PT2008100168W - Método para a identificação funcional de novas células neuronais, células mãe neuronais, astrócitos e células imaturas de culturas de células estaminais e seus usos. - Google Patents

Description

ΡΤΙ2008100168 1 DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO FUNCIONAL DE NOVAS CÉLULAS NEURONAIS, CÉLULAS MÃE NEURAIS, ASTRÓCITOS E CÉLULAS IMATURAS DE CULTURAS DE CÉLULAS ESTAMINAIS E SEUS USOS"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento descreve um método para a identificação funcional de populações neuronais baseada em procedimentos de visualização de células individuais através de imagiologia de cálcio. Este método permite a identificação rápida e simultaneamente funcional/morfológica da diversidade de células na população, permitindo subsequentemente intervenção farmacológica nas células identificadas. Além do mais, este método é adequado para filtrar os factores capazes de promover a diferenciação de células.

ANTECENDENTES DO INVENTO

Reynolds e Weiss (1992) [1] identificaram uma população residente de células estaminais no região subventricular (SVZ) do cérebro de rato, dotado de capacidades proliferativas e auto-renováveis, e capazes de gerar células neuronais e gliais. Desde ai, as células estaminais foram identificadas na SVZ de outras espécies mamíferas, incluindo os primatas [2, 3]. Neuroblastos derivados de SVZ 2 ΡΊΊ2008100168 migram pela corrente migratória rostral até ao bulbo olfactivo (BO), onde se diferenciam funcionalmente em interneurónios, envolvidos na discriminação de odor [4, 5, 6, 7, 8] . A caracterização de neurónios SVZ e de precursores neuronais é feita principalmente por imunocito-química. As culturas SVZ são culturas mistas de células imaturas, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos, progenitores neuronais e gliais, em diferentes estádios de diferenciação [1, 9, 10]. As células SVZ imaturas expressam o filamento intermédio da proteina nestina [9, 11] . O compromisso neuronal prematuro é detectado através da expressão do isótopo da β-tubulina de classe III neurónio-associada [12]. Neuroblastos SVZ imaturos e migratórios expressam dupla-cortina (DCX), uma proteina associada ao microtúbulo [13, 14], e a molécula de adesão à célula neuronal polisialilada (PSA-NCAM) [15, 16]. À medida que a maturação ocorre, os neurónios pós-mitóticos derivados de SVZ expressam MAP-2, neurofilamentos (NF), enzima de enolase especifica dos neurónios (NSE) [17] e NeuN [18]. No entanto, a imunocitoquímica é morosa, não fornece informação sobre a função, e actua em células fixas, isto é, mortas, atrasando o seu uso posterior em propósitos terapêuticos. A medição das variações da concentração de cálcio livre intracelular é útil para caracterizar rapidamente as células funcionais. De facto, a despolarização da membrana ΡΤΙ2008100168 cie células excitáveis, tal como neurónios, após exposição a concentração de KC1 (cloreto de potássio) alta, leva à abertura de canais de cálcio sensíveis à voltagem (VSCC) e influxo massivo de cálcio no citoplasma [19]. Células imaturas/estaminais, tal como células estaminais de embrião, células de carcinoma e de astrocitoma, expressam receptores de histamina funcionais [20, 21, 22, 23, 24, 25]. Apesar de o papel especifico da histamina na neurogénese e no desenvolvimento neuronal não ser bem percebido, a expressão especifica dos receptores de histamina pode ser usada como um marcador para células mãe indifereciadas e de progenitores neuronais indiferenciados. De facto, a estimulação de células imaturas/estaminais com histamina aumenta transitoriamente [Ca2+]i [20, 22, 26], incluindo as células precursoras imaturas de SVZ adulto e pós-natal [25] . A patente US 7,217,565 descreve um método para a identificação e isolamento de populações de células de células estaminais e culturas de células mãe progenitoras baseado na selecção de células activadas fluorescentemente ou alta selecção magnética gradual, mas usando anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromas ou conjugados com partículas magnéticas.

Ambrósio et al., 2000 [42] e Nicholls, 1993 [43], referem que a resposta neuronal a KC1 envolve a activação de canais de Ca2+ sensíveis à voltagem o que permite o influxo de Ca2+ para dentro do citoplasma celular. 4 ΡΊΊ2008100168

Nicholls, 1993 [43] explica que o mesmo efeito pode ser mimetizado por uma multiplicidade de agentes de despolarização incluindo activadores de canais de Na+ (e.g. veratridina), bloqueadores de canais de K+ (e.g. 4-aminopiridine), agonistas de receptores de glutamato ionotrópicos (e.g. N-metil-D-aspartato, cainato).

Leurs et al, 1995 [44] estabelece, com toda a clareza, que a activação de receptores de histamina provoca um aumento na concentração de cálcio intracelular numa multiplicidade de tipos celulares.

Leurs et al., 1995 [44] e Martinez-Mir et al., 1992 [45] consideram ainda que o mesmo padrão de resposta pode ser mimetizado por uma multiplicidade de compostos que actuam especificamente nas mesmas populações celulares referidas na presente invenção, incluindo diversos agonistas de receptores de histamina Hl, tais como 2-tiazolil-etilamina, 2-metil-histamina, 2-(3-bromofenil)histamina ou 2-piridiletilamina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Protocolo experimental para avaliar funcionalmente diferenciação neuronal nas culturas de células SVZ. A: culturas SVZ foram expostas continuamente numa solução Krebs durante 15 minutos, e estimuladas por 2 minutos de 5' a 7' com 50 mM KC1, e de 10' a 12' com 100 μΜ 5 ΡΤΙ2008100168 de histamina. B: Alterações na razão de fluorescência de 340/380 nm. As imagens foram tiradas do mesmo campo e obtidas em diferentes pontos temporais. A imagem da esquerda é representativa de células não-estimuladas (basais), enquanto que a imagem da direita mostra células após estimulação com KC1. A escala de intensidade de fluorescência é indicada à direita: as cores azul e vermelha são indicativas de razões baixas e altas, respectivamente. Os campos observados continham cerca de 100 células. C: De acordo com a nossa hipótese de trabalho, de todas as células analisadas, foram encontrados perfis específicos de resposta para células neuronais e imaturas.

