PT2252282E

PT2252282E - Composição cosmética e/ou dermatológica compreendendo um inibidor de redutase de hmg-coa e um inibidor da sintase de farnesil-pirofosfato

Info

Publication number: PT2252282E
Application number: PT88732342T
Authority: PT
Inventors: Nicolas Levy; Pierre Cau; Patrice Bourgeois; Vincent Bonniol
Original assignee: Université D Aix Marseille
Priority date: 2008-01-03
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2015-11-04
Also published as: US20110165092A1; PL2252282T3; WO2009112653A3; EP2252282B1; FR2926020A1; WO2009112653A2; FR2926020B1; EP2252282A2; DK2252282T3; ES2546208T3

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO COSMÉTICA E/OU DERMATOLÓGICA COMPREENDENDO UM INIBIDOR DE REDUTASE DE HMG-CoA E UM INIBIDOR DA SINTASE DE

FARNESIL-PIROFOSFATO

Campo Técnico A presente invenção refere-se a uma composição cosmética e/ou dermatológica destinada ao tratamento de doenças da pele e do sistema piloso.

Na descrição que se segue, as referências entre parênteses (X) referem-se à lista de referências no final dos exemplos,

Estado da técnica 0 núcleo da célula eucariótica é delimitado por uma dupla membrana perfurada com poros, o envelope nuclear, que controla as trocas moleculares entre compartimentos nucleares e citoplasmáticos. Este envelope isola parcialmente o conteúdo do núcleo, isto é, o material genético e toda a maquinaria enzimática necessária para a realização do genoma nuclear. 0 envelope nuclear é constituído por duas membranas concêntricas, a membrana externa, em continuidade com o retículo endoplasmático, e a membrana interna. Esta última é revestida na sua face interna por uma rede fibrilar densa chamada lamina nuclear. É uma rede de proteínas que consiste essencialmente em polímeros laminados e proteínas associadas. Em vertebrados, há duas subclasses de lâminas: as lâminas do tipo A (lâminas A e C) e do tipo B (lâminas Bl, B2 e B3) que participam todas na elaboração da lamina.

Esta última é mantida no lugar pela combinação com outras proteínas, ligadas à membrana interna do envelope nuclear (para revisão Gruenbaum et al,, 2005 (19)) .

As lâminas são proteínas em forma de filamentos que pertencem à família dos filamentos intermediários (tipo V) que têm todos uma estrutura comum.: um segmento curto globular no terminal N (cabeça) separado dum outro segmento globular do terminal C (cauda) por domínio central longo compreendendo um número de hélices alfa (domínio haste). A cauda globular contém, em particular, um sinal de localização nuclear (NLS) para tratar o núcleo após a síntese. O domínio central permite a associação de duas moléculas de lâmina paralelas e a sua organização em filamentos por associação dos dímeros "cabeça-pés". Esta estrutura dá-lhes propriedades mecânicas muito resistentes.

Apenas a lâmina A e a lâmina B sofrem uma maturação após a síntese de um precursor (para revisão Gruenbaum et al. , 2000 (20)). A lâmina C é sintetizada diretamente na sua forma madura. O precursor da lâmina A e da lâmina B termina com um motivo característico CaaX (C é uma cisteína, tem um aminoácido de cadeia alifática não carregado e X é qualquer aminoácido, aqui uma metionina, para avaliação, Levy & Cau 2003 (29)}. O motivo CaaX do terminal C permite a ligação de um ácido gordo (geralmente, um ácido gordo em C15, farnesil) por uma transferase de farnesil. Esta prenilação (o motivo farnesil derivado de uma unidade alifática de base em C5 chamada isopreno) permite às pré-lâminas serem inseridas na membrana do retículo endoplasmático após a sua síntese no citosol. Sofrem a ação de uma endoprotease própria inserida na membrana do envelope do retículo e cujo centro ativo é citosólico. A endoprotease específica da pré-lâmina A é Facel (ou ZMPSTE24, zinco metalo-profease homóloga de STE24 da levedura), enquanto Face2 (ou Reel, enzima conversora ras) é específica das pré-lâminas B. Estas enzimas catalisam a hidrólise da ligação peptídica entre a cisteina e o aminoácido seguinte (alifático), encurtando as pré-Lâminas de 3 aminoácidos. 0 terminal carboxilo da cisteina farnesilada é, em seguida, reconhecido por uma transferase de isoprenilcisteína-carboximetil (ICMT) que vem fixar um grupo metilo por esterificaçao.

Apenas a maturação da pré-lâmina A continua com uma segunda clivagem endoproteolítica por Facel, que liberta um peptídeo farnesil de 15 aminoácidos e a lâmina A madura. EstaL lâmina A, que não inclui o ácido gordo, torna-se solúvel, é importada para o núcleo através do sinal de localização nuclear, e está localizada na própria lamina nuclear, bem como no resto do compartimento nuclear, constituindo um genuíno esqueleto nuclear (Gruenbaum et al·., 2005 (19)). A lâmina B madura, no entanto, ainda possui no terminal C a sua cisteina farnesilada e metilesterifiçada. Permanece, portanto, inserida na membrana do envelope do retículo e, depois, no lado nucleoplásmico do envelope nuclear, em que a sua localização exclusiva na lamina nuclear, sob a membrana interna do envelope nuclear, onde ela está ancorada. O termo prenilação significa a fixação no grupo tiol de uma cisteina ou uma cadeia de farnesilo de 15 átomos de carbono, que é chamada de farnesilação ou uma cadeia de geranil-geranilo de 20 átomos de carbono, que é chamada de geranil-geranilação (Reid et al., 2004 (39)), ou qualquer outro derivado de isopreno. A farnesilação cataLlisaLda pela transferase de farnesil (FTase), que reconhece a sequência de consenso do terminal C (CaaX), de preferência fixa um grupo farnesilo no resíduo de cisteína do motivo. A geranil-geranilação é a fixação pela transferase de geranil-geranilo (GGTase) de um grupo de geranil-geranilo no resíduo de cisteína do motivo.

Estes ácidos gordos são derivados da via biossintética, que, a partir da hidroximetil-glutaril-coenzima A, é usada pelas células para a produção, em particular, de colesterol os esteroides, o heme na hemoglobina e ubiquinonas (Hampton & al., 1996 (20)) . A família das proteínas preniladas compreende cerca de 300 membros no genoma humano, a maioria dos quais podem ser identificados por o motivo CaaX no terminal C (Reid et al., 2004 (39)). As proteínas das famílias Ras, Rh o, Rab (Leung et al., 2006 (28)), certas proteínas que fornecem função de importação para a mitocôndria (HDJ2), algumas proteínas mitóticas (CENPE, CENPF) são, especialmente, preniladas (Winter-Vann & Casey 2005 (51)) . Em geral, se no motivo CaaX, X é serina, metionina, cisteína, alanina e glutamato, a isoprenóide, preferencialmente enxertada, é farnesilo. Se X é uma leucina, o reconhecimento do motivo Caal far-se-á, preferencialmente, pela GGTase, que catalisará a transferência de um grupo geranil-geranilo (Basso et al., 2006 (1)). É provável que outros grupos derivados de isopreno possam também ser ligados a esta cisteína, embora isso não seja descrito na literatura.

Nos seres humanos, existem três genes de lâminas. O gene LMNA, localizado em lq21.2-q21.3 (Wydner et al., 1996 (52)), dá lâminas A e C, por processamento alternativo. 0 gene LMNA é composto por 12 exões. 0 inicio do exão 1 codifica a extremidade globular do terminal N comum às lâminas A e C; o final do exão 1 e até ao inicio do exão 7 codificam a parte central helicoidal; por fim, os outros exões codificam a extremidade globular do terminal C (Levy & Cau 2003 (29)).

De facto, o gene codifica quatro produtos de processamento diferente, cujas lâminas C e a pré-lâmina A são as duas principais (Lin & Worman 1993 (31)} . A produção diferencial das lâminas A e C é feita através da utilização de um local de processamento alternativo no exão 10 do pré-mensageiro, de tal modo que, a lâmina C é codificada pelos exões 1 a 10 e a lâmina A é codificada pelos exões 1 a 9, os primeiros 90 pares de bases do exão 10, e os exões 11 e 12 (específicos da lâmina A).

Portanto, os péptidos da pré-lâmina A e da lâmina C são idênticos nos primeiros 566 aminoácidos, as extremidades dos terminais C das lâminas C e da pré-lâmina A contêm, em seguida, respetivamente, 6 e 98 aminoácidos específicos.

As lâminas cio tipo B compreendem três proteínas diferentes (Shelton et al 1981. (43)): as lâminas Bl, B2 (as duas isoformas rnais representadas) e B3. O gene LMNBl está localizado em 5q23.3-q31.1 e contém 11 exões que codificam a 1 âm i n a B1 (L i n & W o rm a η 19 9 5 (30)) . O gene LMNB2 está localizado em 19pl3.3 e codifica as lâminas B2 e B3 por um mecanismo de processamento alternativo (Biamonti et al., 1992 (2)).

As lâminas do tipo B são expressas constitutivamente em todas as células a partir das primeiras fases do desenvolvimento, enquanto as lâminas do tipo A estão, geralmente, ausentes em células estaminais embrionárias (Stewart et al. , 1987 (45)) e são expressas em todas as células somáticas diferenciadas. A sua expressão está sujeita a regulamentação por parte do tecido e durante a vida (Duque et al em 2006 (9)). Parece que a sua expressão não é necessária, uma vez que os ratinhos em que foi especificamente bloqueada a expressão da lâmina A, mas, ainda, expressam a lâmina C e outras lâminas, não têm fenótipo apsLrente (Fong et ai em 2006 (14)}.

As lâminas interagem com um grande número de parceiros proteicos com funções muito diversas; por conseguinte, estão envolvidas num grande número de processos nucleares, incluindo a replicação e reparação do ADN, o controlo da transcrição e do processamento, a organização da estrutura da cromatina (para revisão ver Shumaker et al., 2003 (44), Zastrow et al., 2004 (54), Hutchinson et al. 2004 (26), Gruenbaum et al. , 200 5 (19)). As al terações na estrutura da lamina, são a causa de várias doenças hereditárias humanas. São devidas a mutações nos genes que codificam lâminas, ou outras proteínas da lamina. Agrupámos estas patologias condições sob o termo genérico laminopatias (Broers & al., 2006 (5), Mattout et al 2006 (33)). Recen temente, foram identificadas mutações nos genes de enzimas responsáveis pela maturação das lâminas (Facel, em particular), o que leva a patologias que também pertencem ao grupo das laminopatias (Navarro et al, 2004 (36) e 2005 (35)).

Até à data, a única patologia nos seres humanos associada com mutações nos genes LMNBl ou 2 é uma leucodistrofia causada por uma duplicação completa do gene LMNBl (Padiath et al. 2006 (37)). A dúvida permanece sobre o envolvimento potencial das variações na sequência encontradas em LMNB2 em pacientes com sindrome de Barraquer-Simon (Hegele et al em 2006 (22)), No entanto, tem sido demonstrado in vitro por experiências de ARNi (ARN de interferência} (Harborth & al., 2001 (21)) e no modelo de ratinho (Vergnes et al. , 2004 (50) , que as lâminas do tipo B são essenciais para o desenvolvimento e a integridade da célula, De facto, a deficiência da lâmina Bl provoca letalidade perinatal nos ratinhos. Além disso, os núcleos dos fibroblastos embrionários dos mesmos ratos deficientes em. LMNB1 mostrara alterações notáveis na morfologia nuclear, semelhantes às observadas em pacientes portadores de mutações no gene LMNA. Além disso, demonstrou-se recentemente que as lâminas B são necessárias para a formação do fuso de divisão durante a mitose, o que tende a demonstrar que o seu papel é dinâmico e múltiplo durante o ciclo celular, e não, apenas, restringido à manutenção da arquitetura do núcleo (Tsai et al 2006 (48)}. Neste último papel, um artigo recente demonstra a função estrutural das lâminas B: as células artificialmente privadas das lâminas Bl tem um núcleo "flutuante" na célula, que roda sobre si mesmo (Liu et al. 2007 (45)). A redundância funcional existente entre as duas lâminas Bl e B2 é, provavelmente, também um reflexo direto da sua indispensabilidade, exercendo uma forte pressão de seleção e mascarando o efeito de quaisquer alterações na sequência dos genes correspondentes.

As alterações funcionais das lâminas A/C, devido a mutações do gene LMNA, estão na origem cie, pelo menos, 15 desordens envolvendo uma ampla variedade de patologias num espectro clinico que varia de formas leves, que afeta um único tecido, de forma isolada, a formas sistémicas letais no periodo perinaLtal. O número de mutações no gene LMNAL altera significativamente o conjunto de proteínas no envelope nuclear e afetam o funcionamento. Nas células de vários tecidos, a morfologia dos núcleos é alterada: muitas vezes apresentam hérnias que expulsam material genético para o citoplasma (Goldman et ai, 2004 (18)).

As proteínas normalmente associadas ao envelope nuclear, as lâminas B, algumas proteínas de poros nucleares e proteínas LAP2, estão ausentes da periferia dessas hérnias.

Estas anomalias morfológicas são seguidas de alterações funcionais, que eventualmente levam à morte celular:. Entre todas as patologias agrupadas sob o nome de laminopatias, apenas aquelas relacionadas com a acumulação de uma forma anormal da proteína prenilada são englobadas pela presente invenção. É principalmente a síndrome de Hutchinson-Gilford ou progeria (De Sandre-Giovannoli & ai., 2003 (7), Eriksson et al., 2003 (11)), e a dermopatia restritiva (Navarro et al., 2004 (36)). Nestas duas síndromes, a causa fisiopatológica é uma acumulação e uma persistência nas células dos pacientes de pré-lâmina farnesilada não maturada. A dermopatia restritiva, letal em todo o período natal, é caracterizada por sinais clínicos que são quase inteiramente o resultado de um défice cutâneo, que restringe os movimentos in utero. Esta condição é muito rara. A pele é rígida e tensa, cedendo por locais, fazendo, por exemplo, lesões nas axilas ou pescoço. As pestanas, as sobrancelhas e a penugem cutânea estão ausentes ou são muito escassas. Um hidramnio está frequentemente presente, e diminuição da movimentação fetal é relatada a partir do sexto mês de gravidez. Ao nível do esqueleto, a radiografia revela contraturas de todas as articulações, pés em machado de gelo, clavículas finas, displásicas e bipartidas, costelas em fita, ossos longos tubulares dos braços e desmineralização do crânio. A transmissão da dermopatia restritiva letal é autossómica recessiva.

As mutações de LMNA e ZMPSTE24/Facel foram relatadas psLra esta patologia (Navarro et al., 2004 (36)). Nos dois casos, o mecanismo fisiopatológico é o mesmo: a pré-lâmina A não pode amadurecer (mutação nula de Facel ou desaparecimento do local de clivagem por mutação da pré-lâmina A) e, assim, permanece farnesilada e inserida na membrana nuclear. A persistência e acumulação nas células destes precursores anormais, o que provavelmente prevene a interação normal das lâminas B e C com os seus parceiros, provoca a morte celular e, logo, do paciente. Ficou claramente demonstrado que é a persistência do grupo farnesilo, e não a ausência da lâmina A madura, como se poderia pensar à primeira vista, que é responsável pela toxicidade celular (Fong et al. , 2004 (16 )) .

