PT1982184E

PT1982184E - Sol composition for sol-gel biochip to immobilize probe on substrate without surface treatment and method for screening thereof

Info

Publication number: PT1982184E
Application number: PT77085710T
Authority: PT
Inventors: So Youn Kim
Original assignee: So Youn Kim
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2014-07-08
Also published as: US9476876B2; KR20070078556A; WO2007086671A1; US10191045B2; EP1982184B1; JP2009524819A; US20090227466A1; KR100784437B1; JP5538726B2; DK1982184T3; ES2462549T3; EP1982184A1; EP1982184A4; US20160334400A1

Description

ΕΡ 1 982 184/ΡΤΕΡ 1 982 184 / ΡΤ

DESCRIÇÃO "Composição de sol para biochip de sol-gel para imobilizar uma sonda sobre um substrato sem tratamento de superfície e método para o seu rastreio"A sol-gel biochip sol composition for immobilizing a probe on a substrate without surface treatment and method for its screening "

CAMPO TÉCNICO 0 presente invento refere-se a um método para rastrear uma composição de sol para biochips de sol-gel, que é utilizado para imobilizar uma sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, à utilização uma composição de sol rastreada pelo referido método, e a um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre o mesmo.TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for screening a sol gel composition for sol-gel biochips which is used to immobilize a probe on a substrate that is not coated with a high molecular weight synthetic coating agent dissolved in organic solvent, the use of a sun composition screened by said method, and a sol-gel biochip comprising said sol composition immobilized thereon.

ESPECIALIDADE ANTERIOR 0 biochip é um exemplo representativo de nova tecnologia combinando tecnologia de materiais tais como nanotecnologia (NT) e biotecnologia (BT) que aplica conteúdos dos campos da tecnologia de materiais e tecnologia de informação (IT) para analisar uma grande quantidade de resultados. 0 biochip é formado por microarranjo de alta densidade de vários tipos de biomateriais sobre uma unidade de área de uma superfície de um suporte sólido. As tecnologias de biochip incluem uma tecnologia para imobilizar biomateriais, uma tecnologia para tornar a superfície do chip biocompatível, tecnologia de microarranjo de biomateriais, uma tecnologia de ensaio para realizar várias reacções biológicas sobre um chip produzido, uma tecnologia para detectar resultados de reacção, uma engenharia de proteínas para produzir biomateriais para serem imobilizados e tecnologia de recombinação genética.BACKGROUND The biochip is a representative example of new technology combining technology from materials such as nanotechnology (NT) and biotechnology (BT) that applies content from the fields of materials technology and information technology (IT) to analyze a large number of results. The biochip is formed by high density microarray of various types of biomaterials on an area unit of a surface of a solid support. Biochip technologies include a technology to immobilize biomaterials, a technology to make the surface of the chip biocompatible, microarray technology of biomaterials, an assay technology to perform various biological reactions on a chip produced, a technology to detect reaction results, a engineering of proteins to produce biomaterials to be immobilized and genetic recombination technology.

Um chip de proteínas representativo dos biochips é formado por microarranjo intensivo de várias proteínas sobre uma unidade de área da superfície de um suporte sólido. Utilizando o chip de proteínas, é possível conduzir uma experiência para múltiplos propósitos, tais como diagnóstico de doenças, ensaios de elevado rendimento (HTS, high 2 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ throughput screening), testes de actividade enzimática e outros, com uma pequena quantidade de amostras. Têm existido alqumas tentativas para produzir o chip de proteínas utilizando os mesmos princípios e factores técnicos como na produção de chips de ADN, que já foram desenvolvidos e são habitualmente utilizados. Em geral, a maioria dos chips de ADN habitualmente utilizados são produzidos por imobilização de ADN sobre um substrato de vidro, cuja superfície foi pré-tratada com um material de revestimento. Quando o chip de proteínas é fabricado de acordo com um método similar ao utilizado na produção de chips de ADN, isto é, quando o chip de proteínas é fabricado por imobilização de proteínas sobre um substrato de vidro cuja superfície foi pré-tratada com um material de revestimento, ocorrerão provavelmente vários problemas devido à diferença em propriedades físicas e químicas entre as proteínas alvo a serem imobilizadas.A protein chip representative of the biochips is formed by intensive microarray of various proteins on a unit surface area of a solid support. Using the protein chip, it is possible to conduct a multipurpose experiment, such as disease diagnosis, high throughput assays (HTS, high throughput εΡ 1 982 184 / Ρ throughput screening), enzyme activity tests and others, with a small quantity of samples. There have been alchemical attempts to produce the protein chip using the same principles and technical factors as in the production of DNA chips, which have already been developed and are commonly used. In general, most commonly used DNA chips are produced by immobilizing DNA on a glass substrate, the surface of which has been pre-treated with a coating material. When the protein chip is manufactured according to a method similar to that used in the production of DNA chips, i.e. when the protein chip is made by immobilizing proteins on a glass substrate whose surface has been pretreated with a material will probably cause various problems due to the difference in physical and chemical properties between the target proteins to be immobilized.

Um chip de proteínas anterior foi produzido por imobilização de proteínas sobre um substrato de vidro de superfície tratada e utilizado para realizar um ensaio de ligação simples. 0 desempenho do chip de proteínas era determinado pela actividade da proteína imobilizada e foi difícil que funcionasse com sucesso (MacBeath e Schreiber, Science 289:1760, 2000). Estes problemas são causados pela desnaturação, inactivação e degradação de proteínas resultantes da diferença nas propriedades físicas e químicas inerentes das proteínas.A previous protein chip was produced by immobilizing proteins on a treated surface glass substrate and used to perform a single binding assay. The performance of the protein chip was determined by the activity of the immobilized protein and was difficult to function successfully (MacBeath and Schreiber, Science 289: 1760, 2000). These problems are caused by the denaturation, inactivation and degradation of proteins resulting from the difference in the inherent physical and chemical properties of the proteins.

De modo a solucionar estes problemas, investigações e estudos têm sido conduzidos sobre tecnologias de tratamento de superfície para imobilização de proteínas, adequadas para as características de proteínas, que se distinguem das do ADN, e materiais para imobilização de proteínas. Esta investigação e estudos estão focados num método para realizar a imobilização sobre a superfície de um chip de proteína ao mesmo tempo mantendo a actividade da proteína. Exemplos destes incluem uma lâmina revestida a hidrogel (PerkinElmner), o chip Versalinx (Prolinx), o chip PDC que é um biochip disponível comercialmente na Zyomyx, etc. 3 ΕΡ 1 982 184/ΡΤIn order to solve these problems, investigations and studies have been conducted on surface treatment technologies for immobilization of proteins, suitable for the characteristics of proteins, which differ from those of DNA, and materials for immobilization of proteins. This research and studies are focused on a method for performing immobilization on the surface of a protein chip while maintaining protein activity. Examples thereof include a hydrogel coated slide (PerkinElmner), the Versalinx chip (Prolinx), the PDC chip which is a commercially available biochip on Zyomyx, etc. 3 ΕΡ 1 982 184 / ΡΤ

Em particular, a lâmina revestida a hidrogel é uma tecnologia gue utiliza um gel de poliacrilamida tridimensional, na qual um vidro suiço de nivel óptico com uma superfície tratada com silano é utilizado como material de base e um polímero de acrilamida de superfície modificada é aplicado sobre o mesmo para melhorar a força de ligação e a estabilidade estrutural de uma proteína. Aqui, a proteína é imobilizada por uma ligação covalente com um grupo funcional do gel de poliacrilamida. Também, o chip Versalinx da Prolinx compreende uma monocamada de automontagem de poli(L-lisina)-g-poli(etilenoglicol) conjugado com biotina formada sobre TÍO3, no qual uma proteína está imobilizada sobre a superfície da monocamada de automontagem, pela qual a actividade da proteína pode ser melhorada. Estes métodos formam uma microestrutura tridimensional e imobilizam covalentemente proteínas sobre uma superfície modificada de modo a manter as actividades das proteínas dentro de pontos (spots). Para além destes métodos, é também possível produzir chips do tipo micropoços através de microprocessamento de modo a produzir chips no estado de solução. Em Loh, Med. Device Technol. 10(1): 24-30, 1999, são revistas as potencialidades e aplicações da modificação de superfícies por plasma em aplicações biomédicas. Entretanto, um processo de sol-gel é uma tecnologia que tem sido utilizada para produzir uma microestrutura por microprocessamento e, em particular, é uma tecnologia que compreende a formação de uma rede de ligação por um processo moderado e a imobilização de biomoléculas dentro da rede de ligação por outros métodos que não uma ligação covalente, em vez de se ligarem quimicamente biomoléculas a um material inorgânico (Gill, I. e Ballesteros, A., Trends Biotechnol., 18:282, 2000). Biomoléculas incluindo enzimas são imobilizadas sobre uma matriz de massa de sol-gel para utilização na produção de chips de biocatalisadores ou biossensores (Reetz et al., Adv. Mater., 9:943, 1997). Especialmente, a matriz de sol-gel é também utilizada na detecção do desenvolvimento de cor óptica devido à sua transparência e propriedades ópticas (Edminston et al., J. Coll. Interf. Sei., 163:395, 1994). Também, as biomoléculas são conhecidas por serem estabilizadas não apenas quimicamente mas também termicamente quando são imobilizadas 4 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ sobre uma matriz de sol-gel (Dave et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994) . A WO 2004/099776 revela um suporte de biochip, consistindo de um substrato suportando pelo menos uma camada de material poroso sobre uma primeira face, em que a camada pretende assegurar a fixação de moléculas biológicas sobre e no interior da referida camada, e onde a camada é uma camada fina de material óptico preparado por um processo de sol-gel, e um método para enxertar moléculas biológicas à superfície e no interior da camada fina de material preparado pelo processo de sol-gel sobre a primeira face do suporte de biochip. A WO 2004/092250 revela um material biocompatível compreendendo uma composição obtida por hidrólise de um composto de silício monomérico possuindo pelo menos um grupo hidrolisável ou condensável ligado ao átomo de silício do composto com outro composto monomérico possuindo pelo menos um grupo reactivo quimicamente ligado ao átomo de metal ou de metalóide do composto para formar um material compósito de siloxano híbrido; e a utilização do material biocompatível num dispositivo sensor, tal como um biossensor ou biochip.In particular, the hydrogel coated sheet is a technology which uses a three-dimensional polyacrylamide gel in which an optical level Swiss glass with a silane treated surface is used as the base material and a modified surface acrylamide polymer is applied over the same for improving the binding strength and structural stability of a protein. Here, the protein is immobilized by a covalent attachment with a functional group of the polyacrylamide gel. Also, the Prolinx Versalinx chip comprises a self-assembling monolayer of biotin-conjugated poly (L-lysine) -g-poly (ethylene glycol) formed on TiO 3, in which a protein is immobilized on the surface of the self-assembling monolayer, whereby the activity of the protein can be improved. These methods form a three-dimensional microstructure and covalently immobilize proteins on a modified surface so as to keep the activities of proteins within spots. In addition to these methods, it is also possible to produce microwell type chips by microprocessing in order to produce chips in the solution state. In Loh, Med. Device Technol. 10 (1): 24-30, 1999, the potentialities and applications of plasma surface modification in biomedical applications are reviewed. However, a sol-gel process is a technology that has been used to produce a microstructure by microprocessing and in particular is a technology which comprises forming a binding network by a moderate process and the immobilization of biomolecules within the network (Gill, I. and Ballesteros, A., Trends Biotechnol., 18: 282, 2000). A method according to any of the preceding claims, characterized in that the biomolecules are chemically bound to an inorganic material. Biomolecules including enzymes are immobilized on a sol-gel mass matrix for use in the production of biocatalyst or biosensor chips (Reetz et al., Adv. Mater., 9: 943, 1997). Especially, the sol-gel matrix is also used in the detection of optical color development because of its transparency and optical properties (Edminston et al., J. Coll. Interf. Sci., 163: 395, 1994). Also, biomolecules are known to be stabilized not only chemically but also thermally when they are immobilized on a sol-gel matrix (Dave et al., Anal. Chem., 66: 1120, 1994). WO 2004/099776 discloses a biochip carrier, consisting of a substrate supporting at least one layer of porous material on a first face, wherein the layer is intended to ensure the attachment of biological molecules on and within said layer, and wherein the layer layer is a thin layer of optical material prepared by a sol-gel process, and a method for grafting biological molecules to the surface and into the thin layer of material prepared by the sol-gel process on the first face of the biochip carrier. WO 2004/092250 discloses a biocompatible material comprising a composition obtained by hydrolysis of a monomeric silicon compound having at least one hydrolyzable or condensable group attached to the silicon atom of the compound with another monomeric compound having at least one reactive group chemically bonded to the metal or metalloid compound of the compound to form a hybrid siloxane composite material; and the use of the biocompatible material in a sensor device, such as a biosensor or biochip.

