ES2616235T3 - Análisis ratiométrico de pre-ARNr - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar microorganismos viables en una muestra, y el método comprende, en una muestra recogida: estimular nutricionalmente una primera alícuota de la muestra; mantener una segunda alícuota de la muestra en condiciones de control que no son estimulantes nutricionalmente; incubar la primera alícuota y la segunda alícuota; comparar el nivel de al menos un pre-ARNr objetivo de al menos un microorganismo objetivo de la primera alícuota con el nivel del al menos un pre-ARNr objetivo de al menos un microorganismo objetivo en la segunda alícuota; en el que la razón del nivel del al menos un pre-ARNr objetivo en la primera alícuota y el nivel del al menos un pre-ARNr objetivo en la segunda alícuota es indicativa de microorganismos viables en la muestra.

Description

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En una realización, las muestras recogidas para RPA como se describe en la presente memoria pueden incluir muestras naturales que comprenden variaciones espaciales con respecto a la disponibilidad de nutrientes y la presencia de inhibidores del crecimiento y defensas del hospedador. Por ejemplo, los bacilos de tuberculosis en macrófagos recién infectados pueden replicarse a una velocidad superior, mientras es probable que el crecimiento sea lento en la matriz extracelular o en células hospedadoras con una gran carga de bacilos. En una realización, para las muestras naturales recogidas durante una infección aguda en un sujeto, puede ser poco probable que se proporcione a todos los organismos objetivo potenciales de una muestra la mezcla óptima de nutrientes para asegurar un crecimiento celular máximo. Como tal, se puede esperar que los microorganismos objetivo en las muestras naturales sinteticen pre-ARNr y muestren un aumento de pre-ARNr al incubarlos en condiciones de estimulación nutricional. En una realización, los métodos de RPA como se describen en la presente memoria pueden comprender recoger una muestra natural que comprende un microorganismo objetivo vivo en un medio con limitación de nutrientes. En una realización, los métodos de RPA como se describen en la presente memoria pueden incluir determinar el nutriente limitante en la muestra natural y después estimular nutricionalmente una alícuota de la muestra natural con un medio enriquecido de nutrientes que comprende el nutriente limitante. Por lo tanto, el medio enriquecido de nutrientes puede provocar un aumento de los niveles de pre-ARNr en el microorganismo objetivo al proporcionar el nutriente limitante al microorganismo objetivo.
En una realización particular, el RPA se puede llevar a cabo para un organismo objetivo tal como M. tuberculosis en una muestra obtenida de un sujeto humano o animal. En una realización, se puede recoger esputo de un sujeto que se sospecha que está infectado con M. tuberculosis o que se somete a tratamiento para M. tuberculosis. Las muestras de esputo se pueden dividir en 2 alícuotas, una de las cuales se puede estimular nutricionalmente con un medio de enriquecimiento, tal como caldo Middlebrook 7H9, mientras la otra se puede mantener en PBS o agua como control. En una realización, la estimulación nutricional puede desarrollarse durante aproximadamente 3-5 horas a 37 °C. Las bacterias de las alícuotas estimuladas y de control se pueden lisar después, y se puede usar RTqPCR para cuantificar el pre-ARNr y calcular los valores de la razón de estimulación de pre-ARNr. Los valores de estimulación de pre-ARNr se pueden usar para determinar la presencia de M. tuberculosis viable en la muestra natural. En una realización, se indica la presencia de células viables de M. tuberculosis cuando los valores de pre-ARNr en la alícuota estimulada nutricionalmente son mayores que los valores de pre-ARNr en la alícuota de control sin estimular. En las realizaciones similares, los patógenos intracelulares de los géneros Chlamydia, Listeria, Legionella, u otros se pueden detectar mediante RPA con el uso de estimulación nutricional con nutrientes limitantes. Los patógenos objetivo no necesitan ser "cultivables" in vitro. Por ejemplo, un patógeno intracelular obligado tal como Chlamydia trachomatis se puede detectar en una torunda vaginal mediante el uso de RPA en el que se proporciona un nutriente específico que era limitante en su medio intracelular natural. El patógeno puede no ser capaz de replicarse en estas condiciones, pero puede percibir la presencia del nutriente limitante y sintetizar pre-ARNr en un intento fallido de replicarse, ya que la síntesis de pre-ARNr es una etapa muy temprana del crecimiento celular. Tal síntesis sería detectable mediante RPA.
