulinas humanas; ou (3) o aminoácido é imediatamente adjacente a uma das CDR; ou (4) prevê-se que o aminoácido é capaz de interactuar com o antigénio ou com as CDR da imunoglobulina dadora ou humanizada. Além disso, um aminoácido na sequência aceitadora pode opcionalmente ser substituído por um aminoácido típico para sequências humanas nessa posição se (5) o aminoácido na imunoglobulina aceitadora for raro nessa posição e o aminoácido correspondente na imunoglobulina dadora for também raro, relativamente a outras sequências humanas.

Quando combinadas formando um anticorpo intacto, as cadeias leves e pesadas humanizadas serão substancialmente não imunogénicas em seres humanos e retêm substancialmente a mesma afinidade que a imunoglobulina dadora para com CS1.

Uma vez desenhadas, as imunoglobulinas, incluindo fragmentos de ligação e outras formas de imunoglobulinas, podem ser produzidas prontamente através de uma variedade de técnicas de ADN recombinante ou outras. Preferivelmente, os 142 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ polinucleótidos que codificam as sequências de aminoácidos desejadas são produzidos sinteticamente e por união a sequências de ácido nucleico apropriadas, finalmente com expressão em células transfectadas. Os anticorpos monoclonais anti-CSl humanizados serão particularmente úteis no tratamento de desordens humanas susceptíveis a terapia com anticorpos monoclonais, como descrito em detalhe no fascículo.

Exemplo 17: Sequências de CS1 de outros primatas.

As sequência de aminoácidos dos domínios extracelulares de CS1 de vários primatas não humanos, incluindo cinomolgos (cynos), chimpanzé e Rhesus foram determinadas e comparadas com a sequência humana. A sequência de Rhesus foi determinada a partir de uma amostra de PBMC activadas de um macaco Rhesus. A sequência de chimpanzé foi determinada a partir de uma amostra de PBMC que tinha sido previamente estimulada com OKT3. A sequência de cynos foi determinada a partir de uma amostra de PBMC activadas de um macaco cinomolgos. O ARN foi preparado a partir de amostras de tecido utilizando o reagente Trizol LS (Invitrogen)/extracção com clorofórmio, seguida de limpeza com o kit RNAeasy micro (Qiagen). O ADNc da primeira cadeia foi preparado utilizando o SMART RACE (Clontech) . A PCR foi realizada com iniciadores desenhados quer para a sequência publicada para cada espécie ou utilizando a sequência humana se não estavam disponíveis sequências específicas para a espécie, para isolar fragmentos que cobrem as regiões de interesse. Estes fragmentos foram clonados no sistema de clonagem TOPO (Invitrogen) para sequenciação no analisador AB 3100 Genetic Analyzer.

Uma vez determinada a sequência especifica da espécie, submeteram-se os fragmentos requeridos a PCR com iniciadores de clonagem contendo os locais de restrição requeridos para os vectores de expressão. Os domínios extracelulares de cada espécie foram subclonados em vectores NEF39 HAPPFc, NEF39 Fc ou NIF Fc e ORF de comprimento completo em vectores NEF39 HA ICD4. As sequência de aminoácidos foram determinadas a partir da tradução das sequências de ácido nucleico. A Tabela 10 (SEQ ID NOS: 75, 76, 77 e 78) mostra o alinhamento de cada sequência de cynos, rhesus, humana e chimpanzé, respectivamente. As sequências estão alinhadas começando na 143 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Metionina e incluem os respectivos péptidos de sinal. Os resíduos de aminoácido homólogos entre as espécies estão denotados por um símbolo *.

Tabela 10. Alinhamento de sequências de CS1 de primatas (SEQ ID NOS: 75-78)

CynOS MAGSPTCFTFIYILWQLTGSTASGSVKELVGSIGGAVTFPliKSEVKQVDSIVWTFNTTTL ¢0 rheeus ΜΑΟ3ΡΤΟ1ΤΡΙΥΙ1Η01ΤΧ35ΤΑ5σενΚΕΙινθ3ΙθσΛνΤΡΡΙ>Κ8ΕνΚ:<}νθ3ΐν»ΪΤΡΝΤΤΤΙ, 60 humana MAGSPTCLTLIYILí^LTGSAASGPVKELVGSVGGAVTPPIKSKVKQVDSIVWTFNTTPIj 60 chimp MAGSPTCLTLIYILWQIiTGSAASGPVREIiVGSVGGAVTFPIiKSKVKQVDSIVWTFNTTPL 60 *******;* ;**********;***,*;*****;********** ~**************m* cynos VTIQPBGGPMXVTQHRNKERVHFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYNVEIYSSSLODPFTRKY 120 rheeus VTlQPEGGPMIVTQNRHKERVHFPDGGYSUCLSKIiKKNDSGIYNVEIYSSSLQOPFTRinr 120 humana VTIQPEGGTIIVTQHlUailERVDFPDGaYSLXLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQEY 120

Chimp VTIQPKKTIIVTQHRNKERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQKY 120 ********.;*******;***_********************* * *******;* *=;* cynos VLRVYEHLSKPKVTMGLQSMKHGTCVTKLTCCMEHGEEDVIYTWKAIíGQAVNESHNGSIL· 180 rheeus VLRVYEHI>SKPKVTMGWiS(JKNGTCVTNLTCHMEHGEEDVIYTWKALGQAVNESHNGSIIi 180 humana VLHVYEHLSKPKVTWGLQSHKHGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAAHBSHNGSII. 180 chimp VLHVYKHLS KPKVTMGLQSlfKKGTCVTHI/TCCMEHGEEDVI YTWKALGQAANESHNGSII· 180 **:***************** *********** ******************_*********

cynos PISWRWGESDMTFICTVIlNPVSStlSSSPIIARKLCBGAADDSDSSMV rhesus piswrwgesdmtfictvrnpvssnssspilarklcegaaddsdssmv

humana PISWRWGESDMTFICVWOIPVSRWFSSPILAIIKLCEGAADDPDSSMV

chimp PISWRWGESDMTFICVARNPVSSNFSSPILARKLCEGAADDPDSSMV ***************w m***** * ****************f*****

Exemplo 18: Mapeamento de Epitopos de Anticorpos Contra CS1

Construíram-se as proteínas CSl-Fc humana, de ratinho ou quimérica humana-ratinho para avaliar a sua capacidade para se ligarem as diferentes anticorpos anti-CSl utilizando um ELISA em sanduíche. Mostrou-se que o painel de anticorpos anti-CSl se liga a proteína CS1 humana mas não a proteína CS1 de ratinho.

Vectores de expressão de CS1 0 dominio extracelular de CS1 humana (aminoácidos 1-227) foi subclonado no vector NIF Fc, e o domínio extracelular de CS1 de ratinho (aminoácidos 1-224) foi subclonado no vector NEF39 Fc. Estes vectores geram uma proteína de fusão do domínio extracelular de CS1 clonado a montante e em enquadramento com o gene da cadeia pesada da imunoglobulina gama 1 humana. Isto gera uma proteína segregada contendo o dominio extracelular de CS1 e um "marcador" Fc humano no terminal C. PCR e sequenciação

As quimeras humana/ratinho do domínio extracelular de CS1 foram geradas por PCR utilizando iniciadores quiméricos que se estendem pelas junções requeridas das sequências humana e de 144 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ratinho com ADNc previamente clonados como fonte. Estes fragmentos foram utilizados em PCR de ligação para ligar os fragmentos uns aos outros com os locais de restrição requeridos para os vectores de expressão. Estes fragmentos quiméricos foram clonados no sistema de clonagem TOPO (Invitrogen) ou directamente no vector de expressão NIF Fc para sequenciação no analisador AB3100 Genetic Analyzer. A sequenciação confirmou que os fragmentos foram subclonados no vector de expressão NIF Fc.

As construções quiméricas são as seguintes, contendo os aminoácidos indicados da CS1 humana e de ratinho. As sequências estão proporcionadas na Tabela 11. hu25/mu75: aminoácidos 1-67 de CS1 humana fundidos com os aminoácidos 68-224 de CS1 de ratinho (SEQ ID NO:79); mu25/hu75: aminoácidos 1-67 de CS1 de ratinho fundidos com os aminoácidos 68-227 de CS1 humana (SEQ ID NO:80); hu50/mu50: aminoácidos 1-151 de CS1 humana fundidos com os aminoácidos 149-224 de CS1 de ratinho (SEQ ID NO:81); mu50/hu50: aminoácidos 1-131 de CS1 de ratinho fundidos com os aminoácidos 135-227 de CS1 humana (SEQ ID NO:82); hu75/mu25: aminoácidos 1-169 de CS1 humana fundidos com os aminoácidos 167-224 de CS1 de ratinho (SEQ ID NO:83); mu75/hu25: aminoácidos 1-166 de CS1 de ratinho fundidos com os aminoácidos 170-227 de CS1 humana (SEQ ID NO:84).