Em Abril de 2003, a partir de uma sobreposição de sintomas comuns para a displasia acromandibular e determinadas doenças resultantes no envelhecimento prematuro, os inventores mostraram que a progeria, a forma ma is comum e mais grave do envelhecimento prematuro, resulta duma mutação do gene LMNA (De Sandre-Giovannoli & al., 2003 (7)). As crianças com esta doença, também conhecida como síndrome de Hutchinson-Gilford, sofrem de envelhecimento acelerado, até dez vezes mais rápido do que o de um indivíduo normal, e têm uma esperança de não mais do que 13 anos de vida. Na Europa, uma criança em cerca de seis milhões é afetada. Os sintomas são um envelhecimento da pele, calvície, redução do tamanho da mandíbula e problemas relacionados com a velhice, como a rigidez cias articulações e distúrbios cardiovasculares. Estes últimos, tais como, enfarte do miocárdio ou aterosclerose, são muitas vezes a causa da morte. A mutação incriminatória, localizado no exão 11 do gene LMNA, ativa um local de processamento críptico pré-ARNm, resultando em ARNm suprimido de 150 nucleótidos (De-Giovannoli Sander et al. , 2003 (7), Eriksson et al. 2003 (11)). Este mRNA suprimido é traduzido numa pré-lâmina A anormal, a progeria, que não pode ser amadurecida em lâminas A normais: ausência de 50 aminoácidos do exão 11 contendo o reconhecimento protease bloqueia a 2a clivagem da progerina, cuja extremidade do terminal C preserva o seu grupo farnesilo. Continua a ser inserido no lado nucleoplásmico do envelope nuclear, que tem as alterações características, hérnias do nucleoplasma no citosol e distribuição anormal de heterocromatina periférica (Goldman et al., 2004 (18)). Mais uma vez, é a persistência do grupo farnesilo, por isso, necessária para a ancoragem na membrana do envelope do retículo no qual estão localizadas alguns dos enzimas responsáveis pela maturação (clivagens, metilação) que é responsável pela toxicidade celular da progerina (Fong et al., 2004 (16)).

Estas patologias sistémicas têm a particularidade de serem aLSSociado ao aparecimento precoce dos sinais geralmente associados ao envelhecimento. A sua característica fisiopatológica comum é gerar uma lâmina prenilada, com as consequências descrit.as .

Dois estudos recentes têm demonstrado que a redução da acumulação intranuclear da pré-lâmina farnesilada, truncada ou não, evita eficazmente a aparição do fenótipo celular. O primeiro foi realizado no modelo de ratinho progeróide deficiente em protease Facel (Pendas & al., 2002 (38)). Quando cruzados com ratinhos que expressam a metade da Lâmina A (rato LmnA + /-), os efeitos da ausência de Facel são diminuídas (Varela & ai., 2005 (49)). O segundo estudo mostra que o tratamento de células do paciente HGPS por morfolino (oligonucleotídeos antessentido) visando o local de processamento críptico aooie o renótipo mutants (Scatfioi & Mistelri 2υ05 (43)) . Vários estudos recentes (ver Scaffidi & Mistelli 2006 (42)) mostram o envolvimento da lâmina A no processo de envelhecimento fisiológico. Em particular, demonstrou-se que durante o envelhecimento fisiológico, a progerina é sintetizada pelas células na ausência de qualquer mutação do gene LMNA devido ao uso com baixo nível de ruído do local de processamento críptico do exão 11. Esta progerina localiza-se na lamina, na periferia do núcleo das células. O núcleo das células de pacientes idosos "normais" pode ter hérnias características de uma laminopatia causadas por estes eventos de processamento acidentais, que resultam. em. anomalias das funções celulares e são, provavelmente, pelo menos em parte, responsáveis pelo envelhecimento.

Na pele in vivo, a. progerina também é sintetizada por uma subpopulação de fibroblastos dérmicos e queratinócitos, células em que se acumula com a idade. A progerina poderia ser um marcador do envelhecimento da pele (McClintock et al. , 2007 (34)) .

Parece que os mecanismos moleculares semelhantes são parcialmente responsáveis por sinais de envelhecimento prematuro em pessoas que sofrem de Progeria e em. segundo lugar, a um nível muito ma is baixo, estão envolvidos no envelhecimento fisiológico de indivíduos não portadores de mutações * 0 documento Ramirez et al. "human progeroid syndromes aging and cancer : new genetic and epigenetic insights into old question" Cell. Mol. Life Sci, vol. 64, 2007, página 155-170, sugere a utilização de estatinas e aminobifosfonatos para bloquear a farnesilação da lâmina A aberrante que atua na via da sintese do pirofosfato de farnesil. O documento EP 1566177 descreve a incubação da cultura de fibroblastos com uma composição compreendendo pamidronato ou alendronato que estimula a síntese de colagénio 1 pelos ditos fibroblastos (Exemplos 1 a 3). Este documento também descreve uma composição que compreende pamidronato ou alendronato que reduz as rugas (Exemplo 5).

Existem no estado da técnica duas abordagens terapêuticas descritas para melhorar o fenótipo celular causado pela produção patológica de progerina. A primeira destas soluções é simplesmente evitar o uso pelo spliceosome deste local de processamento críptico dentro do exâo 11, "mascarando" por tratamento com um oligonucleótido antessentido (Scaffidi & Misteli 2005 (41)} ou com um retrovirus produzindo um siARN (Huang et al., 2005 (25)). Os resultados são promissores in vitro, mas esta é a terapia "genética" e o desenvolvimento de um fármaco em torno desta abordagem é inevitavelmente longo e complicado, com todos os inconvenientes associados com a vectorização de OAS para conseguir um efeito in vivo, A segunda solução consiste na inibição da transferase de farnesil, a enzima que catalisa a transferência do grupo farnesilo em pré-lâminas a partir de pirofosfaito de farnesil. Quando esses inibidores (FTI) são usados, um envelope nuclear "normal" é apenas parcialmente restaurado em células HGPS (progeria) em cultura, e a sobrevivência de ratos RD (KO ZMPSTE2 4) é melhorada (Glynn & Glover 2005 (17), Cape11 & al., 2005 (6), Toth et al., 2005 (47), Fong et al., 2 0 0 6 (15)) .

No entanto, o bloqueio da farnesilação pode induzir uma geranil-geranilação compensatória (Bishop et al., 2003 (3), Varela et al., 2008 (55)) .

Por outro lado, foi recentemente relatado que os FTI induzem uma paragem do ciclo celular, bloqueando o proteassoma (Demyanets et al., 2006 (8) & Efuet Keyornarsi 2006 (10)). Assim, o tratamento induziu, provavelmente, uma acumulação no nucleoplasma de progerina, provavelmente, ubiquitinilatada, não degradada pelo proteassoma.

Além disso, estudos recentes relatara que a redução na taxa de farnesilação da progerina in vivo é muito baixa, da ordem de 5% (Young et. al., 2006 (53)), que não é suficiente para explicar a restauração da morfologia nuclear observada in vitro.

Finalmente, os FTI são específicos para apenas uma das vias de prenilação de proteínas, e não podem ser considerados como inibidores globais de prenilações pós-traducionais.

Além disso, é relatado que a ausência total de uma das enzimas desta via, mevalonato quinase, é letal na infância (mutação horaozigótica, perda da função do gene que codifica esta enzima, síndrome relatado por Hoffmann et al., 2003 (24)).

Divulgação da Invenção

Depois de extensas pesquisas, os inventores demonstraram que a combinação de um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (família das estatinas} e um inibidor da sintase do pirofosfato de farnesilo (família dos amino-bisfosfonatos, NBP) , ou um seu sal fisiologicamente aceitável, é um tratamento eficaz de situações patológicas ou não, relativamente à acumulação e/ou a persistência nas células de proteínas preniladas, na medida em que atua sobre toda a via de prenilação de proteínas, tanto em Cl 5 como em C2 0, ou nas formas não caracterizadas, Os inventores descobriram, ainda, que a combinação de um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesil têm um efeito sinérgico na restauração do fenótipo normal nos fibroblastos de pacientes com progeria. 0 efeito da combinação é significativamente maior do que o efeito de quaisquer inibidores utilizados individualmente. A utilização da combinação em células de pacientes com progeria e num modelo de ratinho reproduzindo a dermopatia restritiva leva a uma inibição da prenilação de proteínas, portanto, ao aparecimento da pré-lâmina A não farnesilada e melhoria dos sintomas nucleares (Varela & al., 2008 (24)).

Este, por conseguinte, refere-se à utilização de pelo menos um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) e pelo menos um inibidor de sintase de pirofosfato de farnesil, ou um seu sal fisiologicamente aceitável, na preparação de uma composição cosmética e/ou dermatológica. Esta composição pode ser, por exemplo, para tratamento de situações patológicas, ou de outra forma, relacionadas com a acumulação e/ou a persistência de células de proteínas preniladas.

Em particular, a presente invenção refere-se a uma composição tópica dermatológica compreendendo: pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA), e - pelo menos um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesil, para uso no tratamento de desordens cutâneas e/ou pilosas selecionado a paLrtir do grupo que consiste no envelhecimento cutâneo prematuro patológico e/ou envelhecimento mio-lipo-cutâneo precoce patológico, A presente invenção também se refere ao uso cosmético não terapêutico de uma composição cosmética compreendendo: pelo menos um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA), e - pelo menos um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesil para o tratamento de desordens cutâneas e/ou pilosas selecionado a partir do grupo que consiste no envelhecimento cutâneo e/ou lipodistrofia.

Num outro aspeto, a presente, também, descreve a utilização - Em conjunto ou simultaneamente, isto é, pelo menos, os dois produtos seguintes (pelo menos, um inibidor dai redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A, por um lado, e pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesil) são administrados numa única composição que contém os mesmos, - concomitante, isto é, separadamente, cada um dos, pelo menos dois produtos seguintes (pelo menos, um. inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A, por um lado, e pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesil) a ser administrada de forma independente pela mesma, ou por diferentes vias de administração, sendo a administração destes dois produtos realizada concomitantemente ou - sucessivamente, isto é, separadamente, cada um dos, pelo menos dois produtos seguintes (pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetiiglutaril-coenzima A, por um lado, e pelo menos, um. inibidor da sintase de pirof osfato de farnesil) a ser administrada de forma independente pela mesma, ou por diferentes vias de administração, sendo a administração destes dois produtos realizadas sucessivamente, um produto após o outro, pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A, e pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesil, no tratamento de desordens cutâneas e/ou pilosas.

Assim, de acordo com este aspeto, os compostos listados acima podem ser utilizados em mistura para administração simultânea ou separada, por administração concomitante ou sucessiva.

Por exemplo, pelo menos, um inibidor da reductase de fidroximetiIglutaril-coenzima A (HMG-CoA) pode ser administrado em primeiro lugar e, pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesil pode ser administrado em segundo lugar. Em outro exemplo, pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesil pode ser administrado em primeiro lugar e, pelo menos, um. inibidor da redutase de h i droximet i 1 g 1 u t. a r i 1 - c oenz i. ma A (HMG - C o A) p o de s e r administrado em segundo lugar.

De acordo com um terceiro exemplo, pelo menos, um inibidor da sintase de pirosfato de farnesil, por um lado, e, pelo menos um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA), por outro lado, são administrados ao mesmo tempo, mas, por exemplo, por diferentes vias de administração, por exemplo, selecionado a partir de administração oral, tópica, ou por injeção).

Seja qual for a forma de realização da presente invenção, em particular, nos aspetos acima referidos,

Por exemplo, a composição utilizada na presente invenção pode ser preparado extemporaneamente ou imediatamente antes da administração, A preparação pode ser realizada, por exemplo, por meio de uma seringa ou de um sistema de bomba que permite que a mistura dos dois compostos imediatamente antes da administração ou imediatamente antes. A administração pode ser conseguida, por exemplo, por meio de uma seringa dupla e/ou uma bomba cosmética, por exemplo, por meio de uma bomba comercializada pela empresa Kemai (marca registada).

Em outras palavras, mesmo que na presente descrição, seja feita referência a uma composição, é também descrito que cada um dos compostos da composição podem ser administrados concorrentemente ou concomitantemente com outros compostos (por exemplo, numa única composição ou em ambas as composições ou três composições, cada uma das referidas composições compreendendo um ou mais dos elementos supra, o método de administração de cada composto ou composição podem ser idênticos ou diferentes), ou independentemente um do outro, por exemplo, sucessivamente, por exemplo administração independente dum inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA), a administração independente de pelo menos um inibidor da sintase de pirosfato de farnesil, estas administrações sendo realizdas no mesmo paciente, em combinação, concorrentemente ou consecutivamente, ou alternadamente, numa ordem que é a já mencionada, ou numa ou outra ordem. Estas administrações podem ser realizadas de forma independente uma da outra, ou de forma relacionada (composição ou coadministração) , com sl mesma ou diferente via de administração (injeção, ingestão, aplicação tópica, etc.}, ou várias vezes por dia, por: um ou mais dias consecutivos ou não.

Esta composição pode ser, por exemplo, para tratamento de situações patológicas, ou de outra forma, relacionadas com a acumulação e/ou a persistência de células de proteínas preniladas.

Está, também, dentro do âmbito da invenção a utilização de compostos que são inibidores da redutase de hidroximetilglutaril-eoenzima A (HMG-CoA) e da sintase de pirosfato de farnesil.

Na presente, a composição cosmética e/ou dermatológica descrita pode ser para o tratamento de situações patológicas ou não, relacionadas com a acumulação e/ou a persistência nas células de progerina; mais especificamente, o tratamento de situações relacionadas com a acumulação e/ou a persistência de células da pré-lâmina A farnesilada, que é ou não é modificada ou truncada.

Em particular, uma vez que se aceita que o envelhecimento fisiológico é, especialmente, uma consequência da presença de progerina nas células durante a vida. A progerina concentra-se, especialmente, células mesenquimais, a composição pode ser destinada a prevenir os efeitos do envelhecimento celular, particularmente da pele e/ou do endotélio vascular.

Uma composição tópica dermatológica compreendendo: pelo menos um inibidor da redutase de hidroximeti1g1utari1-coenzima A (HMG-CoA), e pelo menos um inibidor da sintase de pirosfato de farnesil, para utilização no tratamento de desordens cutâneas e/ou pilosas selecionado a partir do grupo que consiste em envelhecimento prematuro patológico da pele e/ou envelhecimento lipo-mio-cutâneo precoce patológico.

Por exemplo, a referida composição cosmética é utilizada para prevenir e/ou tratar desordens cutâneas e/ou lipodistrofia. Estas desordens da pele podem ser distúrbios patológicos que ocorrem naturalmente, ou ligados a um tratamento terapêutico. As desordens de origem natural são aqueles distúrbios associados com o envelhecimento natural, tal como, o envelhecimento cutâneo. Os distúrbios patológicos são, por exemplo, aqueles relacionados ao envelhecimento cutâneo hormonal, envelhecimento foto-induzido, envelhecimento cutâneo prematuro, envelhecimento-mio-lipo-cutâneao, lipodistrofia e dermopatia restritiva. Distúrbios associados a um tratamento são, por exemplo, os relacionados com o tratamento quimioterápico, a irradiação com raios-X, raios gama, ultravioleta, ou aqueles relacionados com os efeitos colaterais do tratamento. A Progeria é acompanhada por uma alopecia acentuada. A partir de 2 anos, as crianças atingidas perdem os seus cabelos, que se tornam escassos, brancos e sedosos. As pestanas e sobrancelhas também caem, e os pelos do corpo são raros ou completamente ausentes (ver descrição detalhada dos sintomas clínicos feitos por Hennekam R. (2006). Esta alopecia, também, é observada no modelo do rato de progeria (ratinhos deficientes para ZMPSTE24). O tratamento com uma combinação de pravastatina e zoledronato, de acordo com a presente invenção, restaura inesperadamente, pelo menos, parcialmente, a pelagem destes ratinhos . A composição cosmética e/ou dermatológica da presente invenção pode ser para o tratamento de todos os seres vivos, humano ou animal, particularmente para a prevenção dos efeitos do envelhecimento celular. Por conseguinte, a composição encontra aplicação em medicina humana, medicina veterinária, cosmética e/ou dermatologia. Permite, por exemplo, restaurar e/ou prevenir doenças de pele, fisiológicas ou não, incluindo o envelhecimento da pele e a alteração ou perda do sistema piloso.