Los métodos manuales o automatizados conocidos para la extracción y cuantificación de ácidos nucleicos se pueden aplicar para llevar a cabo los métodos de RPA como se describe en la presente memoria. En una realización, el RPA puede incluir la extracción y/o cuantificación de ácidos nucleicos que usa una o más tecnologías tales como la tecnología de chips de ácidos nucleicos, micromatrices, tecnología multiplex, laboratorio en un chip, laboratorio en una tarjeta, dispositivos microfluídicos, y otras tecnologías de extracción y cuantificación de ácidos nucleicos conocidas por los expertos en la técnica. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "dispositivo microfluídico" es un dispositivo que se puede usar para llevar a cabo RPA, y puede incluir la tecnología de chip de ácidos nucleicos, micromatrices, tecnología multiplex, laboratorio en un chip, laboratorio en una tarjeta, y tecnologías relacionadas. Por ejemplo, se describen métodos de extracción y análisis de ácidos nucleicos en la patente de EE.UU. 7.608.399 y la solicitud de patente de EE.UU. 11/880.790.
En una realización, los métodos de RPA descritos en la presente memoria pueden incluir el uso de una tarjeta de ácido nucleico para la extracción y amplificación del ARN, seguido del análisis ratiométrico. Una alícuota tomada de una muestra se estimula nutricionalmente mientras una alícuota de control se mantiene con tampón (etapa A). Después de una estimulación nutricional breve, las células se lisan (etapa B) y después se cargan en tarjetas de ácido nucleico emparejadas. Tras la finalización de la extracción de ARN (etapa C), los eluidos se someten a qPCR. Cuando se aplica a micobacterias de crecimiento lento, el proceso total, que incluye la estimulación nutricional, puede conllevar de 6 a 24 horas. Comparativamente, el cultivo de Mycobacterium requiere 5-14 días.
En una realización, el RPA como se describe en la presente memoria puede incluir la extracción y cuantificación de ácidos nucleicos mediante el uso de una tarjeta de vidrio plano o compuesta capaz de aislar de manera rápida, sencilla, y fiable ADN y ARN de sangre y una diversidad de otras muestras biológicas. En una realización, el RPA como se describe en la presente memoria se puede llevar a cabo mediante el uso de un dispositivo que combina la lisis celular, la extracción y purificación de ácidos nucleicos, y la medida de los ácidos nucleicos extraídos. En una realización, el dispositivo puede ser un recipiente para recibir y procesar una muestra biológica como se describe en la presente memoria. En una realización, los métodos de RPA descritos en la presente memoria pueden comprender el uso de una tarjeta de flujo para ácidos nucleicos con paredes de vidrio para la extracción de ácidos nucleicos de una muestra. En tal realización, la tarjeta se puede usar para la cuantificación de ácidos nucleicos, la extracción de ADN o ARN y la determinación de la concentración. En una realización alternativa, la extracción y/o cuantificación de ácidos nucleicos se puede realizar manualmente mediante el uso de pipetas insertadas en orificios de carga y
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generar suspensiones celulares de A. hydrophila con razones variables de células viables e inactivadas. Las razones se cuantificaron mediante la colocación en placas de células viables tras la exposición a cloro, y se expresaron como la viabilidad en porcentaje respecto de la densidad de inicio de aproximadamente 1 X 106 ufc/ml. Para llevar a cabo el RPA en las suspensiones celulares tratadas con cloro y sin tratar, se centrifugaron alícuotas emparejadas y los sedimentos celulares se resuspendieron en agua (muestra de control) o caldo de nutrientes (muestra estimulada). Después de 1 hora de estimulación nutricional, se determinaron las razones de estimulación de pre-ARNr. En ciertos experimentos, también se cuantificó mediante qPCR el ADN genómico en las muestras estimuladas y de control. Esto permitió la determinación de la especificidad de RPA hacia las células viables, en comparación con la especificidad observada con la qPCR tradicional de ADN.