Figura 2. Perfis diferentes de variações de [Ca2+]i nos neurónios derivados de SVZ, neuroblastos e astrócitos após a estimulação com 50mM KC1 e ΙΟΟμΜ de histamina. Fotomicrógrafos fluorescentes representativos de neurónios positivos MAP-2 (A; vermelho) , neuroblastos DCX positivos (B; verde) e astrócitos GFAP positivos (C; verde) em culturas SVZ e perfis representativos de variação associada [Ca2+]i. Coloração (azul) Hoescht 33342 foi usada para visualizar os núcleos da célula. Barra de escala 20 μπι. D; valores de distribuição Hist/KCl de acordo com o tipo de célula. Foi analisado um total de 10 neurónios MAP-2, 8 astrócitos GFAP e 10 neuroblastos. Os dados são a média ± SEM. ***P<0.001 usando ANOVA com correcção Bonferroni's para múltiplas comparações.

Figura 3. Fotomicrógrafos fluorescentes representativos de 6 ΡΤΙ2008100168 nestina (A , B, C; vermelho) e células GFAP positivas (B, C; verde) em culturas SVZ e os respectivos perfis de variação [Ca2+]i associados de células de nestina positivas (A) co-expressando ou não (C e B, respectivamente) GFAP, após estimulação com 50 mM KC1 e 100 μΜ de histamina. D: fotomicrógrafo fluorescente confocal de imunodetecção de nestina (vermelho) e GFAP (verde) em cultura de célula SVZ. Coloração (azul) Hoescht 33342 foi usada para visualizar os núcleos da célula. Barra de escala 20μιη.

Figura 4. O aumento de [Ca2+]i em células SVZ imaturas após a estimulação com histamina é mediado pela activação do receptor de histamina 1. A, esquerda: detecção RT-PCR de receptores de Histamina 1 (H1R) e 2 (H2R) em células SVZ de rato [ + : controlos positivos foram feitos no baço do rato mARN]. Direita: fotomicrógrafo confocal fluorescente de imunodetecção de nestina (vermelho) e H1R (verde). Coloração (azul) Hoescht 33342 foi usada para visualizar os núcleos da célula. Barra de escala 20 μτη. As setas mostram designação dupla. B: culturas SVZ foram expostas continuamente em solução Krebs durante 20 minutos e estimuladas por 2 minutos de 5' a 7' com 50 mM KC1, de 10' a 12' com 100 μΜ de histamina e de 15' a 17' com, concomitantemente, quer com 100 μΜ de histamina quer com 1 μΜ de mepiramina ou 50 μΜ de cimetidina. C: Perfis representativos de resposta de células SVZ imaturas após per-fusão de acordo com o protocolo apresentado anteriormente. D: Efeito da mepiramina e cimetidina na percentagem de células SVZ imaturas que responde à estimulação de 7 ΡΤΙ2008100168 histamina (n=3) . Os dados são a média ± SEM. ***P<0.001 usando ANOVA com correcção Bonferroni's para comparação com a resposta à histamina isolada.

Figura 5. Avaliação funcional e fenotípica à diferenciação neuronal em células SVZ. A: Gráfico de barras mostra percentagens de células de resposta tipo-neuronais em culturas de controlo SVZ (sem exposição a fármacos) e em culturas expostas a 20 ng/ml de factor derivado de células estaminais (SCF) ou 10 ng/ml de factor inibidor da leucemia (LIF) durante 7 dias. Foram efectuados controlos positivos e negativos após a aplicação do mesmo protocolo de perfusão em culturas neuronais hipocampais enriquecidas (células hipo) e culturas do córtex glial (células gliais) (n=2-13) . Os dados são a média ± SEM. *P<0.05 usando ANOVA com correcção Bonferroni's para comparação com culturas de controlo SVZ. B: fotomicrógrafos fluorescentes representativos de neurónios NeuN positivos (núcleo vermelho) e coloração Hoescht (núcleo azul) em células SVZ. Imuno-reactividade de NeuN aumentada foi observada em culturas com tratamento SCF, em comparação com as culturas de controlo. Gráfico de barras mostra a percentagem de neurónios com NeuN positivos, expressa como a percentagem do número total de células, em culturas de controlo e em culturas tratadas com 20 ng/ml SCF ou 10 ng/ml LIF durante 7 dias (n=6-7). Os dados são a média ± SEM. *P<0.05 usando ANOVA com correcção Bonferroni's para comparação com culturas de controlo SVZ. ΡΤΙ2008100168

SUMÁRIO DO INVENTO

No presente invento, descrevemos um método rápido para caracterizar funcionalmente diferenciação neural, em culturas SVZ, baseado nas variações especificas [Ca2+]i, de acordo com o tipo de célula, após despolarização KC1 e estimulação com histamina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Culturas de células da zona subventricular contêm populações mistas de células imaturas, neurónios, astrócitos e progenitores em diferentes fases de desenvolvimento. No presente invento, examinámos se os tipos de células do SVZ poderiam ser funcionalmente discriminadas com base nas variações ([Ca2+]i) ao nivel de cálcio intracelular livre após estimulação de KC1 e histamina. Para este propósito, foram medidos [Ca2+]i em culturas de células SVZ de ratos dadores neonatais Pl-3 C57BL/6, em células únicas, após estimulação com ΙΟΟμΜ de histamina ou 50mM de KC1. Neurónios ΜΑΡ-2-positivos e neuroblastos dupla-cortina positivos foram distinguidos com base na sua razão de resposta selectiva à estimulação de KC1 e/ou de histamina. Além do mais, podiamos distinguir células imaturas com base na resposta selectiva à histamina pela activação do receptor de histamina 1. A exposição das culturas SVZ ao factor pró-neurogénico SCF induziu um aumento do número de células que 9 ΡΤΙ2008100168 responderam ao KC1 e uma diminuição no número de células que responderam à histamina, consistente com a diferenciação neuronal. A resposta selectiva a KCl/histamina, por análise e visualização de cálcio em células individuais, oferece uma forma rápida e eficaz para a discriminação funcional da diferenciação neuronal em culturas de células SVZ, abrindo novas perspectivas para a pesquisa de potenciais novos factores pró-neurogénicos.