Tabela 11. Sequências de aminoácidos de proteínas CS1 quiméricas hu25%/mu75% (SEQ ID NO:79)

MAGSPTCLTLIYILWQLTGSAASGPVKELVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPL

VTIQPEGVTSQSSNKERIVFPDGLYSMKLSQLKKNDSGAYRAEIYSTSSQASLIQEYVLH

VYKHLSRPKVTIDRQSNKNGTCVINLTCSTDQDGENVTYSWKAVGQGDNQFHDGATLSIA

WRSGEKDQALTCMARNPVSNSFSTPVFPQKLCEDAATDLTSLRG mu25%/hu75% (SEQ ID NO:80)

MARFSTYIIFTSVLCQLTVTAASGTLKKVAGALDGSVTFTLNITEIKVDYVVWTFNTFFL AMVKKDGGTlIVTQNRNRERVDFPDGGYSIiKLSKLKKNDSGlYYVGIYSSSLQQPSTQEY VLHVYEHLS KPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQAANESHNGSIL PISWRWGESDMTFICVARNPVSRNFSSPILARKLCEGAADDPDSSMV 145 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ hu50%/mu50% (SEQ ID NO:81) MAGSPTCLTLIYILWQLTGSAASGPVKELVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPL·

VTIQPEGGTIIVTQNRNRERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQEY

VLHVYEHLSKPKVTIDRQSNKNGTCVINLTCSTDQDGEMVTYSWKAVGQGDNQFHDGATL

SIAWRSGEKDQALTCMARNPVSNSFSTPVFPQKLCEDAATDLTSLRG mu50%/hu50%_(SEQ ID NO:82)

MARFSTYIIFTSVLCQLTVTAASGTLKKVAGALDGSVTFTLNITEIKVDYVVWTFNTFFL

AMVKKDGVTSQSSNKERIVFPDGLYSMKLSQLKKNDSGAYRAEIYSTSSQASIiIQEYVLH

VYKHLSRPKVTMGLQSNKNGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALOQAANESHNGSILPIS

WRWGESDMTFICVARNPVSRNFSSPrLARKLCEGAADDPDSSMV hu75%/mu25% (SEQ ID NO:83)

MAGSPTCLTLIYILWQLTGSAASGPVKEIjVGSVGGAVTFPLKSKVKQVDSIVWTFNTTPL

VTIQPEGGTIIVTQNRNRERVDFPDGGYSLKLSKLKKNDSGIYYVGIYSSSLQQPSTQEY

VLHVYEHLSKPKVTMGLQSNKWGTCVTNLTCCMEHGEEDVIYTWKALGQGDNQFHDGATL

SIAWRSGEKDQALTCMARNPVSNSFSTPVFPQKLCEDAATDLTSLRG mu75%/hu25% (SEQ ID NO:84)

MARFSTYIIFTSVLCQLTVTAASGTLKKVAGALDGSVTFTLNITEIKVDYVVWTFNTFFL AMVKKDGVTSQS SNKERIVFPDGLYSMiaSQLKKNDSGAYRAE IYSTSSQASLIQEYVLH VYKHLSRPKVTIDRQSNKNGTCVINLTCSTDQDGENVTYSWKAVGQAANESHNGSILPIS WRWGESDMTFICVARNPVSRNFSSPILARKLCEGAADDPDSSMV

Transfecção transiente

Plaquearam-se células 293/T a 2xl05 células por poço em placas de 6 poços. Passadas 24 horas, misturaram-se 0,15 pmol de ADN com FuGeneô (Roche) de acordo com as instruções do fabricante e adicionaram-se às células. Passadas 24 horas transferiram-se as células para balões T75 contendo 12 ml de meio com soro de IgG Ultra-low (Invitrogen) . Passados 3 dias colheu-se o sobrenadante e confirmou-se a presença de proteína de fusão CSl-Fc e guantificou-se por detecção do marcador Fc por ELISA. ELISA de mapeamento de epítopos

As proteínas CSl-Fc humana, de ratinho ou guimérica humana-ratinho foram avaliadas guanto à sua capacidade para se ligarem a diferentes anticorpos anti-CSl utilizando um ELISA em sanduíche. O anticorpos de captura, anti-gama humana (Jackson Immunological) foi ligado durante a noite a uma placa de ELISA (Immulon 4 HBX - ThermoLabSystems) em tampão de 146 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ carbonato a 1,8 ug/ml. Após bloqueio, incubaram-se 100 ul de sobrenadante de células 293/T transfectadas com as construções de CS1, a 37°C durante uma hora, seguindo-se incubação com anticorpos anti-CSl a 2 ug/ml. Anticorpos anti-ratinho, conjugados com peroxidase de rábano foram então incubados a 0,5 ug/ml e subsequentemente foram detectados com 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Sigma). Cada ensaio foi realizado pelo menos duas vezes com duas transfecções diferentes.

Foi previamente determinado que os anticorpos contra CS1 se ligam a CS1 humana mas não a CS1 de ratinho. Contudo, os domínios extracelulares de CS1 das duas espécies são suficientemente similares para permitir a produção de quimeras entre CS1 humana e de ratinho para localizar as regiões da proteína a que os anticorpos se ligam. As construções de expressão contendo quimeras dos domínios extracelulares de CS1 humana e de ratinho foram transfectadas em células 293/T e avaliadas quanto à sua capacidade para se ligarem a anticorpos contra CS1. Como esperado, os anticorpos contra CS1 ligaram-se a CS1 humana mas não a CS1 de ratinho e verificou-se que caiem em 3 diferentes grupos de epítopos (Tabela 12).

Tabela 12. Mapeamento de epítopos de anticorpos contra CS1 construção anticorpo vector NIF Fc huCSl muCSl hu25/ mu75 mu25/ hu75 hu50/ mu 50 mu50/ hu50 hu75/ mu25 Mu75/ hu2 Luc3 4 - + - - - + - + - LucX - + - - - + - + - Luc69 - + - - - + - + - Luc9 0 - + - - - + - + - Luc5 - + - - + + - + - Luc3 8 - + - - + + - + - Luc4 - + - - + - + - + Lucl2 - + - - + - + - + Luc23 - + - - - + - + Luc29 - + - - + - - + Luc32 - + - - + - + - + Luc37 - + - - + - + - + Luc63 - + - - + - + - + 147 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Os anticorpos contra CS1, Luc34, LucX, Luc69 e Luc90, ligam-se a hu50/mu50, que contém os primeiros 151 aminoácidos de CS1 humana e a segunda metade de CS1 de ratinho. Assim, estes anticorpos ligam-se na primeira metade do domínio extracelular de CS1 humana. Contudo, nenhum dos anticorpos se liga nem a hu25/mu75, que contém os primeiros 67 aminoácidos de CS1 humana nem a mu25/hu75, que contém os aminoácidos 68-227 da CS1 humana. Assim, os epítopos para estes anticorpos sobrepõem-se em ambas estas regiões e podem potencialmente situar-se na junção destas construções, nos aminoácidos 67-68. Os anticorpos contra CS1, Luc5 e Luc38, ligam-se ambos a hu50/mu50, que contém os primeiros 151 aminoácidos de CS1 humana, e a mu25/hu75, que contém os aminoácidos 68-227 de CS1 humana. Assim, estes anticorpos ligam-se entre os aminoácidos 68-151 de CS1 humana. A menor região de CS1 humana testada a que Luc4, Lucl2, Luc23, Luc29, Luc32, Luc37 e Luc63 se ligam é mu75/hu25. Assim, estes anticorpos ligam-se aos 58 aminoácidos C-terminais do domínio extracelular de CS1 humana.

Este estudo agrupou os locais de ligação do anticorpo CS1 em 3 agrupamentos de epítopos:

(1) o epítopo definido por Luc90, que se liga a hu50/mu50 (SEQ ID NO:81). Este epítopo cobre desde cerca do resíduo de aminoácido 23 até cerca do resíduo de aminoácido 151 de CS1 humana. Este epítopo reside no interior do domínio 1 (domínio V) do domínio extracelular. Este epítopo é também reconhecido por Luc34, LucX (incluindo LucX.l e LucX.2) e Luc69. (2) o epítopo definido por Luc38, que se liga a mu25/hu75 (SEQ ID NO:80) e hu50/mu50 (SEQ ID NO:81) . Este epítopo cobre provavelmente desde cerca do resíduo de aminoácido 68 até cerca do resíduo de aminoácido 151 de CS1 humana. Este epítopo é também reconhecido por Luc5.

(3) o epítopo definido por Lu63, que se liga a mu75/hu25 (SEQ ID NO:84). Este epítopo cobre desde cerca do resíduo de aminoácido 170 até cerca do resíduo de aminoácido 227 de CS1 humana. Este epítopo reside no interior do domínio 2 (domínio C2) de CS1 humana. Este epítopo é também reconhecido por Luc4, Lucl2, Luc23, Luc29, Luc32 e Luc37. 148 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Entenda-se que os exemplos descritos acima de modo nenhum servem para limitar o verdadeiro âmbito da presente invenção, sendo antes apresentados para fins ilustrativos.

