PT2189469E

PT2189469E - Construções de arnsi multicistrónicas para inibir tumores

Info

Publication number: PT2189469E
Application number: PT100024322T
Authority: PT
Inventors: Jasti S Rao; Christopher S Gondi; Sajani S Lakka
Original assignee: Univ Illinois
Priority date: 2004-11-18
Filing date: 2005-11-17
Publication date: 2016-01-22
Also published as: WO2006055727A3; EP2189469B1; ES2556272T3; EP1814899A4; US20110236956A1; JP2008520243A; EP2189469A2; CA2587854C; EP2189469A3; AU2005307737B2; WO2006055727A2; JP2013027405A; EP1814899A2; AU2005307737C1; US20080020992A1; CA2587854A1; AU2005307737A1; US7893035B2

Description

DESCRIÇÃO

CONSTRUÇÕES DE ARNsi MULTICISTRONICAS PARA INIBIR TUMORES ANTECEDENTES A progressão de tumor envolve modulação de adesão às células tumorais durante a migração celular e degradação da matriz extracelular (ECM) durante a invasão do tecido. Um equilíbrio intrincado de proteases, seus ativadores e seus inibidores, regula ambos estes processos durante a invasão do tumor. Três classes de proteinases que degradam a ECM são as proteinases serina, metaloproteases e proteinases cisteína. Ativador de plasminogénio uroquinase (uPA) inicia uma cascata de proteases que podem degradar a maioria da matriz e componentes da membrana de base e interferir com interações célula-célula e célula-matriz. uPA, ligado ao seu recetor de superfície celular, ativador de plasminogénio uroquinase receptor (uPAR), é um participante da degradação de ECM, conforme demonstrado por um aumento de várias ordens de magnitude na ativação de plasminogénio, uPA também ativa vários fatores de crescimento após a degradação de componentes de ECM. A ligação de uPA com o seu recetor uPAR ativa moléculas de sinalização a jusante através de um número de vias, incluindo as proteínas quinases ativadas por mitogénio (MAPK) e transdutor de sinal e ativador de vias de transcrição (Stat). A descoberta recente de ARN de interferência (ARNi) abriu novas direções na terapêutica cancerígena. ARNi é um mecanismo de silenciamento de genes pós-transcricional específico de sequência que é afetado através de moléculas de ARN de cadeia dupla homólogas à sequência do gene alvo. ARN de interferência (ARNi) é um mecanismo de silenciamento de genes pós-transcricional específico de sequência que é despoletado por ARN de cadeia dupla (ARNcd) e causa a degradação de ARNm com uma sequência homóloga ao ARNcd. 0 ARNi depende da formação de ARN de cadeia dupla (ARNcd) cuja cadeia anti-senso é complementar ao transcrito de um gene alvo. ARNi de inibição especifico de sequência também pode ser induzido em células de mamífero. Numa implementação de ARNi, a degradação seletiva de ARNm alvo em células de mamífero foi conseguida por transfeção com ARN de cadeia dupla interferente curto (ARNsi), conduzindo a degradação rápida e eficiente do alvo. Demonstrou-se que estes ARNsi evitam os efeitos não específicos bem documentados despoletados por ARN de cadeia dupla mais longos em células de mamífero. 0 cancro da próstata é a segunda malignidade mais comum em homens Americanos, com estimativas de 230 110 novos casos e aproximadamente 30 000 mortes em 2004. Como tal, o cancro da próstata coloca um grande problema de saúde pública nos Estados Unidos e em todo o mundo. Atualmente, o cancro da próstata metastático não é curável e, em última análise, reivindica a vida dos pacientes. Um fator na seriedade relativa do cancro da próstata é a capacidade de invasão das células tumorais constituintes que causam metástase. A natureza invasiva das células tumorais é uma característica para metástases cancerígenas. Invasão e metástase de células tumorais são processos complexos com três fases proeminentes: adesão de células malignas (neoplásticas) à matriz extracelular, digestão da matriz para libertar células da massa tumoral primária e migração das células tumorais para alvos secundários.

Glioblastoma multiforme (GBM) é um neoplasma do sistema nervoso central primário altamente maligno, que é altamente refratário à terapêutica. Uma propriedade que torna o glioblastoma resistente ao tratamento é a tendência das células tumorais para invadirem tecido cerebral normal. Terapêutica que afeta tecido cerebral normal não é aceitável. A capacidade de invasão é, assim, considerada como um determinante principal do comportamento maligno dos gliomas humanos. A invasão de células únicas difusa, que ocorre em todos os tumores gliais independentemente do grau histológico, é definida como uma translocação de células neoplásticas através de barreiras celulares e ECM do hospedeiro. Gliomas malignos expressam níveis mais elevados de uPA, uPAR e MMP-9 comparados com tecidos cerebrais normais. MMPs potenciam a invasão de células tumorais degradando proteínas da matriz extracelular, ativando cascatas de transdução de sinal que promovem a motilidade e ativando fatores de crescimento, tais como transformar o fator de crescimento β, que são implicados na motilidade GBM. Expressão das gelatinases MMP-2 e MMP-9 correlacionam com os potenciais invasivos e metastáticos de vários cancros, incluindo gliomas. Os níveis de MMP-9 estiveram altamente correlacionados com o grau histológico de malignidade glioma. MMP-9 é relevante na morfogénese das células endoteliais e formação capilar nos co-cultivos gliais/endoteliais in vitro. MMPs também regulam a angiogénese tumoral e podem ser necessários para o ' interrutor angiogénico' que ocorre durante a neovascularização tumoral. A atividade proteolítica de catepsina B, uma protease cisteína, envolve a degradação direta de proteínas ECM, incluindo fibronectina, colagénio tipos I e IV e laminina. Catepsina B também ativa indiretamente outras enzimas envolvidas na cascata proteolítica que medeia a degradação ECM, incluindo metaloproteinases e ambos ativador de plasminogénio uroquinase (uPA) solúvel e ligado a recetor. Além disso, sugeriu-se que a catepsina B aumenta a atividade de MMP desativando inibidores de tecido de metaloproteinases da matriz (TIMPs). Logo, a catepsina B poderia ser um regulador a montante importante na ativação de pró-uPA/plasminogénio e pró-MMPs. Também se demonstrou que catepsina B contribui para a apoptose causando a libertação de citocromo c e a ativação da caspase 9 e 3 (eventos chave na via mitocondrial da apoptose). Aumento na expressão da catepsina B e reduções nos seus níveis inibidores foram associados com crescimento, vascularização, invasão de tumor e metástase em vários cancros.

Moléculas de ARNsi que estão dirigidas a uma pluralidade de genes implicados em tumores são desejadas para desenvolver composições terapêuticas.

Lakka S. et al., PROCEEDINGS OF THE ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, EUA, volume 44, 1 de julho de 2003 (2003-07-01), página 650, XP001525366, ISSN: 0197-016X é um resumo de uma conferência que se refere aos efeitos de "degradação por ARN alvo mediada por ARNsi de uPAR e MMP-9 em linhas de células de glioma humano". LAKKA SAJANI S ET AL: " Synergistic down-regulation of urokinase plasminogen activator receptor and matrix metalloproteinase-9 in SNB19 glioblastoma cells efficiently inhibits glioma cell invasion, angiogenesis, and tumor growth.", CANCER RESEARCH, volume 63, n.° 10, 15 de maio de 2003 (2003-05-15), páginas 2454-2461, XP002608814, ISSN: 0008-5472) refere-se à eficácia da expressão mediada por adenovirus de uPAR anti-senso e MMP-9 na inibição da invasão e crescimento de tumor in vitro e in vivo. CHRISTOPHER S GONDI ET AL: "Downregulation of uPA, uPAR and MMP-9 using small, interfering, hairpin RNA (siRNA) inhibits glioma cell ivasion, angiogenesis and tumor growth" NEURON GLIA BIOLOGY, volume 1, n.° 2, 25 de outubro de 2004 (2004-10-25), página 176, XP002543013 ISSN: 1740-925X doi: 1 0.1017/S 1740925X04000237 descreve uma construção tricistrónica e descreve que MMP-9, uPAR e uPA desempenham um papel na invasão do glioma e crescimento tumoral.

SUMÁRIO A invenção é definida nas reivindicações. A invenção refere-se a uma construção de ARN interferente curta bicistrónica que compreende uma primeira sequência auto-complementar do recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e uma segunda sequência auto-complementar da matriz metaloprotease 9 (MMP-9) e uma sequência interveniente entre a primeira e a segunda sequências auto-complementares de cerca de 22-68 pares de base. A primeira auto-complementar inclui uma sequência nucleotidica do recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e a segunda sequência auto-complementar compreende uma sequência nucleotidica da matriz metaloprotease 9 (MMP-9). Uma sequência auto-complementar de uPAR é CTACAGCAGTGGAGAGCGATT-alça- AATCGCTCTCCACT-GCTGTAG e uma sequência auto-complementar de MMP-9 é CAAGTGGCACCACCACAACAA-alça-TTGTTGTGGT-GGTGCCACTTG e a alça inclui cerca de 9 nucleotideos que são deficientes em GC. Uma sequência de alça adequada inclui uma sequência nucleotidica ATATATAAT. As sequências auto-complementares de uPAR e MMP-9 são geralmente separadas por uma sequência interveniente de comprimento de cerca de 22-35 pares de base. Uma sequência interveniente é GATCCA CTAGTAACGG CCGCCAGTGT GCTGG AATT. A construção uPAR-MMP-9 é um ácido nucleico circular ou linear.

Uma sequência auto-complementar de uPAR é CTACAGCAGTGGAGAGCGATT-alça- AATCGCTCTCCACT-GCTGTAG; e uma sequência auto-complementar de MMP-9 é CAAGTGGCACCACCACAACAA-alça-TTGTTGTGGT-GGTGCCACTTG. A alça inclui cerca de 9 nucleotideos que são deficientes em GC. A sequência da alça inclui uma sequência nucleotidica ATATATAAT. As sequências auto-complementares de uPAR e MMP-9 são geralmente separadas por uma sequência interveniente de comprimento de cerca de 22-68 pares de base. Uma sequência interveniente é GATCCA CTAGTAACGG CCGCCAGT-GT GCTGG AATTC TGCAGATATC CATCACACTG GCGGCCGC TCGA. É revelado um método de inibir tumores, incluindo o método as etapas de: (a) administrar uma construção multicistrónica de ARN interferente curta; e (b) reduzir a expressão de uma pluralidade de genes expressos em tumores, inibindo, assim, a formação ou crescimento de tumores e regredindo tumores que já existam. É revelado um método de utilizar uma construção multicistrónica de ARN interferente ou formadora curta que está dirigida, por exemplo, a recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPA), reduzindo, assim, a expressão de uPAR e uPA e inibindo tumores. A construção multicistrónica de ARN interferente curta inclui uma sequência nucleotidica TGAGAGCCCTGCTGGCGCGCC-alça- GGCGCGCCAGCAGGGCTCTCA-sequência interveniente- CTACAGCAGTGGAGAGCGATT-alça-AATCGCTCTCCACTGCTGTAG. Outro termo para "sequência interveniente" é um "espaçador". Um tumor é inibido reduzindo pelo menos uma de proliferação de células tumorais, invasão de células tumorais, migração de células tumorais e angiogénese. Tumores incluem cancro da próstata, glioma, cancro da mama e melanoma. Uma construção é entregue através de um vetor virai ou administrada através de entrega direta ou por qualquer método adequado conhecido daqueles habilitados na arte.

Um método de utilizar uma construção multicistrónica de ARN interferente curta pode também dirigir o recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e matriz metaloprotease 9 (MMP-9), reduzindo, assim, a expressão de uPAR e MMP-9 e inibindo tumores. A construção multicistrónica de ARN interferente curta inclui uma sequência nucleotidica CTACAG-CAGTGGAGAGCGATT-alça- AATCGCTCTCCACTGCTGTAG-espaçador-CAAGTGGCACCACCACAACAA-aIça-Τ' T-GTTGTGGTGGTGCCACTTG . 0 tumor é inibido reduzindo pelo menos uma de proliferação de células tumorais, invasão de células tumorais, migração de células tumorais e angiogénese. Tumores incluem cancro da próstata, glioma, cancro da mama e melanoma. A construção é entregue através de um vetor virai ou administrada através de entrega direta ou por qualquer método adequado conhecido daqueles habilitados na arte. É revelado um método de inibir tumores, que inclui as etapas de: (a) administrar uma construção multicistrónica dirigida a pelo menos um de uPA, uPAR, MMP-9 e CB; e (b) reduzir a expressão de pelo menos um de uPA, uPAR, MMP-9 e CB, inibindo, assim, tumores.

Uma molécula de ARN interferente curta inclui moléculas de ARN dirigidas a: (a) recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e matriz metaloprotease 9 (MMP-9), que inclui uma sequência de ácido nucleico CUACAGCAGUGGAGAGCGAUU-alça-AAUCGCUCUCCACUGCUGUAG-espaçador-CAAGUGGCACCACCACAACAA-alça-UUGUUGUGGUGGUGCCACUUG.

Uma célula recombinante transformada com a construção reivindicada de uPAR-MMP-9 é revelada aqui.

Um virus recombinante transformado com a construção reivindicada de uPAR-MMP-9 é revelado aqui.

Abreviaturas

uPA significa ativador de plasminogénio tipo uroquinase; uPAR significa recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase; MMP-9 significa matriz metaloprotease 9; CB significa catepsina B; CMV significa citomegalovírus; SV40 significa vírus de símio tipo 40; GFP significa proteína fluorescente verde; ECM significa matriz extracelular; ARNsi significa ARN interferente curto; ARNgc significa ARn em forma de gancho curto; ARNi significa ARN de interferência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIGURA 1 mostra que niveis de expressão da proteína uPA e uPAR e atividade de uPA estão correlacionados com o potencial invasivo de linhas de células de cancro da próstata humanas. A expressão de proteína uPA e uPAR endógena foi examinada por análise imunoblot de proteínas celulares totais isoladas das seguintes linhas de células de cancro da próstata: LNCaP, DU145 e PC3. Quantidades iguais de proteína isolada de extratos celulares de todas as três linhas de células foram sujeitas a imunoblot com anticorpos anti-uPA, anti-uPAR e anti-GAPDH. GAPDH foi utilizado como um controlo de carga (A) . A atividade de uPA em linhas de células de cancro da próstata foi avaliada por zimografia de fibrina. Quantidades iguais de proteína de células de cancro da próstata em meios livres de soro foram separadas por SDS-PAGE em géis 10% contendo fibrinogénio e plasminogénio em condições não redutoras. Após troca de SDS com lavagem com Triton X-100, o gel foi incubado em tampão de glicina (0,1 M, pH 8,0). A atividade fibrinolítica foi detetada como bandas de lise claras após coloração com negro de amido e descoloração subsequente com metanol-ácido acético (B).

Comparação dos potenciais invasivos in vitro de linhas de células de cancro da próstata (C). Foram realizados ensaios de invasão em câmaras transpoço com 12 poços contendo filtros de policarbonato com poros de 12 pm revestidos com matrigel. As células que passaram para a sub-superfície dos filtros foram coradas e foram tiradas fotografias ao microscópio a uma amplificação de 200X (C) . As células que invadiram através da matrigel foram contadas ao microscópio em três campos aleatórios a uma amplificação de 200X. Cada barra representa a média ± DP de três campos onde as diferenças significativas de células LNCaP com poucas ou nenhumas metástases, que exibiram expressão de proteína uPA e uPAR indetetável, são representadas por asteriscos * (P <0,05) (D). A FIGURA 2 mostra o knockdown por ARNi da expressão de uPA e uPAR na linha de células do cancro da próstata PC3. Representação esquemática da construção do plasmídeo sh-uPAuPAR (A) . A construção consiste de um promotor CMV humano e sequências homólogas dirigidas contra uPA e uPAR. Após a expressão, o forte promotor CMV leva à formação de moléculas em forma de gancho curtas especificas para uPA e uPAR A sequência de poliadenilação da hormona de crescimento bovina (BGH) serve como um sinal de terminação do promotor CMV baseado em ARN pol II. Dicer/Drosha processa o específico de ARNsh para uPA e uPAR e as moléculas de ARNsi resultantes interagem com os genes alvo uPA e uPAR. Esta interação resulta no knockdown simultâneo da expressão de genes uPA e uPAR. PCR transcrição reversa semi-quantitativa de ARN extraído a partir de células PC3 transfetadas com ARNsh (B) . O ARNm de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi co-amplifiçado como um controlo. Immunoblotting de lisados de proteínas totais extraídos a partir de células PC3 transfetadas com ARNsh (C) . Ambas bandas uPA e uPAR estão presentes em células mock, EV e transfetadas com SV. Em conformidade, cada via de ARNsh específica de gene mostra uma diminuição significativa da banda apropriada. GAPDH foi incluída como um controlo de carga. Níveis de expressão de proteína uPA e uPAR também foram detetados utilizando imunofluorescência indireta em células PC3. Células PC3 transfetadas com as células EV, SV e mock coradas positivas para deteção imunofluorescente de uPA (FITC) e uPAR (Texas Red) (D). Células transfetadas com ARNsh específicas de gene alteraram substancialmente os perfis de coloração das células de uPA e uPAR conforme comparados com células transfetadas com EV/SV e mock. A contra-coloração nuclear foi obtida com DAPI. (Resultados são representativis de pelo menos três experiências separadas.) A FIGURA 3 mostra que o knockdown por ARNi da expressão de uPA e uPAR inibe o potencial invasivo das células PC3. 0 potencial invasivo das células mock e células transfetadas com os plasmídeos ARNsh indicados foram examinadas por ensaio de invasão Matrigel (campo visual representativo de uma experiência) (A). Ensaios de invasão realizados conforme descritos aqui (ver FIGURA 1C). Número representativo de células invasoras através da matrigel foi contado ao microscópio em três campos aleatórios a 200X (B) . Cada barra representa a média DP de três campos contados. Diferentes significativas dos controlos (isto é, células transfetadas por mock ou vetor misturado) estão indicadas por asteriscos * (P <0,05).

A FIGURA 4 ilustra que o knockdown por ARNi da expressão de uPA e uPAR inibe a proliferação celular e induz a apoptose em células PC3. A viabilidade das células PC3 transfetadas com plasmídeos ARNsh específicos de gene ou controlos (células mock ou transfetadas com EV/SV) foi revelada por ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (A). Cada barra representa análises em triplicado de média DP onde as diferenças significativas dos controlos são representadas por um asterisco * (P <0,05) . Imunoblots representativos mostram alterações na expressão de genes pró-apoptótica em células PC3 de knockdown de uPA-uPAR (B) . GAPDH foi utilizada como um controlo de carga. A ativação da caspase foi detetada in situ com rotulagem de fluorescência (painel inferior) utilizando FAM-VAD-FAK, um inibidor de caspase permeável à célula que se liga a caspases ativadas (C). Foi realizada coloração nuclear com DAPI (painel superior). Um número significativo de células transfetadas com sh-uPAuPAR exibiu fluorescência verde. Diagrama de barras que mostra dados quantitativos da razão de células rotuladas DAPI/FMK-VAD-FAK de três campos aleatórios utilizando um microscópio confocal (D) . A razão de DAPI para FMK-VAD-FAK foi aumentada significativamente em células transfetadas com sh-uPAuPAR Diferenças significativas em relação às células mock ou transfetadas com EV/SV estão indicadas por asteriscos * (P <0,05). Foi observado DNA laddering em células transfetadas com uPA-uPAR shRNA e células tratadas com actinomicina D (ActD, 0,2 g/ml) (E). Um gel de agarose foi corado com brometo de etidio e fotografado sob luz UV. Marcadores de AND foram submetidos a eletroforese como um par quilobase de referência com bandas padrão de 2,0, 1,5, 1,0, 0,75 e 0,5 kb (via M). A FIGURA 5 demonstra que o knockdown por ARNi da expressão de uPA e uPAR inibe sinalização a jusante em células PC3. Análise imunoblot de formas total e fosforilada de quinase regulada por sinal extracelular (ERK) , p38 e JNK em células mock e transfetadas com ARNsh (A) . Células PC3 transfetadas com mock, EV, SV, sh-uPA, sh-uPAR e sh-uPAuPAR foram lisadas 72 h mais tarde e sujeitas a SDS-PAGE seguido de immunoblotting com formas total e fosforilada de anticorpos ERK, p38 e JNK. Anticorpos GAPDH foram utilizados para verificar que quantidades semelhantes de proteína foram carregadas em cada via. Análise imunoblot de proteína Stat 3 em células mock e transfetadas com ARNsh (B) . Quantidades iguais de proteína foram carregadas e o immunoblotting foi realizado utilizando anticorpos Stat 3 fosfo-especificos contra tirosina 705 e anticorpos contra uma forma não fosforilada de Stat 3. GAPDH foi incluída como um controlo de carga. Ensaio de alteração da mobilidade eletroforética de células mock e transfetadas com ARNsh (C) . Complexos proteína-AND foram separados num gel de poliacrilamida 6%, secos e auto-radiografados. É mostrada acima a atividade de ligação ao ADN específica de extratos nucleares preparados a partir das células transfetadas com ARNsh indicadas. A posição da sonda livre é mostrada. A FIGURA 6 mostra que o knockdown por ARNi da expressão de uPA-uPAR anula o crescimento tumoral num modelo de tumor de próstata de ratinho ortotópico. Imagens representativas in situ de cada grupo de tratamento de ratinhos portadores de tumores PC3 ortotópicos (A). O tumor de próstata primário é rotulado com setas tracejadas e setas sólidas indicam a posição das metástases. Células PC3 foram transplantadas intraprostaticamente em ratinhos nus e tumores de próstata PC3 estabelecidos foram tratados com ARNsh específico para uPA, uPAR e uPAuPAR. Após 4 semanas de tratamento destas construções, os ratinhos foram sacrificados e avaliados em relação ao crescimento do tumor de próstata primário e metástases visualmente. Uma comparação de tumores de próstata dissecados de cada grupo de tratamento com ARNsh (B). Cada barra representa o peso médio do tumor DP de seis animais por grupo. Diferenças significativas em relação aos grupos controlo (isto é, mock ou tratados com EV/SV) estão representadas por asteriscos * (P <0,05). Amostras de proteínas extraídas de tumores de próstata PC3 de seis animais por grupo foram analisadas utilizando immunoblotting para níveis de expressão de uPA e uPAR (C) . GAPDH foi incluída como um controlo de carga. A FIGURA 7 demonstra que o knockdown por ARNi da expressão de uPA e uPAR anula simultaneamente o crescimento tumoral num modelo de tumor de próstata de ratinho ortotópico. Imagens representativas in situ de cada grupo de tratamento de ratinhos portadores de tumores PC3 ortotópicos (A) . 0 tumor de próstata primário é rotulado com setas tracejadas e setas sólidas indicam a posição das metástases. Células PC3 foram transplantadas intraprostaticamente em ratinhos nus e tumores de próstata PC3 estabelecidos foram co-injetados com ambos os vetores sh-upA e sh-uPAR. Após 4 semanas de tratamento destas construções, os ratinhos foram sacrificados e avaliados em relação ao crescimento do tumor de próstata primário e metástases visualmente. Uma comparação de tumores de próstata dissecados de cada grupo de tratamento com shRNA (B) . Cada barra representa o peso médio do tumor DP de seis animais por grupo. Diferenças significativas em relação aos grupos controlo (isto é, mock ou tratados com EV/SV) estão representadas por asteriscos * (P <0,05) .

Amostras de proteínas extraídas de tumores de próstata PC3 de seis animais por grupo foram analisadas utilizando immunoblotting para níveis de expressão de uPA e uPAR (C). GAPDH foi incluída como um controlo de carga. Secções representativas de hematoxilina e eosina dos tumores de ratinho de próstata PC3 ortotópicos (D) . Tumores de próstata primários foram colhidos de cada grupo de tratamento à conclusão da experiência. Tumores foram fixados em formalina e embebidos em parafina. Secções de tecido (5 m) foram preparadas e coradas com H e E para análise histopatológica. Coloração DNA fragEL de secções de parafina microdissecadas de tumores de próstata estabelecidos dos grupos de tratamento indicados (E). Ensaios de rotulagem de extremidades de fragmentos de ADN foram realizados. Os resultados são mostrados a uma amplificação de 40X com exceção da caixa, que é a uma amplificação de 200X. Diagrama de barras que mostra dados quantitativos de células rotuladas com DNA fragEL de seus campos aleatórios por grupo de tratamento (F) . Diferenças significativas em relação aos grupos controlo são indicadas por asteriscos * (P <0,05) . A FIGURA 8 mostra uma representação esquemática da expressão de siRNA para uPAR e MUMP-9 a partir do vetor pUM. Construções de plasmideo pcDNA 3 foram desenvolvidas com duas repetições invertidas complementares conduzidas por um promotor CMV dirigido contra uPAR e MMPs-9. O promotor CMV conduz a formação de uma estrutura em forma de gancho dual que, por sua vez, é processada pela enzima DICER que reconhece o ARN de cadeia dupla para formar moléculas de ARNsi viáveis. A estabilidade da molécula em forma de gancho dual é assegurada por causa da estrutura secundária da molécula que lembra uma molécula de ARNm com uma cauda poli A conduzida por uma sequência sinal poli-a da hormona de crescimento bovina (BGH).