De acordo com a invenção, qualquer inibidor da sintase do pirofosfato de farnesilo, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, podem ser utilizados na preparação da composição de acordo com a invenção.

Os sais fisiologicamente aceitáveis podem ser, por exemplo, sais formados com ácidos clorídrico, bromídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, ácidos carboxílicos, por exemplo, acético, fórmico, propiónico, benzoico, maleico, fumárico, sucínico, tartárico, cítrico, oxéLlico, glioxílico, aspártico, alcanos, sulfónicos, tais como, ácidos metano ou etano-sulfónico, arilsulfónicos, tais como, o ácido benzeno ou para-to1ueηossu1fónico.

Em particular, o inibidor da sintase de pirosfato de farnesil pode ser um membro da família dos polifosfonatos, especialmente, aminobifosfonatos (NBP), ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Os polifosfonatos são moléculas sintéticas amplamente utilizados no tratamento da osteoporose e da regeneração OS SGcí . 0 termo fosfonato aplica-se a moléculas muito semelhantes a fosfato:

0 núcleo dos bisf osf onatos (BP) é o equivalente de uma ligação P-O-P em ATP, como por exemplo, mas em que o oxigénio é substituído por carbono. Isto dá estabilidade bastante peculiar a estas moléculas.

Um. bisfosfonato simples seria equivalente a ADP, os dois grupos de fosfato (O3P) a serem substituídos pelo grupo de bisfosfonato.

0 carbono central, ao contrário do oxigénio dos fosfatos, pode, também, estar envolvido em 2 ligações, e é a natureza dos grupos enxertados no carbono que faz a especificidade dos bisfosfonatos.

Quando as cadeias "laterais" (Rl e R2) contêm uma função amina (NH) , ou mais geralmente um ou mais átomos de azoto, fala-se de amino-bisfosfonato ou NBP.

Claro, outros substituintes podem estar ligados £los oxigénios. 0 ácido pirofosfórico, ou pirofosiato em solução (IPP)

é utilizado em muitas reações metabólicas como transportador de substratos, e é devolvido no final da reação. Uma das vias metabólicas que utilizam moléculas acopladas a pirofosfato é da prenilação de proteínas, 0 enxerto dum isopentenil-PP (unidade de base em C5) para um geranil-PP (CIO) para dar farnesil-PP, numa reação catalisada pela enzima da de sintase pirosfato de farnesil (EPS), liberta um PPI, É neste passo que é especificamente inibida por NBP. A este respeito e a título de exemplo, o aminobifosfonato (inibidor da sintase de pirosfato de farnesil) pode ser selecionado a partir de - ácido alendrónico ou a sua forma iónica, alendronato; - ácido clodrónico ou a sua forma iónica, clodronato; - ácido etidrónico ou a sua forma iónica, etidronato; - ácido ibandrónico ou a sua forma iónica, ibandronato; - ácido medrónico ou a sua forma iónica, medronato; - ácido neridrónico ou a sua forma iónica, neridronato; - ácido olpadrónico ou a sua forma iónica, olpadronato; - ácido pamidrónico ou a sua forma iónica, pamidronato; - ácido risedrónico ou a sua forma iónica, risedronato; - ácido tiludrónico ou a sua forma iónica, tiludronato; - ácido zoledrónico ou a sua iónica, zoledronato; - ácido 4-N,N-dimetilaminometano difosfónico ou a sua forma iónica, dimetilaminometanodifosfonato; - α-amino (4-hidroxibenzilideno) difosfonato.

De preferência, de acordo com a invenção, é preferido o ácido zoledrónico (também designado por ácido zolendrónico) ou a sua forma iónica, zoledronato (também chamado zolendronato).

De acordo com a invenção, qualquer inibidor da redutase de HMG-CoA, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, pode ser utilizado na preparação da composição.

Em particular, o inibidor da redutase de HMG-CoA pode ser uma molécula da familia da estatina, quer lipossolúvel ou solúvel em água, ou um dos seus sais f isiologicamente aceitáveis,

As estatinas têm sido identificadas em fungos. Têm atividade inibidora da redutase de HMG-CoA, uma enzima chave na biossíntese do colesterol e dos esteroides, que catalisa a redução de glutarato de hidroximetil acoplado à coenzima A para ácido mevalónico (mevalonato em solução). Esta inibição é assegurada pela sua analogia estrutural com o esqueleto do hidroximetilglutarato. A via metabólica envolvida é reconhecidamente a da biossíntese do colesterol, mas é, também, a síntese de grupos prenilados, ods polímeros da unidade de base de isopreno de 5 carbonos, usado para alterar cerca de 300 proteínas em células e uni-las a uma cauda lipofílica, permitindo, nomeadamente, sl susl ancoragem nas membranas,

Os principais poliprenos, todos a partir de piruvato e de HMG-CoA, são geranilo (CIO), farnesil (C15), e geranil-geranil (C20).

Todas as estatinas são, globalmente, hepatoseletivas, mas não têm todas o mesmo modo de entrada nas células. Com efeito, a pravastatina e a rosuvastatina são ambas hidrofílicas, portanto, solúveis em água, ao contrário de todos as outras que são lipofílicas, portanto, podem difundir-se livremente através das membranas plásmicas (bicamadas lipídicas), o que explica, sem dúvida, a sua maior toxicidade. As estatinas solúveis em água precisam de um transportador específico para entrar na célula, transportador aniónico orgânico 3, ou OAT3, ou SLC22A8 (Takedaa et ai 2004) . São amplamente utilizados para o tratamento da hipercolesterolemia, e os seus efeitos secundários, raros, estão bem caracterizados. Estes incluem casos de rabdomiólise (1-7% de acordo com a molécula usada, Evans et ai 2002), donde o prenúncio, dores musculares no paciente tratado, provoca a cessação imediata do tratamento. A este respeito, e a título de exemplo, uma estatina pode ser selecionada a partir de atorvastatina, simvastatina, pravastatina, rivastatina, mevastatina (ou compactina), fluindostatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, cerivastatina pentostatina, rosuvastatina, lovastatina, pitavastatina, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis. A lovastatina, pravastatina e simvastatina são moléculas de derivados de metabolitos de fungos, enquanto outras (atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, pitavastatina e rosuvastatina) são totalmente sintéticas. De preferência, de acordo com a invenção, é utilizado pravastatina, uma estatina seminatural, solúvel em água.

Claro que é possível, de acordo com a invenção, a utilização de um ou mesmo dois ou mais inibidores da sintade de pirofosfato de farnesilo associados com um ou mesmo dois ou mais inibidores da redutase de HMG-CoA. É descrita a composição para o tratamento de situações patológicas, que requerem, a inibição da prenilação de proteínas. Estas doenças podem ser marcadas ou não, por exemplo, a síndrome de Costello, de Noonan, a síndrome de cardio-fasciocutânea, ou doenças associadas com a prenilação anormal ou persistente de Ras e proteínas de transdução de sinal.

Na presente invenção, é descrita a composição destinada ao tratamento de condições patológicas, ou não, com sinais de envelhecimento, de ocorrência natural, prematura ou acelerada, especialmente, em casos de sinais de deterioração do endotélio vascular (proteção do endotélio vascular), envelhecimento da pele, perda de pelos e/ou do cabelo, e a destruição óssea.

Na presente descrição, é descrita a composição dermatológica e/ou cosmética destinada ao tratamento da progéria (HGPS, síndrome da progéria de Hutchinson-Gilford) e da dermopatia restritiva (DR ou RD).

De acordo com a invenção, o inibidor da sintase do pirofosfato de farnesilo e inibidores da redutase de HMG-

CoA estão, de um modo preferido, presentes na composição em doses fisiologicamente eficazes.

Em geral, as doses a serem administradas podem ser adaptadas dependendo do paciente, da patologia, do modo de administração, etc. Entende-se que podem ser realizadas administrações repetidas, possivelmente em combinação com outros ingredientes ativos ou em qualquer veiculo.

Em geral, a dose diária dos inibidores é a dose minima para atingir o efeito terapêutico desejado.

De acordo com a invenção, o inibidor da redutase da hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) e da sintase de pirofosfato de farnesilo, podem ser utilizados na composição, em mistura com um ou mais excipientes ou veículos inertes, ou seja, fisiologicamente inativos e não tóxicos. Pode-se citar, por exemplo, os ingredientes normalmente utilizados em preparações cosméticas ou dermatológicas. A composição cosmética e/ou dermatológica da presente invenção compreende pelo menos um produto cosmético e/ou dermatológico na composição. Por "produto cosmético e/ou dermatológico" entende-se qualquer produto que permite estabelecer, com os referidos dois inibidores, uma composição para uso cosmético e/ou dermatológico, isto é, uma composição que pode ser aplicada na pele, ou para o tratamento da pele, do ponto de vista cosmético e/ou de rma t o1ó g i c o.

No mínimo, o produto cosmético e/ou dermatológico é aquele que permite pôr em de suspensão ou solubilizar ambos os inibidores, de modo a aplicar-se na pele. Por exemplo, neste caso, pode ser um álcool, água, um tampão, solução salina, uma solução isotónica, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.

De preferência, é claro, o produto cosmético e/ou dermatológico é fisiologicamente aceitável, em particular para aplicação tópica. 0 produto cosmético e/ou dermatológico, usado na composição da presente invenção, também podem compreender ou consistir em qualquer composto ou mistura de compostos utilizados correntemente nas composições cosméticas e/ou dermatológicas.

Pode ser, por exemplo, um ou mais dos compostos selecionados do grupo que compreende agentes tensioativos, agentes espessantes, agentes gelificantes, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, perfumes, silicones, agentes quelantes, antioxidantes, corantes, cosméticos, agentes fungicidas, agentes antibacterianos, agentes de formação de película, agentes estabilizant.es, agentes tamponantes, filtros UV, ligantes, estabilizadores de emulsão. 0 termo "agente emulsionante" entende-se qualquer composto que pode promover as misturas de líquidos imiscíveis. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o aLgente emulsionante pode ser selecionado a partir do grupo que compreende substâncias catiónicas, aniónicas, por exemplo, ácidos gordos e glicóis, tais como, butileno glicol, propileno glicol, polietileno glicol, poliglucósidos, esteróis vegetais, álcoois esteáricos, behenet 25, álcool cetearilo.

Por "conservador" entende-se qualquer composto para inibir o crescimento de microrganismos numa composição cosmética e/ou dermatológica. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Este pode ser, por exemplo, um fungicida e/ou um agente antibacteriano.

Por "agente fungicida" entende-se qualquer composto capaz de reduzir e/ou inibir o crescimento de fungos numa composição cosmética e/ou dermatológica.

Por "agente antibacteriano" entende-se qualquer composto capaz de reduzir ou inibir o crescimento de bactérias numa composição cosmética e/ou dermatológico. Por exemplo, o conservante pode ser selecionado a partir do grupo que compreende os parabenos, por exemplo, butilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, isobutilparabeno, metilparabeno, ácidos orgânicos, diazolidiinas, isotiazolinonas, álcoois fenólicos, hidroximetilglicinatos, 5-bromo-5-nitro-l, 3 dioxano, diazolidinil ureia, 31 -desmetoxi-30-demetilmatairesinol (DMDM) hidantoina.

Por exemplo, o silicone pocle ser selecionado a partir do grupo constituído por dimeticonas, dimeticolóis, feniltrimeticonas, óleos de silicones voláteis e não voláteis.

Por "agente quelante" entende-se qualquer composto que forma complexos com os iões metálicos que alteram a estabilidade e/ou a viscosidade duma composição cosmética e/ou dermatológica. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o agente quelante pode ser selecionado a partir do grupo que compreende ácido n i t r o1o a céti c o, á c i do po1i aminocarboxí1i c o, á c i do etilenodiaminotetracético (EDTA) e os seus sais.

Por "agente espessante" entende-se qualquer composto capaz de aumentar a viscosidade duma composição cosmética e/ou dermatológica. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o espessante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em polímeros naturais, íslís como, o ácido algínico e seus derivados, celulose e seus derivados, escíeroglucanos, goma xantana, goma-arábica, polímeros e copolímeros sintéticos, carboxivinilo, que também podem ter uma função de emulsionante, por exemplo acrilato, metacrilato, acrilamida e suas misturas, por exemplo, o copolímero de acrilato/acrilato de alquilo CIO-30, polimetilmetacrilato.

Por "agente de humedecimento", entende-se um composto capaz de manter e/ou reter a humidade numa composição cosmética e/ou dermatológica. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o humectante pode ser selecionado a partir de butileno glicol, propileno glicol, polietileno glicol.

Por "antioxidante" entende-se qualquer composto capaz de inibir as reações de oxidação por oxigénio e o ranço. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o antioxidante pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de sulfito, aminoácidos, por exemplo, glicina, histidina, tirosina, triptofano e seus derivados, imidazoles, péptidos, por exemplo D-carnosina, L-carnosina.

Por "tensioativo" entende-se um composto que pode reduzir a tensão da superfície da composição e promover: uma distribuição uniforme dos compostos duma composição cosmética e/ou dermatológica. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o tensioativo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em betaina de cetilo, betaína cocamidopropil, c o c o a n f o d i a c etato d i s s ó d i c o, laureth s u1f ossucci nato, hexileno-glicol, laureth-3, laureth-4, polietileno glicol (PEG) PEG-30, cocoato de glicerilo, PEG-40, óleo de rícino hidrogenado, PEG-7, cocoato de glicerilo, polissorbato 20, polissorbato 80, fosfato cetílico de potássio, sulfato de sódio cetearílico, lauril sulfato de química de sódio, lauril sulfato de sódio, palmitato de sódio (hexadecanoato de sódio), estereato-100, estearet.o-2, esteareto-21.

Por "agente absorvente" entende-se um composto que absorve as substâncias solúveis em água e/ou lipossolúveis dissolvidas ou dispersas. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o agente absorvente pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de nitreto de boro, sílica, carbonato de magnésio, celulose microcristalina, sílica (dióxido de silício), talco (E553) .