Parágrafos Relevantes: 1. Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, em que o referido anticorpo ou fragmento se ligam a um epitopo de CS1 humana reconhecido por Luc90. 2. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 1, em que o referido anticorpo ou fragmento se ligam a um domínio V da referida CS1 humana. 3. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 1, em que o referido anticorpo ou fragmento se ligam ao referido epitopo de CS1 humana codificada em SEQ ID NO:81. 4. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 1, em que o referido anticorpo ou fragmento inibem a secreção de imunoglobulinas por uma célula secretora de imunoglobulina. 5. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 1, em que o referido anticorpo desencadeia efeitos citotóxicos em células que expressam CS1 ou aumenta a citotoxicidade mediada por células imunitárias. 6. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 5, em que o referido anticorpo desencadeia citotoxicidade mediada por ADCC de células que expressam CS1. 7. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 1, em que o referido anticorpo ou fragmento compreendem uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo seleccionado de um grupo que consiste em SEQ ID NOS: 9, 10, 11, 12, 13 e 14. 8. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 1, em que o referido anticorpo ou fragmento compreendem uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo seleccionado de um grupo que consiste em SEQ ID NOS: 21, 22, 23, 24, 25 e 26. 149 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ 9. Ο anticorpo ou ο fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 1, em que o referido anticorpo ou fragmento compreendem uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo seleccionado de um grupo que consiste em SEQ ID NOS: 53, 54, 55, 56, 57 e 58. 10. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 1, em que o referido anticorpo ou fragmento compreendem uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo seleccionado de um grupo que consiste em SEQ ID NOS: 61, 62, 63, 64, 65 e 66. 11. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 1, em que o referido anticorpo ou fragmento compreendem uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo seleccionado de um grupo que consiste em SEQ ID NOS: 69, 70, 71, 72, 73 e 74. 12. O anticorpo dos parágrafos 7, 8, 9, 10 ou 11, em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo completamente humano. 13. Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, em que o referido anticorpo se liga a um epitopo de CS1 humana reconhecido por Luc63. 14. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 13, em que o referido anticorpo ou fragmento se ligam a um domínio C2 da referida CS1 humana. 15. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 13, em que o referido anticorpo ou fragmento se ligam ao referido epitopo de CS1 humana codificado em SEQ ID NO:84. 16. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 13, em que o referido anticorpo ou fragmento inibem a secreção de imunoglobulinas por uma célula secretora de imunoglobulina. 17. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 13, em que o referido anticorpo desencadeia efeitos citotóxicos em células que expressam CS1 ou aumenta a citotoxicidade mediada por células imunitárias. 18. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 17, em que o referido anticorpo desencadeia 150 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ citotoxicidade mediada por ADCC de células que expressam CS1. 19. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do parágrafo 13, em que o referido anticorpo ou fragmento compreende uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo seleccionado de um grupo que consiste em SEQ ID NOS: 15, 26, 17, 18, 19 e 20. 20. O anticorpo do parágrafo 19, em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo completamente humano. 21. Uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmacêutico e o anticorpo do parágrafo 1 ou 13. 22. Um método para matar células que expressam CS compreendendo o contacto das referidas células com uma quantidade eficaz do anticorpo do parágrafo 1 ou 13. 23. O método do parágrafo 22, em que as referidas células que expressam CS1 são células de cancro de células plasmáticas. 24. O método do parágrafo 23, em que os referidos cancros de células plasmáticas são seleccionados de um grupo que consiste em mieloma múltiplo, mieloma do osso, plasmocitoma extramedular, macroglobulinemia, doença das cadeias pesadas, amiloidose primária e gamopatia monoclonal de significado indeterminado. 25. O método do parágrafo 22, em que as referidas células que expressam CS1 são derivadas de células de cancro que não de células plasmáticas. 26. 0 método do parágrafo 25, em que o referido cancro que não de células plasmáticas é leucemia linfocítica crónica. 27. O método do parágrafo 22, em que as referidas células que expressam CS são derivadas de leucócitos. 28. O método do parágrafo 27, em que os referido leucócitos são células B ou células T activadas. 29. O método do parágrafo 28, em que os referidos leucócitos são derivados de um paciente que sofre de LES. 30. O método do parágrafo 22, em que o referido anticorpo tem níveis diminuídos de fucose ou é mutado para aumentar a afinidade do anticorpo para com um receptor FcyR. 151 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ 31. Um método para tratamento de um indivíduo com cancro de células plasmáticas compreendendo a administração do anticorpo do parágrafo 1 ou 13. 32. Um método para tratamento de um indivíduo com artrite reumatóide compreendendo a administração do anticorpo do parágrafo 1 ou 13. 33. Um método para tratamento de um indivíduo com doença inflamatória do intestino compreendendo a administração do anticorpo do parágrafo 1 ou 13.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Facet Biotech Corporation <120> Utilização Terapêutica de Anticorpos Anti-CSl <130> 381828-11ST1 (101900) <140> 10982357 <141> 2004-11-05 <160> 85 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 2672

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 cttccagaga gcaatatggc tggttcccca acatgcctca ccctcatcta tatcctttgg 60 cagctcacag ggtcagcagc ctctggaccc gtgaaagagc tggtcggttc cgttggtggg 120 gccgtgactt tccccctgaa gtccaaagta aagcaagttg actctattgt ctggaccttc 180 aacacaaccc ctcttgtcac catacagcca gaagggggca ctatcatagt gacccaaaat 240 cgtaataggg agagagtaga cttcccagat ggaggctact ccctgaagct cagcaaactg 300 aagaagaatg actcagggat ctactatgtg gggatataca gctcatcact ccagcagccc 360 tccacccagg agtacgtgct gcatgtctac gagcacctgt caaagcctaa agtcaccatg 420 ggtctgcaga gcaataagaa tggcacctgt gtgaccaatc tgacatgctg catggaacat 480 ggggaagagg atgtgattta tacctggaag gccctggggc aagcagccaa tgagtcccat 540 aatgggtcca tcctccccat ctcctggaga tggggagaaa gtgatatgac cttcatctgc 600 gttgccagga accctgtcag cagaaacttc tcaagcccca tccttgccag gaagctctgt 660 gaaggtgctg ctgatgaccc agattcctcc atggtcctcc tgtgtctcct gttggtgccc 720 ctcctgctca gtctctttgt actggggcta tttctttggt ttctgaagag agagagacaa 780 gaagagtaca ttgaagagaa gaagagagtg gacatttgtc gggaaactcc taacatatgc 840 ccccattctg gagagaacac agagtacgac acaatccctc acactaatag aacaatccta 900 960 152 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ aaggaagatc cagcaaatac ggtttactcc ccccactcac tgctcacgat gccagacaca tagacagcag tgcactcccc taagtctctg aaaacaatca gaagaattca ctgatttgac gacttttttc caggataaat tatctctgat atccactgct gagaaatctc ctcaaaccca gattgtgaat gtcagcaaac cataaaaaaa atgcaaggtc acacatatta atgacagcct ctggagtttc attccatccc agggcttgga aggagggcaa gaagaccaaa acagacagac aaatggatgt attaattggc tctataaact aattggtcag acgtgctgtc tgccctcatg atgagcagtt gtagcaggcc tgaccacaga acttgaaggt caaagttcac aaagatgaag actataatgg agacacagaa gtgtgcatgg atttatgcac ttgtgctgca aaagaaaagt ccaataaaga gaccgagtct gaagtcacat ggcagtgaga ctggtggggc acggggggca aattcattca atagatattt attaagaacc taatcccagc actttgggag gceaaggtgg cagcctggcc aacatggtga aaccccatct ggtggtgtgc acctgtaatc ccagctactc ctgggaggtg gaggttgcag tgagctgaga agagcaaaac tccaatacaa acaaacaaac aagatgaaca tccctaccaa cacagagctc gggaagggga aaggggaatg gctgcttttg gacctcccta ccaagtgatg aaagtgttga gaatgggatt gaggattatc ttctctcaga ctctccctac tgcaaaaccc tattgtagta agatattgtg agattcaaaa aaaaaaaaaa

<210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 actgtggaaa taccgaaaaa gatggaaaat ccaaggctat ttgcctatga gaatgttatc ctcaaaaaaa aaacaattct cggcccaaag tagaaacaCC aaggaagaat gaagaacgtt gcttctttag atttaagagt tcataattcc gaaggtttaa tcacttcatc ccaaaaatgg gtgcttagaa gtattcctat agaaatgtaa gttgtattaa tgatggctcc aggtcagtgt tgtaaggatt ataccaagag tcttgctacc aagtccagca gaagcagatg cacctgacaa atgtgcccag cactatgctg agcttacact aaattggctc caaatgaatg aactactttc ttcccagagg gccaggtgtg gatccacagg aatcagggta gctgaccatg tttggcagat cccaaggaca aggacctcca gccaggcttc ctaggtttta aggctgtgcc agaacccatc tgtaaatcta gtgtaggaga cttggagtca gtgggtactt gtaaaccttt aaagatggtt tatgcggccc ggcatggtgg ctcacacctg gtgggtcatc tgaggtcagg agttcaagac ctactaaaga tacaaaaatt tgctgagcgt gagaggccaa ggcatgagaa tcgcttgaac tggcaccact gcactccggc ctaggcaacg aaacacctgt gctaggtcag tctggcacgt accatctctt atacttaagt gaaaaacatg atatgttccc tgacacatat cttgaatgga aaaacttaat aacaaatgct tgttgggcaa aaggcattgt gaaggaattg agccagatct aaaaagtctt ctttactatc ttaataaaac aa