No caso do biossensor, a reacção sol-gel é utilizada como um método para formar padrões por formação de uma microestrutura sobre um suporte sólido bem como para imobilização simples.In the case of the biosensor, the sol-gel reaction is used as a method for forming patterns by forming a microstructure on a solid support as well as for simple immobilization.

Aqui, o método de formação de padrões inclui modelação de um sol no estado líquido utilizando um molde por dinâmica de fluido, gelatinização do material modelado e separação do molde para formar um padrão. Por exemplo, uma tecnologia designada por tecnologia de micromodulação em capilares (MIMIC, micro-moduling in-capillaries) é utilizada para formação de padrões em sílica mesoscópica (Kim et al., J.Here, the patterning method includes modeling a sol in the liquid state using a die by fluid dynamics, gelatinizing the shaped material and separating the mold to form a pattern. For example, a technology called micro-modulating in-capillaries (MIMIC) technology is used to form patterns in mesoscopic silica (Kim et al., J.

Ferment. Bioeng. 82:239, 1995; Marzolin et al., Adv. Mater. 10:571, 1998; Schuller et al., Appl. Optics 38:5799, 1999).Ferment. Bioeng. 82: 239, 1995; Marzolin et al., Adv. Mater. 10: 571, 1998; Schuller et al., Appl. Optics 38: 5799, 1999).

Esta tecnologia pode ser utilizada na formação de padrões básicos de engenharia de microfluidos.This technology can be used in the formation of basic microfluidic engineering standards.

No entanto, uma vez que a actividade de proteínas pode ser afectada por vários factores tais como o pH, é 5 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ importante estabelecer as condições para a manutenção da actividade adicionando a proteina a partir do seu estado de sol no processo de sol-gel. Para este propósito, são propostas tecnologias para formação de padrões de uma proteina misturando previamente a proteina com um sol, utilizando várias condições moderadas tais como pH neutro (Kim et al., Biotechnol. Bioeng. 73:331 a 337, 2001), mas existem problemas pelo facto de o processo de sol-gel progredir rapidamente a pH neutro para formar um gel e poderem ocorrer fissuras ou o gel tornar-se opaco, de acordo com a escolha de aditivos.However, since the activity of proteins can be affected by various factors such as pH, it is important to establish the conditions for maintaining the activity by adding the protein from its sun state in the process of sol-gel. For this purpose, technologies for pattern formation of a protein are proposed by premixing the protein with a sol, using various mild conditions such as neutral pH (Kim et al., Biotechnol. Bioeng. 73: 331 to 337, 2001), but there are problems in that the sol-gel process progresses rapidly to neutral pH to form a gel and cracks can occur or the gel becomes opaque, according to the choice of additives.

Para ultrapassar os problemas acima descritos, os presentes inventores desenvolveram anteriormente um biochip utilizando uma reacção sol-gel (Publicação de Patente Coreana em Aberto N.° 10-2004-0024510). Especificamente, porque não existia na especialidade anterior qualquer tecnologia pela qual uma matriz de sol-gel contendo biomateriais, incluindo proteínas, pudesse ser imobilizada sobre um substrato de chip na forma de pontos, não existia qualquer biochip no qual uma matriz de sol-gel possuindo biomateriais imobilizados na mesma fosse integrada na forma de pontos. Na patente anterior, foi desenvolvida uma tecnologia de tratamento da superfície de um substrato de chip com um material de revestimento especial, e assim pôde ser preparado pela primeira vez um biochip utilizando uma reacção sol-gel sobre o substrato de chip. Pela tecnologia de tratamento de superfície do substrato de chip de acordo com a patente anterior, uma mistura de sol contendo biomateriais pode ser integrada sobre o substrato de chip na forma de pontos, uma reacção sol-gel para gelificação da mistura de sol pode ocorrer sobre o substrato de chip, e matrizes de sol-gel podem ser imobilizadas sobre o substrato de chip. Em particular, na patente anterior, ao contrário dos biochips anteriores possuindo biomateriais imobilizados sobre a superfície de substrato de chip por ligações covalentes, foi desenvolvido um biochip compreendendo biomateriais aprisionados e encapsulados nos poros de pontos do tipo gel, que estão integrados e imobilizados sobre um substrato de chip. 6 ΕΡ 1 982 184/ΡΤTo overcome the above-described problems, the present inventors have previously developed a biochip using a sol-gel reaction (Korean Open Patent Publication No. 10-2004-0024510). Specifically, because there was in the prior art any technology by which a sol-gel matrix containing biomaterials, including proteins, could be immobilized on a chip substrate in the form of dots, there was no biochip in which a sol-gel matrix having the biomaterials immobilized in it were integrated in the form of points. In the prior patent, a technology for treating the surface of a chip substrate with a special coating material was developed, and thus a biochip could be prepared for the first time using a sol-gel reaction on the chip substrate. By the surface treatment technology of the chip substrate according to the prior patent, a biomaterial containing sol mixture can be integrated onto the chip substrate in dotted form, a sol-gel reaction for gelling the sol mixture can occur on the chip substrate, and sol-gel matrices may be immobilized on the chip substrate. In particular, in the prior patent, unlike prior biochips having biomaterials immobilized on the chip substrate surface by covalent bonds, a biochip comprising entrapped and encapsulated biomaterials was constructed in the gel-like point pores, which are integrated and immobilized on a chip substrate. 6 ΕΡ 1 982 184 / ΡΤ

No entanto, no caso deste biochip, de modo a imobilizar os pontos de gel contendo biomaterial sobre o substrato, a superfície do substrato deverá ser tratada com um agente de revestimento tal como poli(acetato de vinilo), e a mistura de sol deverá ser aplicada por pontos sobre o substrato de superfície tratada. Assim, este biochip é desvantajoso em termos de custo ou de produção em massa e tem uma limitação pelo facto de não poder ser aplicado a biochips possuindo uma superfície ou forma que não pode ser revestida.However, in the case of this biochip, in order to immobilize the gel spots containing biomaterial on the substrate, the surface of the substrate should be treated with a coating agent such as polyvinyl acetate, and the sol mixture should be applied by dots on the treated surface substrate. Thus, this biochip is disadvantageous in terms of cost or mass production and has a limitation in that it can not be applied to biochips having a surface or shape that can not be coated.

Por conseguinte, os presentes inventores desenvolveram muitos esforços para encontrar uma composição de material para utilização em encapsulação de sol-gel, que se pode ligar fortemente a um substrato que não foi submetido a tratamento de superfície essencial para a utilização comercial de biochips. Como resultado, os presentes inventores conceberam um método eficiente para rastrear uma composição de sol e encontrar uma composição de sol, que se pode ligar fortemente a uma superfície de substrato e assim pode suportar uma lavagem intensa durante o processo de análise de biochips e, ao mesmo tempo, pode proporcionar bons resultados de ensaio, completando deste modo o presente invento.Accordingly, the present inventors have made great efforts to find a composition of material for use in sol-gel encapsulation, which can bind strongly to a substrate which has not undergone surface treatment essential for the commercial use of biochips. As a result, the present inventors have devised an efficient method for tracking a sol composition and finding a sol composition, which can bind strongly to a substrate surface and thus can withstand intensive washing during the biochip analysis process, and can provide good test results, thereby completing the present invention.

SUMÁRIO DO INVENTOSUMMARY OF THE INVENTION

Por conseguinte, é um objectivo do presente invento proporcionar um método para rastrear uma composição de sol para biochips de sol-gel, que é utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico.It is therefore an aim of the present invention to provide a method for screening a sol gel composition for sol-gel biochips which is used to immobilize a probe on a substrate that is not coated with a high dissolved synthetic molecular weight synthetic coating agent in an organic solvent.

Outro objectivo do presente invento é proporcionar a utilização de uma composição de sol para substratos de PMMA ou substratos de ouro ou substratos de bolacha de silício, rastreada pelo referido método, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre o mesmo.Another object of the present invention is to provide the use of a sol composition for PMMA substrates or gold substrates or silicon wafer substrates, screened by said method, as well as a sol-gel biochip comprising said sol composition immobilized on the same.

Para conseguir o objectivo anterior, o presente invento proporciona um método para rastrear uma composição de sol 7 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ para biochips de sol-gel, que é utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, o método compreendendo os passos de: (a) obter uma primeira biblioteca de composições de sol onde pelo menos um monómero de silicato seleccionado entre o grupo consistindo de tetrametilortossilicato (TMOS), metiltrimetoxissilano (MTMOS), tetraetilortossilicato (TEOS), etiltrimetoxissilano (ETrEOS), trimetoxissilano (TMS), metiltrimetoxissilicato (MTMS) e 3-aminopropiltrimetoxissilicato (3-ATMS), e pelo menos um aditivo seleccionado entre o grupo consistindo de poliglicerilsilicato (PGS), diglicerilsilano (DGS), 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano (GPTMOS), (N-trietoxissililpropil)-O-poli(óxido de etileno)-uretano (PEOU), glicerol e polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular de 100-10000, são misturados um com o outro em tampão em várias proporções; (b) formar pontos da primeira biblioteca de composições de sol sobre um substrato alvo que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; (c) medir a adesão, aspecto, transmitância e tempo de gelificação dos pontos formados no passo (b) e, com base nos resultados das medições, seleccionar composições que não mostram o desprendimento dos pontos mesmo quando são raspados com uma ponta após lavagem, possuem um diâmetro de ponto de 100-800 pm mantendo ao mesmo tempo uma forma circular, mostram uma autofluorescência inferior à fluorescência de fundo, e têm um tempo de gelificação de 4-48 horas num tubo e um tempo de gelificação de 1-4 horas nos pontos do substrato, obtendo-se desse modo uma segunda biblioteca de composições de sol; (d) adicionar uma sonda à segunda biblioteca de composições de sol e formar pontos da segunda biblioteca contendo sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; e (e) medir a taxa de imobilização dos pontos para a sonda, e a especificidade entre a sonda e uma substância alvo e, com base nos resultados da medição, seleccionar uma composição de sol onde a taxa de imobilização da sonda é pelo menos 70% e a razão de sinais específicos/sinais não específicos da sonda e da substância alvo é pelo menos 3. 8 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ Ο presente invento proporciona também a utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA (tratado por plasma) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico compreende: 17,5-25 partes em peso de TMOS; 5-15 partes em peso de MTMS; 2,5-15 partes em peso de GPTMOS; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada; 11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda. O presente invento proporciona também um biochip de sol-gel, no qual a referida composição de sol está imobilizada sobre um substrato de PMMA (tratado por plasma) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico. O presente invento proporciona também a utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol é utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico e compreende: 22,5-25 partes em peso de TMOS; 7,5-10 partes em peso de MTMS; 2,5-5 partes em peso de GPTMOS; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada; 11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda. O presente invento proporciona também um biochip de sol-gel, no qual a referida composição de sol está imobilizada sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico. O presente invento proporciona também a utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, compreende: 16,2-18,7 partes em peso de TMOS; 3,7-6,2 partes em peso de MTMS; 13,7-16,2 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12,5 9 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ partes em peso de HC1 10 mM; 23, 7-24,5 partes em peso de água destilada; 11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda. O presente invento proporciona também um biochip de sol-gel, no qual a referida composição de sol está imobilizada sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico. O presente invento proporciona também a utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de silício (bolacha) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, compreende: 5-30 partes em peso de TMOS; 2-35 partes em peso de MTMS; 1-15 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 23, 7-24, 5 partes em peso de água destilada; 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 12,5 partes em peso de uma solução de sonda. O presente invento proporciona também um biochip de sol-gel, no qual a referida composição de sol está imobilizada sobre um substrato de silício (bolacha) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico.To achieve the above object, the present invention provides a method for screening a sol-gel composition for sol-gel biochips, which is used to immobilize a probe on a substrate that is not coated with a the method comprising the steps of: (a) obtaining a first library of sol compositions wherein at least one silicate monomer selected from the group consisting of tetramethylorthosilicate (TMOS), methyltrimethoxysilane (MTMOS ), trimethoxysilane (TMS), methyltrimethoxysilicate (MTMS) and 3-aminopropyltrimethoxysilicate (3-ATMS), and at least one additive selected from the group consisting of polyglycerylsilicate (PGS), diglycerylsilane (DGS), tetraethylorthosilicate (TEOS), ethyltrimethoxysilane (ETrEOS) ), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), (N-triethoxysilylpropyl) -O-poly (ethylene oxide) -urethane (PEOU), glycerol and pol ethylene glycol (PEG) having a molecular weight of 100-10000, are mixed together in buffer in various proportions; (b) forming points of the first library of sun compositions on a target substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent; (c) measuring the adhesion, appearance, transmittance and gelation time of the points formed in step (b) and, based on the results of measurements, selecting compositions which do not show peeling even when scraped with a tip after washing, have a dot diameter of 100-800Âμ while maintaining a circular shape, show an autofluorescence lower than background fluorescence, and have a gel time of 4-48 hours in a tube and a gel time of 1-4 hours at the points on the substrate, thereby obtaining a second library of sol compositions; (d) adding a probe to the second library of sol compositions and forming points of the second probe containing library on a substrate that is not coated with a high molecular weight synthetic coating agent dissolved in an organic solvent; and (e) measuring the rate of immobilization of the probe points, and the specificity between the probe and a target substance and, based on the measurement results, selecting a sol composition where the probe immobilization rate is at least 70 % and the ratio of specific signals / non-specific signals of the probe and the target substance is at least 3. The present invention also provides the use of a sol composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition used to immobilize a probe on a plasma treated PMMA substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent comprises: 17.5-25 parts by weight TMOS; 5-15 parts by weight of MTMS; 2.5-15 parts by weight of GPTMOS; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 25 parts by weight of distilled water; 11-13 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 10-15 parts by weight of a probe solution. The present invention also provides a sol-gel biochip, wherein said sol composition is immobilized on a PMMA substrate (plasma treated) which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent. The present invention also provides the use of a sol gel composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition is used to immobilize a probe on a PMMA substrate that is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent and comprises: 22.5-25 parts by weight TMOS; 7.5-10 parts by weight of MTMS; 2.5-5 parts by weight of GPTMOS; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 25 parts by weight of distilled water; 11-13 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 10-15 parts by weight of a probe solution. The present invention also provides a sol-gel biochip, wherein said sol composition is immobilized on a PMMA substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent. The present invention also provides the use of a sol composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition used to immobilize a probe on a gold substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent, comprises: 16.2-18.7 parts by weight of TMOS; 3.7-6.2 parts by weight of MTMS; 13.7-16.2 parts by weight of GPTMOS; 0.01-20 parts by weight of an adhesive; 12.5 9 Ρ Ρ 1 982 184 / ΡΤ parts by weight of 10 mM HCl; 23, 7-24.5 parts by weight of distilled water; 11-13 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 10-15 parts by weight of a probe solution. The present invention also provides a sol-gel biochip, wherein said sol composition is immobilized on a gold substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent. The present invention also provides the use of a sol composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition used to immobilize a probe on a silicon substrate (wafer) which is not coated with a synthetic coating agent of weight molecular weight dissolved in an organic solvent, comprises: 5-30 parts by weight TMOS; 2-35 parts by weight of MTMS; 1-15 parts by weight of GPTMOS; 0.01-20 parts by weight of an adhesive; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 23, 7-24, 5 parts by weight of distilled water; 12.5 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 12.5 parts by weight of a probe solution. The present invention also provides a sol-gel biochip, wherein said sol composition is immobilized on a silicon (wafer) substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent.

