PT1819833E - Variante genética do gene de anexina a5 - Google Patents

Description

ΕΡ1819833Β1

DESCRIÇÃO VARIANTE GENÉTICA DO GENE DE ANEXINA A5 A descrição descreve uma molécula de ácido nucleico que compreende um elemento de regulação do gene de anexina A5 (ANXA5) que compreende pelo menos uma mutação pontual, em que a referida pelo menos uma mutação pontual (substituição) é seleccionada do grupo constituído por (i) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 186 de SEQ ID NO: 2; (ii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 203 de SEQ ID NO: 2; (iii) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 229 de SEQ ID NO: 2; e (iv) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 276 de SEQ ID NO: 2. A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende um promotor de anexina A5 (ANXA5) humana, que compreende as seguintes mutações pontuais (substituições) : (i) uma mutação pontual de G para A, numa posição que corresponde ao nucleótido 186 de SEQ ID NO: 2; (ii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 203 de SEQ ID NO: 2; (iii) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 229 de SEQ ID NO: 2; e (iv) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 27 6 de SEQ ID NO: 2. A presente invenção refere-se também a uma molécula de ácido nucleico que compreende um promotor de anexina A5 (ANXA5) humana que compreende as seguintes mutações pontuais (substituições): (ii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 203 de 1 ΕΡ1819833Β1 SEQ ID NO: 2; e (iii) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 229 de SEQ ID NO: 2.

Além disso, a presente invenção proporciona um vector que compreende uma molécula de ácido nucleico da invenção e um hospedeiro transformado com o vector. A invenção também se refere a utilizações especificas, em particular utilizações de diagnóstico das moléculas de ácido nucleico aqui descritas. Além disso, o pedido descreve um método para a haplotipagem de um elemento de regulação do gene ANXA5 num indivíduo, que compreende os passos de: (a) isolar um ácido nucleico de uma amostra que foi removida do indivíduo; (b) determinar a presença dos nucleótidos presentes nas posições 186, 203, 229 e 276 da cópia do elemento de regulação do gene ANXA5 do indivíduo, em que os números de posição são determinados por comparação com a SEQ ID NO:2; (c) atribuir aos indivíduos um haplotipo particular, por comparação dos nucleótidos presentes nas referidas posições com os nucleótidos indicados nos haplotipos como aqui definido. A perda gestacional é um fenómeno frequente com origem heterogénea. A condição genética mais prevalente, em especial para casos de aborto precoce, é aberrações cromossomais. Os distúrbios de hipercoagulação que promovem a trombose, designados conjuntamente por trombofilia, são também outro factor genético significativo. Os defeitos mais significativos (risco de perda gestacional 3 a 6 vezes maior) incluem a mutação do factor V de Leiden, variantes genéticas da metilenotetrahidrofolatoreductase (MTHFR), e mutação 20210G->A do factor II (protrombina) . Entre estes, as associações entre o factor V de Leiden e protrombina 20210G-.A (PTm) com perda gestacional recorrente estão demonstradas por meta-análise estatística [Rey, 2003] . A associação entre 2 ΕΡ1819833Β1 algumas destas variantes genéticas de MTHFR e a trombose é controversa [Rey, 2003, Key, 2002, Seligsohn, 2001]. Outro factor principal para abortos repetidos é a presença de anticorpos antifosfolipido maternos, circulantes (aPL). Foi documentado um maior risco de perda gestacional em gravidezes de baixo risco e de alto-risco (mais de 3 perdas fetais), quando os aPL estão presentes [Empson, 2002 e referências ai citadas]. A anexina A5 (proteína anticoagulante placentar) é encontrada nas vilosidades placentares normais e parece estar diminuída na presença de aPL [Rand, 1994]. Outros estudos confirmam imunohistoquimicamente uma menor expressão de anexina A5 em trofoblastos placentares de pacientes com pré-eclampsia. A anexina A5 é um membro típico da família do gene de anexina de cordata. Ela projecta a estrutura de tétrada essencial e a ligação aos fosfolípidos dependente de cálcio, que a tornaram num modelo chave para estudar a função de anexina [Gerke e Moss, 2002]. É uma proteína expressa de forma abundante e ubíqua, essencialmente presente no rim, fígado e placenta [Morgan, 1998] . A anexina A5 pode funcionar extracelularmente como um inibidor da coagulação sanguínea e é proposto que esta proteína pode formar um escudo anticoagulante protector na superfície de trofoblastos placentares [Rand e Wu, 1999; Rand, 2003].

Hayes discute o papel possível da expressão de Anexina 5 nalgumas condições patológicas, tais como a perda gestacional. Não há, no entanto, nenhuma sugestão de que estas condições possam estar ligadas a um promotor de ANX5A mutado. 3 ΕΡ1819833Β1 0 gene de anexina A5 foi bem caracterizado há uma década [Cookson, 1994] e o gene e a proteína codificada estão extensivamente estudados e caracterizados. Até há pouco tempo, pouco se conhecia, no entanto, sobre a regulação da expressão de anexina A5. 0 gene de anexina A5 (ANXA5) humana produz várias moléculas transcritas e tem um promotor complexo com uma regulação intrincada [Carcedo, 2001].

Nenhuma mutação da anexina A5 foi associada com um fenótipo de doença, com a excepção da variante genética "-1C->T", que é proposto ter acção protectora contra o enfarte do miocárdio em pacientes jovens [Gonzalez-Conejero, 2002]. Há, no entanto, outros dados e considerações, que contrariam a validade desta hipótese [Kozak, 2003; van Heerde, 2003].

Os problemas técnicos da presente invenção são proporcionar meios e métodos para determinar o risco de perda gestacional. A solução para este problema técnico é proporcionada na presente invenção, tal como caracterizada nas reivindicações e como aqui ilustrada e exemplificada. A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende um promotor de anexina A5 (ANXA5) humana o qual compreende as seguintes mutações pontuais (substituições) : (i) uma mutação pontual de G para A, numa posição que corresponde ao nucleótido 186 de SEQ ID NO: 2; (ii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 203 de SEQ ID NO: 2; (iii) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 229 de SEQ ID NO: 2; e (iv) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 27 6 de SEQ ID NO: 2. A presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico que compreende um promotor de 4 ΕΡ1819833Β1 anexina A5 (ANXA5) humana, o qual compreende as seguintes mutações pontuais (substituições): (ii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 203 de SEQ ID NO: 2; (iii) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 229 da SEQ ID NO: 2; A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico compreendendo um elemento de regulação do gene de anexina A5 (ANXA5) que compreende as seguintes mutações pontuais (substituição) (i) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 186 de SEQ ID NO: 2; (ii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 203 de SEQ ID NO: 2; (iii) uma mutação pontual de T para C numa posição corresponde ao nucleótido 229 de SEQ ID NO: 2; e (iv) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 276 de SEQ ID NO: 2.

Como documentado nos exemplos seguintes foi encontrada, surpreendentemente, uma variante genética na região do promotor de ANXA5 (BamHI) no gene de anexina A5 (ANXA5) entre mulheres que foram avaliadas quanto a diferentes defeitos genéticos de trombose hereditária devido a perdas gestacionais repetidas. Esta variante consiste de quatro substituições de nucleótido, que são herdadas como um haplotipo. Sem estar cingido a uma teoria, estas quatro alterações são importantes para a actividade do promotor de anexina A5 e resultam numa menor expressão de genes. Como 5 ΕΡ1819833Β1 definido a seguir, têm particular relevância a este respeito quatro mutações pontuais caracterizadas como "-19 G para A", "1 A para C", "27 T para C" e "7 6 G para A", em que "G" designa guanina, "C" designa citosina, "A" designa adenina e "T" timina.

As posições "-19", "1", "27" e "76" das mutações/substituições aqui descritas referem-se à numeração da sequência, como indicada na Figura 2, que mostra a estrutura do promotor nuclear de ANXA5. A numeração em particular refere-se ao primeiro ponto de iniciação da transcrição do gene (tsp 1, como indicado "+1"). No entanto, as substituições/mutações correspondentes também são definidas em relação a sequências especificas que representam o promotor ANXA5, e indicados em particular na SEQ ID NO: 2 (uma estrutura do promotor de ANXA5 como descrito em Carcedo (2001), Biochem. J. 356, 571-579), SEQ ID NO: 1 (uma estrutura do promotor ANXA5 depositado com o número de acesso do gene U01681; NCBI) e designado por "gene de anexina V humano, região 5'-não traduzida, exões 1 e 2); e duas outras regiões de promotor de anexina V/regiões 5'-não traduzidas aqui definidas como SEQ ID NOS: 3 e 4. A região 5'-não traduzida de um gene de anexina V pode, no contexto desta invenção, em particular ser caracterizada como compreendendo dois motivos específicos "A" e "B" que estão documentados na

Figura 2. Outro promotor de ΑΝΧΑ V, de acordo com esta invenção, é uma estrutura de promotor que compreende pelo menos uma estrutura de sequência como definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 17, 18, 19 e 20.