Met Ala Gly Ser Pro Thr Cys Leu Thr Leu ile Tyr ile Leu Trp Gin 15 10 15 1020 1000 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2672

Leu Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Pro Vai Lys Glu Leu vai Gly Ser 20 25 30 153 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Vai Gly Gly Ala 35 Val Thr phe Pro 40 Leu Lys Ser Lys val 45 Lys Gin Val Asp Ser 50 lie val Trp Thr phe 55 Asn Thr Thr Pro Leu 60 val Thr Ile Gin Pro 65 Glu Gly Gly Thr Ile 70 ile Val Thr Gin Asn 75 Arg Asn Arg Glu Arg 80 vai ASP Phe Pro Asp 85 Gly Gly Tyr Ser Leu 90 tys Leu Ser Lys Leu 95 Lys Lys Asn ASP Ser 100 Gly Ile Tyr Tyr Val 105 Gly He Tyr Ser Ser 110 Ser Leu Gin Gin Pro 115 Ser Thr Gin Glu Tyr 120 val Leu H1S Val Tyr 125 Glu HiS Leu ser Lys 130 Pro Lys Val Thr Met 135 Gly Leu Gin ser Asn 140 Lys Asn Gly Thr cys 145 val Thr Asn Leu Thr 150 Cys cys Met Glu Hl S 155 Gly Glu Glu Asp val 160 ile Tyr Thr Trp Lys 165 Ala Leu Gly Gin Ala 170 Ala Asn Glu Ser HiS 175 Asn Gly Ser Ile Leu 180 Pro ile Ser Trp Arg 185 Trp Gly Glu Ser Asp 190 Met Thr phe lie Cys 195 val Ala Arg Asn Pro 200 Val Ser Arg Asn Phe 205 Ser. Ser Pro ile Leu 210 Ala Arg Lys Leu cys 215 Glu Gly Ala Ala Asp 220 Asp pro ASP ser ser 225 Met Val Leu Leu cys 230 Leu Leu Leu Val Pro 235 Leu Leu Leu ser Leu 240 Phe val Leu Gl y Leu 245 Phe Leu Trp phe Leu 250 Lys Arg Glu Arg Gin 255 GlU Glu Tyr He Gl u 260 Glu Lys Lys Arg val 265 Asp ile Cys Arg Glu Thr 270 pro Asn ile Cys 275 Pro Hl S Ser Gly Glu 280 Asn Thr Glu Tyr ASD 285 Thr Ile Pro Hl 5 Thr 290 Asn Arg Thr ile Leu 295 Lys Glu Asp Pro Ala 300 Asn Thr Val Tyr Ser 305 Thr val Glu Ile pro 310 Lys Lys Met Glu Asn 315 Pro HlS Ser Leu Leu 320

Thr Met ργο Asp rhr pro Arg Leu Phe Ala Tyr Glu Asn vai lie 325 330 335 154 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> Gin vai 1 3 Gin Leu Gin 5 Gin Pro Gly Ala Glu 10 Leu val Arg pro Gly Ala 15 Ser vai Lys Leu 20 Ser cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr ser Phe Thr 30 Thr Tyr Trp Met Asn 35 Trp val Lys Gin Arg 40 pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp ile Gly Met 50 He His Pro ser Asp 55 ser Glu Thr Arg Leu 60 Asn Gin Lys Phe SP Asp Lys Ala Thr Leu 70 Thr val ASP Lys ser 75 Ser Ser Thr Ala ar Met Gin Leu ser Ser 85 Pro Thr ser Glu ASp 90 ser Ala val Tyr 5Γ cys Ala Arg ser Thr 100 Met Ile Ala Thr Arg 105 Ala Met Asp Tyr Trp 110 Gly Gin Gly Thr ser 115 val Thr val ser ser 120

<210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 4

Asp Ile val Met Thr Gin ser g1 n Lys ser Met Ser Thr Ser val Gly 1 5 10 15 ASP Arg val Ser ile Thr cys Lys Ala Ser Gin Asp val ile Thr Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala SO ser Tyr Arg ΙΓ Thr Gly val Pro ASp 60 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr ile Ser Asn val Gin Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr cys Gin Gin HiS Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu LyS 100 105 155 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 5

Glu 1 vai Lys Leu Leu 5 Glu ser Gly Gly Gly 10 Leu Vai Gin Pro Gly Gly IS Ser Leu Lys Leu 20 ser cys Ala Ala ser 25 Gly Phe ASp Phe ser 30 Arg Tyr Trp Met Ser 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp ile Gly Glu 50 Ile Asn Pro Asp Ser 55 Ser Thr Ile Asn Tyr 60 Thr Pro Ser Leu Lys Asp 65 Lys Phe Ile Ile 70 Ser Arg ASp Asn Ala 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gl π Met ser Lys 85 Vai Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Leu Tyr T^r Cys Ala Arg Pro Asp 100 Gly Asn Tyr Trp Tyr 105 Phe Asp Vai Trp Gly 110 Ala Gly Thr Thr vai 115 Thr Vai ser ser

<210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 6

Asp Ile vai Met Thr 5 Gin Ser His Lys Phe 10 Met Ser Thr Ser Val 15 Gly ASp Arg vai Ser 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Asp Vai Gly 30 Ile Ala Vai Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys pro 40 Gly Gin Ser Pro Leu Leu Ile Tyr Trp 50 Ala ser Thr Arg HlS 55 Thr Gly Vai pro Asp 60 Arg phe Thr Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 phe Thr Leu Thr Ile 75 ser Asn vai Gin ser 80 Glu ASP Leu Ala ASP 85 Tyr Phe cys Gin Gin 90 Tyr ser ser Tyr Pro 95 Tyr Thr Phe Gly dy 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ile Lys 156 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 7

Gin vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Gin 35 Trp vai Lys Gin Arg 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala ASp Lys Ser Ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Vai Tyr Tyr Gly ser Asn Pro Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai ser Ala 115 120

<210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 8 ASp 1 Ile Gin Met Thr S Gin Ser ser ser Tyr 10 Leu Ser val Ser Leu 15 Gly Gly Arg vai Thr 20 lie Thr cys Lys Ala 25 ser Asp His ile Asn 30 Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu ile 35 40 Ser Gly 50 Ala Thr Ser Leu Glu 55 Thr Gly vai Pro ser 60 Arg Phe Ser Gly ser 65 Gly Ser Gly Lys ASP 70 Tyr Thr Leu Ser ile 75 Thr Ser Leu Gin Thr 80 Glu Asp Vai Ala Thr 85 Tyr Tyr cys Gin Gin 90 Tyr Trp ser Thr ΡΓΟ 95 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 157 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ <210> 9 <211 > 5 <212> PRT <213> Mus Musculus <4 0 0 > 9 Thr Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 10 <211 > 17 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 10 Met ile : HÍS Pro Ser Asp 1 5 ASP <210 > 11 <211> 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 11 ser Thr Met Ile Ala Thr 1 5 <210 > 12 <211 > 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 12 Lys Ala Ser Gin Asp vai 1 5 <210> 13 <211 > 7 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 13 Ser Ala ser Tyr Arg Tyr 1 5 <210 > 14 <211 > 9 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 14 Gin Gin Hl S Tyr ser Thr uys 10 10 158 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ 158 <210> 15 <211 > 5 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 15 Arg Tyr Trp Met ser 1 5 <210 > 16 <211 > 17 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 16 Glu il 1 e Asn Pro Asp ser 5 Asp <210 > 17 <211 > 10 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 17 Pró Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Vai 15 10 10

Pro ser Leu Lys 15 <210> 18 <211 > 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 18 Lys Ai; » Ser Gin asp vai Gly ile Ala vai 15 10 <210 > 19 <211 > 7 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 19 Trp Al« i Ser Thr Arg His Thr 1 s <210 > 20 <211> 9 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 20 Gin Gl n Tyr Ser ser Tyr Pro Tyr Thr 159 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ <2 10> 21 <2 11> 5 <2 Λ CM \—1 PRT <2 13> Mus <4 Λ O O 21 ser Ty r Trp Musculus Met Gin 5 <210 > 22 <211 > 17 <212> PRT <213> Mus <400> 22 Ala Π 1 e Tyr Gly <210 > 23 <211 > 12 <212> PRT <213> Mus <400> 23 Gly Lys vai