Os objectos, características e concretizações anteriores e outros do presente invento serão mais claramente compreendidos a partir da descrição detalhada seguinte e das reivindicações apensas.The foregoing and other objects, features and embodiments of the present invention will be more clearly understood from the following detailed description and the appended claims.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 mostra um método de análise que utiliza um biochip do tipo placa de 96 poços de acordo com o presente invento. A FIG. 2 é um fluxograma mostrando um método para rastrear uma composição de sol que forma pontos sobre um substrato de superfície não tratada. 10 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ A FIG. 3 mostra propriedades físicas de uma formulação de chip de proteínas seleccionada a partir do método de rastreio de acordo com o presente invento. A FIG. 4 mostra resultados de diagnóstico de HIV obtidos misturando proteína de antigénio de HIV p24 com a composição de sol obtida através do processo de rastreio do invento, por imobilização da proteína de antigénio sobre uma placa de 96 poços sem tratamento de superfície e realização do diagnóstico de um paciente de HIV utilizando o antigénio imobilizado. A FIG. 5 mostra resultados de diagnóstico de HCV obtidos por mistura de um marcador de HCV com a composição de sol obtida através do processo de rastreio do invento, imobilização do marcador sobre uma placa de 96 poços sem tratamento de superfície e realização do diagnóstico de hepatite C utilizando o marcador imobilizado. A FIG. 6 mostra o limite de detecção (sensibilidade) para um chip de proteínas de sol-gel de acordo com o presente invento. À esquerda estão os resultados do diagnóstico de hepatite C realizado utilizando um biochip possuindo uma composição de sol utilizada de acordo com o presente invento imobilizada sobre o mesmo e à direita um gráfico mostrando os resultados obtidos analisando quantitativamente os resultados de diagnóstico utilizando um programa de software de quantificação. A FIG. 7 mostra um chip de ouro fabricado por formação de pontos de uma composição de sol rastreada de acordo com o método do invento sobre um substrato de ouro (Au). A FIG. 8 é um chip de semiconductor fabricado por formação de pontos de uma composição de sol rastreada de acordo com o método do invento sobre um substrato semicondutor.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows a method of analysis using a 96-well plate type biochip according to the present invention. FIG. 2 is a flowchart showing a method for tracking a dots-forming sol composition on an untreated surface substrate. 10 Ε 1 982 184 / ΡΤ FIG. 3 shows physical properties of a protein chip formulation selected from the screening method according to the present invention. FIG. 4 shows HIV diagnostic results obtained by blending HIV p24 antigen protein with the sol composition obtained by the screening procedure of the invention, by immobilizing the antigen protein on a 96-well plate without surface treatment and performing the diagnosis of an HIV patient using the immobilized antigen. FIG. 5 shows HCV diagnostic results obtained by mixing an HCV marker with the sol composition obtained by the screening procedure of the invention, immobilizing the marker on a 96-well plate without surface treatment and performing the diagnosis of hepatitis C using the stationary marker. FIG. 6 shows the detection limit (sensitivity) for a sol-gel protein chip according to the present invention. On the left are the results of the diagnosis of hepatitis C performed using a biochip having a sol composition used in accordance with the present invention immobilized thereon and to the right a graph showing the results obtained by quantitatively analyzing the diagnostic results using a software program of quantification. FIG. 7 shows a gold chip made by spotting a sun composition screened according to the method of the invention on a gold (Au) substrate. FIG. 8 is a semiconductor chip made by dotting a sun composition screened according to the method of the invention on a semiconductor substrate.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO E CONCRETIZAÇÕES PREFERIDASDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION AND PREFERRED EMBODIMENTS

Num aspecto, o presente invento refere-se a um método para rastrear uma composição de sol para biochips de sol- 11 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ gel, que é utilizado para imobilizar uma sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, o método compreendendo os passos de (a) obter uma primeira biblioteca de composições de sol onde pelo menos um monómero de silicato seleccionado entre o grupo consistindo de tetrametilortossilicato (TMOS), metiltrimetoxissilano (MTMOS), tetraetilortossilicato (TEOS), etiltrimetoxissilano (ETrEOS), trimetoxissilano (TMS), metiltrimetoxissilicato (MTMS) e 3-aminopropiltrimetoxissilicato (3-ATMS), e pelo menos um aditivo seleccionado entre o grupo consistindo de poliglicerilsilicato (PGS), diglicerilsilano (DGS), 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano (GPTMOS), (N-trietoxissililpropil)-O-poli(óxido de etileno)-uretano (PEOU), glicerol e polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular de 100-10000, são misturados um com o outro em tampão em várias proporções; (b) formar pontos da primeira biblioteca de composições de sol sobre um substrato alvo que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; (c) medir a adesão, aspecto, transmitância e tempo de gelificação dos pontos formados no passo (b) e, com base nos resultados das medições, seleccionar composições que não mostram o desprendimento dos pontos mesmo quando são raspados com uma ponta após lavagem, possuem um diâmetro de ponto de 100-800 pm mantendo ao mesmo tempo uma forma circular, mostram uma autofluorescência inferior à fluorescência de fundo, e têm um tempo de gelificação de 4-48 horas num tubo e um tempo de gelificação de 1-4 horas nos pontos do substrato, obtendo-se desse modo uma segunda biblioteca de composições de sol; (d) adicionar uma sonda à segunda biblioteca de composições de sol e formar pontos da segunda biblioteca contendo sonda sobre um substrato que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico; e (e) medir a taxa de imobilização dos pontos para a sonda, e a especificidade entre a sonda e uma substância alvo e, com base nos resultados da medição, seleccionar uma composição de sol onde a taxa de imobilização da sonda é pelo menos 70% e a razão de sinais especificos/sinais não específicos da sonda e da substância alvo é pelo menos 3. 12 ΕΡ 1 982 184/ΡΤIn one aspect, the present invention relates to a method for screening a sol composition for sol-gel biochips, which is used to immobilize a probe on a substrate that is not coated with a release agent. the method comprising the steps of (a) obtaining a first library of sol compositions wherein at least one silicate monomer selected from the group consisting of tetramethylorthosilicate (TMOS), methyltrimethoxysilane (MTMOS) (TMS), methyltrimethoxysilicate (MTMS) and 3-aminopropyltrimethoxysilicate (3-ATMS), and at least one additive selected from the group consisting of polyglycerylsilicate (PGS), diglycerylsilane (DGS), tetraethylorthoxysilicate (TEOS), ethyltrimethoxysilane (ETrEOS), trimethoxysilane , 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), (N-triethoxysilylpropyl) -O-poly (ethylene oxide) -urethane (PEOU), glycerol and polyethylene glycol (PEG) m having a molecular weight of 100-10000, are mixed together in buffer in various proportions; (b) forming points of the first library of sun compositions on a target substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent; (c) measuring the adhesion, appearance, transmittance and gelation time of the points formed in step (b) and, based on the results of measurements, selecting compositions which do not show peeling even when scraped with a tip after washing, have a dot diameter of 100-800Âμ while maintaining a circular shape, show an autofluorescence lower than background fluorescence, and have a gel time of 4-48 hours in a tube and a gel time of 1-4 hours at the points on the substrate, thereby obtaining a second library of sol compositions; (d) adding a probe to the second library of sol compositions and forming points of the second probe containing library on a substrate that is not coated with a high molecular weight synthetic coating agent dissolved in an organic solvent; and (e) measuring the rate of immobilization of the probe points, and the specificity between the probe and a target substance and, based on the measurement results, selecting a sol composition where the probe immobilization rate is at least 70 % and the ratio of specific signals / non-specific signals of the probe and the target substance is at least 3. 12 Ε 1 982 184 / ΡΤ

No presente invento, a sonda é preferivelmente qualquer uma seleccionada entre o grupo consistindo de proteínas, oligopéptidos, ácidos nucleicos, substâncias de peso molecular baixo, microorganismos, fungos e materiais de ervas medicinais, e o substrato é preferivelmente qualquer um seleccionado entre o grupo consistindo de placas de polímero, metais, bolachas de silício, vidro e LCD.In the present invention, the probe is preferably any one selected from the group consisting of proteins, oligopeptides, nucleic acids, low molecular weight substances, microorganisms, fungi and herbal materials, and the substrate is preferably any one selected from the group consisting of of polymer plates, metals, silicon wafers, glass and LCD.

Noutro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA (tratado por plasma) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico compreende os componentes seguintes, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre um substrato de PMMA (tratado por plasma) que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico: 17.5- 25 partes em peso de TMOS; 5-15 partes em peso de MTMS; 2.5- 15 partes em peso de GPTMOS; 12,5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada;In another aspect, the present invention relates to the use of a sol composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition used to immobilize a probe on a (plasma-treated) PMMA substrate which is not coated with a high molecular weight synthetic coating agent dissolved in an organic solvent comprises the following components, as well as a sol-gel biochip comprising said sol composition immobilized on a PMMA substrate (plasma treated) which is not coated with a high molecular weight synthetic coating dissolved in an organic solvent: 17.5-25 parts by weight TMOS; 5-15 parts by weight of MTMS; 2.5- 15 parts by weight of GPTMOS; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 25 parts by weight of distilled water;

11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda.11-13 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 10-15 parts by weight of a probe solution.