La Tabla 1 muestra los resultados de dos experimentos en los que se midió el ADN genómico, así como el pre-ARNr. En el primer experimento, las muestras con viabilidades en porcentaje del 96,3%, 26,9%, y 0,02% exhibieron valores de razones de estimulación de pre-ARNr de ≥3 ± 1 DE. Las muestras sin células viables detectables (0% de viabilidad) exhibieron razones de estimulación de pre-ARNr que no fueron estadísticamente mayores de 1,0. Por lo tanto, RPA mostró valores significativos de razones de estimulación de pre-ARNr en una muestra en la que hasta aproximadamente un 99,98% de los microorganismos objetivo estaban muertos. En contraste, la detección mediante qPCR del ADN genómico de A. hydrophila fue claramente positiva en todas las muestras, independientemente de la viabilidad celular. Además, no hubo ninguna diferencia entre las señales de ADN en las alícuotas estimuladas nutricionalmente y las de control (no mostrado). Se observaron resultados similares en el segundo experimento (Tabla 1). Este ejemplo ilustra la notable sensibilidad de RPA hacia las células viables, incluso cuando están superadas en número por las células inactivadas mediante factores de 5000 veces o más, como en la muestra del Experimento 1 que se trató con 2 mg/l de hipoclorito.
Tabla 1
Experimento 1
Hipoclorito (mg/l)
Ucf/ml final Viabilidad en porcentaje1 Razón de estimulación de pre-ARNr2 Copias de ADN genómico (millones)
0
963000 96,3 3,0 ± 0,2 1,4 ± 0,4
1
279000 27,9 17,2 ± 3,6 3,8 ± 0,5
2
190 0,02 73,0 ± 54,2 4,0 ± 0
3
0 0 0,6 ± 1,0 3,8 ± 0,5
4
0 0 0,04 ± 0,1 5,4 ± 0,6
Experimento 2
Hipoclorito (mg/l)
Ucf/ml final Viabilidad en porcentaje1 Razón de estimulación de pre-ARNr2 Copias de ADN genómico (millones)
0
774000 77,4 39,4 ± 17,0 0,5 ± 0,1
1
846000 84,6 17,44 ± 5,4 2,2 ± 0,5
1,5
186000 18,6 16,47 ±6,6 2,7 ± 0,1
2
0 0 1,28 ± 0,4 2,2 ± 0,04
1 Normalizado respecto de aproximadamente 1 X 106 bacterias iniciales. 2 Media ± DE de 3 muestras replicadas. En cuatro experimentos que usaron el protocolo de la Tabla 1, se aplicó el RPA a un total de 18 muestras tratadas con cloro y sin tratar con viabilidades en porcentaje variables. Las razones de estimulación de pre-ARNr observadas en las muestras sin unidades formadoras de colonias detectables fueron significativamente inferiores (p = 0,0026 mediante la prueba U de Mann-Whitney) que las observadas en las muestras con unidades formadoras de colonias detectables (Figura 4A). Hubo cierto solapamiento entre los dos grupos, sin embargo el solapamiento fue significativamente menor que el observado cuando se cuantificó el ADN genómico mediante qPCR en las muestras estimuladas o sin estimular (Figura 4B). No hubo una correlación significativa entre la viabilidad y las razones de estimulación de ADN. Más específicamente, la FIG. 4 muestra la correlación entre la presencia de células viables de
A. hydrophila y la razón de estimulación de pre-ARNr (A) o ADN genómico cuantificado mediante qPCR (B) en suspensiones de laboratorio tratadas con hipoclorito. Los valores de la razón de estimulación de pre-ARNr (A) son las razones de pre-ARNr en las muestras estimuladas respecto de las muestras de control, medidos mediante RTqPCR. Los valores son las medias de 3 medidas por muestra. Las copias de ADN genómico (B) se cuantificaron mediante qPCR normalizadas respecto de una curva patrón de ADN genómico. El ADN se midió en muestras estimuladas nutricionalmente (cuadrados claros), así como en muestras no estimuladas (triángulos claros).