Musculus Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gin 5 10

Lys

Phe Lys15

Musculus Tyr Tyr Gly Ser Asn Pro Phe Ala Tyr 5 10 <210> 24 <211 > 11 <212> PRT <213> Mus <400> 24 Lys Ala Ser 1 Musculus

Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala5 10 <210 > 25 <211 > 7 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 25 Gly Ala 1 Thr Ser Leu Glu Thr 5 <210 > 26 <211> 9 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 26 Gin Gin Tyr Trp ser Thr Pro Trp Thr 1 5 160 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 27 <211> 137 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 27

Met Asp Phe Gly Leu ile phe phe rle vai Al a Leu Leu Lys Gly vai 1 5 10 15 Gin Cys Glu vai Lys Leu Leu Glu ser Gly Gly Gly Leu vai Gin Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser 35 40 45 Arg Tyr Trp Met Ser Trp vai Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 S5 60 Trp He Gly Glu lie Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp sr Phe xle lie Ser Arg 90 Asp Asn Ala Lys Asn 95 Thr Leu Tyr Leu Gl n Met ser Lys vai Arg ser GlU Asp Thr Ala Leu Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg pro ASp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp vai Trp Gly 115 120 125 Ala Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser ser 130 135

<210> 28 <211> 127 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 28 161 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Met Glu Thr His Ser Gin vai 1 5 vai Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser 10 15

Gly Val Glu Gly 20 Asp ile Val Thr Ser Val Gly Asp Arg Val 35 val Gly 50 Ile Al a val Ala Trp 55 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 65 70 Arg Phe Thr Gly Ser 85 Gly Ser Asn Val Gin Ser GlU Asp Leu 100 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly 115 <21 0> 29 <21 1> 18

Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser 2S 30

Ile Thr cys Lys Ala ser Gin Asp 45

Gin Gin Lys pro Gly oln ser pro 60

Thr Arg His Thr Gly vai Pro Asp 75 80

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 90 95

Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser 105 110

Gly Thr Lys Leu Glu ile Lys 125

<212> PRT ile Val Ala Leu Leu Lys Gly vai 10 15 ile Asn Tyr Thr pro Ser Leu Lys 10 15 <213> Mus Musculus <400> 29

Met Asp Phe Gly Leu lie Phe 1 5

Gin Cys

<210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 30

Arg Tyr Trp Met ser 1 5

<210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 31

Glu Ile Asn Pro Asp Ser ser 1 5

Asp

<210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Mus Musculus 162 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ <400> 32 Pro Asp Gly Asn Tyr Trp <2 10 > 33 <211> 3 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 33 Asn Tyr 1 Ai a <210 > 34 <211 > 20 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 34 Met Glu 1 Thr His Ser Gin 5 Gly Vai Glu Gly 20 <210 > 35 <211 > 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 35 Lys Ala 1 ser Gin Asp vai 5 <210 > 36 <211 > 7 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 36 Trp Ala 1 . Ser Thr Arg His 5 <210 > 37 <211> 9 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 37 Gin Gin 1 Tyr ser Ser Tyr S <210 > 38 <211 > 119 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 38 10

Ser 10 163 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Glu Vai Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gin pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Trp Met ser Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Glu He Asn Pro Asp ser ser Thr lie Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Asp Lys Phe lie lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Lys Vai Arg ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr cys 85 90 95

Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp vai Trp Gly Ala Gly 100 105 110

Thr Thr vai Thr vai Ser ser 115 164 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 39 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Glu val eln Leu vai 1 5 çlu ser Gly Gly Gly Leu Val Gl" pr0 Gly Gly

Ser Leu Arg

Leu ser cys Ala Ala 20 ser Gly Phe Thr phe Ser Trp val 25 30 , , , i o·· Glu Trp Val Ala

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu g « 40

<210> 40 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Arg Phe Thr

Met Asn ser - « Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

Ile Ser Arg Asp Asn A>- ^ ' 15 π ,.-1.. rhr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Leu Arg Ala Glu Asp τη· 30 20 25

<210> 41 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> Glu val 1 41 Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 val Gln Pro Gly Gly IS Ser Leu Arg Leu 20 ser cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Asp Phe Ser 30 Arg Tyr Trp Met Ser 35 Trp val Arg Gln Al a 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp ile Gly Glu 50 Ile Asn Pro Asp Ser 55 ser Thr ile Asn 3r Ala Pro Ser Leu Lys 65 Asp Lys phe Ile Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu ASP 90 Thr Ala Val Tyr Tyr cys 95 Ala Arg pro Asp 100 Gly Asn Tyr Trp Tyr 10S Phe Asp val Trp Gly Gln Gly 110 Thr Leu Val 115 Thr val ser Ser 165 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ <210> 42 <211 > 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 42 Asp lie ! val Met Thr Gin Ser His 1 5

Lys Phe Met ser Thr Ser vai Gly 10 15

Asp Arg vai Ser Ile Thr Cys Lys 20

Ala Ser Gin Asp Vai Gly ile Ala 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40

Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu ile

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 50 55

Gly vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr ile Ser Asn vai Gin ser 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys 85

Gin Gin Tyr Ser ser Tyr pro Tyr 90 95

Glu lie Lys 10S

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 <210> 43 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Asp ile Gin Met Thr Gin ser pro 1 5 Asp Arg Vai Thr ile Thr Cys Trp 20 pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly vai 35 40 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 50 55 ser ser Leu ser Ala ser Vai Gly 10 15

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Vai 25 30 pro ser Arg Phe Ser Gly ser Gly 45 ile ser ser Leu Gin Pro Glu Asp 60

Gin Gly Thr Lys Vai Glu ile L^s

Ser ser Leu ser Ala ser Vai Gly 10 15 vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly 65 70

<210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser pro 1 5 166 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ASP Arg vai Thr ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp vai Gly ile Ala 20 25 jw vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Vai Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Trp Ala ser Thr Arg His Thr Gly vai pro Asp Arg Phe ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Gin Pro 6S 70 75 80

Glu Asp val Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr ser ser Tyr Pro Tyr 85 "0

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 45 <211> 119 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 45

Glu val Lys Leu Leu Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe ser Arg Tyr 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Glu Ile asm Pro Asp Ser ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 SS 60

Lys Asp Lys Phe ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Lys val Arg ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr cys 85 90 95

Ala Arg pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 HO

Thr Thr val Thr val Ser ser 115 167 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 46 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Glu Vai Gin 1 Leu vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin Pro Gly Gly 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser cys Ala Ala ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Trp Val Arg Gin Ala 35 pro Gly Lys Gly Leu 40 Glu Trp vai Ala Arg 45 Phe Thr rle Ser Arg Asp Asn 50 Ala Lys Asn 55 Ser Leu Tyr Leu Gin 60 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 Asp Thr Ala 70 vai Tyr Tyr Cys Ala 75 Arg Trp Gly Gin Gly 80 Thr Leu vai Thr vai 85 Ser ser <210> 47 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Glu Vai Gin 1 Leu vai S Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin pro Gly Gly ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala ser 25 Gly phe ASP Phe Ser 30 Arg Tyr Trp Met ser 35 Trp vai Arg Gin Ala 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp lie Gly Glu lie 50 Asn Pro Asp Ser 55 Ser Thr ile Asn Tyr 60 Ala Pro Ser. Leu Lys Asp Lys 65 Phe lie lie 70 Ser Arg ASP Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala Arg pro Asp 100 Gly Asn Tyr Trp Tyr 105 phe Asp Val Trp Gly 110 Gin Gly Thr Leu vai 115 Thr vai ser Ser 168 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 48

Asp 1 lie vai Met Thr 5 Gin Ser His Lys Phe 10 Met ser Thr ser vai 15 Gly Asp Arg vai ser 20 ile Thr cys Lys Ala 25 ser Gin ASp vai Gly 30 Ile Ala vai Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Gin ser pro Lys 45 Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg HÍS Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 S5 60 ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr lie 75 Ser Asn vai Gin Ser 80 Glu ASP Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr pro Tyr 85 90 95 Thr phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu il e Lys 100 105

<210> 49 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 ASP 1 ile Gin Met Thr 5 Gin ser Pro ser Ser 10 Leu Ser Ala ser val 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 ile Thr Cys Trp sr Gin Gin Lys Pro Gly 30 Lys val pro Lys Leu Leu ile Tyr Gly vai pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Thr ASP Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp 50 S5 60 vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu ile Lys 65 70 75 80 169 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Ala Gly Asp Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu ser Ser val 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 ser Gin ASp val Gly 30 ile Ala Vai Ala Trp 3S Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys val Pro Lys 45 Leu Leu Ile Tyr Trp 50 Ala Ser Thr Arg HIS 55 Thr Gly val Pro Asp 60 Arg phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser Ser Leu Gin pro 65 70 75 80 Glu ASp val Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr ser ser Tyr pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 100 105 <21 0> 51 <21 1> 120 <212> PRT <213> Mus Muscul '.us <400> 51 Ala Gin vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly pro Glu Leu val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp val Lys Gin Arg pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg He Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Ser Asn Gly Lys Phe 50 S5 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser ser Arg Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala val Tyr phe Cys 85 90 95 Ala Arg ser Thr 100 Met ile Met Thr lll Al a Met Asp Tyr Trp 110 Gly Gin Gly Thr Ser val Thr Val ser Ser 115 120 170 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ <210> 52 <211 > 108 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 52 ASp 111 e vai Met Thr Gin ser His 1 5