Objectivos do Invento 0 primeiro objectivo do invento é um método para a identificação funcional de novos neurónios, progenitores neuronais, astrócitos e células imaturas de culturas de células estaminais e caracterização farmacológica de diferentes tipos de células que se diferenciam de culturas de células estaminais, compreendendo os seguintes passos: a) estimular as referidas culturas de células estaminais com compostos capazes de aumentar as concentrações intracelulares de cálcio, especificamente nos neurónios, b) estimular as referidas culturas de células estaminais com compostos capazes de aumentar a concentração intracelulares de cálcio, especificamente em células progenitoras imaturas e neuronais, c) verificar as concentrações intracelulares de cálcio recorrendo a uma sonda, e d) e utilizar razões de valores fluorescentes decorrentes das estimulações à avaliação directa do nivel de diferenciação das células. 10 ΡΤΙ2008100168

Numa materialização ideal, as culturas de células estaminais são obtidas do tecido neuronal.

Noutra materialização ideal, as culturas de células estaminais são obtidas da zona subventricular dos mamíferos.

Preferencialmente, a sonda é uma sonda fluorescente sensível ao cálcio, mais preferencialmente Fura 2-AM.

Normalmente, a avaliação do nível de diferenciação das células é baseada no aumento específico do tipo de célula de concentrações intracelulares de cálcio decorrentes de estimulações de células específicas para neurónios e estimulações de células específicas para células imaturas e progenitores neuronais, sendo o anterior avaliado por meio de uma sonda de cálcio Fura-2AM.

Preferencialmente, as estimulações de células específicas para neurónios incluem exposição de células a uma solução contendo altas concentrações extracelulares de KC1, e as referidas estimulações de células específicas para células imaturas e progenitores neuronais incluem exposição de células a uma solução com histamina.

As células que respondem a altas concentrações extracelulares de KC1, ao aumentar os níveis de cálcio intracelular, e não respondem à histamina são células MAP-2 positivas; células que respondem à histamina e ao KC1 11 ΡΤΙ2008100168 apresentam razão de resposta superior à das células ΜΔΡ-2 positivas apresentam imuno-reactividade para dupla-cortina.

Numa materialização ideal, as células que respondem à histamina e não a altas concentrações extra-celulares de KC1, incluem células nestina positivas.

Normalmente, as células GFAP positivas e nestina negativas não respondem nem às referidas estimulações de células especificas para neurónios nem às referidas estimulações especificas para células imaturas e progenitores neuronais. 0 segundo objectivo do invento é a utilização do método do invento em estudos laboratoriais ou farmacológicos .

Numa materialização ideal, o método é usado em estudos farmacológicos sobre células indiferenciadas nestina positivas, astrócitos GFAP positivos e nestina negativas, neuroblastos positivos para dupla-cortina, neurónios MAP-2 positivos, em diferentes estádios de diferenciação.

Noutra materialização ideal, o método é utilizado para a visualização de factores que induzem a diferenciação de células de culturas de células estaminais.

Noutra materialização ideal, o método é utilizado 12 ΡΤΙ2008100168 para a cultura de células estaminais neurais na presença de factores candidatos a induzir a diferenciação celular e subsequente avaliação do aumento da percentagem de células diferenciadas.

Noutra materialização ideal, o método é utilizado para a cultura de células estaminais neurais na presença de eventuais factores pró-neurogénicos e subsequente avaliação do aumento da percentagem de novos neurónios.

Materiais e Métodos

Todas as experiências foram efectuadas de acordo com as orientações NIH e Europeias (86/609/EEC) sobre o cuidado e utilização de animais de laboratório.

Culturas SVZ

As células SVZ foram obtidas de ratos dadores C57B1/6 com idade entre 1 e 3 dias. Foram removidos os cérebros após decapitação e colocados numa solução HBSS (Gibco, Rockville, MD, USA). Fragmentos de SVZ foram dissecados de 450 secções coronais ym-compactas do cérebro, digeridas em 0.025% de tripsina e 0.265 mM EDTA (Gibco) e desagregadas por trituração gentil com uma pipeta P1000. A suspensão da célula foi diluida numa cultura composta por um meio livre de soro (SFM) constituído por um meio de transporte Dulbecco's modificado (D-MEM/F12 + GlutaMAXTM-I, Gibco) suplementado com 100 U/ml de penicilina, 100 yg/ml 13 ΡΤΙ2008100168 de estreptomicina (Gibco), 1% B27 (Gibco), 10 ng/ml factor de crescimento epidermal (EGF; Gibco) e 10 ng/ml factor de crescimento básico de fibroblastos (FGF-2; Gibco). Células únicas foram então colocadas em placas de Petri descobertos a uma densidade de 3000 células/cm2. As neuroesferas puderam desenvolver-se numa atmosfera húmida com 37°C, com 95% ar-5% C02. 6 a 8 dias após a cultura, as neuroesferas foram recolhidas com uma pipeta de Pasteur e disseminadas em lamelas vidro revestidas com poli-D-lisina e colocadas em caixas de cultura de células com 12 compartimentos para utilização em experiências de imagem de cálcio, ou caixas de cultura de células com 24 compartimentos para experiências de imunocitoquimica, e cobertos com 1 ml ou 500 μΐ, respectivamente, de SFM desprovido de factores de crescimento.

Para as experiências que relacionam imagem de cálcio em células individuais (SCCI) com imunodetecção, as neuroesferas SVZ foram disseminadas em lamelas marcadas com micro-grelha e revestidas com poli-D-lisina (Eppendorf CELLocate ® coverslip, Hamburg, Germany).

As neuroesferas puderam desenvolver-se durante 7 dias a 37°C na ausência ou presença de 10 ng/ml LIF ou 20 ng/ml SCF (ambos de Chemicon International, Temecula, USA).

