PT1888766E - Detecção de cianobactérias hepatotóxicas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DETECÇÃO DE CIANOBACTÉRIAS HEPATOTÓXICAS

Campo Técnico A presente invenção refere-se a métodos e kits para a detecção de cianobactérias tóxicas, em particular de cianobactérias produzindo hepatotoxina.

Antecedentes da Invenção

As cianobactérias, também conhecidas como algas azuis-verdes, são bactérias fotossintéticas disseminadas em ambientes marinhos e de água doce a nível mundial. São de particular importância para a qualidade da água e saúde humana e animal as cianobactérias que produzem compostos tóxicos. Uma gama diversificada de géneros de cianobactérias é bem conhecida por formar eflorescências de algas azuis-verdes tóxicas em superfícies de água (ver, por exemplo, Codd et al., 1999; Carmichael, 2001). Muitas destas eflorescências são nocivas para humanos e animais, devido à produção de hepatotoxinas e neurotoxinas pelos organismos formando eflorescências e à capacidade de as eflorescências florescerem e expandirem em águas costeiras, cursos de água, lagos e em reservatórios de água potável e recreativos. Há uma necessidade de métodos rápidos para a detecção exacta de cianobactérias tóxicas, para possibilitar uma avaliação do potencial perigo para a saúde das eflorescências cianobacterianas e para permitir a implementação de estratégias eficazes de gestão da água para minimizar os efeitos de surtos de eflorescências tóxicas. 1

Duas hepatotoxinas de preocupação particular são a microcistina e nodularina. Ambas as toxinas são inibidores de proteínas fosfatases 1 e 2A de tipo eucariótico e nos vertebrados a toxicidade é mediada via transporte das toxinas para hepatócitos. A exposição aguda a qualquer das toxinas pode conduzir a falência hepática e morte em animais, incluindo humanos. Além disso, a exposição subcrónica a microcistina e nodularina está associada a promoção tumoral e, no caso da nodularina, iniciação tumoral (Hitzfeld et al., 2000). A microcistina e nodularina são péptidos ciclicos sintetizados não ribossomicamente por grandes complexos multienzimáticos consistindo em diferentes módulos, incluindo péptido sintetases não ribossómicas (NRPS) e policétido sintases (PKS) (Tillett et al., 2000; Moffitt e Neilan, 2001). Estes módulos catalisam a activação, modificação e condensação de aminoácidos específicos. As microcistinas formam uma grande familia de heptapéptidos cíclicos, de fórmula geral ciclo-(D-alanina-X-D-MeAsp-Z-Adda-D-glutamato-Mdha), onde D-MeAsp é ácido Ό-β-eritro-metil-aspártatico, Mdha é N-metildesidroalanina e X e Z são aminoácidos L variáveis. A nodularina é um pentapéptido cíclico, de fórmula geral ciclo-(D-MeAsp-L-arginina-Adda-D-glutamato-Mdhb), onde Mdhb é ácido 2-(metilamino)-2-desidrobutirico. A porção de microcistina e nodularina mais invulgar é Adda (ácido 3-amino-9-metoxi-2,3,8-trimetil-10-fenil-4,6-decadienióco).

As espécies produzindo microcistina produzem habitualmente um cocktail de diferentes variantes de microcistina, contudo apenas um tipo será sintetizado de modo predominante (Mikalsen et al., 2001) . Até à data, foram identificados apenas alguns variantes de nodularina. 2

Até à data, tem havido referências da produção de microcistina por espécies cianobacterianas das quatro ordens Chroococcales, Nostocales, Oscillatoriales e Stignonematales, incluindo Microcystis sp., Chroococcus dispersus (Chroococcales), Anahaena sp., Nostoc sp., Anaheanopsis sp, (Nostocales), Haphalosiphon, Phormidium sp., Planktothrix sp. e Oscillatoria sp. Contudo, os genes para a produção de nodularina foram apenas referidos em N. spumigena e uma estirpe de N. harveyana (Moffitt e Neilan, 2001).

Devido a esta ampla distribuição da produção de hepatotoxina e diferenças de sequências em géneros cianobacterianos, há uma ausência de protocolos moleculares fiáveis que possibilitem a detecção de todas as espécies cianobacterianas potencialmente produzindo hepatotoxina. A maior parte dos métodos de detecção baseados em PCR são apenas baseados na amplificação de sequências génicas de microcistina ou nodularina sintetase de um género ou uma espécie (por exemplo, Neilan, 1996; Moffitt et al., 2001; Tillet et al., 2000; Christiansen et al., 2003; Vaitomaa et al., 2003; Kurmayer et al., 2003, 2004) . Os protocolos baseados em mais de um conjunto de dados apenas visam as espécies formando eflorescências produzindo microcistina mais comuns Microcystis, Planktothrix e Anahaena (Hishergues et al., 2003). A detecção molecular de outras espécies produzindo microcistina, tais como Anahaenopsis, Phormidium e Nostoc, não foram anteriormente abordadas. O documento W02004/104211 divulga um método para a detecção de cianobactérias tóxicas, pela detecção de uma região do gene mcyE, de um modo preferido, a região responsável pela adição de Adda e D-glutamato ao produto de sintese imaturo de microcistina. 3

Ouahid et al. (2005), Environ. Toxicol. 20(3):235-242, divulga um método para a detecção de cianobactérias produzindo microcistina, compreendendo a amplificação de um segmento do gene mcyE.

Consequentemente, há uma clara necessidade para o desenvolvimento de um sistema de detecção simples para a identificação de múltiplas espécies e géneros cianobacterianos produzindo hepatotoxina. A presente requerente desenvolveu, agora, um método molecular que possibilita a detecção de todas as espécies potencialmente produzindo microcistina e nodularina conhecidas com uma única reacção de PCR.