Ejemplo 4-Ensayo de Campo de un Ensayo RPA
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Como habitante habitual de las aguas superficiales, A. hydrophila fue un modelo adecuado para el ensayo de campo de RPA. Se recogieron muestras de localizaciones de agua dulce y salada en Seattle, WA. Se trató en autoclave una porción de cada muestra para generar un control inactivado. Las muestras tratadas y sin tratar en autoclave (300 ml cada una) se concentraron mediante filtración. Tras la resuspensión, se diluyeron alícuotas dos veces en caldo de nutrientes 2X (muestra estimulada) o agua (control). Después de 1 hora de incubación, se concentraron las bacterias y partículas mediante centrifugación, y después se midió el pre-ARNr de A. hydrophila en los sedimentos mediante RT-qPCR. Se determinaron los recuentos viables de A. hydrophila en las muestras mediante colocación en placas de células viables siguiendo métodos habituales.
Tabla 2.
Sitio
Descripción Recuentos de A. hydrophila viable (ufc media por ml ± DE) Pre-ARNr (razón media estimulado/control ± DE)1
A1
Agua dulce 798 4,8 ± 1,4
A2
Agua dulce 280 9,5 ± 5,9
B
Agua salada 6 Pre-ARNr no detectado
C
Agua dulce 760 39,8 ± 12,8
1Medias y desviaciones estándar de ≥4 medidas por muestra.
En total, se analizaron 3 muestras de agua dulce y 1 muestra de agua salada. Las muestras de agua dulce produjeron cuentas viables de A. hydrophila que oscilaron de 280 a 798 ufc/ml. Todas ellas exhibieron señales positivas de RPA (Tabla 2). Ninguna de las muestras tratadas en autoclave produjeron ufc, y no se detectó pre-ARNr de A. hydrophila en estas muestras. La muestra de agua salada tuvo 6 ufc/mL de A. hydrophila, sin embargo no se detectó pre-ARNr de A. hydrophila en las muestras estimuladas o sin estimular, con o sin tratamiento en autoclave.
Los resultados apoyan el uso de RPA como medio para detectar de manera específica microorganismos viables en muestras ambientales. Los métodos de RPA se pueden usar para eliminar resultados falsos positivos observados en muestras que contienen solamente células bacterianas muertas y ADN. El uso de RPA puede reducir también los falsos positivos provocados por la contaminación de laboratorio de las muestras o los reactivos de PCR. Además, el RPA es robusto y se basa en una característica fisiológica de todas las bacterias, y es útil en el análisis de la seguridad de alimentos y agua, por sí mismo o como análisis auxiliar para otras herramientas.
Ejemplo 5-Sensibilidad biológica de RPA
Se puede usar el RPA para mejorar la sensibilidad de un ensayo con respecto a la detección de ADN genómico. La FIG. 5 muestra los resultados de múltiples reacciones de RT-qPCR llevadas a cabo en alícuotas emparejadas estimuladas y de control obtenidas de una única muestra de agua dulce de lago (muestra A2 de la Tabla 2) que contuvo 280 ufc/ml de A. hydrophila viables. Siguiendo con referencia a la FIG. 5, se dividió una muestra del lago Union, Seattle, WA en dos alícuotas, una de las cuales se estimuló con caldo de nutrientes (barras oscuras) y la otra se resuspendió en ATW (barras claras) como control. Los resultados mostrados en la FIG. 5 se expresan como copias de pre-ARNr aproximadas por ml de muestra calculadas comparando los valores de ciclo umbral (Ct) respecto de una curva patrón de ADN genómico. En cada una de estas réplicas técnicas, las señales de pre-ARNr en las muestras estimuladas superaron las de las muestras de control con márgenes sustanciales.
Los valores de Ct de la Tabla 2 estuvieron todos en el intervalo de 32 a 43, es decir, las señales fueron dudosas y débiles. Esto se debió muy probablemente a los inhibidores de PCR que son habituales en las muestras de agua superficial concentrada. A pesar de estas limitaciones, los resultados fueron inequívocamente positivos, ya que el aumento coherente de la señal de pre-ARNr en las muestras estimuladas prestó confianza a la conclusión de que hubo células viables de A. hydrophila.
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