Por "agente de formação de película" entende-se um composto que permite a formação de uma película contínua aquando da aplicação duma composição cosmética e/ou dermatológica. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o agente formador de película pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de copolímero de acrilato de acrilamida/amónio, acrilamidas, copolímero de cloreto de acrilamido-propil-trimónio/copolímero de acrilatos, acrilatos de acrilatos/Cl0-30 alquil acrilato, cera de abelhas brancas (E901), guar tétragonolubus (guar), celulose de hidroxietilo, tereftalato de polietileno (PET), poliglicerilo, poliquatérnio-10, poliquatérnio-11, poliquatérnio-7, copolímero de polivinilpirrolidona (PVP)/ copolímero de eicoseno, copolímero de PVP/hexadeceno, PVP/ acetato de vinilo (VA). O termo "estabilizador" significa um composto que melhora a estabilidade duma composição cosmética e/ou dermatológica e/ou melhora a estabilidade dos componentes incluídos na referida composição. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o agente estabilizante pode ser selecionado a partir do grupo que compreende hidroxietilcelulose, celulose microcristalina, policaprolactona, estanato de sódio. 0 termo "agente tampão" significa um composto que estabiliza o pH duma composição cosmética e/ou dermatológico. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o agente tamponante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em aminometilo propanol, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido ortofosfórico, ácido sebácico (ácido decanedióico), citrato de sódio, hidróxido de sódio, ácido tartárico, pirofosfato de tetrassódio, trietilamina (TEA). 0 termo "filtro UV" significa um composto usado para filtrar alguns raios UV. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o filtro de UV pode ser selecionado de entre o grupo consistindo de benzofenona-3 (oxibenzona), benzofenona-4 (sulisobenzona), avobenzona, etilhexilmetoxicinamato, metoxicinamato de octilo, salicilato de etilhexilo

Por "hidratante" entende-se um composto para aumentar o teor de água duma composição cosmética e/ou dermatológica. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o hidratante pode ser selecionado a partir do grupo que compreende Aloé (Aloe vera), extrato de planta de ananás, dimeticonol, Echinacea angustifolia, glicina, extrato de alcaçuz, extrato de jasmim, ésteres de jojoba, estearato de magnésio, manitol, mel, óleo de rícino.

Por "ligante" entende-se um composto para aumentar a coesão de uma composição cosmética. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o ligante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em copolímeros de acrilato, tétragonolubus de guar (guar), hidroxietil celulose, miristato de isopropilo, carbonato de magnésio, manitol, polietileno-glicol-90M, polideceno, copolimero PVP/copolímero eicoseno, copolímero PVP/hexadeceno, copolimero de PVPNA, copolimero de acrilatos de sódio, carboximetilcelulose de sódio, betaglucano, dextrano de carboximetil de sódio, cera de parafina, goma de xantano.

Por "agente estabilizador da emulsão" entende-se um composto para melhorar a emulsificação duma composição cosmética e/ou dermatológico e/ou melhorar a estabilidade de uma emulsão cosmética e/ou dermatológica. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o estabilizador de emulsão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em estearato de glicol acetilado, carbómero, álcool de cetearilo, guar tétragonolubus, hidroxietilcelulose, celulose microcristalina, PEG-90M, copolimero de PVPNA, dextrano de carboximetil de sódio, ácido esteárico, octadecanol, cera da síntese de parafina sintética, goma de xantano.

Por "perfume" entende-se um composto que pode dar a uma composição cosmética e/ou dermatológico um odor particular. Estes compostos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, a fragrância pode ser qualquer perfume apropriado para a aplicação cosmética e/ou dermatológica. 0 perfume pode ser selecionado, por exemplo, de entre o grupo que compreende extratos naturais de plantas, espécies de plantas, por exemplo, extratos e/ou essências de rosas, camomila, menta. 0, ou os, compostos utilizados para formar o produto cosmético e/ou dermatológico dependem, nomeadamente, da formulação selecionada para a composição cosmética e/ou dermatológica da presente invenção. A composição cosmética e/ou dermatológica pode estar em qualquer forma adequada para utilização. Isto pode ser por exemplo uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma microemulsão, uma pasta. Isto pode ser por exemplo um gel, um creme, um aerossol, uma pomada, uma espuma, um pó, um óleo, comprimidos, supositórios, drageias, cápsulas, etc., possivelmente, por meio de formas galénicas ou dispositivos proporcionando uma libertação prolongada e/ou retardada. Para este tipo de formulação é vantajoso usar um agente tal como a celulose, carbonatos ou amido. A composição cosmética e/ou dermatológica da invenção pode também, compreender água. Neste caso, de um modo preferido, a composição compreende água desionizada ou destilada. A composição pode ainda compreender pelo menos um outro ingrediente ativo, particularmente um. outro ingrediente terapeuticamente e/ou cosmeticamente e/ou dermatoiogicamente ativo, por exemplo para utilização simultânea, separada ou escalonada no tempo de acordo com sl formulação farmacêutica usada. A composição pode ainda compreender um meio para facilitar a sua penetração na pele. Por exemplo, um composto selecionado a partir do grupo constituído por vasodilatadores, glucocorticoides. Isto é de interesse quando a composição da presente invenção se destina a aplicação tópica. A composição da presente invenção pode ser utilizada por qualquer meio adequado conhecido dos peritos na técnica. Por exemplo, na aplicação tópica, transdérmica ou transcutânea, ou a composição pode ser administrada por via oral. Também pode ser usada num penso transdérmico. Pode ser aplicado sobre a pele por meio de uma pulverização ou por imersão.

Para os fins da composição, pode-se também utilizar um meio físico para aumentar a penetração da composição na pele, por exemplo, uma película de plástico depositado ou envolvendo a pele após aplicação da composição.

De acordo com a invenção, na composição cosmética e/ou dermatológica da invenção, a proporção do inibidor da sintase de pirosfato de farnesil para o inibidor da redutase de hidroximetil glutaril coenzima A, ou um seu sal fisiologicamente aceitável, pode situar-se entre 0,002 e 50, de preferência entre 0,005 e 25, de preferência entre 0,01 e 1,8, de preferência 0,05 a 0,35.

Na composição cosmética e/ou dermatológica da invenção, a quantidade de inibidor da sintase de pirosfato de farnesil pode situar-se entre 0,001 para 0,500 por cento, em peso, de preferência 0,005 para 0,025, de preferência de 0,025 para 0,1, de preferência 0,100 para 0,150, de preferência 0,150 para 0,200, de preferência 0,200 para 0,250, de preferência 0,250 para 0,300, de preferência 0,300 paLra 0,350, de preferência 0,350 para 0,400, de preferência 0,400 para 0,45 0, de preferência cie 0,4 50 para 0,50 0 por cento, em peso, da composição cosmética e/ou dermatológica.

Na composição cosmética e/ou dermatológica da invenção, a quantidade da reductase de hidroximetilglutaril coenzima A. pode ser entre 0,010 para 0,500 por cento em. peso, de preferência 0,075 para 0,095, de preferência 0,095 para 0,100, de preferência 0,100 para 0,150, de preferência 0,150 para 0,2 00, de preferência 0,200 para 0,250, cie preferência 0,250 para 0,300, de preferência 0,300 para 0,350, de preferência 0,350 para 0,400, de preferência 0,400 para 0,45 0, de preferência de 0,450 psLra 0, 50 0 por cento, em peso, da composição cosmética e/ou dermatológica.

Na composição cosmética e/ou dermatológica da invenção, a soma da quantidade da redutase de hidroximetilglutaril coenzima A e a quantidade de inibidor da sintase de pirosfato de farnesil pode ser entre 0,010 e 1,000, de preferência a partir de 0,1 a 0, 800 por cento em peso da composição, de preferência, a quantidade é igual a 0,1, por cento em peso.

Outras vantagens também podem ocorrer aos peritos na técnica após a leitura dos exemplos abaixo, dados a titulo de ilustração e mostrados nas figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra os resultados obtidos no Western Blot nos fibroblastos de controlo "normais" tratados com doses crescentes de uma estatina solúvel em água (pravastatina P, 20 a 100 μΜ), e um aminobifosfonato (NBP zoledronato Z, 20-100 μΜ) ((Faixas A a I, respetivamente, P20/Z20, P20/Z60, P20/Z100, P60/Z20, P60/Z60, P60/Z100, P100/Z20, P100/Z60, P100/Z100)). A faixa J é um controlo positivo da presença da pré-lâmina A (fibroblastos de pacientes DR), a faixa K é o controlo negativo, tratado apenas com o solvente (PBS). A Figura 2 ilustra os resultados obtidos com as doses eficazes de cada produto. A Figura 3 mostra o efeito superior obtida com a administração de dois produtos conjuntamente. A Figura 4 mostra a ação da associação de dois produtos nas células envelhecidas. A Figura 5 ilustra a proliferação celular de fibroblastos, medindo o Índice mitótico com base nas condições de cultura de células. 0 Índice mitótico é a razão entre o número de núcleos corados (entrados em divisão) em relação ao número total de núcleos do campo observados dependendo de cada tratamento.

Figura 6 : Western blot mostrando que o bloqueio da prenilação da pré-lâmina A requer tanto a inibição da transferase de farnesil e a transferase geranil-geranil do tipo I. Deteção da lâmina A/C em células HeLa tratadas por inibidores de transferase farnesil e/ou transferase de geranil-geranilo tipo I. LA = lâmina A, LC = lâmina C, Pre = pré-lâmina A.

Figura 7: Lâmina A (células de controlo) e pré-lâmina A (células de ratinho ZMPSTE24~/ foram analisadas por espectrometria de massa (MALDI-TOF). a, b: porções do espectro correspondentes a péptidos trípticos farnelisados (a) e geranil-geranilados (b).

Figura 8: Análise de espectrometria de massa de proteínas extraídas a partir do envelope nuclear das células não tratadas (a) , células de pacientes com progeria tratados com FTI (2,5 μΜ, b) ou tratSLdos com a mistura de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada, c).

Figura 9: Análise por espectrometria de massa de proteínas extraídas a partir do envelope nuclear dos fibroblastos não tratados (a) ou tratados com a mistura de pravastatina + zoledronato (1 uM cada, b) a partir de ratinhos ZMPSTE24 ~/~

Figura 10: Representações de resultados das diferentes experiências que demonstram o efeito sinérgico da combinação de pravastatina + zoledronato na acumulação de pré-lâmina A em células de controlo e pacientes com progeria: (a) deteção imunocitoquímica da lâmina Ά/C e pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais, não tratSLdos, tratados com pravastatina e/ou zoledronato. (b) deteção imunocitoquímica da lâmina A/C e pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais e pacientes com progeria tratados com combinação de pravastatina + zoledronato. (c) análise quantitativa do efeito do tratamento de pravastatina + zoledronato sobre a morfologia nuclear de células do paciente com. progeria, (d) análise quantitativa do efeito do tratamento de pravastatina + zoledronato sobre a morfologia nuclear de células do pacientecom progeria na presença de farnesol, geranilgeraniol ou ambos os compostos. Barras de erro = média ± erro padrão da média. Escala da barra = 10 um.

Figura 11: Representação dos resultados do tratamento com pravastatina + zoledronato que mostram a correção da morfologia nuclear e indução de uma deslocalização parcial das isoformas da lâmina A/C e lâmina Bl da lâmina nuclear no nucleoplasma, em células de pacientes com progeria, (a), imunofluorescência e microscopia confocal. As imagens a a c de cada painel são projeções da intensidade média de 27 imagens na pilha e mostram os túbulos do retículo nuclear marcados pela calreticulina nas células de progeria incubadas com PBS. Imagens dal: seções confocais isolados de 0,2 ym de espessura. Efeito do tratamento pravastatina + zoledronato {g) e (h) . (b) Co-localizaçâo da lâmina Bl e da calreticulina. Barra de escala ~ 5 um.

Figura 12: Representação do efeito da pravastatina e zoledronato, associado ou não, na morfologia nuclear de células de ratinho ZMPSTE24~/~ (a) e ratinhos de controlo (b) , em cultura na presença de farnesol, geranilgeraniol ou ambas as moléculas.

Figura 13: Efeito do tratamento de pravastatina + zoledronato nas anomalias de reparação de ruturas dos filamentos duplos (DSB) do ADN nas células de pacientes com progeria. Imunodeteção dos focos de historia Η2ΆΧ fosforilada detetados 24 h após a irradiação, focos correspondente às quebras de cadeia dupla não reparados (imagens acima). Coloração nuclear DAPI (imagem inferior). Curvas de fundo: evolução do número de focos de H2AX fosforilada em função da historia de tempo após a irradiação em células de controlo (quadrado sólido) e as células de progeria (circulo vazio) incubadas com PBS ou tratadas com pravastatina + zoledronato. Cada curva representa a média ± erro padrão da média de pelo menos 3 experiências.

Figura 14: Efeito do tratamento de pravastatina + zoledronato no fenótipo do rato progeróide ZMPSTE24~ !~ (a) fotografias representativas de ratos com 3 meses ZMPSTE24 +/+, ZMPSTE24 e Zmpste2 4 tratados com a combinação de pravastatina + zoledronato. . Escala da barra = 1 cm (b) Peso de ratos com 3 meses ZMPSTE24 τ/τ {n = 12), ZMPSTE24 _/_ (n = 13) e ZMPS TE 2 4 tratados (n 15) (c) Curvas de Kaplan-Meier que mostram um aumento significativo na duração da vida do rato ZMPSTE24 -/" tratado, (d) Representação tridimensional por tomografia computadorizada da tíbia do rato ZMPSTE24 tratado e não tratado (em cima) . 0 psLÍnel inferior mostra o volume relativo do osso e do numero de trabéculas ósseas, em ratinhos ZMPSTE24~'~ não tratados e tratados, (e) Quantificação de alterações nucleares dos hepatócitos de rato ZMPSTE24 i/ +, ZMPSTE24 ~f~ e ZMPSTE24 tratados. As setas brancas mostram os núcleos anormais. Escala da barra = 10 ym. (f) expressão relativa de genes alvo da p53 no coração e no fígado do rato ZMPSTE24 +/+, ZMPSTE24 _/“ e ZMPSTE24 ~f~ tratados, analisados por RT-PCR quantitativo. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001. As barras de erro representam a média ± erro padrão da média.

Figura 15: Efeito da pravastatina por si só ou do zoledronato no tempo de vida de ratinhos ZMPSTE24+/+: Curvas de Kaplan-Meier pravastatina sozinha (a) e zoledronato sozinho (b) em ratinhos ZMPSTE24 tratados (diamante vazio} e não tratados (círculos fechados) .

Figura 16: Efeito do tratamento de pravastatina + zoledronato no tempo de vida do rato LMNA "'J": curvas de Kaplan-Meier do rato LMNA tratado com pravastatina + zoledronato (n = 12, diamante vazio), em comparação com que de ratos não tratados (círculos a cheio, n = 11).

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Efeito sinérgico da combinação de vim inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e vim inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo em culturas de células normais e progeróides ♦ Células e cultura de células

As linhas de células são ou fibroblastos de controlo AG16409 do Instituto Coriell, ou fibroblastos derivadas de biópsias de pacientes com dermopatia restritiva. São cultivadas a 37°C sob 5% de CO2, em sala P2. O meio de cultura completo habitual é - RPMI (Invitrogen) suplementado com - Soro fetal de vitelo a 20% (Invitrogen) - 200 mM de L-glutamina (Invitrogen)

Mistura de Penicilina/Estreptomicina/Fungizona 1 X (reserva 100 X, Cambrex) ♦ Colheita de células A colheita de células é realizada por tripsinização como se segue (protocolo para um balão grande, 75 cm2, BD Falcon): - O meio é aspirado; - As células são lavadas com 10 ml de PBS IX (Invitrogen) , 10 mL ; - Foram adicionados 5 ml de uma solução de tripsina/EDTA IX (Cambrex) - O balão é incubado durante cerca de 6 minutos a 37°C, até as células se tornarem destacadas; - A tripsina foi inibida por diluição em 15 ml de meio completo; - As células são sedimentadas por centrifugação 10 min a 10 0 0 rpm a 16 ° C; - O sedimento foi ressuspenso em 2 ml de PBS IX, e re-centrifugado sob as mesmas condições; - Ou as células são congeladas para utilização posterior, ou são transplantadas a partir deste sedimento lavado. ♦ Tratamentos A solução de pravastatina (estatina solúvel em água) usada é preparada como se segue: 40 mg de pravastatina (Sigma Aldrich, P4498) foram tomados em água esterilizada para formar uma solução de reserva de 10 mM.