Sumário da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é proporcionado um método para a detecção de cianobactérias produzindo microcistina e cianobactérias produzindo nodularina, compreendendo o método as etapas de: (a) obtenção de uma amostra cianobacteriana; e (b) análise da amostra para a presença de sequências do dominio de aminotransferase associado a hepatotoxina (AMT), em que o referido dominio de AMT está localizado nas fases de leitura aberta de mcyE e ndaF e a presença das sequências do dominio de aminotransferase AMT associado a hepatotoxina é indicativa das referidas cianobactérias produzindo microcistina e cianobactérias produzindo nodularina. 4

As sequências do domínio de aminotransferase associado a hepatotoxina podem ser derivadas da fase de leitura aberta de mcyE do complexo génico de microcistina sintetase ou um seu ortólogo ou homólogo e/ou a fase de leitura aberta de ndaF do complexo génico de nodularina sintetase ou um seu ortólogo ou homólogo. A etapa (b) de análise pode compreender: (i) amplificação de ADN da amostra utilizando iniciadores adequados; e (ii) detecção de sequências amplificadas.

Os iniciadores podem ser iniciadores oligonucleotídicos compreendendo as sequências nucleotídicas como expostas em qualquer das SEQ ID N°: 1 a 4. Numa forma de realização, a amplificação pode ser realizada utilizando o par de iniciadores compreendendo as sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 2. Numa forma de realização, a amplificação pode ser realizada utilizando o par de iniciadores compreendendo as sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 4. Numa forma de realização, a amplificação pode ser realizada utilizando o par de iniciadores compreendendo as sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 3 e 4. A detecção das sequências amplificadas pode compreender electroforese em gel e/ou sequenciação de ácido nucleico.

A amostra cianobacteriana pode compreender um ou mais organismos cianobacterianos isolados ou cultivados ou pode ser uma amostra ambiental contendo um ou mais organismos cianobacterianos. A amostra ambiental pode ser de água salgada ou água doce. A 5 amostra ambiental pode ser uma amostra de água ou uma amostra de uma eflorescência de algas azuis-verdes.

Esta divulgação também se refere a um método para a detecção de cianobactérias produzindo hepatotoxinas, compreendendo o método as etapas de: (a) obtenção de uma amostra cianobacteriana; e (b) análise da amostra para a presença de sequências do domínio de aminotransferase associado a hepatotoxina, em que a presença de sequências do domínio de aminotransferase associado a hepatotoxina é indicativa de cianobactérias produzindo hepatotoxinas. A hepatotoxina pode ser microcistina ou nodularina.

As sequências do domínio de aminotransferase associado a hepatotoxina podem ser derivadas da fase de leitura aberta de mcyE do complexo génico de microcistina sintetase ou um seu ortólogo ou homólogo e/ou a fase de leitura aberta de ndaF do complexo génico de nodularina sintetase ou um seu ortólogo ou homólogo. A etapa (b) de análise pode compreender: (i) amplificação de ADN da amostra utilizando iniciadores adequados; e (ii) detecção de sequências amplificadas.

Os iniciadores podem ser iniciadores oligonucleotídicos compreendendo as sequências nucleotídicas como expostas em 6 qualquer das SEQ ID N°: 1 a 4. Numa forma de realização, a amplificação pode ser realizada utilizando o par de iniciadores compreendendo as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 2. Numa forma de realização, a amplificação pode ser realizada utilizando o par de iniciadores compreendendo as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 4. Numa forma de realização, a amplificação pode ser realizada utilizando o par de iniciadores compreendendo as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 3 e 4. A detecção das sequências amplificadas pode compreender electroforese em gel e/ou sequenciação de ácido nucleico. A amostra cianobacteriana pode compreender um ou mais organismos cianobacterianos isolados ou cultivados ou pode ser uma amostra ambiental contendo um ou mais organismos cianobacterianos. A amostra ambiental pode ser uma amostra de água ou uma amostra de uma eflorescência de algas azuis-verdes.

De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção é proporcionado um kit para a detecção de cianobactérias produzindo microcistina e cianobactérias produzindo nodularina, compreendendo o kit um par de iniciadores concebido para a amplificação por PCR das sequências do dominio de aminotransferase associado a hepatotoxina nos genes ndaF e mcyE.

Os iniciadores podem ser iniciadores oligonucleotidicos compreendendo as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 a 4. Os iniciadores oligonucleotidicos podem compreender as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 2. Os iniciadores oligonucleotidicos podem compreender as sequências nucleotidicas como mostradas nas 7 SEQ ID N°: 1 e 4. Os iniciadores oligonucleotidicos podem compreender as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 3 e 4. A divulgação também se refere a um kit para a detecção de cianobactérias produzindo microcistina, compreendendo o kit, pelo menos, um iniciador concebido para detectar sequências do domínio de aminotransferase associado a hepatotoxina. 0 kit pode compreender múltiplos iniciadores concebidos para amplificar as sequências do domínio de aminotransferase associado a hepatotoxina. Os iniciadores podem ser iniciadores oligonucleotidicos compreendendo as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 a 4. Os iniciadores oligonucleotidicos podem compreender as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 2. Os iniciadores oligonucleotidicos podem compreender as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 4. Os iniciadores oligonucleotidicos podem compreender as sequências nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 3 e 4.

Definições A expressão "sequência do domínio de aminotransferase associado a hepatotoxina", como aqui utilizada, significa uma sequência nucleotídica codificando uma actividade de aminotransferase que funciona na adição de um grupo amino a uma hepatotoxina peptídica cíclica. Tipicamente, a sequência do domínio de aminotransferase é parte de uma fase de leitura aberta (ORF) codificando um complexo multienzimático, funcionando na produção da hepatotoxina, estando a ORF fisicamente localizada no agrupamento génico biossintético de hepatotoxina, como no caso da ORF de mcyE do complexo génico de microcistina sintetase e da ORF de ndaF do complexo génico de nodularina sintetase. Alternativamente, o domínio de aminotransferase pode estar localizado num gene separado codificando uma enzima aminotransferase.

No contexto desta descrição, o termo "compreendendo" significa "incluindo principalmente, mas não necessariamente unicamente". Além disso, variações da palavra "compreendendo", tais como "compreende" e "compreendem", têm significados correspondentemente variados.

Breve Descrição dos Desenhos

As formas de realização da presente invenção serão agora descritas, apenas a título exemplificativo, fazendo referência aos desenhos anexos.