A FIGURA 9 ilustra se ARN em forma de gancho (hp) longo são processados para ARNsi, moléculas foram transfetadas em células SNB19 com controlo/EV, SV, puPAR, pMMP-9 e pUM; as células também foram transfetadas com uma construção não relacionada dirigida a GFP em células não GFP para determinar o processamento de moléculas de ARNsi apropriadas. Pequenas moléculas de ARN fracionadas num gel de agarose 2% foram permitidas hibridizar com oligo senso rotulado com DIG apropriado na presença de 6xSSC. A solução híbrida resultante foi corrida num gel de poliacrilamida 15% e eletroblotada numa membrana de náilon. A membrana foi processada para visualizar o híbrido ADN:ARN com 21pb conforme as intruções do fabricante. As sondas utilizadas são representadas como números (ver Quadro 1), 1-suPAR, 2-SMMP-9 e 3-sGFP (FIGURA 9A). Células SNB19 foram transfetadas com controlo/EV (via a), SV (via b), puPAR (via c), pMMP-9 (via d) e pUM (via e) conforme protocolos padrão conhecidos daqueles habilitados na arte. 72 h mais tarde, o ARN total foi isolado e ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando um kit de síntese de ADNc (Invitrogen) (FIGURA 9B) . A reação de PCR foi montada utilizando o ADNc de primeira cadeia como o molde para uPAR e Mump-9; PCR para GAPDH também foi montada para servir como controlo de carga (ver Quadro D · A FIGURA 10 caracteriza a análise Western blot para uPAR e zimografia em gelatina para MMP-9. Células SNB19 foram transfetadas com mock, um vetor vazio/misturado e um vetor que codifica ARNsi único ou bicistrónico para uPAR e Mump-9 (puPAR, pMMP-9, pUM) . (A) Análise Western blot de expressão de proteínas uPAR em lisados celulares de células SNB19 transfetadas com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM. Análise Western blot Western blot foi realizado utilizando um anticorpo específico para uPAR. GAPDH foi simultaneamente imuno-detetada para verificar a carga de quantidades semelhantes de lisados celulares. (B) Meios condicionados contendo quantidades iguais de proteína (20 pg) de células transfetadas de EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM foram misturados com tampão de amostra Laemmli e corridos em géis SDS-PAGE 10% contendo 0,1% gelatina para determinar a atividade de MMP-9 por zimografia em gelatina. A FIGURA 11 demonstra que regulação para baixo mediada por ARNi de uPAR e MUMP-9 reduz proliferação de células de glioma SNB19. Em suma, 5xl04 células SNB19 transfetadas com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pCM foram semeadas em microplacas com 96 poços revestidas com VN em condições livres de soro. 0 número de células viáveis foi avaliado por ensaio MTT. A FIGURA 12 ilustra que ARNi reduziu SPAR e níveis de MMPs-9 conforme mostrado por análise imuno-histoquímica e angiogénese induzida por tumor. (A) Células SNB19 foram transfetadas com EV, SV, puPAR, pMMP-9 e pUM. Células controlo ou não transfetadas foram também utilizadas. 72h após a transfeção, as células foram fixas e processadas para visualizar a expressão de uPAR e MMP-9 in vivo. As células foram montadas utilizando meios de montagem com DAPI para visualizar o núcleo. (B) Células SNB19 (2xl04) foram semeadas em lâminas de câmaras com 8 poços e transfetadas com mock EV, puPAR, pMMP-9 e pUM. Após 24 h de incubação, o meio foi removido e as células foram co-cultivadas com 4xl04 células endoteliais dérmicas microvasculares humanas. Após 72 h, as células endoteliais foram sondadas com anticorpo para antígeno do fator VIII ou coloração com H e E e examinadas sob um microscópio a laser de varrimento confocal. (C) Quantificação de angiogénese em co-cultivos transfetados com mock EV, puPAR, pMMP-9 e vetor pUM ou vetor pUM. Os valores são média ± DP de três experiências diferentes. Inibição da angiogénese tumoral no vetor pUM por ensaio de janela dorsal em ratinho (D) . PV, vasculatura pré-existente, TN, tumor induz vasculatura. A FIGURA 13 demonstra que ARNsi para uPAR e MMP-9 inibe invasão de células SNB 19. Células SNB19 (13106) transfetadas com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM foram permitidas migrar através de inserções trans-poço revestidas com Matrigel (poros com 8-ym pores) durante 24 h. As células que invadiram através das inserções trans-poço revestidas com Matrigel foram coradas, contadas e fotografadas sob um microscópio ótico a uma amplificação de 20X. (A) A percentagem de invasão foi quantificada. Os valores são média ± DP de cinco experiências diferentes (P < 0,001). Esferóides de células SNB19 (fluorescência) de 100-200 ym de diâmetro foram selecionados, transfetados com EV/SV, puPAR, puMMP-9 e pUM e co-cultivados com agregados cerebrais fetais de ratazana (fluorescência verde). Destruição progressiva de agregados cerebrais fetais de ratazana e invasão de células SNB19 foi observada durante 72 h utilizando microscopia de varrimento a laser confocal. (C) . Os volumes restantes dos agregados cerebrais ou esferóides tumorais às 24, 48 e 72h foram quantificados utilizando programa de análise de imagem (D). A FIGURA 14 analisa regressão mediada por ARNi de intracerebral pré-estabelecido no crescimento tumoral. Células de glioblastoma SNB19-GFP foram injetadas intracerebralmente (2xl06 células em 10 μΐ solução salina de tampão fosfato) em ratinhos nus. Após 10 dias, mock EV, puPAR, pMMP-9 e pUM (150 yg de cada vetor foram injetados no cérebro utilizando mini bombas Alzet à taxa de 0,25yl/h (oito ratinhos em cada grupo). Secções de tumor fotomicrografadas foram examinadas por fluorescência GFP (A) e subsequentemente coradas com hematoxilina e eosina (B) . Semi-quantificação de volume de tumor em grupos tratados com mock EV, puPAR, pMMP-9 e vetor pUM após 4-6 semanas após injeção intracranial destas células (C) . Dados mostrados são valores ± DP de oito animais por cada grupo. Noutro conjunto de experiências, 10 dias após injeção intracerebral de células SNB19 GFP, vetor pUM foi injetado intraperitonealmente duas vezes a um intervalo de 3 dias e os animais foram sacrificados após 4 meses. A FIGURA 15 mostra que a regulação para baixo mediada por ARNi de uPAR e MMP-9 reduz a fosforilatina de ERK, MAPK e AKT. Análise Western blot de formas total e fosforilada de MAPK, ERK e AKT. Células SNB19 foram transfetadas com EV/SV, puPAR, MMP-9 e pUM em placas revestidas com VN em condições livres de soro células foram lisadas 72 h mais tarde e sujeitas a SDS-PAGE e immunoblotting com as formas total e fosforilada de anticorpos MAPK, ERK e AKT. Anticorpos GADPH foram utilizados para verificar que quantidades semelhantes de proteína foram carregadas em cada via. A FIGURA 16 é uma apresentação esquemática de uPAR e vetor MMPs-9 (A) e eventos celulares na superfície da célula (B) . Após ativação do plasminogénio em plasmina, que, por sua vez, ativa MMPs, libertação uPA de vários fatores de crescimento após degradação de ECM. A apresentação esquemática demonstrou o envolvimento de integrinas em várias moléculas de via de sinalização. A FIGURA 17 é uma representação esquemática que mostra a formação de moléculas ARNg a partir de uma única construção repetição invertida dual conduzida por CMV para catepsina B e uPAR. 0 promotor virai CMV conduz a formação de uma colécula de ARN que possui repetições invertidas auto-complementares para catepsina B e uPAR. A FIGURA 18 mostra análise Western blot para uPAR e catepsina B. Células SNB19 foram transfetadas com mock, um vetor vazio e um vetor que codifica ARNsi para catepsina B e uPAR (pCU) . Foi realizada análise Western blot de níveis de catepsina B (A) proteína uPAR (C) em lisados celulares de células SNB19 transfetadas com mock, vetor vazio e pCU utilizando urn anticorpo específico para catepsina B e uPAR β-actina foi simultaneamente imuno-sondada para controlo de carga. Quantificação de catepsina B (B) e proteína uPAR (D) foi obtida digitalizando os auto-radiogramas com densitometria. A FIGURA 19 mostra que ARNi inibe a formação de redes capilares induzidas pelas células tumorais. Células SNB19 foram transfetadas com mock, vetor vazio, pC, pU e pCU durante 24h. Depois, as células foram co-cultivadas com células endoteliais dérmicas humanas durante 48h. Após incubação, as células foram fixas e bloqueadas com 2% albumina do soro bovino durante 1 hr e células endoteliais foram sondadas com anticorpo para antígeno do fator VIII. (Anticorpo do fator VIII, DAKO Corporation, Carpinteria, California) ou coloração com H e E e examinadas sob um microscópio confocal de varrimento a laser (A) . Quantificação da angiogénese em co-cultivos infetados com mock, vetor vazio ou vetor pCU (B). Inibição da angiogénese tumoral em células SNB19 infetadas com vetor pCU por ensaio da janela dorsal em ratinho (C) . Vasculatura pré-existente a PV, Vasculatura induzida por tumor TN. A FIGURA 20 demonstra que o ARNi inibe a migração e invasão das células de glioma. Esferóides SNB19 GFP form infetados com mock, vetor vazio, pC, pU e pCU. Após 72 h, esferóides únicos de glioma foram colocados no centro de um poço revestido com vitronectina numa placa com 96 poços e cultivados durante 48 h. No final do ensaio de migração, os esferóides foram fixos e fotografados (A) . A migração das células dos esferóides foi medida utilizando um microscópio calibrado com micrómetro ocular e um palco (B) . Os dados mostrados foram o valor médio ± DP dos resultados de quatro experiências independentes de cada grupo. Células SNB19 foram tripsinizadas 72 h após transfeção com mock, vetor vazio, pC, pU e pcU, lavadas com PBS e re-suspensas em meio livre de soro. Foram realizados ensaios de invasão numa unidade trans-poço com 12 poços (Costar, Cambridge, Massachusetts) em filtros de policarbonato com poros de 8-pm revestidos com Matrigel. Após um período de incubação de 24h, as células que passaram pelo filtro para os poços inferiores foram coradas, contadas e fotografadas num microscópio ótico (C) . A percentagem de invasão foi quantificada (D) . Os valores são média ± DP de 5 experiências diferentes (P<0,001) . Esferóides de células SNB19 foram transfetados com mock, vetor vazio, pC, pU e pcU e corados com Dil e co-cultivados com agregados cerebrais fetais de ratazana corados com DiO. Foi observada a destruição progressiva de agregados cerebrais fetais pelos esferóides tumorais (E) . Quantificação dos agregados cerebrais fetais remanescentes pelos esferóides SNB19 infetados com vetor vazio, pC, pU ou vetor pCU (F) . A FIGURA 21 mostra que o ARNi mediou a regulação para baixo de uPAR e Catepsina B reduz a proliferação de células de glioma SNB 19. Ensaio de proliferação. Em suma, 5xl04 células SNB19 transfetadas com PBS, EV, SV, pU, pC e pCU foram semeadas em microplacas com 96 poços revestidas com VN em condições livres de soro. 0 número de células viáveis foi avaliado pelo ensaio MTT. São mostrados os valores médios (± DP) de três experiências separadas. A FIGURA 22 ilustra que o ARNi mediou a regulação para baixo de uPAR e Catepsina B reduz a fosforilação de ERK e FAK. Análise Western blot de ERK, FAK total e fosfo, proteínas utilizando os seus anticorpos específicos após transfeção de células SNB19 com construções mock, EV, SV, pU, pC e pCU. Os níveis de β-actina serviram como o controlo de carga. A FIGURA 23 mostra a regressão medida por ARNi de crescimento tumoral pré-estabelecido. Células tumorais SNB19 GFP foram injetadas intracerebralmente com a ajuda de uma estrutura estereotática em ratinhos nus. Após 1 semana, ou um vetor vazio ou um vetor que expressa ARNsi para catepsina B e uPAR (pCU) ou separadamente por pC ou pU foi injetado no cérebro utilizando uma mini bomba osmótica Alzet. Secções do tumor fotomicrografadas foram observadas para fluorescência GFP (A) e subsequentemente coradas com hematoxilina e eosina (B). Semiquantificação do volume do tumor em grupos tratados com mock/vetor vazio, pU, pC e vetor pCU após 5 semanas. Os dados mostrados são os valores médios ± DP de 6 animais de cada grupo (*P<0,001) (C). A FIGURA 24 é um esquema da formação de moléculas ARNg a partir de uma única construção repetição tri-invertida, conduzida por CMV para uPAR, uPA e MMP-9. O poderoso promotor virai CMV conduz a formação de uma molécula de ARN que possui repetições invertidas auto-complementares para uPA, uPAR e MMP-9. A FIGURA 25 é um Western blot, zimografia fibrina/gelatina e análise imuno-histoquímica de uPA e MMP-9. Células SNB19 ou foram transfetadas com mock ou transfetadas com um vetor vazio/vetor misturado (EV/SV) e vetores que codificam ARNsi uPAR (puPAR), uPA (puPA) , MMP-9 (pMMP-9) e uma combinação dos três juntos (ptbM). Após um período de incubação de 3 dias, os lisados celulares totais foram preparadas em tampão de extração e 50 pg de proteína destas amostras foram separados por 12% SDS-PAGE não redutor e submetidos a immunoblotting com anticorpo anti-uPAR (A) . GAPDH foi imuno-sondado simultaneamente como um controlo de carga. Foi colhido meio condicionado destas amostras (20 pg) e foi realizada zimografia com gelatina e fibrina para detetar atividade de MMP-9 (B) e uPA (C). (D) Células SNB19 (lxlO4) foram semeadas em lâminas de câmara Lab-Tek II e transfetadas com mock ou transfetadas com EV/SV e vetores que codificam ARNsi puPA, puPAR e pMMP-9 isolados ou em conjunto (pU2M) . Após 72 horas, as células foram fixas, lavadas durante 1 hora com tampão bloqueador e coradas para expressão de uPAR, uPA e MMP-9 utilizando anticorpos específicos para uPA, uPAR e MMP-9. A FIGURA 26 ilustra a inibição de angiogénese e invasão de glioma por construções de ARNsi. Células SNB19 (2xl04) foram semeadas em lâminas de câmara com 8 poços e transfetadas com EV/SV e vetores que codificam ARNsi uPAR (puPAR), uPA (puPA), MMPs-9 (pMMP-9) e uma combinação dos três juntos (pU2ND. Após um período de incubação de 24 horas, o meio foi removido, as células foram co-cultivadas ou com 4xl04 células endoteliais humanas ou com 4xl04 células endoteliais isoladas e foram crescidas na presença de meios condicionados. Após 72 horas, as células endoteliais foram coradas para o antígeno do fator VIII nos co-cultivos (fluorescência verde). As células crescidas nos meios condicionados preservados foram coradas com H e E e examinadas ou sob um microscópio florescente ou sob um microscópio de campo claro (A) . (B) Quantificação da angiogénese em co-cultivos infetados com vetores EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M. Os valores são média ± DP de quatro experiências. Células SNB19 foram tripsinizadas 72 horas após transfeção com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M, lavadas com PBS e re-suspensas em meio livre de soro. (C) Foram realizados ensaios de invasão numa unidade trans-poço com 12 poços em filtros de policarbonato com poros de 8-pm revestidos com matrigel (0,7 mg ml-1) . Após um período de incubação de 24 horas, as células que passaram pelo filtro para os poços inferiores foram coradas, contadas e fotografadas num microscópio de campo claro. (D) A percentagem de invasão foi quantificada. A FIGURA 27 mostra a inibição e regressão da capacidade de invasão e crescimento tumoral por ARNsi por ensaios esferóide e intracranial. (A) A capacidade de invasão de esferóides de glioma foi medida co-cultivando esferóides de glioma com agregados cerebrais fetais de ratazana. Esferóides de células SNB19 foram transfetados com EV/SV, puPA, puPAR, pMMP-9 e pU2M e corados com Dil e co-cult ivados com agregados cerebrais fetais de ratazana corados com DiO. Foram obtidas secções em série com espessura de l-pm a partir da superfície através do centro dos co-cultivos com um microscópio de varrimento a laser confocal nos pontos temporais indicados. (B) Foi medido o volume restante dos agregados cerebrais de ratazana transfetados com EV/SV, puPA, puPAR, pMMP-9 e pU2M. Os valores são média ± DP de três experiências. (C,D) Regressão mediada por ARN de crescimento tumoral pré-estabelecido. Células SNB19 GFP em suspensão (2xl05 em 10 μΐ de meio livre de soro) foram injetadas intracranialmente. Uma semana mais tarde, os ratinhos foram injetados ou com EV/SV ou com vetores que expressam ARNsi (puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M) utilizando uma mini bomba osmótica Alzet (construções diluídas para 1,5 pg ml-1 em PBS e injetados a 0,25 pg hora-1, com seis ratinhos em cada grupo) . Após um período de seguimento de 5 semanas, os ratinhos foram sacrificados, os seus cérebros removidos, embebidos em parafina e seccionados. As secções foram observadas sob microscopia de fluorescência para células que expressam GFP. (D) Semi-quantificação do volume do tumor em grupos controlo, tratados com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M foi avaliada após 5 semanas. Dados mostrados são média ± DP de seis animais de cada grupo. A FIGURA 28 demonstra que a regulação para baixo mediada por ARNi de uPAR, uPA e MMP-9 reduz a fosforilação de ERK. Análise Western blot de proteína total e fosforilada ERK (pERK) após transfeção de células de glioblastoma com construções EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M. Níveis de GAPDH serviram como controlo de carga. A FIGURA 29 é uma representação esquemática da expressão de ARNsi para catepsina B e MMP-9 do vetor pCM: foram desenvolvidas construções do plasmídeo pCDNA 3 com duas repetições invertidas complementares conduzidas por um promotor CMV dirigido contra catepsina B e MMP-9. 0 promotor CMV leva à formação de uma estrutura em forma de gancho dual que, por sua vez, foi processada pela enzima DICER que reconhece ARN de cadeia dupla para formar moléculas de ARNsi viáveis. A estabilidade da molécula em forma de gancho dual foi assegurada, por causa da estrutura secundária da molécula que é reminiscente de uma molécula de ARNm com uma cauda poli A conduzida por uma sequência sinal poli A da hormona de crescimento bovina (BGH). A FIGURA 30 confirma que o ARN de interferência diminuiu os níveis de catepsina B e MMP-9 em células SNB19. Lisados celulares totais e meio livre de soro foram colhidos de células SNB19 transfetadas com mock, vetor vazio ou um vetor que codifica ARNsi para MMP-9 (pM) e catepsina B (pC) e juntos (pCM). Subsequentemente, 30 pg de proteína destas amostras foram separadas em condições não redutoras em 8% a 12% SDS-PAGE e transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram sondadas com anticorpos para Catepsina B (A) e MMP-9 (C) e com anticorpo secundário apropriado (conjugado de peroxidase de raiz-forte) e desenvolvido de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham, Arlington Heights, Illinois). β-actina foi simultaneamente imunodetetada para verificar a carga de quantidades semelhantes de lisados celulares. A atividade de MMPs-9 de células SNB19 infetadas com vetor vazio, vetor pC, pM ou pCM durante 3 dias em meio livre de soro e foram determinadas por zimografia em gelatina (B). A FIGURA 31 mostra que ARNi inibe a formação de redes capilares induzida pelas células tumorais. Células SNB19 foram transfetadas com mock, vetor vazio, pM, pC e pCM durante 24h. Depois, as células foram co-cultivadas com células endoteliais dérmicas humanas durante 48h. Após incubação, as células foram fixas e bloqueadas com 2% albumina do soro bovino durante 1 hr e as células endoteliais foram sondadas com anticorpo pata antigeno do fator VIII. (Anticorpo do fator VIII, DAKO Corporation, Carpinteria, California) e examinadas sob um microscópio fluorescente após sondagem com um anticorpo secundário conjugado FITC apropriado. Células endoteliais crescidas na presença de meios condicionados com SNB19 (controlo, vetor vazio, transfetadas com PM, pC, ou pCM) foram coradas com H e E e fotografadas (A). Quantificação da angiogénese em co-cultivos infetados com mock, vetor vazio ou vetor pCM (B). Inibição da angiogénese tumoral em células SNB19 infetadas com vetor pCM por ensaio de dobra da pele do dorso em ratinho (C) . Vasculatura pré-existente a PV, Vasculatura induzida por tumor TN. As fotografias foram tiradas utilizando microscopia ótica (painel superior) e para fluorescência FITC (painel inferior) para determinar a presença de vasculatura desenvolvida recentemente. A FIGURA 32 demonstra que o ARNi inibe a migração e invasão das células de glioma. Esferóides SNB19 GFP foram infetados com mock, vetor vazio e um vetor que codifica ARNsi para catepsina B e MMP-9 (pCM). Após 3 dias, esferóides de glioma únicos foram colocados no centro de um poço revestido com vitronectina numa placa com 96 poços e cultivados durante 48 h. No final do ensaio de migração, os esferóides foram fixos e fotografados (A) . Células SNB19 foram tripsinizadas 3 dias após transfeção com mock, vetor vazio e um vetor que codifica ARNsi para catepsina B e MMP-9 (pCM), lavadas com PBS e re-suspensas em meio livre de soro. Foram realizados ensaios de invasão numa unidade trans-poço com 12 poços (Costar, Cambridge, Massachusetts) em filtros de policarbonato com poro de 8-ym revestidos com Matrigel. Após um período de incubação de 24h, as células que passaram pelo filtro para os poços inferiores foram coradas, contadas e fotografadas sob um microscópio ótico (B). Esferóides de células SNB 19 foram transfetados com mock, vetor vazio e um vetor que codifica ARNsi para catepsina B e MMP-9 (pCM) e corados com Dil e co-cult ivados com agregados cerebrais fetais de ratazana corados com DiO. Foi observada a destruição progressiva dos agregados cerebrais fetais pelos esferóides tumorais (C) . A FIGURA 33 mostra regressão mediada por ARNi de crescimento tumoral pré-estabelecido. Células tumorais SNB19 GFP foram injetadas intracerebralmente com a ajuda de uma estrutura estereotática em ratinhos nus. Após 1 semana, ou um vetor vazio ou um vetor que expressa ARNsi para catepsina B e MMP-9 (pCM), catepsina B (pC) ou MMP-9 (pM) foi injetado no cérebro utilizando uma mini bomba osmótica Alzet. Foram observadas fotografias das secções do tumor para fluorescência GFP (A) e subsequentemente coradas com hematoxilina e eosina (B) . Foi feita a semiquantificação do volume do tumor em grupos tratados com mock/vetor vazio, pM, pC e vetor pCM após 5 semanas. Os dados mostrados são valores médios ± DP de 6 animais por cada grupo (*P<0,001) (C) . Noutra experiência, 10 dias após a injeção intracerebral, o vetor pCM foi injetado intraperitonealmente duas vezes e os animais foram sacrificados após 4 meses (D). A FIGURA 34 é uma representação esquemática do promotor ARN pol II (CMV) para a indução de ARNi. A FIGURA 35 é uma representação esquemática do promotor com base em ARN pol III (U6) para a indução de ARN i. A FIGURA 36 é uma representação esquemática da produção de adenovirus recombinantes. A FIGURA 37 indica células SNB19 GFP transfetadas com ARNi para GRP ou mock mostrando a expressão de GRP. A FIGURA 38 mostra a expressão de OAS em células SNB 19 transfetadas com vetores ARNi conduzidos por ARN pol II (CMV) ou ARN pol III (U6) foi determinado por RT-PCR. RT-PCRT para GAPDH serviu como controlo. A FIGURA 39 demonstra a regulação para baixo de uPAR e uPA conforme determinado por análise Western blot e zimografia em fibrina de lisados celulares SNB 19 de células transfetadas ou com U6 ou com promotores conduzidos por CMV. Plasmideos ARNi para vetor misturado (SV), plasmideo que expressa ARNi para uPAR (puPAR), uPA (puPA) e construção bicistrónica uPAR-uPA (pU2). GAPDH foi sondado para controlo de carga. A FIGURA 40 é uma representação esquemática de construções de expressão de ARNsi utilizados para determinar a indução de resposta imunitária celular. A FIGURA 41 mostra a determinação da expressão da sintetase 2'5' -oligoadentiato (0AS1) em células SNB19 transfetadas com cassete de expressão circular (C) , linear (L) ou com sinal poli A deletado (ΔΑ) para vetor vazio (EV), vetor misturado (SV), construções de expressão de ARNsi para uPAR (puPAR) , uPA (puPA) e construção bicistrónica para uPAR e uPA (pU2) por RT-PCR. RT-PCR foi normalizado com GAPDH. A expressão de 0AS1 foi quantificada conform mostrado. A FIGURA 42 é uma representação esquemática da estrutura secundária prevista de transcritos EV e SV que não mostram estrutura tipo indutor de ARNi viável e transcrito puPAR, puPA e pU2 previsto com poli A e sem poli A pU2AA). A FIGURA 43 é uma representação esquemática da estrutura secundária parcial do transcrito pU2 que mostra estrutura secundária espaçada. A estrutura secundária espaçada não se parece em nada ao ARNm.

A FIGURA 44 mostra RT-PCR no ARN total isolado de controlo (C) , uPAR anti-senso (como uPAR), uPA anti-senso (como uPA) e construções de ARNi para uPAR (puPAR), uPA (puPA), uPAR-uPA (pU2), GFP (pGFP), vetor vazio (pEV) e vetor misturado (pSV) para níveis de uPA, uPAR e OAS ARN. GAPDH serviu como controlo. A FIGURA 45 mostra hibridização in situ do promotor CMV em ratinhos injetados IP. Secções do crânio de ratinhos injetados intraperitonealmente com solução salina (Mock), vetor vazio (EV), vetor misturado (SV), vetores de expressão de ARNi para uPAR (pu-PAR) , uPA (puPA) e construção bicistrónica uPAR-uPA (pU2) foram sondadas para a presença de ADN que contém o promotor CMV rotulando ADN sonda com fosfatase alcalina (AP). A atividade da AP foi detetada por substrato Western Blue AP (Promega, Madison, WI).