Ainda noutro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol é utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico e compreende os componentes seguintes, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre um substrato de PMMA que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico: 22.5- 25 partes em peso de TMOS; 7.5- 10 parte em peso de MTMS; 13 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ 2,5-5 partes em peso de GPTMOS; 12.5 partes em peso de HC1 10 mM; 25 partes em peso de água destilada;In yet another aspect, the present invention relates to the use of a sol composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition is used to immobilize a probe on a PMMA substrate that is not coated with a coating agent synthetic high molecular weight polymer dissolved in an organic solvent and comprises the following components as well as a sol-gel biochip comprising said sol composition immobilized on a PMMA substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent: 22.5-25 parts by weight of TMOS; 7.5- 10 part by weight of MTMS; 13 ÅΡ 1 982 184 / ΡΤ 2.5-5 parts by weight of GPTMOS; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 25 parts by weight of distilled water;

11-13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10- 15 partes em peso de uma solução de sonda.11-13 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 10-15 parts by weight of a probe solution.

Na utilização da composição de sol, a referida sonda é preferivelmente proteina, mais preferivelmente antigénio de HCV, e no biochip de sol-gel o referido substrato é preferivelmente uma placa de 96 poços.In use of the sol composition, said probe is preferably protein, more preferably HCV antigen, and in the sol-gel biochip said substrate is preferably a 96-well plate.

Ainda num outro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico, compreende os componentes seguintes, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre um substrato de ouro que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico: 16,2-18,7 partes em peso de TMOS; 3.7- 6,2 partes em peso de MTMS; 13.7- 16,2 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12.5 partes em peso de HC1 10 mM; 23.7- 24,5 partes em peso de água destilada;In yet another aspect, the present invention relates to the use of a sol composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition used to immobilize a probe on a gold substrate which is not coated with a coating agent synthetic high molecular weight polymer dissolved in an organic solvent comprises the following components as well as a sol-gel biochip comprising said sol composition immobilized on a gold substrate which is not coated with a high dissolved synthetic molecular weight synthetic coating agent in an organic solvent: 16.2-18.7 parts by weight of TMOS; 3.7- 6.2 parts by weight of MTMS; 13.7 - 16.2 parts by weight of GPTMOS; 0.01-20 parts by weight of an adhesive; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 23.7- 24.5 parts by weight of distilled water;

11- 13 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 10-15 partes em peso de uma solução de sonda.11-13 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 10-15 parts by weight of a probe solution.

Na utilização da composição de sol, o referido adesivo é preferivelmente 1010 e/ou 1020, e a referida sonda é preferivelmente proteina.In the use of the sol composition, said adhesive is preferably 1010 and / or 1020, and said probe is preferably protein.

Ainda noutro aspecto, o presente invento refere-se à utilização de uma composição de sol para biochips de sol-gel, pela qual a composição de sol utilizada para imobilizar uma sonda sobre um substrato de silício que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso 14 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ molecular elevado dissolvido num solvente orgânico compreende os componentes seguintes, bem como um biochip de sol-gel compreendendo a referida composição de sol imobilizada sobre um substrato de silício que não está revestido com um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado dissolvido num solvente orgânico: 5-30 partes em peso de TMOS; 2-35 partes em peso de MTMS; 1-15 partes em peso de GPTMOS; 0,01-20 partes em peso de um adesivo; 12.5 partes em peso de HC1 10 mM; 23,7-24,5 partes em peso de água destilada;In yet another aspect, the present invention relates to the use of a sol composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition used to immobilize a probe on a silicon substrate that is not coated with a synthetic coating agent of high molecular weight dissolved in an organic solvent comprises the following components, as well as a sol-gel biochip comprising said sol composition immobilized on a silicon substrate which is not coated with a synthetic coating agent of high molecular weight dissolved in an organic solvent: 5-30 parts by weight of TMOS; 2-35 parts by weight of MTMS; 1-15 parts by weight of GPTMOS; 0.01-20 parts by weight of an adhesive; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 23.7-24.5 parts by weight of distilled water;

12.5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8); e 12.5 partes em peso de uma solução de sonda.12.5 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 12.5 parts by weight of a probe solution.

Como aqui utilizado, o termo "tratamento de superfície" é o termo revelado na patente anterior (Publicação de Patente Coreana em Aberto N.° 10-2004-0024510) dos presentes inventores e refere-se ao revestimento da superfície de um substrato para utilização em biochips de sol-gel com uma solução de um agente de revestimento sintético de peso molecular elevado, tal como poli(acetato de vinilo), dissolvido num solvente orgânico tal como diclorometano ou tetra-hidrofurano.As used herein, the term " surface treatment " is the term disclosed in the above patent (Korean Patent Publication No. 10-2004-0024510) of the present inventors and relates to coating the surface of a substrate for use in sol-gel biochips with a solution of a high molecular weight synthetic coating agent, such as polyvinyl acetate, dissolved in an organic solvent such as dichloromethane or tetrahydrofuran.

Como biomateriais que podem ser imobilizados sobre o biochip de acordo com o presente invento, é possível utilizar todos os biomateriais que se podem ligar especificamente a uma substância alvo para permitir a análise da ligação entre eles. Preferivelmente, os biomateriais incluem ácidos nucleicos incluindo ADN, ARN ou PNA, proteínas e oligopéptidos. Adicionalmente, é também possível imobilizar vários compostos, incluindo substâncias de baixo peso molecular e substâncias naturais.As biomaterials that can be immobilized on the biochip according to the present invention, it is possible to use all biomaterials that can specifically bind to a target substance to permit analysis of binding between them. Preferably, the biomaterials include nucleic acids including DNA, RNA or PNA, proteins and oligopeptides. In addition, it is also possible to immobilize various compounds, including low molecular weight substances and natural substances.

Entre os biomateriais, exemplos não limitantes de proteínas que podem ser integradas sobre a superfície de substrato de chip com uma densidade elevada de acordo com o presente invento incluem p24 de HIV, Combo, RgpIII, HCV core, NS5, NS3, E1/E2, antigénios de superfície e anticorpos de HBV, IgG-Cy3, antigénios ou anticorpos para diagnóstico 15 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ de doenças infecciosas, antigénios ou anticorpos para diagnóstico do cancro, incluindo AFP (alfa-fetoproteina), PSA, CA1-1 e glipecano, e enzimas que são utilizadas em medição de actividade. Também, para além de proteínas, antigénios e anticorpos, utilizando a composição de sol é possível imobilizar substâncias de baixo peso molecular para utilização no desenvolvimento de novos fármacos, e substâncias naturais, incluindo plantas nativas, microorganismos, fungos e materiais de ervas medicinais.Among the biomaterials, non-limiting examples of proteins that can be integrated onto the high density chip substrate surface according to the present invention include HIV p24, Combo, RgpIII, core HCV, NS5, NS3, E1 / E2, surface antigens and antibodies to HBV, IgG-Cy3, antigens or antibodies for the diagnosis of infectious diseases, antigens or antibodies for the diagnosis of cancer, including AFP (alpha-fetoprotein), PSA, CA1-1 and glipecane, and enzymes which are used in measuring activity. Also, in addition to proteins, antigens and antibodies, using the sun composition it is possible to immobilize low molecular weight substances for use in the development of novel drugs, and natural substances, including native plants, microorganisms, fungi and herbal materials.

De acordo com o presente invento, uma mistura de sol possuindo uma composição seleccionada por rastreio pode ser usada para formar pontos sobre um substrato do tipo placa de 96 poços sem tratamento de superfície, e um biochip possuindo uma sonda imobilizada sobre o mesmo utilizando a mistura de sol pode ser usada para diagnóstico e análise utilizando dispositivos automatizados existentes para testes imunológicos sem introdução de novos dispositivos. 0 processo de análise é apresentado na FIG. 1. Como a placa de 96 poços, qualquer placa de polímero disponível comercialmente de qualquer fabricante pode ser utilizada sem qualquer limitação particular mas, no presente invento, utilizou-se uma placa de 96 poços (NUNC, SPL) para imobilizar pontos e fabricar um chip. Também, como se mostra na FIG. 1, os dispositivos automatizados podem ser utilizados, por exemplo, com um dispositivo Axym (Abott) e um dispositivo da Roche.According to the present invention, a sol mixture having a composition selected by screening can be used to form spots on a 96-well plate-type substrate without surface treatment, and a biochip having a probe immobilized thereon using the mixture can be used for diagnosis and analysis using existing automated devices for immunological testing without introducing new devices. The analysis process is shown in FIG. 1. As the 96-well plate, any commercially available polymer plate from any manufacturer can be used without any particular limitation but in the present invention a 96-well plate (NUNC, SPL) was used to immobilize points and manufacture a chip. Also, as shown in FIG. 1, the automated devices may be used, for example, with an Axym (Abott) device and a Roche device.

No caso de um chip de proteína, o diâmetro dos pontos é preferivelmente cerca de 100-500 pm, e são integrados preferivelmente 1-1000 pontos por poço. Nos Exemplos abaixo, foi fabricado um chip possuindo 100 pontos/cm2, mas é possível integrar pontos com uma densidade elevada de até 1000 pontos/cm2.In the case of a protein chip, the diameter of the points is preferably about 100-500 Âμm, and preferably 1-1000 points per well are integrated. In the Examples below, a chip having 100 dots / cm2 was manufactured, but dots with a high density of up to 1000 dots / cm 2 can be integrated.

No caso de um biochip fabricado utilizando uma reacção sol-gel no presente invento, resultados de reacção podem ser obtidos em 30 minutos a 2 horas, ao contrário de um método de diagnóstico requerendo um tempo de reacção longo, ou um método de diagnóstico de biochip existente. 16 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ Ο chip de proteínas fabricado de acordo com o presente invento pode ser utilizado em diagnóstico, marcando um antigénio com um pigmento fluorescente do mesmo modo como num ensaio de sanduíche, como um método de diagnóstico imunológico. Neste caso, num passo de medição de resultados, os resultados de diagnóstico podem ser analisados e quantificados utilizando um analisador de fluorescência através de um programa de software. 0 chip de proteínas fabricado de acordo com o presente invento pode substituir um método de diagnóstico imunológico enzimático de HIV, HCV, HBV e outros.In the case of a biochip fabricated using a sol-gel reaction in the present invention, reaction results may be obtained within 30 minutes to 2 hours, unlike a diagnostic method requiring a long reaction time, or a biochip diagnostic method existing. The protein chip manufactured according to the present invention can be used in the diagnosis by labeling an antigen with a fluorescent pigment in the same manner as in a sandwich assay as an immunological diagnostic method. In this case, in a step of measuring results, the diagnostic results can be analyzed and quantified using a fluorescence analyzer through a software program. The protein chip made in accordance with the present invention may replace an enzymatic immunological diagnostic method of HIV, HCV, HBV and the like.

Na composição de sol utilizada de acordo com o presente invento, porque os biomateriais podem ser adicionados num estado de solução, proteínas ou substâncias de baixo peso molecular podem ser integradas numa densidade elevada. Assim, é possível realizar ensaios de elevado rendimento (HTS, high throughput screening) utilizando o biochip fabricado. Também, porque as enzimas para utilização na medição da actividade de proteínas podem ser integradas na mistura de sol, o biochip fabricado pode ser utilizado na medição de actividade enzimática. As enzimas para medição da actividade incluem enzimas que são utilizadas em análise de toxicidade, análise ambiental e análise de bactérias nos alimentos. Assim, o biochip do tipo placa de 96 poços de acordo com o presente invento pode ser aplicado para diagnóstico de doenças e pode ser utilizado não apenas em tecnologias fundamentais para o desenvolvimento de novos fármacos, mas também em análise ambiental e análise de toxicidade. A FIG. 1 mostra um método de análise utilizando o biochip do tipo placa de 96 poços de acordo com o presente invento. No presente invento, uma composição de sol pode ser imobilizada de modo estável sobre uma placa de 96 poços sem tratamento de superfície, e pode ser analisada do mesmo modo utilizando um dispositivo de diagnóstico imunológico existente.In the sol composition used in accordance with the present invention, because the biomaterials can be added in a solution state, proteins or low molecular weight substances can be integrated into a high density. Thus, it is possible to perform high throughput screening (HTS) using the fabricated biochip. Also, because the enzymes for use in measuring protein activity can be integrated into the sol mixture, the fabricated biochip can be used in the measurement of enzyme activity. Enzymes for measuring activity include enzymes that are used in toxicity analysis, environmental analysis and analysis of bacteria in food. Thus, the 96-well plate type biochip according to the present invention can be applied for disease diagnosis and can be used not only in technologies essential for the development of new drugs but also in environmental analysis and toxicity analysis. FIG. 1 shows a method of analysis using the 96-well plate type biochip according to the present invention. In the present invention, a sol composition may be stably immobilized on a 96-well plate without surface treatment, and may be analyzed in the same manner using an existing immunological diagnostic device.