Deste modo, as quatro substituições, como aqui definido, referem-se às seguintes posições nas estruturas de promotor correspondentes, como indicado nas SEQ ID NOS: 1 to 4: 6 ΕΡ1819833Β1

Substituição SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 -19 G-> A 186 1259 243 190 1 A - C 203 1276 262 209 27 T ^ C 229 1302 288 235 7 6 G^ A 276 1349 337 284

Estes nucleótidos variantes estão representados em casos de perda gestacional repetida a uma taxa de portabilidade muito mais elevada, comparada com controlos fêmea normais, sem problemas de gravidez referidos (praticamente duas a três vezes maior). Deste modo, o haplotipo BamHI ~ representa um factor de risco para perdas gestacionais repetidas. Além disso, este nucleótidos variantes estão representados em casos de perdas gestacionais repetidas a uma taxa de portabilidade cerca de duas vezes maior, em comparação com a população normal do noroeste da Alemanha (1,916 vezes). A presente invenção proporciona um procedimento/método analítico que discrimina este haplotipo de risco do alelo de tipo selvagem, normal. Resumindo, a presente invenção proporciona variantes genéticas do promotor do gene ANXA5 designadas por alelos "Ml" e "M2" (Bam ΗΓ) . 0 "haplotipo Ml" correspondente compreende as mutações "1 A a C" e "27 T a C", enquanto que o "haplotipo M2" correspondente compreende todas as quatro mutações definidas acima, i.e. adicionalmente, a mutação "-19 G para A" e a mutação "76 G para A". Estimou-se a frequência destes alelos em pacientes e grupos de controlo. Adicionalmente, a relevância funcional dos alelos ANXA5 Ml e M2 (Bam Hl ~) para a expressão de genes de ANXA5 está documentada. Com particular relevância, uma relação entre portabilidade do alelo de ANXA5 Bam Hl e a condição de perda gestacional repetida é demonstrada e é estabelecido um procedimento analítico para distinguir o alelo de ANXA5 Bam Hl ~ da sequência do tipo selvagem. 7 ΕΡ1819833Β1

Numa forma de realização da invenção, a molécula de ácido nucleico que compreende um elemento de regulação do gene ANXA5 da invenção é uma molécula de ácido nucleico em que a referida pelo menos uma mutação pontual de G para A na posição 186 de SEQ ID NO: 2 corresponde a (i) uma mutação pontual G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 1259 de SEQ ID NO: 1; (ii) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 243 de SEQ ID NO: 3; ou (iii) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 190 de SEQ ID NO: 4.

Adicionalmente, é proporcionada uma molécula de ácido nucleico que compreende um elemento de regulação do gene ANXA5 como definido acima, em que a referida pelo menos uma mutação pontual de A para C na posição 203 de SEQ ID NO: 2 corresponde a (i) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 1276 de SEQ ID NO: 1; (ii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 262 de SEQ ID NO: 3; ou (iii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 209 de SEQ ID NO: 4; e/ou pelo que a referida pelo menos uma mutação pontual de T para C na posição 229 de SEQ ID NO: 2 corresponde a 8 ΕΡ1819833Β1 (i) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 1302 de SEQ ID NO : i; (ii) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 288 de SEQ ID NO: 3; ou (iii) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 235 de SEQ ID NO: 4; e/ou pelo que a referida pelo menos uma mutação pontual de G para A na posição 276 de SEQ ID NO: 2 corresponde a (i) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 1349 de SEQ ID NO: 1; (ii) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 337 de SEQ ID NO: 3; ou (iii) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 284 de SEQ ID NO: 4.

Numa forma de realização preferida da invenção, a molécula de ácido nucleico que compreende um elemento de regulação do gene ANXA5 como definido nas reivindicações compreende pelo menos uma das seguintes sequências (i) TGCGGTTGGGGC (SEQ ID NO: 17); (ii) TGGCGGGGGTGGGACGGGCCAAGCCGGGCAGGGCCGGGGTGGGGC (SEQ ID NO: 18), (iii) GCTGGCGTTTCCGTTGCTTGGATCAGTCTAGGTGCAGCTGC (SEQ ID NO: 19); ou (iv) GGATCC (SEQ ID NO: 20), 9 ΕΡ1819833Β1 pelo que o G na SEQ ID NO: 17 pode ser um A (correspondente a -19 G para A), em que o referido A na SEQ ID NO: 18 pode ser um C (correspondendo a 1 A para C) , em que o referido T na SEQ ID NO: 18 pode ser um C (correspondendo a 27 T para C) e em que o referido G na SEQ ID NO: 20 pode ser um A (correspondendo a 76 G para A).

Como documentado acima, a molécula de ácido nucleico aqui definida como elemento de regulação do gene ANXA5 é um promotor. Deste modo, a molécula de ácido nucleico é capaz de conferir a actividade da anexina A5 na forma de expressão de anexina A5/V. A referida expressão pode ser testada por métodos conhecidos na arte, por exemplo ligando de forma operacional a molécula de ácido nucleico da presente invenção, quer com uma molécula marcadora a ser expressa e/ou à sequência codificante de anexina A5 e detectando se a referida anexina A5 ou a referida molécula marcadora é expressa em, inter alia, um sistema de expressão de genes heterólogo.

Também estão compreendidas na definição de uma sequência promotora/reguladora de ANXA5 como definido nas reivindicações, moléculas de ácido nucleico que são pelo menos 60%, mais preferencialmente 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% e muito preferencialmente pelo menos 95% idênticas às sequências de promotor como apresentado em qualquer uma de SEQ ID NOS: 1 a 4 . O promotor de ANXA5 como aqui definido é, deste modo, um promotor que é altamente homólogo às sequências de promotor como definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 4, ou na Figura 2 anexa e que é capaz de dirigir a expressão de 10 ΕΡ1819833Β1 ΑΝΧΑ5 em células, sendo estas células seleccionadas do grupo constituído por: HeLa, HEK293, HepG3 BeWo, trofoblastos de placenta, hepatócitos e células epiteliais de rim.

Outro aspecto importante da invenção refere-se às sequências regulatórias acima definidas ou utilizações de sequências regulatórias (compreendendo a substituição aqui definida) que hibridam com uma das sequências regulatórias da invenção acima descritas, de preferência à sua cadeia complementar, e compreende pelo menos uma das substituições proporcionadas na presente invenção. De preferência, a referida sequência de hibridação compreende, na sua cadeia complementar, pelo menos duas substituições como aqui proporcionado.

Estas sequências hibridação podem ser promotores como acima definido, ou elementos regulatórios que compreendem, em qualquer uma das cadeias complementares, uma substituição(s) como aqui definido. 0 termo "híbrida" como utilizado, refere-se a condições de hiridação convencionais, de preferência a condições de hibridação em que se utiliza 5xSSPE, SDS a 1%, lx solução de Denhardt como solução e/ou as temperaturas de hibridação são entre 35°C e 70°C, de preferência 65°C. Após hibridação, a lavagem é de preferência realizada primeiro com 2xSSC, SDS a 1% e subsequentemente com 0,2xSSC a temperaturas entre 35°C e 70°C, de preferência a 65°C (em relação à definição de SSPE, SSC e solução de Denhardt ver Sambrook, loc. cit.) . São particularmente preferidas condições de hibridação rigorosas como descrito, por exemplo, em Sambrook, supra. Condições de hibridação rigorosas particularmente definidas estão, por exemplo, presentes se a lavagem ocorrerem a 65°C, como 11 ΕΡ1819833Β1 indicado acima. Condições de hibridação não rigorosas, por exemplo com hibridação e lavagem realizadas a 45°C, são menos preferidas e a 35°C ainda menos.

Numa forma de realização particular preferida, a molécula de ácido nucleico da invenção está ligada de forma operacional a um gene que codifica para uma proteína marcadora, uma proteína de sinal ou um gene repórter. A invenção refere-se numa forma de realização ao referido gene marcador ou repórter a ser expresso sob o controlo das sequências regulatórias aqui descritas que são, e.g., proteínas fluorescentes (e.g. proteína fluorescente verde) ou proteínas que podem, directa ou indirectamente, levar a um sinal visível ou mensurável, quando expresso (e.g cloranfenicol acetiltransferase, beta-galactosidase).

Exemplos de genes marcadores ou repórteres que permitem que a actividade de expressão de sequências regulatórias, de preferência promotores, seja detectada, de preferência em células eucarióticas, estão descritos na literatura. Exemplos de genes repórter que codificam para luciferase, proteína fluorescente (verde/vermelho) e suas variantes, como eGFP (proteína fluorescente verde melhorada) , RFP (proteína fluorescente vermelha, tal como DsRed ou DsRed2), CFP (proteína fluorescente ciano), BFP (proteína fluorescente azul), YFP (proteína fluorescente amarela), β-galactosidase ou cloranfenicol acetiltransferase e semelhantes.

Por exemplo, a GFP pode ser de Aequorea victoria (patente U.S. No. 5491084). Um plasmídeo que codifica para a GFP de Aequorea victoria está disponível com o número de acesso da ATCC 87451. Outras formas mutadas desta GFP 12 ΕΡ1819833Β1 incluindo, mas não limitado a, pRSGFP, EGFP, RFP/DsRed, e EYFP, BFP, YFP, entre outros, estão comercialmente disponíveis de, inter alia, Clontech Laboratories, Inc. (Paio Alto, Califórnia). Por exemplo, a DsRed2 também está disponível da Clontech Laboratories, Inc. (Paio Alto, Califórnia); ver exemplos anexos. Também outras proteínas luminescentes podem ser expressas sob o controlo da sequência regulatória aqui proporcionada. Neste contexto, contempla-se uma sequência de nucleótidos que codifica, inter alia, para uma proteína da família de luciferase. A invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende a sequência regulatória da invenção e um gene sob o seu controlo, em que o referido gene codifica para um marcador. 0 referido marcador pode ser seleccionado do grupo constituído por His-Tag, glutationo, Strep-tag, Flagtag, CBP (péptido de ligação a Calmodulina) , TAG-100 (disponível da Quiagen), E2-tag (da proteína E2 transactivadora de papilomavírus tipo I de bovino) e Z-tag, mas não se limita a estes. Por exemplo, o marcador de ligação a quitina auto-clivável (e.g. do sistema IMPACT-CN), ou hemaglutinina de influenza (HA) pode ser utilizado de acordo com a presente invenção.