DESCRIÇÃO DETALHADA ARN em forma de gancho pequenos (ARNsh), também referidos como ARN interferentes pequenos (ARNsi), estão dirigidos a genes humanos, tais como uPA e uPAR para inibir o crescimento tumoral, invasão tumoral e proliferação tumoral. Construções de ARNsi inibiram de forma significativa a expressão de uPA e uPAR em ambos os níveis de ARNm e proteína numa linha de células de cancro da próstata altamente metastático PC3. 0 knockdown de uPA-uPAR em células PC3 resultou numa redução significativa da invasão de células tumorais conforme indicado, por exemplo, por um ensaio de invasão em Matrigel. 0 silenciamento simultâneo dos genes para uPA e uPAR utilizando uma única construção do plasmídeo que expressa ARNsh para ambos uPA e uPAR reduziu significativamente a viabilidade celular e também resultou na indução da morte celular apoptótica. ARNi para uPA e uPAR também anulou a sinalização de uPA-uPAR para moléculas alvo a jusante, tais como quinases reguladas por sinal extracelular 1/2 (ERK1/2) e o transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (Stat 3) . Injeção intratumoral com uma construção do plasmídeo que expressa ARNsh para uPA e uPAR inibiu significativamente crescimento e sobrevivência tumoral estabelecidos num modelo de cancro da próstata de ratinho ortotópico. Evidência de uma rede de sinalização que opera a jusante de uPA-uPAR que avança ativamente a invasão, proliferação e sobrevivência de células tumorais de células de cancro da próstata é revelada. 0 direcionamento dirigido por ARNi de uPA e uPAR e os ARNsi correspondents são agentes terapêuticos novos para terapêutica de cancro, incluindo cancros da próstata. A degradação de ARN alvo mediada por siRNA de uPAR e MMPs-9 em linhas de células de glioma humano resultou na inibição tumoral. ARNi dirigido para uPAR e MMP-9 conseguiu uma inibição específica de uPAR e MMPs-9. Uma construção bicistrónica (pUM) inibiu a formação de estruturas tipo capilares em ambos modelos in vitro e in vivo de angiogénese. Bloquear a expressão de uPAR e MMP-9 resultou na inibição significativa da invasão tumoral de glioma em modelos de ensaio de Matrigel e invasão de esferóides. ARNi para uPAR e MMP-9 inibiu a proliferação celular e reduziu os níveis de formas fosforiladas das moléculas de via de sinalização MAPK, ERK e AKT quando comparados com células SNB19 transfetadas com vetor vazio/vetor misturado (EV/SV) parental. Além disso, utilizando ARNi para atingir simultaneamente duas moléculas protease e injetar estas construções intracerebralmente in vivo utilizando mini bombas Alzet ou injeções intraperitoneais resultou na regressão significativa de crescimento tumoral intracerebral pré-estabelecido. A utilização de vetores de expressão de ARNsi em forma de gancho para uPAR e MMP-9 providencia uma ferramenta terapêutica eficaz para terapêutica de cancro, incluindo glioblastoma.

Noutra modalidade, a abordagem ARNi silenciou a expressão de uPAR e catepsina B. ARNi foi utilizado para inibir a expressão de proteases implicadas na degradação da matriz extracelular, uma caracteristica típica da progressão de tumor. ARNi de uPAR e catepsina B reduziu a invasão de células de glioma e angiogénese em modelos in vitro e in vivo. Injeções intratumorais de vetores plasmídeos que expressam ARNg (ARNsi) para uPAR e catepsina B resultaram na regressão de tumores intracranianospré-estabelecidos. ARNi para uPAR e catepsina B inibiu a proliferação celular e reduziu os níveis de pERK e pFAK quando comparados com os controlos. ARNi opera em células de glioma humano e providencia uma base para terapêutica de genes de cancro, incluindo glioblastoma. A abordagem ARNi silenciou a expressão de uPA, uPAR e MMP-9 em células tumorais. Um molde de ADN conduzido pelo promotor citomegalovírus (CMV) numa única construção tricistrónica induziu o ARNi despoletado por ARN em forma de gancho (ARNg) a inibir a expressão dos genes de uPA, uPAR e MMP-9 com uma única construção. Verificou-se que os níveis de proteína uPAR e atividade enzimática de uPA e MMP-9 diminuíram significativamente em células transfetadas com um plasmídeo que expressa ARNsi em forma de gancho para uPAR, uPA e MMP-9. Células SNB19 transfetadas com pU2M diminuíram significativamente a expressão de uPA, uPAR e MMP-9 comparado com células mock e transfetadas com EV/SV, determinado por análise imuno-histoquímica. As construções únicas para estas moléculas resultaram numa inibição específica dos seus respetivos níveis de proteínas, conforme demostrado por análise imuno-histoquímica. Após transfeção com um vetor plasmídeo que expressa ARNcd para uPA, uPAR e MMP-9, a invasão de células de glioma foi retardada comparado com os grupos tratados com mock e EV/SV, demonstrado pelo ensaio de invasão em Matrigel e pelo ensaio de invasão de esferóides. A regulação para baixo de uPA, uPAR e MMP-9 utilizando ARNi inibiu a angiogénese num modelo in vitro (co-cultivo). Injeções intratumorais diretas de ADN de plasmídeo que expressa ARNg para uPA, uPAR e MMP-9 também regrediram significativamente tumores intracranianos pré-estabelecidos em ratinhos nus. Células tratadas com ARNi para uPAR, uPA e MMP-9 mostraram níveis de pERK reduzidos comparados com células SNB 19 parentais e tratadas com EV/SV. A regressão simultânea de uPAR, uPA e MMP-9 é uma ferramenta terapêutica para tratar cancros.

Um ARN em forma de gancho (ARNg, ARNsi) AND conduzido pelo promotor de citomegalovirus (CMV) de uma única construção bloqueou a expressão de genes de MMP-9 e catepsina B. A transfeção de um vetor plasmídeo que expressa ARNcd para MMP-9 e catepsina B inibiu significativamente a expressão de MMP-9 e catepsina B e reduziu o comportamento invasivo da linha de células de glioblastoma SNB 19 em modelos de invasão em Matrigel e esferóides. A regulação para baixo de MMP-9 e catepsina B utilizando ARNi em células SNB 19 também reduziu a interação célula-célula de células endoteliais microvasculares humanas, resultando na interrupção da formação de rede de capilares em ambos modelos in vitro e in vivo. Injeções intratumorais diretas de ADN de plasmideo que expressa ARNg para MMP-9 e catepsina B inibiram significativamente o crescimento e invasão tumoral de glioma estabelecido em tumores intracranianos in vivo. Injeções intraperitoneais (ip) de ADN de plasmideo que expressa ARNg para MMP-9 e catepsina B regrediram completamente tumores pré-estabelecidos durante um período significativo. 0 direcionamento mediado por ARNi simultâneo de MMP-9 e catepsina B é uma metodologia de tratamento adequada para gliomas humanos. ARNg conduzidos pelo promotor CMV baseados em plasmideo dirigidos a uPAR, uPA e MMP-9, seja isoladamente ou em simultâneo, induz ARNi na linha de células de glioma humano SNB 19. A regulação para baixo mediada por ARNi simultânea de uPAR, uPA e MMP-9 em células de glioma humano SNB 19 causou: (1) Inibição da invasão e angiogénese in vitro. (2) Regressão de tumores intracranianos pré- estabelecidos em ratinhos nus in vivo. (3) Redução na fosforilaçãode moléculas de sinalização ERK 1 e 2. ARNsi ou ARNsh ou ARNg conduzidos a partir de um plasmideo circular (por exemplo, uPA, uPAR, MMP-9 e catepsina B ou qualquer combinação dos mesmos) é adequado para induzir ARN de interferência in vitro. ARNsi de plasmídeos circulares são estáveis e não induzem resposta imunitária indesejável, conforme demonstrado por indução de 0AS1. Construções lineares de uPA, uPAR, MMPs-9, e catepsina B ou qualquer combinação dos mesmos também são adequadas para induzir ARNi. ARNsi ou ARNsh ou ARNg revelados aqui incluem ácidos nucleicos que consistem essencialmente de sequências auto-complementares de uPA, uPAR, MMP-9, catepsina B ou uma combinação dos mesmos. A região alça e o espaçador (regiões intervenientes) podem variar ambas em comprimento e na sequência dependendo da sequência alvo, da construção e da utilização terapêutica. As moléculas de ácido nucleico reveladas aqui podem ser modificadas de forma apropriada com análogos, derivados de ácidos nucleicos ou qualquer outra modificação adequada para melhorar a estabilidade ou eficácia da indução de ARNi. As moléculas de ácido nucleico reveladas aqui também podem ser administradas em combinação com outros agentes ativadores imunes específicos de tumor, agentes dirigidos a tumor e quaisquer veículos ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis adequados. As moléculas de ácido nucleico reveladas aqui também podem ser administradas em conjunto com outras terapêuticas de cancro, tais como terapêutica de radiação ou quimioterapêutica.

EXEMPLOS

Exemplos que não estão cobertos pelas reivindicações são para fins ilustrativos apenas.

Exemplo 1. Expressão de proteínas uPA e uPAR endógenas está associada com a capacidade de invasão in vitro de células de cancro da próstata humano. Células PC3 são altamente metastáticas, ao passo que células DU145 e LNCaP são moderadamente e fracamente metastáticas, respetivamente. uPA e o seu recetor uPAR estão envolvidos na invasão tumoral e metástase. Os níveis destas proteínas nas três linhas de células de cancro da próstata humano com diferentes potenciais metastáticos foram comparados. Conforme mostrado na FIGURA IA, os níveis de proteínas uPA e uPAR foram significativamente superiores em células PC3 e DU145 quando comparados com as células LNCaP fracamente metastáticas, que expressaram níveis indetetáveis destas proteínas. Uma tendência semelhante foi observada na atividade de uPA conforme avaliado por zimografia em fibrina (FIGURA 1B) . Assim, os níveis de proteínas uPA e uPAR, bem como a atividade de uPA, estiveram correlacionados positivamente com o seu potencial metastático conhecido. A capacidade das células de cancro da próstata de invadirem Matrigel, uma camada de gel composta de proteínas da membrana basal, foi examinada. Este ensaio é um modelo in vitro bem estabelecido para avaliar a capacidade de invasão de tumores. A linha de células de cancro da próstata altamente metastática PC3 mostrou os níveis mais elevados de capacidade de invasão seguida das linhas de células DU145 e LNCaP, uma ordem consistente com os seus potenciais metastáticos conhecidos (FIGURAS 1C e 1D). Células PC3 foram 14 vezes mais invasivas e DU145 foram 9 vezes mais invasivas que as células LNCaP. Foi demonstrada uma forte correlação entre os níveis de proteínas uPA e uPAR e a capacidade invasiva das células de cancro da próstata humano com potenciais metastáticos diferentes. Linhas de células PC3 e DU145 foram mais invasivas do que as células LNCaP, consistente com os seus potenciais metastáticos conhecidos. Existe uma forte correlação entre os padrões de expressão de uPA e uPAR e o potencial invasivo das linhas de células de cancro da próstata utilizadas (FIGURA 1) . A expressão potenciada de uPA e uPAR em linhas de células de cancro da próstata está associada com capacidade de invasão e potencial metastático aumentados.

Exemplo 2. Knockdown eficaz de expressão de genes de uPA e uPAR em células de cancro da próstata PC3 humano utilizando ARNi. 0 papel biológico de uPA e uPAR na progressão do tumor da próstata foi investigado utilizando ARN em forma de gancho pequenos para derrubar a expressão de genes uPA e uPAR endógenos na linha de células de cancro da próstata humano PC3, que expressa uPA e uPAR, bem como um elevado potencial metastático. Vetores pcDNA3-CMV foram desenvolvidos contendo construções em forma de gancho pequenas capazes de gerar oligonucleotideos de ARNi duplex com 19 ou 21 nucleotideos correspondendo a uPA ou uPAR. Além disso, uma única construção bicistrónica conduzida pelo promotor citomegalovirus (CMV) para entregar pequenos ganchos duais dirigidos contra ambos uPA e uPAR foi construída para testar a eficácia de inibir simultaneamente a expressão de dois genes endógenos (FIGURA 2A). Os vetores que expressam ARNsh para uPA, uPAR e a combinação uPA-uPAR foram transfetados para células PC3.

Conforme mostrado na FIGURA 2B, a análise das células transfetadas com ARNsh para expressão de uPA e uPAR através de PCR-transcrição reversa semi-quantitativa demonstrou uma redução específica nos níveis de ARNm para cada gene em relação às células transfetadas com EV/SV ou células mock. Contudo, o efeito de ARNi foi mais com o vetor ARNsh dirigido simultaneamente a uPA e uPAR (FIGURA 2B) . Foi realizada análise immunoblot de extratos celulares para determinar se a expressão de ARNm diminuída, conforme observado, se correlacionava com tradução diminuída do produto génico. Uma tendência semelhante também foi observada por ensaio immunoblot (FIGURA 2C) . Não foram observados efeitos de ARNi na expressão de GAPDH, que foi utilizada como um controlo interno para especificidade e carga ao nível ARNm bem como ao nível proteico. Além disso, células transfetadas com EV/SV também mostraram que knockdown dirigido por ARNi de uPA e uPAR é especifico (FIGURAS 2B e 2C).

Além disso, os efeitos de ARNsh específicos de genes na expressão das proteínas uPA e uPAR foram detetados em células PC3 utilizando imunocoloração dupla com anticorpos anti-uPA e anti-uPAR. Conforme mostrado na FIGURA 2D, a coloração de uPA e uPAR foi drasticamente reduzida por ARNsh específicos de genes em comparação com células transfetadas com EV/SV. A imunocoloração dupla de uPA e uPAR foi totalmente diminuída em células transfetadas com sh-uPAuPAR (FIGURA 2D) . Por outro lado, as células PC3 transfetadas com EV e SV exibiram uma intensidade e padrão de coloração semelhante que as células mock. Estes estudos de imunofluorescência confirmaram as análises RT-PCR e immunoblot. A inibição simultânea de dois genes utilizando um sistema ARNsi baseado em plasmídeo é uma ferramenta útil. ARNi regulou para baixo eficazmente ARNm de uPA e uPAR, bem como a expressão proteica na linha de células de cancro da próstata PC3 (FIGURAs 2B e 2C) . Estes plasmídeos de ARNi específicos de genes reduziram a expressão de uPA e uPAR substancialmente quando comparados com células mock ou transfetadas com EV/SV. Dados de coloração imuno-histoquímica mostraram que células mock ou transfetadas com EV/SV revelaram coloração positiva para uPA e uPAR, ao passo que células transfetadas com sh-uPAuPAR mal coraram, com a exceção da coloração nuclear DAPI, o que sugere o knockdown da expressão das proteínas uPA e uPAR (FIGURA 2D) . Da mesma forma, a intensidade da imunocoloração para uPA e uPAR foi reduzida por ARNi específico de gene.

Exemplo 3. Knockdown da expressão de uPA e uPAR por ARN inibiu invasão em matrigel de células PC3.

Uma das funções de uPA e uPAR é promoção da invasão, um processo necessário para a metástase tumoral. 0 impacto do knockdown de uPA e uPAR na invasão celular de PC3 foi avaliado por um ensaio de invasão em Matrigel utilizando as células transfetadas com ARNsh. Quando comparadas com as células mock ou células transfetadas com EV/SV, as células transfetadas com sh-uPAuPAR mostraram uma redução substancial na capacidade invasiva (FIGURA 3A). Invasão das células PC3 foi reduzida para 75% da daos controlos (isto é, mock ou células transfetadas com EV/SV) por sh-uPA e para 90% por sh-uPAuPAR (FIGURA 3B). Apesar do knockdown de uPAR isoldo não ter mostrado uma redução significativa na invasão, o knockdown de uPA, bem como de uPAR tiveram um efeito significativo (FIGURAS 3A e 3B), o que sugere que a invasão das células PC3 para o matrigel é regulada substancialmente pela função coordenada de uPA e uPAR Estes resultados mostram que a expressão de uPA e uPAR é necessária para a invasão do cancro da próstata, bem como de metástase. 0 efeito sh-uPAuPAR foi significativo de tal maneira que as células mal puderam invadir através da membrana de matrigel, o que sugere que o ARNi interferiu significativamente com o sistema uPA-uPAR mediando a atividade proteolítica e a viabilidade celular.

Exemplo 4. Knockdown da expressão de uPA e uPAR por ARNi inibe a proliferação celular e induz apoptose.

Os efeitos do silenciamento de uPA e uPAR mediado por ARNi na proliferação e sobrevivência celular foram examinados por análise MTT 72 h após transfeção com ARNsh especifico de uPA e uPAR (FIGURA 4A) . 0 direcionamento de ARNi contra uPA não teve efeito na capacidade proliferativa das células PC3, ao passo que ARNi especifico de uPAR teve um pequeno efeito inibidor. Por outro lado, foi observada uma redução dramática na proliferação de células PC3 com ARNi dirigido simultaneamente a uPA e uPAR (FIGURA 4A). As percentagens de células viáveis foram reduzidas na presença de uPAR e uPA-uPAR ARNi em aproximadamente 30% e 60% em média, respetivamente, conforme comparado com as células controlo. Estes resultados sugerem que níveis aumentados de uPA e/ou uPAR em células tumorais podem dotar as células de capacidade de crescimento e sobrevivência potenciada. Como tal, reduzir os níveis de uPA e uPAR pode induzir a apoptose em células cancerígenas.

Para examinar esta possibilidade, células PC3 foram transformadas com plasmídeos que expressam sh-uPA, sh-uPAR ou sh-uPAuPAR Análise molecular de extratos proteicos de células PC3 revelaram que a transfeção de sh-uPAuPAR induziu genes pró-apoptóticos, incluindo Bax, Bc1-Xs/l caspase 9 (FIGURA 4B) . Além disso, coloração com tinta fluorescente de células PC3 transfetadas com sh-uPAuPAR com FAM-VAD-FMK revelou atividade de caspase potenciada que não foi detetada nem nas células mock nem nas células transfetadas com EV/SV (FIGURAS 4C e 4D). Análise de fragmentação do ADN providenciou evidência adicional de indução apoptótica. Tal como a FIGURA 4E indica, células PC3 transfetadas com sh-uPAuPAR exibiram DNA laddering, um distintivo típico da apoptose, em eletroforese em gel de agarose que não foi detetado nem em células mock nem em células transfetadas com EV/SV. Este DNA laddering foi semelhante ao da apoptose induzida pelo tratamento com actinomicina D (FIGURA 4E), confirmando, assim, que a morte celular observada foi um resultado de apoptose. Além disso, DNA laddering não foi observado em células transfetadas ou com sh-uPA ou com sh-uPAR. Estes resultados também estão de acordo com a indução da caspase 9 e atividade da caspase potenciada em geral conforme determinado por FAM-VAD-FMK. Exemplo 5. Knockdown da expressão de uPA e uPAR por ARNi inibe a sua sinalização a jusante e tumorigénese em ratinhos nus.

As consequências biológicas devido ao silenciamento de uPA e uPAR pode ser um resultado de alterações na sinalização mediada por uPA-uPAR e subsequentes funções a jusante. Uma vez que a expressão aumentada de uPA e uPAR ativa a sinalização de ERK1/2, foi examinado o estado das proteínas quinases ativadas por mitogénio em células knockdown uPA-uPAR. A análise immunoblot mostra que a fosforilação de ERK 1/2 foi completamente anulada nas células transfetadas com sh-uPAuPAR, mas não nas células controlo (FIGURA 5A). A fosforilação de ERK não se alterou nas células transfetadas ou com sh-uPA ou com sh-uPAR A atividade total, incluindo fosforilação, de Stat 3 foi substancialmente suprimida em células transfetadas com sh- uPAuPAR quando comparada com células controlo (FIGURA 5B). Além disso, ensaio de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA) com extratos nucleares de células transfetadas com sh-uPAuPAR demonstrou que o knockdown da expressão de uPA e uPAR inibiu a ligação dos extratos aos locais de ligação a Stat 3 rotulados (FIGURA 5C) . Dado que a ativação de Stat 3 contribui para o estímulo da via anti-apoptótica, o nível reduzido de fosfo-Stat 3, bem como a atividade de ligação ao AND, podem explicar a suscetibilidade aumentada de células PC3 transfetadas com sh-uPAuPAR à morte celular apoptótica. Em alternativa, a ativação de ERK constitutiva pode cotribuir para a sobrevivência celular.

Foi investigado se uPA-uPAR ARNi também suprimiria a tumorigenicidade de tumores ortotópicos PC3 pré-estabelecidos em ratinhos nus. Células PC3 foram inoculadas intraprostaticamente no lóbulo lateral da próstata. Nos dias 7 e 14 após a implantação, os tumores foram injetados com construções do plasmídeo que expressam sh-uPA, sh-uPAR ou sh-uPAuPAR Os ratinhos foram depois sacrificados 14-15 dias após a segunda dose de tratamento com ARNi, tal como necessitado pela morbidez resultante dos tumores que se formaram nos grupos controlo. A morfologia grosseira dos tumores primários e locais de metástase foram examinados (FIGURA 6A) . Não se observaram visualmente tumores secundários em ratinhos tratados com os plasmídeos sh-uPA, sh-uPAR e sh-uPAuPAR, ao passo que ratinhos tratados com EV, SV e mock apresentaram tumores secundários além do tumor primário dentro da glândula da próstata (FIGURA 6A). Os tumores foram dissecados e pesados (FIGURA 6B) . Uma incidência de 90-100% de tumores primários, bem como secundários foi observada em grupos mock, e tratados com EV e SV. Apesar dos tratamentos com sh-uPA e sh-uPAR não inibirem o crescimento tumoral completamente, os pesos das massas tumorais formadas a partir destes grupos de tratamento foram mais pequenas do que os tumores dos grupos de tratamento controlo (FIGURA 6B). Uma redução significativa no peso do tumor foi observada em ratinhos tratados com sh-uPAuPAR Análise immunoblot para níveis de proteínas em amostras de tumor confirmou que os tumores tratados com sh-uPAuPAR diminuíram significativamente os níveis de uPA e uPAR (FIGURA 6C). Além disso, 150 pg de sh-uPAuPAR regrediram completamente o cancro da próstata pré-estabelecido.

Foi realizada análise imuno-histoquímica nos tecidos tumorais embebidos em parafina colhidos para avaliar os efeitos de sh-uPAuPAR no comportamento in vivo das células PC3. A expressão de ARNi dirigida por sh-uPAuPAR não mudou a arquitetura geral da glândula da próstata e coloração com H e E mostrou em grande parte histologia normal, ao passo que a coloração revelou ambos tumor e células hospedeiras nos grupos controlo. ARNi dirigido contra uPA ou uPAR isolado reduziu ligeiramente células tumorais em relação aos grupos controlo. Supostamente, não houve resgate in vivo da apoptose induzida por uPA-uPAR ARNi. Para testar isto, as secções de tumor embebidas em parafina de todos os grupos de tratamento foram coradas para marcadores apoptóticos utilizando análise de fragmentação de ADN Klenow-FragEL. Esta rotulagem das extremidades para células apoptóticas demonstra diferenças significativas entre grupos de tratamento. Tumores de mock, EV e grupos tratados com SV mostraram coloração generalizada de baixo nível para FragEL, indicando, assim, que as células tumorais eram saudáveis. Por outro lado, a maioria das áreas dos tumores de próstata PC3 tratados com sh-uPAuPAR foram positivos para coloração Klenow.

Co-injeção intratumoral de sh-uPA e sh-uPAR também resultou na regressão quase completa de crescimento de tumor da próstata pré-estabelecido, ao passo que os grupos controlo de mock, EV e SV mostram tumores reproduzíveis e significativos (FIGURAS 7A e 7B) . Análise immunoblot demonstrou o knockdown seletivo dos níveis das proteínas uPA e uPAR em tumores co-tratados com construções sh-uPA e sh-uPAR (FIGURA 7C) . Este co-tratamento exibiu histologia em grande parte normal por coloração com H e E, ao passo que tumores de gupos tratados com mock, EV e SV exibiram alterações observáveis na arquitetura geral da glândula da próstata e coloração com H e E mostrou ambos tumor e células hospedeiras (FIGURA 7D). 0 knockdown de uPA e uPAR através do co-tratamento também resultou numa indução significativa da morte celular apoptótica, conforme revelado por coloração de Klenow positiva (FIGURAS 7E e 7F). Quando combinados com os dados apresentados nas FIGURAS 6A-C e 7A-F, estes resultados mostram que o tratamento com sh-uPAuPAR, contudo, tem efeito ARNi potente quando comparado com o co-tratamento com sh-uPA e sh-uPAR, que causa redução significativa no tamanho do tumor estabelecido.

Os resultados da análise DNA laddering in vitro e de um ensaio de rotulagem das extremidades do fragmento de ADN in vivo mostram que o knockdown simultâneo de uPA e uPAR por shRNA-based ARNi induz apoptose. A sinalização a jusante mediada por uPA-uPAR é um alvo excelente para o tratamento de cancro da próstata independente de hormonas. A sinalização a jusante mediada por uPA-uPAR é altamente necessária para a invasão, sobrevivência e proliferação celular na linha de células do cancro da próstata PC3. Exemplo 6. Sinalização funcional de uPA e uPAR e seu papel na tumorigénese

Verificou-se que a expressão aberrante de uPA e uPAR é uma das alterações mais frequentes no cancro da próstata em estádio avançado. 0 facto de uPA e uPAR serem sobre-expressos apenas no estádio avançado do cancro da próstata sugere que uPA e uPAR afetam as vias funcionais que são relevantes em determinar os fenótipos de estádios avançados de cancros, tais como proliferação e invasão aumentadas. Invasão através da matriz extracelular é uma etapa caracteristica na metástase tumoral. A anulação da expressão de uPA ou de uPAR para suprimir a tumorigénese foi conseguida utilizando várias abordagens diferentes. A união de uPA com uPAR orquestra várias moléculas de sinalização diferentes que formam uma rede única de vários tipos diferentes de respostas biológicas, tais como proliferação, migração, invasão, angiogénese e metástase. Estas respostas biológicas à ligação uPA-uPAR parecem ser altamente especificas do tipo de célula, da natureza da molécula de sinalização a jusante e do nível da sua expressão. A ligação de uPA com uPAR ativa ERK 1 e 2 e que isto induza a atividade ERK é necessário para a migração de células de cancro da mama MCF-7 induzida por uPA. Uma cascata de sinalização incluindo FAK, Src e She é responsável pela ativação de ERK induzida por uPA e migração celular. Por outro lado, migração e proliferação de células do músculo liso vascular (VSMC) induzidas por uPA precisam da ativação da via Stat. Em células de cancro da mama humano a atividade mitogénica induzida por uPA requer a ativaão de ambas vias Stat e ERK. uPA anti-senso inibiu a sinalização de PI3K/Akt e células sensibilizadas à apoptose por estaurosporina na linha de células de glioblastoma SNB 19. A ligação de uPA com uPAR provavelmente ativa cascatas de sinalização para regular a migração, invasão, proliferação e sobrevivência celular. ARNi para uPA-uPAR em células PC3 mostrou supressão notável da invasão e proliferação, bem como indução de apoptose (FIGURAS 3-4) . A supressão do sistema uPA-uPAR e moléculas de sinalização a jusante (ERK e Stat 3) foi observada em células PC3 transfetadas com sh-uPAuPAR, mas não em células mock ou transfetadas com EV/SV (FIGURA 5) . Isto sugere que todas as alterações fenotipicas observadas nestas células foram mediadas suprimindo a interação uPA- uPAR e o estado de fosforilação das suas moléculas a jusante. A sinalização de uPA-uPAR estimula ambas as vias Stat e ERK e protégé as células cancerígenas da morte. Várias linhas de evidência mostraram que ambas vias ERK e Stat 3 são capazes de proteger as células da morte celular apoptótica. Transfeção com sh-uPA ou com sh-uPAR não despoletou a apoptose em células PC3 (FIGURA 4). Isto pode ser porque bloquear só uPA ou uPAR pode não afetar de forma suficiente as moléculas de sinalização a jusante ERK e Stat 3.