Figura 1. Alinhamento dos iniciadores HEPF e HEPR com a região alvo de aminotransferase das espécies hepatotóxicas caracterizadas Nodularia NSORIO (Moffitt e Neilan, 2004), estirpe 90 de Anabaena (Rouhiainenet al., 2004), M. aeruginosa PCC7806 (Tillett et al., 2000), M. aeruginosa K-139 (Nishizawa et al., 1999) e Plankfothrix NIVA-CYA126/8 (Christiansen et al., 2003).

Figura 2. Posições relativas dos iniciadores HEPF, HEPR, HEPF2 e HEPR2 e tamanhos aproximados (pb) de produtos de PCR.

Figura 3. Produtos de PCR contendo o domínio de AMT utilizando os iniciadores HEPF/HEPR de amostras de 9 azuis-verdes, eflorescência de algas azuis-verdes, separados por electroforese em gel num gel de agarose a 2%: M: escada de ADN de lkb+. Pista 1: controlo positivo (M. aeruginosa PCC7806), pista 2: amostra do Lago Spino (Itália), pista 3: amostra do Lago Alexandria (Austrália), pista 4: amostra do Lago John Oldman Park (Austrália), pista 5: amostra do Rio Swan (Austrália).

Figura 4. Análise filogenética do fragmento de PCR contendo o dominio de AMT de 472 pb. A relação filogenética foi construída utilizando o método de Neighbor-Joining. São mostrados os valores de Bootstrap superiores a 500 (após 1000 eventos de reamostragem de dados). A escala é 0,05 mutações por posição de aminoácido. As amostras de eflorescência são indicadas em negrito. A sequência nucleotídica dos iniciadores oligonucleotídicos HEPF está exposta na SEQ ID N°: 1 e a sequência nucleotídica do iniciador oligonucleotídico HEPR está exposta na SEQ ID N°: 2. A sequência nucleotídica do iniciador oligonucleotídico HEPF2 está exposta na SEQ ID N°: 3. A sequência nucleotídica do iniciador oligonucleotídico HEPR2 está exposta na SEQ ID N°: 4.

Melhor modo de Realização da Invenção A invenção será agora descrita em maior detalhe incluindo, apenas a título de ilustração, com respeito aos exemplos que se seguem.

Como aqui descrito, a presente requerente desenvolveu uma ferramenta molecular possibilitando a identificação bem sucedida 10 de espécies cianobacterianas potencialmente hepatotóxicas e eflorescências de algas azuis-verdes. A ferramenta reside numa única reacção de PCR baseada na presença/ausência de um dominio de aminotransferase (AMT) no agrupamento génico de sintese de hepatoxina. 0 dominio de AMT está localizado entre os módulos de policétido sintase (PKS) e péptido sintetase não ribossómica (NRPS) nas fases de leitura aberta de mcyE e ndaF dos complexos enzimáticos de microcistina e nodularina o sintetase, respectivamente. 0 AMT desempenha um papel critico na biossintese de microcistinas e nodularinas para a transferência de um grupo amino para a porção de Adda (Tillett et al., 2000).

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é proporcionado um método para a detecção de cianobactérias produzindo microcistina e cianobactérias produzindo nodularina, compreendendo o método as etapas de: (a) obtenção de uma amostra cianobacteriana; e (b) análise da amostra para a presença de sequências do dominio de aminotransferase associado a hepatotoxina (AMT), em que o referido dominio de AMT está localizado nas fases de leitura aberta de mcyE e ndaF e a presença das sequências do domínio de aminotransferase AMT associado a hepatotoxina é indicativa das referidas cianobactérias produzindo microcistina e cianobactérias produzindo nodularina. A presente invenção também proporciona kits para a detecção de cianobactérias produzindo microcistina e cianobactérias produzindo nodularina, os kits compreendendo um iniciador concebido para a amplificação por PCR das sequências do dominio 11 de aminotransferase associado a hepatotoxina nos genes ndaF e mcyE.

Como aqui exemplificado, utilizando o método de acordo com uma forma de realização da invenção, as culturas de cianobactérias hepatotóxicas, assim como eflorescências de algas azuis-verdes, das ordens Oscillatoriales, Chroococcales e Nostocales, foram detectadas com êxito. Além disso, os géneros das cianobactérias hepatotóxicas identificadas poderiam ser determinados por análise de sequência, devido à congruência de espécie e evolução de hepatotoxina peptídica em cianobactérias.

Os métodos e kits da presente invenção proporcionam uma ferramenta valiosa para a detecção de isolados cianobacterianos potencialmente tóxicos, por exemplo, desde amostras de água salgada ou água doce possibilitando, desse modo, a avaliação do potencial para que se forme uma eflorescência tóxica, a identificação de eflorescências tóxicas ou uma avaliação do potencial tóxico e, deste modo, o perigo para a saúde colocado por uma eflorescência de algas azuis-verdes. Consequentemente, os métodos e kits da invenção podem formar parte de processos de rotina de monitorização de qualidade da água ou serem utilizados como requerido no caso de um surto de ef lorescência de algas azuis-verdes ou em condições consideradas susceptiveis de suportar ou conducentes a este tipo de surto.

Os especialistas na técnica entenderão que os métodos e kits da presente invenção podem ser utilizados isoladamente ou em conjunto com outros testes disponíveis na identificação de espécies e eflorescências cianobacterianas tóxicas. 12

Será entendido pelos especialistas na técnica que as cianobactérias a que a presente invenção se refere são quaisquer cianobactérias potencialmente hepatotóxicas, sendo aquelas tipicamente capazes da produção de microcistina ou nodularina. Por exemplo, as cianobactérias a que a presente invenção é aplicável podem ser seleccionadas das ordens Oscillatoriales, Chroococcales, Nostocales e Stigonematales. Por exemplo, as cianobactérias podem ser seleccionadas dos géneros Anabaena, Nostoc, Microcystis, Planktothrix, Oscillatoria, Phormidium e Nodularia. Por exemplo, as cianobactérias podem ser seleccionadas das espécies Microcystis aeruginosa, Microcystis viridis, Microcystis wesenbergii, Nodularia harveyana e Nodularia spumigena. Por exemplo, as cianobactérias podem ser seleccionadas de Microcystis aeruginosa PCC7806, Microcystis aeruginosa, Microcystis viridis NIES 102, Microcystis wesenbergii NIES 107, estirpe UTEX 2667 de Microcystis sp., estirpe UTEX 2664 de Microcystis sp., Nodularia harveyana PCC7804, Nodularia spumigena NROS 10, Nodularia spumigena BY1, Nodularia spumigena HEM, estirpe 202A2 de Anabaena sp., estirpe 152 de Nostoc sp., estirpe 18R de Oscillatoria sp., estirpe 195 de Oscillatoria sp., isolado 2-26b de Phormidium sp., isolado l-6c de Phormidium sp. e isolado 4-19b de Phormidium sp.