Em todas as experiências, cada condição expe- ΡΤΙ2008100168 rimental foi analisada em três espaços diferentes. Excep-tuando quando especificado em contrário, as experiências foram repetidas três vezes.

Visualização de Células Individuais através de Imagologia de Cálcio Intracelular

Para determinar o padrão de diferenciação das células SVZ, analisámos as variações dos niveis de cálcio intracelular após estimulação com 50mM de KC1 e ΙΟΟμΜ de histamina(Sigma), de acordo com a sequência exibida na Figura IA. A despolarização-KCl provoca um aumento dos niveis de cálcio intracelular nos neurónios [19], enquanto que a estimulação com histamina leva ao aumento dos niveis de cálcio intracelular em células estaminais/progenitoras [25] .

As culturas SVZ foram carregadas durante 40 min, a 37°C, com 5 μΜ Fura-2 AM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), 0.1% BSA livre de ácido gordo e 0.02% ácido plurónico F-127, em solução de Krebs (132 mM NaCl, 1 mM KC1, 1 mM MgC12, 2.5 mM CaC12, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4). Depois de um periodo de 10 min após carga a temperatura ambiente, a lamela com cobertura de vidro foi montada numa câmara RC-20 numa plataforma PH3 (Warner Instruments) num microscópio Axiovert 200 (Cari Zeiss)fluorescente invertido. As células foram expostas continuamente com solução Krebs e estimuladas aplicando ΙΟΟμΜ de histamina ou solução Krebs com concentrações de potássio aumentadas (contendo 50 15 ΡΤΙ2008100168 mM de KC1, substituição isosmótica com NaCl). As soluções foram adicionadas às células por um sistemas de pressurização rápida (95% ar, 5% atmosfera C02) (AutoMate Scientific, Inc) . A concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i) foi avaliada quantificando taxa de fluorescência emitido a 510nm após excitação alternada (750 msec) a 340nm e 380nm, usando um aparelho Lambda DG4 (Sutter Instruments Company) , e um filtro de faixa de frequência de 510 nm (Cari Zeiss ref. 21) antes da aquisição de fluorescência com uma objectiva 40x e uma máquina fotográfica digital Coll SNAP (Roper Scientific). Os valores adquiridos foram processados usando o software MetaFluor (Universal Imaging Corporation).

Os valores de histamina/KCl para a razão Fura-2 foram calculados para determinar a extensão da maturação neuronal em culturas. Os resultados obtidos em culturas SVZ foram comparados com os obtidos em culturas de células gliais corticais ou em neurónios hipocampais cultivados [27] .

Para determinar qual o receptor de histamina envolvido no efeito da histamina, analisámos as variações de [Ca2+] i após a perfusão das células com ΙΟΟμΜ de histamina concomitantemente com quer ΙμΜ de mepiramina quer com 50 μΜ de cimetidina (ambas de Tocris, Ellisville, MO, USA), antagonistas específicos dos receptores de histamina 1 (H1R) e 2 (H2R) , respectivamente [28] de acordo com a sequência evidenciada na Figura 1 B. 16 ΡΤΙ2008100168

Imunocitoguímica

Após fixação, durante lh, em 4% de parafor-maldeído, as células foram permeabilizadas e os locais de ligação não específicos foram bloqueados, por lh30, usando 0.25% Triton X-100 (Sigma) e 6% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma) dissolvida em PBS. As células foram então subsequentemente incubadas com os seguintes anticorpos primários: anti-nestina monoclonal de rato (1:200; Chemicon International), anticorpo anti-MAP-2 monoclonal de rato (1:200; Sigma), anticorpo anti-GFAP monoclonal de coelho (1:1000; Sigma), anticorpo anti-NeuN monoclonal de rato (1:100, Chemicon International), anticorpo anti-dupla-cortina policlonal de coelho (1:200, Cell Signaling, Danvers; MA, USA), durante a noite a 4 °C. Após isto, as lamelas de cobertura foram limpas em PBS e incubadas, por lh, a temperatura ambiente, com o anticorpo secundário de cabra Alexa Flúor 488 anti-coelho (1:200, Molecular Probes) ou anticorpo de cabra Alexa Flúor 594 anti-rato (1:200, Molecular Probes), respectivamente. Após limpeza com PBS, as preparações das células foram incubadas com Hoescht 33342 (2pg/ml, Molecular Probes) em PBS contendo 0.25 % BSA, 5 min a temperatura ambiente, para coloração nuclear. Finalmente, as preparações equipadas usando meio fluorescente Dakocytomation (Dakocytomation Inc., Califórnia, USA) . 17 ΡΤΙ2008100168

Imagens fluorescentes foram gravadas usando uma máquina fotográfica digital ligada a um microscópio Axioskop (Cari Zeiss, Gõttingen, Germany).

Isolamento do ARN Total das células SVZ de ratos 0 ARN total foi isolado das células SVZ usando TRI REAGENT (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram suavemente homogeneizadas em tiocianato de guanidina e fenol. Foi adicionado clorofórmio permitindo um claro isolamento na resultante fase aquosa. 0 ARN foi precipitado com isopropanol e o sedimento foi lavado com Etanol a 75%. 0 sedimento foi eluido em dietilpirocarbonato (DEPC), e água desionizada. A quantidade total de ARN foi quantificada através de medidas de densidade óptica (DO)a 260 nm, e o seu grau de pureza foi avaliado através da proporção entre a DO (densidade óptica) a 260 nm e 280 nm (calculadora ARN/ADN GeneQuant II, Pharmacia Biotech Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden). Para além disso, a qualidade do ARN foi verificada através de electroforese em gel. O ARN extraido dos esplenócitos foi utilizado como controlo positivo para a detecção da expressão de receptores de histamina 1 e 2. 18 ΡΤΙ2008100168

Análise por RT-PCR A expressão de receptores de histamina 1 e 2 mARN foi determinada por- PCR de transcrição reversa (RT-PCR). Inicialmente, o cADN foi obtido pela transcrição de 2 pg ARN utilizando transcrição reversa dos virus da microblastose aviária (AMV) e Oligo-p(dT)15 primers (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) . 0 PCR foi efectuada num sistema de reacção de 50pL (Roche Molecular Biochemicals) contendo 5pL cADN template, 1 pL mistura de desoxinucleotideos, 5 pL lOx PCR de tampão da reacção, 0,2 pL de primers a montante e 0,2 pL de primers a juzante, um volume variável de água e 0.25 pLTaq ADN polimerase (35 ciclos: a 95°C por 30 s, a 56°C/58°C (receptor de histamina 1/ receptor de histamina 2) por 30 s e a 72°C por 30 s) (BIORON GmbH, Ludwigshafen, Germany)).