Uma vez que a sinalização de uPA-uPAR modula a expressão de ERK e Stat 3, a inibição simultânea de uPA e uPAR pode prejudicar estas vias, conduzindo à inibição do crescimento e indução da apoptose. 0 sistema uPA-uPAR funciona provavelmente como um regulador positivo da sobrevivência celular facilitando a proliferação e sobrevivência celular, os dois distintivos do cancro. Logo, quando sobre-expressos em cancros, uPA e uPAR dotam uma célula cancerígena de proliferação aumentada e/ou resistência aumentada à apoptose. Por outro lado, o knockdown da expressão ou função de uPA-uPAR deveria inibir o crescimento de células cancerígenas e induzir a apoptose. Intercetar a sinalização mediada por uPA-uPAR através do knockdown de uPA e uPAR inibiu simultaneamente o crescimento de células cancerígenas e induziu a apoptose. De notar que, uPA-uPAR ARNi funcionou na linha de células de cancro da próstata PC3 resistente a hormonas. Isto sugere que o knockdown da expressão de uPA-uPAR por ARNi é uma estratégia para inibir o crescimento e sobrevivência de tumor dah próstata resistente a hormonas. A implantação ortotópica de células cancerígenas humanas em ratinhos nus parece-se mais com os comportamentos biológicos destas células em humanos, particularmente no que respeita ao desenvolvimento de metástases. Isto provou ser particularmente verdadeiro para células de cancro da próstata humano, que foram tumores e metástases primários com muito mais baixa eficiência quando implantados ectopicamente em ratinhos nus. Um sistema plasmídeo ARNi baseado em ARNsh representa uma estratégia que pode suprimir eficazmente a expressão de uPA-uPAR em tumores ortotópicos de próstata conforme determinado por análise immunoblot (FIGURA 6C). Além disso, o tratamento in vivo de tumores ortotópicos pré-estabelecidos com ARNi dirigido a sh-uPAuPAR demonstrou uma inibição quase total do crescimento do tumor, ao passo que só foi observada redução parcial com ARNi de sh-uPA ou de sh-uPAR (FIGURA 6B) . Além disso, o co-tratamento de tumores ortotópicos pré-estabelecidos com sh-uPA e sh-uPAR também inibiu quase completamente o crescimento tumoral (FIGURA 7) . Não foram notados efeitos deletérios em grupos animais tratados com ARNi quando comparado com grupos tratados com mock ou EV/SV. Além disso, esta abordagem pode ser dirigida a uma ampla variedade de tipos de tumores e inibir fenótipos malignos dependentes de uPA-uPAR in vitro bem como in vivo. Portanto, este sistema ARNi providencia uma nova ponderosa ferramenta terapêutica e também para analisar vias de sinalização a jusante uPA-uPAR, bem como oferece opções de tratamento para intervenção cancerígena com relevância clínica. Além disso, ARNi providencia uma forma nova, conveniente e seletiva de interferir com a expressão de uPA-uPAR e para estudar a significância biológica da sua sinalização na biologia do cancro.

Apesar dos avanços no entendimento dos mecanismos moleculares do cancro humano, desenvolver abordagens terapêuticas para o tratamento clínico de malignidades humanas permanece um desafio importante. 0 knockdown da expressão de uPA-uPAR inibiu significativamente o crescimento de células PC3 in vitro, bem como in vivo, e resultou, em última análise, na morte celular apoptótica. Genes alvo distintos (ERK e Stat 3) foram regulados a jusante do sinal uPA-uPAR. As células PC3 demonstraram bixa fosforilação de Stat 3 e a fosforilação de ERK foi was totalmente anulada quando transfetadas com sh-uPAuPAR. ARNi para uPA-uPAR induziu a morte celular em células PC3 in vitro, bem como in vivo.

Exemplo 7. Repetições invertidas com 21 pb conduzidas por promotor CMV baseado em plasmideo dirigidas a uPAR e MMP-9 são processadas para ARNsi.

Para determinar se o transcrito conduzido pelo promotor CMV (dirigido a uPAR e MMP-9) é processado corretamente para ARNsi, células SNB 19 foram transferidas com controlo/EV, SV, puPAR, pMMP-9 e pUM. A FIGURA 8 ilustra uma representação esquemática da construção. A células também foram transfetadas com uma construção não relacionada dirigida a GFP em células não GFP para determinar o processamento do transcrito de ARN para ARNsi e confirmar o facto de que os resultados obtidos não são apenas produtos de degradação do gene alvo. Células SNB 19 não GFP transfetadas com pGFP resultaram no processamento do transcrito de ARN para ARNsi (FIGURA 9A) . Da mesma forma, células transfetadas com puPAR, pMMP-9 e pUM resultaram no processamento do transcrito de ARN para o ARNsi apropriado. Células transfetadas com EV não produziram qualquer fragmento tipo ARNsi dirigido a uPAR ou MMPs-9 indicando que o fragmento ARNsi observado é processado a partir das alças da repetição invertida incorporadas na construção. Células transfetadas com SV também não produziram qualquer fragmento tipo ARNsi dirigido a uPAR ou MMP-9; SV consistiu de uma sequência da repetição invertida imperfeita sem homologia com qualquer gene conhecido. Quando sondado com um oligo senso com 21b para SV, nenhum híbrido ADN:ARN com 21pb foi visto indicando que esta construção não processou para fragmentos tipo ARNsi. Células SNB 19 transfetadas com pUM causaram a regulação para baixo de ARNm de ambos uPAR e MMPs-9. Para determinar se a construção do plasmídeo contendo sequências com 21 pares de base invertidas homólogas a uPAR e MMP-9 induziriam ARNi, células SNF19 foram transfetadas com controlo/EV, SV, puPAR, pump-9 e pUM. ARN total foi isolado das células transfetadas e o ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando um kit de síntese de ADNc (Invitrogen). 0 ADNc foi depois sujeito a PCR de acordo com protocolos padrão conhecidos daqueles habilitados na arte. Utilizando iniciadores específicos para uPAR, MMP-9 e GAPDH (ver Quadro 1) em células transfetadas com controlo/EV e SV, não houve redução nos níveis de uPAR ou MMPs-9; ao passo que nas células transfetadas com puPAR e níveis de uPAR, ARNm foi reduzido significativamente e os níveis de ARNm de MMP-9 não foram alterados. Em células transfetadas com pMMP-9, os níveis de ARNm de MMP-9 foram reduzidos, ao passo que os níveis de ARNm de uPAR não se alteraram indicando a especificidade dos vetores em direcionar moléculas. Células transfetadas com pUM mostraram uma diminuição nos níveis de ARNm de ambos uPAR e MMP-9. Os níveis de GAPDH não se alteraram (FIGURA 9B).

Exemplo 8. Inibição da atividade de MMP e niveis de proteína uPAR por ARN de interferência Células SNB19 foram transfetadas com EV/SV, puPAR, MMP-9 e pUM depois determinados os níveis de uPAR e MMP-9 em lisados celulares por western blotting e meios condicionados por zimografia em gelatina, respetivamente. Células SNB19 transfetadas com o vetor pUM expressaram quantidades reduzidas de proteína uPAR quando comparadas com células parentais e tratadas com EV/SV por western blotting (FIGURA 10A). Para determinar se este efeito inibidor era específico para uPAR, os níveis de β-actina foram avaliados no mesmo ensaio blot. Os níveis de β-actina foram semelhantes em todas as vias confirmando igual carga em todas as vias. Meios condicionados de células SNB19 infetadas com pUM expressaram níveis significativamente baixos de atividade de MMP-9 comparados com células mock e transfetadas com vetor vazio/misturado (FIGURA 10B) . Os níveis de MMP-2 não foram alterados, o que indica inibição específica da proteína alvo. Análise quantitativa das bandas de uPAR e MMP-9 por densitometria revelou uma diminuição significativa na proteína uPAR (12 a 14 vezes) e atividade enzimática de MMPs-9 (8 a 10 vezes) em células transfetadas com pUM comparadas com células parentais e transfetadas com EV/SV. Células transfetadas com vetores puPAR e pMMP-9 inibiram níveis de uPAR e MMP-9 (FIGURAS 10A e 9B) quase da mesma forma que a construção bicistrónica, mas a regulação para baixo das moléculas alvo foi mais pronunciada com a construção bicistrónica comparada com as construções simples.

Expressão mediada por vetor de ARN em forma de gancho curto (ARNsh) para uPAR e MUMP-9 pode atingir silenciamento de genes eficaz e estável numa linha de células de glioma in vitro e in vivo. 0 silenciamento de genes baseado em ARNi pode ser adaptado para dirigir proteínas sobre-expressas em gliomas com potencial terapêutico significativo. Moléculas sintéticas de ARNsi também têm o msmo efeito em suprimir níveis de MMP-9 e uPAR endógenos. Exemplo 9. Inibição da proliferação celular por ARNsi para uPAR e MMP-9. O ensaio MTT foi utilizado para avaliar o efeito de vetores ARNsi (EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM) na proliferação de células cultivadas em microplacas revestidas de vitronectina. Após 3 dias de infeção, as células SNB19 infetadas com o vetor puPAR, puPAR, pMMP-9 e pUM mostraram uma diminuição na proliferação em relação às células SNB19 parentais e transfetadas com EV/SV (FIGURA 11). O efeito do vetor pUM foi muito superior na proliferação de SNB19 comparado com as construções de ARNsi únicas (puPAR e pMMP-9). Não houve diferença na proliferação entre células SNB19 parentais e transfetadas com EV/SV.

Exemplo 10. ARN de interferência inibiu imunofluorescência de uPAR e MMP-9 e angiogénese induzida por tumor. Células SNB 19 transfetadas com puPAR e pMMP-9 causaram a regulação para baixo dos níveis das proteínas uPAR e MMP-9 conforme determinado por imuno-citoquímica, respetivamente. As células transfetadas com pUM causaram a regulação para baixo de ambos níveis das proteínas uPAR e MMP-9 conforme determinado por imuno-citoquímica (FIGURA 12A) . Para determinar o efeito da construção combinada que expressa ARNsi para ambos uPAR e MMP-9, células SNB19 foram transfetadas com puPAR, pMMP-9 e pUM; as células também foram transfetadas com EV e SV, que serviram como controlos. Dos resultados, é evidente que as células transfetadas com puPAR apenas mostraram uma regulação para baixo dos níveis da proteína uPAR. Células transfetadas com pMMP-9 mostraram uma regulação para baixo de MMP-9 isolada, ao passo que células transfetadas com pUM causaram uma regulação para baixo dos níveis das proteínas uPAR e MMPs-9, indicando que a construção dual foi tão eficiente, se não mais, na regulação para baixo dos níveis das proteínas alvo. Para testar se ARNsi para uPAR e MMP-9 também poderia inibir a formação de capilares induzida por tumor, células de glioma SNB19 transfetadas e não transfetadas foram co-cultivadas com células endoteliais humanas. Foi realizada análise imuno-histoquímica utilizando antígeno do fator VIII para avaliar a formação de vasos induzida por tumor num sistema de co-cultivo in vitro e coloração com H e E destes co-cultivos após transfeção com EV/SV, puPAR ou pMMP-9 e pUM. A FIGURA 12B mostra que células endoteliais cultivadas com células SNB19 formaram diferentes redes tipo de capilares em cultivos mock e transfetados com vetor vazio em 24-48 h. Por outro lado, células SNB19 transfetadas com pUM não induziram a formação de redes tipo de capilares em células endoteliais. A quantificação dos pontos de ramificação e número de ramos foram significativamente reduzidos em co-cultivos transfetados com pUM comparados com co-cultivos parentais e transfetados com vetor vazio/misturado (FIGURA 12C) . Além disso, o efeito foi inferior a 50% em vetor puPAR e pMMP-9 e foi inferior a 50% em co-cultivos transfetados com vetor puPA e pMMP, quando comparados com o grupo tratado com EV/SV parental em relação à formação de estruturas tipo capilares. A implantação de uma câmara contendo células SNB 19 transfetadas com EV parental resultou no desenvolvimento de micro-vasos com estruturas curvadas, finas e muitas manchas de sangue minúsculas. Por outro lado, a implantação de células SNB 19 transfetadas com o vetor pUM não resultou no desenvolvimento de quaisquer micro-vasos adicionais (FIGURA 12D).

Exemplo 11. ARNsi para uPAR e MMP-9 inibe a invasão de células SNB19.

Uma vez que a expressão de ARNsi inibiu uPAR e MMPs-9, a sua capacidade para inibir a invasão celular foi avaliada. Células SNB19 transfetadas com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e o vetor PUM foram permitidas invadir através de filtros revestidos com Matrigel. A FIGURA 13A ilustra que a coloração de células SNB 19 transfetadas com pUM foi significativamente inferior do que as células parentais e transfetadas com EV/SV. A análise quantitativa de células mostrou que apenas 8% das células transfetadas com pUM invadiu comparado com as células parentais e transfetadas com EV/SV (FIGURA 13B) . Além disso, a análise quantitativa da invasão de células SNB19 transfetadas com puPAR e vetor pMMP-9 invadiram 25% e 50% quando comparadas com células SNB19 parentais e transfetadas com EV/SV (FIGURAS 13A e 13B). ARNi também inibiu a invasão das células SNB19 num modelo de invasão de esferóides tridimensional. A FIGURA 13C demonstra que os esferóides de glioma transfetados com mock e vetor vazio/misturado se anexaram a agregados cerebrais de ratazana e invadiram progressivamente os agregados. Contudo, co-cultivos com esferóides de glioma transfetados com pUM não conseguiram anexar-se aos agregados cerebrais de ratazana e não invadiram. Análise quantitativa indicou que apenas 2-4% dos agregados cerebrais fetais de ratazana permaneceram nos esferóides parentais e transfetados com EV/SV, ao passo que 90-95% dos agregados cerebrais fetais de ratazana permaneceram nos esferóides transfetados com pUM (FIGURA 13D) . Às 72 h, os agregados cerebrais de ratazana revelaram aproximadamente 25% e 45% de invasão nos co-cultivos transfetados com puPAR e pMMP-9. Em conjunto, estas observações providenciam forte evidência que o silenciamento mediado por ARNi de uPAR e MMP-9 inibe grandemente a invasão de células de glioma em ambos modelos de invasão in vitro comparados com construções de ARNsi simples para uPAR e MMP-9. Estes resultados mostraram que construções de ARNsi simples para uPAR foram mais eficazes do que a construção de ARNsi única para MMP-9.

Exemplo 12. Efeito terapêutico de ARNsi para uPAR e MMPs-9.

Para avaliar a eficácia da interferência mediada por ARNi da expressão génica de uPAR e MMP-9 na progressão de tumor, o vetor pUM foi injetado em ratinhos portadores de tumor utilizando uma bomba estereotática. Para facilitar a deteção de células tumorais invasivas, células de glioblastoma humanas (SNB19) foram avaliadas com o ADNc para a proteína fluorescente verde (SNB19-GFP). Exame microscópico de secções de cérebro revelou que os animais controlo que receberam PBS ou vetor vazio (EV) apenas desenvolveram crescimento tumoral significativo após um período de seguimento de 5 semanas conforme visualizado por fluorescência GFP e coloração com H e E de secções semelhantes. Por outro lado, o crescimento tumoral ou fluorescência GFP ou coloração com H e E não foi detetada em animais que receberam o vetor pUM nas mesmas condições (FIGURAS 14A e 14B) . A quantificação de secções de cérebro coradas com hematoxilina e eosina ou secções GFP por um neuropatologista que não conhecia o tratamento não revelou diferenças no tamanho do tumor entre os grupos controlo e tratados com vetor vazio; contudo, a regressão total dos tumores foi revelada no grupo tratado com o vetor pUM (FIGURA 14C) . No caso de construções tratadas com ARNsi único para uPAR e MMP-9, o crescimento do tumor intracranial pré-estabelecido foi inibido 70% e 40%, respetivamente. Injeções intraperitoneais do vetor pUM resultaram na regressão completa do regression crescimento do tumor intracranial pré-estabelecido durante um longo período de 6 meses. Estes resultados demonstraram que a supressão mediada por ARNi de uPAR e MMPs-9 inibiu dramaticamente o crescimento do tumor intracranial pré-estabelecido . A inibição mediada por ARNi de uPAR e MMP-9 pode inibir o crescimento tumoral de várias formas interdependentes. Apoptose medida por fragmentação de ADN foi superior nos cérebros de animais injetados com os clones estáveis de uPAR anti-senso comparado com a linha de células parental. Os efeitos antitumorais observados no modelo de tumor intracranial poderiam ser devidos à indução de morte celular do tumor.

As células tumorais dependem da angiogénese para sobreviverem e proliferarem. A inibição mediada por ARNi de uPAR e MMP-9 inibiu significativamente a indução de tumor num sistema de co-cultivo in vitro. Os efeitos anti-angiogénicos do vetor pUM suprimiram a capacidade das células tumorais de recrutarem vasos sanguíneos necessários para a sobrevivência e de dirigirem efeitos anti-invasivos para as próprias células tumorais. A capacidade de ARNsi para uPAR de bloquear a progressão tumoral também poderia incluir o bloqueamento de efeitos anti-apoptóticos e angiogénicos de uPA. Em geral, nenhum agente anti- angiogénico único (incluindo angiostatina e endostatina) utilizado como monoterapêutica em modelos pré-clínicos é capaz de reduzir a carga tumoral depois dos tumores terem atingido 100 mm. Foi reportado que a ausência de Plg, uPA ou tPA diminuiu significativamente o desenvolvimento de neovascularização coroidal experimental comparado com ratinhos de tipo selvagem ou deficientes em uPAR. Este efeito foi sugerido ser parcialmente devido à modulação da atividade da matriz metaloproteinase. Apesar de estudos terem demonstrado o efeito anti-angiogénico de inibidores de MMP sintéticos, virtualmente todos estes inibidores carecem de especificidade por um único MMP. Por exemplo, a densidade de vasos diminuída e apoptose celular tumoral aumentada foram observadas em tumores e metástases primários em ratinhos tratados com KB-R7785, que inibe MMP-1, -3 e -9. MMPIs mostraram baixo benefício clínico quando utilizados como mooterapêutica em pacientes com doenças avançadas. Portanto, a utilização combinada da inibição de MMP com outras modalidades é também uma estratégia para tratamento de cancro.

Exemplo 13. ARNsi contra uPAR e MMP-9 inibe o nivel de ERK, ΜΆΡΚ e AKT fosforilado.

As vias ERK, MAPK e AKT desempenham um papel fundamental na proliferação e sobrevivência celular. Foi utilizado western blotting para comparar os níveis de formas total e fosforilada de ERK, MAPK e AKT utilizando anticorpos específicos para estas moléculas após transfeção de células SNB19 com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM. Não houve diferenças significativas nas quantidades de MAPK, ERK e AKT total por construções EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM (FIGURA 15). Mas os níveis das formas fosforiladas de MAPK, ERK e AKT foram diminuídos significativamente por pUM comparados com células SNB19 transfetadas com EV/SV, puPAR e puPA (FIGURA 15). A ligação de uPA a uPAR em células MCF-7 ativa ERK1 e ERK2, que são necessárias na mobilidade celular. Na linha de células de cancro da próstata (PC3MLN4) , hipóxia aumentou a invasão de células tumorais regulando para cima a expressão de uPAR, que pode ser mediada através da via de sinalização de MAPK, ERK e quinase p38. Além disso, a regulação para cima da expressão de uPAR por Bcl2 na hipóxia foi mediada pela atividade de ligação ao ADN SP1 através da via de sinalização ERK. Na ausência de EGFR, uma via alternativa liga uPAR a ERK. Contudo, esta via é silenciada pela expressão de EGFR, indicando, assim, o envolvimento de uPAR na motilidade celular. A transfeção estável de PTEN (fosfatase e homólogo de tensina) reduziu a secreção de MMP-9 causada pela fosforilação induzida pelo ácido hialurónico de quinase de adesão focal e sinalização de ERK1/ERK2. Glioblastomas com amplificação de EGFR VIII demonstraram os níveis mais altos de MMP-9. A transfeção passageira de células SNB 19 com mt ERK ou mt JNK reprimiu o promotor MMPs-9 o que sugere que interferir com qualquer uma das vias poderia resultar na inibição da expressão de MMP-9. A regulação da ativação de MMP-9 por vários estímulos ou em diferentes cenários celulares pode envolver diferentes vias de transdução de sinal. Inibição de ERK por inibidores específicos de MEK bloqueou a expressão de MMP-9 em células de cancro da mama e diminuiu a produção de MMP-9 e atenuou a capacidade de invasão in vivo em células de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. Células transfetadas com mt-ERK estáveis foram menos invasivas e reduziram significativamente os níveis de MMP-9. Foi reportado que estas duas vias de sinalização (MAPK e ERK1/2) são ativadas quando uPA se liga a construção uPAR pUM inibe as formas fosforiladas destas moléculas de vias de sinalização (FIGURAS 15-16).

Exemplo 14. Terapêuticas de cancro mediadas por ARNi e entrega de ARNsi A inibição de ARNsi de tais como, por exemplo, sobre- expressão de uPAR e MMP-9 estende a lista de modalidades terapêuticas disponíveis para o tratamento de cancro humano. Apesar de estarem disponíveis abordagens anti-senso, incluindo tecnologias de ribozima e oligonucleotídeo anti-senso, a sua eficiência não é satisfatória. A inibição mediada por ARNi de uPAR e MMP-9 suprimiu completamente crescimento de tumor de glioma pré-estabelecido em ratinhos nus. Assim, ARNi é uma alternativa mais poderosa a outras ferramentas genéticas, tais como oligonucleotideos anti-senso e tecnologias de rebozima na redução da expressão dos genes alvo. Efeitos de ARNi ou tipo ARNi foram mais potentes do que os efeitos anti-senso na redução da expressão dos genes alvo, o que sugre também a aplicabilidade potencial de ARNi. Foi utilizado um vetor péptido que inclui motivo arginina-glicina-ácido aspártico de alojamento de tumor numa conformação cíclica, um oligo de ligação a ADN lisina e resíduos de histidilo para facilitar a entrega no citosol. 0 vetor péptido pode funcionar como um veículo de ARNsi. Terapêutica de genes baseada em ARNi é uma abordagem nova para o tratamento de gliomas e outros tumores metastáticos, incluindo cancro da próstata, cancro da mama e melanoma.

Exemplo 15. Efeito do vetor pCU nos níveis de proteínas catepsina B e uPAR em extratos de células totais. ARNi dirigido contra degradação proteolítica é uma intervenção para prevenir a invasão de células cancerígenas (FIGURA 17) . Mostrou-se que catepsina B e uPAR desempenham papéis importantes na degradação da ECM. A transfeção de células SNB19 com o vetor que expressa ARNsi para catepsina B e uPAR (pCU) inibiu fortemente a expressão de ambas proteínas quando comparado com os controlos mock e vetor vazio (EV) (FIGURAS 18 A e C) . Os níveis de β-actina determinaram que foram carregadas no gel quantidades iguais de proteína (FIGURA 18). Análise quantitativa das bandas de catepsina B e uPAR por densitometria revelaram uma diminuição significativa (P<0,001) na proteína catepsina B (14 a 16 vezes) e uPAR (10 a 12 vezes) e em células transfetadas com pCU comparado com células mock e transfetadas com vetor vazio (FIGURAS 18B e D) . Células transfetadas com vetores pU e pC inibiram os níveis para uPAR e catepsina B, respetivamente (FIGURAS 18 A e C). Exemplo 16. Inibição de formação de rede capilar induzida por células tumorais pelo vetor pCU.

Tumores emergentes são dependentes da formação de novos vasos sanguíneos gue alimentam o crescimento tumoral. Dado gue a catepsina B e uPAR foram reportados regular a angiogénese, o efeito de pCU na angiogénese induzida por células tumorais foi avaliado. Foi realizada análise imuno-histoguímica utilizando antígeno do fator VIII para avaliar a formação de vasos induzida pelo tumor num sistema de co-cultivo in vitro e coloração com H e E para as células endoteliais crescidas na presença de meios condicionados de células SNB 19 após transfeção com mock, vetor vazio, pC, pU ou pCU. Os resultados demonstram gue células endoteliais formam estruturas tipo capilares na presença de células transfetadas com mock e vetor vazio em 48 h; ao passo gue o vetor pCU inibiu significativamente a formação de rede tipo de capilares induzida por células tumorais (FIGURA 19A). A guantificação dos pontos de ramificação e do número de ramos foi indetetável em co-cultivos transfetados com pCU comparada com mock e vetor vazio (FIGURA 19B). Além disso, o efeito foi inferior a 50% em co-cultivos tratados com pC ou pU quando comparados com vetor pCU em relação às estruturas tipo capilares. Para confirmar as experiências de co-cultivo in vitro, foi examinado se o vetor pCU pode inibir a angiogénese tumoral in vivo conforme avaliado pelo modelo de câmara dorsal. Câmaras implantadas contendo células SNB19 transfetadas com mock e vetor vazio (EV) resultaram no desenvolvimento de micro-vasos (conforme indicado pelas setas) com estruturas finas curvadas e muitas manchas de sangue minúsculas. Por outro lado, câmaras implantadas de células SNB19 transfetadas com o vetor pCU não resultaram no desenvolvimento de quaisquer micro-vasos adicionais (FIGURA 19C).

Exemplo 17. Inibição da migração de esferóides de SNB19 por ARNsi.