Consequentemente, a invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende a molécula de ácido nucleico que representa um promotor de ANXA5 como definido nas reivindicações e que compreende pelo menos uma substituição como aqui definido, estando a referida molécula de ácido nucleico da invenção ligada de forma operacional a uma sequência de molécula de ácido nucleico que é capaz de conferir a actividade de um gene repórter. Também é 13 ΕΡ1819833Β1 proporcionado, deste modo, uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção.

Portanto, a invenção também proporciona moléculas de ácido nucleico recombinantes, especificas, que compreendem a sequência regulatória aqui descrita. A referida molécula de ácido nucleico recombinante compreende as sequências regulatórias numa "forma isolada", de preferência em combinação com uma sequência de ácido nucleico heteróloga a ser expressa. Tal como aqui utilizado, o termo "isolada" quando utilizado em conjunção com moléculas de ácido nucleico/sequências regulatórias da presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um organismo numa forma substancialmente purificada (i.e. substancialmente isenta de outras substâncias provenientes desse organismo), ou uma molécula de ácido nucleico com a mesma sequência de nucleótidos, mas não necessariamente separada do organismo (i.e. moléculas de ácido nucleico sintetizadas ou produzidas de forma recombinante).

De preferência, e particularmente contemplado, as sequências regulatórias descritas na presente invenção estão ligadas de forma operacional a sequências de ácido nucleico heterólogas, adicionais, numa molécula de ácido nucleico recombinante. Como descrito em detalhe a seguir, a referida sequência de ácido nucleico adicional pode ser um gene codificante, bem como uma sequência de ácido nucleico que, por expressão, leva à produção de outras moléculas de ácido nucleico, tal como uma construção anti-sentido, uma ribozima ou semelhantes.

Tal como aqui utilizado, o termo "molécula de ácido nucleico heteróloga", significa uma molécula de ácido 14 ΕΡ1819833Β1 nucleico que está de preferência ligada de forma operacional à sequência regulatória descrita acima, mas não é uma molécula de ácido nucleico que codifica para anexina 5 ou um seu fragmento. Deste modo, a referida "molécula de ácido nucleico heteróloga" provém de um contexto genético diferente do da sequência regulatória descrita acima. Exemplos não limitantes destas "moléculas de ácido nucleico heterólogas" são dados a seguir e compreendem em particular moléculas marcadoras, como a luciferase, galactosidase, proteínas fluorescentes, GFP, eGFP, DsRed, etc. ou moléculas-marcadoras, como Flag-tags, CBP e outras. No entanto, também se contemplam outros genes repórter, proteínas de superfície. Também se contemplam moléculas de ácido nucleico que não codificam para proteínas, como "moléculas de ácido nucleico heterólogas". Estes ácidos nucleicos compreendem, mas não se limitam a, moléculas anti-sentido, aptâmeros, ribozimas, moléculas de ARN inibidoras e semelhantes, sendo particularmente úteis em investigação. 0 termo "molécula de ácido nucleico recombinante" refere-se a moléculas de ácido nucleico provenientes de um contexto genético diferente e combinadas por métodos de biologia molecular. Aqui, o termo "contexto genético diferente" refere-se a genomas de espécies, variedades ou indivíduos diferentes, ou posições diferentes num genoma. Moléculas de ácido nucleico recombinantes podem conter não só sequências naturais, mas também sequências que, comparadas com as naturais, são mutadas ou quimicamente modificadas, ou então, as sequências são todas sequências sintetizadas de novo.

As moléculas de ácido nucleico recombinantes da invenção apresentam uma ou mais das sequências regulatórias 15 ΕΡ1819833Β1 acima descritas em combinação com sequências de outro contexto genético. Um exemplo de uma molécula de ácido nucleico recombinante contém uma ou mais sequências regulatórias da invenção, ou um promotor mínimo derivado e obtido das sequências aqui descritas, em combinação com um gene diferente do gene de anexina A5, de preferência diferente do gene de anexina A5 humano. 0 termo "molécula de ácido nucleico recombinante", deste modo, não se refere a moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência codificante de anexina A5 sob o controlo das sequências regulatórias aqui proporcionadas.

Além disso, as moléculas de ácido nucleico recombinantes podem conter, além de um promotor que contém uma ou mais sequências regulatórias da invenção, uma sequência poliligante localizada a jusante desta e que compreende um ou mais sítios de restrição nos quais se podem clonar sequências de nucleótidos, por métodos conhecidos do perito na arte, ficando assim sob o controlo de expressão do promotor.

Adicionalmente, a molécula de ácido nucleico recombinante aqui descrita pode conter um sinal de terminação da transcrição a jusante do poliligante. Exemplos de sinais de terminação adequados estão descritos no estado da arte. 0 sinal de terminação pode, por exemplo, ser o sinal de poliadenilação de timidina cinase. As moléculas de ácido nucleico recombinantes aqui descritas que contêm de preferência uma sequência de nucleótidos a ser expressa, podem ser utilizadas directamente para utilizações dentro do contexto da invenção, tais como transfecções de ADN, produção de células hospedeiras geneticamente modificadas, ou animais transgénicos não humanos. Adicionalmente, as referidas 16 ΕΡ1819833Β1 moléculas recombinantes podem ser utilizadas em métodos de pesquisa aqui descritos, bem como em utilizações médicas e cientificas.

Como definido acima, a molécula de ácido nucleico da invenção pode ser ADN, ARN, bem como APN. Deste modo, de acordo com a presente invenção, o termo "molécula de ácido nucleico" compreende também qualquer derivado possivel de um ácido nucleico, com o qual pode hibridar uma sonda de ácido nucleico. A referida sonda de ácido nucleico pode ser, ela própria, um derivado de uma molécula de ácido nucleico capaz de hibridar com a referida molécula de ácido nucleico, ou o referido seu derivado. 0 termo "molécula de ácido nucleico" compreende também ácidos nucleicos de péptido (PNAs) contendo análogos de ADN com ligações de esqueleto de amida (Nielsen, Science 254 (1991), 1497-1500).

Também se proporciona no contexto da presente invenção um vector que compreende a molécula de ácido nucleico como definido nas reivindicações. O referido vector pode, inter alia, ser um vector de expressão, ou um vector de transferência de genes. O termo "vector" refere-se a moléculas de ácido nucleico circulares ou lineares que se podem replicar de forma autónoma em células hospedeiras, nas quais são introduzidas. Os vectores podem conter as moléculas de ácido nucleico recombinantes acima caracterizadas em todo o seu comprimento, ou podem conter, à parte das sequências regulatórias da invenção, os componentes descritos para as moléculas de ácido nucleico recombinantes, tais como um promotor minimo (compreendendo pelo menos um dos substitutos acima definidos), poliligante e/ou sinal de terminação. 17 ΕΡ1819833Β1

Os vectores da invenção podem ser adequados para replicação em células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas. Eles contêm uma origem de replicação correspondente. Os vectores são preferencialmente adequados para replicação em células de mamífero, particularmente de preferência em células humanas.

Os vectores da invenção contêm de preferência um marcador de selecção. Exemplos de marcadores de selecção são conhecidos do perito na arte. Os genes de marcadores de selecção que são adequados para selecção em células hospedeiras eucarióticas são, por exemplo, genes para a resistência a dihidrofolato reductase, G418 ou neomicina.

Os vectores da invenção são, de preferência, vectores de expressão para expressão em células eucarióticas. Estes vectores podem ser construídos começando com vectores de expressão conhecidos, por substituição do seu promotor, ou as sequências que não pertencem a um promotor mínimo com as sequências regulatórias da invenção, ou por suplementação com sequências regulatórias (elementos regulatórios) da presente invenção. Exemplos de vectores de expressão que podem ser modificados deste modo são pcDVl (Pharmacia), pRC/CMV, pcDNAl ou pcDNA3 (Invitrogen).

Também se proporciona um hospedeiro transformado com o vector, como aqui definido, em que o referido hospedeiro é de preferência seleccionado do grupo constituído por uma célula de mamífero, uma célula de anfíbio, uma célula de insecto, uma célula de fungo, uma célula de planta, e uma célula bacteriana. Exemplos não limitantes de células de mamífero são células HeLa, células HepG2, células CHO, células 293 e células COS, como mencionado a seguir. Células bacterianas 18 ΕΡ1819833Β1 adequadas são as que são geralmente utilizadas para clonagem, tais como E. coli ou Bacillus subtilis. Exemplos de células de fungos são células de levedura, de preferência as do género Saccharomyces ou Pichia, particularmente de preferência Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris. Células animais adequadas incluem, por exemplo, células de insecto, células de vertebrados, de preferência células de mamífero, tais como células CHO, C0S7, Hela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, K562, HepG2, 293- e semelhantes. No entanto, também se contemplam células primárias cultivadas, tais como trofoblastos de placenta, ou células primárias/culturas de células de rim ou fígado. Outras linhas celulares adequadas estão descritas na arte e podem, por exemplo, ser obtidas da Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig). Neste contexto, deve referir-se que as células hospedeiras podem ser transfectadas com uma sequência regulatória, uma sequência de ácido nucleico recombinante, ou um vector da invenção. Estas células transfectadas são particularmente úteis em métodos científicos para elucidar a função de um promotor de ANXA-5 e/ou ANXA5 expresso. No entanto, estas células podem ser utilizadas em sistemas de pesquisa, por exemplo pesquisas de elevada capacidade, em que os compostos são testados quanto à sua capacidade para activar ou silenciar a sequência regulatória da invenção, compreendendo pelo menos uma mutação como aqui definido.