Também, a composição de sol utilizada de acordo com o presente invento pode ser aplicada a um biossensor desenvolvido anterior para aumentar a sua sensibilidade. A 17 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ composição de sol pode ser imobilizada sobre polímeros, superfícies de metal incluindo ouro, superfícies de semicondutor incluindo silicio, superfícies de polímero transparentes, superfícies de vidro incluindo espelho, para aumentar a sua sensibilidade. Para facilitar a detecção, uma substância alvo é preferivelmente marcada com um indutor de sinal tal como um pigmento fluorescente. A detecção da ligação entre o biomaterial e a substância alvo pode ser realizada utilizando vários métodos, incluindo um método de detecção de fluorescência, um método de detecção electroquímico, um método de detecção que utiliza uma alteração de massa, um método de detecção que utiliza uma alteração de carga eléctrica, e um método de detecção que utiliza uma diferença em propriedades ópticas, de acordo com as propriedades de um substrato ao qual uma substância alvo marcada com um indutor de sinal está ligada.Also, the sol composition used in accordance with the present invention can be applied to a previously developed biosensor to increase its sensitivity. The composition of sol can be immobilized on polymers, metal surfaces including gold, semiconductor surfaces including silicon, transparent polymer surfaces, glass surfaces including mirror, to increase its sensitivity. To facilitate detection, a target substance is preferably labeled with a signal inducer such as a fluorescent pigment. Detection of the binding between the biomaterial and the target substance can be accomplished using a variety of methods, including a fluorescence detection method, an electrochemical detection method, a detection method using a mass change, a detection method using a an electric charge change, and a detection method which uses a difference in optical properties according to the properties of a substrate to which a target substance labeled with a signal inducer is attached.

Quando a composição de gel é utilizada de acordo com o presente invento, podem ser integradas proteínas, antigénios, anticorpos, substâncias de baixo peso molecular e bactérias num máximo de 1000 pontos por poço. A composição utilizada de acordo com o presente invento pode ser tipicamente utilizada em rastreio de bancos de sangue para procedimentos de compatibilidade em transfusão de sangue (marcadores de doenças infecciosas, por exemplo, HIV I, II, HCV, HBV, malaria, H. pylori, sífilis, etc.) num processo de colheita de sangue, e um marcador para o diagnóstico de cancro em geral e um marcador para o diagnóstico de um cancro específico podem ser integrados sobre um substrato ao mesmo tempo e podem ser utilizados em diagnóstico. Além disso, de acordo com o presente invento, pode ser desenvolvido um grupo de produtos, incluindo POCT, que podem detectar doenças e bactérias sem um marcador fluorescente, utilizando vários substratos de metal e semiconductor. Também, marcadores sensíveis a poluição ambiental, particularmente poluição da água, podem ser integrados ao mesmo tempo, pelo que a poluição da água pode ser detectada prontamente.When the gel composition is used in accordance with the present invention, proteins, antigens, antibodies, low molecular weight substances and bacteria may be integrated into a maximum of 1000 points per well. The composition used in accordance with the present invention can typically be used in blood bank screening for blood transfusion compatibility procedures (markers of infectious diseases, eg, HIV I, II, HCV, HBV, malaria, H. pylori , syphilis, etc.) in a blood collection process, and a marker for the diagnosis of cancer in general and a marker for the diagnosis of a specific cancer can be integrated on a substrate at the same time and can be used in diagnosis. Further, in accordance with the present invention, a group of products, including POCTs, can be developed which can detect diseases and bacteria without a fluorescent label using various metal and semiconductor substrates. Also, markers sensitive to environmental pollution, particularly water pollution, can be integrated at the same time, so water pollution can be detected promptly.

Exemplos O presente invento será aqui a seguir descrito em maior detalhe através de exemplos. No entanto, deve ser entendido 18 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ que estes exemplos podem ser modificados em várias outras formas, e o âmbito do presente invento não pretende estar limitado a tais exemplos. Estes exemplos são apresentados para descrever mais detalhadamente o presente invento para uma pessoa perita na especialidade.Examples The present invention will hereinafter be described in more detail by way of examples. However, it should be understood that these examples may be modified in various other forms, and the scope of the present invention is not intended to be limited to such examples. These examples are presented to further describe the present invention to a person skilled in the art.

Exemplo 1: Rastreio de composições de sol que são específicas para um substrato e biomateriais e, ao mesmo tempo, podem ser imobilizadas directamente sobre o substratoExample 1: Screening of sun compositions which are specific for a substrate and biomaterials and, at the same time, can be immobilized directly onto the substrate

Uma composição de sol-gel, que pode suportar uma forte lavagem mesmo quando é imobilizada directamente sobre um substrato de superfície não tratada e, ao mesmo tempo, tem excelentes propriedades físicas quando é fabricada num biochip, foi rapidamente rastreada pelo método de rastreio do invento (FIG. 2) . A FIG. 2 é um fluxograma que mostra um método para rastrear uma composição de sol que forma pontos sobre um substrato de superfície não tratada, e a FIG. 3 mostra exemplos de composições seleccionadas e excluídas no método de rastreio da FIG. 2. Pode-se observar que as composições excluídas não podiam imobilizar biomateriais tais como proteínas sem tratamento de superfície e foram completamente desprendidas durante um processo de lavagem.A sol-gel composition, which can withstand strong washing even when directly immobilized on an untreated surface substrate and at the same time has excellent physical properties when manufactured in a biochip, has been rapidly screened by the screening method of the invention (FIG 2). FIG. 2 is a flowchart showing a method for tracking a dots-forming sol composition on an untreated surface substrate, and FIG. 3 shows examples of compositions selected and excluded in the screening method of FIG. 2. It can be seen that the excluded compositions could not immobilize biomaterials such as proteins without surface treatment and were completely detached during a washing process.

Primeiro, cerca de 100000 composições de sol baseadas em monómeros de silicato foram utilizadas para formar pontos sobre um substrato e medidas no que se refere à forte adesão capaz de suportar lavagem num processo de análise, propriedades físicas capazes de manterem a forma dos pontos constante, tempo de gelificação, transmitância óptica, e autofluorescência baixa. Das composições utilizadas para formar os pontos, foi primeiramente rastreado um total de 700 composições, que não se desprenderam mesmo quando foram raspados com uma ponta após lavagem, tinham um diâmetro de ponto de 100-800 pm mantendo ao mesmo tempo uma forma circular, tinham uma autofluorescência inferior à fluorescência de fundo, e tinham um tempo de gelificação de 4-48 horas num tubo e um tempo de gelificação de 1-4 horas nos pontos do substrato.First, about 100,000 sun compositions based on silicate monomers were used to form dots on a substrate and measured with respect to the strong adhesion capable of withstanding washing in an analytical process, physical properties capable of maintaining the shape of the dots constant, gelation time, optical transmittance, and low autofluorescence. From the compositions used to form the dots, a total of 700 compositions were first screened, which did not come off even when scraped with a tip after washing, had a dot diameter of 100-800Âμ while maintaining a circular shape, had an autofluorescence lower than the background fluorescence, and had a gel time of 4-48 hours in a tube and a gel time of 1-4 hours at the substrate points.

Entre as 700 composições de sol, em face do rendimento de imobilização de biomateriais e da sensibilidade numa 19 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ análise imunológica, foram seleccionadas as composições onde a taxa de imobilização de uma sonda foi mais de 70% e a razão de sinais específicos/sinais não específicos da sonda e da substância alvo foi pelo menos 3.Among the 700 sol compositions, in view of the immobilization yield of biomaterials and the sensitivity in an immunological analysis, compositions were selected where the immobilization rate of a probe was more than 70% and the ratio of Specific signals / non-specific signals from the probe and the target substance were at least 3.

Finalmente, quando os biomateriais eram substâncias de baixo peso molecular, proteínas e anticorpos, obtiveram-se respectivamente, 2 composições, 7 composições e 8 composições.Finally, when the biomaterials were low molecular weight substances, proteins and antibodies, 2 compositions, 7 compositions and 8 compositions respectively were obtained.

Será aqui a seguir descrito em mais detalhe, o método para rastrear composições de sol de acordo com o presente invento.The method of screening sun compositions according to the present invention will hereinafter be described in more detail.

Rastreio primário de composições de solPrimary tracking of sun compositions

Monómeros de silicato (TMOS, MTMOS, TEOS, TrEOS, TMS, MTMS e 3-ATMS), intermediários (PGS e DGS) e aditivos (GPTMOS, PEOU, glicerol, PEG200, PEG400 e PEG8000) foram adicionados a uma solução HC1 10 mM para se obterem várias composições. Finalmente, a cada uma das composições foram adicionados tampões possuindo diferentes pH (4-9), concentrações (0-500 mM) e sais (potássio e amónio). Como resultado, obtiveram-se mais do que 100000 composições, e estas composições foram integradas sobre uma placa de PMMA disponível comercialmente (poli(metacrilato de metilo)), e testadas quanto à adesão, aspecto dos pontos, tempo de gelificação, transmitância e fluorescência de fundo. A adesão foi testada por raspagem intensa dos pontos após lavagem, na qual o substrato foi lavado intensivamente três vezes com 1 χ PBS (contendo 10% de Tween®) a 1200 rpm durante 5 minutos, e depois seleccionaram-se as composições de pontos que não se desprenderam mesmo quando foram raspadas directamente com uma ponta. O aspecto dos pontos foi observado directamente com um microscópio óptico para seleccionar os pontos que mantiveram uma forma circular e tinham um diâmetro de ponto de 100-800 pm. O tempo de gelificação foi medido tanto num tubo como nos pontos, e seleccionaram-se as composições que mostraram um tempo de gelificação de mais de 4 horas no tubo e um tempo de gelificação de mais de 1 hora nos pontos. No que se refere à transmitância óptica, seleccionaram-se as composições que se 20 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ determinou terem uma autofluorescência inferior à fluorescência de fundo utilizando um leitor de laser (GenePix 4100, Axon Instrument).Silicate monomers (TMOS, MTMOS, TEOS, TrEOS, TMS, MTMS and 3-ATMS), intermediates (PGS and DGS) and additives (GPTMOS, PEOU, glycerol, PEG200, PEG400 and PEG8000) were added to a 10 mM HCl solution to obtain various compositions. Finally, to each of the compositions were added buffers having different pH (4-9), concentrations (0-500 mM) and salts (potassium and ammonium). As a result, more than 100,000 compositions were obtained, and these compositions were integrated onto a commercially available PMMA (poly (methyl methacrylate) plate), and tested for adhesion, dot appearance, gelation time, transmittance and fluorescence background. Adhesion was tested by intense scraping of the spots after washing, in which the substrate was intensively washed three times with 1 χ PBS (containing 10% TweenÂ®) at 1200 rpm for 5 minutes, and then the dot blends were selected. they did not detach even when they were scraped directly with a tip. The appearance of the dots was directly observed with an optical microscope to select the dots which remained circular in shape and had a dot diameter of 100-800 Âμm. The gelation time was measured both in a tube and at points, and compositions were selected which showed a gel time of more than 4 hours in the tube and a gel time of more than 1 hour at the points. As regards optical transmittance, the compositions were selected which were determined to have an autofluorescence lower than background fluorescence using a laser reader (GenePix 4100, Axon Instrument).