Para determinar se a expressão de ARNsi de catepsina B e uPAR é capaz de influenciar a migração e proliferação de células tumorais, esferóides de SNB 19 foram transfetados com o vetor pCU. Conforme mostrado na FIGURA 20A, houve muito mais migração celular dos esferóides transfetados com mock e vetor vazio (EV) até 50% de inibição da migração foi observada com esferóides transfetados com uma única construção. Contudo, a migração celular dos esferóides tumorais foi completamente inibida em esferóides transfetados com o vetor pCU. A migração dos esferóides transfetados com mock e vetor vazio foi significativamente superior (P<0,001) comparado com esferóides transfetados com pC, pU e pCU conforme quantificado pelo número de células que migram para fora dos esferóides (FIGURA 20B). A migração das células dos esferóides foi inibida com construção bicistrónica comparada com construções de ARNi únicas para estas moléculas. Algumas células migraram de esferóides de SNB19 transfetados com pCU conforme comparado com os dos controlos mock e vetor vazio, indicando, assim, o papel da catepsina B e uPAR na migração celular.

Exemplo 18. ARNsi contra catepsina B e uPAR inibe a invasão de células tumorais.

Para avaliar o impacto da inibição mediada por ARNsi de catepsina B e uPAR na capacidade de invasão de glioma, foi utilizado um sistema com dois modelos. Células SNB19 transfetadas com mock e vetor vazio invadiram extensivamente as inserções trans-poço revestida com Matrigel conforme observado pela coloração intensa das células. Por outro lado, os cultivos transfetados com pC, pU e pCU tiveram menos capacidade de invasão através da membrana basal reconstituída, comparado com células transfetadas com mock e vetor vazio (FIGURA 20C) . Determinação quantitativa da invasão confirmou que as células SNB19 transfetadas com o vetor pC, pU e pCU invadram apenas 55%, 40% e 6%, respetivamente, quando comparado com os controlos transfetados com mock e vetor vazio (FIGURA 20D) . A inibição do comportamento invasivo destas células conforme determinado pelo ensaio de invasão em Matrigel foi muito superior nas células transfetadas com construção bicistrónica quando comparado com a construção simples. A extensão do efeito de pCU no ensaio de invasão de esferóides foi testada. No ensaio de co-cultivo de esferóides, os esferóides de glioma controlo e esferóides transfetados com o vetor vazio invadiram progressivamente agregados cerebrais fetais de ratazana e resultaram na inibição parcial a quase completa da invasão de esferóides transfetados com pCU (FIGURA 20E) . A quantificação dos agregados cerebrais fetais de ratazana revelou que esferóides de glioma invadiram os agregados cerebrais fetais de ratazana em 25% em 24 h, > 70% em 48 h e > 90% às 72 h. Por outro lado, os esferóides de tumor transfetados com o vetor pCU não invadiram os agregados cerebrais fetais de ratazana. Às 72 h, os agregados cerebrais de ratazana revelaram invasão aproximadamente 90%, 85%, 55% e 35% nos co-cultivos transfetados com mock, vetor vazio, pC e pU, mas apenas 2% a 3% invasão nos co-cultivos transfetados com pCU (FIGURA 20F) . Em conjunto, estas observações providenciam forte evidência de que o silenciamento mediado por ARNi de catepsina B e uPAR inibe fortemente a invasão de células de glioma em ambos modelos in vitro e que o efeito foi muito superior com a construção bicistrónica comparado com as construções simples. A aquisição da capacidade de invasão de células tumorais é um dos aspetos da progressão tumoral. Existem vários relatórios que indicam a expressão de catepsina B e uPAR são componentes essenciais do processo de invasão. A transfeção com o vetor pCU inibiu a capacidade de invasão de células SNB 19 e esferóides nos ensaios de invasão em Matrigel e co-cultivo de esferóides. 0 requisito da catepsina B para o ensaio de invasão em Matrigel poderia ser devido à sua interação com uma rede de proteases. Mostrou-se que a catepsina B ativa precursores de proteinases serina às suas formas ativas, tais como pró-uPA e metaloproteinases, tais como prostromelisina. A capacidade de invasão através de Matrigel de linhas de células epiteliais de mama humana transformadas foi relacionada com a expressão de catepsina B e foi inibida por inibidores da proteinase cisteína. Em células de cancro do ovário, a inibição de catepsina B à superfície celular previne a ativação de pró-uPA e, subsequentemente, a invasão das células de carcinoma através de Matrigel. A atividade de catepsina B no cancro do cólon humano está associada com a capacidade de invasão das células cancerígenas, células endoteliais e células inflamatórias, bem como morte celular necrótica e apoptótica. uPA e uPAR são conhecidos por serem sobre-expressos em várias malignidades incluindo cancros da mama, do ovário e gástrico e foi demonstrado serem essenciais na manutenção do fenótipo invasivo e metastático.

Exemplo 19. Regulação para baixo mediada por ARNsi de Catepsina B e uPAR reduz a proliferação de células SNB 19.

Um ensaio MTT padrão foi utilizado para avaliar o efeito dos vetores ARNsi (Controlo, EV, SV, pC, pU e pCU) na proliferação de células cultivadas em microplacas revestidas de vitronectina (FIGURA 21). 72 h após a infeção, as células SNB 19 infetadas com vetor pC, pU e pCU mostraram uma diminuição na proliferação em relação à dos SNB19 e controlos vetor. Célula transfetada com PCU não mostrou qualquer crescimento apreciável mesmo após 7 dias de transfeção. Não foram observadas quaisquer células flutuantes ou resíduos de células em qualquer das células transfetadas mesmo após 7 dias de ensaio o que indica a ausência de apoptose.

Exemplo 20. Regulação para baixo mediada por ARNsi de uPAR e catepsina B inibe a fosforilação de ERKl/2 e FAK.

Para determinar o efeito da regulação para baixo de uPAR e catepsina B nas moléculas das vias de sinalização, a fosforilação de ERK e FAK foi testada por Western blotting ambos os quais estão diretamente envolvidos na sobrevivência, migração e proliferação das células tumorais. A FIGURA 22 mostra que a regulação para baixo mediada por ARNi simultânea de uPAR e catepsina B retarda a fosforilação de ERKl/2 e FAK e o efeito foi muito menor com construções únicas.

Os resultados demonstram que a regulação para baixo de uPAR e catepsina B induz a regulação para baixo da fosforilação de ERKl/2 e FAK que são diretamente responsáveis pela sobrevivência e proliferação celular. 0 envolvimento de uPAR na cascata ERK-FAK foi previamente reportado em células de carcinoma humano HEp3, mas o papel da catepsina B ainda permanece pouco claro. Uma regulação para baixo combinatória de uPAR e catepsina B é mais eficaz na inibição da fosforilação de ERKl/2 e FAK.

Exemplo 21. ARNsi de catepsina B e uPAR suprime crescimento tumoral intracraniano.

Um modelo tumoral intracraniano foi utilizado para avaliar os efeitos potenciais da inibição mediada por ARNi no crescimento tumoral pré-estabelecido in vivo. As secções de cérebro dos grupos não tratados (mock) e controlo tratados com EV foram caracterizadas pela grande dispersão do crescimento do tumor por coloração com H e E e fluorescência GFP elevada após um período de seguimento de 5 semanas (FIGURAS 23A e B). Contudo, fluorescência GFP não foi detetada nas secções de cérebro de ratinhos tratados com o vetor pCU (FIGURAS 23A e B). Quantificação adicional de secções de cérebro coradas com H e E classificadas por um neuropatologista que não conhecia o tratamento, não revelou qualquer diferença no tamanho do tumor entre os grupos de tratamento mock e vetor vazio e regressão significativa do crescimento tumoral 55% e 65% nos grupos tratados com pC e pU comparados com os controlos. Contudo, regressão total de tumores pré-estabelecidos foi revelada no grupo tratado com pCU (FIGURA 23) . Estes resultados demonstram que a supressão mediada por ARNi de catepsina B e uPAR inibiu significativamente o crescimento tumoral intracraniano. A entrega intracraniana local de pCU utilizando mini bombas osmóticas inibiu eficazmente o crescimento de glioma maligno humano. Mini bombas osmóticas mantêm um padrão bem definido e consistente de exposição ao fármaco durante um período de tempo significativo e podem ser utilizadas com sucesso para entregar agentes ao cérebro. A regulação para baixo de catepsina B e uPAR resulta na inibição da angiogénese induzida por tumor. Um ensaio de co-cultivo foi utilizado in vitro para testar o efeito de pCU na angiogénese. Os resultados demonstram que a catepsina B e uPAR desempenham papéis relevantes na estimulação da angiogénese, o que sugere um mecanismo possível de ação para a atividade antitumoral in vivo de pCU no modelo tumoral intracraniano. Coloração intense para catepsina B está presente em células endoteliais de novos vasos, mas não na microvasculatura pré-existente na próstata. Da mesma forma, foi observada forte imunocoloração de catepsina B em células endoteliais microvasculares de cérebro de ratazana à medida que formaram tubos capilares in vitro. Uma vez que se mostrou que a catepsina B é um inibidor de TIMPs e TIMPs são inibidores da angiogénese, catepsina B também poderia estimular a angiogénese, que tem um papel relevante na dispersão do tumor. Direcionamento mediado por ARNi de catepsina B e uPAR suprimiu crescimento de tumores intracranianos pré-estabelecidos, possivelmente inibindo a angiogénese e a capacidade de invasão. Estes resultados também suportam que a regulação para baixo mediada por ARNsi da expressão de genes alvo é suficientemente estável dentro do micro-ambiente cerebral.

Exemplo 22. Efeito de construções de ARNsi na proteina uPAR e atividade enzimática de uPA e MMP-9 em células de glioblastoma SNB19.

Para inibir em simultâneo três genes endógenos com ARNsi em forma de gancho, foi construído um vetor (pU2M) que expressa ARNsi para uPAR (77-98 bases de uPAR humano em ARN) , uPA (346-367 bases de uPA humano em ARN) e MMP-9 (360-381 bases de MMP-9 humano em ARN) sob o controlo do promotor CMV (FIGURA 24). As bases indicam as posições numa sequência codificante de comprimento inteiro. Foi realizada análise western blot para examiner o efeito da transfeção com vetor vazio/vetor misturado (EV/SV), puPAR, puPA, MMP-9 e pU2M nas concentrações da proteína uPAR em células SNB 19. A banda da proteína uPAR esteve presente em células SNB19 transfetadas com EV/SV, puPA e pMMP-9, ao passo que foi reduzida significativamente em células tratadas com puPAR e pU2M (FIGURA 25A) . O efeito da construção tricistrónica (pU2M) foi superior do que puPAR (FIGURA 25A) . Os níveis de GAPDH determinaram que quantidades iguais de proteína foram carregadas no gel (FIGURA 25A) . Zimografia em fibrina foi realizada para examinar o efeito de células SNB 19 tratadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M na atividade enzimática de uPA. Zimografia em gelatina foi realizada para determinar o efeito destas construções nos níveis de MMP-9 em células SNB19. Os níveis de MMP-9 foram significativamente reduzidos nas células SNB19 tratadas com puPAR, pMMP-9 e pU2M comparada com células parentais, tratadas com EV/SV e puPA (FIGURA 25B) .

Curiosamente, os níveis de MMP-2 também foram regulados para baixo em células tratadas com pU2M. Teve-se em atenção carregar igual quantidade de proteínas. (FIGURA 25B) . A atividade enzimática de uPA (MR 55 000) foi reduzida significativamente em células tratadas com puPA e pU2M comparado com os grupos parental, tratados com EV/SV, puPAR e pMMP-9 (FIGURA 25C). O efeito da construção tricistrónica foi mais pronunciado do que o das construções de ARNsi únicas para estas moléculas. Determinada por análise imuno-histoquímica, a transfeção com puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M diminuiu as concentrações de uPAR, uPA e MMP-9 em células SNB 19. A FIGURA 25D mostra os níveis de proteínas de uPAR, uPA e MMP-9 em células parentais, transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M utilizando anticorpos específicos para uPAR, uPA e MMP-9. As intensidades respetivas de uPAR, uPA e MMP-9 foram elevadas em células parentais e em células transfetadas com EV/SV. Contrariamente, a intensidade de uPAR diminuiu em células SNB19 transfetadas com puPAR e pU2M. A transfeção com puPA e pU2M diminuiu significativamente a intensidade de proteína uPA comparado com as células parentais, transfetadas com EV/SV, puPAR e pMMP-9. Além disso, a concentração da proteína MMPs-9 diminuiu significativamente em células transfetadas com pMMP-9 e pU2M comparadas com células parentais, transfetadas com EV/SV, puPA e puPAR. Estes resultados demonstram que o efeito das construções únicas é especifico da molécula e que o efeito da construção tricistrónica é muito mais pronunciado do que o das construções únicas sozinhas.

Exemplo 23. puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M inibem a formação de rede de capilares induzida por tumor. O crescimento de um tumor glial depende da indução de novos vasos sanguíneos capilares que são necessários para suportar a massa tumoral em desenvolvimento. Um sistema de co-cultivo foi utilizado no qual as células endoteliais microvasculares foram induzidas pelos meios condicionados de células gliais para formar estruturas tipo capilares para examinar o efeito da supressão mediada por ARNi de uPAR, uPA e MMP-9. Análise imuno-histoquímica utilizando antigeno do fator VIII para avaliar formação de vasos induzida por tumor num sistema de co-cultivo in vitro e realizada coloração com H e E. Células endoteliais formam estruturas tipo capilares na presença de meios condicionados de SNB19 parentais e Células transfetadas com EV/SV (FIGURA 26A). Contrariamente, a transfeção de células SNB 19 com vetores que expressam ARNsi para uPA, uPAR e MMP-9 seja individualmente ou em combinação inibiram parcial ou completamente a formação de micro-vasos induzida por tumor (FIGURA 26A). Não foram detetados novos pontos de ramificação e/ou um aumento no número de ramos em células transfetadas com pU2M comparados com células tratadas com EV/SV (FIGURA 2 6A) . Além disso, comparados com células tratadas com EV/SV, a formação de estruturas tipo capilares foi inibida em -55% em cultivos tratados com puPAR, -36% em cultivos tratados com puPA e -60% em cultivos tratados com pMMP-9 (FIGURA 26B).

Meio condicionado de uma linha de células de glioblastoma transfetadas com PU2M inibiu as estruturas tipo capilares comparadas com mock ou vetor vazio (FIGURAS 26A-B). Isto indica que o sinal angiogénico necessário para a indução da angiogénese não esteve presente em células transfetadas com pU2M. Conforme demonstrado pela ausência de indução angiogénica em células de glioma SNB19 transfetadas com PU2M, a regulação para baixo de uPA, uPAR e MMP-9 por ARNg causou a regulação para baixo de fatores angiogénicos. A ausência de uPA ou tecido tipo ativador de plasminogénio (tPA) diminuiu significativamente o desenvolvimento de neovascularização coroidal experimental comparado com ratinhos de tipo selvagem (WT) ou deficientes em uPAR (uPA-/-). Foi reportado que ocorreu um crescimento de tumor primário significativamente diminuído em ratinhos uPA-/- e deficientes no inibidor 1 do ativador de plasminogénio (PAI-1-/-) em relação a ratinhos WT e tumores em ratinhos uPA-/- e PAI-/- exibiram índices proliferativos inferiores e apoptóticos superiores e também exibiram uma neovascularmorfologia distinta quando com ratinhos WT. Vários péptidos que se mostrou inibem a ligação de uPA por exibição de bacteriófago inibem a angiogénese e crescimento de tumor primário em ratinhos singénicos.

Exemplo 24. puPAR, puPA, pMMP-9 e PU2M inibem a invasão em células SNB19. A degradação proteolítica de componentes de ECM é relevante para a invasão das células tumorais. Para avaliar o impacto da inibição mediada por ARNsi de uPAR, uPA e MMP-9 na capacidade de invasão de glioma, foram utilizados dois modelos. No primeiro modelo, a capacidade invasiva das células SNB19 transfetadas com puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M foi comparada com aquelas infetadas com o vetor EV/SV. Células SNB19 transfetadas com EV/SV e células parentais demonstraram invasão extensiva através de inserções trans-poço revestidas com Matrigel, conforme indicado pela coloração intensa das células. Contrariamente, cultivos transfetados com puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M foram menos invasivos através da membrana basal reconstituída, conforme indicado pela intensidade da coloração comparada com os controlos (FIGURA 26C) . Quantificação confirmou que a transfeção com vetores puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M reduziu a invasão por células SNB 19 em 9%, 40%, 15% e 2%, respetivamente, comparada com parentais e controlos transfetados com EV/SV (FIGURA 26D). A inibição da invasão foi superior em células transfetadas com a construção tricistrónica quando comparada com construções únicas sozinhas. O efeito dos vetores puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M foi examinado utilizando um ensaio de invasão de esferóides. Uma vantagem significativa, potencial de utilizar esferóides de glioma é que as células tumorais crescidas em cultivos tridimensionais exibem propriedades que se parecem mais às dos tumores in vivo. No sistema de co-cultivo de esferóides, esferóides controlo e esferóides transfetados com o vetor EV/SV invadiram progressivamente agregados cerebrais fetais de ratazana, ao passo que esferóides transfetados com puPAR, puPA, pMMP-9 e PU2M demonstraram inibição parcial a quase completa da invasão (FIGURA 27A) . Quantificação revelou que os esferóides de glioma invadiram os agregados cerebrais fetais de ratazana em 30% em 1 dia, 55% em 2 dias e 95% em 3 dias, em cujo momento o esferóide tumoral e agregados cerebrais se combinaram numa única entidade (FIGURA 27B) . Foi observada uma tendência semelhante com esferóides de glioma transfetados com o vetor EV/SV. Contrariamente, esferóides de tumor transfetados com o vetor pU2M não invadiram agregados cerebrais fetais de ratazana. Aos 3 dias, os agregados cerebrais de ratazana foram invadidos em aproximadamente 96%, 95%, 45%, 25% e 15% nos co-cultivos parentais, transfetados com EV/SV, puPA, pMMP-9 e puPAR e em 1% nos co-cultivos transfetados com pU2M (FIGURA 27B). Estes resultados providenciam forte evidência de que pU2M inibe fortemente a invasão de glioma em ambos modelos in vitro. Exemplo 25. pU2M regride completamente o crescimento tumoral intracraniano. A regulação para baixo dos níveis de uPAR, uPA e MMP-9 foi examinada utilizando ou construção únicas ou tricistrónicas causa regressão do crescimento de tumor intracraniano pré-estabelecido em ratinhos nus. Todos os animais nos grupos controlo e tratados com EV/SV tinham tumores cerebrais intactos que foram caracterizados por forte fluorescência GFP (FIGURA 27C), ao passo que secções de cérebro de ratinhos tratados com puPAR, puPA e pMMP-9 tinham pequenos tumores, ilustrados por fluorescência GFP mínima. Notavelmente, não foi detetada fluorescência GFP em secções de cérebro de ratinhos tratados com pU2M (FIGURA 27C). Quantificação adicional destas secções (classificadas por um neuropatologista que não conhecia as condições de tratamento) não revelou qualquer diferença no tamanho do tumor entre os grupos parental e tratado com EV/SV e regressão significativa do crescimento de tumor intracraniano pré-estabelecido nos grupos tratados com puPAR, puPA e pMMP-9 (80%, 55% e 68%, respetivamente) comparados com os grupos controlo (FIGURA 27D). Contudo, a regressão completa do crescimento de tumor intracraniano pré-estabelecido foi revelada no grupo tratado com pU2M. Estes resultados demonstram que a supressão mediada por ARNide uPAR, uPA e MMP-9 utilizando uma construção tricistrónica erradicou completamente o crescimento de glioma maligno em ratinhos nus.

Exemplo 26. Inibição da fosforilação de ERKl/2.

Para compreender melhor o efeito da regulação para baixo mediada por ARNsi de uPAR, uPA e MMP-9 nas vias de sinalização, foram testados níveis total e fosforilado de ERKl/2 que estão envolvidos diretamente na sobrevivência, migração e proliferação das células tumorais. Western blots mostraram que não houve diferenças significativas nas concentrações de ERKl/2 total em células controlo e transfetadas com EV/SV comparados com células transfetadas com puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M (FIGURA 28) . Contudo, a concentração de fosfo-ERKl/2 foi reduzida significativamente em células SNB19 transfetadas com o vetor pU2M comparada com o controlo, células SNB19 transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA e pMMP-9. Notavelmente, não houve efeito nos níveis de fosfo-ERK em células SNB19 transfetadas com qualquer uma das construções únicas. Os níveis de GAPDH indicaram que foram carregadas quantidades iguais de proteína no gel (FIGURA 28).

Exemplo 27. ARNsi especifico de genes diminuem a expressão de proteina MMP-9 e catepsina B numa linha de células de glioma.

Para testar a eficácia de inibir simultaneamente dois genes endógenos com um vetor de expressão de ARNsi em forma de gancho, um vetor que expressa ARNsi para catepsina B (732 a 753 bases de ARNm de catepsina B humana) e MMP-9 (360 a 381 bases de ARNm de MMP-9 humano) foram construídos sob o controlo do promotor do citomegalovírus (CMV) humano (pCM) (FIGURA 29). As bases indicam as posições numa sequência codificante de comprimento inteiro. A FIGURA 30A demonstra que a transfeção com vetor pC e pCM inibiram especificamente níveis de catepsina B comparados com controlos mock, vetor vazio e vetor pM. Os níveis de β-actina avaliados no mesmo blot indicaram que a inibição da catepsina B foi específica e confirmaram carga igual de amostra. Os níveis de MMP-2 e MMP-9 foram determinados no meio condicionado nas células transfetadas. A quantidade de MMP-9 libertada das células transfetadas com mock e vetor vazio (EV) foram as mesmas. Células transfetadas com vetor pM e pCM expressaram níveis baixos de MMP-9 comparadas com controlos mock, EV e pC. Não houve alteração na expressão de MMP-2 o que demonstra a inibição específica de sequência do vetor pM e pCM (FIGURA 30B) . Para confirmar que a diminuição na atividade de MMP-9 foi devida a uma diminuição na expressão de proteínas, o meio condicionado foi analisado utilizando immunoblotting com um anticorpo especifico de MMP-9. A banda da proteina MMP-9 foi diminuída dramaticamente por immunoblotting do meio condicionado das células transfetadas com vetor pM e pCM, mas as bandas foram significativamente muito maiores no meio condicionado das células infetadas com o vetor vazio ou com o vetor pC (FIGURA 30C).

Exemplo 28. Inibição da formação da rede de capilares induzida por células tumorais pelo vetor PCM. 0 crescimento de um tumor glial depende da indução de novos vasos sanguíneos capilares, uma vez que são necessários para suportar a massa tumoral em desenvolvimento. Um sistema de co-cultivo foi utilizado no qual células endoteliais microvasculares foram induzidas pelas células gliais para formar estruturas tipo capilares para examinar a supressão mediada por ARNi de catepsina B e MMP-9. Células SNB19 induziram células endoteliais para se diferenciarem em estruturas tipo capilares em 72 h. Por outro lado, a transfeção de células SNB 19 com o vetor que expressa ARNsi para catepsina B e MMP-9 inibiu completamente a morfogénese de micro-vasos induzida por células tumorais (FIGURA 31A). Quantificação adicional dos pontos de ramificação e número de ramos foram indetetáveis em co-cultivos transfetados com pCM comparados com mock e vetor vazio (FIGURA 31B) . Além disso, o efeito foi apenas de 50% em co-cultivos tratados com pC ou pM quando comparados com vetor pCM em relação a estruturas tipo capilares. Para confirmar as experiências de co-cultivo in vitro, foram examinados se o vetor pCM poderia inibir a angiogénese tumoral in vivo conforme avaliado pelo modelo da janela dorsal. Implantação de uma câmara contendo células SNB19 transfetadas com mock e vetor vazio (EV) resultou no desenvolvimento de micro-vasos (conforme indicado por setas) com estruturas finas curvadas e muitas manchas de sangue minúsculas. Por outro lado, a implantação de células SNB 19 transfetadas com o vetor pCM não resultou no desenvolvimento de quaisquer micro-vasos adicionais (FIGURA 31C). A manutenção do crescimento de tumores malignos está intimamente relacionada com o desenvolvimento da rede vascular que proporciona nutrientes ao tumor. Não foi observada a formação de uma rede vascular caracterizada por polígonos fechados e estruturas tipo malha complexas nas células tratadas com o vetor pCM. Esta rede é tipicamente observada quando as células de glioma são co-cultivadas com células endoteliais. A proteólise de componentes da matriz extracelular permite as células endoteliais migrarem e liberta moléculas de sinalização angiogénicas armazenadas da matriz extracelular. Análise imuno-histoquímica demonstrou que catepsina B foi fortemente expressa em astrocitomas e glioblastomas anaplásticos malignos quando comparados com tecido cerebral normal.

Estes resultados mostram que MMPs podem promover angiogénese e que a ausência absoluta de atividade de MMP pode prevenir a formação de novos vasos sanguíneos. A regressão do tumor conseguida pelo tratamento combinado na presente revelação é devida às ações complementares da catepsina B e MMP-9. A expressão dirigida de catepsina B e MMP-9 em células tumorais é uma abordagem eficaz para controlar a angiogénese e crescimento tumoral.