As Sequências utilizadas nas reacções PCR foram os seguintes: Receptor de histamina 1: sequência a montante 5'-GGG CTC AAA GGC CAA TGA C-3' e sequência a juzante 5'-TCC GCC GGC AAG TAC TCA-3'. Receptor de histamina 2: sequência a montante 5' -CTG GCT GTC AGC TTG AAT CG-3' e sequência a juzante 5'-GCT GCC AGG GAC ACA ATG A-3'. β-actina: sequência a montante 5'-GAC TAC CTC ATG AAG ATC CT-3' e sequência a juzante 5'-ATC TTG ATC ATG GTG CTG-3' (MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany) [29].

Os produtos de PCR de cada amostra foram sujeitos a electrof orese em 1,5% de gel de agarose e corado com 19 ΡΤΙ2008100168 brometo de etídio. Tiraram-se fotografias num Sistema de visualização Versa- Doc (Model 3000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Análise da Informação e Estatísticas

Calculou-se a percentagem de células imunoreacti-vas NeuN de contagens celulares em 5 campos independentes em cada lamela coberta com uma objectiva de 40X (cerca de 200 células por campo) .Uma vez que não foram encontradas diferenças significativas entre experiências, a informação correspondente foi tratada estatisticamente e expressa como ±SEM. O significado estatístico das diferenças foi examinado pela análise da variância simples seguida pelo teste Bonferroni para comparações múltiplas, ou teste- T. O nível de significação estatística foi definido para valores de p< 0,05.

Resultados

Variações em [Ca2+]j após estimulação com KC1 ou histamina

Caracterizámos o perfil das variações de [Ca2+]i em células SVZ após a estimulação com KCL e histamina. Foram colocadas neuroesferas com 6 a 8 dias, em lamelas de poli-D-lisina cobertas, desenvolvendo-se em 7 dias em meio de cultura sem soro desprovido de factores de crescimento. As células foram então, incubadas com Fura-2 AM, e perfundidas continuamente com cálcio por 15 minutos com 20 ΡΤΙ2008100168 solução de Krebs e apenas estimuladas (2 Min) com 50 mM KC1 ou com 100 μΜ de histamina, como se mostra na figura A. As alterações nas razões de fluorescência 340/380 nm foram constantemente monitorizados durante toda a experiência. A Figura 1 B mostra um exemplo das variações de [Ca2+]i em células SVZ após a estimulação com KC1. De uma forma interessante, algumas células mostraram um aumento de [Ca2+]i após a estimulação com KCl mas não após a perfusão de histamina, consistente com um perfil neuronal. E mais ainda, um perfil imaturo, caracterizado pela ausência de resposta ao KCl mas com um aumento no [Ca2+]i após a estimulação com histamina foi também encontrado. (Figura 1 C) .

Para associar os perfis de variações de [Ca2+]i com o respectivo fenótipo célula, monitorizámos as respostas [Ca2+]i utilizando a visualização de células individuais através de imagiologia de cálcio e, em seguida, realizámos uma caracterização por imunocitoquimica nas células SVZ cultivadas nas lamelas marcadas com micro-grelha, permitindo a sua localização celular. Demonstrámos que o tipico perfil neuronal das variações de [Ca2+] i é apresentado por neurónios MAP-2 (Figura 2 A) . Outra população de células que respondeu ao KCl, embora de forma mais fraca que os neurónios ΜΑΡ-2-positivos e com ainda menos resposta à histamina, expressa o marcador neuronal imaturo DCX (Figura 2 B). As células que nem responderam ao KCl nem à histamina são GFAP-positivos consistentemente com a sua natureza astocitica (Figura 2 C). 21 ΡΤΙ2008100168

Em seguida, calculámos a razão entre as respostas consequentes da exposição à histamina e ao KC1 (Hist/KCl) num total de 10 neurónios ΜΑΡ-2-positivos, 10 neuroblastos DCX-positivos e 8 astrócitos GFAP-positivos que apresentam astrócitos. Os valores Hist/KCl foram significativamente diferentes entre os grupos, como demonstrado na Figura 2 D, indicado que a seguir à estimulação com KCl e histamina, os neurónios derivados de SVZ e neuroblastos podem ser diferenciados de acordo com a razão Hist/KCl. Para mais, as razões apresentadas quer pelos neurónios maduros e imaturos foram significativamente inferiores às encontradas nas células GFAP positivas, uma vez que estas células não responderam nem à estimulação com histamina nem com KCl, e por conseguinte, apresentam uma razão Hist/KCl normalizada próxima de um. Assim, as células neuronais podem ser diferenciadas sem qualquer dúvida das células gliais com base na sua razão Hist/KCl.

Experiências similares de visualização de células únicas de cálcio foram desenvolvidas em culturas SVZ subsequentemente definidas como marcadores de células imaturas, pela nestina. Como demonstrado na Figura 3 A, as células responderam à histamina e não ao KCl expressam nestina, sugerindo que a resposta [Ca2+]i resultante da estimulação com histamina é restrita às células imaturas/ indiferenciadas, em culturas SVZ. No entanto, a nestina é expressa por um amplo tipo de células SVZ [30] . Consequentemente, as células nestina-positivas que expressam 22 ΡΤΙ2008100168 GFAP, um marcador para astrócitos maduros, foram encontrados em culturas SVZ. (Figure 3 D, célula b) , tal como a nestina+/GFAP“ (Figura 3 D, célula a) e células nestina-/GFAP+ (Figura 3 D, célula c) . As experiências de imagiologia de cálcio intracelular em células individuais foram, em seguida, levadas a cabo em culturas SVZ seguidas de imunodetecção dupla e marcadores GFAP. Um perfil tipicamente imaturo de [Ca ]i foi associado tanto as células nestina+/GFAP“ como às nestina+/GFAP+ (Figura 3 B e C, respectivamente).