Também se contempla na presente invenção um organismo transgénico não humano, que é um hospedeiros no sentido da presente invenção e que compreende uma molécula de ácido nucleico como definido nas reivindicações i.e. um promotor de anexina 5 compreendendo pelo menos uma mutação, como proporcionado na presente invenção. Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a uma 19 ΕΡ1819833Β1 célula/célula hospedeira geneticamente modificada que compreende a sequência regulatória de ANXA5 compreendendo pelo menos uma mutação como aqui definido, a molécula de ácido nucleico recombinante ou o vector como descrito acima. Também se proporciona um método(s) para preparar células hospedeiras geneticamente modificadas, caracterizado por as células hospedeiras serem transfectadas com um dos vectores acima descritos e a célula hospedeira transfectada ser cultivada num meio de cultura. 0 termo meio "geneticamente modificado" significa que a célula hospedeira ou o hospedeiro contém, além do genoma natural, uma molécula de ácido nucleico ou um vector da presente invenção, que foi introduzido na célula hospedeira, ou no hospedeiro, ou num precursor. A molécula de ácido nucleico ou o vector pode estar presente na célula hospedeira/hospedeiro geneticamente modificado quer como uma molécula independente fora do genoma, de preferência como molécula replicável, ou pode ser integrada de forma estável no genoma da célula hospedeira ou hospedeiro. A introdução de um vector em células hospedeiras pode ser realizada de acordo com métodos convencionais conhecidos, como por exemplo descrito em Sambrook (Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1989), ou Higgins e Hames (Eds.)). Exemplos de técnicas de transfecção aplicáveis são a transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por dextrano DEAE, electroporação, transdução, infecção, lipofecção ou transferência biolistica. 20 ΕΡ1819833Β1

Numa forma de realização preferida a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada seleccionada do grupo constituído pelo haplotipo Ml e M2, em que o haplotipo Ml compreende uma sequência, como apresentado na SEQ ID NO: 2 e em que a referida sequência tem na posição 203 uma substituição de A para C e na posição 229 uma substituição de T para C e em que o haplotipo M2 compreende uma sequência como apresentado na SEQ ID NO: 2 e em que a referida sequência tem na posição 186 uma substituição de G para A, na posição 203 uma substituição de A para C, na posição 229 uma substituição de T para C e na posição 276 uma substituição de G para A. A definição do haplotipo "Ml" bem como "M2" também é dada nos exemplos anexos. O haplotipo "Ml" e "M2" também se refere a mutações pontuais específicas aqui proporcionadas e caracterizadas em qualquer das outras estruturas de promotor de ANXA5 proporcionadas em qualquer das sequências SEQ ID NOS: 1, 3 ou 4, ou como apresentado na Figura 2 anexa. Deste modo, a invenção também proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada seleccionada do grupo constituído pelo haplotipo Ml e M2, em que o referido haplotipo Ml compreende uma mutação pontual definida como 1 A -► C e uma mutação pontual definida como 27 I -> C, e em que o referido haplotipo M2 compreende todas as quatro mutações pontuais como aqui definido, i.e. as mutações de adição - 19 G -► A e 76 G -► A.

Também se descreve um método para a haplotipagem de um elemento de regulação de um gene ANXA5 num indivíduo que compreende os passos de (a) isolar um ácido nucleico de uma amostra que foi removido do indivíduo; 21 ΕΡ1819833Β1 (b) determinar a presença dos nucleótidos presentes nas posições 186, 203, 229 e 27 6 da cópia do elemento de regulação do gene ANXA5 do indivíduo, em gue os números de posição são determinados por comparação com a SEQ ID NO: 2; (c) atribuir aos indivíduos um haplotipo particular por comparação dos nucleótidos presentes nas referidas posições com os nucleótidos referidos nos haplotipos definidos como "Ml" ou "M2" agui acima.

Para utilização médica, os métodos in vitro para diagnosticar são particularmente importantes. A presente invenção proporciona ferramentas importantes, com as guais se podem detectar "variantes genéticas" específicas da região promotora de ANXA5 e em que a referida detecção é indicativa de um maior risco de perda gestacional/aborto e/ou um risco elevado de desenvolver anticorpos antifosfolípido. A presença de anticorpos antifosfolípido na circulação da mãe está associada com maior risco de perda fetal em ambas, gravidez de baixo risco e gravidez de alto risco, como documentado em, inter alia, Empson (2002).

Sem estar ligado a teoria, a presente invenção argumenta que a expressão do gene ANX A5 reduzida, documentada, devido à variação alélica, aqui documentada, na sua sequência de promotor, poderá ser uma causa directa para um menor enriquecimento de anexina A5 na superfície plancentar e é muito provável que provoque o desenvolvimento de anticorpos antifosfolípido.

Portanto, a invenção também proporciona um método in vitro para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição 22 ΕΡ1819833Β1 para, ou uma tendência para perda gestacional (aborto) e/ou o desenvolvimento de anticorpos antifosfolipido, em que o referido método compreende os passos de (a) examinar um elemento de regulação do gene ANXA5 para detectar pelo menos uma mutação pontual/substituição como definido nas reivindicações; e (b) determinar se qualquer uma das pelo menos uma das referidas mutações pontuais está presente. 0 método correspondente in vitro pode ser realizado por métodos conhecidos na arte, como aqui descrito e documentado nos exemplos anexos.

Como se pode ver nos exemplos, o pedido descreve um método in vitro para o diagnóstico ou detecção da predisposição para, ou tendência para perda gestacional (aborto), em que o referido método compreende os passos de (a) fazer a haplotipagem de um indivíduo de acordo com os métodos aqui proporcionados; (b) determinar se o referido indivíduo tem um haplotipo "Ml" ou "M2" como aqui definido, ou um haplotipo "normal"/"do tipo selvagem" "N", em que o haplotipo N não compreende uma mutação pontual/substituição, como definido na invenção. (c) determinar se o referido indivíduo tem um genótipo N/N, Ml/N, M2/N, Ml/Ml, M2/M2 ou M1/M2. 23 ΕΡ1819833Β1 0 método correspondente também é útil no diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou tendência para desenvolver anticorpos antifosfolipido.

Como se mostra nos exemplos, um indivíduo "heterogéneo" ou "homogéneo", i.e. um indivíduo que tem um "genótipo" M2/N, M2/M2 ou M1/M2 tem um risco mais elevado, particular, de perda gestacional e deverá ter acompanhamento e supervisão médica durante a gravidez. 0 perito na arte também pode determinar os outros haplotipos, como Ml/N ou Ml/Ml de modo a tomar medidas específicas no cuidado e supervisão médica, mesmo que o "haplotipo-Ml" esteja associado com um risco menor, ou mesmo normal, de perda gestacional em comparação com o "haplotipo M2". Como referido acima, a detecção de pelo menos uma mutação pontual como aqui descrito, ou de um haplotipo como aqui descrito pode ser realizada por métodos convencionais, conhecidos na arte. Por exemplo, a detecção da referida pelo menos uma mutação pontual no referido elemento de regulação do gene ANXA5, ou a referida haplotipagem pode ser realizada ou determinada por técnicas de ácido nucleico baseadas no tamanho ou sequência. A referida técnica baseada no tamanho ou sequência pode ser seleccionada de entre os grupos constituídos por técnicas de hibridação, sequenciação de ácidos nucleicos, PCR, determinação de fragmentos de restrição, determinação de polimorfismo de nucleótidos individuais (SNPs)-, LCR (reacção em cadeia de ligação) ou determinação do polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição (RFLP)-. Exemplos correspondentes e outros detalhes podem ser obtidos a partir da literatura técnica convencional (como Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in 24 ΕΡ1819833Β1

Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), ou Higgins and Hames (Eds.))· Como documentado nos exemplos anexos, um método particularmente preferido no contexto da presente invenção é a determinação de fragmentos de restrição ou o método RFLP, particularmente de preferência compreendendo a determinação de um sitio de restrição de BamHI. Como se mostra aqui, a ausência (BamHI ), ou presença (BamHI +) de um sitio de restrição de BamHI é determinada, e é indicativa da ausência ou presença de uma mutação pontual, como aqui definido. Detalhes deste método são dados nos exemplos anexos e a seguir. Numa forma de realização, uma porção de ADN relevante pode ser amplificada a partir de ADN genómico por tecnologia de PCR. Os iniciadore4s potenciais a ser utilizados compreendem, mas não se limitam a, iniciadores como descrito na SEQ ID NO: 22 (ANX5.P.F) e SEQ ID NO: 23 (ANX5. exl. R) . 0 perito na arte está em posição de facilmente deduzir outros pares de iniciadores ou iniciadores a ser utilizados de modo a amplificar porções relevantes do elemento de regulação/promotor de anexina A5 (ANXA5) aqui definido. Após o amplicão ser obtido (ver também a parte experimental) ele pode ser digerido (digestão de restrição) com a enzima de restrição BamHI (que pode ser obtida de vários fornecedores, inter alia: Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha; MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha; New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemanha. Mais uma vez, são dados detalhes na parte experimental. Após esta digestão, a ser realizada de acordo com métodos bem conhecidos na arte (ver inter alia Sambrook/Russel, 2001, (log.cit.)), pode ser feita outra análise do sítio de restrição de BamHI /BamHI + por técnicas conhecidas, como análise em gel, e.g. análise em gel de agarose (ver também a parte experimental e, de forma ilustrativa, a figura 4 anexa). 25 ΕΡ1819833Β1

Numa forma de realização preferida das utilizações e métodos da invenção o referido sítio de restrição BamHI é o sítio de restrição correspondente aos nucleótidos 276 a nucleótidos 281 de SEQ ID NO: 2; aos nucleótidos 1349 a nucleótidos 1354 de SEQ ID NO: 1; aos nucleótidos 337 a nucleótidos 342 de SEQ ID NO: 3 ou corresponde aos nucleótidos 284 a 289 de SEQ ID NO: 4. A ausência do referido sitio de restrição BamHI (BamHI “) é indicativa de uma predisposição para perda gestacional, como já mostrado nos exemplos anexos.