Exemplo 29. Efeitos supressores do vetor pCM na migração e invasão de glioma A migração celular requer a regulação coordenada de anexações célula-célula, anexação célula-matriz e remodelação da matriz. Foi estudada a influência de suprimir catepsina B e MMP-9 na capacidade das células migrarem na vitronectina num ensaio de migração de esferóides. Esferóides de glioma multicelular foram crescidos de células SNB19-GFP em placas com 6 poços revestidos com agarose. Depois de verificar a viabilidade utilizando morfologia e exclisão com azul de tripano, os esferóides de diâmetro semelhante (100-200 ym) foram transfetados com mock, vetor vazio (EV) ou com o vetor pCM que expressa ARNsi para catepsina B e MMP-9. Três dias mais tarde, esferóides únicos foram colocados em placas revestidas com vitronectina e permitidos migrar. A FIGURA 32A indica que as células dos esferóides controlo e esferóides infetados com o vetor vazio mostraram uma capacidade significativamente superior das células migrarem quando comparadas com as células infetadas com o vetor pCM. A degradação proteolítica dos componentes da matriz extracelular é relevante para a invasão de células tumorais. Para investigar se a expressão de ARNsi para catepsina B e MMP-9 desempenha um papel na capacidade de invasão de glioma, foram comparadas a capacidade invasiva de células SNB19 transfetadas com o vetor pCM com aquelas células infetadas com mock e vetor vazio. Células SNB19 transfetadas com mock e vetor vazio (EV) invadiram através de Matrigel mais extensivamente comparadas com as células transfetadas com o vetor pCM que penetraram através da matrigel (FIGURA 32B). A extensão dos efeitos supressores do ARNsi num ensaio de invasão de esferóides foi examinada. Uma vantagem potencial de utilizar esferóides de glioma é que foi demonstrado que as células tumorais crescidas em cultivos tridimensionais exibem propriedades que se parecem mais com aquelas dos tumores in vivo. Esferóides transfetados com mock e vetor vazio invadiram 25% dos agregados cerebrais normais num dia, 50% em dois dias e aos três dias, 95% do esferóide do tumor e agregado cerebral combinaram-se numa única entidade (FIGURA 32C). Por outro lado, esferóides de glioma transfetados com o vetor pCM que expressam ARNsi para catepsina B e MMP-9 permaneceram separados dos agregados cerebrais normais. A presente revelação mostra que a expressão conduzida pelo promotor CMV de ARNsi contra catepsina B e MMP-9 (pCM) pode silenciar com sucesso a expressão de catepsina B e MMP-9 na linha de células de glioblastoma SNB19, conforme analisado por Western blotting e zimografia em gelatina. Os resultados também demonstraram que o potencial invasivo de células de glioma tratadas com o vetor pCM foi significativamente inibido. Células cancerígenas têm de se destacar das células vizinhas e componentes da matriz extracelular para migrarem e invadirem. A proteólise da matriz pode modular diretamente a adesão célula-matriz seja por remoção dos locais de adesão ou por exposição de um local de ligação, que, por sua vez, pode efetuar a migração celular. A inibição mediada por ARNi de catepsina B e MMP-9 bloqueou significativamente a migração de células de glioma SNB19 conforme mostrado num ensaio de migração de esferóides.

Exemplo 30. ARNi induz a regressão completa de tumores de glioblastoma em ratinhos nus. A capacidade do ARNsi para MMP-9 e catepsina B para inibir a regressão de tumores SNB19 intracranianos foi testada em ratinhos nus. Ratinhos com crescimento de gliomas pré-estabelecidos foram injetados estereotaticamente com PBS (mock), vetor vazio (EV), vector pC, pM e pCM. Secções de cérebro de ratinhos tratadas com mock e EV mostraram crescimento tumoral rápido, ao passo que ratinhos injetados com o vetor pCM utilizando mini bombas osmóticas num tumor pré-estabelecido, resultou na inibição completa do crescimento tumoral ao longo de um período de 5 semanas (FIGURAS 32A e 32B) . A quantificação do tamanho do tumor mostrou uma regressão total de tumor no grupo tratado com o vetor pCM comparado com mock ou vetor vazio (FIGURA 33C). Secções de cérebro de ratinhos tratados com grupo tratado com vetor pC ou pM, resultaram em cerca de 50% de regressão do tumor comparadas com grupos controlo. Injeções intraperitoneais do vetor também resultaram na regressão completa do crescimento de tumor intracraniano pré-estabelecido sem indicação de células tumorais por períodos longos de vários meses (FIGURA 33D). Assim, ARNi foi capaz de erradicar completamente crescimento de tumor de glioma maligno neste modelo de ratinho nu. A supressão prolongada do crescimento do glioma poderia ser devida à amplificação de ARNsi. ARNsi contra catepsina B e MMP-9 suprimiu o crescimento do glioma mais eficazmente do que o oligodesoxinucleotídeo anti-senso para MMP-9 e catepsina B. Assim, o controlo da expressão de ambos catepsina B e MMP-9 teve significância considerável para a regulação da progressão do tumor.

Foi demonstrada a eficácia anti-cancerigena da inibição mediada por ARNi de catepsina B e MMP-9. A comparação dos efeitos supressores de oligonucleotideos anti-senso e ARNsi dirigidos contra os mesmos alvos em células de mamífero revelou que o valor CI50 para o ARNsi foi cerca de 100 vezes mais baixo do que o dos oligonucleotideos anti-senso. A capacidade de ARNsi de silenciar genes alvo específicos de sequência e as concentrações inferiores necessárias para inibir a expressão génica tornam o ARNi uma ferramenta poderosa para terapêutica de genes.

Exemplo 31. Resposta imunogénica reduzida para ARNsi de plasmideos circulares

Para desenvolver um vetor capaz de produzir moléculas de ARNsi em forma de gancho para uPA e uPAR, foi utilizado o vetor plasmídeo de expressão de mamífero pCDNA 3. As FIGURAS 34-35 ilustram representações esquemáticas das várias formas de construções de ARNi conduzidas por U6 e CMV. Foram sintetizadas sequências de repetição invertida auto-complementar espaçadas por uma região com 9 bases deficiente em G C dirigida para uPA (346 a 367) e uPAR (77 a 89). Oligos para uPA foram terminados com locais HindIII e os oligos para uPAR foram terminados com BamHI e auto-emparelhados por aquecimento a 100°C durante 5 min e arrefecidos à temperatura ambiente em 6x SSC que resultou na formação de moléculas de ADN de cadeia dupla com as respetivas extremidades do local de restrição adesivas. Estas moléculas de ADNcd foram ligadas aos locais BamBI e HindIII do vetor plasmídeo pCDNA3, resultando na formação de um plasmídeo que contém repetições invertidas para uPA e uPAR a jusante do promotor CMV e terminado por um terminador BGH. O plasmídeo resultante, designado pU2, quando transfetado para células de mamífero resultou na produção de uma molécula de ARNsi em forma de gancho dual dirigida a ambos uPA e uPAR que foram adicionalmente processados por uma enzima que reconhece ARNcd (DICER) para produzir moléculas de ARNsi individuais para induzir ARNi. Uma sequência homóloga a GFP foi utilizada na construção de um vetor misturado. Sequências imperfeitas, que não formam uma estrutura em forma de gancho perfeita, foram utilizadas para desenvolver o vetor misturado. Dois oligos auto-complementares foram sintetizados e emparelhados para gerar uma molécula de ADNcd com locais HindIII. Esta molécula de ADNcd foi ligada no local HindIII do plasmídeo pCDNA3. 0 plasmídeo resultante foi designado pSV. 0 transcrito conduzido por CMV resultante não tinha qualquer estrutura tipo gancho e não era homólogo com nenhum gene nativo.

Uma cassete de expressão que expressa ARNsi para uPA e uPAR foi subclonada no vetor transporte Ad5 na região ΔΕ1 conduzida com um promotor ARN pol II ou ARN pol III. 0 plasmídeo resultante foi co-transfetado com plasmídeo genómico Ad 5 (como PJM17) em células permissivas de replicação 293 para gerar partículas de vírus Ad 5 deficientes em replicação recombinante contendo cassete de expressão de ARNsi para uPA e uPAR (FIGURA 36) . Uma vetor de ARNi GFP foi construído para determinar a especificidade de direcionamento utilizando ARNi. Células SNB19 estáveis que expressam GFP foram utilizadas como controlos e transfetadas com ARNi dirigidas contra GFP. Células transfetadas com GFP ARNi perderam a expressão de GFP (FIGURA 37), ao passo que não foi observada qualquer alteração na expressão de ARNm de GAPDH como visto na reação RT-PCR (FIGURA 44).

Para determinar se plasmídeos circulares com U6 (ARN pol III) ou promotor CMV (ARN pol II) induzem resposta imunitária ao nível celular, 5 construções foram utilizadas com promotor U6 ou CMV. Células de glioma humano SNB19 foram transfetadas com plasmídeos circulares contendo promotor U6 ou CMV para conduzir o seguinte: não inserção designado vetor vazio (EV), inserção ARNi GFP que não formou estrutura em forma de gancho perfeita designado vetor misturado (SV), expressor em forma de gancho ARNi para uPAR (puPAR) , expressor em forma de gancho ARNi para uPA (puPA) e uma expressão em forma de gancho ARNi dual para ambos uPAR e uPA (pU2) . RT-PCR foi realizada para determinar a expressão dos níveis de 0AS1. ARN total foi isolado de cada das células transfetadas após 48 h de transfeção e RT-PCR foi realizada para determinar o nível de expressão de 0AS1 por 50ng de ARN total. (RT-PCR foi realizada conforme as instruções do fabricante (Invitrogen)) . Não houve alteração nos níveis de ARNm 0AS1 ou níveis de ARNm GAPDH em células SNB19 transfetadas com plasmídeos circulares contendo o promotor U6 ou CMV (FIGURA 38) .

Exemplo 32. Comparação de ARN pol II (CMV) e ARN pol III (U6) como promotores para a iniciação de ARNi.

Para determinar a atividade e a eficácia de ARN pol II e ARN pol III foram construídos vetores ARNi em plasmídeo pSilenciador (Ambion, Austin TX) para vetor misturado, uPAR, uPA e combinação uPAR-uPA como em pcDNA3. As construções pSilenciador foram terminadas com tetra Ts, conforme as instruções do fabricante. Células SNB19 foram transfetadas em dois conjuntos, um conjunto continha ARN pol II promotor CMV e o segundo conjunto continha ARN pol III promotor U6 (C, SV, puPAR, puPA e pU2) . 48 h após transfeção, proteínas foram extraídas de células conforme o protocolo padrão e carregadas num gel SDS (10 pg/via) poliacrilamida 12%. Western blotting e zimografia em fibrina foi realizado conforme o protocolo padrão e sondado para uPAR e uPA e o controlo de carga foi determinado sondando para GAPDH. Da FIGURA 39 é evidente que as construções do promotor ARN pol II foram mais eficientes a regular para baixo as moléculas alvo quando comparadas com as construções do promotor ARN pol III.

Exemplo 33. Determinação de gene de resposta interferão OAS1.

Foram utilizadas construções do plasmídeo para vetor vazio (EV), vetor misturado (SV), uPAR (puPAR), uPA (puPA) e a construção bicistrónica para uPAR e uPA (pU2) para determinar o nível de indução de interferão na linha de células de glioma humano SNB19. A expressão do gene 0AS1 foi utilizada como um indicador para indução de interferão. Foram utilizados plasmídeos circulares (C), cassete de expressão linear (L) , e cassete de expressão linear com sequência sinal poli A BGH deletada (ΔΑ) . Células SNB 19 foram transfetadas com quantidades equivalentes do plasmídeo ou cassetes de expressão anteriores (C, L, ΔΑ representação esquemática) e ARN total foi isolado após 48 h de transfeção utilizando protocolos padrão. RT-PCR foi realizado nas amostras anteriores e os níveis de amplicão 0AS1 foram determinados em gel de agarose. Os iniciadores utilizados para amplificação de 0AS1 foram 5'-aggtggtaaagggtggctcc-e 5'-acaaccaggtcagcgtcagat-3'. Os iniciadores utilizados para amplificar a cassete de expressão dos plasmídeos anteriores (EV, SV, puPAR, puPA e pU2) foram: iniciador para a frente 5'ctggtgtcgacctgcttccgcgatgtacgggc3' e iniciador reverso 5'ctggtgtcgacatccccagcatgcctgctat3' (FIGURA 40). RT-PCR para indução de ARNm OAS1 (2' 5'-oligoadentlato sintetase) foi realizada para determinar a relevância de uma sequência sinal poli A. Foram utilizadas cassete de expressão circular, linear (cassete de expressão sozinha) e com sequência sinal poli A deletada (C, L e ΔΑ, respetivamente) . No caso de EV e SV, não foi detetada indução de ARNm OAS1 (FIGURA 41) . No caso de EV, não se esperou que o comprimento total do transcrito fosse mais de lkb e a estrutura prevista do transcrito não teve estrutura de ARNcd significativa para induzir uma resposta imunitária com ou sem uma cauda poli A conforme observado na figura (também em SV) (FIGURA 44). Por outro lado, com puPAR, puPA e pU2 a estrutura secundária prevista não possuía estruturas de ARNcd, mas com a presença de uma cauda poli A, ainda assim a indução de resposta imunitária não foi detetada (expressão de 0AS1). No caso da cassete de expressão sozinha onde uma sequência sinal poli A esteve presente, mas a construção transfetada foi linear, induziu uma resposta imunitária. Isto indicou que a presença de uma molécula circular produziu uma cauda poli A viável; e uma vez que a construção linear foi terminada logo depois da sequência sinal poli A, a iniciação de uma cauda poli A viável não foi iniciada ou ficou incompleta. No caso de construções lineares com uma resposta imunitária com sequência sinal poli A deletada foi iniciada, indicando que a presença de uma cauda poli A pode ser necessária na prevenção de uma resposta imunitária e na estabilidade da molécula de ARN transcrito (FIGURAS 41-42). 0 ARNm previsto da construção bicistrónica não se parecia com ARNmi e tinha uma estrutura alça em forma de gancho para ambas sequências uPAR e uPA. Uma sequência com 48 bases que forma um ARNcd parcial de 24 bases foi introduzida entre sequências uPAR e uPA para permitir a transcrição eficiente de ambas moléculas ARNsi. A sequência bicistrónica foi terminada com uma sequência poli A codificada por uma sequência sinal poli ΔΑ BGH (FIGURA 43).

RT-PCR para o gene 0AS1, um gene de resposta antiviral clássico, indicou que não houve resposta imunitária como nas células controlo transfetadas e EV/SV. RT-PCR também foi conduzido para transcritos uPA e uPAR em células transfetadas com ARNi e anti-senso. Conforme determinado por RT-PCR, não foi observada qualquer alteração nos transcritos de ARNm uPAR ou uPA nas células transfetadas anti-senso, ao passo que os níveis de ARNm de uPAR ou uPA nas células transfetadas com ARNi foram reduzidos, indicando uma destruição do ARNm respetivo (24 h). 0 mecanismo de ARNi envolve a destruição das moléculas de ARNm alvo. A expressão de 0AS1 foi semelhante a grupos controlo (pGFP, pEV e pSV) indicando a ausência de resposta imunitária ao nível celular (FIGURA 44).

Exemplo 34. Localização in situ de vetores que expressam ARNi.

Secções embebidas em parafina foram desparafinizadas e re-hidratadas conforme protocolo padrão em condições livres de nuclease. Estas secções foram tratadas com proteinase K para revelar qualquer ADN ligado a proteínas. 0 ADN foi desnaturado conforme protocolo padrão. Plasmídeo pcDNA 3 foi tomado e a cassete de expressão contendo o promotor CMV (digestão com Nru I Hind III) foi rotulado com fosfatase alcalina termo-estável (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e hibridizado com as secções tratadas. A hibridização foi conduzida conforme as instruções do fabricante. Ratinhos injetados com mock não mostraram qualquer atividade da fosfatase alcalina, ao passo que ratinhos tratados com injeções IP de EV, SV, puPAR, puPA ou pU2 mostraram atividade da fosfatase alcalina, indicando a presença do promotor CMV. A atividade da fosfatase alcalinafoi, na maioria dos casos, localizada em redor dos vaos ssanguíneos e mostrou padrões radiantes à volta da vasculatura, indicando o cruzamento dos vetores plasmídeos portadores de CMV através da barreira do cérebro sanguíneo (FIGURA 45).

Exemplo 35. Determinação de gene de resposta interferão OAS1 para plasmideos circulares uPAR-Catepsina B.

Construções do plasmídeo para vetor vazio (EV), vetor misturado (SV), uPAR (pU), catepsina B (pC) e a construção bicistrónica para uPAR e catepsina B (pCU) foram utilizadas para determinar o nível de indução de interferão na linha de células de glioma humano SNB19. A expressão do gene 0AS1 foi utilizada como um indicador da indução de interferão. Foram utilizados plasmideos circulares (C), cassete de expressão linear (L) , e cassete de expressão linear COM sequência sinal poli A BGH deletada (-A) . Células SNB19 foram transfetadas com quantidades equivalentes do plasmideo ou cassetes de expressão anteriores e o ARN total foi isolado após 48 h de transfeção utilizando protocolos padrão. RT PCR foi realizada nas amostras anteriores e os níveis de amplicão 0AS1 foram determinados num gel de agarose. Os iniciadores utilizados para amplificação de OAS1 foram 5'-aggtggtaaag-ggtggctcc-3' e 5'-acaaccaggtcagcgtcagat-3'. Os iniciadores utilizados para amplificar a cassete de expressão dos plasmideos anteriores (EV, SV, pU, pC e pCU) foram: iniciador para a frente 5'ctggtgtcgacctgcttccgcgatgtacgggc3' e iniciador reverso 5' ctggtgtcgacatccccagcatgcctgctat3. RT-PCR para a indução de ARNm 0AS1 (2'S'-oligoadentlato sintetase) foi realizada para determinar a relevância de uma sequência sinal poli A. Foram utilizadas cassete de expressão circular, linear (cassete de expressão sozinha) e com sequência sinal poli A deletada (C, L, e -A, respetivamente) . No caso de EV e SV, não foi detetada sobre-indução de ARNm 0AS1. No caso de EV, não se esperou que o comprimento total do transcrito fosse mais de lkb e a estrutura prevista do transcrito não teve estrutura de ARNcd significativa para induzir uma resposta imunitária com ou sem uma cauda poli A conforme observado na figura (também em SV) . Por outro lado, com pU, pC e pCU a estrutura secundária prevista possuía estruturas ARNcd, mas com a presença de uma cauda poli A, ainda assim a indução da resposta imunitária não foi detetada (expressão de 0AS1) . No caso da cassete de expressão sozinha onde a sequência sinal poli A esteve presente, mas a construção transfetada foi linear, induziu uma resposta imunitária. Isto indicou que a presença de uma molécula circular produziu uma cauda poli A viável; e uma vez que a construção linear foi terminada logo após a sequência sinal poli A, a iniciação da cauda poli A viável não foi iniciada ou foi incompleta. No caso de construções lineares foi iniciada uma resposta imunitária com sequência sinal poli A deletada, indicando que a presença de uma cauda poli A pode ser importante na prevenção de uma resposta imunitária e na estabilidade da molécula de ARN transcrita. A indução de 0AS1 foi examinada em tumores xenoenxertados intracranianos tratados com EV, SV, pU, pC e pCU. Ratinhos normais que foram tratados com interferão α (3 pg/ratinho) intracranialmente foram incluídos e sacrificados 5 horas mais tarde. 0 baço e o fígado foram utilizados como tecidos controlo normais para substanciar a especificidade do anticorpo onde a presença da expressão de 0AS1 esteve presente em condições normais. Além da imuno-histoquimica, foi realizada hibridização in situ nestes tecidos utilizando oligos senso (acaaccaggtcagcgtcagat) para determinar os níveis de ARN de 0AS1. Apenas expressão muito mínima de ARNm de 0AS1 e proteínas nos cérebros de ratinho com tumores intracranianos ou nos cérebros dos ratinhos tratados com pU, pC e pCU. Notavelmente, não houve indução de 0AS1 no grupo tratado com pCU.

MATERIAIS E MÉTODOS

Construção de small hairpin RNAs expressing plasmids: uPA-uPAR: Oligonucleotídeos interferentes pequenos específicos para uPA de 346 a 367 bases (agcttGagagccctgctggcgcgccatatataatggcgcgccagcagggctctca) e para uPAR de 77 a 98 bases

(gatccTacagcagtggagagcgattatatataataatcgctctccactgctgtag) foram sintetizados e emparelhados. Um vetor plasmideo ARNi uPA-uPAR que expressa ARNsh para ambos uPA e uPAR sob o controlo de um promotor CMV humano foi construído inserindo pares dos oligonucleotídeos de ADN emparelhados específicos para uPA no local Hind III e uPAR no local BamHI sequencialmente no vetor pcDNA3 (sh-uPAuPAR). Além disso, foram construídos vetores de expressão ARNsh para uPA (sh-uPA) e uPAR (sh-uPAR) unicamente. Foi utilizado um vetor misturado pcDNA3 com uma sequência imperfeita, que não forma uma estrutura em forma de gancho perfeita, para desenvolver o vetor misturado para utilização como um controlo. Os controlos vetor vazio (EV) e vetor misturado (SV) foram testados em múltiplas linhas de células e não demonstram qualquer toxicidade para células conforme demonstrado pelo ensaio MTT após transfeção, bem como não tendo qualquer efeito na expressão de genes housekeeping, GAPDH e γ-actina. uPAR e MMP-9. pcDNA 3 foi utilizado para a construção de um vetor que expressa ARNsi para ambos uPAR e MMPs-9 a jusante do promotor citomegalovírus (CMV) (Esquema 1) . A sequência uPAR de +77 a +98 foi utilizada como a sequência alvo e por conveniência foi utilizado um oligo auto-complementar. A sequência uPAR com 21 bases de comprimento com uma região alça de 9 bases e locais BamHI foram incorporadas nas extremidades (gatcctacagcagtggagagcgat-tatatataataatcgctctccactgctgtag). 0 oligo foi auto-emparelhado em 6x SSC utilizando protocolos padrão e ligado ao local BamHI de um plasmídeo vetor pcDNA-3. Da mesma forma, uma sequência complementar MMP-9 de +360 a +381 (aattcaagtggcaccaccacaacaatatataattgttgtggtggtgccacttg) com locais EcoRI incorporados nas extremidades foi ligada no local EcoRI do vetor contendo a sequência ARNsi para uPAR. Isto resultou finalmente num plasmídeo de expressão ARNsi para uPAR e MMP-9 com uma separação de 35pb. A orientação de qualquer uma das inserções não importa, uma vez que os oligos são auto-complementares e têm uma simetria bilateral. O terminador SV40 serviu como um sinal de terminação para a síntese de ARN.

Catepsina B e uPA: pcDNA 3 foi utilizado para a construção de um vetor que expressa ARNsi para ambos catepsina B e uPAR a jusante do promotor citomegalovirus (CMV) (FIGURA 17). Foi utilizada a sequência uPAR de +77 a +98 como a sequência alvo e por conveniência foi utilizado um oligo auto-complementar. Foi utilizada a sequência uPAR com 21 bases de comprimento com uma região alça com 9 bases com locais BamHI incorporados nas extremidades (gatcctacagcagtggagagcgat-tatatataataatcgctctccactgctgtag). 0 oligo foi auto-emparelhado em 6x SSC utilizando protocolos padrão e ligado ao local BamHI de um plasmídeo vetor pcDNA-3. Da mesma forma, uma sequência complementar de catepsina B de +732 a +753 (tcgaggtggcctctatgaatcccaatatataattgggattcatagaggccacc) com locais Xhol incorporados nas extremidades foi ligado ao local Xhol do vetor que contém a sequência ARNsi para uPAR Isto finalmente resultou num plasmídeo de expressão de ARNsi para catepsina B e uPAR designado pCU. Vetores de expressão de ARNsi únicos para uPAR (pU) e catepsina B (pC) também foram construídos. A orientação de qualquer uma das inserções na única ou bicistrónica não é importante, uma vez que os oligos foram auto-complementares e tinham simetria bilateral. Terminador poli A BGH serviu como um sinal de terminação para a síntese de ARN para as três construções. uPAR, uPA e MMP-9: pcDNA3 foi utilizado para a construção de um vetor que expressa ARNsi para uPAR, uPA e MMP-9 a jusante do promotor citomegalovirus (CMV). A sequência uPAR de +77 a +98 foi utilizada como a sequência alvo e por conveniência foi utilizado um oligo auto-complementar. Foi utilizada a sequência uPAR com 21 bases de comprimento com uma região alça com 9 bases com locais BamHI incorporados nas extremidades (gatcctacagcagtggagagcgattatatataataatcgctctc-cactgctgtag). 0 oligo foi auto-emparelhado em 6x SSC utilizando protocolos padrão e ligado no local BamHI de um plasmídeo vetor pcDNA3. Da mesma forma, sequência complementar uPA de +346 a +367 (agcttgagagccctgctggcgcgccat-atataatggcgcgccagcagggctctca) com locais HindiII incorporados nas extremidades foi ligada no local HindIII e MMP-9 +360 a +381 (aattcaagtggcaccaccacaacaatatataattgttgtggtggtgccacttg) foi ligado no local EcoRI do vetor que contém a sequência ARNsi para uPAR e uPA. Isto finalmente resultou num plasmídeo de expressão de ARNsi para uPAR, uPA e MMP-9 designado pU2M. Vetores de expressão de ARNsi únicos para uPAR (puPAR), uPA (puPA) e MMP-9 (pMMP-9) também foram construídos. A orientação da inserção em qualquer uma de construção tricistrónica ou única não foi um fator, porque os oligos foram auto-complementares e tinham simetria bilateral. Terminador poli A BGH serviu como um sinal de terminação para síntese de ARN para as quatro construções.

Catepsina B e MMP-9: Foram sintetizadas sequências de repetição invertida auto-complementares espaçadas por uma região deficiente em G C com 9 bases dirigida a catepsina B (732 a 753) e MMP-9 (360 a 381) . Oligos para catepsina B foram terminados com locais Xho I e os oligos para MMP-9 foram terminados com EcoRI e auto-anelhados por aquecimento a 100°C durante 5 min e arrefecidos à temperatura ambiente em 6x SSC, o que poderia resultar na formação de moléculas de ADN de cadeia dupla com as respetivas extremidades do local de restrição adesivas. Estas moléculas de ADNcd foram ligadas aos locais Xhol e EcoRI do vetor plasmídeo pCDNA, resultando na formação de um plasmídeo que contém repetições invertidas para catepsina B e MMP-9 a jusante do promotor CMV e terminadas por um terminador SV40. O plasmídeo resultante designado pCM transfetado para células de mamífero poderia resultar na produção de uma molécula de ARNsi em forma de gancho dual dirigida a ambas Catepsina B e MMP-9, que seriam adicionalmente processadas por uma enzima que reconhece ARNcd (DICER) para produzir moléculas de ARNsi individuais para induzir ARNi (Esquema 1).