Selecção de composições óptimasSelection of optimal compositions

Mediu-se a velocidade de imobilização dos pontos de cada uma das composições rastreadas primeiramente por comparação dos sinais de um péptido, uma proteina BSA e um anticorpo imobilizados marcados com Cy-3, antes e após um processo de lavagem. Para análise de actividade, uma proteina BSA (500 ng/μ ) foi adicionada a cada uma das composições rastreadas primeiramente, e as misturas resultantes foram integradas sobre uma placa do tipo lâmina de PMMA em conjunto com a proteina. Deixou-se a lâmina reagir com um anticorpo de BSA marcado com Cy-3 (Sigma) durante 30 minutos, e depois lavou-se intensamente com uma solução de lavagem (1 χ PBS, 0,1% de Tween® (Sigma)), seguindo-se secagem. Para analisar a sensibilidade dos sinais, efectuou-se a leitura dos pontos da lâmina, e o valor do sinal em relação ao valor de fundo foi quantificado utilizando o software GenePix Pro 4.0 (Axon Instrument) de modo a analisar a sensibilidade do sinal.The spot immobilization rate of each of the screened compositions was measured first by comparing the signals of a Cy-3-labeled peptide, BSA protein and immobilized antibody before and after a washing process. For activity analysis, a BSA protein (500 ng / μ) was added to each of the first screened compositions, and the resulting mixtures were integrated onto a PMMA blade type plate in conjunction with the protein. The slide was allowed to react with a Cy-3-labeled BSA antibody (Sigma) for 30 minutes, and then washed intensively with a wash solution (1 χ PBS, 0.1% Tween® (Sigma)). , followed by drying. To analyze the sensitivity of the signals, the points of the slide were read, and the signal value in relation to the background value was quantified using the GenePix Pro 4.0 software (Axon Instrument) in order to analyze the signal sensitivity.

Como resultado, como se mostra na Tabela 1 abaixo, duas composições entre as composições rastreadas primeiramente mostraram uma taxa de imobilização de mais de 70% para a substância de peso molecular baixo ai contida, 7 composições mostraram uma taxa de imobilização de mais de 80% para a proteina ai contida, e 8 composições mostraram uma taxa de imobilização de cerca de 90% para o anticorpo.As a result, as shown in Table 1 below, two compositions among the first screened compositions showed an immobilization rate of more than 70% for the low molecular weight substance contained therein, compositions showed an immobilization rate of greater than 80% for the protein contained therein, and compositions showed an immobilization rate of about 90% for the antibody.

Tabela 1: Taxa de imobilização de composiçoes de sol para substâncias alvo a serem imobilizadasTable 1: Rate of immobilization of sol compositions for target substances to be immobilized

Taxa de imobilização (%) Molécula pequena Proteína Anticorpo Composições de sol para molécula pequena (2) 75,5 50,5 43,2 Composições de sol para proteína (7) 21,1 82,7 74, 5 Composições de sol para anticorpo (8) 1,2 10,3 88,9 21 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ(2) 75.5 50.5 43.2 Sun compositions for protein (7) 21.1 82.7 74.5 Sun compositions for antibody (2) (8) 1.2 10.3 88.9 21 ΕΡ 1 982 184 / ΡΤ

Análise de superfície A superfície dos pontos foi observada utilizando SEM (S-4800 SEM, Hitachi Co. ) . O revestimento condutor para observação de SEM foi realizado utilizando um equipamento de revestimento por pulverização (sputter coater) de feixe de iões com um alvo de irídio (cerca de 20 nm de espessura) , e depois os pontos foram completamente gelifiçados. O tamanho dos poros foi medido utilizando um programa de software de análise de imagem (Image-Pro Plus, MediaCybernetics). Mediu-se o número de poros em 9 áreas diferentes (576 nm χ 430 nm) , e calculou-se a densidade média de poros como [Σ área de poros]/[área total (576 nm χ 430 nm)].Surface analysis The surface of the dots was observed using SEM (S-4800 SEM, Hitachi Co.). The conductive coating for SEM observation was performed using an ion beam sputter coater with an iridium target (about 20 nm thick), and then the spots were completely gelled. Pore size was measured using an image analysis software program (Image-Pro Plus, MediaCybernetics). The number of pores in 9 different areas (576 nm χ 430 nm) was measured, and the mean pore density was calculated as [Σ pore area] / [total area (576 nm χ 430 nm)].

Análise interna de pontos em soluçãoInternal analysis of points in solution

As imagens internas de pontos foram medidas em ar utilizando TappingModeTM AFM (MultiMode SPM, Nanoscope Illa, Vecco Instrument). Os pontos foram seccionados utilizando um micrótomo vertical.The internal dot images were measured in air using TappingMode ™ AFM (MultiMode SPM, Nanoscope III, Vecco Instrument). The points were sectioned using a vertical microtome.

Análise do perfil de varrimento de pontoAnalysis of the dot-scan profile

As imagens de ponto foram medidas através de uma forma de reflexão padrão utilizando um microscópio de varrimento de laser confocal (LSM 5 pascal, Cari Zeiss Inc.) . O perfil de varrimento para o centro dos pontos foi medido para ter uma espessura inferior a 63 pm e um diâmetro inferior a 380 pm.Spot images were measured by a standard reflection form using a confocal laser scanning microscope (LSM 5 Pascal, Cari Zeiss Inc.). The scanning profile for the center of the dots was measured to have a thickness of less than 63 Âμm and a diameter of less than 380 Âμm.

Para medir a distribuição da proteína e do anticorpo nos pontos após análise imunológica, a imagem de tomografia vertical dos pontos internos foi fotografada com CLSM (LSM 5 pascal, Cari Zeiss Inc.) . A resolução mais elevada do eixo dos z utilizando um motor passo a passo foi 50 nm, e as resoluções mais elevadas do eixo dos x e do eixo dos y utilizando um módulo de varrimento foram xl00 e x40, respectivamente. Para fotografar imagens de CLSM, micropontos contendo uma proteína p24 foram primeiro integrados sobre uma lâmina de vidro, deixou-se a lâmina possuindo os pontos contendo proteína p24 aí integrados 22 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ reagir com ο anticorpo de p24 durante 1 hora, e depois lavou-se intensamente. Depois, deixou-se a lâmina reagir com um anticorpo secundário marcado com Cy3 durante 20 minutos, lavou-se e secou-se e fotografaram-se as suas imagens de CLSM.To measure the protein and antibody distribution at points after immunological analysis, the vertical tomography image of the internal spots was photographed with CLSM (LSM 5 pascal, Cari Zeiss Inc.). The highest resolution of the z-axis using a stepper motor was 50 nm, and the highest x-axis and y-axis resolutions using a scanning module were x100 and x40, respectively. To photograph CLSM images, micropoints containing a p24 protein were first integrated onto a glass slide, the slide having the p24 protein-containing points integrated therein was allowed to react with the p24 antibody for 1 hour, and then washed thoroughly. The slide was then allowed to react with a Cy3-labeled secondary antibody for 20 minutes, washed, and dried and its CLSM images were photographed.

Medição da especificidade entre marcador e substância alvo e sua actividadeMeasurement of the specificity between marker and target substance and its activity

Para medir a especificidade e actividade da interacção proteína-proteína sobre um substrato sol-gel, uma proteína p24 como proteína de antigénio de HIV foi misturada com a composição de sol IV da Tabela 2 abaixo e imobilizada. Realizou-se a análise imunológica com diluições em série de soro contendo um anticorpo de HIV correspondendo à proteína p24. Ao mesmo tempo, para confirmar a adsorção não específica do anticorpo de HIV, uma proteína BSA foi imobilizada sobre o mesmo chip no substrato de sol-gel. A interacção não específica, que ocorre após a reacção de uma proteína (4-1BB) não possuindo qualquer relação com os pontos, de uma composição de sol não contendo qualquer proteína era muito baixa. No entanto, com os anticorpos de BSA ou 4-1BB contra BSA ou antigénio 4-1BB, a interacção específica foi evidente nos pontos exactos. A Tabela 2 mostra as propriedades de 7 composições de sol para imobilização de proteínas, rastreadas pelo presente invento. Na Tabela 2, a composição 0 é uma composição comparativa consistindo apenas de TMOS e MTMS.To measure the specificity and activity of the protein-protein interaction on a sol-gel substrate, a p24 protein as the HIV antigen protein was mixed with the sol IV composition of Table 2 below and immobilized. Immunological analysis was performed with serial dilutions of serum containing an HIV antibody corresponding to the p24 protein. At the same time, to confirm non-specific adsorption of the HIV antibody, a BSA protein was immobilized on the same chip on the sol-gel substrate. The non-specific interaction, which occurs after the reaction of a protein (4-1BB) having no relation to the dots, of a sol composition containing no protein was very low. However, with antibodies to BSA or 4-1BB against BSA or 4-1BB antigen, the specific interaction was evident at the exact points. Table 2 shows the properties of sol protein immobilization compositions screened by the present invention. In Table 2, composition 0 is a comparative composition consisting only of TMOS and MTMS.

Entre as referidas 7 composições para imobilização de proteínas, as composições IV mostraram os melhores resultados no que se refere aos sinais e à relação sinal/fundo. A composição IV tinha uma proporção de TMOS baixa em comparação com as outras composições, continha PEG de peso molecular elevado, e evidenciava uma densidade de poros elevada e um baixo teor de anticorpos não específicos. 23 ΕΡ 1 982 184/ΡΤAmong the said compositions for protein immobilization, the IV compositions showed the best results with respect to the signals and signal to background ratio. Composition IV had a low TMOS ratio compared to the other compositions, contained high molecular weight PEG, and showed high pore density and low nonspecific antibody content. 23 ΕΡ 1 982 184 / ΡΤ

Tabela 2: Análise de propriedades de composiçoes para imobilização de proteínasTable 2: Analysis of properties of compositions for protein immobilization

Composições de sol Composição Actividade Propriedades de poro do ponto Capacidade de adsorção dimensão (nm) densidade 0 25,5% TMOS, 12,5% MTMS 1,1475 12,4 0,07 1993,33 I 17,5% TMOS, 12,5% MTMS, 4% PGS 3,45084 21,9 0,188 578,29 II 20,5% TMOS, 10,5% MTMS, 5% PEOU 6,35116 21,3 0, 102 304,06 III 25,5% TMOS, 12,5% MTMS, 3% PEG400 18,8969 27, 8 0,349 265,66 IV 25,5% TMOS, 12,5% MTMS, 5% PEG8000 37,43029 21,5 0,259 14, 69 V 25,5% TMOS, 12,5% MTMS, 2,5% glicerol 16,58053 21,9 0,139 77, 24 VI 25,0% TMOS, 7,5% MTMS, 5% GPTMOS 3,45084 17, 6 0,053 517,62 VII 10% MTMS 5,3421 20,4 0,119 99,64Compositions of activity Composition Activity Point pore properties Adsorption capacity dimension (nm) density 0 25.5% TMOS, 12.5% MTMS 1.1475 12.4 0.07 1993.33 I 17.5% TMOS, 12 , 5% MTMS, 4% PGS 3.45084 21.9 0.188 578.29 II 20.5% TMOS, 10.5% MTMS, 5% PEOU 6.35116 21.3 0, 102 304.06 III 25.5 % TMOS, 12.5% MTMS, 3% PEG400 18.8969 27.8 0.349 265.66 IV 25.5% TMOS, 12.5% MTMS, 5% PEG8000 37.43029 21.5 0.259 14.69 V 25 , 5% TMOS, 12.5% MTMS, 2.5% glycerol 16.58053 21.9 0.139 77.24 VI 25.0% TMOS, 7.5% MTMS, 5% GPTMOS 3.45084 17.6 0.053 517 , 62 VII 10% MTMS 5.3421 20.4 0.119 99.64

Exemplo 2: Diagnóstico imunológico enzimático de doenças através da imobilização de pontos de proteínas no chip de sol-gel imobilizados sobre placa de 96 poçosExample 2: Enzymatic immunological diagnosis of diseases by immobilizing protein spots on the sol-gel chip immobilized on a 96-well plate

Neste Exemplo, as composições de sol seleccionadas noIn this Example, the selected sol compositions in the

Exemplo 1 foram medidas utilizando um processo de diagnóstico de ELISA automatizado que é correntemente utilizado para diagnóstico da hepatite. 0 processo de diagnóstico automatizado compreendeu um processo de lavagem intensa e assim, entre as composições rastreadas, foi utilizada uma composição na qual os pontos mostravam uma forte adesão e podiam manter a sua forma circular característica mesmo após lavagem. A composição de sol utilizada neste Exemplo estava optimizada tal que os pontos 24 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ formados se mantinham mesmo após raspagem utilizando um dispositivo Abbott Axsym e um dispositivo Roche Elecsys.Example 1 were measured using an automated ELISA diagnostic process which is currently used for hepatitis diagnosis. The automated diagnostic process comprised an intensive washing process and thus, among the screened compositions, a composition was used in which the spots showed strong adhesion and could maintain their characteristic circular shape even after washing. The sol composition used in this Example was optimized such that the formed spots were maintained even after scraping using an Abbott Axsym device and a Roche Elecsys device.