Os métodos in vitro da invenção podem também compreender a detecção da referida pelo menos uma mutação pontual aqui descrita, ou a referida haplotipagem como aqui descrito, em que se utilizam iniciadores de PCR (reacção em cadeia com polimerase) adequados. Por exemplo, (a) uma mutação pontual correspondente à substituição definida aqui como -19 G -► A pode compreender a utilização de um iniciador directo, como definido na SEQ ID NO: 8 ou 9 e um iniciador inverso, como definido na SEQ ID NO: 10 (ou SEQ ID NO: 13); (b) uma mutação pontual correspondente à substituição definida aqui como 1 A -> C pode compreender a utilização de um iniciador directo, como definido na SEQ ID NO: 11 ou 12 e um iniciador inverso, como definido na SEQ ID NO: 13 (ou SEQ ID NO: 10); (c) uma mutação pontual correspondente à substituição definida aqui como 27 T -» C pode compreender a utilização de um iniciador directo, como definido na 26 ΕΡ1819833Β1 SEQ ID NO: 14 ou 15 e um iniciador inverso, como definido na SEQ ID NO: 16 (ou SEQ ID NO: 7); e (d) uma mutação pontual correspondente à substituição definida aqui como 7 6 G -> A pode compreender a utilização de um iniciador directo, como definido na SEQ ID NO: 5 ou 6 e um iniciador inverso, como definido na SEQ ID NO: 7 (ou SEQ ID NO: 16).

Também a haplotipagem como acima descrito pode ser realizada utilizando iniciadores (e.g. em reacções de PCR e semelhantes. De preferência, a referida haplotipagem compreende a utilização de iniciadores como se mostra nas SEQ ID NOS: 5 a 16.

Numa forma de realização particularmente preferida da invenção, determina-se a ausência ou presença de uma mutação pontual/substituição correspondente à posição 276 de um elemento de regulação do gene ANXA5 como apresentado na SEQ ID NO: 2, sendo a referida mutação pontual/substituição de preferência uma substituição de G para A.

Como se mostra nos exemplos, os métodos in vitro aqui proporcionados são muito preferencialmente realizados em ADN genómico e o referido ADN genómico é isolado de uma amostra biológica. A amostra biológica pode ser, sem limitação, seleccionada do grupo constituído por sangue, soro, urina, fluido amniótico, secreções vaginais, aspirados de mamilo, expectoração e amostras de epitélio mucoso. 27 ΕΡ1819833Β1 A presente invenção é particularmente útil para monitorizar a mulher grávida, ou a mulher que pretende engravidar. Uma vez que os métodos da presente invenção podem ser realizados em ADN genómico da referida mulher, podem-se obter facilmente as amostras correspondentes, e.g. por esfregaços bucais. A invenção também proporciona um kit que compreende pelo menos um par de iniciadores como acima definido. 0 referido kit é particularmente útil na preparação de uma composição para o diagnóstico, ou para detectar uma predisposição para, ou uma tendência para perda gestacional, e/ou para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou uma tendência para desenvolver anticorpos antifosfolipido.

Consequentemente, a invenção também se refere à utilização de pelo menos um par de iniciadores, como aqui definido, para a preparação de uma composição de diagnóstico para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou tendência para perda gestacional e/ou para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição para o desenvolvimento de anticorpos antifosfolipido.

Proporciona-se ainda a utilização de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma mutação pontual como aqui definido, para a preparação de uma composição de diagnóstico para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou uma tendência para perda gestacional e/ou para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou tendência para desenvolver anticorpos antifosfolipido. A referida molécula de ácido nucleico é particularmente útil em métodos de diagnóstico como marcador 28 ΕΡ1819833Β1 comparativo e/ou padrão, compreendendo pelo menos uma mutação definida como aqui descrito.

Descrevem-se na presente invenção meios e métodos para pesquisar, em particular, ADN genómico, quanto à presença ou ausência de mutações pontuais especificas no elemento de regulação do gene ANXA5. Deste modo, também se proporciona um método para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou tendência para perda gestacional num indivíduo e/ou um método para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou uma tendência para desenvolver anticorpos antifosfolípido que compreende o passo de determinar se o referido indivíduo tem pelo menos uma das pelo menos uma mutação pontual/substituição como aqui definido, nomeadamente, a substituição -19 G^A, a 1 A -► C, a 27 T C e/ou a 76 G -► A. 0 referido método para o diagnóstico ou detecção pode compreender os métodos in vitro para detectar uma mutação pontual, como descrito acima. 0 método de diagnóstico é muito preferencialmente utilizado na pesquisa de mulheres grávidas, ou que pretendem engravidar. Os métodos e análises correspondentes dos resultados obtidos são proporcionados nos exemplos anexos, não limitativos.

Numa outra forma de realização da presente invenção, proporciona-se um método de pesquisa para moléculas que são capazes de interagir com um elemento de regulação do gene ANXA5 mutado, como definido acima, compreendendo os passos de (a) contactar uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma mutação no elemento regulatório do gene ANXA5 como aqui proporcionado, ou 29 ΕΡ1819833Β1 contactar um vector ou um hospedeiro compreendendo esta molécula de ácido nucleico com uma molécula candidata; (b) medir e/ou detector uma resposta; e (c) comparar a referida resposta com uma resposta convencional, como medido na ausência da referida molécula candidata; e (d) comparar a referida resposta com uma resposta obtida com a referida molécula candidata e o promotor ANXA5 não mutado (tipo selvagem).

No método de pesquisa proporcionado para moléculas interactivas, as moléculas de ácido nucleico acima definidas que compreendem um elemento regulatório do gene como aqui definido (e que compreendem pelo menos uma mutação como descrito na invenção) e que estão ligadas de forma operacional a um gene repórter e/ou marcador são particularmente úteis. Os compostos a ser pesquisados são pesquisados quanto à interacção directa ou indirecta da sequência regulatória aqui proporcionada. 0 referido "contacto" pode ser realizado in vivo, bem como in vitro. É contemplado, e.g. que o referido animal transgénico seja contactado in vivo com o composto/candidatos a ser testados. 0(s) referido(s) composto(s) pode(m), inter alia, ser injectado no referido animal, por exemplo, por injecção inter-cerebral/inter-craniana. De igual modo, as células transfectadas com uma molécula de ácido nucleico recombinante como aqui descrito, podem ser contactadas in vitro com os compostos a ser testados, por exemplo introduzindo os compostos de teste no meio de cultura. 30 ΕΡ1819833Β1

Detectar se o(s) composto (s) é capaz de interagir com a sequência regulatória da invenção pode envolver detectar se a sequência regulatória é activada. Um bom sistema celular a ser utilizado de modo a determinar se a sequência regulatória do gene ANXA5 mutada está activa pode ser seleccionado do grupo constituído por células HeLa, HEK293, HepG2, BeWo, células de rim e semelhantes. A resposta obtida quando se pesquisa um composto que interage com a sequência regulatória do gene ANXA5 mutado pode ser comparada com uma resposta obtida com o mesmo composto a ser pesquisado e utilizando uma sequência regulatória do gene ANXA5 não mutada, do "tipo selvagem". 0 termo "contactar uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção com (a) um composto(s) que se suspeita que interage directa ou indirectamente com a referida sequência regulatória" pode compreender testes de interacção. Estes testes podem ser realizados por ensaios imunológicos, bioquímicos e/ou genéticos específicos, que são conhecidos na arte e compreendem ensaios homogéneos e heterogéneos. Por exemplo, no método da presente invenção, os ensaios de interacção a ser utilizados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para detectar como resposta a interacção directa ou indirecta da sequência regulatória com a molécula candidata. Os referidos ensaios de interacção que utilizam sistema de leitura são bem conhecidos na arte e compreendem, inter alia, pesquisas de dois híbridos, (como descrito, inter alia, em EP-0 963 376, WO 98/25947, WO 00/02911 e modificados para a detecção de parceiros de interacção para as sequências regulatórias da invenção) , colunas GST-pull-down, ensaios de co-precipitação de extractos celulares, como descrito, inter alia, em Kasus-Jacobi, Oncogene 19 (2000), 2052-2059, sistemas de 31 ΕΡ1819833Β1 "interacção-armadilha" (como descrito, inter alia, na US 6004746), ensaios de ligação in vitro e semelhantes. Outros métodos de ensaio de interacção e sistemas de leitura correspondentes são, inter alia, descritos na US 5525490, WO 99/51741, WO 00/17221, WO 00/14271, WO 00/05410. Têm particular relevância de acordo com a presente invenção os ensaios de interacção que compreendem métodos bioquimicos/genéticos como, e.g., ensaios de desvio de bandas que são utilizados para deduzir, inter alia, compostos proteicos capazes de interagir com sequências regulatórias/promotores, em particular com promotores que compreendem pelo menos uma mutação como aqui proporcionado.