Condições de cultivo celular e transfeção: Células de cancro da próstata: Foram obtidas linhas de células de cancro da próstata humanas LNCaP, DU145 e PC3 da Coleção de Culturas Tipo Americana (Manassas, VA). Células LNCaP foram crescidas em meio RPMI suplementado com 2mM L-glutamina, 1,5 g/L bicarbonato de sódio, 4,5 g/L glicose, 10 mM HEPES e 1,0 mM Piruvato de sódio (Invitrogen,

Carlsbad, CA). Células PC3 e DU145 foram crescidas em meio essencial mínimo. Ambos meios continham 10% soro bovino fetal (GIBCO BRL, Lewisville, TX) e 5% penicilina/estreptomicina e foram mantidas numa incubadora a 37°C numa atmosfera humidificada 5% C02. As transfeções foram realizadas utilizando reagente Lipofectamine™ 2000 (Life technologies, Rockville, MD) conforme as instruções do fabricante. Após 72 h de transfeção, as células foram utilizadas para ensaios de proliferação celular, análise immunoblot, análise RT-PCR, ensaio de invasão em Matrigel, ensaio de fragmentação de ADN, ensaio EMSA e ensaio da atividade da caspase. Para DAPI e imunocoloração duplas, as transfeções foram realizadas em lâminas de câmara Lab-Tek 11 (Nalge Nunc International, Naperville, IL). Células de glioblastoma: A linha de células de glioblastoma humano SNB19 foi mantida em DMEM F-12 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suplementado com 10% FCS, 100-pg/ml estreptomicina e 100-unidades/ml penicilina (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37°C numa atmosfera humidificada 5% C02. As células foram transfetadas com plasmídeo pC pU ou pCU que expressa ARNsi utilizando o reagente Lipofectamine (Invitrogen Grand Island, NI) conforme as instruções do fabricante. Após transfeção, as células foram incubadas em meio contendo soro durante 48 h.

Zimografia em fibrina: A atividade enzimática e massa molecular de formas separadas por eletroforese de uPA foram determinadas em meio condicionado de linhas de células de cancro da próstata LNCaP, DU145 e PC3 by SDS-PAGE. Em suma, o gel SDS-PAGE contém acrilamida à qual plasminogénio purificado e fibrinogénio foram substratos antes da polimerização. Após polimerização, quantidades iguais de proteínas nas amostras foram submetidas a eletroforese e o gel foi lavado e corado. Células SNB 19 transfetadas com EV/SV puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M também foram realizadas conforme descrito aqui.

Zimografia em gelatina. Meios condicionados foram recolhidos de células transfetadas com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM e centrifugados para remover resíduos celulares. Vinte microgramas das amostras resultantes foram testadas em relação à atividade da gelatinase utilizando 10% géis de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida contendo gelatina (0,5 mg/ml) . Os géis foram corados com negro de amido (Sigma Aldrich ST LOUIS MO) e a atividade da gelatinase foi visualizada como áreas de bandas claras nos géis. Células SNB19 transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M também foram realizadas conforme descrito aqui.

Análise transcrição reversa-PCR: uPA-uPAR: ARN celular foi isolado utilizando o kit

Qiagen RNeasy e 1 g de ARN foi tratado com ADNase (10 unidades/g de ARN, lh) e utilizado como um molde para a reação de transcrição reversa (RT, 20 1) . A mistura da reação RT (Invitrogen) continha 11 (10 pm) de iniciadores. O ADNc resultante foi depois utilizado em reações PCR e analisado por eletroforese em gel. Foram utilizados os iniciadores seguintes: uPA-senso: 5'TGCGTCCTGGTCGTGAGCGA 3'; uPA-anti-senso: 5'CTACAGCGCTGACACGCTTG 3'; uPAR-senso: 5'CATGCAGTGTAAGACCCAACGGGGA 3'; uPAR-anti-senso: 5'AATAGGTGACAGCCCGGCCAGAGT 3'; GAPDH-senso: 5'CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT 3'; e GAPDH-anti-senso: 5'AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC3'.

Análise RT-PCR para células SNB19 transfetadas com control/EV, SV, puPAR, pMMP-9 e pUM foi realizada conforme descrita aqui.

Condições de PCR foram como se segue: 95°C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 95°C durante 1 min, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. A extensão final foi a 72 °C durante 5 min. A temperatura de emparelhamento varia dependendo da sequência das várias construções e foram realizadas seguindo os procedimentos padrão.

Deteção de imunofluorescência PC3: Células PC3 transfetadas com vários plasmídeos ARNsh foram fixos com 4% paraformaldeídeo e incubadas com anti-uPA (1: 500; Biomeda, Foster City, CA) e/ou anti-uPAR (1: 500; American Diagnostics Inc., Greenwich, CT). Após lavagem, anticorpos secundários fluorescentes (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foram adicionados a uma diluição 1:500. As células foram de novo lavadas três vezes com PBS e contra-coradas com DAP I. Foram adquiridas imagens fluorescentes utilizando um dispositivo acoplado carregado RT Slider Spot Camera (Diagnostic Instruments Inc, Burroughs Sterling Heights, MI) ligado a um microscópio (Olympus, Melville, NY) e gerido por um computador equipado com um programa de manchas RT v3.5 (Diagnostic instruments, Burroughs Sterling Heights, MI).

Ensaio de invasão em Matrigel de células: Após transfeção, as células foram destacadas e lavadas duas vezes em PBS. 5xl05 células foram semeadas na câmara superior de uma inserção trans-poço (poros com 12 μΜ) revestida com Matrigel (0,7 mg/ml) (Collaborative Research Inc., Boston, MA) . A câmara inferior foi preenchida com 4001 de meio RPMI. Após um período de incubação de 24 h, as células não migradas na câmara superior foram gentilmente raspadas e as células aderentes presentes na superfície inferior da inserção foram coradas com Hema-3 e fotografadas.

Ensaio da atividade da caspase in situ: A ativação de caspase foi detetada utilizando o kit de deteção policaspase (Immunochemistry Technologies, Bloomington, IL) de acordo com as instruções do fabricante. Neste ensaio, os inibidores fluorocromos não citotóxicos, permeáveis a células, de caspases (FLICA) ligam covalentemente a um resíduo de cisteína reativo na subunidade grande do heterodímero de caspase ativo, inibindo, assim, atividade enzimática adicional. Este kit utiliza um inibidor peptídico cetona fluorometilo rotulado com carboxifluoresceina de muitas caspases (caspase 1, -3, -4, -5, -6, -7, -8 e -9; FAM-VAD-FMK), que é uma sonda genérica para a deteção da maioria das caspases e emite fluorescência verde. O sinal fluorescente verde é uma medida direta da quantidade de caspase ativa na célula no momento em que o reagente é adicionado. Após 72 h de transfeção, a ativação da caspase foi detetada corando as células com o corante FAM-VAD-FMK (marcador in situ). Ο marcador ligado foi localizado por deteção de fluorescência conforme observado com um microscópio confocal. DAPI foi utilizado para coloração nuclear.

Ensaio de DNA laddering: Após transfeção, as células foram colhidas e lavadas duas vezes em PBS. Bolas de células foram re-suspensas em tampão de lise (lOmM Tris- HC1, 400mM NaCl, ImM EDTA e 1% TritonX-100) contendo 0,1 mg/ml Proteinase K (Invitrogen) e depois incubadas a 37°C durante 2 h. O ADN foi limpo dos lisados por centrifugação e depois extraído utilizando um volume igual de fenol/clorofórmio e precipitado adicionando etanol absoluto e 0,3 M acetato de sódio (pH 5,2) a -80°C durante 2 h. O ADN foi re-suspenso em tampão Tris-EDTA (lOmM Tris-HCl; pH 7,5, lmM EDTA), tratado com ARNase A a 37 °C durante lhe depois resolvido num gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio (0,5 g/ml).

Ensaio de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA): Após transfeção, as proteínas nucleares foram extraídas utilizando um kit de extração de proteínas (Ambion, Austin, TX), de acordo com as instruções do fabricante. Concentrações de proteínas nucleares foram determinadas em amostras diluídas utilizando um procedimento com ácido bicinconinico (Pierce Biochemical Company, Rockford, IL) . Interação entre Stat 3 no extrato proteico e sonda de ADNfoi investigada utilizando um kit de ensaio de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA) da Panomics (Redwood City, CA), de acordo com as instruções do fabricante.

Ensaio de rotulagem das extremidades do fragmento de ADN: Secções de tecido de tumor da próstata controlo ou tratadas com ARNsh (espessura 5 M) foram desparafinizadas e re-hidratadas. De seguida, as secções do tecido foram permeabilizadas cobrindo o espécime completo com solução de Proteinase K (20 g/ml Proteinase K em 10 mM Tris, pH 8) e incubadas durante 20 min à temperatura ambiente. As secções de tecido foram depois lavadas em solução salina tamponada com Tris (lx TBS, 20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl) . A inativação de peroxidases endógenas foi conseguida imergindo as secções de tecido em 3% peróxido de hidrogénio diluído em metanol durante 5 min à temperatura ambiente. As lâminas de vidro foram depois colocadas em tampão de equilíbrio Klenow (50 mM Tris pH 8, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2) durante 30 min. As secções de tecido foram depois incubadas com 60 1 de uma solução constendo uma mistura de desoxinucleotídeos rotulados e não rotulados a uma razão ótima para rotulagem das extremidades do fragmento de ADN com Klenow, de acordo com as instruções do fabricante (kit de deteção de fragmentação de ADN Klenow-FragEL, Oncogene Research Products, Cambridge, MA) a 37°C durante 90 min numa câmara humidificada. A reação enzimática foi parade por incubação com EDTA (0,5 M, pH 8) durante 5 min à temperatura ambiente. As lâminas foram depois lavadas com TBS e imergidas em tampão bloqueador durante 10 min (4% BSA em PBS) seguido de incubação com 100 1 de uma solução contendo peroxidase estreptavidina durante 30 min numa câmara humidificada à temperatura ambiente. As secções de tecido foram depois lavadas em TBS e cobertas com uma solução contendo 3, 3' diaminobenzidina (DAB, 0,7 mg/ml), peróxido de hidrogénio e ureia (0,6 mg/ml). De seguida, as lâminas foram lavadas com água destilada e contra-coradas com verde de metilo (0,3%) durante 30 seg e examinadas sob um microscópio de fluorescência Olympus. A coloração positiva rotulada das extremidades do fragmento de ADN foi classificada de seis imagens capturadas aleatoriamente/amostra utilizando programa de manchas RT v3.5 (Diagnostic instruments, MI).

Modelo de tratamento de próstata de ratinho ortotópico: Ratinhos nus machos atímicos (nu/nu; 6-8 semanas de idade) foram obtidos de Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, IN). Os procedimentos de manejo e experimentação animal foram aprovados pelo comité de experimentação animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Illinois. A implantação ortotópica foi realizada conforme descrito previamente. Em suma, após anestesia do corpo total com ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), foi feita uma incisão através da parede abdominal no abdómen inferior. Uma suspensão de células PC3 (lxlO6) em 30 μΐ PBS foi injetada num lóbulo lateral da próstata e a ferida foi fechada com agrafos metais cirúrgicos. Esta concentração de células foi necessária para atingir crescimento tumoral local consistente em 7 dias após a implantação. Os ratinhos foram divididos em cinco grupos de tratamento com seis ratinhos por grupo de tratamento. Aos dias 7 e 14 após a implantação, foi feita uma incisão através da parede abdominal e os tumores foram injetados com construções do plasmideo que expressam sh-uPA, sh-uPAR, sh-uPA-uPAR ou controlos EV/SV (75 pg/150 pg cada) . Noutro conjunto de experiências, os ratinhos implantados ortotopicamente foram co-injetados intratumoralmente com plasmideos sh-uPA e sh-uPAR (150 pg cada) nos dias 7 e 14. Os ratinhos foram sacrificados 14-15 dias após a injeção de plasmideo ARNsh final e o crescimento de tumor primário e locais de metástases foram determinados por inspeção visual e fotografados. Os tumores primários foram depois excisados, medidos e pesados. Os espécimes foram fixos em formalina e embebidos em parafina para coloração com H e E. Além disso, algum do tecido foi congelado rapidamente imediatamente para immunoblotting.

Western blotting. Células SNB19 foram transfetadas com mock, vetor vazio, pC, pU ou pCU e cultivadas 48 hr. No final da incubação, as células foram colhidas, lavadas duas vezes com PBS frio e lisadas em tampão (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Hcl, 2 mMEDTA, 1% NP-40, PH 7,4), contendo inibidores de protease. Quantidades iguais de proteína (30 pg/via) de sobrenadantes ou células foram submetidos a eletroforese em condições não redutoras em géis de acrilamida 10%. Após SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad). Para bloquear ligação não específica, a membrana foi incubada durante 2 h em PBS com 0,1% Tween-20 [T-PBS] contendo 5% leite magro durante 2 h. Subsequentemente, a membrana foi incubada durante 2 h com anticorpo contra catepsina B, uPAR, ERK, pERK, FAR ou pFAK, respetivamente, em T-PBS + 5% leite

magro. Após lavagem em T-PBS, a proteína na membrana foi visualizada utilizando o kit de deteção ECL™ com um anticorpo anti-coelho rotulado com peroxidase (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Reino Unido), de acordo com as instruções do fabricante. Para controlo de carga, as membranas foram despidas e sondadas com anticorpos monoclonais para β-actina, conforme protocolos padrão. Análise immunoblot para células SNB19 foram transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M também foi realizada conforme descrito aqui. Os seguintes anticorpos foram utilizados para análise immunoblot uPA-uPAR: anti-uPA (Biomeda, Foster City, CA), anti-uPAR (American Diagnostics Inc., Greenwich, CT), anti-Bax (Santa Cruz Biotechnology,

Santa Cruz, CA), anti-Bcl-Xs/L, (Santa Cruz Biotechnology,

Santa Cruz, CA), anti-caspase 9 (Cell Sig-naling Technology Inc., Beverly, MA), e anti-GAPDH (Abeam, Cambridge, MA) . Anticorpos contra formas fosfo e total de ERK, JNK, p38 e Stat 3 foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Western blotting para células SNB19 foram transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M também foi realizado conforme descrito aqui.

Análise imuno-histoquímica. Células SNB19 (lxlO4) foram semeadas em lâminas de câmara com 8 poços revestidas com vitronectina, incubadas durante 24 h e transfetadas com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM. Após 72 h adicionais, as células foram fixas com 3,7% formaldeídeo e incubadas com 1% albumina do soro bovino em PBS à temperatura ambiente durante 1 h para bloqueamento. Depois das lâminas serem lavadas com PBS, IgG anti-uPAR (coelho) ou IgG anti-MMP-9 (ratinho) foi adicionado a uma concentração de 1:200. As lâminas foram incubadas a 4o C durante a noite e lavadas três vezes com PBS para remover anticorpo primário em excesso. As células foram depois incubadas com conjugado FITC anti-ratinho ou conjugados IgG anti-FITC (diluição 1:500) durante 1 h à temperatura ambiente. As lâminas foram depois lavadas três vezes, cobertas com lamelas de vidro e foram tiradas microfotografias fluorescentes. Imagens unidas compostas foram obtidas para visualizer a expressão de uPAR e MMP-9 em células transfetadas com controlo/EV, SV, puPAR, pMMP-9 e pUM.

Ensaio de proliferação de células SNB19. O crescimento celular foi avaliado por ensaio MTS. Para detetar o efeito destas construções no crescimento das células SNB19 in vitro, foi medida a massa de células viáveis utilizando o ensaio colorimétrico Cell Titer 96™. 5x003 células de glioblastoma foram semeadas em triplicado em placas com 96 ou 24 poços e permitidas crescer durante 24 h antes da transfeção apenas com meio de cultivo (mock), vetores EV, SV, pC, pU e pCU durante 48 h. Estas células foram depois alteradas para meio contendo soro e permitidas diferentes intervalos temporais. Antes de cada ponto temporal, foi adicionado reagente MTS e continuous-se a incubação durante mais 2 h para permitir o desenvolvimento de cor. A4 90 foi medida em cada poço utilizando um leitor de placa ELISA. As leituras de absorvância dos cultivos de células a curto prazo vs. longo prazo foram comparadas e os efeitos destas construções foram interpretados em relação ao crescimento dos grupos não tratados/controlo correspondentes. A percentagem de inibição do crescimento devido às construções de ARNsi foi calculada em relação à taxa de crescimento das mesmas células no mesmo meio menos estas contruções.

Ensaios de proliferação de células PC3: A viabilidade das células 72 h após transfeção foi avaliada utilizando um ensaio MTT. MTT [3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, brometo de 5-difeniltetrazólio] (Sigma) foi adicionado ao meio de cultivo em cada poço a uma concentração de 500 g/ml e as placas foram incubadas durante 4 h a 37°C. Foi imediatamente adicionado ácido-isopropanol (0,04 N HCl/isopropanol) a todos os poços e misturado vigorosamente para que os cristais azúis escuros se dissolvessem de forma eficaz. A absorvância foi medida a 570 nm (Benchmark, BIORAD, Hercules, CA).

Ensaio angiogénico in vitro de SNB19. Células SNB19 (2xl04) foram semeadas em lâminas de câmara com 8 poços e transfetadas com mock, EV, pU, pC e pCU, conforme protocolos padrão. Após um período de incubação de 24 h, o meio foi removido e 4xl04 células endoteliais dérmicas humanas foram semeadas e permitidas co-cultivar durante 72 h. Após fixação em 3,7% formaldeído, as células endoteliais foram imuno-sondadas para antigeno do fator VIII. Anticorpo do fator VIII foi comprado da DAKO Corporation (Carpinteria, CA). As células foram lavadas com PBS e incubadas com anticorpo secundário conjugado com FITC durante 1 h. e foram depois lavadas e examinadas sob um microscópio fluorescente. Lâminas semelhantes de células endoteliais crescidas na presença de meios condicionados de células SNB 19 transfetadas com mock, EV, pU, pC ou pCU foram coradas com H e E para visualizar a formação de redes. Foi utilizado o programa Image Pro para quantificação da angiogénese, o grau de angiogénese foi medido pelo método seguinte: número de pontos de ramificação e o número total de ramos por ponto foram contados aleatoriamente (por 10 campos) com o produto indicando o grau de angiogénese comparado com os controlos. Foram realizados ensaios angiogénicos in vitro para células SNB19 (2xl04) semeadas em lâminas de câmara com 8 poços e transfetadas com mock/EV, puPAR, pMMP-9 e pUM conforme descrito aqui. Foram realizados ensaios angiogénicos para células SNB19 (lxlO4 poço-1) semeadas em lâminas de câmara com 8 poços, incubadas durante 24 hours e transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M conforme descrito aqui.

Modelo de câmara de dobra de pele dorsal: Ratinhos nus atímicos (nu/nu; 18 machos/Fêmeas, 28-32 g) foram criados e mantidos num ambiente livre de germes, especifico de patógeno A técnica de implantação do modelo de câmara de dobra de pele dorsal. Técnicas cirúrgicas de pequenos animais estéreis foram seguidas. Os ratinhos foram anestesiados por injeção ip com ketamina (50mg/kg) zilazina (10mg/kg). Assim que o animal foi anestesiado completamente, foi feito um saco aéreo dorsal no ratinho injetando 10ml de ar. Foram preparadas câmaras de difusão (Fisher) alinhando membranas com 0,45-micrónes Millipore (Fisher) em ambos lados do aro do anel "0" (Fisher) com selador. Assim que as câmaras secaram (2-3 min), elas foram esterilizadas por radiação UV durante 20 min. 20 μΐ de PBS foi utilizado para humedecer as membranas. 2xl05 células SNB 19 (transfetadas com mock, vetor vazio ou pCU), suspensas em 100-150 μΐ de PBS estéril, foram injetadas na câmara através da abertura do anel "0". A abertura foi selada por uma quantidade pequena de cera de osso. Foi feita uma incisão superficial com l\/2 a 2 cm horizontalmente ao longo da berma do saco aéreo dorsal e o saco aéreo foi aberto. Com a ajuda de fórcepes as câmaras foram colocadas por baixo da pele e suturadas cuidadosamente. Após 10 dias os animais foram anestesiados com ketamina/xilazina e sacrificados por perfusão intracardiaca com solução salina (10 ml) seguido de um 10 ml de 10% formalina/0,1 M solução fosfato e seguido por 0,001% solução FITC em PBS. Os animais foram cuidadosamente esfolados à volta das câmaras implantadas e as câmaras implantadas foram removidas da fáscia aérea s.c. As dobras de pele que cobrem as câmaras foram fotografadas sob luz visível e para fluorescência FITC. Os números de vasos sanguíneos dentro da câmara na área da fáscia do saco aéreo foram contados e os seus comprimentos medidos. Células SNB 19 transfetadas com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM também foram utilizadas para modelo de câmara de dobra de pele dorsal conforme descrito aqui.

Ensaio de migração de células SNB19: Uma suspensão de 2xl06 células em meio Eagle modificado por Dulbecco de uma variante que expressa GFP de células SNB19 foi semeada em placas de cultivo de tecido com 100 mm de anexação ultra baixa e cultivadas até se formarem agregados esferóides. Foram selecionados esferóides medindo -150 pm em diâmetro (cerca de 4xl04 células/esferóide), transfetados com mock, vetor vazio, pC, pU e pCU e cultivados durante 48 h. 72 h após transfeção, um único esferóide de glioma foi colcoado em cada poço de uma microplaca com 96 poços revestida de vitronectina (50 pg/mL) e cultivado com 200 pl de meio livre de soro. Os esferóides foram incubados a 37°C durante 24 h, após o qual os esferóides foram fixos e corados com Hema-3 e fotografados. A migração de células de esferóides a monocamadas foi medida utilizando um microscópio calibrado com um palco e um micrómetro ocular e utilizado como um índice de migração celular. Células de glioblastoma foram semeadas em triplicado em placas com 96 ou 24 poços e permitidas crescer durante 24 h antes da transfeção com meio de cultivo apenas (mock), EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM conforme descrito aqui. Foram realizados ensaios de migração celular para células SNB19 transfetadas com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM conforme descrito aqui. Foram realizados ensaios para células SNB19 (lxlO4 poço-1) foram semeadas em lâminas de câmaras com 8 poços, incubados durante 24 horas e transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M conforme descrito aqui.

Ensaio de invasão de câmara de Boyden de células SNB19: A capacidade de invasão in vitro de células SNB19 na presença do vetor que expressa ARNsi para catepsina B e uPAR foi avaliada utilizando um ensaio de câmara de Boyden modificado. Células SNB19 foram transfetadas com vetor mock, EV, pU, pC ou pCU que expressa ARNsi para catepsina B e uPAR único ou em conjunto durante 48 h. Células lxlO6 foram suspensas em 600 μΐ de meio livre de soro suplementado com 0,2% BSA e colocadas no compartimento superior das câmaras trans-poço (Corning Costar Fischer Scientific Cat N.° 07-200-158, Pittsburg, PA) revestidas com Matrigel (0,7 mg/ml). O compartimento inferior da câmara foi preenchido com 200 μΐ de meio livre de soro e as células foram permitidas migrar durante 24 h. Após incubação, as células foram fixas e coradas com Hema-3 e fotografadas. Foi realizada a quantificação do ensaio de invasão. Foram realizados ensaios para células SNB19 (lxlO4 poço-1) foram semeadas em lâminas de câmaras com 8 poços, incubadas durante 24 horas e transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M conforme descrito aqui.

Ensaio de esferóide SNB19: Células de glioblastoma SNB19 (3xl06) foram semeadas em placas de cultivo de tecido com 100 mm (Corning, Corning, NI) pré-revest idas com 0,75% agar preparadas em DMEM e cultivadas até se formarem os agregados esferóides. Foram selecionados esferóides com 100-200 pm de diâmetro e transfetados com mock, vetor vazio, pC, pU e pCU durante 48 h. Três dias após infeção, esferóides SNB19 foram corados com o corante fluorescente Dil e colocados em contacto com agregados cerebrais fetais de ratazana corados com DiO. A destruição progressiva dos agregados cerebrais fetais de ratazana e invasão de células SNB 19 foram observadas por microscopia de varrimento a laser confocal e fotografadas conforme descrito previamente. O volume remanescente de agregados cerebrais ou esferóides de tumor durante co-cultivos foi determinado conforme descrito previamente. Ensaios de esferóides para células SNB19 transfetadas com EV/SV, puPAR, pMMP-9 e pUM foram realizados conforme descrito aqui. Ensaios para células SNB19 (lxlO4 poço-1) foram semeadas em lâminas de câmaras com 8 poços, incubadas durante 24 horas e transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M foram realizados conforme descrito aqui.

Experiências com ratinhos para análise de glioma. Células SNB19 GFP (2xl06) foram injetadas nos cérebros de ratinhos nus utilizando uma estrutura estereotática. Após 8-10 dias, os ratinhos foram tratados com mock, vetor vazio EV/SV, pC, pU e pCU. A entrega intracraniana in vivo de vetores foi realizada utilizando mini bombas osmóticas Alzet (Direct Corp. Cupertion, CA) à taxa de 0,25 μΐ/hr, mock (PBS) de 150 pg vetor ADN, 150 pg pC, 150 pg pU, 150 pg pCU ou vetor puPAR (150 pg) , vetor pMMP-9 (150 pg) e vetor pUM (150 pg) foram injetados no cérebro (lOOuL por ratinho). Todas as experiências foram realizadas em conformidade com diretrizes institucionais estabelecidas pelo Comité de Utilizadores de Controlo Animal Institucional que aprova experiências na Faculdade de Medicina da Universidade de Illinois em Peoria. Após 5 semanas, ou quando os ratinhos controlo começaram a exibir sintomas, os ratinhos foram eutanasiados por perfusão cardíaca com formaldeído. Os cérebros foram depois removidos e embebidos em parafina conforme protocolos padrão. Foram preparadas secções e observadas para expressão de GFP ou foram coradas com H e E. As secções foram revistas cegamente e classificadas de forma semi-quantitativa em relação ao tamanho do tumor em cada caso. A área média do tumor por secção foi utilizada para calcular o volume do tumor e comparar entre controlos e grupos tratados. Foram realizadas experiências para células SNB19 (lxlO4 poço-1) foram semeadas em lâminas de câmaras com 8 poços, incubadas durante 24 horas e transfetadas com EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M conforme descrito aqui.

Análise estatística: Foram realizadas comparações estatísticas utilizando ANOVA para análise de significância entre diferentes valores utilizando o programa GraphPad Prism (San Diego, CA). Os valores são expressos como média DP de pelo menos três experiências separadas e as diferenças foram consideradas significativas a um valor de P inferior a 0,05.