Lys Phe Met Ser Thr Ser vai Gly 10 15

Asp Arg vai ile ile Thr cys Lys 20

Ala ser Gin Asp vai ser Thr Ala 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40

Gly Gin ser pro Lys Leu Leu lie 45

Tyr ser Ala ser Phe Arg Tyr Thr 50 55

Gly vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Phe Thr vai Ser ser vai Gin Ala 75 80

Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys 85

Gin Gin His Tyr ser Thr Pro Pro 90 95

Leu Glu ile Lys 105

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100

<210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 53

Asn ser Trp Met Asn 1 5

<210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 54

Arg ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys ser Asn Gly Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 55

Ser Thr Met Ile Met Thr Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 171

ΕΡ 2 301 576/PT

<210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 56

Lys Ala Ser Gin Asp Vai Ser Thr Ala Vai Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 57

Ser Ala ser Phe Arg Tyr Thr 1 5

<210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 58

Cys Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Pro Tyr Thr 1 S 10

<210> 59 <211> 120 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 59

Gl n Vai Gin Leu Gin Gl n Ser Gly Pro Glu Leu vai Lys pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser vai Lys lie ser Cys Lys Al a Ser Gly Tyr Al a Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp ile 35 40 45 Gly Arg ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala A5P Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser vai ASP Ser Ala vai Tyr Phe cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Al a Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Ser vai 115

Thr Vai Ser ser 120 172 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 60

Glu Thr Thr Vai Thr Gin ser pro a1 a Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Vai Thr lie Arg Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Glu pro pro ΪΫ Leu Leu ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 ser Gly Tyr Gly Thr Asp phe vai Phe Thr ile Glu Asn Met Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Vai Ala Asp 85 Tyr Tyr cys Leu Gin 90 ser ASP Asn Leu Pro 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 61 ser ser Trp Met Asn l 5 <210 > 62 <211 > 17 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 62 Arg ile 1 Tyr Pro Gly Asp Gly Asp 5 Thr Lys Tyr Asn Gly Lys 10 Phe Lys 15 Gly <210> 63 <211 > 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 63 ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 173 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ <210> 64 <211 > 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 64 Ile Thr ser Thr Asp ile Asp Asp Asp Met Asn 1 5 10

<210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 65

Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro 1 5

<210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 66

Leu Gin Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr 1 S

<210> 67 <211> 120 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 67

Gin val Gin Leu Gin Gin Ser Gly pro Glu Leu vai Lys Pro Gly Ala 15 10 15 ser val Lys lie ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe ser ser ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Arg rle Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser ser Leu Thr ser val Asp ser Ala val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg ser Thr Met Ile Ala Thr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Ser val Thr val ser Ser 115 120 174 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 68 <211> 108 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 68 ASp ile val Met Thr Gl n ser His Lys Phe Met ser Thr ser val Gly 1 5 10 15 Asp Arg val ser 20 lie Thr cys Lys Al a 25 ser Gin ASp val ser 30 Thr Ala val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr phe Thr ile Ser ser val Gin Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr ser Thr pro Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 6 9 ser ser Trp Met Asn 1 5

<210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 70

Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 71

Ser Thr Met ile Ala Thr Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 72 175 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<211> 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 72

Lys Ala ser Gin Asp val ser Thr Ala vai Ala 15 10

<210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 73

Ser Ala ser Tyr Arg Tyr Thr

<210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 74

Gin Gin His Tyr ser Thr pro Pro Tyr Thr 1 5 10

<210> 75 <211> 227 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 75

Met Ala Gly Ser Pro Thr cys Phe Thr Phe ile Tyr Ile Leu Trp Gin 1 5 10 15 Leu Thr Gly Ser Thr Ala ser Gly Ser Val Lys Glu Leu Val Gly Ser 20 25 30 Ile Gly Gly Ala Val Thr Phe Pro Leu Lys ser Glu val Lys Gin Val 35 40 45 Asp Ser Ile Val Trp Thr Phe Asn Thr Thr Thr Leu Val Thr Ile Gin 50 55 60 Pro Glu Gly Gly Pro Met ile val Thr Gin Asn Arg Asn Lys Glu Arg 65 70 75 80 val Hi S phe Pro ASp Gly Gly Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Lys Leu Lys 85 90 95 Lys Asn ASP Ser Gly Ile Tyr Asn val Glu Ile Tyr ser ser ser Leu 100 10S 110 Gin Asp Pro 115 Phe Thr Arg Lys Tyr 120 val Leu Arg Val 35 Glu His Leu ser Lys pro Lys val Thr Met Gly Leu Gin Ser Asn Lys Asn Gly Thr 130 135 140 Cys val Thr ASn LâU Thr cys cys Met Glu Hl s Gly Glu Glu ASp val 145 150 155 160 176 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ile Tyr Thr Trp Lys 165 Ala Leu Gly Gin Ala 170 Val Asn Glu Ser His 175 Asn eiy ser ile Leu pro Ile ser Trp Arg Trp Gly Glu ser Asp Met Thr ISO 185 190 phe Ile 81 Thr val Arg Asn Pro 200 Val ser ser Asn ser 205 Ser Ser Pro lie Leu Ala Arg Lys Leu Cys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Asp Ser 210 215 220 ser Met Val 225 <210> 76 <211> 227 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 76 Ile Gin Met 1 Ala Gly ser Pro 5 Thr Cys Leu Thr phe 10 Ile Tyr Leu Trp 15 Leu Thr Gly Ser 20 Thr Ala Ser Gly Ser 25 val Lys Glu Leu Val 30 Gly Ser ile Gly Gly 35 Ala val Thr Phe pro 40 Leu Lys ser Glu Val 45 Lys Gin Val Asp Ser SO rle Val Trp Thr Phe 55 Asn Thr Thr Thr Leu 60 val Thr Ile Gin pro 65 Glu Gly Gly Pro Met 70 ile Val Thr Gin Asn 75 Arg Asn Lys Glu Arg 80 val HÍS Phe Pro Asp 85 Gly Gly Tyr Ser Leu 90 Lys Leu Ser Lys Leu 95 Lys Lys Asn Asp Ser 100 Gly Ile Tyr Asn val 105 GlU ile Tyr Ser ser 110 ser Leu Gin Asp Pro 115 Phe Thr Arg Lys Val Leu Arg val 35 Glu His Leu Ser Lys 130 Pro Lys Val Thr Met 135 Gly Leu Gin ser Asn 140 Lys Asn Gly Thr cys 14 S val Thr aso Leu Thr 150 cys HÍS Met Glu Hl" S 155 Gly Glu GlU Asp val 160 lie Tyr Thr Trp Lys 165 Ala Leu Gly Gin Ala 170 val Asn Glu Ser HÍS 175 Asn ciy ser Ile Leu 180 Pro Ile ser Trp Arg 185 Trp Gly Glu ser Asp 190 Met Thr Phe He Si Thr val Arg Asn pro 200 val Ser Ser Asn Ser 205 ser Ser Pro lie Leu Ala Arg Lys Leu cys Glu Gly Ala Ala ASp Asp Ser Asp ser 210 215 220

Met Vai

Ser 225 177 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 77 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77

Met Ala Gly ser pro Thr Cys Leu 1 5 Leu Thr Gly Ser 20 Ala Ala ser Gly vai Gly Gly Ala Val Thr Phe Pro 35 40 Asp Ser lie vai Trp Thr Phe Asn 50 55 pro GlU Gly Gly Thr lie Ile Val 65 70 vai Asp phe Pro Asp 85 Gly Gly Tyr Lys Asn ASP Ser 100 Gly Ile Tyr Tyr Gin Gin Pro Ser Thr Gl π GlU Tyr 115 120 Ser Lys Pro Lys Val Thr Met Gly 130 135 cys vai Thr Asn Leu Thr Cys cys 145 150 ile Tyr Thr Trp Lys 165 Ala Leu Gly Gly Ser lie Leu pro Ile ser Trp 180 Phe lie Cys Vai Ala Arg Asn Pro 195 200 lie Leu Ala Arg Lys Leu cys Glu 210 215

Thr Leu rle Tyr ile Leu Trp Gin 10 15 Pro Val Lys Glu Leu val Gly ser 25 30 Leu Lys ser Lys val 45 Lys Gin Val Thr Thr Pro Leu val Thr ile Gin 60 Thr Gin Asn Arg Asn Arg 75 Glu Arg 80 ser Leu Lys Leu Ser Lys Leu Lys 90 95 Val Gly Ile Tyr Ser Ser ser Leu 105 110 Val Leu His val Tyr Glu His Leu 125 Leu Gin ser Asn Lys Asn Gly Thr 140 Met Glu His Gly Glu Glu Asp val 155 160 Gin Ala Ala Asn Glu Ser Hi S Asn 170 175 Arg Trp Gly Glu Ser Asp Met Thr 185 190 val ser Arg Asn Phe Ser Ser Pro 205 Gly Ala Ala asp Asp Pro Asp Ser 220