Os métodos e kits da invenção também podem ser empregues para a descoberta de novas espécies ou géneros hepatotóxicos em colecções de cultura ou de amostras ambientais. Métodos e kits O ADN a ser analisado utilizando os métodos e kits da presente invenção pode ser extraido de células cianobacterianas, em 13 cultura mista ou como isolados individuais de espécie ou género. Consequentemente, as células podem ser cultivadas antes do isolamento de ADN ou, alternativamente, o ADN pode ser extraído directamente de amostras ambientais, tais como amostras de água salgada, amostras de água doce ou eflorescências de algas azuis-verdes. Vários métodos adequados, conhecidos dos especialistas na técnica, podem ser utilizados para a extracção e purificação de ADN para efeitos da presente invenção, por exemplo, como descrito em Neilan (1995) e Neilan et al. (2002) . Os especialistas na técnica entenderão facilmente que a presente invenção não deve estar limitada à utilização dos métodos específicos para isolamento de ADN. De facto, a presente invenção pode ser realizada sem isolamento de ADN antes da análise de ADN.

Tipicamente, de acordo com métodos da invenção, a análise de ADN é efectuada por amplificação por PCR. Os produtos amplificados podem ser ainda analisados por sequenciação de ácido nucleico. A amplificação por PCR pode ser conduzida em ADN extraído de isolados cianobacterianos ou amostras ambientais, como descrito acima ou, alternativamente, as sequências podem ser amplificadas directamente de organismos, sem a necessidade de etapas anteriores de extracção ou purificação de ADN. É conhecida dos especialistas na técnica uma variedade de métodos para PCR directo.

Os métodos e reagentes para utilização em reacções de amplificação por PCR, subsequente resolução de fragmentos e sequenciação de ácido nucleico são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Em cada caso, os protocolos e reagentes adequados dependerão largamente de circunstâncias individuais. A orientação pode ser obtida de uma variedade de 14 fontes, tais como, por exemplo, Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989 e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoe. e Wiley-Intersciences, 1992. Alguém especialista na técnica entenderia facilmente que diversos parâmetros destes processos podem ser alterados, sem afectar a capacidade de alcançar o produto desejado. Por exemplo, no caso de amplificação por PCR, a concentração de sal pode ser variada ou o tempo e/ou temperatura de uma ou mais das etapas de desnaturação, emparelhamento e extensão podem ser variados. De modo semelhante, a quantidade de ADN utilizado num molde também pode ser variada, dependendo da quantidade de ADN disponível ou da quantidade óptima de molde requerido para amplificação eficiente.

Os iniciadores para utilização nos métodos e kits da presente invenção são tipicamente oligonucleótidos de, em geral, 15 a 30 bases em comprimento. Esses iniciadores podem ser preparados por qualquer método adequado incluindo, por exemplo, síntese química directa ou clonagem e restrição de sequências apropriadas. Nem todas as bases no iniciador necessitam reflectir a sequência da molécula molde a que o iniciador se irá hibridar, o iniciador necessita apenas de conter bases complementares suficientes para possibilitar que o iniciador se hibride ao molde. Um iniciador também pode incluir erros-de-emparelhamento de bases numa ou mais posições, sendo bases que não são complementares a bases no molde mas são, antes, concebidas para incorporar alterações no ADN após extensão ou amplificação de base. Um iniciador pode incluir bases adicionais, por exemplo, na forma de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição na extremidade 5', para facilitar a clonagem do ADN amplificado. 15

Como aqui exemplificado, os iniciadores adequados para a amplificação de produtos contendo domínio de AMT para detecção de cianobactérias potencialmente hepatotóxicas podem compreender sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 a 4. Os pares de iniciadores adequados para amplificação por PCR podem compreender sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4. Contudo, os especialistas na técnica entenderão que a presente invenção não está limitada à utilização dos iniciadores específicos exemplificados, mas também podem ser utilizadas sequências iniciadoras alternativas, desde que os iniciadores sejam concebidos apropriadamente, de modo a possibilitar a amplificação das sequências de AMT de cianobactérias hepatotóxicas. Por exemplo, em formas de realização alternativas, as sequências nucleotídicas de um iniciador podem partilhar, pelo menos, 85%, pelo menos, 90% ou, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência como exposta nas SEQ ID N°: 1 a 4. Os especialistas na técnica entenderão que uma ou mais substituições, adições ou deleções de bases da(s) sequência(s) destas sequências podem ser realizadas na geração de uma sequência de, pelo menos, 85%, pelo menos, 90% ou, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade.

Além disso, a localização de iniciadores adequados para a amplificação de sequências de AMT pode ser determinada por factores, como teor de G+C e a capacidade de uma sequência para formar estruturas secundárias não desejadas.

As sequências iniciadoras adequadas podem ser determinadas pelos especialistas na técnica utilizando processos de rotina, sem experimentação indevida. 16

Os métodos de análise adequados do ADN amplificado são bem conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, electroforese em gel que pode ou não ser precedida por digestão com enzimas de restrição e sequenciação de ácido nucleico. A electroforese em gel pode compreender electroforese em gel de agarose ou electroforese em gel de poliacrilamida, técnicas geralmente utilizadas pelos especialistas na técnica para separação de fragmentos de ADN com base no tamanho. A concentração de agarose ou poliacrilamida no gel determina, em grande parte, a capacidade de resolução do gel e a concentração apropriada de agarose ou poliacrilamida irá depender, por conseguinte, do tamanho dos fragmentos de ADN a serem distinguidos.