Adicionalmente, o método acima referido para a pesquisa de compostos capazes de regular o promotor de ANXA5 e em particular um promotor de ANXA5 que compreende pelo menos uma mutação como aqui definido, pode compreender a pesquisa de substâncias que são capazes de induzir um programa de diferenciação e/ou expressão de genes numa célula de teste/hospedeira, compreendendo a sequência regulatória da presente invenção. Os referidos métodos de pesquisa podem também compreender a pesquisa de compostos que activam, directa ou indirectamente, a sequência regulatória mutada de ANXA5, como aqui definido. Deste modo, a presente invenção também proporciona métodos de pesquisa de fármacos, em que estes fármacos podem ser úteis no tratamento ou prevenção de distúrbios relativos a perda gestacional/aborto e/ou ao desenvolvimento de anticorpos antifosfolipido.

Um agente é, deste modo, capaz de "interagir com a sequência regulatória" da presente invenção, quando uma leitura correspondente pontua positiva ou negativamente. Por exemplo, um agente candidato pode provocar a expressão de um 32 ΕΡ1819833Β1 gene marcador ou repórter, como eGFP, DsRed ou GFP sob o controlo da sequência regulatória de ANXA5 mutada, aqui descrita. Neste caso, o composto candidato interagiu, quer directa, quer indirectamente, com a referida sequência regulatória. Uma interacção directa é, inter alia, contemplada a partir de um factor de transcrição especifico capaz de se ligar à sequência regulatória mutada da invenção e de desencadear a transcrição. Um exemplo de interacção directa do composto candidato compreende, mas não se limita ao envolvimento de uma via de transdução de sinal. A comparação acima referida entre a resposta por contacto da sequência regulatória mutada da invenção com a referida molécula candidata e a resposta convencional, tal como medido na ausência da referida molécula candidata em comparação com uma sequência regulatória do gene ANXA5 não mutado (tipo selvagem), pode proporcionar a presença, ausência, diminuição ou aumento de um sinal específico, num sistema de leitura. 0 referido sistema de leitura, como aqui descrito, pode ser, e.g., um sistema de leitura bioquímico ou fisiológico. Os sistemas de leitura genéticos também são contemplados. Um sinal especifico que está aumentado em relação ao sinal/resposta convencional pode, assim, ser classificado como activador da sequência regulatória de ANXA5 mutada aqui proporcionada, enquanto que um sinal diminuído pode ser classificado como sendo de diagnóstico para um inibidor da função ou expressão da sequência regulatória de ANXA5. invenção, de ácido sequência fragmento

Também tem utilidade particular na presente um fragmento de ácido nucleico das moléculas nucleico como acima definido, nomeadamente uma regulatória de ANXA5 mutado, em que o referido 33 ΕΡ1819833Β1 compreende pelo menos 15 nucleótidos e em que o referido fragmento compreende pelo menos uma mutação/substituição pontual como aqui definido. 0 referido fragmento de ácido nucleico pode ser particularmente útil em métodos de pesquisa aqui proporcionados. São igualmente úteis, oligómeros que consistem de pelo menos uma sequência e com um comprimento de pelo menos 20 nucleótidos, que é capaz de hibridar especificamente com uma molécula de ácido nucleico como definido nas reivindicações, i.e. uma sequência regulatória de ANXA5 mutada que compreende pelo menos uma mutação, como aqui definido. 0 referido oligómero deverá ser capaz de hibridar com fragmentos de ácido nucleico que compreendem pelo menos 15 nucleótidos e compreendem pelo menos uma mutação pontual, como aqui definido.

Portanto, a invenção também proporciona um oligómero que consiste essencialmente de pelo menos uma sequência de bases e com um comprimento de pelo menos 10 nucleótidos, que híbrida, ou é capaz de hibridar com fragmentos de ácido nucleico como acima definido e que compreendem pelo menos uma mutação pontual, como aqui proporcionado. Um exemplo específico deste oligómero é, ou compreende, a sequência de ácidos nucleicos como apresentado na SEQ ID NO: 21. Os oligómeros aqui descritos podem ser, inter alia, um oligonucleótido ou um oligómero de ácido nucleico de péptido (PNA) .

Também se inclui na presente invenção um conjunto de oligómeros como aqui definido. Os referidos oligómeros e/ou referido conjunto de oligómeros são particularmente úteis nos 34 ΕΡ1819833Β1 métodos de pesquisa, bem como nas utilizações de diagnóstico aqui proporcionadas.

Portanto, a invenção também se refere à utilização de um oligonucleótido/oligómero como acima definido, ou a um conjunto de oligómeros aqui proporcionado, para a detecção de uma mutação pontual/substituição como definido na presente invenção, ou para a detecção de polimorfismos de nucleótido individuais (SNPs) em sequências retiradas de SEQ ID NOS: 1, 2, 3 ou 4.

Os oligómeros aqui proporcionados e capazes de interagir com moléculas de ácido nucleico que compreendem pelo menos uma mutação pontual como aqui proporcionado podem também ser úteis em pesquisas de elevada capacidade (HTPs). Deste modo, estes oligómeros podem também ser utilizados na produção da "análise do gene" ou "chips de genes". A invenção também proporciona um método para o fabrico de um arranjo de oligómeros diferentes (série), fixados a um material transportador, em que o referido método compreende o acoplamento de pelo menos um oligómero, ou um conjunto de oligómeros como aqui definido, numa fase sólida. Também se inclui um arranjo de oligómeros (série) que pode ser obtido pelo método de fabrico como discutido acima. A preparação de séries é bem conhecida na arte. Uma revisão sobre a arte anterior de fabrico de séries de oligómeros pode ser obtida da edição especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, Janeiro de 1999), publicada em Janeiro de 1999, e da literatura aí citada. 35 ΕΡ1819833Β1

As sondas marcadas com fluorescência são muitas vezes utilizadas para pesquisa de séries de ADN imobilizadas. A ligação simples de corantes de Cy3 e Cy5 ao 5'-OH da sonda especifica é particularmente adequada para marcadores de fluorescência. A detecção da fluorescência das sondas hibridadas pode ser realizada, por exemplo, por microscópio confocal. Os corantes Cy3 e Cy5, além de muitos outros, estão comercialmente disponíveis.

De acordo com a presente invenção, é preferido que um arranjo de oligonucleótidos diferentes e/ou oligómeros PNA (uma designada "série"), disponibilizado pela presente invenção, esteja presente de modo a que esteja igualmente ligado a uma fase sólida. Esta série de oligonucleótidos e/ou sequências de oligómeros de PNA diferentes pode ser caracterizada por estar organizada na fase sólida na forma de uma malha rectangular ou hexagonal. A superfície de fase sólida é de preferência composta por silício, vidro, poliestireno, alumínio, aço, ferro, cobre, níquel, prata ou ouro. No entanto, a nitrocelulose, bem como plásticos, tais como nylon, que podem existir na forma de sedimentos ou também como matrizes de resina, são alternativas adequadas.

Portanto, outro assunto objecto da presente invenção é um método para o fabrico de uma série fixada a um material transportador para o tratamento melhorado e monitorização de distúrbios de proliferação de células da mama. No referido método, pelo menos um oligómero de acordo com a presente invenção é acoplado a uma fase sólida. Os métodos para o fabrico destas séries são conhecidos, por exemplo da patente US 5744305, por meio de química de fase sólida e grupos protectores fotolábeis. 36 ΕΡ1819833Β1

Outro objecto da presente invenção refere-se a um chip de ADN para o tratamento melhorado e monitorização da mulher grávida, ou mulher a ser monitorizada quanto a uma potencial gravidez. 0 chip de ADN contém pelo menos um ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Os chips de ADN são conhecidos, por exemplo, da patente US 5837832.

Além disso, um assunto objecto da presente invenção é um kit que pode ser composto, por exemplo, por um conjunto de oligonucleótidos iniciadores contendo pelo menos dois oligonucleótidos cujas sequências em cada caso correspondem a, ou são complementares a um segmento de pelo menos 10, de preferência pelo menos 18 pares de bases de comprimento das sequências de bases especificadas nas SEQ ID NOs: 1 a 4 que compreendem pelo menos uma mutação, como aqui proporcionado.

Os métodos e ensaios acima citados são preferencialmente utilizados na pesquisa de ADN genómico. O ADN genómico é obtido a partir do ADN de células, tecido ou outras amostras de teste, utilizando métodos convencionais. Esta metodologia convencional é encontrada em referências como Fritsch e Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. A presente invenção proporciona métodos e ácidos nucleicos para a análise de amostras biológicas quanto a caracteristicas associadas com o desenvolvimento de anticorpos antifosfolipido e/ou o prognóstico de perda gestacional/aborto. A invenção é caracterizada por o ácido nucleico suspeito de compreender pelo menos uma mutação como aqui proporcionado ser contactado com um reagente, ou uma série de reagentes capazes de distinguir entre um ácido nucleico que compreende a referida mutação(s) e uma sequência 37 ΕΡ1819833Β1 promotora de ANXA5 do tipo selvagem, dentro da sequência genómica (ou numa parte da referida sequência genómica) de interesse. A presente invenção disponibiliza um método para determinar parâmetros genéticos de ADN genómico. 0 método é para ser utilizado para determinar o prognóstico de uma perda gestacional/aborto potencial. A invenção apresenta melhorias em relação ao estado da arte, na medida em que por meio dos métodos e compostos aqui descritos um perito na arte pode realizar um ensaio de detecção sensível e específico da matéria celular, compreendendo as mutações específicas aqui proporcionadas. Isto é particularmente útil uma vez que permite a análise de amostras de, e.g., fluidos corporais. A informação gerada é útil na selecção de um tratamento ou uma monitorização do paciente. Se uma mutação como aqui proporcionado é determinada, poderá ser necessário outro tratamento. A maioria das técnicas aqui proporcionadas baseia-se em métodos de biologia molecular conhecidos e compreende a utilização de sondas e/ou iniciadores específicos que são capazes de detectar/amplificar moléculas de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma mutação, como aqui definido.