Ser Met Vai 225 178 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

<210> 78 <211> 227 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 78

Met Ala Gly Ser Pro Thr Cys Leu Thr Leu Ile Tyr Ile Leu Trp Gin 1 5 10 15 Leu Thr Gly ser Ala Ala Ser Gly Pro val Arg Glu Leu val Gly ser 20 25 30 vai Gly Gly Ala Val Thr Phe Pro Leu Lys ser Lys Val Lys Gin val 35 40 45 Asp Ser ile vai Trp Thr Phe Asn Thr Thr pro Leu val Thr ile Gin 50 55 60 Pro Glu Gly Gly Thr Ile Ile val Thr Gin Asn Arg Asn Lys Glu Arg 65 70 75 80 Vai ASp Phe Pro ASP 85 Gly Gly Tyr Ser Leu 90 Lys Leu Ser Lys Leu 95 Lys Lys Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr val Gly ile Tyr Ser Ser Ser Leu 100 105 110 Gin Gin pro 115 Ser Thr Gin Lys Tyr 120 Val Leu HiS val Glu His Leu Ser Lys Pro Lys Val Thr Met Gly Leu Gin Ser Asn Lys Asn Gly Thr 130 135 140 cys vai Thr Asn Leu Thr cys cys Met Glu HiS Gly Glu Glu Asp val 145 150 155 160 ile Tyr Thr Trp Lys Ala Leu Gly Gin Ala Ai a Asn Glu ser HIS Asn 165 170 175 Gly ser ile Leu Pro Ile ser Trp Arg Trp Gly Glu ser Asp Met Thr 180 185 190 Phe ile as val Ala Arg Asn pro 200 val ser Ser Asn Phe 205 ser ser pro lie Leu Ala Arg Lys Leu cys Glu Gly Ala Ala ASp Asp Pro Asp ser 210 215 220 Ser Met Vai

22S <210> 79 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> hu25/mu75: aminoácidos 1-67 de Csl humana fundidos com os aminoácidos 68-224 de CS1 de ratinho 179 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ <400> 79 Met Ala Gly ser pro 5 Thr cys Leu Thr Leu 10 Ile Tyr Ile Leu Trp 15 Gin ueu Thr Gly Ser 20 Ala Ala ser Gly pro 25 val Lys Glu Leu val 30 Gly Ser vai Gly Gly Ala 35 val Thr Phe pro 40 Leu Lys ser Lys Val 45 Lys Gin val Asp Ser ile Vai SO Trp Thr Phe 55 Asn Thr Thr Pro Leu 60 val Thr Ile Gin pro Glu Gly Vai 65 Thr Ser 70 Gin Ser Ser Asn Lys 75 Glu Arg Ile val Phe 80 Pro Asp Gly Leu Tyr 85 Ser Met Lys Leu Ser Gin 90 Leu Lys Lys Asn 95 Asp Ser Gly Ala Tyr 100 Arg Ala Glu ile Tyr 105 ser Thr ser ser Gin 110 Ala ser Leu Ile Gin Glu 11S Tyr val Leu His 120 Val Tyr Lys HIS Leu 125 Ser Arg Pro Lys vai Thr Ile 130 ASP Arg Gin 135 Ser Asn Lys Asn Gly Thr Cys 140 val ile Asn 145 Leu Thr cys Ser Thr 150 Asp Gin Asp Gly Glu 155 Asn val Thr Tyr Ser 160 Trp Lys Ala Val Gly 165 Gin Gly ASP Asn Gin 170 Phe His Asp Gly Ala 175 Thr Leu ser Ile Ala 180 Trp Arg ser Gly GlU 185 Lys Asp Gin Ala Leu 190 Thr cys Met Ala Arg Asn 195 Pro Val ser Asn 200 Ser Phe ser Thr Pro 205 val Phe Pro Gin Lys Leu Cys 210 Glu ASP Ala 215 Ala Thr Asp Leu Thr 220 Ser Leu Arg Gly <210> 80 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mu25/hu75· aminoácidos 1-67 de CS1 de ratinho fundidos com os aminoácidos 68'227 de CS1 humana <400> 80 180

ΕΡ 2 301 576/PT

Met Ala Arg Phe Ser Thr Tyr Ile ile phe Thr ser Val Leu cys Gin 1 S 10 15 Leu Thr Val Thr Ala Ala Ser Gly Thr Leu Lys Lys Val Ala Gly Ala 20 25 30 Leu Asp Gly Ser val Thr Phe Thr Leu Asn ile Thr GlU ile Lys val 35 40 45 Asp 3r Val val Trp Thr Phe 55 Asn Thr Phe Phe Leu 60 Ala Met Val Lys Lys ASp Gly Gly Thr ll« Ile Val Thr Gin Asn Arg Asn Arg Glu Arg 65 70 75 80 Val Asp Phe pro ASP 85 ciy Gly Tyr Ser Leu 90 Lys Leu ser Lys Leu 95 Lys Lys Asn Asp ser Gly ile Tyr Tyr val Gly Ile Tyr ser Ser Ser Leu 100 105 110 Gin Gin Pro 115 Ser Thr Gin Glu 35 val Leu HÍS val Tyr 125 Glu His Leu ser Lys Pro Lys Val Thr Met Gly Leu Gin ser Asn Lys Asn Gly Thr 130 135 140 Cys Val Thr Α5Π Leu Thr Cys Cys Met Glu HÍS Gly Glu Glu Asp val 145 150 155 160 Ile Tyr Thr Trp Lys Ala Leu Gly Gl n Ala Ala Asn Glu ser HIS Asn 165 170 175 Gly Ser Ile Leu 180 Pro Ile ser Trp í« Trp Gly Glu Ser Asp 190 Met Thr Phe Ile Cys Val Ala Arg Asn Pro val ser Arg Asn Phe Ser Ser Pro 195 200 205 rle Leu Ala Arg Lys Leu Cys Glu Gly Ala Ala ASp Asp pro Asp Ser 210 215 220

Ser Met Vai 225 <210> 81 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> hu50/mu50: aminoácidos 1-151 de Csl humana fundidos com os aminoácidos 149-224 de CS1 de ratinho <400> 81

Met Ala Gly ser Pro Thr cys Leu Thr ueu ile Tyr ile Leu Trp Gin 1 5 10 15

Leu Thr Gly Ser Ala Ala ser Gly Pro val Lys Glu Leu vai Gly Ser 20 25 30 181 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Vai Gly ei y 35 Ala val Thr Phe Pro 40 Leu t-ys ser t-ys val 45 Lys Gin val ASP ser 50 lie val Trp Thr Phe 55 Asn Thr Thr Pro Leu 60 Val Thr ile Gin ΡΓΟ 65 Glu Gly Gly Thr Ile 70 ile val Thr Gl Π Asn 75 Arg Asn Arg Glu Arg 80 val Asp Phe Pro Asp 85 Gly Gly Tyr Ser Leu 90 Lys Leu Ser Lys Leu 95 Lys Lys Asn Asp ser 100 Gly Ile Tyr Tyr Val 105 Gly Ile Tyr ser ser 110 Ser Leu Gin Gin Pro 115 Ser Thr Gl n Glu Tyr 120 val Leu His val Tyr 125 Glu HÍS Leu Ser 33 pro Lys val Thr ile 135 Asp Arg Gin ser Asn 140 Lys Asn Gly Thr cys 145 val ile Asn Leu Thr 150 Cys Ser Thr Asp Gin 155 Asp Gly Glu Asn val 160 Thr Tyr ser Trp Lys 165 Ala Val Gly Gin Gly 170 Asp Asn Gin phe His 175 Asp Gly Ala Thr Leu 180 Ser ile Al a Trp Arg 185 Ser Gly Glu Lys Asp 190 Gin Ala Leu Thr 31 Met Ala Arg Asn pro 200 Val Ser Asn Ser Phe 205 ser Thr Pro val phe Pro Gin Lys Leu cys Glu ASp Ala Ala Thr ASp Leu Thr Ser 210 215 220

Leu Arg Gly

22S <210> 82 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> mu50/hu50: aminoácidos 1-131 de CS1 de ratinho fundidos com os aminoácidos 135-227 de CS1 humana <400> 82