Todas as células analisadas que responderam à histamina apresentaram uma imunorreactividade à nestina (n=12), mas nem todas as células nestina-imunoreactivas responderam à estimulação com histamina (n=10). Este resultado está de acordo com o facto bem estabelecido de que a nestina não é um marcador selectivo das células imaturas uma vez que também pode ser expressa pelas células diferenciadas por derivação SVZ. [30]. Estes resultados demonstram ainda que o aumento em [Ca2+]i após a estimulação com histamina é restrita às células SVZ imaturas/ indiferenciadas. Mais ainda, os neurónios maduros podem ser diferenciados das células imaturas de acordo com a sua razão Hist/KCl baixa ou elevada, respectivamente. O aumento em [Ca2+]j em células SVZ imaturas é mediado pela activação do receptor Hl da histamina

Para investigar mais profundamente qual o 23 ΡΤΙ2008100168 receptor de histamina envolvido na indução por histamina realizámos RT-PCR para detectar receptores H1R e H2R em células SVZ. Foram encontrados mARN para ambos os receptores em células SVZ (Figura 4 A).

Para avaliar o envolvimento de cada receptor no aumento do [Ca2+]i após a estimulação com histamina, desenvolvemos estudos de imagiologia de cálcio intracelular em células individuais na presença de antagonistas especificos para H1R e H2R. As células foram continuamente perfundidas com solução de Krebs, durante 20 minutos, e estimuladas com KC1, histamina ou histamina com 1 μΜ mepiramina, um antagonista de H1R, ou ΙΟΟμΜ histamina com 50μΜ cimetidina, um antagonista de H2R (Figura 4 B). Estão demonstrados na Figura 4 C os perfis representativos de resposta das células imaturas SVZ. Mais ainda, calculámos as razões de resposta após a exposição de histamina e histamina mais antagonista. Assim, avaliámos a percentagem das células SVZ sensíveis à histamina que continuaram a responder à histamina na presença de antagonistas (razão histamina/histamina + antagonista perto de 1). Após a estimulação com mepiramina, foi observado um decréscimo significativo de 82% (n=3) no número de células imaturas que responderam à histamina, onde a estimulação com cimetidina não bloqueou as respostas [Ca2+]i induzidas pela histamina (n=3) (Figura 4 D).

Por conseguinte, ao realizarmos uma imunocito-quimica dupla à H1R e à nestina, mostrámos que as células ΡΤΙ2008100168 - 24 - imaturas SVZ expressam receptor 1 da histamina. (Figura 4 A; imagem à direita).

Variações de [Ca2+]j em neurónios, as células da glia ou precursoras após a estimulação com KC1 ou histamina: avaliação da diferenciação neuronal.

Para validar o método descrito neste invento, procedemos a experiências utilizando imagiologia de cálcio intracelular em células individuais em células fenotipi-camente identificadas, i.e. em culturas primárias de neurónios de hipocampo e em culturas de células de glia corticais. Em culturas controlo, 20% das células apresentam um perfil tipicamente neuronal, i.e. com a razão Hist/KCl abaixo de 0,8 (n=13) (Figura 5 A). Em culturas de hipocampo, 40% (n=3) das células apresentam uma baixa razão Hist/KCl (abaixo 0,8) (Figura 5 A), como o esperado para uma cultura primária enriquecida num fenótipo neuronal. De forma contrária, nas culturas de células gliais, não observámos quaisquer células que demonstrassem uma baixa razão Hist/KCl (n=2) (Figura 5 A).

Em seguida, utilizámos este método para avaliar a diferenciação neuronal em culturas SVZ pré-tratadas com factor SCF progénico [31] ou com o factor gliogénico LIF [32, 33, 34, 35]. Para este objectivo, tratámos as culturas com 20 ng/ml SCF ou 10 ng/ml LIF, durante 7 dias. Foi observado, em culturas SVZ tratadas com SCF, um aumento significativo de 25% (n=8) na proporção de células SVZ que 25 ΡΊΊ2008100168 apresentavam um perfil tipicamente neuronal. (Figura 5 A). Por contraste, após o tratamento com LIF, o número relativo de neurónios diminuiu, embora de forma não significativa. (n=6) (Figura 5 A) . De forma consistente, o tratamento com SCF aumentou o número de neurónios positivos NeuN para 25% (n=7) se comparado com os 9% do controlo (n=6) (Figura 5 B). 0 tratamento com LIF não alterou a diferenciação neuronal (n=6).

Discussão

Neste invento, descrevemos um método rápido para avaliar funcionalmente a diferenciação neuronal das culturas de células SVZ. Este método é baseado nos perfis das variações de [Ca2+]i., de acordo com o tipo de célula, seguida da despolarização de KC1 e estimulação com histamina. Por conseguinte, a despolarização de KC1 foi utilizada como forma de diferenciação neuronal, uma vez que as VSCC estavam ausentes ou expressas a valores muito baixos nos percursores neuronais, ao passo que durante a diferenciação neuronal e em neurónios diferenciados existe uma expressão de niveis elevados destes canais [36, 37, 38]. De igual forma, observámos que após a perfusão de KC1, existe um aumento de [Ca2+]i nas células neuronais resultante da abertura de VSCC, ao passo que nas células imaturas ou nas gliais o [Ca2+]i se mantém inalterado. Por outro lado, a perfusão com histamina aumenta o [Ca2+]i em células SVZ imaturas [25] mas não em neurónios, nem em células gliais. 26 ΡΤΙ2008100168