Inibição de crescimento de tumor intracraniano. Para o modelo de tumor intracerebral, 2xl06 células SNB19 GFP foram injetadas intracerebralmente em ratinhos nus. Os tumores foram permitidos crescer durante 10 dias. Nesta altura, os animais foram aleatorizados em sete grupos e EV/SV, puPAR, puPA, pMMP-9 e pU2M (150 pg de cada construção foram injetados no cérebro utilizando mini bombas osmóticas Alzet a uma taxa de 0,25 μΐ th1 (seis ratinhos em cada grupo). Cinco semanas após a inoculação do tumor, seis ratinhos de cada grupo foram sacrificados por perfusão cardíaca com 3,5% formaldeído em PBS. Os seus cérebros foram removidos e colocados em 4% paraformaldeído durante 24 horas, embebidos em parafina e seccionados. As secções foram rastreadas para fluorescência GFP para examiner o crescimento tumoral sob um microscópio fluorescente. As secções foram revistas cegamente e classificadas de forma semi-quantitativa em relação ao tamanho do tumor. A área média do tumor em cada secção foi utilizada para calcular o volume do tumor e comparar entre controlos e grupos tratados.

Ensaio de invasão em matrigel. A capacidade de invasão das células SNB 19 transfetadas foi testada in vitro com ο ensaio de invasão na câmara de Boyden após transfeção ou com o vetor vazio (EV) ou com o vetor que expressa ARNsi para catepsina B e MMP-9 (pCM). Em suma, inserções trans-poço com poros de 8-pm foram revestidss com Matrigel (0,7 mg/ml) (Collaborative Research, Inc., Boston, MA). Células SNB19 foram tripsinizadas e 500 μΐ da suspensão celular (lxlO6 células/ml) foi adicionado aos poços em triplicado. Após incubação durante 24 h a 37°C, as células que passaram pelos filtros para os poços inferiores foram quantificadas e expressas como uma percentagem da soma de células nos poços superior e inferior. As células no lado inferior da membrana foram fixas, coradas com Hema-3 e fotografadas.

Ensaios para outras construções descritos também foram realizados seguindo os procedimentos descritos aqui.

Entrega de ácidos nucleicos: As entregas dos ácidos nucleicos são conseguidas utilizando qualquer tipo de métodos, tais como, por exemplo, agente lipofílico, vírus incluindo adeno, associados a adeno ou lenti ou com vírus modificados. Também são utilizadas construções do plasmídeo nuas que são circulares ou lineares com extremidades rombas ou adesivas, como ARN de cadeia dupla, ARN de cadeia simples ou híbridos ADN-ARN onde uma das cadeias é ADN e a outra é ARN ou com estrutura dorsal ribose ou desoxirribose na mesma cadeia. ADN, ARN ou híbridos ADN-ARN revestidos com proteínas ou carbohidratos ou combinações dos mesmos ou utilizados em conjunto com hormonas ou derivados de hormonas. ADN, ARN ou híbridos ADN-ARN quimicamente modificados também podem ser utilizados como moléculas terapêuticas para induzir direcionamento de ARNi de uPAR, uPA, MMP-9 e Catepsina B em qualquer combinação. A utilização pretendida seria em organismos eucariontes ou linhas de células, preferencialmente humanos e linhas de células humanas. Métodos e composições terapêuticas conhecidos daqueles habilitados na arte para entregar ARNsi ou ARNsh estão dentro do âmbito da presente revelação. Por exemplo, ARNsi, ARNsh e outros ácidos nucleicos revelados aqui podem ser entregues a células de mamíferos através de técnicas, tais como entrega de vetor virai, lipofeção, métodos eletroquimicos e bioquímicos. Entrega baseada em vírus inclui gerar vetores adenoviral recombinante, lentiviral, retroviral ou quaisquer vetores adequados que alberguem um ácido nucleico de interesse e entregar os vetores virais utilizando técnicas conhecidas daqueles habilitados na arte. Sistemas de entrega baseados em lipossomas incluem lipofeção e composições baseadas em cardiolipina. Entrega direta de ácidos nucleicos nus e em combinação com adjuvantes químicos ou bioquímicos está dentro do âmbito desta revelação. Por exemplo, plasmídeos circulares que albergam ARNsi contra uma sequência alvo, tais como, por exemplo, uPA, uPAR, MMP-9, e catepsina B podem ser diretamente injetados ou entregues intratumoralmente ou podem ser injetados intraperitonealmente. Da mesma forma, ácidos nucleicos preparados sinteticamente ou quimicamente também podem ser entregues intratumoralmente ou intraperitonealmente. Além disso, entrega seletiva ou específica de ARNsi ou ácidos nucleicos que expressam ARNsi também pode ser conseguida através de acoplamento adequado com outro agente tal como um ácido nucleico peptídico (PNA) ou um anticorpo ou qualquer agente alvo adequado. As técnicas e métodos supra-mencionados são adequados e adaptáveis para entregar sequências de ácido nucleicos intercelularmente, intracelularmente, cultivos de células in vitro, in vivo, dentro de um orgão, ao longo da barreira sangue-cérebro, a cancros da próstata, gliomas, cancros da mama e cancros do cólon.

Sequências: Sequências para várias construções de ARNsi (sequência parcial) são reveladas aqui. A porção sublinhada indica as repetições invertidas auto-complementares. 0 negrito indica a sequência alça interveniente.

UPAR-uPA GCTAACTAGA GAACCCACTG CTTACTGGCT TATCGAAATT AATACGACTC ACTATAGGGA GACCCA agcttGagaeccctectegcgcgccatatataateecgcgccagcagggctctca AGCT TGGTACCGAG CTCG gatccTacagcagtggagagcgattatatataataatcgctctccactgctgtag GATCCA CTAGTAACGG CCGCCAGTGT GCTGGAATTC TGCAGATATC CATCACACTG GCGGCCGCTC GAGCATGCAT CTAGAGGGCC CTATTCTATA GTGTCACCTA AATGCTAGAG CTCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAA TAAAAaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Espaço entre alças em forma de gancho com 22 bases UPAR-MMP-9

GCTAACTAGA GAACCCACTG CTTACTGGCT TATCGAAATT AATACGACTC ACTATAGGGA GACCCA AGCT TGGTACCGAG CTCG gatccTacagcagtggagagogattatatataataatcgctctccactectgtag GATCCA CTAGTAACÕG CCGCCAGTGT GCTGG aattCaagtggcac&accacaasaatatataattgttgtggtggtgccacttg AATTC TGCAGATATC CATCACACTG GCGGCOGCTC GAGCATGCAT CTAGAGGGCC CTATTCTATA GTGTCACCTA AATGCTAGAG CTCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAA TAAAAaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Espaço entre alças em forma de gancho com 35 bases

UPAR CB

GCTAACTAGA GAACCCACTG CTTACTGGCT TATCGAAATT AATACGACTC ACTATAGGGA GACCCA AGCT TGGTACCGAG CTCG gatccTacaecagtggagagcgattatatataataatc gctctccactgctetag GATCCA CTAGTAACGG CCGCCAGTGT GCTGG AATTC TGCAGATATC CATCACACTG GCGGCCGC tcgaGgtggcctctatgaatcccaatatataattgggattcatagaggccacc TC GAGCATGCAT CTAGAGGGCC CTATTCTATA GTGTCACCTA AATGCTAGAG CTCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAA TAAAAaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Espaço entre alças em forma de gancho com 68 bases MMP9-CB

GCTAACTAGA GAACCCACTG CTTACTGGCT TATCGAAATT AATACGACTC ACTATAGGGA GACCCA AGCT TGGTACCGAG CTCG GATCCA CTAGTAACGG CCGCCAGTGT GCTGG aattCaagtggcaccaecacaacaatatataattgttgtggtggtgccacttg AATTC

TGCAGATATC CATCACACTG GCGGCCGC tcgaGgtggcctctatgaatcccaatatataattgggattcatagaggccacc TC GAGCATGCAT CTAGAGGGCC CTATTCTATA GTGTCACCTA AATGCTAGAG CTCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAA TAAAAaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Espaço entre alças em forma de gancho com 37 bases

UPAR, uPA e Cath B

GCTAACTAGA GAACCCACTG CTTACTGGCT TATCGAAATT AATACGACTC ACTATAGGGA GACCCA AGCT TGGTACCGAG CTCG

gatccTacagcagteeagagcgattatatataataatcgctctccactactetaff GATCCA CTAGTAACGG CCGCCAcTacagcagtggagaeceattatatataataatcgctctccactectgtagGTGT GCTGG AATTC TGCAGATATC CATCACACTG GCGGCCGC

tcgaGgtgg&ctctatgaatcccaatatataaftgggattcatagaggccacc TC GAGCATGCAT CTAGAGGGCC CTATTCTATA GTGTCACCTA AATGCTAGAG CTCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAA TAAAAaaaaaaaaaaaaaaaaaaa DOCUMENTOS CITADOS

Estes documentos são listados apenas na medida em que se relacionam a materiais e métodos na presente revelação.

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Zhang, Z., et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 11636-11641 É revelada uma construção de ARN interferente curta multicistrónica que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda sequência auto-complementar, em que a construção é utilizada para inibir a formação de tumor e para regredir tumores pré-formados.

Também é revelada a construção multicistrónica anterior, em que a primeira sequência auto-complementar compreende uma sequência nucleotídica do recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) humano e o seu complemento e a segunda sequência auto-complementar compreende uma sequência nucleotídica de ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPA) humano e o seu complemento. É ainda revelada a construção multicistrónica anterior, em que a sequência auto-complementar de uPA é TGAGAGCCCTGCTGGCGCGCC-alça-GGCGCGCCAGCAGGGCTCTCA e a sequência auto-complementar de uPAR é CTACAGCAGTGGAGAGCGATT-alça-AATCGCTCTCCACTGCTGTAG.

Também é revelada a construção multicistrónica anterior, em que as sequências auto-complementares de uPAR e uPA são separadas por uma sequência interveniente de comprimento de cerca de 22-35 pares de base. É ainda revelada a construção multicistrónica anterior, em que a sequência interveniente é AGCTTGGTAC-CGAG CTCG GATC.

Também é revelada a construção de ARN interferente curta multicistrónica anterior que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda sequência auto-complementar, em que a construção é utilizada para inibir a formação de tumor e para regredir tumores pré-formados e em que a primeira sequência auto-complementar compreende a sequência nucleotidica do recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e o seu complemento e a segunda sequência auto-complementar compreende a sequência nucleotidica da matriz metaloprotease 9 (MMP-9) e o seu complemento.

Também é revelada a construção multicistrónica anterior, em que a sequência auto-complementar de uPAR é CTACAGCAGTGGAGAGCGATT-alça-AATCGCTCTCCACTGCTGTAG e a sequência auto-complementar de MMP-9 é CAAGTGGCACCACCACAACAA-alça-TTGTTGTGGTGGTGCCACTTG.

Também é revelada a construção multicistrónica anterior, em que cada alça compreende 9 nucleotideos. É ainda revelada a construção multicistrónica anterior, em que cada alça compreende 9 nucleotideos e em que cada alça é ATATATAAT.

Também é revelada a construção multicistrónica anterior que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda sequência auto-complementar, em que a construção é utilizada para inibir a formação de tumor e para regredir os tumores pré-formados revelados anteriormente e em que as sequências auto-complementares são separadas por uma sequência interveniente de cerca de 22-35 pares de base de comprimento. É ainda revelada a construção multicistrónica revelada anteriormente, em que a sequência interveniente é GATCCA CTAGTAACGG CCGCCAGTGT GCTGG AATT.

Também é revelada a construção multicistrónica anterior que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda sequência auto-complementar, em que a construção é utilizada para inibir a formação de tumor e para regredir os tumores pré-formados revelados anteriormente, em que a construção é um ácido nucleico circular. É revelado um método de inibir a formação de tumor ou regredir tumores pré-formados, compreendendo o método: (a) administrar a construção multicistrónica de ARN interferente curta revelada anteriormente ao tumor; e (b) reduzir a expressão de uma pluralidade de genes expressos no tumor e dirigidos pela construção de ARN interferente curta, inibindo, assim, o tumor.

Também é revelado o método anterior, em que a construção multicistrónica de ARN interferente curta está dirigida ao recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPA). É ainda revelado o método anterior, em que a construção multicistrónica de ARN interferente curta compreende TGAGAGCCCTGCTGGCGCGCC-alça- GGCGCGCCAGCAGGGCTCTCA- sequência interveniente-CTACAGCAGT-GGAGAGCGATT-alça- AATCGCTCTCCACTGCTGTAG. É ainda revelada a construção de ARN interferente curta multicistrónica anterior que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda sequência auto-complementar, em que a construção é utilizada para inibir a formação de tumor e para regredir tumores pré-formados e em que os tumores são inibidos reduzindo pelo menos uma de proliferação de células tumorais, invasão de células tumorais, migração de células tumorais e angiogénese. É ainda revelada a construção de ARN interferente curta multicistrónica anterior que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda sequência auto-complementar, em que a construção é utilizada para inibir a formação de tumor e para regredir tumores pré-formados e em que os tumores são seleccionados do grupo que consiste em cancro da próstata, glioma, cancro da mama e melanoma.

Também é revelada a construção de ARN interferente curta multicistrónica anterior, em que a construção é administrada através de entrega direta.

Também é revelado o método anterior, em que a construção multicistrónica de ARN interferente curta está dirigida ao recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e matriz metaloprotease 9 (MMP-9).

Também é revelado o método anterior, em que a construção multicistrónica de ARN interferente curta compreende CTACAGCAGTGGAGAGCGATT-alça- AATCGCTCTCCACTGCTGTAG- sequência interveniente- CAAGTGGCACCAC-CACAACAA-alça- TTGTTGTGGTGGTGCCACTTG.

É revelada uma molécula de ARN interferente curta selecionada do grupo que consiste em moléculas de ARN dirigidas a: (a) recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e matriz metaloprotease 9 (MMPs-9) a molécula de ARN interferente curta, compreendendo a sequência de ácido nucleico CUACAGCAGUGGAGAGCGAUU-alça-AAUCGCU-CUCCACUGCUGUAG-espaçador- CAAGUGGCACCACCACAACAA-alça- UUGUUGUGGUGGUGCCACUUG; e (b) recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPA), a molécula de ARN interferente curta que compreende a sequência de ácido nucleico UGAGAGCCCUGCUGGCGCGCC-alça-GGCGCGCCAGCAGGGCUCUCA-CUACAGCAGUGGAGAGCGAUU- alça-AAUCGCUCUCCACUGCUGUAG.

Também é revelada uma célula recombinante transformada com a construção multicistrónica anterior.

Também é revelado um vírus recombinante transformado com a construção multicistrónica anterior.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ILLINOIS

<12 0> CONSTRUÇÕES DE ARNSI MULTICIS TRÓNICAS PARA INIBIR

TUMORES <13 Ο > 100-030Τ1 <150> ΕΡ 05 826 614.9 (PCTUS2005/041709) <151> 17-11-2005 <150> 60/629.659 <151> 18-11-2004 <160> 38 <170> Patentln Ver. 3.3

<210> 1 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <22 0> <221> base modificada <222> (22)..(30) <223> Alças nucleotidica de variável 9 <22 0> <223> Veja-se a memória descritiva como se apresenta na descrição detalhada das substituições e formas de realização preferidas <4 0 0> 1 tgagagccct gctggcgcgc cnnnnnnnnn ggcgcgccag cagggctctc a 51 <210> 2

<211> 51 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <22 0> <221> base modificada <222> (22)..(30) <223> Alças nucleotidica de variável 9 <22 0> <223> Veja-se a memória descritiva como se apresenta na descrição detalhada das substituições e formas de realização preferidas <400> 2 ctacagcagt ggagagcgat tnnnnnnnnn aatcgctctc cactgctgta g 51

<210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <400> 3 agcttggtac cgagctcgga tc 22 <210> 4 <211> 51 <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <22 0> <221> base modificada <222> (22)..(30) <223> Alças nucleotidica de variável 9 <22 0> <223> Veja-se a memória descritiva como se apresenta na descrição detalhada das substituições e formas de realização preferidas <400> 4 caagtggcac caccacaaca annnnnnnnn ttgttgtggt ggtgccactt g 51

<210> 5 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <400> 5 gatccactag taacggccgc cagtgtgctg gaatt 35

<210> 6 <211> 49 <212> ADN <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <213> Sequência artificial <22 0> <22 0> <221> base modificada <222> (21) . . (29) <223> Alças nucleotidica de variável 9 <22 0> <223> Veja-se a memória descritiva como se apresenta na descrição detalhada das substituições e formas de realização preferidas <400> 6 caagtggcac caccacaaca nnnnnnnnnt gttgtggtgg tgccacttg 49

<210> 7 <211> 68 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <400> 7 gatccactag taacggccgc cagtgtgctg gaattctgca gatatccatc acactggcgg 60 ccgctcga 68

<210> 8 <211> 37 <212> ADN <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <213> Sequência artificial <22 0> <400> 8 aattctgcag atatccatca cactggcggc cgctcga 37

<210> 9 <211> 51 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <22 0> <221> base modificada <222> (22)..(30) <223> Alças nucleotidica de variável 9 <22 0> <223> Veja-se a memória descritiva como se apresenta na descrição detalhada das substituições e formas de realização preferidas <400> 9 cuacagcagu ggagagcgau unnnnnnnnn aaucgcucuc cacugcugua g 51

<210> 10 <211> 51 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <22 0> <221> base modificada <222> (22)..(30) <223> Alças nucleotidica de variável 9 <22 0> <223> Veja-se a memória descritiva como se apresenta na descrição detalhada das substituições e formas de realização preferidas <4 0 0> 10 caaguggcac caccacaaca annnnnnnnn uuguuguggu ggugccacuu g 51

<210> 11 <211> 51 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <22 0> <221> base modificada <222> (22)..(30) <223> Alças nucleotidica de variável 9 <22 0> <223> Veja-se a memória descritiva como se apresenta na descrição detalhada das substituições e formas de realização preferidas <4 Ο 0> 11 ugagagcccu gcuggcgcgc cnnnnnnnnn ggcgcgccag cagggcucuc a 51

<210> 12 <211> 49 <212> ARN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <22 0> <221> base modificada <222> (21) . . (29) <223> Alças nucleotidica de variável 9 <22 0> <223> Veja-se a memória descritiva como se apresenta na descrição detalhada das substituições e formas de realização preferidas <4 0 0> 12 caaguggcac caccacaaca nnnnnnnnnu guuguggugg ugccacuug 49

<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <4 Ο 0> 13 aggtggtaaa gggtggctcc 20

<210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <4 0 0> 14 acaaccaggt cagcgtcaga t 21

<210> 15 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <4 0 0> 15 ctggtgtcga cctgcttccg cgatgtacgg gc 32

<210> 16 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <4 Ο 0> 16 ctggtgtcga catccccagc atgcctgcta t 31

<210> 17 <211> 55 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <4 0 0> 17 agcttgagag ccctgctggc gcgccatata taatggcgcg ccagcagggc tctca 55

<210> 18 <211> 55 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <4 0 0> 18 gatcctacag cagtggagag cgattatata taataatcgc tctccactgc tgtag 55

<210> 19 <211> 53 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <4 Ο 0> 19 aattcaagtg gcaccaccac aacaatatat aattgttgtg gtggtgccac ttg 53

<210> 20 <211> 53 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <400> 20 tcgaggtggc ctctatgaat cccaatatat aattgggatt catagaggcc acc 53

<210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <400> 21 tgcgtcctgg tcgtgagcga 20

<210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <4Ο0> 22 ctacagcgct gacacgcttg 20

<210> 23 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <400> 23 catgcagtgt aagacccaac gggga 25

<210> 24 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <400> 24 aataggtgac agcccggcca gagt 24

<210> 25 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <4Ο0> 25 cggagtcaac ggatttggtc gtat 24

<210> 26 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <400> 26 agccttctcc atggtggtga agac 24

<210> 27 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <400> 27 gttcgaaatt agtttggtta ac 22

<210> 28 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Iniciador sintético <4Ο0> 28 ccgaataact aatattataa acg 23

<210> 29 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Sonda sintética <400> 29 gagctgttca ccggggtggt g 21

<210> 30 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Sonda sintética <400> 30 ctacagcagt ggagagcgat t 21

<210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Sonda sintética <4Ο0> 31 caagtggcac caccacaaca a 21

<210> 32 <211> 444 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Construção sintética de ARNsi <400> 32 gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga 60 gacccaagct tgagagccct gctggcgcgc catatataat ggcgcgccag cagggctctc 120 aagcttggta ccgagctcgg atcctacagc agtggagagc gattatatat aataatcgct 180 ctccactgct gtaggatcca ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc tgcagatatc 240 catcacactg gcggccgctc gagcatgcat ctagagggcc ctattctata gtgtcaccta 300 aatgctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 360 tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgfc cctttcctaa 420 taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 444

<210> 33 <211> 442 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Construção sintética de ARNsi <400> 33 gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactç actataggga 60 gacccaagct tggtaccgag ctcggatcct acagcagtgg agagcgatta tatataataa 120 tcgctctcca ctgctgtagg atccactagt aacggccgcc agtgtgctgg aattcaagtg 180 gcaccaccac aacaatatat aattgttgtg gtggtgccac ttgaattctg cagatatcca 240 tcacactggc ggccgctcga gcatgcatct agagggccct attctatagt gtcacctaaa 300 tgctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 360 cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 442

<210> 34 <211> 442 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Construção sintética de ARNsi <400> 34 gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga 60 gacccaagct tggtaccgag ctcggatcct acagcagtgg agagcgatta tatataataa 120 tcgctctcca ctgctgtagg atccactagt aacggccgcc agtgtgctgg aattctgcag 180 atatccatca cactggcggc cgctcgaggt ggcctctatg aatcccaata tataattggg 240 attcatagag gccacctcga gcatgcatct agagggccct attctatagt gtcacctaaa 300 tgctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 360 cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 442

<210> 35 <211> 440 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Construção sintética de ARNsi <400> 35 gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgractc actataggga 60 gacccaagct tggtaccgag ctcggatcca ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc 120 aagtggcacc accacaacaa tatataattg ttgtggtggt gccacttgaa ttctgcagat 180 atccatcaca ctggcggccg ctcgaggtgg cctctatgaa tcccaatata taattgggat 240 tcatagaggc cacctcgagc atgcatctag agggccctat tctatagtgt cacctaaatg 300 ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 360 cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 440

<210> 36 <211> 493 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descripción de la sequência artificial: Construção sintética de ARNsi <400> 36 gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga 60 gacccaagct tggtaccgag ctcggatcct acagcagtgg agagcgatta tatataataa 120 tcgctctcca ctgctgtagg atccactagt aacggccgcc actacagcag tggagagcga 180 ttatatataa taatcgctct ccactgctgt aggtgtgctg gaattctgca gatatccatc 240 acactggcgg ccgctcgagg tggcctctat gaatcccaat atataattgg gattcataga 300 ggccacctcg agcatgcatc tagagggccc tattctatag tgtcacctaa atgctagagc 360 tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 420 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaa 493

<210> 37 <211> 10 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <400> 37 aaaaaaaaaa 10

<210> 38 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleotideo sintético <400> 38 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 39

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • EP 05826614 A [0167] • US 2005041709 W [0167] • US 60629659 B [0167]

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Lisboa, 14 de Dezembro de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Uma construção de ARN interferente curta bicistrónica que compreende uma primeira sequência auto-complementar do recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e uma segunda sequência auto-complementar de matriz metaloprotease 9 (MMP-9) e uma sequência interveniente entre a primeira e segunda sequências auto-complementares de cerca de 22-68 pares de base.
2. A construção bicistrónica da reivindicação 1, em que a sequência auto-complementar de uPAR é CTACAGCAGTGGA-GAGCGATT-alça-AATCGCTCTCCACTGCTGTAG (SEQ. ID N.° 2) e a sequência auto-complementar de MMP-9 é CAAGTGGCACCACCACAACAA-alça-TTGTTGTGGTGGTGCCACTTG (SEQ. ID N.0 4) .
3. A construção bicistrónica da reivindicação 2, em que cada alça compreende 9 nucleotideos.
4. A construção bicistrónica da reivindicação 3, em que cada alça é ATATATAAT.
5. A construção bicistrónica da reivindicação 1, em que a sequência interveniente é GATCCA CTAGTAACGG CCGCCAGTGT GCTGG AATT (SEQ. ID N.° 5).
6. A construção bicistrónica da reivindicação 1, em que a construção é um ácido nucleico circular.
7. Composição farmacêutica que compreende a construção bicistrónica de ARN curta interferente de qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. A composição farmacêutica da reivindicação 7, em que a construção de ARN interferente curta bicistrónica está dirigida para recetor ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPAR) e matriz metaloprotease 9 (MMP-9).
9. A composição farmacêutica da reivindicação 7, em que a construção bicistrónica de ARN curta interferente compreende CT-ACAGCAGTGGAGAGCGATT-alça-AATCGCTCTCCACTGCTGTAG-sequência interveniente-CAAGTGGCACCAC-CACAACAA-alça-TTGTTGTGGTGGTGCCACTTG (SEQ. ID N.°s 2 e 4, respetivamente, por ordem de aparecimento).
10. A construção bicistrónica de qualquer uma das reivindicações 1-6 para inibir a formação de tumor e regredir tumores pré-formados.
11. A construção bicistrónica para a utilização da reivindicação 10, em que os tumores são inibidos reduzindo pelo menos uma de proliferação de células tumorais, invasão de células tumorais, migração de células tumorais e angiogénese.
12. A construção bicistrónica para a utilização da reivindicação 10, em que os tumores são selecionados do grupo que consiste em cancro da próstata, glioma, cancro da mama, e melanoma.
13. A construção bicistrónica para a utilização da reivindicação 12, em que a construção é para ser administrada sistemicamente.
14. A construção bicistrónica para a utilização da reivindicação 12, em que a construção é para ser administrada através de entrega direta.
15. Uma célula recombinante transformada com a construção bicistrónica da reivindicação 1.
16. Um vírus recombinante transformado com a construção bicistrónica da reivindicação 1. Lisboa, 14 de Dezembro de 2015