As concentrações finais testadas foram de 500 nM, 1, 5, 50 e 100 μΜ, obtidas por diluição da solução de reserva em meio completo. A solução de zoledronato (NBP) utilizada é preparada da seguinte forma: - Uma solução de reserva de ácido (l-hidroxi-2-imidazol-l-il-l-fosfono-acetato)fosfónico (0,8 mg/ml, Novartis) é ajustada a uma concentração de 2 mM.

As concentrações finais testadas foram de 500 nM, 1, 5, 50 e 100 uM, obtidas por diluição da solução de reserva em meio completo. ♦ Western blot A. 4.1 Preparação de Células

Para uma experiência de Western blot, as células são tratadas como se segue: - Aproximadamente 7,5 x 105 células são semeadas num balão grande e cultivadas nas condições acima quase até confluência (4 dias).

Após 4 dias, as células foram lavadas com PBS IX, e recuperados em meio completo suplementado com o tratamento.

As células são incubadas durante o tempo de processamento (6 a 72 horas, sequencialmente ou simultaneamente) na incubadora a 37°C.

No final do tratamento, as células foram tratadas com tripsina (protocolo acima) e o sedimento resultante armazenado a -80°C até à extração da proteína. A.4.2 Extração de proteínas por Western blot 0 sedimento de células foi recolhido em 300 μΐ de tampão de lise

Triton X100 1% SDS 0,1% O desoxicolato de sódio 0,5%

NaCl 50 mM

EDTA 1 mM

Tris.HCl pH 7,4 20 mM

Inibidor de protease 1 comprimido por 50 ml (Roche 11697498001)

Extemporaneamente, acrescenta-se

Ortovanadato de sódio 1 mM PMSF 1 mM

As células são expostas a ultrassons duas vezes por 30 seg (Brandson Sonifier Cell Disruptor B15) .

Os detritos celulares foram centrifugados durante 10 min a 10 000 rpm a 4°C. O sobrenadante de proteína foi armazenado a -80°C até à sua utilização. A dosagem das proteínas é realizada no descongelamento. A.4.3 Western blot Gel

Um gel de acrilamida a 8% é convencionalmente utilizado para detetar várias formas de lâminas A/C.

Acrilamida/bisacrilamida 37/1 8 %

TrisHCl pH 8,8 375 mM SDS 0,1 % APS 0,1 % TEMED 0,01%

Um gel de concentração é derramado no gel separador.

Acrilamida/bisacrilamida 37,5/1 3 %

TrisHCl pH 6,8 375 mM SDS 0,1 % APS 0,1 % TEMED 0,01% É medida a concentração de proteína da amostra, e alíquotas foram ajustadas a 50 yg por tubo em tampão de lise qs 15 yl. 5 μΐ de tampão de carga é adicionado a cada amostra SDS 4 %

TrisHCl pH 6,8 100 mM

Glicerol 20 % β-mercaptoetanol 20 %

Azul de bromofenol vestígios

As amostras são desnaturadas por aquecimento durante 5 min a 95°C e colocados nas cavidades. A migração tem lugar em 50, em seguida, 100 volts em tampão:

Tris-Base 0,3 %

Glicina 1,44% SDS 0,1 %

Transferência A membrana de transferência (Hybon P, Amersham Biosciences) foi preparada por imersão em etanol, seguido por um banho de 5 min em água estéril, e 10 minutos em tampão de transferência:

Tris-Base 12 mM Glicina 96 mM Etanol 20 % O gel é humidificado durante 20 minutos em tampão de transferência, e então a sanduíche é montada (sistema Miniprotean, Biorad). A transferência ocorre geralmente de noite num quarto frio, a 10 volts. A membrana é lavada com 1 x PBS, conservada húmida, e usada como tal para a deteção.

Deteção A membrana foi incubada 1 h à temperatura ambiente numa solução de saturação:

Caseína 10 %

Tween 2 0 0, 1 %

PBS 1 X

Foi lavada 2x 10 minutos em tampão de lavagem (0,1% Tween 20/PBS IX). O anticorpo primário é diluído no tampão de saturação (detalhes e diluição, ver abaixo imunocoloração) . A membrana foi incubada com o anticorpo primário durante 1 hora à temperatura ambiente, sob agitação.

No final, foi lavada 3x com tampão de lavagem, em seguida, lavou-se 3x 15 min com o mesmo tampão. O anticorpo secundário (sistema acoplado com peroxidase, Jackson Immunoresearch) foi diluído a l/10000e em tampão de saturação. A membrana foi incubada com esta solução 30-45 minutos à temperatura ambiente, com agitação.

No final, foi lavada 3x com tampão de lavagem, em seguida, lavou-se 3x 15 min com o mesmo tampão. A deteção é realizada com o kit ECL Plus Western Blotting System da Amersham Bioscience, de acordo com as instruções do fabricante.

Após o desenvolvimento, a membrana é exposta sobre a película Biomax MR (Kodak), o tempo necessário para obter um sinal satisfatório. A.5 Imunomarcação o Preparação de células

Uma cultura de células é tripsinizada, e as células contadas em células Neubauer.

Poços de cultura estilo Labtech (Nunc, ref. 177399) são semeados a uma taxa de 5xl04 células por poço. 0 meio de cultura completo é suplementado com o tratamento ou os tratamentos (estatina, NBP, 2), e as células em cultura durante o tempo ad hoc.

No final, o meio de cultura foi aspirado, os poços removidos.

As lâminas foram lavadas em PBS IX.

As células foram fixadas numa solução de paraformaldeído a 4% (em PBS) durante 10 minutos à temperatura ambiente. É realizada uma lavagem de 10 min em PBS IX.

As células são desidratadas por banhos sucessivos de três minutos em soluções de etanol com percentagem crescente (70, 90, 100%, sendo este último banho repetido).

Após a secagem, as lâminas são armazenadas a -80°C até à sua utilização. A.5.2 Marcação

Após a descongelação, as células são incubadas 5 min à temperatura ambiente numa câmara húmida, em 50 μΐ de uma solução de permeabilização:

PBS 1 X

Triton XI00 0,5 % RNS 5 % (Soro de coelho normal, Vetor S5000)

Inibidor de protease 1 pastilha por 50 ml (Roche 11697498001) São realizados 3 banhos de pré-incubação de 15 min cada, em 50 μΐ de solução de incubação:

PBS 1 X RNS 5 %

Inibidor de protease 1 patilha por 50 ml (Roche 11697498001) 0 anticorpo primário é diluído a 1/1006 em 50 μΐ de solução de incubação e colocado em contacto com as células durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara húmida.

Os anticorpos primários utilizados são de dois tipos:

Rato anti-lâmina A/C (lado do terminal N), clone 4A7, G. Morris (Oswestry, UK)

Cabra anti-pré-lâmina A (15 aa extremidade do terminal C) produto SC6214, Santa Cruz Biotechnology, Inc. São realizadas 3 lavagens em 50 μΐ de PBS IX durante 15 minutos cada. A incubação com o anticorpo secundário tem lugar durante 1 hora em 50 ml de solução de incubação à temperatura ambiente, numa câmara húmida. Os anticorpos secundários são de dois tipos: - Burro anti-rato, Jackson Immunoresearch, 1/100 diluição6 - Burro anti-cabra, Jackson Immunoresearch, diluição 1/2006 São realizadas 3 lavagens em 50 μΐ de PBS IX durante 10 minutos cada. A incubação com 100 μΐ de solução DAPI 50 ng/ml (Serva, Ref. 18860) é levada a cabo durante 15 min à temperatura ambiente, numa câmara húmida. São realizadas 3 lavagens em PBS IX em tabuleiros de corte durante 5 minutos cada. É realizada uma lavagem final durante 5 min numa solução de Tween 20 a 0,1% em PBS. A. 5.3 Montagem

As células são imersas numa gota de Vectashield (Vector), cobertas com uma lamela e observadas sob um microscópio de fluorescência (Leica DMR Leica Microsystems) , equipado com um sistema de câmera CoolSnap (Princeton).

B) RESULTADOS B. l) Western blotting (Figura 1)

Fibroblastos de controlo "normais" foram tratados com uma estatina solúvel em água (pravastatina P 20-100 μΜ), e com um aminobifosfonato (NBP zoledronato Z 20-100 μΜ) em combinação (Faixas A a I, respetivamente, P20/Z20, P20/Z60, P20/Z100, P60/Z20, P60/Z60, P60/Z100, P100/Z20, P100/Z60,

PlOO/ZlOO). 0 western-blot mostra o "aparecimento" de uma banda correspondente ao tamanho da pré-lâmina A imatura (não-truncada) como uma função do aumento da concentração das duas moléculas, o que confirma que é necessária a farnesilação para a maturação da lâmina A. Este resultado mostra que o bloqueio da síntese de farnesil-PP em 2 pontos do percurso é mais eficiente do que o bloqueio de um único ponto da inibição da farnesilação da pré-lâmina A, pelo menos, ex-vivo. B.2) Dose e tempo de resposta em imuno-histoquímica (Figura 2)

Foram usadas as curvas dose-resposta e tempo-resposta para determinar uma eficiência máxima por medição de dois parâmetros de controlo em células saudáveis, por um lado, e em células de pacientes HGPS. A associação pravastatina (solúvel em água)/zoledronato (NBP) é alcançada de forma mais eficaz para 1 μΜ de pravastatina durante 24 h e, em seguida, o zoledronato, durante 12 horas: em células saudáveis, não foi observada toxicidade, ao passo que em células HGPS (células com alterações nucleares), o número de núcleos "deformados" baixa de 75-40%. Ao mesmo tempo, a taxa da pré-lâmina A obtida em células saudáveis é máxima. B.3) Efeito do tratamento em imuno-histoquimica (Figura 3) A ação combinada da pravastatina e zoledronato mostra melhor eficiência, uma vez que a taxa do produto da pré-lâmina A em células saudáveis tratadas (estimada em 35%) é muito mais elevada em combinação de modo que se as moléculas são adicionadas isoladamente (respetivamente, 25 e 15%). Em vez disso, a taxa de núcleos deformados (indicando toxicidade para as células saudáveis) é mínima (inferior a 10%), menos do que em células tratadas com pravastatina por si só, por exemplo, (cerca de 12%). B.4) Ação sobre células envelhecidas em imuno-histoquímica (Figura 4)

Dependendo do número de "passagens" (número de células de transplante), e, por conseguinte, a idade das células, a percentagem de núcleos anormais aumenta, o que é uma caracteristica das células HGPS não tratadas. Se forem tratadas, esta proporção continua, e até mesmo diminui ligeiramente (menos de 40% contra 80% nas células tratadas com o placebo). Tratamento: Pravastatina 1 μΜ, durante 24, zoledronato 1 μΜ, durante 12 horas. B.5) Conclusão A combinação de pravastatina/zoledronato é eficaz em doses para as quais quase nenhum efeito é observado com compostos administrados separadamente. O efeito fisiológico de bloqueio da via de prenilação é conseguido com doses muito inferiores às usadas no tratamento único em artigos publicados em culturas de células (Kusuyama et ai 2006, 10 μΜ de pravastatina por si só, em células progenitoras vasculares; Flint et ai, 1997, 25 μΜ de pravastatina por si. só em células musculares de ratos neonatais). EXEMPLO 2: Efeito duma composição cosmética de acordo com a invenção compreendendo de vim inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e vim inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo sobre a divisão de fibroblastos humanos idosos e fibroblastos humanos jovens

A. OBJETO DO EXEMPLO

Mo presente exemplo, a avaliação do efeito in vitro de uma composição de acordo com. a invenção compreendendo um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel ou lipossolúvel e um inibidor da sintase de pirosfato de farnesil na taxa de divisão celular (índice mitótico) de fibroblastos foi medida. Uma comparação do efeito da composição em fibroblastos humanos idosos relativamente aos fibroblastos j ovens humanos foi também realizada. 0 número de ativos utilizados nesta experiência é de quatro, tendo os produtos sido utilizados em combinação dois a dois. Os ativos utilizados são:

Al: zolendronato A2: Alendronato

Bl: Pravastatina B2: Simvastatina

As combinações particulares que foram utilizados neste exemplo são as seguintes: A1B1, A1B2, A2B1, A2B2.

B. PROTOCOLO

Neste exemplo, dois lotes de fibroblastos, os fibroblastos idosos (número do lote: 9052) e jovens (número do lote: 7080) foram cultivados em meio RPMI (Invitrogen) contendo 10% de soro fetal de vitelo sem antibióticos por 24 horas após tripsinização das caixas fornecidas.

Foram adicionaidos ativos diferentes a uma concentração de 1 μΜ final a cada durante 24 horas (foi feita uma diluição a 10 0 0 de uma solução de reserva em água para os compostos Al, A2 e BI, ou em etanol a 100% para o composto B2). O indice mitótico foi avaliado por incorporação de bromo-desoxi-ur idina (BrdU) em 45 minutos depois de 24 h de incubação das células com uma das combinações de ativos. Uma revelação imuno-histoquímica permitiu revelar as células em fase de síntese do ADN (células em pré-divisão) , A coloração dos núcleos (material genético) foi realizada através da incorporação de indole diamino fenilo (DAPI). A inserção de 6 domínios microscópicos (Olympus IX 70) permitiu a medida do indice mitótico por análise de imagem (Olympus AnalySIS). O índice mitótico é a razão entre o número de núcleos que incorporaram BrdU e o número de núcleos com DAPI incorporado. Ura índice médio é calculado estatisticamente, com um desvio-padrão (DP) de 0,005 para 0,061.

Um teste de Student bilateral foi utilizado para medir a significância estatística dos resultados.

C. RESULTADOS

Cj Ακe λ wya λ 2 λ ·ϊ7ΐ on a 1 moivs 1 π 2 ο ΛάΙ I1! 1 st cs 9 ^te 9 Λ9^ 2^ dte V* €te ^ακ* ^5β^αί \τ ^te te? ^#4<C™ ^te yj te5 te €3b ^te tete^te teS te^'Ste ^te v& ate €te

Estes resultados mostram uma muito baixa capacidade de divisão de fibroblastos envelhecidos, sem qualquer tratamento prévio para o estudo.

Os fibroblastos jovens apresentaram maior capacidade de divisão do que os fibroblastos envelhecidos. A capacidade de divisão dos fibroblastos envelhecidos era inferior a 5%, enquanto a capa.cida.de de divisão dos fibroblastos jovens foi de 15,6%. A diferença na capacidade de divisão entre os fibroblastos envelhecidos não tratados e os fibroblastos jovens não tratados foi, portanto, igual a 3,

Na forma de realização deste exemplo, não foi observada toxicidade visualmente após 24 horas de incubação de fibroblastos com combinações de ativos testados.