Monitorizámos os aumentos de [Ca2+]i usando imagiologia de cálcio intracelular em células iindividuais e correlacionámos esta informação com a caracterização por imunocitoquimica subsequente das mesmas células visualizadas. 0 aumento de [Ca2+]i após estimulação sequencial com KC1 e histamina, foi associada a diferentes fenótipos celulares. Os neurónios ΜΔΡ-2-positivos, responderam a KC1, enquanto que os percursores neuronais imaturos DCX-positivos responderam com menor amplitude a KC1 e à histamina. As células onde o [Ca2+]i não foi afectado de forma significativa tanto pelo KC1 como pela histamina foram identificados como astrócitos GFAP-posi-tivos. A análise da razão de respostas obtidas a partir da perfusão com histamina e KC1 (Hist/KCl) permite-nos concluir que as células que apresentam uma razão (Hist/KCl) abaixo dos 0,80 são neurónios maduros, fenotipicamente identificáveis pela expressão MAP-2. As células que respondem somente à histamina, embora apresentem uma elevada razão (Hist/KCl) (maior que 1) foram identificadas como células imaturas nestina-positivas. A expressão GFAP foi encontrada em células que nem responderam ao KC1 nem à histamina, consistente com o fenótipo de astrócito, tal como na população de células que responderam à histamina e que expressam nestina.

Com base na razão (Hist/KCl), calculámos a percentagem de células que demonstraram um perfil tipicamente neuronal, em culturas de células cortico- gliais, em 27 ΡΊΊ2008100168 culturas hipocampais enriquecidas por neurónios e em culturas SVZ. Não foram encontradas células que apresentassem uma resposta tipicamente neuronal nas culturas de células cortico- gliais, ao passo que foram encontradas 40% nas culturas hipocampais neuronais pós- natal. Esta informação indica fortemente que o método agora descrito permite de forma segura a identificação dos neurónios e a diferenciação neuronal nas culturas SVZ. Em culturas não tratadas de SVZ (controlo), cerca de 20% das células demonstram uma resposta tipicamente neuronal. O pré-tratamento das células SVZ com SCF, um factor trófico apontado como estimulador de neurogéneses num modelo in vitro de isquémia cerebral, e igualmente em condições basais in vivo [31], aumentou a percentagem de células com uma resposta tipicamente neuronal, quando comparada com outras culturas de controlo. Por contraste, o pré-trata-mento das culturas SVZ com LIF, uma citoquina multifuncional referida como promotora da auto -regeneração das células estaminais neuronais ou em alternativa da diferenciação das células progenitoras/ neuronais em células imunoreactivas GFAP [32, 33, 34, 35, 39], diminuiu, embora de forma não significativa, a percentagem de células com uma resposta tipicamente neuronal, quando comparadas com culturas de controlo. Foram quantificados neurónios diferenciados expressando NeuN em cada condição e a informação obtida corroborou o potencial pro-neurogénico de SCF, em culturas SVZ pós-natal. No entanto, o procedimento que aqui descrevemos foi completamente adaptado para a identificação de possíveis factores pró-neurogénicos. 28 ΡΤΙ2008100168

Mais ainda, este método caracteriza, embora de forma indirecta, as células gliais e imaturas. De facto, as células que nem respondem ao KC1 nem à histamina são astrócitos GFAP, ao passo que as células que só respondem à histamina expressam nestina. Uma subpopulação de células nestina-positivas, respondendo apenas à histamina, foi entendida como sendo GFAP positiva, consistente com a larga expressão da nestina entre as células SVZ, incluindo a subpopulação de astrócitos [30].

Utilizando RT-PCR e inibidores do receptor-selectivo de histamina mostramos que o aumento do [Ca2+]i nas células SVZ após estimulação com histamina é mediado pela activação de H1R. De facto, já foi demonstrado por outros autores que as células estaminais embrionárias e as de carcinoma expressam receptores funcionais de histamina 1, sugerindo um papel para este receptor, como marcador para os progenitores neuronais não diferenciados. [20, 21, 24, 25].

Inicialmente 10] . A nossa informação demonstra que a monitorização do aumento do [Ca2+] i após a despolarização do KC1 e da estimulação com histamina é uma ferramenta poderosa e de confiança para avaliar a diferenciação neuronal nas culturas SVZ. A cultura SVZ é uma cultura mista de neurónios, astrócitos, oligodendrócitos, células-mãe neuronais e gliais em diferentes etapas de diferenciação, e células estaminais/imaturas. [1, 9, 29 ΡΤΙ2008100168 cultivámos células SVZ simples com EGF e FGF-2 durante 7 dias para permitir a formação de neuroesferas, i.e., para aumentar a proliferação celular. A colocação em lamelas revestidas com poli-D-lisina e também a eliminação de factores de crescimento são passos necessários para atingir a diferenciação das células progenitoras tanto no seu destino glial como neuronal. [40]. Neuroesferas livres e flutuantes aderem ao substrato de poli-D-lisina e a diferenciação celular ocorre na fronteira das neurosferas, quando as células migrantes emergem, formando um denso tapete de células. Todas as medições das variações de [Ca2+] i e a classificação imunocitológica foram efectuadas nestas células. Apesar do facto das células na área seleccionada poderem ser mais diferenciadas, é igualmente verdade que estas células não são só fenotipicamente diferentes (células da glia versus neurónios) mas também diferentes nas suas etapas de desenvolvimento. De facto, em culturas SVZ, os neurónios estão presentes em diferentes fases de desenvolvimento, e por isso, é possivel encontrar marcadores para neurónios imaturos tais como NeuN e MAP-2, e também marcadores para células imaturas, tais como a DCX e a nestina. A avaliação da diferenciação neuronal por imunocitoquimica envolve procedimentos demorados realizados em células post mortem. Os estudos de visualização de células individuais através de imagiologia de cálcio são um método rápido para avaliação da função neuronal. A funcionalidade pode ser analisada por electrofisiologia, 30 ΡΤΙ2008100168 registando a capacidade dos neurónios de gerar correntes eléctricas após a estimulação. No entanto, abordagens de registo da actividade eléctrica em células individuais ("patch-clamp") são demoradas e permitem registos de cada célula, tornando impossível a estimativa da diferenciação neuronal em toda a cultura. Este é um contraste claro entre a possibilidade de visualização entre 100-120 células, ao mesmo tempo, em 15 min, usando visualização de células individuais através de imagiologia cálcio.