Numa forma de realização preferida, os referidos métodos são obtidos contactando as sequências de ácido nucleico numa amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, com pelo menos um reagente ou uma série de reagentes, em que o referido reagente ou série de reagentes, distingue entre sequências regulatórias do gene ANXA5 do tipo selvagem e uma sequência regulatória do gene ANXA5 compreendendo pelo menos uma mutação, como definido na presente invenção. 38 ΕΡ1819833Β1

Numa forma de realização, o método compreende os seguintes passos:

No primeiro passo do método, a amostra de ADN genómico é isolada de fontes, tais como células ou componentes celulares que contêm ADN, fontes de ADN que compreendem, por exemplo, tecido dos ovários, tecido da mama, bem como sangue, plasma, expectoração, fluido linfático, tecido linfático, células do dueto, fluido de lavagem do dueto, fluido de aspiração de mamilo e suas combinações. Também se prevêem sondas derivadas de esfregaços bucais. A extraeção pode ser feita por meios que são convencionais para os peritos na arte, em que estes incluem a utilização de lisados de detergente, sonificação e agitação num vórtex com pérolas de vidro. Uma vez extraídos os ácidos nucleicos utiliza-se o ADN de cadeia dupla, genómico, na análise.

Os detalhes dos métodos correspondentes da presente invenção são dados nos exemplos anexos.

Numa forma de realização, o ADN pode ser clivado antes do passo seguinte do método, o que pode ser realizado por meios convencionais na arte, em particular, mas não se limitando a endonucleases de restrição. Os exemplos anexos proporcionam uma técnica em que se utiliza BamHl para detectar pelo menos uma mutação pontual como aqui definido.

Adicionalmente, são contemplados métodos de PCR, como acima referido. Amplificam-se fragmentos (e.g. fragmentos compreendendo de preferência cerca de 100 bp ou muito preferencialmente pelo menos 50 bp) do ADN genómico, utilizando conjuntos de oligonucleótidos iniciadores e uma 39 ΕΡ1819833Β1 polimerase, preferencialmente estável ao calor. Devido a considerações estatísticas e práticas, de preferência são amplificados mais do que seis fragmentos diferentes com um comprimento de 50 - 2000 pares de bases (pb) . No entanto, podem-se amplificar fragmentos de pelo menos 50 bp. A amplificação de vários segmentos de ADN pode ser realizada em simultâneo, num mesmo vaso reaccional. Normalmente, a amplificação é realizada por meio de reacção em cadeia com polimerase (PCR). Mais uma vez, os exemplos correspondentes são dados na parte experimental. A concepção destes iniciadores é conhecida do perito na arte. Estes deverão incluir pelo menos dois oligonucleótidos cujas sequências são, cada uma, inversamente complementares ou idênticas a um segmento de pelo menos 18 pares de bases de comprimento, das seguintes sequências de bases especificadas no apêndice: SEQ ID NO 1 a 4 e compreendendo pelo menos uma mutação como aqui proporcionado. Os referidos iniciadores de oligonucleótidos são preferencialmente caracterizados por serem capazes de detectar pelo menos uma mutação, como aqui proporcionado. Numa forma de realização do método particularmente preferida, a sequência dos referidos iniciadores de oligonucleótidos é concebida de modo a fundir selectivamente com, e amplificar, apenas o ADN de interesse, específico (compreendendo a referida pelo menos uma mutação), minimizando deste modo a amplificação de fundo, ou o ADN não relevante. No contexto da presente invenção, o ADN de fundo designa ADN genómico que não tem uma mutação relevante na região promotora de ANXA5, ou que não está relacionado com o promotor de ANXA5. Os iniciadores preferidos são dados nos exemplos anexos e compreendem, inter alia, os iniciadores como apresentado nas SEQ ID NO: 5 to 16. 40 ΕΡ1819833Β1

De acordo com a presente invenção, também se contempla que pelo menos um iniciador de oligonucleótido seja ligado a uma fase sólida, durante a amplificação. As sequências de oligonucleótido e/ou oligómero-PNA diferentes podem ser organizadas numa fase sólida plana, na forma de uma malha rectangular ou hexagonal, sendo a superfície de fase sólida preferencialmente composta de silício, vidro, poliestireno, alumínio, aço, ferro, cobre, níquel, prata ou ouro, sendo possível utilizar também outros materiais, tais como nitrocelulose ou plásticos.

Os fragmentos obtidos por meio de amplificação podem utilizar um marcador detectável, directa ou indirectamente. São preferidos marcadores na forma de marcadores fluorescentes, radionuclidos ou fragmentos de molécula destacáveis com uma massa típica que pode ser detectada num espectrómetro de massa.

No passo seguinte, os ácidos nucleicos amplificados são analisados de modo a determinar o estado da mutação do ADN genómico.

Numa forma de realização dos métodos aqui revelados, o estado de mutação do promotor de ANXA5 pode ser determinado por meio de análise de hibridação. Nesta forma de realização, as moléculas amplificadas são, inter alia, hibridadas com uma série ou conjunto de oligonucleótidos e/ou sondas de PNA. Neste contexto, a hibridação pode ocorrer do modo descrito a seguir. 0 conjunto de sondas utilizadas durante a hibridação é de preferência composto por pelo menos 4 oligonucleótidos ou oligómeros de PNA. No processo, as moléculas amplificadas 41 ΕΡ1819833Β1 servem como sondas que hibridam com oligonucleótidos previamente ligados a uma fase sólida. Os fragmentos não hibridados são subsequentemente removidos. Os referidos oligonucleótidos contêm pelo menos uma sequência de bases com um comprimento de 10 nucleótidos que é inversamente complementar, ou idêntica a um segmento da molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma mutação como aqui definido, a um fragmento da referida molécula de ácido nucleico, em que o referido fragmento compreende pelo menos uma mutação como aqui definido, ou em que o referido fragmento se refere a um fragmento do promotor de ANXA5.

As moléculas amplificadas não hibridadas são em seguida removidas. No passo final do método, as moléculas amplificadas hibridadas são detectadas. Neste contexto, é preferido que os marcadores ligados às moléculas amplificadas sejam identificáveis em cada posição da fase sólida, na qual está localizada uma sequência de nucleótidos.

Numa forma de realização preferida do método, o estado da mutação do promotor de ANXA5 pode ser determinado por meio de sondas de oligonucleótido que são hibridadas com o ADN tratado, ao mesmo tempo com os iniciadores de amplificação por PCR.

Uma forma de realização particularmente preferida deste método é a utilização de PCR quantitativa em tempo real baseada em fluorescência (Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996) que utiliza uma sonda de oligonucleótido fluorescente de marcação dupla (TaqMan™ PCR, utilizando um sistema de detecção de sequência ABI Prism 7700, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). A reacção de PCR TaqMan™ utiliza um oligonucleótido de pesquisa, não 42 ΕΡ1819833Β1 extensível, designado por sonda TaqMan™ que é concebido para hibridar com uma sequência rica em GpC, localizada entre os iniciadores de amplificação directo e inverso. A sonda TaqMan™ compreende também uma "porção repórter" fluorescente e uma "porção neutralizadora" ligada de forma covalente a porções ligantes (e.g., fosforamidites) ligadas aos nucleótidos do oligonucleótido TaqMan™.

As sondas de oligómero, bem como os iniciadores de acordo com a presente invenção, constituem ferramentas importantes e eficazes que, pela primeira vez, tornam possível determinar parâmetros específicos durante a análise e monitorização da gravidez humana. Os referidos oligonucleótidos permitem o tratamento e monitorização melhorados de mulheres em perigo de perda de gestacional/aborto.

As Figuras mostram:

Figura 1 - Cromatogramas de sequência de variantes alélicas do promotor de ANXA5 Bam Hl. N/N = tipo selvagem, M/N = heterozigoto, M/M = homozigoto para o alelo BamHI.

Figura 2 - Estrutura da região promotora nuclear de ANXA5. As fronteiras da região estão marcadas com barras verticais e são numeradas de acordo com a posição do primeiro ponto de partida da transcrição (tspl) . 0 exão 1 não traduzido está sombreado a cinzento. Os consensos do factor de transcrição estão em minúsculas e as abreviaturas de factores de transcrição correspondentes estão em itálico, sobre as linhas das sequências. Os sítios de 43 ΕΡ1819833Β1 restrição Notl e BamHI estão a sublinhado e a sequência da porção de Z-ADN no promotor está em itálico. Os nucleótidos que marcam pontos de partida de transcrição (tsp) estão em sublinhado. As regiões importantes para a função do promotor (motivos A e B, correspondentes) ocupam as posições de nucleótido 295 - 311 e 328 - 337. Os nucleótidos alterados no haplotipo BamHI~ estão a negrito e os nucleótidos substituintes estão indicados em maiúsculas a negrito, sobre as posições respectivas concordantes.

Figura 3 - Medições das actividades de variante do promotor de anexina A5 (ensaios do gene repórter de luciferase). N designa a sequência de promotor do tipo selvagem, que é normalizado como 100% de actividade. Ml contém as alterações de nucleótido ÍA^C e 271UC, e a variante M2 contém todas as quatro substituições (-19G->A, 1A->C, 27T->C e 7 6G-»A), caracterist icas da variante do promotor de ANXA5 BamHI~.