Os kits para utilização na detecção de cianobactérias tóxicas também são proporcionados pela presente invenção. Tipicamente, os kits de acordo com a presente invenção são concebidos especificamente com componentes para possibilitar a detecção de sequências de domínio de AMT e, desse modo, facilitar a identificação de cianobactérias potencialmente tóxicas.

Consequentemente, os kits, como aqui divulgado, podem incluir um ou mais iniciadores oligonucleotídicos que se hibridam especificamente a sequências de domínio de AMT de cianobactérias e possibilitam a detecção de cianobactérias hepatotóxicas. Nesses kits, quantidades apropriadas dos iniciadores podem ser proporcionadas em recipientes adequados. Os iniciadores oligonucleotídicos podem ser proporcionados suspensos numa solução aquosa ou como um pó seco por congelação ou liofilizado, por exemplo. 17

As sequências apropriadas dos iniciadores podem variar. 0 kit da invenção compreende um par de iniciadores adequados para a amplificação por PCR de sequências de AMT de cianobactérias. 0 par de iniciadores pode compreender sequências como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 2. 0 par de iniciadores pode compreender sequências como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 4 . 0 par de iniciadores pode compreender sequências como mostradas nas SEQ ID N°: 3 e 4. A quantidade de cada iniciador proporcionado no kit pode ser qualquer quantidade apropriada, dependendo da natureza da aplicação e, tipicamente, pode ser uma quantidade suficiente para iniciar, pelo menos, várias reacções de amplificação. Alguém especialista na técnica entenderia facilmente a quantidade apropriada de cada iniciador a utilizar numa única reacção de amplificação.

Um kit de acordo com a presente invenção também pode incluir uma molécula molde de controlo e/ou iniciadores de controlo adequados para utilização numa reacção de controlo. A concepção de moldes de controlo e iniciadores adequados e de reacções de controlo é bem conhecida dos especialistas na técnica.

Um kit de acordo com a presente invenção pode ainda incluir outros componentes para a realização de reacções de amplificação incluindo, por exemplo, reagentes de preparação de amostras de ADN, tampões apropriados (e. g., tampão de polimerase), sais (e. g., cloreto de magnésio), enzima polimerase e desoxirribonucleótidos (dNTP). 0 kit pode ainda incluir os reagentes necessários para efectuar a análise do ADN amplificado, tais como enzima(s) de restrição apropriada(s), tampão(ões) de reacção para digestão com enzimas de restrição e reagentes para utilização na separação de fragmentos digeridos (e. g., agarose) e/ou sequenciação de ácido nucleico. 18

Tipicamente, um kit também pode incluir recipientes para alojamento dos diversos componentes e instruções para utilização dos componentes do kit para conduzir reacções de amplificação de acordo com a presente invenção. A presente invenção será agora descrita ainda em maior detalhe, com referência aos seguintes exemplos específicos, que não devem ser interpretados como limitando, em nenhuma instância, o âmbito da invenção.

Exemplos

Exemplo 1- Detecção por PCR de genes de hepatotoxina peptidica cíclica

Os iniciadores oligonucleotídicos foram concebidos para serem adequados para a amplificação do dominio de aminotransferase (AMT) codificado nos complexos multienzimáticos de microcistina sintetase de mcyE e nodularina sintetase de ndaF. A concepção de iniciador foi baseada nas quatro sequências completas de

microcistina sintetase de Microcystis aeruginosa PCC7806, Microcystis aeruginosa K-139, estirpe 90 de Anabaena e Planktothrix sp. 128/6, assim como o gene de nodularina sintetase de Nodularia spumigena NSORIO (ver a Figura 1) . A partir destas cinco sequências foram identificados dois sitios conservados que possibilitaram a concepção de iniciadores específicos, HEPF e HEPR, como mostrado na Figura 1 e nas SEQ ID N°: 1 e 2, respectivamente. Iniciadores alternados, designados HEPF2 e HEPR2, também foram concebidos e sintetizados, sendo estes iniciadores complementares a sequências alvo cerca de 170 pb e 560 pb a jusante das sequências alvo para HEPR (ver a Figura 2) . Como ilustrado na 19

Figura 2, a amplificação por PCR foi realizada utilizando o conjunto de iniciadores HEPF/HEPR, o conjunto de iniciadores HEPF/HEPR2 e o conjunto de iniciadores HEPF2/HEPR2 para determinar a sua capacidade para o rastreio para produtores de hepatotoxina peptidica cianobacteriana. A especificidade dos iniciadores foi testada utilizando espécies cianobacterianas hepatotóxicas em cultura, assim como material de eflorescência total.

Foram testadas 17 culturas hepatotóxicas (Tabela 1), pertencendo aos géneros Microcystis, Anabaena, Nostoc, Planktothrix, Oscillatoria, Phormidium e Nodularia. A presença de microcistina ou nodularina nas estirpes investigadas era conhecida de estudos anteriores. Foram testadas 12 culturas não tóxicas, dos géneros Microcystis, Anabaena, Nostoc, Nodularia, Lyngbya, Phormidium, Synechocystis e Cylindrospermopsis. Os géneros dominantes de formação de eflorescência nestas amostras eram Microcystis, Planktothrix e Nodularia.

As amostras de eflorescência rastreadas (Tabela 2) foram recolhidas do Lago Alexandria, John Oldman Park e do Rio Swan, Austrália. A amostra de eflorescência do Lago Spino (Itália) foi proporcionada por Milena Bruno (Departamento de Higiene Ambiental, Instituto Nacional de Saúde, Itália). 0 isolado de eflorescência de Planktothrix sp. (Lago Ammersee, Alemanha) e isolado de Phormidium sp. foram proporcionados por Daniel Dietrich (Universidade de Konstanz, Alemanha) e George Izaguirre, (Secção da Qualidade da Água, Metropolitan Water District of Southern Califórnia, EUA), respectivamente. Outras estirpes cianobacterianas foram obtidas da colecção da School of 20

Biotechnology e Biomolecular Culture, Universidade de Nova Gales do Sul, Austrália (Tabela 1). 21

Tabela 1. Espécies cianobacterianas testadas para produção de hepatotoxina

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Como confirmado por PCR no presente estudo utilizando os iniciadores HEPF/HEPR 24