Met Ala Arg Phe Ser Thr Tyr ile lie Phe Thr Ser Vai Leu Cys Gin 15 10 15 182 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Leu Thr Val Thr 20 Ala Ala Ser Gly Thr 25 Leu Lys Lys val Ala Gly 30 Ala Leu Asp Gly 35 Ser Val Thr Phe Thr 40 Leu Asn Ile Thr Glu 45 Ile Lys val ASp Val Val Trp Thr Phe 55 Asn Thr Phe Phe Leu 60 Ala Met val Lys Lys 65 Asp Gly val Thr ser 70 Gin ser Ser Asn 8' Glu Arg rle val phe 80 pro Asp Gly Leu Tyr 85 Ser Met Lys Leu Ser 90 Gin Leu Lys Lys Asn 95 Asp Ser Gly Ala Tyr 100 Arg Ala Glu He Tyr 105 Ser Thr ser Ser Gin 110 Ala Ser Leu ile Gl n 115 Glu Tyr Val Leu Hi s 120 Val Tyr Lys HÍ5 Leu 125 Ser Arg Pro Lys Val 130 Thr Met Gly Leu Gin 135 Ser Asn Lys Asn Gly 140 Thr cys val Thr Asn 145 Leu Thr cys Cys Met 150 Glu His Gly Glu Glu 155 Asp val Ile Tyr Thr 160 Trp Lys Ala Leu ílí Gin Ala Ala Asn Glu 170 Ser His Asn Gly ser 175 Ile Leu Pro lie Ser 180 Trp Arg Trp Gly Glu 185 Ser Asp Met Thr Phe 190 Ile Cys vai Ala Arg 195 Asn Pro val Ser Arg 200 Asn Phe ser ser Pro 205 ile Leu Ala Arg Lys 210 Leu cys Glu Gly Ala 215 Ala Asp Asp Pro Asp 220 Ser ser Met Val <210> 83 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> hu75/mu25: aminoácidos 1-169 de CS1 humana fundidos com os aminoácidos 167-224 de CS1 de ratinho <400> 83

Met Ala Gly ser Pro Thr Cys Leu Thr Leu ile Tyr ile Leu Trp Gin 1 S 10 15

Leu Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Pro vai Lys Glu Leu vai Gly Ser 20 25 30 vai Gly Gly Ala Vai Thr Phe Pro Leu Lys ser Lys vai Lys Gin vai 35 40 45 183 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ ASp ser Ile vai Trp Thr Phe Asn Thr Thr pro Leu Vai Thr Ile Gin 50 55 60 pro Glu Gly Gly Thr Ile lie Vai Thr Gin Asn Arg Asn Arg Glu Arg 65 70 75 80 vai ASP Phe Pro ASp Gly Gly Tyr Ser Leu Lys Leu ser tys Leu Lys S5 90 95 tys Asn ASP ser Gly ile Tyr Tyr vai Gly lie Tyr ser ser ser Leu 100 105 110 Gin Gin pro Ser Thr Gin Glu Tyr vai Leu Mis Vai ryr Glu HfS Leu 115 120 125 Ser m pro Lys Vai Thr Met 135 Gly Leu Gin Ser Asn 140 Lys Asn Gly Thr cys vai Thr Asn Leu Thr cys cys Met Glu Hf s Gly GlU Glu Asp vai 145 150 155 ISO ile Tyr Thr Trp Lys 165 Ala Leu Gly Gin Gly 170 ASp Asn Gin Phe Hf S 175 ASp Gly Ala Thr Leu ser Ile Ala Trp Arg ser Gly Glu Lys ASp Gin Ala ISO 185 190 Leu Thr Cys Met Ala Arg Asn Pro vai Ser Asn Ser Phe Ser Thr Pro 1§5 200 20S Vai Phe Pro Gin Lys Leu Cys Glu ASp Ala Ala Thr ASP Leu Thr Ser 210 215 220 Leu Arg Gly

22S <210> 84 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mu75/hu25: aminoácidos 1-166 de CS1 de ratinho fundidos com os aminoácidos 170-227 de CS1 humana <400> 84

Met Ala Arg phe ser Thr ryr ile lie Phe Thr Ser Vai Leu cys Gin 15 10 15 184 ΕΡ 2 301 576/ΡΤ

Leu Thr Vai Thr Ala Ala Ser Gly Thr Leu Lys Lys vai Ala Gly Ala 20 25 30

Leu Asp Gly Ser Vai Thr Phe Thr Leu Asn Ile Thr Glu lie Lys Vai 35 40 45

Asp Tyr Vai Vai Trp Thr Phe Asn Thr Phe Phe Leu Ala Met Vai Lys 50 55 60

Lys Asp Gly Vai Thr ser Gin ser Ser Asn Lys Glu Arg Ile Vai Phe 65 70 75 80 pro Asp Gly Leu Tyr Ser Met Lys Leu Ser Gin Leu Lys Lys Asn Asp 85 90 95

Ser Gly Ala Tyr Arg Ala Glu ile Tyr Ser Thr Ser ser Gin Ala ser 100 105 110

Leu Ile Gin Glu Tyr Vai Leu His Vai Tyr Lys His Leu Ser Arg Pro 115 120 125

Lys Vai Thr ile Asp Arg Gin ser Asn Lys Asn Gly Thr cys vai ile 130 135 140

Asn Leu Thr cys Ser Thr Asp Gin Asp Gly Glu Asn vai Thr Tyr Ser 145 150 155 160

Trp Lys Ala Vai Gly Gin Ala Ala Asn Glu Ser His Asn Gly Ser Ile 165 170 175

Leu Pro ile ser Trp Arg Trp Gly Glu Ser Asp Met Thr Phe Ile cys 180 185 190

Vai Ala Arg Asn Pro Vai Ser Arg Asn Phe Ser ser Pro ile Leu Ala 195 200 205

Arg Lys Leu cys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Asp ser Ser Met vai 210 215 220 <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <400> 85

Glu ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr He Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15

Asp

Lisboa, 2012-12-04

Claims

ΕΡ 2 301 576/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou um fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para administração em combinação com velcade para o tratamento de mieloma múltiplo, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl se ligam a uma proteína codificada por SEQ ID NO:l, inibem a secreção de imunoglobulinas e competem pela ligação à referida proteína com um anticorpo de controlo, em que o anticorpo de controlo compreende uma região VH compreendendo SEQ ID NO:5 e uma região VL compreendendo SEQ ID NO: 6 .
2. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl diminuem em pelo menos 50%, num ensaio de ligação competitiva, a ligação do anticorpo de controlo à proteína.
3. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl compreendem uma região variável da cadeia pesada com sequências de região determinante de complementaridade (CDR) possuindo sequências de aminoácidos que partilham 85% a 100% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17.
4. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl compreendem uma região variável da cadeia leve com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos que partilham 85% a 100% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20.
5. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com qualquer ΕΡ 2 301 576/ΡΤ 2/5 uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl compreendem uma região variável da cadeia pesada com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17; e uma região variável da cadeia leve com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20.
6. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com as reivindicações 3 ou 4, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl possuem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:5 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:6.
7. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl compreendem uma região variável da cadeia pesada com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:85 e SEQ ID NO:17; e uma região variável da cadeia leve com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20.
8. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para a utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl possuem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 47 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:50.
9. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, 7 ou 8, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl são humanizados. ΕΡ 2 301 576/ΡΤ 3/5
10. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com gualguer reivindicação precedente, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl inibem a secreção de imunoglobulinas em pelo menos 40%.
11. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl são uma IgGl.
12. Utilização de (a) um anticorpo monoclonal anti-CSl ou um fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl e (b) velcade, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de mieloma múltiplo, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou o fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl se ligam a uma proteína codificada por SEQ ID NO:l, inibem a secreção de imunoglobulinas e competem pela ligação à referida proteína com um anticorpo de controlo, em que o anticorpo de controlo compreende uma região VH compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma região VL compreendendo SEQ ID NO:6.
13. Utilização da reivindicação 12, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl diminuem em pelo menos 50%, num ensaio de ligação competitiva, a ligação do anticorpo de controlo à proteína.
14. Utilização da reivindicação 12 ou da reivindicação 13, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl compreendem uma região variável da cadeia pesada com sequências de região determinante de complementaridade (CDR) possuindo sequências de aminoácidos que partilham 85% a 100% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17.
15. Utilização de qualquer uma das reivindicações 12 a 14, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl compreendem uma região variável da cadeia leve com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos que partilham 85% a 100% de identidade de ΕΡ 2 301 576/ΡΤ 4/5 sequência com as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20.
16. Utilização de qualquer uma das reivindicações 12 a 15, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl compreendem uma região variável da cadeia pesada com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17; e uma região variável da cadeia leve com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20.
17. Utilização das reivindicações 14 ou 15, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl possuem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:6.
18. Utilização de qualquer uma das reivindicações 12 a 15, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl compreendem uma região variável da cadeia pesada com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:85 e SEQ ID NO:17; e uma região variável da cadeia leve com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20.
19. Utilização da reivindicação 18, em que o anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl possuem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:47 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:50.
20. Utilização de qualquer uma das reivindicações 12 a 15, 18 ou 19, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl são humanizados.
21. Utilização de qualquer uma das reivindicações 12 a 20, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl inibem a secreção de imunoglobulinas em pelo menos 40%. ΕΡ 2 301 576/ΡΤ 5/5
22. Utilização de qualquer uma das reivindicações 12 a 21, em que o anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl são uma IgGl. Lisboa, 2012-12-04