Na forma de realização deste exemplo, nenhum efeito tóxico de etanol (0,1% final) foi observado após 24 horas de mcubaçao. D. AVALIAÇÃO DO ÍNDICE MITÓTICO (Figura 5)

Em. geral, o número de fibroblastos envelhecidos sem qualquer tratamento em fase de síntese de ADN foi extremamente baixo: menor do que 5% (ver Figura 5, Coluna t / * O índice mitótico não foi muito alto para fibroblastos jovens: cerca de 15% (ver Figura 5, Coluna 6).

Em comparação com os fibroblastos envelhecidos de controlo sem tratamento, os fibroblastos de controlo expostos ao etanol (0,1% - 24 h), não apresentam uma diferença significativa (p = 0,11, n = 6) da sua taxa mitótica. Os valores foram então combinados (controlo, n = 12).

Os resultados mostrados na Figura 5, coluna 2 mostram, sobre o índice mitótico dos fibroblastos envelhecidos um efeito ativador de AlBl = zolendronato-pravastatina versus controlo (estimulação por um fator de mais de 2) (p <0,001, n>6)

Por conseguinte, este exemplo mostra que a aplicação da combinação zolendronato-Pravastatina tem um. efeito ativador na divisão celular de fibroblastos envelhecidos. EXEMPLO 3: Efeito de unta combinação de um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-eoenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo num modelo de ratinho possuindo uma sindrome progeróide

Os ratos KO ZMPSTE24_/“ utilizados são aqueles descritos no artigo citado de Varela et al 2 0 05. (49) . Uma prova da eficácia da combinação de duas moléculas (pravastatina e zoledronato) foi feita em colaboração com. um laboratório espanhol (Pr C. Lopez Otin) . A eficácia é obtida em doses combinadas que não têm efeito quando os produtos são utilizados separadamente, mostrando um efeito sinérgico.

As duas moléculas (ácido zoledrónico (Zoraeta (marca registada)) de 100 mg/kg/dia e a pravastatina de 100 mg/kg/dia) foram diluídas em PBS IX e injetadas por via intraperitoneal diariamente, em ratinhos com 1 mês e até a morte. Os controlos são de ratos selvagens da mesma ninhada tratados unicamente IX com PBS. A sobrevivência dos ratinhos tratados foi muito melhorada, é máxima, particularmente, para as fêmeas, com um aumento no tempo de vida médio de cerca de 80%. Os sintomas clínicos da doença são grandemente reduzidos em comparação com os indivíduos tratados apenas com PBS. Em particular, observou-se um efeito do tratamento sobre a pele e novo crescimento de pelo destes ratos em comparação com os ratinhos tratados com PBS, que mostraram grandes áreas calvas.

Exemplo 4: composições cosméticas de acordo com a invenção compreendendo um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo

Composição 4

Exemplo 5: Testes de irritação cutânea em pele reconstituída de composições cosméticas de acordo com a invenção compreendendo um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo

No presente exemplo, composições cosméticas que compreendem um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) (uma estatina: a pravastatina) e um inibidor da sintase de pirosfato de farnesil, o ácido alendrónico ou o ácido zolendrónico são aplicados à epiderme humana reconstruída in vitro, 0 tamanho da derme é de 0,5 cm2, Diferentes quantidades da composição cosmética são aplicadas, de entre 30 a 50 mg. A viabilidade celular é determinada por um teste de "MMT". O teste de "MMT" é um ensaio colorimétrico baseado na quantificação das desidrogenases mitocondriais, enzimas assinalando a viabilidade celular. Este teste é realizado em duas épocas de aplicação diferentes: 24 e 72 horas.

Controlos positivos utilizando dodecilsulfato de sódio (SDS) e controlos negativos, também são realizados. EXEMPLO 6: Testes de irritação ocular aguda de composições cosméticas de acordo com a invenção compreendendo um iam inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo

Neste exemplo, os ensaios são realizados de acordo com "boas práticas de laboratório", em conformidade com os requisitos regulamentares, o Decreto de 10/08/04 e com o artigo L5131-5 do Código de Saúde Pública. A avaliação da citotoxicidade é levada a cabo pela técnica de mistura de vermelho neutro na linha SIRC de células da córnea. EXEMPLO 7: Efeitos da combinação de um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-eoenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo em extratos ex-vivo de pele humana. A. Protocolo

Neste exemplo, os testes são realizados com uma pele de um dador com cerca de 60 anos. A preparação de 21 explant.es de pele humana é realizada e sobrevivência em meio EM (explantes meio de BIO-CE).

Os explantes são divididos em três lotes de seis explantes e um lote de controlo TO de 3 explantes, como segue: TO Testemunha Plastie: 3 explantes T Controlo não tratado: 6 explantes R Controlo Positivo: 6 explantes P explantes tratados com a composição da invenção: 6 explantes A.l. Tratamento 0 tratamento é realizado em dias diferentes, no primeiro dia (dia 0), 2 horas após a preparação dos explantes e no D + 1 dia, D + 2 dias, D + 4 dias, D + 6 dias, D + 8 dias e D + 10 dias.

Os produtos são aplicados sobre os explantes como se segue: T: explantes não recebem tratamento, A: explantes recebem pelo DO, D + 2 e D + 4, 1 mg do controlo positivo (creme de retinol) PI: os explantes recebem cada um e a cada tempo de tratamento de 2mg do produto P, O tratamento é realizado por aplicação tópica da composição da invenção. A composição é então espalhada sobre toda a superfície do explante, usando uma espátula. Metade do meio de cultura é renovado a cada dois dias e os explantes são postos em sobrevivência a 37°C, numa atmosfera húmida enriquecida com 5% de CCç. A.2. Amostragem para histologia

Ao DO, os 3 explantes do lote TO são tomados.

Ao D + 6 dias e ao D + 11 dias, 3 explantes foram tomados a partir de cada lote. As amostras são cortadas em duas partes, uma metade é fixada em formalina e a outra metade foi congelada a -80°C, seguindo o procedimento BIO-CE "P006-PPEH". B. Estudo histológico

Após 24 horas de fixação em formaline, as amostras foram secas, impregnadas e revestidas em parafina. Secções de 5 um foram, realizadas para observação morfológica. B.l. Passo um: estudo morfológico O estudo morfológico de estruturas epidérmicas e dérmicas é realizado em cortes corados com tricrómico de Masson, variante Goldner. B.2. Passo dois: B.2.1 Imunomarcação de Ki67: A marcação das células mitóticas é realizada em cortes congelados com anticorpos policlonsLÍs anti-KI 67 (Novo Castra) revelados em DAB, As células positivas são contadas ao longo de todo o comprimento e a epiderme média reduziu o número de células marcadas por cm. B.2.2 Imunomarcação de colagénio I:

A imunomarcação de colagénio I é levada a cabo em secções congeladas com anticorpo policlonal anti-colagénio I revelado por FITC. Os núcleos são contra-corados com iodeto de propidio. B.2.3 Imunomarcação cie colagénio III: A imunomarcação de colagénio III é levada a cabo em secções congeladas com anticorpo policlonal anti-colagénio III revelado em DAB. Os núcleos são contra-corados com hemalun cie Masson. B.2.4 Imunomarcação de colagénio IV: A imunomarcação de colágeno IV é realizada em cortes congelados com anticorpo policlonal anti-colagénio IV (Cliniscience) revelado por FITC. Os núcleos são contra-corados com iodeto de propídio. B.2.5 Imunomarcação de colagénio VII: A imunomarcação de colagénio VII é realizada em secções congeladas com anticorpo monoclonal anti-colagénio VII revelada em FITC. Os núcleos são contra-corados com iodeto de propídio. B.2.6 Imunomarcação de PECAMl: A visualização de células endoteliais é efetuada pela imunocoloração PECAM-1, realizada em secções congeladas com anticorpo monoclonal anti-PECAM-1 revelado em vermelho-F a s t * EXEMPLO 8: Efeito da combinação de um inibidor da redutase hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo em culturas £zi vítTQ das células que constituem a pele.

Este exemplo foi realizado com as mesmas combinações ativas como no Exemplo 2 acima. Estas combinações diferentes de ativos são utilizados in vitro para avaliar o seu efeito sobre os parâmetros fisiológicos envolvidos no envelhecimento da pele.

As combinações utilizadas no presente exemplo são AlBl, A1B2, A2B1, A2B2, respetivamente. Estas quatro combinações são testadas em várias concentrações, as experiências são feitas em triplicado (representando pelo menos 36 pontos de dados}.

As concentrações de 4 combinações são propostas pelo requerente e, portanto, não está prevista nesta fase o estudo (exceto como um controlo único) da citotoxicidade in vitro. A experiência é feita em culturas de fibroblastos tal como apresentado no Exemplo 1. Este produto também é aplicado a culturas de queratinócitos. Os parâmetros seguintes foram, examinados por quatro combinações de ativos nas concentrações indicadas. - Medição do índice mitótico.

Medição da remodelação da matriz extracelular pela contração de treliças de colagénio. - Medição da reparação do ADN genómico após a irradiação com UVB (stress fotoinduzido aproximado das condições de banhos de sol) A medição do índice mitótico é realizada após a exposição das células ao ativo durante um único tempo. 0 índice é medido através da contagem de núcleos de células de análise de imagem que tem. incorporado um análogo da. timidina fluorescente, sobre o número total de núcleos. Vários campos são analisados. As fotografias são arquivadas para iconografia. A remodelação da matriz extracelular induzida por fibroblastos expostos slos ativos é avaliada pela incorporação dessas células em treliças de colagénio e quantificam a sua capacidade de retratar essas treliças. A avaliação da superfície dá um índice de remodelação retraída. As fotografias são arquivadas para iconografia. A extensão da reparação de ADN genómico é realizada após a irradiação das células com uma dose de UV-B a imitar as condições de uma queimadura solar. Considera-se, em primeiro lugar, avaliar o efeito dos ativos durante a cinética de reparação do ADN seguida em 3 fases. A quantificação é realizada por meio de análise e deteção de imagem de dímeros de pirimidina ciclobutano induzidos pela radiação UVB, utilizando uma técnica de imuno-histoquímica.

As fotografias são arquivadas para iconografia.

Exemplo 9: tratamento com uma estatina e aminobifosfonato aumenta o tempo de vida de um rato modelo reproduzindo uma síndroma humana de envelhecimento prematuro.

Este exemplo também é publicado em. Varela et al, Nature Medicine 2008, 7, 767 (55).

Materiais e Métodos Ratos:

Foi descrita a produção cie rato Zmpsle24~'~ e LMNA (Pendas et al 2002. (38) Sullivan et al, 1999. (56)) . A

tomografia computadorizada óssea de ratinho foi realizada usando sistema de micro-CT Skyscan 1172 (SkyScan - marca comercial}). Todas as experiências em ratos obedecem às normas expedidas pela Comissão de Experimentação Animal da Universidade de Oviedo (Espanha). A pravastatina (100 mg/kg/dia) e zoledronato (100 mg/kg/dia) diluída em PBS foram administradas aos ratinhos diariamente. Os ratinhos que receberam o tratamento de pravastatina-zoledronato ou os ratinhos de controlo que receberam apenas PBS não mostram nenhum dano aparente ou stress.

Cultura celular

Os fibroblastos da derme de um indivíduo de controlo (GM00038) e pacientes com progeria e portadores da mutação G608G (AG11498 e AG01972) foram obtidos a partir do Coriell Cell Repository. Células HeLa a partir da American Type Culture Collection. As células foram cultivadas em DMEM (Gibco) suplementado com FBS a 10% (Gibco) e 1% de antibiótico-antimicótico (Gibco). Os fibroblastos provinham de caudas de ratos com idade de 12 dias (Varela et al., 2005) . A concentração e a duração do tratamento com a estatina e aminobifosfonato estão indicadas na legenda das figuras. Quando do tratamento combinado estatina + aminobifosfonato na presença de farnesol e/ou geranilgeraniol, 1 mM de pravastatina e 1 mM de zoledronato foram adicionadas ao meio de cultura com concentrações crescentes de farnesol e/ou geranil-geraniol. A percentagem de núcleos anormais é medida 48 horas após o início do tratamento.

Irauno - ci toquimi ca

Os fibroblastos são cultivados em câmaras Lab Tek (Nunc Nalgen international), lavados em PBS, depois fixados em paraformaldeido a 4% durante 15 min. As células foram desidratadas em banhos de etanol em concentrações crescentes e foram permeabilizadas 5 min a 25°C em PBS contendo Triton X-100 (0,5%), 5% de soro (cabra ou coelho). As lâminas foram pré-incubadas a 25°C em PBS durante 5 min. A diluição dos anticorpos primários foi de 1:100 para o anticorpo policlonal de cabra anti-pré-lâmina A (Sc-6214, Santa Cruz Biotechnology), 1:40 para o anticorpo anti-lâmina A/C (4A7 fornecida por G, Morris), 1:200 para o anticorpo de coelho anti-calreticulina (Stressgen) e 1:100 para o anticorpo anti-lâmina BI (Abeam) . Após lavagem em PBS, as lâminas são incubadas 1 h a 2 5 °C com anticorpo secundário diluído na solução de incubação. A diluição do anticorpo secundário é a seguinte: 1:100 de IgG de burro anti-ratinho conjugada com FITC (Jackson ImmunoResearch), 1:400 de IgG de burro anti-cabra acoplado a Alexa 488, 1:800 de IgG de burro anti-cabra acoplsLdo a Alexa 5 68 (Molecular Probes) e 1:100 de IgG de burro anti-coelho acoplado a isotiocianato de tetrametilrodamina (Sigma), As células são então lavadas, os núcleos coradas durante 15 ruin a 25°C com DAPI (100 ng/ral, Sigma-Aldrich) , e, finalmente, lavou-se 3 vezes com PBS contendo 0,5% de Tween 20, As lâminas foram montadas nas Vectashield (Vector) . .As imagens digitais são gravadas com um microscópio Leica DMR equipado com uma câmera CoolSnap ou com. um microscópio confocal Leica TCS SP5. Os núcleos são observados nas células após marcação da lâmina A/C. Mais de 100 núcleos foram anaLlisaLdos em fibroblastos de controlo para caLda tratamento. O número de núcleos de células analisados de pacientes com progeria é de 250 (passagem 8), 198 (passagem 13) e 150 (passagem 20).