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<D 25 0 ADN genómico total de estirpes e material de eflorescência foi extraido utilizando tampão XS (Neilan et al., 2002) . Foram utilizados para cada extracção aproximadamente 200 mg de células cianobacterianas. As células foram combinadas com 600 pL de tampão de extracção XS (metilxantogenato de potássio a 1%; acetato de amónio a 800 mM; EDTA a 20 mM; SDS a 1%; Tris-HCl a 100 mM, pH 7,4) . A mistura foi agitada em vórtice e incubada a 65 °C, durante 2 h, e os extractos foram arrefecidos, durante 10 min, sobre gelo. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação, a 12000 x g, durante 10 min. O ADN foi precipitado pela adição de 1 volume de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de amónio a 4 M, durante 15 min, a 4 °C. O ADN precipitado foi sedimentado por centrifugação, a 12000 x g, durante 10 min e lavado com etanol a 70%. O ADN extraido foi ressuspenso em 100 pL de água estéril. A amplificação por PCR foi realizada utilizando diversas combinações dos iniciadores HEPF (5'-TTTGGGGTTAACTTTTTTGGGCATAGTC-3') (SEQ ID N°: 1), HEPR (5'-AATTCTTGAGGCTGTAAATCGGGTT-3' ) (SEQ ID N°: 2), HEPF2 (5'-AGTATGATCTGCGGTAAAGCAGATTTCT-3') (SEQ ID N°: 3) e HEPR2 (5'-AAACAAACTCGTTTTTCCCATGT-3') (SEQ ID N°: 4), como delineado acima (ver a Figura 2).

Todas as reacções de PCR foram realizadas utilizando 0,2 unidades de Taq polimerase (Fischer Biotech, Perth, Austrália) numa mistura de reacção de 20 pL contendo MgCl2 a 2,5 mM, tampão Taq-polimerase a lx (Fischer Biotech), dNTP a 0,2 mM (Fischer Biotech), 0,5 pmol de iniciador directo e inverso. O PCR foi realizado utilizando 1 pL de ADN molde, a uma concentração de, aproximadamente, 100 ng pL-1. A ciclização térmica foi num termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Norwalk, CT) . A temperatura de emparelhamento utilizada foi 52 °C para os iniciadores HEPF/HEPR, 57 °C para HEPF/HEPR2 e 53 °C para HEPF2/HEPR2. Uma etapa de desnaturação inicial a 92 °C, durante 2 min, foi seguida de 35 ciclos de 92 °C, durante 20 s, 52 °C/57 °C/53 °C (conforme apropriado), durante 30 s e 72 °C, durante 1 min, com uma etapa de extensão final a 72 °C, durante 5 min. Os produtos de PCR foram analisados em géis de agarose a 1% ou 2% com tampão TAE a lx. Os produtos de PCR foram corados com brometo de etidio (1 pg/mL), durante 10 min. Para documentação fotográfica, foi utilizado um Gel-DOC Bio-RAD System, com software Quantity One 4.1 R (BIO-RAD, EUA) . A sequenciação foi realizada utilizando os iniciadores HEPF, HEPR e HEPF2 para cada produto de amplificação. A sequenciação automática foi realizada utilizando o sistema de sequenciação ciclico PRISM Big Dye e o ABI 3730 Capillary Applied Biosystem (Foster City, Califórnia). As identidades dos produtos de amplificação sequenciados foram determinadas utilizando uma pesquisa BLAST no GenBank.

Um fragmento de, aproximadamente, 472 pb foi amplificado por PCR utilizando o conjunto de iniciadores HEPF/HEPR de ADN de todas as estirpes hepatotóxicas pertencendo a Microcystis, Anabaena, Nostoc, Planktothrix, Phormidium e Nodularia, ao passo que não foi obtido produto de PCR de qualquer das estirpes não tóxicas pertencendo a Microcystis, Anabaena, Nostoc, Phormidium, Nodularia, Lyngbya, Synechocystis e Cylindrospermopsis (dados não mostrados). Deste modo, os resultados de PCR são completamente consistentes com a designação, como tóxico ou não tóxico, da totalidade das espécies listadas na Tabela 1.

Todos os produtos de PCR foram sequenciados para confirmar a identidade dos fragmentos amplificados. A análise de sequência dos produtos de amplificação revelou que representavam o fragmento génico de AMT esperado de ortólogos de mcyE ou ndaF. 0 PCR de HEPF/HEPR também amplificou com êxito o fragmento de 472 pb de todas as amostras de eflorescência cianobacteriana hepatotóxica (ver a Figura 3). Estes fragmentos também foram sequenciados e comparados com os dados de sequência das cianobactérias cultivadas.

Além disso, um fragmento de, aproximadamente, 1000 pb foi amplificado por PCR utilizando o conjunto de iniciadores HEPF/HEPR2 e cerca de 400 pb utilizando o conjunto de iniciadores HEPF2/HEPR2 de ADN de estirpes hepatotóxicas pertencendo a Microcystis, Anabaena, Nostoc, Planktothrix, Phormidium e Modularia, ao passo que não foi obtido produto de PCR da estirpe não tóxica Microcystis sp. HUB 53 (ver Tabela 3). Estes dois pares de iniciadores também amplificaram com êxito os fragmentos das amostras de eflorescência cianobacteriana hepatotóxica tendo origem no Lago John Oldman Park, Lago Spino e Lago Alexandria (ver Tabela 2), consistente com os resultados obtidos utilizando o conjunto de iniciadores HEPF/HEPR (dados não mostrados). Os produtos de PCR obtidos da estirpe M. aeruginosa PCC7806 utilizando os conjuntos de iniciadores HEPF/HEPR2 e HEPF2/HEPR2 foram sequenciados para confirmar a identidade dos fragmentos amplificados. A análise de sequência dos produtos de amplificação revelou que representavam o fragmento génico de AMT esperado de mcyE (M. aeruginosa PCC7806, número de acesso: AAF00958).