Outro relatório descreveu o isolamento de células imaturas, células-mãe gliais e neuronais do telencéfalo do rato embrionário [41]. Neste estudo, os autores utilizaram um tipo de célula activada por fluorescência e a combinação das respostas de cálcio a FGF ou EFG básicos e subsequente imunocitoquímica. No entanto, em vez da forte resposta das células SVZ imaturas à histamina, detectada usando o nosso método, Barker e seus colaboradores isolaram as células estaminais neurais por selecção citométrica da corrente negativa por 5 superfícies epitopes. Mais ainda, utilizando a visualização de cálcio em células estaminais embrionárias, a resposta celular ao FGF básico via activação do receptor FGFR1 não foi específica para os precursores neuronais uma vez que alguns progenitores neuronais e gliais também responderam com um aumento de [Ca2+] i ao basal FGF [41] . O nosso método, ao usar o aumento específico da [Ca2+]i após a perfusão com histamina, provou ser mais rápido e não envolve métodos de separação celular activada por fluorescência (FACS) caros. ΡΤΙ2008100168

Concluindo, verificando o aumento de [Ca2+]i seguida da aplicação de KC1 ou histamina, permitiu-nos desenhar um rápido método para avaliar a diferenciação neuronal nas culturas SVZ vivas. Este método é baseado nos diferentes padrões de aumento do [Ca2+] i, em células SVZ, após a estimulação com KC1 ou histamina, permitindo a caracterização de uma população de neurónios imatura, mas funcional. Este método permite-nos ainda, a rápida visualização dos possíveis factores pró-neurogénicos que podem ser relevantes para a terapia de base celular, à medida que permite a identificação de neurónios imaturos funcionais; células essas que são mais plásticas do que neurónios totalmente diferenciados e por isso são mais adequadas para a substituição neuronal eficiente após serem enxertados no cérebro morto.

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Lisboa, 1 de Junho de 2010

Claims (13)

1. ΡΤΙ2008100168 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a identificação funcional de novos neurónios, células-mãe neurais, astrócitos e células imaturas das culturas de células estaminais e a caracterização farmacológica dos diferentes tipos de células diferenciando-os das culturas células estaminais, caracterizado por compreender os seguintes passos: a) estimular as referidas culturas de células estaminais com compostos capazes de aumentar as concentrações intracelulares de cálcio, tais como KC1 e/ou histamina, especificamente nos neurónios b) estimular as referidas culturas de células estaminais com compostos capazes de aumentar as concentrações intracelulares de cálcio, tais como KC1 e/ou histamina, em células-mãe imaturas, c) verificar as concentrações intracelulares de cálcio recorrendo a uma sonda, e d) e utilizar razões de valores fluorescentes decorrentes das estimulações à avaliação directa do nivel de diferenciação das células.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas culturas de células estaminais serem obtidas de tecido neuronal.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as referidas culturas de células estaminais serem obtidas da zona subventricular dos mamíferos. 2 ΡΤΙ2008100168
4. 4. Método da reivindicação 1, caracterizado por a referida sonda ser uma sonda fluorescente sensivel ao cálcio.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a avaliação directa do nivel de diferenciação das células ser baseada no aumento especifico do tipo de células em concentrações intracelulares de cálcio induzidas dos estímulos celulares específicos para os neurónios e estímulos celulares específicos para células imaturas e progenitores neuronais, monitorizados por meios advindos da sonda fluorescente sensível ao cálcio Fura-2AM.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os referidos estímulos celulares específicos para os neurónios incluírem a exposição das células a uma solução que contém elevadas concentrações extracelulares de KC1, e os referidos estímulos celulares específicos para as células imaturas e células-mãe neuronais incluírem uma exposição das células a uma solução que contem histamina.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por as células serem Neurónios ΜΆΡ-2-positivos que respondem a concentrações de KC1 superiores a 5 mM, aumentando os níveis intracelulares de cálcio e não responderem à histamina, tendo portanto, uma baixa razão de resposta da histamina/KCl; ou serem neuroblastos de dupla-cortina positiva que respondem a concentrações de KC1 3 ΡΤΙ2008100168 superiores a 5 mM, e apresentarem resposta à histamina, e portanto com uma razão de resposta da histamina/KCl superior à referida para os neurónio Map-2-positivos.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por as células responderem à histamina e não a concentrações de KC1 superiores a 5 mM incluindo células nestina-positivas.
9. 9. Método de acordo com as reivindicações 1 e 6, caracterizado por o GFAP ser positivo, e as células nestinas negativas não responderem quer às referidas estimulações celulares especificas para os neurónios, quer às estimulações celulares especificas para as células imaturas e progenitores neuronais.
10. 10. Uso do método descrito nas reivindicações 1 a 9, caracterizado por o referido método ser utilizado em estudos farmacológicos em células nestina-positivas indiferenciadas, astrócitos GFAP-positivos e nestina negativos, neuroblastos com dupla-cortina, Neurónios MAP-2-positivos, em diferentes fases de diferenciação.
11. 11. Uso do método descrito nas reivindicações 1 a 9, caracterizado por o referido método ser utilizado para a visualização dos factores capazes de induzir indiferenciação celular em culturas de células estaminais. 4 ΡΤΙ2008100168
12. 12. Uso do método descrito nas reivindicações 1 a 9, caracterizado por o referido método ser utilizado para a cultura de células estaminais neuronais na presença de factores passíveis de induzir diferenciação celular e subsequente avaliação do aumento em percentagem de células diferenciadas.
13. 13. Uso do método descrito nas reivindicações 1 a 9, caracterizado por o referido método ser utilizado para a cultura de células estaminais neurais na presença de possíveis factores pró-neurogénicos e subsequente avaliação do aumento em percentagem de novos neurónios. Lisboa, 1 de Junho de 2010