Irradiação X e estudo da histona H2AX fosforilada. Células de pacientes com progeria e células de controlo 1 BR3 são irradiadas com um aparelho Philips X. O feixe de raios X é produzida por um ânodo de tungsténio sujeito a uma tensão de 2 00 kV, com uma corrente de 2 0 mA com um filtro de cobre de 0,1 mm de diâmetro. A taxa de dose é de 1,243 Gy/min. A histona fosforilada H2AX é detetada com anticorpos que reconhecem especif icamente sl serina 139 fosforilada (Upstate Biotechnology-Euromedex Mundolsneim, França), a uma diluição de 1:800 e anticorpos anti-ratinho conjugado com FITC, (1:100, Sigma-Aldrich). O número de quebras de cadeias duplas (DSB), dependendo da duração da reparação foi ajustado com a fórmula Nt = NO (1/1 4- βt) , onde α e β são parâmetros ajustáveis e Nt e NO o número de DSB no momento t e no tempo 0,

Western blot

As células foram homogeneizadas no meio seguinte: 50 mM de Tris (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 50 mM de NaF, 1 mM de ditiotreitole, 2 mg/ml de pepstatina A, na presença de inibidores de protease (cocktail inibidor completo, Roche) e inibidores de fosfatase (Cocktail inibidor da fosfatase I e II, Sigma). Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose bloqueadas com 5% de leite em pó sem gordura, utilizando tampão de TBS-T (2 0 mM de Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCl e 0,05% de Tween 20), e incubou-se durante 1 hora quer com um anticorpo anti-lâmina A/C específico (4A7, 1:500) ou um anti-lâmina A específico (C20, Santa Cruz Biotechnology, 1:250) ou um actina anti-beta (A5441, Sigma, 1:5000) . Os anticorpos são diluídos em TBS-T contendo 3% de leite em pó sem gordura. As membranas são então incubadas com um anticorpo acoplado a peroxidase (cabra anti-ratinho ou anti-coelho, Jackson ImmunoResearch) em TBS-T contendo 1,5% de leite em pó sem gordura, em seguida, lavou-se e finalmente revelou-se por quimioluminescência (substrato Immobilon Western quimioluminescent HRP, Millipore - marca registada),

Análise por espectroraetria de massa

Os fibroblastos de ratinhos de controlo e ZMPSTE24 e as células linfoblastóides de pacientes com progeria foram homogeneizados, os núcleos isolados por ultracentrifugaçâo e as proteínas nucleares obtidas como descrito em Blobel e Potter, VR. Núcleos de fígado de rato: método de isolamento que combina pureza com elevado rendimento, Science 154, 1662-1665, 1966. As proteínas da lâmina nuclear foram separadas por SDS-PAGE e as bandas contendo a lâmina A, a pré-lâmina A e a progerina foram excisadas. Os fragmentos do gel foram lavados duas vezes com 180 ml de uma mistura de bicarbonato de amónio/acetonitrilo {70:30, 25 mm), secou-se (15 min, 90 °C) e foi digerido (1 h, 60 °C) com tripsina (12 ng/mL, Promega) em 25 mM de bicarbonato de amónio. Numa experiência típica, 1 ml de CHCA (ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico, Waters) é colocado num espectrómetro de MALDI-TOF. Uma vez seco, 1 ml da solução de péptido e 1 ml da matriz (CHCA) são colocados no espectrómetro equipado com uma fonte de laser (Voyager-DE STR (marca registada) , .Applied Biosystems) . Os dados recolhidos de 200 disparos cie laser produzem espectros analisados usando o programa Data Explorer (versão 4.0.0.0, Applied Biosystems). PCR quantitativa eia teiapo real

Os níveis de expressão de genes alvo p53 (ATE'S,

Gadd45g e CDKN1A, que codificam p21) foram medidos com o PRISM 7900HT Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems).

Análise estatística A diferença entre os diferentes grupos de ratinhos e células, tratSLdos ou não, foi ansLlissLda utilizando o teste de Student. Os cálculos foram realizados utilizando o programa Microsoft Excel. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (SEM). f 3Ηλ<3

As células HeLa são cultivadas na presença de inibidores de farnesiltransferase (FTI-277, Sigma-Aldrich) e/ou transferase cie geranil-geranil tipo I (GGTI-2147, Sigma-Aldrich) com. as concentrações indicadas. Apenas a combinação de ambos os inibidores leva à acumulação nas células de uma. grande quantidade de pré-lâmina A não prenilada em relação ao efeito de cada inibidor sozinho.

Estes resultados são mostrados na Figura 6 que é uma fotografia de um Western blot que mostra a deteção obtida a partir da lâmina A/C em células HeLa, tratadas com inibidores cie farnesiltransf erase e/ou transferase de geranil-geranil tipo I. LA = lâmina A, LC = lâmina C, Pre = pré-1âmi na A.

Estes resultados confirmam que o bloqueio da prenilação da pré-lâmina A requer tanto a inibição da farnesil-transferase e da transferase de geranil-geranil tipo I de acordo com a presente invenção.

Inibidor de farnesiltransferase (FTI) induz a geranil-geranilação compensatória de progerina (em células de pacientes com progeria) e em fibroblastos de rato ZMPSTE24 ~/_ A análise por espectrometria de massa mostra como esperado a presença de péptidos trípticos da pré-lâmina A farnesilada e carboximetilada em células de ratinho ZMPSTE24 mas não em células de ratinhos de controlo. Estes resultados são mostrados na Figura 9a. 0 péptido farnesilaLdo é desprovido dos 3 resíduos SIM indicando que ZMPSTE24 não é essencial para a primeira clivagem durante a maturação da pré-lâmina A. Uma diminuição na quantidade de pré-lâmina A farnesilada é observada em células de ratinho tratados com FTI. Quando se observa a porção do espectro correspondente a péptidos geranil-geranilados, qualquer péptido derivado da pré-lâmina A poderia ser detetada em. células de ratinho ZMPSTE24 “'“não tratado. Mas um péptido cuja massa é compatível com um fragmento geranil-geranilado da pré-lâmina A é detetado após tratamento com FTI. Estes resultados são mostrados na Figura 9b.

Em células de pacientes com progeria, péptidos correspondentes à progerina farnesilada e carboximetilada são detetados na ausência de qualquer tratamento, tal como indicado na Figura 7a. 0 tratamento destas células com FTI-127 provoca o aparecimento de péptidos cuja massa corresponde à de péptidos geranil-geranilados da progerina, como pode ser visto na Figura 7b.

Este conjunto de dados mostra que a progerina e a pré-lâmina A são geranil-geraniladas alternativamente como resultado da FTI e fornecem uma explicação para a baixa eficiência de tratamentos FTI em modelos murinos de síndrome progeróide.

As células de pacientes com progeria e ratinhos ZMPSTE24~' ~ foram utilizados psLra avaliar as estratégias terapêuticas para prevenção de prenilação cruzada da pré-lâmina A e da progerina. A nossa hipótese é que fames ilação das variantes anormais da lâmina A poderiam ser inibidos por fármacos que atuam no caminho da biossintese do pirosfato de farnesil, substrato da transferase de farnesil e precursor do pirofosfato de geranilgeranil, transferase do substrato geranil geranil de tipo 1. Foram testados, por conseguinte, o efeito dos dois fármacos, uma estatina e aminobifosfonato, conhecidos por agir em duas etapas desta via metabólica, em células de pacientes com progeria. Análise por espectrometria de massa mostra que a associação pravastatina (estatina) e zoledronato (aminobifosfonato) provoca o aparecimento de um péptido correspondente ao terminal C da progerina não prenilado, não detetável nas células de péptido tratado com FTI, enquanto nem os péptidos farnesilados nem os péptidos geranil-geranilados não são detetados, tal como pode ser visto na Figura 7c. 0 tratamento com estatina + aminobifosfonato inibe bem a prenilação da progerina. A mesma observação foi efetuada para a pré-lâmina A, tal como pode ser visto na Figura 8. 0 seu péptido do terminal C, não prenilado, é detetado nas células tratadas com a mistura de estatina + aminobifosfonato, ao passo que está ausente em células não tratadas, em que se encontra o péptido farnesilado e carboximetilado. Finalmente, o tratamento com pravastatina f zoledronato não faz aparecer a pré-lâmina A geranil-geranilad, ao contrário do FTI.

Legenda da Figura 9: Lâmina A (células de controlo) e pré-lâmina A (células de ratinho ZMPSTE24 foram analisadas por espectrometria cie massa (MALDI-TOF) . a, b: porções do espectro correspondentes a péptido tríptico farnesilado (a) e geranil-geranilado (b) . Cada pico é marcado com a massa teórica (entre parêntesis) do péptido derivado a partir da digestão com tripsina da lâmina A ou da pré-lâmina A. 0 número do resíduo é indicado no azul, A sequência dos péptidos e a sua massa estão marcadas a vermelho. Earn = farnesilado; CM = carboximetilado; Ger = geranil-geranilado ,

Legenda da Figura 7: Análise de espectrometria de massa de proteínas extraídas a partir do envelope nuclear das células não tratadas (a) , células de pacientes com progeria tratados com FTI (2,5 pm, b) ou tratados com a mistura de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada, c). A porção do espectro correspondendo às proteínas não modificadas, farnesiladas e geranil-geraniladas, é mostrado na parte superior, média e inferior da figura. Cada pico corresponde ao péptido tríptico de progerina e é marcado com a massa monoisotópica medida na experiência e pela massa teórica (entre parêntesis). 0 número de resíduos de aminoácidos é anotado em azul. A sequência dos péptidos e a sua massa estão marcadas a vermelho. A progerina é predominantemente farnesilada (F) e carboximetilada (CM) nas células não tratadas (a, painel do meio), ao mesmo tempo, sob o efeito de FTI, o pico é muito reduzido e a progerina geranil-geranilada aparece fosforilada e (b, painel inferior), Após o tratamento com pravastatina + zoledronato, a progerina não modificada, é si forma predominante.

Legenda da Figura 8: Análise de espectrometria de massa de proteína extraídas do envelope nuclear de fibroblastos não tratados (a), ou tratados com a mistura de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada, b) a partir de ratinhos ZMPSTE24~'' A porção do espectro correspondente as proteínas não modificadas, geranil-geraniladas on farnesiladas, e é mostrado na parte superior, média e inferior da figura. Cada pico corresponde ao péptido tríptico de progerina e é marcado com a massa monoisotópica medida na experiência e com a massa teórica (entre parêntesis). 0 número de resíduos de aminoácidos está indicado a azul. A sequência dos péptidos e a sua massa estão marcados a vermelho.

Nesta figura, vemos que a pré-lâmina A é predominantemente farnesilada (F) e carboximeti lada (cm) em. células não tratadas (a, painel central), enquanto as formas não modificadas ou geranil-geraniladas não são detetadas. Após o tratamento com pravastatina + zoledronato, os péptidos prenilados já não são detetáveis e a forma não modificada da pré-lâmina A é predominante (b, painel superior).

Tratamento com pravastatina + zoledronato corrige anormalidades nucleares de células de pacientes com progeria e rato ZMPSTE24 em cultura, e parcialmente restaura os mecanismos de reparação por danos ao ADN induzidos pela radiação X (Figura 10, 11, 12 e 13}. 0 tratamento com pravastatina + zoledronato provoca o aparecimento da pré-lâmina A no núcleo de células de controlo (Fig. 10a), como no núcleo das células do paciente com progeria, mas com uma melhoria significativa na morfologia nuclear destas últimas (Fig. 10b). A análise quantitativa mostra um. aumento de alterações nucleares em células de pacientes com progeria. com o número de passagens, o número de anomalias que diminui sob o efeito do tratamento de pravastatina + zoledronato (Fig. 10c). Observadas sob um microscópio confocal, as células do paciente cora progeria contêm agregados de lâmina A/C, invaginações profundas da face nucleoplásmica do envelope nuclear no nucleoplasma (retículo nuclear) marcados por anticorpos anti-calreticulina (Fig. 11a-f). Estes agregados de lâmina A/C estão ausentes das células de sujeitos de controlo (Fig, 10j-l) e desaparecem das células de pacientes com progeria, sob o efeito do tratamento de pravastatina + zoledronato (Fig. lOg-i). A localização da lâmina Bl, um. componente farnesilado da lâmina nuclear, é modificada sob o efeito do tratamento, o que confirma que o tratamento bloqueia a prenilação das lâminas.

Verificou-se que a melhoria da forma dos núcleos pelo tratamento de pravastatina + zoledronato está relacionada com o bloqueio da prenilação da progerina, incubando as células com o farnesol e/ou geranil-genaniol. A suplementação das células com. o farnesol e geranil-gerânio 1 permite que as células sintetizem o pirofosfato de farnesil e o pirofosfato de geranil-geranilo e, por conseguinte, prenilam a progerina, mesmo na presença de pravastatina + zoledronato (Fig. lOd). 0 farnesol suprime o efeito do tratamento com pravastatina + zoledronato, que é uma outra prova do efeito do tratamento, através da inibição da síntese de pirofosfato de farnesilo. Deve notar-se que o geranil-geraniol também bloqueia o efeito do tratamento, o que mostra que a forma da progerina geranil-geranilada também é tóxica para as células (Fig. lOd). Os mesmos efeitos são observados nas células ZMPSTE24~'~ (Fig. 12a) , sugerindo que os dados relativos à progerina podem, ser estendidos à pré-lâmina A, a proteína acumulada nas células ZMPSTE24~' ~, Nem o farnesol ou geranil-geraniol produzem efeito sobre os fibroblastos de controlo, o que elimina a eventualidade dum artefacto induzido por estas moléculas (Fig. 12b).

Finalmente, o tratamento com pravastatina + zoledronato provoca uma redução do número de focos da histona Η2ΆΧ fosforilada, focos diretamente correlacionados com o número de quebras de ADN de cadeia dupla não reparados (Fig. 13).

Em conclusão, os dados obtidos in vitro mostram que a combinação de pravastatina + zoledronato inibe parcialmente a fames ilação e geranilgeran ilação, e faz com. que as alterações esperadas na localização da lâmina e de distribuição no nucleoplasma, da pré-lâmima A e progerina não preniladas em células ZMPSTE24 e pacientes com progeria. Além disso, a diminuição da quantidade cie progerina fames ilada na lâmina e a sua deslocação no nucleoplasma explica os efeitos benéficos do tratamento sobre as células de pacientes com progeria.

Legenda da Figura 10: Efeito sinérgico da combinação de pravastatina + zoledronato na acumulação de pré-lâmina A em células de controlo e pacientes com progeria. (a) Deteção imunocitoquímica de lâmina A/C e pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais, não tratados, tratados com pravastatina (60 ym, 12 h) , por zoledronato (60 ym, 6 H) sozinho ou em combinação. (b) Deteção imunocitoquímica de lâmina A/C e pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais e pacientes com progeria tratados durante 2 4 h com a combinação cie pravastatina + zoledronato (1 ym cada). (c) Análise quantitativa do efeito do tratamento com pravastatina + zoledronato (1 yM cada) sobre a morfologia nuclear de células de pacientes com progeria. As células tratadas ou não foram imunocoradas com um anticorpo anti-lâmina A/C, na passagems 8 (P8) , 13 (pl3) e 20 (p20) . As setas brancas mostram os núcleos anormais, (d) Análise quantitativa do efeito do tratamento com pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada) sobre a morfologia nuclear de células de pacientes com. progeria na presença de farnesol, geranil-geraniol, ou ambos os compostos. As barras de erro = médio ± erro padrão da média. Escala da barra = 10 um.

Legenda da Figura 11: o tratamento com pravastatina + zoledronato corrige a morfologia nuclear e induz a uma deslocalização parcial das isoformas de lâmina A/C e lâmina Bl, da lâmina nuclear no nucleoplasma, em células de pacientes com progeria. (A) co-localização de lâmina A/C e calreticulina nas células com progeria, tratadas ou não. Imunofluorescência e mi cr: os copia con focal (Lei ca TCS SP5, pilha tridimensional de imagens em 2048 x 2048 pixels de 0,2 um, média de 3 linhas, acumulação de 3 imagens, zoom x 1,7). As imagens a a c de cada painel são projeções da intensidade média die 27 imagens na pilha e mostram os túbulos do retículo nuclear marcados pela calreticulina nas células de progeria incubadas com PBS. Imagens dal: secções confocais isoladas de 0,2 ymi de espessura. O tratamento com pravastatina + zoledronato corrige a forma dos núcleos de células com progeria, diminui o número de túbulos do retículo nuclear (g) e a espessura da lâmina nuclear (h). (B) Co-localização de lâmina Bl e calreticulina. O tratamento com pravastatina + zoledronato aumenta o sinal de marcação nucleoplásmica pela lâmina Bl, indicando que a farnesilação desta proteína é parcialmente inibida. Barra de escala = 5 ym.