Tabela 3. Isolados cianobacterianos rastreados utilizando HEPF/HEPR2 e HEPF2/HEPR2

Espécie Estirpe Hepatotóxica HEPF/ HEPR2 HEPF2/ HEPR2 Hepatotoxina Chroococcales Microcystis aeruginosa PCC7806 + + + microcistina Microcystis aeruginosa HUB53 Nostocales Anabaena sp. estirpe 202A2 + + + microcistina Anabaena sp. estirpe 90 + + + microcistina Modularia spumigena NROS 10 + + + nodularina Mostoc sp. estirpe 152 + + + microcistina Oscillatoriales Oscillatoria sp. estirpe 18R + + + microcistina Oscillatoria sp. estirpe 195 + + + microcistina Phormidium sp. isolado 2-26b + + + microcistina Phormidium sp. isolado l-6c + + + microcistina Phormidium sp. isolado 4-19b + + + microcistina

Exemplo 2- Evolução de genes de hepatotoxina peptidlca ciclica

As sequências das culturas foram alinhadas e analisadas filogeneticamente de acordo com as suas sequências de aminoácidos traduzidas. A glutamato-l-semialdeído aminotransferase de Aquifex sp. (Acesso Genbank N° AE000709) foi escolhida como o grupo externo. As sequências obtidas de ADN total de eflorescência também foram incluídas na análise quando as sequências foram consideradas de elevada qualidade, tais como as amostras do Rio Swan (Austrália) , Lago Alexandria (Austrália) , Lago John Oldman Park (Austrália) e Lago Spino (Itália).

Os dados de sequência foram analisados utilizando o programa de computador Applied Biosystem Auto-Assembler. As sequências foram comparadas num alinhamento múltiplo utilizando Clustal x (1.8) e a matriz PAM-Dayhoff. As árvores filogenéticas foram obtidas utilizando o método de Neighbor-Joining e os niveis de confiança foram calculados por meio de bootstrapping, utilizando um número de reamostragem de 1000. As sequências de referência foram obtidas do GenBank (NCBI).

Para comparação filogenética, as regiões de AMT amplificadas de culturas cianobacterianas, assim como material total de eflorescência foram agrupadas em agrupamentos distintamente diferentes, A e B (Figura 3) . O agrupamento A compreendia estirpes dos géneros Anabaena, Nostoc e Nodularia pertencendo à ordem Nostocales, ao passo que o agrupamento B continha os géneros Oscillatoria/Planktothrix e Phormidium, assim como as estirpes Microcystis hepatotóxicas. Os dados de sequência obtidos das amostras de eflorescência de Microcystis agrupados com as estirpes Microcystis e o material de eflorescência de Nodularia alinhados com N. spumigena NSORIO. Os dados de sequência para a AMT de McyE das diferentes estirpes Oscillatoria/Planktothrix eram idênticos. O mesmo foi observado para os três isolados de Phormidium, contudo os dados de McyE para Microcystis, Anabaena e os dados de sequência de NdaF das estirpes de Nodularia não eram 100% semelhantes. A análise filogenética indicou que NdaF evoluiu a partir de McyE. Além disso, a AMT da nodularina sintetase mostrou a relação mais próxima com a AMT dos produtores de microcistina formando heterocisto e estava situada como um sub-ramo de AMT da estirpe 152 de Nostoc (Figura 4). A filogenia de AMT revelou agrupamento de acordo com os géneros das espécies investigadas e, por conseguinte, estes resultados suportam a hipótese de que a microcistina e nodularina são relíquias ancestrais que foram perdidas em estirpes não tóxicas. 0 que sugeria a co-evolução de microcistina sintetase, nodularina sintetase e ADNr 16S.

Referências

Bolch, C. J. S. et al. 1999. Variação genética, morfológica e toxicológica entre estirpes de Nodularia (cianobactérias) globalmente distribuídas. J. Phycol. 35:339-355.

Carmichael, W. W. 2001. Efeitos de saúde de cianobactérias produzindo toxinas: O CyanoHABs. Human and ecological risk assessment 7:1393-1407.

Christiansen, G., J. et al. 2003. Biossíntese de microcistina em Planktothrix: genes, evolução e manipulação. J. Bacteriol. 185:564-572.

Codd, G. A. et al. 1999. Toxinas cianobacterianas, vias de exposição e saúde humana. Europ. J. Phycol. 34:405-415.

Dempsey, L. C. 1977. O isolamento e caracterização de Microcystis aeruglnosa Kutzing emend. Elenkin 1924 do Lago Winnebago Pool. Tese de M.S. Universidade de Wisconsin, Oshkosh.

Doers, E. P. e D. L. Parker. 1988. Propriedades de Microcystis aeruginosa e M. flosaquae (Cyanophyta) em cultura: implicações taxonómicas. J. Phycol. 24:502-508.

Eloff, J. N. toxicológicos e A. sobre J. Van der Microcystis,

Westhuizen. 1981. p. 343-364. Em P·

Estudos W. W.

Algal Toxins and

Carmichael (ed.), The Water Environment Health. Plenum. Press, Nova Iorque. sp. e toxinas seu impacto no Environ. Tox.

Ernst et al. 2001. Presença de Planktothrix cianobacterianas no Lago Ammersee, Alemanha e coregono branco (Corregonus lavaretus L.) . 16:483-488.

Hawkins, P. R. et al. 1997. Isolamento e toxicidade de Cyllndrospermopsls raciborskll de um lago ornamental. Toxicon 35:341-346.

Hisbergues, M. et al. 2003. Identificação baseada em PCR de genótipos produzindo microcistina de diferentes géneros cianobacterianos. Arch. Microbiol. 180:402-410.

Hitzfeld, B. et al. 2000. Toxinas cianobacterianas: Remoção durante o tratamento da água potável e avaliação de risco. Environ. Health Perspect. 108:113-122.

Izaguirre, G. et al. 2004. Uma espécie de Phormidium bêntica que produz microcistina-LR, isolada de três reservatórios na Califórnia do Sul. 6a Conferência Internacional sobre Cianobactérias Tóxicas.

Kurmayer, R. et al. 2004. Abundância de genótipos activos e inactivos de microcistina em populações da cianobactéria tóxica Planktothrix spp. Environ. Microbiol. 6:831-841.