Neste Exemplo, quando o material de uma placa de 96 poços para a composição seleccionada através deste processo era PMMA tratado por plasma, uma mistura da composição de sol para imobilização e uma solução de proteína consistiram de 17,5-25 partes em peso de TMOS, 5-15 partes em peso de MTMS, 2,5-15 partes em peso de GPTMOS, 12,5 partes em peso de HC1 10 mM, 25 partes em peso de água destilada, 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8) e 12,5 partes em peso de uma solução de proteína.In this Example, when the material of a 96 well plate for the composition selected by this process was plasma treated PMMA, a mixture of the sol composition for immobilization and a protein solution consisted of 17.5-25 parts by weight of TMOS , 5-15 parts by weight of MTMS, 2.5-15 parts by weight of GPTMOS, 12.5 parts by weight of 10 mM HCl, 25 parts by weight of distilled water, 12.5 parts by weight of phosphate buffer 10 mM sodium (pH 5.8) and 12.5 parts by weight of a protein solution.

No caso de composições contendo TMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 17,5-25 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo TMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo MTMS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 5-15 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno, e no caso de composições contendo MTMS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 2,5-15 partes em peso, ocorreram muitas reacções não específicas devido à elevada capacidade de adsorção dos pontos e, no caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi facilmente imobilizada devido um tamanho de poro grande.In the case of compositions containing TMOS in an amount greater than the upper limit in the range of 17.5-25 parts by weight, the immobilization rate of the target substance was low, due to an excessively low pore density and a small pore size and, in the case of compositions containing TMOS in an amount less than the lower limit of said range, the target substance has not been immobilized due to an excessively high pore density and a large pore size. In the case of compositions containing MTMS in an amount greater than the upper limit in the range of 5-15 parts by weight, the immobilization rate of the target substance was low, due to an excessively low pore density and a small pore size, and in the case of compositions containing MTMS in an amount less than the lower limit of said range, the target substance has not been immobilized due to an excessively high pore density and a large pore size. In the case of compositions containing GPTMOS in an amount greater than the upper limit in the range of 2.5-15 parts by weight, many non-specific reactions have occurred because of the high adsorption capacity of the dots and, in the case of compositions containing GPTMOS in a minor amount than the lower limit of said range, the target substance was not readily immobilized because of a large pore size.

Utilizando o antigénio de HIV, proteína p24, como solução de proteína, os pontos de sol-gel foram integrados sobre uma placa de 96 poços. Como resultado, como se mostra na FIG. 4, quatro amostras mostraram uma reacção específica 25 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ pela proteína ρ24 de HIV, indicando que as amostras eram todas HIV positivas. A proteína pôde ser fortemente imobilizada tridimensionalmente sobre a placa de 96 poços fabricada de PMMA tratado por plasma utilizando a mistura de sol-gel, e os resultados de reacções antigénio-anticorpo puderam ser confirmados utilizando o biochip através do dispositivo de diagnóstico automatizado e de um método de ensaio existentes.Using the HIV antigen, p24 protein, as the protein solution, the sol-gel spots were integrated onto a 96-well plate. As a result, as shown in FIG. 4, four samples showed a specific Î »1 982 184 / reacção reaction by the HIV ρ24 protein, indicating that the samples were all HIV positive. The protein could be strongly immobilized three-dimensionally on the 96-well plate made of plasma-treated PMMA using the sol-gel mixture, and the results of antigen-antibody reactions could be confirmed using the biochip through the automated diagnostic device and a existing test method.

Também, uma mistura de uma composição de sol e uma solução de proteína, para imobilização sobre uma placa de 96 poços fabricada de PMMA comercial não tratado por plasma, era composta de 22,5-25 partes em peso de TMOS, 7,5-10 partes em peso de MTMS, 2,5-5 partes em peso de GPTMOS, 12,5 partes em peso de HC1 10 mM, 25 partes em peso de água destilada, 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8), e 12,5 partes em peso de uma solução de proteína.Also, a mixture of a sol composition and a protein solution for immobilization on a 96-well plate made of commercial non-plasma PMMA was composed of 22.5-25 parts by weight TMOS, 7,5- 10 parts by weight of MTMS, 2.5-5 parts by weight of GPTMOS, 12.5 parts by weight of 10 mM HCl, 25 parts by weight of distilled water, 12.5 parts by weight of sodium phosphate buffer 10 mM (pH 5.8), and 12.5 parts by weight of a protein solution.

No caso de composições contendo TMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 22,5-25 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo TMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo MTMS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 7,5-10 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo MTMS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 2,5-5 partes em peso, ocorreram muitas reacções não específicas devido à elevada capacidade de adsorção dos pontos e, no caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi facilmente imobilizada devido um tamanho de poro grande. 26 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ A composição optimizada foi misturada com um antigénio de HCV e integrada sobre uma placa de 96 poços fabricada de PMMA não tratado por plasma, preparando-se assim um biochip. Utilizando o biochip, foi realizado um teste em 79 pacientes (negativos: 25 pessoas, e positivos: 54 pessoas) com o kit EIA de HCV da Roche. A FIG. 5 mostra resultados de análise de sangue para 12 pacientes. Como se pode observar na FIG. 5, os resultados de teste obtidos utilizando o biochip foram completamente consistentes com os resultados de teste obtidos utilizando o método ELISA existente, sugerindo que o biochip do invento tinha uma elevada reprodutibilidade de resultados. 0 biochip de acordo com o presente invento teve um elevado desempenho, elevada sensibilidade, elevado rendimento e elevada exactidão, e pôde realizar medições a um custo baixo, sugerindo que poderia ser utilizado em substituição de métodos de diagnóstico de ELISA existentes. Também, o biochip do invento podia imobilizar a proteína numa quantidade maior do que no método de diagnóstico imunológico existente, pelo que os seus falsos positivos podiam ser reduzidos em comparação com o método de diagnóstico existente, e assim pôde ser realizado um método de diagnóstico da hepatite mais exacto.In the case of compositions containing TMOS in an amount greater than the upper limit in the range of 22.5-25 parts by weight, the immobilization rate of the target substance was low, due to an excessively low pore density and a small pore size and, in the case of compositions containing TMOS in an amount less than the lower limit of said range, the target substance has not been immobilized due to an excessively high pore density and a large pore size. In the case of compositions containing MTMS in an amount greater than the upper limit in the range of 7.5-10 parts by weight, the immobilization rate of the target substance was low, due to an excessively low pore density and a small pore size and, in the case of compositions containing MTMS in an amount less than the lower limit of said range, the target substance has not been immobilized due to an excessively high pore density and a large pore size. In the case of compositions containing GPTMOS in an amount greater than the upper limit in the range of 2.5-5 parts by weight, many non-specific reactions have occurred because of the high adsorption capacity of the dots and, in the case of compositions containing GPTMOS in a minor amount than the lower limit of said range, the target substance was not readily immobilized because of a large pore size. The optimized composition was mixed with an HCV antigen and integrated onto a 96-well plate made of plasma untreated PMMA, thereby preparing a biochip. Using the biochip, a test was performed on 79 patients (negative: 25 people, and positive: 54 people) with the Roche HCV EIA kit. FIG. 5 shows blood analysis results for 12 patients. As can be seen in FIG. 5, the test results obtained using the biochip were completely consistent with the test results obtained using the existing ELISA method, suggesting that the biochip of the invention had a high reproducibility of results. The biochip according to the present invention had a high performance, high sensitivity, high throughput and high accuracy, and was able to perform measurements at a low cost, suggesting that it could be used in place of existing ELISA diagnostic methods. Also, the biochip of the invention could immobilize the protein in a greater amount than in the existing immunological diagnostic method, whereby its false positives could be reduced compared to the existing diagnostic method, and thus a diagnostic method of diagnosis could be performed. more accurate hepatitis.

Também, de modo a examinar se a análise quantitativa podia ser realizada utilizando o biochip do invento, foram realizados testes sobre limites de detecção e intervalos de quantificação através de diluições em série de amostras de paciente (FIG. 6). Como resultado, foi apresentada uma distribuição quantitativa. A partir dos resultados de teste, pôde-se observar que, quando se utilizou o biochip de acordo com o presente invento, pôde também ser realizada a análise quantitativa, que não podia ser realizada em métodos existentes de diagnóstico imunológico.Also, in order to examine whether quantitative analysis could be performed using the biochip of the invention, tests on detection limits and quantitation intervals were performed by serial dilutions of patient samples (FIG 6). As a result, a quantitative distribution was presented. From the test results, it could be seen that when using the biochip according to the present invention, quantitative analysis could also be performed, which could not be performed in existing methods of immunological diagnosis.

Exemplo 3: Fabricação e análise de um biochip utilizando substrato de chip de ouroExample 3: Manufacture and analysis of a biochip using gold chip substrate

Neste Exemplo, uma composição de sol para imobilização sobre um substrato de chip de ouro foi seleccionada de acordo com o mesmo método como no Exemplo 1 utilizando um chip de ouro (Au) utilizado num sistema SPRi. No caso do 27 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ chip de ouro, adicionaram-se adesivos (1010 e 1020; LG Chemical Co., Ltd., Coreia) como aditivos à composição de sol para imobilização. Após formação de pontos a mistura de sol foi modificada numa substância, que era transparente como o vidro e tinha poros, mas a mistura de sol não foi imobilizada sobre o chip de ouro, cuja superfície estava revestida com Au. Neste Exemplo, de modo a imobilizar pontos de sol sobre a superfície de chip de ouro, foram utilizados aditivos, e a composição da mistura de sol utilizada era composta de 16,2-18,7 partes em peso de TMOS, 3,7-6,2 partes em peso de MTMS, 13,7-16,2 partes em peso de GPTMOS, 0,01-20 partes em peso de adesivos (1010, 1020, etc.), 12,5 partes em peso de HC1 10 mM, 23,7-24,5 partes em peso de água destilada, 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8), e 12,5 partes em peso de uma solução de proteína.In this Example, a sol composition for immobilization on a gold chip substrate was selected according to the same method as in Example 1 using a gold (Au) chip used in an SPRi system. In the case of the 27 Ρ 1 982 184 / ΡΤ gold chip, adhesives (1010 and 1020; LG Chemical Co., Ltd., Korea) were added as additives to the sol composition for immobilization. After spotting the sol mixture was modified on a substance, which was transparent as glass and had pores, but the sol mixture was not immobilized on the gold chip, the surface of which was Au coated. In this Example, in order to immobilize sun spots on the gold chip surface, additives were used, and the composition of the sol mixture used was composed of 16.2-18.7 parts by weight of TMOS, 3,7- 6.2 parts by weight of MTMS, 13.7-16.2 parts by weight of GPTMOS, 0.01-20 parts by weight of adhesives (1010, 1020, etc.), 12.5 parts by weight of HCl 10 mM, 23.7-24.5 parts by weight of distilled water, 12.5 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8), and 12.5 parts by weight of a protein solution.

No caso de composições contendo TMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 16,2-18,7 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo TMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo MTMS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 3,7-6,2 partes em peso, a taxa de imobilização da substância alvo foi baixa, devido a uma densidade de poros excessivamente baixa e um tamanho de poro pequeno e, no caso de composições contendo MTMS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi imobilizada devido a uma densidade de poros excessivamente elevada e um tamanho de poro grande. No caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade maior do que o limite superior do intervalo de 13,7-16,2 partes em peso, ocorreram muitas reacções não especificas devido à elevada capacidade de adsorção dos pontos e, no caso de composições contendo GPTMOS numa quantidade menor do que o limite inferior do referido intervalo, a substância alvo não foi facilmente imobilizada devido um tamanho de poro grande. 28 ΕΡ 1 982 184/ΡΤ A mistura foi aplicada por pontos sobre o chip de ouro do mesmo modo como nos Exemplos 2 e 3, e depois ensaiada para uma proteina p24. A diferença do ensaio do chip de ouro em relação ao ensaio do biochip imobilizado sobre a placa de 96 poços era que foi realizada uma reacção de anticorpo primário e os resultados podiam ser detectados sem uma reacção secundária com marcação por fluorescência. Os resultados do chip de ouro submetido à reacção primária podiam ser lidos por medição e visualização de uma alteração de ressonância que ocorre durante a reacção, utilizando o sistema SPR (FIG. 7) . 0 chip de ouro podia imobilizar uma qrande quantidade de proteina e detectar directamente a ligação proteína-proteína sem marcação química, e assim tinha uma sensibilidade elevada.In the case of compositions containing TMOS in an amount greater than the upper limit in the range of 16.2-18.7 parts by weight, the immobilization rate of the target substance was low, due to an excessively low pore density and a size of pore size and, in the case of TMOS-containing compositions in an amount less than the lower limit of said range, the target substance was not immobilized due to an excessively high pore density and a large pore size. In the case of compositions containing MTMS in an amount greater than the upper limit in the range of 3.7-6.2 parts by weight, the immobilization rate of the target substance was low, due to an excessively low pore density and a size of and in the case of compositions containing MTMS in an amount less than the lower limit of said range, the target substance has not been immobilized due to an excessively high pore density and a large pore size. In the case of compositions containing GPTMOS in an amount greater than the upper limit in the range of 13.7-16.2 parts by weight, many non-specific reactions occurred because of the high adsorption capacity of the dots and, in the case of compositions containing GPTMOS in a amount less than the lower limit of said range, the target substance was not readily immobilized due to a large pore size. The mixture was spotted onto the gold chip in the same manner as in Examples 2 and 3, and then assayed for a p24 protein. The difference from the gold chip assay relative to the immobilized biochip assay on the 96 well plate was that a primary antibody reaction was performed and the results could be detected without a secondary reaction with fluorescence labeling. The results of the gold chip subjected to the primary reaction could be read by measuring and displaying a resonance change occurring during the reaction using the SPR system (Figure 7). The gold chip could immobilize a large amount of protein and directly detect protein-protein binding without chemical labeling, and thus had a high sensitivity.