Legenda da Figura 12: Precursores de pirofosfato de farnesilo e pirofosfato de geranilo-geranilo abolem o efeito do tratamento com pravastatina + zoledronato em células de ratinho ZMPSTE24~'~ em cultura. A quantificação do efeito da pravastatina (1 ym) e zoledronato (1 ym) associados, ou não, sobre a morfologia nuclear de células de ratinho ZMPSTE24~'~ (a) e ratinhos de controlo (b) em cultura na presença de farnesol, geranil-geraniol ou ambas as moléculas.

Farnesol, geranil-geraniol, sozinho ou combinado, abolem o efeito do tratamento com pravastatina + zoledronato sobre a morfologia nuclear de células ZMPSTE24~f

Legenda da Figura 13: 0 tratamento com pravastatina + zoledronato corrige parcialmente anomalias da reparação de ruturas dos filamentos duplos (DSB) do ADN nas células de pacientes com progeria.

Fibroblastos de controlo e de pacientes com progeria foram incubadas com a mistura de pravastatina + zolédonate (1 yM cada) ou com PBS e foram irradiadas com raios X (2 Gy). Imunodeteção de focos de histona H2AX fosforilada detetados 24 h após a irradiação, focos correspondentes às quebras de cadeia dupla não reparados (imagens acima) . Coloração nuclear DAPI (imagem inferior) .

Curvas de fundo: evolução do número de focos de histona H2AX fosforilada em função de tempo após a irradiação em células de controlo (quadrado sólido) e as células com progeria (círculo vazio) incubadas com PBS ou tratadas com pravastatina + zoledronato. Cada curva representa a média ± erro padrão da média de pelo menos 3 experiências. A terapia de combinação pravastatina + zoledronato melhora fenótipo progeróide de ratinhos ZMBSTE24 ~^ ~ (figuras 14, 15 e 16):

Ratos ZMPSTE24 ~'~e ratinhos de controlo foram tratados diariamente com pravastatina, zoledronato ou a combinação de ambos os fármacos, a uma dose que foi anteriormente demonstrado que é desprovida de toxicidade em ratinhos. Como já foi observado para as células do paciente com progeria, cada fármaco ozinho, pravastatina ou zoledronato, não melhora o tempo de vida de ratinhos ZMPS TE 2 4~'~ (Fig. 15). Pelo contrário, a combinação de ambos os fármacos melhoram significativamente o fenótipo progeróde de ratinhos ZMPSTE24~/~: o tratamento melhora o ganho de peso, aumenta a quantidade de gordura subcutânea, reduz a importância da cifose e a alopecia e aumenta o tempo de vida. 0 valor médio de sobrevivência passa de 101 para 17 9 dias e para a sobrevivência máxima passa de 151 para 222 dias (P <0,001,Fig. 14c). Deve notar-se que todos os sinais fenotípicos, corrigidos pelo tratamento nos ratinhos, são também as características da progeria em seres humanos. A terapia de combinação corrige a diminuição na densidade óssea, que é uma das caracterí sticas dos ratinhos ZMPSTE24~/~ e pacientes com progeria ou uma síndrome progeróide relacionada. A tomografia computorizada óssea mostra um aumento da mineralização do osso e a espessura cortical tibial dos ratinhos tratados (Fig. 14d). Em adição, a quantificação de alterações morfológicas nucleares em fígado cie rato ZMPSTE24+/~r, ZMPSTE24~'~ e ZMPSTE24~’~ mostra que o tratamento com pravastatina + zoledronato normaliza a forma dos núcleos das células ZMPSTE24"/" (Fig. 14). Processamento adicional corrige a transcrição aumentada dos genes alvo da proteína p53, um aumento que foi descrita em células de ratinho ZMPSTE24 (Varela et al, 2005} (Fig. 14f) . Finalmente, foi investigado se o tratamento poderia ter um efeito sobre ratos LMNÁ~!" que não podem acumular pré-lâmina A. O tratamento com pravastatina + zoledronato não tem nenhum efeito sobre o tempo de vida destes ratinhos (Fig, 16), o que é mais uma prova de que este tratamento só pode agir em ratinhos que acumulam pré-lâmina A farnesilada no envelope nuclear.

Legenda da Figura 14: O tratamento com pravastatina + zoledronato melhora o fenótipo progeróide em ratinhos ZMPSTE24_/_ : (A) Fotografias representativas ratos, com 3 meses de idade, ZMPSTE24 +/+, ZM PS TE 2 4 ~j~ e ZMPSTE24 tratados com a combinação de pravastatina (100 mg/kg/dia) e zoledronato (100 mg/kg/dia) . Escala da barra = 1 cm (B) Peso de ratos, com 3 meses de idade, ZMPSTE24 +/+ (n = 12), ZMPSTE24 (n = 13) e ZMPSTE24 tratados (n = 15) . (c) Curvas de Kaplan-Meier que mostram um aumento significativo da vida do ratinho ZMPSTE24 tratado (n = 15) comparado com o de ratos não tratados (n = 13) (d) Representação tridimensional por A tomografia computadorizada da tíbia de ratos ZMPSTE24 _/_ tratados e não tratados (em cima) , O painel inferior mostra o volume relativo de osso (volume de osso/volume da tíbia) e o número de trabéculas ósseas, em ratinhos ZMPSTE24"1" não tratados (n = 6} e tratados (n = 5) . (e) Quantificação de alterações nucleares nos hepatócitos de ratos ZMPSTE24 +/+, ZMPSTE24~f~ e ZMPSTE24~/ ' tratados. As setas brancas mostram os núcleos anormais. Escala da barra = 10 ym. (f) expressão relativa de genes alvo da p53 no coração e no fígado de ratos ZMPSTE24 Λ/Λ, ZMPSTE24'e ZMPSTE24 tratados, analisados por RT-PCR quantitativo. *P <0,05; **P <0,01; * * * P <0,001. As barras de erro representam a média ± erro padrão da média.

Legenda da Figura 15: Nem sl pravastatina sozinha, nem o zolendronato sozinho aumentam o tempo de vida de ratimhos ZMPSTE24~''~:

As curvas de Kaplan-Meier mostram que a pravastatina isolada (n = 5} (a), e o zoledronato isolado (n = 5) (b)não corrigem, o tempo de vida de ratos ZMPSTE24~'~ tratados (diamante vazio) e não tratados (círculos fechados, n =

Legenda da Figura 16: O tratamento com pravastatina + zoledronato não corrige o tempo de vida de ratinhos LMNA~/~:

As curvas de Kaplan-Meier mostram a vida útil dos ratos LMNA ~!" tratados com pravastatina + zoledronato (n = 12, diamantes vazios) comparada com a de ratos não tratados (círculos a cheio, n = 11). O tratamento com pravastatina + zoledronato não tem efeito em ratinhos sem lâmina A/C.

Resumo/conclusão/perspetivas Várias síndromes progeróides humanas, incluindo progeria de Hutchinson-Gilford, são causadas pela acumulação no envelope nuclear de pré-lâmina A farnesilada excluída (progerina) ou não. A progerina também é produzida durante o envelhecimento fisiológico. Estudos anteriores realizados com células de pacientes com progeria têm mostrado que os inibidores da farnesil-transferase (FTI) melhoram a morfologia dos núcleos, sugerindo que esses inibidores podem representar um tratamento para estas síndromas de v astadoras.

Os inventores mostram aqui que a pré-lâmina A e sl progerina sofrem uma prenilação alternativa pela transferase de geranil-geranil quando é inibida, o que pode explicar a baixa eficiência do FTI para melhorar o fenótipo de modelos murinos de estas síndromes progeróides.

Mostram também que a combinação de uma estatina e um aminobifosfonato inibe eficazmente tanto a farnesilação e geranil-geranilação da pré-lâmina A e da progerina, melhorando significativamente o fenótipo do envelhecimento do rato, naqueles em que foi inativado o gene que codifica a metaloprotease ZMPSTE24 envolvida na maturação da pré-lâmina A. A melhoria do fenótipo inclui os defeitos da curva de crescimento, peso, lipodistrofia, perda de pelo e de osso.

Além disso, o tempo de vida destes ratinhos é aumentado substancialmente.

Estes dados abrem uma nova abordagem terapêutica para síndromes progeróides humanos com acumulação de proteínas preniladas no envelope nuclear. 0 tratamento com pravastatina + aminobifosfonato está a ser implementado em Marselha para os próximos 3 anos em crianças com progeria, no âmbito de um ensaio clínico europeu (15 crianças) sob a responsabilidade do Pr. Nicolas Lévy, financiado pelo Ministério da Saúde (PHRC 2008) e pela Associação Francesa contra Miopatias (AFM) e recebeu autorização das AFSSAPS e CCP Sul-Mediterrâneo. O mesmo tratamento será dado, em breve, em Roma, sob a responsabilidade do Pr. Giuseppe Nove 11 i em pacientes com. acromandibular displasia, uma outra síndrome progeróoide com acumulação de pré-lâmina A farnesilada.

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição tópica dermatológica compreendendo: Pelo menos um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA), e - Pelo menos um inibidor da sintase de pirosfato de farnesil, para uso no tratamento de desordens cutâneas e/ou pilosas selecionado a partir do grupo gue consiste em envelhecimento prematuro cutâneo patológico e/ou envelhecimento lipo-mio-cutâneo precoce patológico.
2. Composição da reivindicação 1, em gue o inibidor da redutase de HMG-CoA é uma molécula da família das estatinas ou um dos seus sais f isiologicamente aceitáveis.
3. Composição da reivindicação 2, em gue o inibidor da redutase de HMG-CoA é uma estatina solúvel em água.
4. Composição da reivindicação 2, em gue o inibidor da redutase de HMG-CoA é uma estatina lipossolúvel.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o inibidor da reductase de HMG-CoA é selecionado a partir do grupo que consiste de atorvastatina, simvastatina, pravastatina, rivastatina, mevastatina (ou compactina), fluindostatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, cerivastatina, pentostatina, rosuvastatina, lovastatina, pitavastatina e os seus sais fisiologicamente aceitáveis.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o inibidor da sintase de pirosfato de farnesil é selecionado a partir do grupo que compreende uma molécula da família dos aminobifosfonatos (NBP) ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, em que o aminobifosfonato pode ser selecionado a partir de: - Ácido alendrónico ou a sua forma iónica, alendronato; - Ácido clodrónico ou a sua forma iónica, clodronato; - Ácido etidrónico ou a sua forma iónica, etidronate; - Ácido ibandrónico ou a sua forma iónica, ibandronato; - Ácido medrónico ou a sua forma iónica, medronato; - Ácido neridrónico ou a sua forma iónica, neridronato; - Ácido olpadrónico ou a sua forma iónica, olpadronato; - Ácido pamidrónico ou a sua forma iónica, pamidronato; - Ácido ridesrónico ou a sua forma iónica, risedronato; - Ácido tiludrónico ou a sua forma iónica, tiludronato; - Ácido zoledrónico (ou zolendrónico) ou a sua forma iónica, zoledronato (ou zolendronato); - ácido 4-N,N-dimetilaminometano difosfónico ou a sua forma iónica, dimetilaminometanodifosfonato; - A α-amino (4-hidroxibenzilideno) difosfonato.
8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o inibidor da sintase de pirosfato de farnesil é o ácido zoledrónico ou a sua forma iónica, o zoledronato.
9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a quantidade de inibidor das sintase de pirosfato de farnesil é entre 0,001 a 0,050 por cento, em peso, da composição cosmética e/ou dermatolóqica.
10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a quantidade de inibidor da reductase de HMG-CoA é entre 0,010 a 0,100 por cento em peso da composição dermatológica.
11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a soma da quantidade de inibidor da redutase de HMG-CoA e a quantidade de inibidor da sintase de pirosfato de farnesil está entre 0,011 e 0,150 por cento em peso da composição dermatológica.
12. Uso cosmético não terapêutico de uma composição cosmética compreendendo: Pelo menos um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA), e - Pelo menos um inibidor da sintase de pirosfato de farnesil para o tratamento de desordens cutâneas e/ou pilosas selecionado a partir do grupo que consiste em envelhecimento da pele e/ou lipodistrofia.
13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o inibidor da redutase de HMG-CoA é uma molécula da família das estatinas ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.
14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o inibidor da redutase de HMG-CoA é uma estatina solúvel em água.
15. Utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o inibidor da redutase de HMG-CoA é uma estatina lipossolúvel.
16. Utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o inibidor da reductase de HMG-CoA é selecionado a partir do grupo que consiste em atorvastatina, simvastatina, pravastatina, rivastatina, mevastatina (ou compactina), fluindostatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, cerivastatina, pentostatina, rosuvastatina, lovastatina, pitavastatina e os seus sais fisiologicamente aceitáveis.
17. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, em que o inibidor da sintase de pirosfato de farnesil é selecionado a partir do grupo que compreende uma molécula da familia dos aminobifosfonatos (NBP) ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.
18. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o aminobifosfonato pode ser selecionado a partir de: - Ácido alendrónico ou a sua forma iónica, alendronato; - Ácido clodrónico ou a sua forma iónica, clodronato; - Ácido etidrónico ou a sua forma iónica, etidronate; - Ácido ibandrónico ou a sua forma iónica, ibandronato; - Ácido medrónico ou a sua forma iónica, medronato; - Ácido neridrónico ou a sua forma iónica, neridronato; - Ácido olpadrónico ou a sua forma iónica, olpadronato; - Ácido pamidrónico ou a sua forma iónica, pamidronato; - Ácido ridesrónico ou a sua forma iónica, risedronato; - Ácido tiludrónico ou a sua forma iónica, tiludronato; - Ácido zoledrónico (ou zolendrónico) ou a sua forma iónica, zoledronato (ou zolendronato); - ácido 4-N,N-dimetilaminometano difosfónico ou a sua forma iónica, dimetilaminometanodifosfonato; - A α-amino (4-hidroxibenzilideno) difosfonato.
19. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, em que o inibidor da sintase de pirosfato de farnesil é o ácido zoledrónico ou a sua forma iónica, o zoledronato.
20. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, em que a quantidade de inibidor da sintase de pirosfato de farnesil é entre 0,001 a 0,050 por cento em peso da composição cosmética.
21. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20, em que a quantidade de inibidor da reductase de HMG-CoA é entre 0,010 a 0,100 por cento em peso da composição cosmética.
22. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 21, em que a soma da quantidade de inibidor da redutase de HMG-CoA- e a quantidade de inibidor da sintase de pirosfato de farnesil é entre 0,011 e 0,150 por cento peso da composição cosmética.
23. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 21, em que a composição cosmética compreende, pelo menos, um selecionado a partir do grupo que compreende um tensioativo, um agente espessante, um agente gelificante, um conservante, um humectante, um agente emulsionante, perfume, um silicone, um agente quelante, um antioxidante, um fungicida, um agente antibacteriano, um corante cosmético, um agente absorvente, um agente formador de película, um agente estabilizador, um agente tamponante, um filtro de UV, um creme hidratante, um ligante, um estabilizador de emulsão.
24. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 23, em que a composição cosmética está na forma de um creme, um aerossol, um gel, um unguento, um pó, uma espuma, um leite, um suplemento alimentar ou um produto administrável por via oral.