Kurmayer, R. e T. Krutzenberger. 2003. Aplicação de PCR em tempo real para quantificação de genótipos de microcistina numa população da cianobactéria tóxica Microcystis sp. Appl. Environ. Microbiol. 69:6723-6730.

Lehtimáki, J. et al. 1994. Os efeitos de tempo de incubação, temperatura, luz, salinidade e fósforo no crescimento e produção de hepatotoxina por estirpes de Nodularia. Arch. Hydrobiol. 130:269-282.

Lyra, C. et al. 2001. Caracterização molecular de cianobactérias planctónicas dos géneros Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis e Planktothrix. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:513-526.

Mikalsen, B. et al. 2003. Variação natural no operão mcyABC de microcistina sintetase e impacto na produção de microcistina em estirpes de Microcystis. J. Bacteriol. 185:2774-2785.

Moffitt, C. M. e B. A. Neilan 2004. Caracterização do agrupamento génico de nodularina sintetase e evolução proposta de hepatotoxinas cianobacterianas. Appl. Environ. Microbiol. 70:6353-6362.

Moffitt, M. C. e B. A. Neilan 2001. Sobre a presença de genes de péptido sintetase e policétido sintetase no género cianobacteriano Nodularia. FEMS Microbiol. Lett. 196:207-214.

Neilan, B. A. 1995. Identificação e análise filogenética de cianobactérias toxigénicas por PCR de ADN polimórfico multíplex aleatoriamente amplificado. Appl. Environ. Microbiol. 61:2286-2291.

Neilan, B. A. et al. 1999. Síntese peptídica não ribossómica e toxigenicidade de cianobactérias. J. Bacteriol. 181:4089-97.

Neilan, B. A. et al. 2002. Identificação molecular de cianobactérias associadas a estromatólitos de localizações geográficas distintas. Astrobiol. 2:271-280.

Nishizawa, T. et al. 1999. Análise genética dos genes de péptido sintetase para uma microcistina heptapeptídica cíclica em Microcystis spp. J. Biochem. 126:520-529.

Rippka, R. e M. Herdman. 1992. Colecção de Culturas de Pasteur (PCC) de estirpes cianobacterianas em cultura axénica, vol. 1, catálogo de estirpes. Paris, França; Instituto Pasteur.

Rouhiainen; L. et al. 2004. Genes codificando para heptapéptidos hepatotóxicos (microcistinas) na estirpe 90 da cianobactéria Anabaena. Appl. Environ. Microblol. 70:686-692.

Starr, R. C. e J. A. Zeikus. 1993. UTEX - a Colecção de Culturas de Algas na Universidade do Texas em Austin. J. Phycol. 29 (Supl.):1-106.

Tillet, D. et al. 2000. Organização estrutural da biossíntese de microcistina em Microcystis aeruginosa PCC7806: um sistema integrado de péptido-policétido sintetase. Chem. Biol. 7:753-764 .

Vaitomaa, J. et al. 2003. PCR quantitativo em tempo real para determinação dos números de cópia de microcistina sintetase E para Microcystis e Anabaena em lagos. Appl. Environ. Microbiol. 69:7289-7297.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Unisearch Limited <120> Detecçao de Cianobactérias Hepatotóxicas <130> 702175 <160> 4 <17 0> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sequência sintética <4 0 0> 1 tttggggtta acttttttgg gcatagtc <210> 2 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sequência sintética <4 0 0> 2 aattcttgag gctgtaaatc gggtt <210> 3 <211> 28

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sequência sintética <4 0 0> 3 agtatgatct gcggtaaagc agatttct 28 <210> 4 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sequência sintética <400> 4 aaacaaactc gtttttccca tgt 23 11-04-2013

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a detecção de cianobactérias produzindo microcistina e cianobactérias produzindo nodularina, compreendendo o método as etapas de: (a) obtenção de uma amostra cianobacteriana; e (b) análise da amostra para a presença de sequências do domínio de aminotransferase associado a hepatotoxina (AMT), em que o referido domínio de AMT está localizado nas fases de leitura aberta de mcyE e ndaF e a presença das referidas sequências do domínio de AMT associado a hepatotoxina é indicativa das referidas cianobactérias produzindo microcistina e cianobactérias produzindo nodularina.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a etapa (b) de análise compreende: (i) amplificação de ADN da amostra utilizando iniciadores adequados; e (ii) detecção de sequências amplificadas.
3. 3. Método da reivindicação 2, em que os iniciadores são iniciadores oligonucleotídicos compreendendo as sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 2.
4. 4. Método da reivindicação 2, em que os iniciadores são iniciadores oligonucleotídicos compreendendo as sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 4.
5. 5. Método da reivindicação 2, em que os iniciadores são iniciadores oligonucleotídicos compreendendo as sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 3 e 4.
6. 6. Método de qualquer uma das reivindicações 2 a 5, em que a detecção das sequências amplificadas compreende electroforese em gel e/ou sequenciação de ácido nucleico.
7. 7. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a amostra cianobacteriana compreende um ou mais organismos cianobacterianos isolados ou cultivados.
8. 8. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a amostra cianobacteriana compreende uma amostra ambiental contendo um ou mais organismos cianobacterianos.
9. 9. Método da reivindicação 8, em que a amostra ambiental é uma amostra de água salgada ou água doce.
10. 10. Método da reivindicação 8, em que a amostra ambiental é uma amostra de uma eflorescência de algas azuis-verdes.
11. 11. Kit para a detecção de cianobactérias produzindo microcistina e cianobactérias produzindo nodularina, compreendendo o kit um par de iniciadores concebido para a amplificação por PCR das sequências do domínio de aminotransferase associado a hepatotoxina nos genes ndaF e mcyE.
12. 12. Kit da reivindicação 11, em que os iniciadores são iniciadores oligonucleotídicos compreendendo as sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 2.
13. 13. Kit da reivindicação 11, em que os iniciadores são iniciadores oligonucleotídicos compreendendo as sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 1 e 4. adores são sequências
14. 14. Kit da reivindicação 11, em que os inici iniciadores oligonucleotidicos compreendendo as nucleotidicas como mostradas nas SEQ ID N°: 3 e L 11-04-2013