Exemplo 4: Imobilização e detecção electroquímica de pontos sobre um chip de semiconductorExample 4: Immobilization and electrochemical spotting on a semiconductor chip

Este Exemplo refere-se a um sistema no qual uma mistura condutora de sol foi imobilizada sobre o eléctrodo positivo de um chip de semicondutor para utilização em medições electroquímicas, e a diferença em resistência eléctrica antes e após uma reacção ocorrendo entre os mesmos foi medida para monitorizar a reacção. Uma superfície de metal utilizada neste Exemplo era uma bolacha de silicio muito frequentemente utilizada em eléctrodos, mas era difícil na especialidade anterior fixar uma substância polimérica à bolacha de silício sem tratamento de superfície, porque a sua superfície era muito uniforme e lisa. Contudo, neste Exemplo, uma composição de sol para imobilização sobre eléctrodos foi rastreada de acordo com o método do Exemplo 1 e misturada com proteina p24, e a mistura foi imobilizada sobre uma bolacha de semiconductor. A composição de sol para chips de semicondutor, utilizada neste Exemplo, era composta de 5-30 partes em peso de TMOS, 2-35 partes em peso de MTMS, 1-15 partes em peso de GPTMOS, 0,01-20 partes em peso de adesivos, 12,5 partes em peso de HC1 10 mM, 23,7-24,5 partes em peso de água destilada, 12,5 partes em peso de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 5,8), e 12,5 partes em peso de uma solução de sonda. 29 ΕΡ 1 982 184/ΡΤThis Example relates to a system in which a conductive mixture of sol was immobilized on the positive electrode of a semiconductor chip for use in electrochemical measurements, and the difference in electrical resistance before and after a reaction occurring between them was measured for monitor the reaction. A metal surface used in this Example was a silicon wafer very often used in electrodes, but it was difficult in the prior art to attach a polymeric substance to the silicon wafer without surface treatment, because its surface was very uniform and smooth. However, in this Example, a sol electrode immobilization composition was screened according to the method of Example 1 and mixed with p24 protein, and the blend was immobilized on a semiconductor wafer. The sol composition for semiconductor chips, used in this Example, was composed of 5-30 parts by weight TMOS, 2-35 parts by weight MTMS, 1-15 parts by weight GPTMOS, 0.01-20 parts by weight weight of adhesives, 12.5 parts by weight of 10 mM HCl, 23.7-24.5 parts by weight of distilled water, 12.5 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8), and 12.5 parts by weight of a probe solution. 29 ΕΡ 1 982 184 / ΡΤ

Utilizando ο chip de semicondutor sobre o qual a composição de sol e a proteina p24 foram imobilizados, mediu-se a diferença em resistência eléctrica antes e depois de uma reacção, de acordo com um método de medição electroquimico, e os resultados da medição são apresentados na FIG. 8. Como se mostra na FIG. 8, a sensibilidade foi significativamente aumentada, e a razão de ruído de fundo pôde ser reduzida. Assim, o chip de semicondutor chip de acordo com este Exemplo é barato e, ao mesmo tempo, é útil para a fabricação de sistemas de análise de biochip de pequena dimensão.Using the semiconductor chip on which the sol composition and the p24 protein were immobilized, the difference in electrical resistance before and after a reaction was measured according to an electrochemical method of measurement and the results of the measurement are given in FIG. 8. As shown in FIG. 8, the sensitivity was significantly increased, and the background noise ratio could be reduced. Thus, the semiconductor chip chip according to this Example is inexpensive and at the same time useful for the manufacture of small-scale biochip analysis systems.

APLICABILIDADE INDUSTRIALINDUSTRIAL APPLICABILITY

Como descrito acima em detalhe, o presente invento proporciona um método para rastreio de uma composição de sol para biochips de sol-gel, que é utilizado para imobilizar uma sonda sobre um substrato de superfície não tratada. Também, o presente invento proporciona a utilização de uma composição de sol para substratos de PMMA, substratos de chip de ouro e substratos de bolacha de silício, rastreada pelo referido método, e um biochip de sol-gel preparado utilizando a referida composição de sol. 0 biochip de acordo com o presente invento é conveniente e económico, porque pode utilizar sistemas de reacção e sistemas de análise existentes por imobilização de pontos do tipo gel contendo biomateriais directamente sobre placas de 96 poços, que são amplamente utilizadas em bioensaios. Também o biochip pode proporcionar bons resultados de análise, porque ocorre menos modificação dos biomateriais imobilizados sobre o biochip. Em particular, quando o biochip é utilizado num método de análise sem uma sonda, para além da análise de fluorescência, o problema de sensibilidade que ocorre no método de análise anterior pode ser solucionado ligando fortemente pontos de sol-gel tridimensionais, e assim é de esperar que o biochip seja útil para o desenvolvimento de produtos, incluindo POCT.As described above in detail, the present invention provides a method for screening a sol composition for sol-gel biochips, which is used to immobilize a probe on an untreated surface substrate. Also, the present invention provides the use of a sol composition for PMMA substrates, gold chip substrates and silicon wafer substrates, screened by said method, and a sol-gel biochip prepared using said sol composition. The biochip according to the present invention is convenient and inexpensive because it can utilize existing gel-type dot-like reaction systems and analytical systems containing biomaterials directly onto 96-well plates which are widely used in bioassays. Also the biochip can provide good analysis results, because less modification of the biomaterials immobilized on the biochip occurs. In particular, when the biochip is used in a method of analysis without a probe, in addition to fluorescence analysis, the sensitivity problem occurring in the above analysis method can be solved by strongly binding three-dimensional sol-gel spots, and thus is expect the biochip to be useful for product development, including POCT.

Lisboa, 2014-06-23Lisbon, 2014-06-23

Claims

A method of screening a sol-gel sol-gel composition which is used to immobilize a probe on a substrate that is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent (a) obtaining a first library of sol compositions wherein at least one silicate monomer selected from the group consisting of tetramethylorthosilicate (TMOS), methyltrimethoxysilane (MTMOS), tetraethylorthosilicate (TEOS) , trimethoxysilane (TMS), methyltrimethoxysilicate (MTMS) and 3-aminopropyltrimethoxysilicate (3-ATMS), and at least one additive selected from the group consisting of polyglycerylsilicate (PGS), diglycerylsilane (DGS), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane ( GPTMOS), (N-triethoxysilylpropyl) -O-poly (ethylene oxide) -urethane (PEOU), glycerol and polyethylene glycol (PEG) having a molecular weight of 100-10000, are mixed together in buffer in various proportions; (b) forming points of the first library of sun compositions on a target substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent; (c) measuring the adhesion, appearance, transmittance and gelation time of the points formed in step (b) and, based on the results of the measurements, selecting the compositions which do not show peeling even when scraped with a post-wash tip , have a dot diameter of 100-800Âμ while maintaining a circular shape, show an autofluorescence lower than the background fluorescence, and have a gel time of 4-48 hours in a tube and a gel time of 1-4 hours at the points on the substrate, thereby obtaining a second library of sol compositions; (D) adding a probe to the second library of sol compositions and forming points of the second probe containing library on a substrate that is not coated with a high molecular weight synthetic coating agent dissolved in a solvent organic; and (e) measuring the rate of immobilization of the probe points, and the specificity between the probe and a target substance and, based on the measurement results, selecting a sol composition where the probe immobilization rate is at least 70 % and the ratio of specific signals / non-specific signals of the probe and the target substance is at least 3.

A method for screening a sol composition for sol-gel biochips according to claim 1, wherein the probe is any one selected from the group consisting of proteins, oligopeptides, nucleic acids, low molecular weight substances, microorganisms, fungi and herbal materials.

A method for screening a sol composition for sol-gel biochips according to claim 1, wherein the substrate is any one selected from the group consisting of polymer plates, metals, silicon wafers, glass and LCD.

Use of a sol composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition used to immobilize a probe on a PMMA substrate that is not coated with a high molecular weight synthetic coating agent dissolved in an organic solvent comprises : 17.5-25 parts by weight of TMOS; 5-15 parts by weight of MTMS; 2.5- 15 parts by weight of GPTMOS; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 25 parts by weight of distilled water; 11-13 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 10-15 parts by weight of a probe solution. ΕΡ 1 982 184 / ΡΤ 3/5

Use of the sol composition for sol-gel biochips according to claim 4, wherein said probe is a protein.

A sol-gel biochip in which the sol composition used in one of claims 4 or 5 is immobilized on a PMMA substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent.

Use of a sol composition for sol-gel biochips by which the sol composition is used to immobilize a probe on a PMMA substrate which is not coated with a high molecular weight synthetic coating agent dissolved in an organic solvent and comprises: 22.5-25 parts by weight of TMOS; 7.5- 10 parts by weight of MTMS; 2.5- 5 parts by weight of GPTMOS; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 25 parts by weight of distilled water; 11-13 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 10-15 parts by weight of a probe solution.

Use of the sol composition for sol-gel biochips according to claim 7, wherein said probe is a protein.

Use of the sol composition for sol-gel biochips according to claim 8, wherein said protein is HCV antigen.

Sol-gel biochip in which the sol composition used in one of claims 7 or 8 is immobilized on a PMMA substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent.

A sol-gel biochip according to claim 10, wherein said substrate is a 96-well plate. ΕΡ 1 982 184 / ΡΤ 4/5

Use of a sol gel composition for sol-gel biochips wherein the sol composition used to immobilize a probe on a gold substrate which is not coated with a high molecular weight synthetic coating agent dissolved in an organic solvent, comprises: 16.2-18.7 parts by weight of TMOS; 3.7- 6.2 parts by weight of MTMS; 13.7 - 16.2 parts by weight of GPTMOS; 0.01-20 parts by weight of an adhesive; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 23.7- 24.5 parts by weight of distilled water; 11-13 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 10-15 parts by weight of a probe solution.

Use of the sol composition for sol-gel biochips according to claim 12, wherein said adhesive is 1010 and / or 1020.

The use of the sol composition for sol-gel biochips according to claim 12, wherein said probe is a protein.

Sol-gel biochip in which the sol composition used according to any one of claims 12-14 is immobilized on a gold substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent.

Use of a sol composition for sol-gel biochips, whereby the sol composition used to immobilize a probe on a silicon substrate that is not coated with a high molecular weight synthetic coating agent dissolved in an organic solvent comprises : 5-30 parts by weight of TMOS; 2-35 parts by weight of MTMS; 1-15 parts by weight of GPTMOS; 0.01-20 parts by weight of an adhesive; 12.5 parts by weight of 10 mM HCl; 23.7- 24.5 parts by weight of distilled water; Î »1 982 184 / ΡΤ 5/5 12.5 parts by weight of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8); and 12.5 parts by weight of a probe solution.

Use of the sol composition for sol-gel biochips according to claim 16, wherein said probe is a protein.

A sol-gel biochip in which the sol composition used in one of claims 16 or 17 is immobilized on a silicon substrate which is not coated with a synthetic high molecular weight coating agent dissolved in an organic solvent. Lisbon, 2014-06-23