Figura 4 - Digestão de restrição com Bam Hl para detecção do alelo do promotor de ANXA5 BamHI~. Coluna 1, produto de PCR de um genótipo do tipo selvagem (N/N); coluna 2, (M/N), heterozigoticidade para o alelo BamHI~} coluna 3, (M/M), homozigoticidade para a variante BamHI~; L é um padrão de tamanho (escada de 100 pb, MBI Fermentas)

Os exemplos ilustram a invenção. 44 ΕΡ1819833Β1

Exemplo I: Materiais e métodos utilizados na presente invenção

Pacientes com perda gestacional recorrente

Setenta pacientes de origem Norte Europeia com uma condição de perda gestacional recorrente (mais de duas perdas fetais), que foram referidos para aconselhamento genético no Institute of Human Genetics, University Clinics Muenster, foram examinados quanto a mutações no gene de ANXA5. Estes pacientes foram pré-pesquisados para mutações de PTm e do factor V de Leiden e verificou-se que eram não-portadores. 0 estudo está conforme as linhas de orientação éticas das instituições envolvidas. Foi obtido o consentimento informado de todos os indivíduos examinados.

Análise de sequência do gene ANXA5 A análise foi realizada em toda a sequência codificante de ANXA5, juntamente com 60 - 80 pb dos intrões flanqueadores e a região promotora do gene (o primeiro exão não traduzido e cerca de 270 pb a montante da 5' UTR). Após amplificação por PCR das regiões genómicas relevantes, fez-se a sequenciação directa de amplicões, utilizando um sequenciador automático, analisador de ADN ABI PRISM® 3700 (ABI/Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemanha).

Grupo de controlo e pesquisa de pacientes A frequência na população de alelos variantes do promotor Ml e M2 foi analisada na amostra de 533 pessoas de controlo, fêmea, anónimas, abaixo da idade reprodutiva, 45 ΕΡ1819833Β1 provenientes do noroeste da Alemanha, bem como no grupo de pacientes acima descrito, de 70 grupos. Os alelos M2 (variantes Bam Hl ~) foram determinados por digestão com Bam Hl ~ de amplicões constituídos 436 pb da sequência da região promotora de ANXA5. Os portadores de Bam Hl ~ heterozigóticos e homozigóticos foram confirmados por sequenciação dos amplicões respectivos em todos os pacientes Bam Hl ~ e indivíduos controlo. Os portadores BamHI+ foram ainda pesquisados quanto à presença de mutações ÍA^C e 27T^C (haplotipo Ml), utilizando amplificação por PCR específica de alelos, com os iniciadores 5' CCCTGGCGGGGGTGGGA 3' (SEQ ID NO: 11) e 5' CCCTGGCGGGGGTGGGC 3' (SEQ ID NO: 12) com o iniciador inverso 5' GTTGTGGGTAAATCCAGCGCA 3' (SEQ ID NO: 13), discriminando as variantes IA e 1C e os iniciadores 5' CCGGGCAGGGCCGGGGT 3' (SEQ ID NO: 14) e 5' CCGGGCAGGGCCGGGGC 3' (SEQ ID NO: 15) com o iniciador inverso 5' GAACCGGGACACAGAAAC 3' (SEQ ID NO: 16), discriminando as variantes 27T e 27C. Os amplicões de todos os portadores de Ml homozigóticos e heterozigóticos determinados por amplificação por PCR específica de alelos, nos grupos de pacientes e controlo foram também sequenciados para confirmar as mutações ÍA^C e 27T->C. No grupo de controlo os genótipos Ml e M2 foram determinados por sequenciação da região promotora relevante.

Determinação do haplotipo para os alelos Ml e M2 (Bam Hl ) de ANXA5

Os amplicões de pacientes ou indivíduos controlo contendo 436 pb do promotor de ANXA5 e caracterizados com duas (1A->C e 27T->C) ou quatro (-19G->A, 1A->C, 27T->C e 7 6G->A) mutações foram clonados no vector básico pGL3- (Promega, Freiburg, Alemanha). Dez clones portadores da inserção de 46 ΕΡ1819833Β1 amplicões contendo as quatro mutações foram seleccionados aleatoriamente e o ADN plasmídico foi hidrolisado com BamHI e as inserções de clones de BamHI+ e BamHI~ foram sequenciadas em ambas as direcções. As inserções de amplicões clonadas contendo as duas mutações (1A-»C e 27T->C) foram sequenciadas directamente em ambas as direcções, a partir de 10 clones seleccionados aleatoriamente.

Ensaios de gene repórter

As análises foram realizadas em paralelo para as variantes do promotor de ANXA5, Ml e M2 (Bam Hl -) , para determinar a sua relevância para a expressão do gene. Um gene de luciferase, contido no vector básico pGL3 foi seleccionado como repórter. Um gene de beta-galactosidase sob o promotor de CMV forte serviu como padrão interno (BD Biosciences Clontech, Heidelberg). As construções foram expressas em células HeLa e as actividades repórter foram medidas. As medições foram repetidas a cada 3 vezes, para cinco expressões de construções independentes e todos os valores foram apresentados como razões em relação à actividade de beta-galactosidase estimada.

Análise estatística

As distribuições genotipicas e alélicas em casos e controlos foram comparadas utilizando testes de χ2 e análise de regressão logistica. Os métodos de simulação baseados em computador foram utilizados para testar desvios nas frequências genotipicas em relação às esperadas sob equilíbrio de Hardy-Weinberg, bem como para a construção de intervalos de confiança de 95%, para estimativas das frequências de genes e cálculo de razões de probabilidade. As 47 ΕΡ1819833Β1 análises foram realizadas com o programa da biblioteca SAS v8 e o EpiMax Calculator web-based; ver, inter alia, www.healthstrategy.com/epiperl/epiperl.htm. No entanto, podem-se utilizar outros programas normalmente utilizados, tal como proporcionado por, inter alia, ISI (International Statistical Institute).

Exemplo II: Identificação de mutações especificas do promotor ANXA5

Por pesquisa sistemática de mutações de exões, juntamente com fronteiras exão-intrão e 270 pb da região não traduzida 5' do gene, identificaram-se no grupo de pacientes quatro substituições de nucleótido consecutivas no promotor de ANXA5. Estas estão numeradas começando no primeiro ponto de iniciação da transcrição do gene, tspl, (+1). Estas substituições são como se segue: -19G->A, 1A->C, 27T^C e 76G^A. Uma numeração alternativa é aqui proporcionada e refere-se às sequências aqui proporcionadas. As quatro alterações, em conjunto ou apenas duas delas (1A-»C e 27T^C) são herdadas como haplotipos, i.e. ou todas elas estão numa e na mesma cadeia de ADN, haplotipo M2, ou as duas alterações "do meio" (1A->C e 271->C) são encontradas na mesma cadeia de ADN, haplotipo Ml (resultados de subclonagem de alelos e sequenciação) . A quarta substituição, 76G^A, altera um sítio de restrição de Bam Hl existente, o alelo do promotor mutante resultante que contém todas as quatro substituições de nucleótido foi designada por alelo BamHI ". A Figura 1 representa conjuntos de cromatogramas da sequência de um amplicão de tipo selvagem (-/-, i.e. Bam Hl +/Bam Hl +) , portadores heterozigóticos (Bam Hl +/Bam Hl ~) e homozigóticos (Bam Hl ~ / Bam Hl ) do alelo BamHI ~. A substituição 76G->A é bem visível. Adicionalmente, estimou-se 48 ΕΡ1819833Β1 a distribuição dos alelos Ml e M2 em pacientes e num grupo de controlo de 500 indivíduos (ver Materiais e métodos, grupo de controlo e pesquisa de pacientes). Os resultados das distribuições do alelo Ml e M2 em pacientes e controlos estão resumidos na tabela 1 seguinte. Na primeira série de análise estatística com 500 indivíduos controlo, fêmea, sem história registada de perdas gestacionais recorrentes (super-controlos), observou-se neste grupo um desvio significativo do equilíbrio de Hardy-Weinberg em relação ao alelo M2 (D=0,026, 95% Cl: 0,016-0,038). Este desvio é confirmado quer utilizando um teste de χ2 (χ2 = 105,2, d.f. = 2, p < 0,0001) quer utilizando um teste de simulação (valor de p < 0,0001). Os dados sugerem que na amostra de controlo os heterozigóticos estão sub-representados (31 observados versus ~49 previstos sob H-W), enquanto que os homozigóticos para BamHI - estão sobre-representados (observados 10, previstos ~2) .

Tabela 1. Distribuições de genótipo de alelos do promotor de ANXA5 Ml e M2, em pacientes e controlos.

Pacientes Controlos OR Cl Genótipo Observado Esperado Observado Esperado N/N 45 64,3%) 44,8 415(77,8%) 413, 3 1, 000 n. a. N/Ml 6 (8,6%) 6,4 35 (6,6%) 47,8 1,581 0,563-4,208 Ml/Ml 1 (1,5%) 0,2 1 (0,2%) 1,5 9,222 0,249- 342,136 N/M2, Ml/M2a 16 22,8%) 17,2 77 (14,4%) 69 1,916b 0,983-3,703 M2/M2 2 (2,8%) 1,4 5 (1%) 1,4 3, 689 0,481-22,321 Total 70 70 533 533

Esperado: a frequência de genótipo esperada no equilíbrio de Hardy-Weinberg; OR: razão de probabilidade em relação ao genótipo N/N; Cl: intervalo de confiança de 95% para a razão de probabilidade; a: o genótipo M1/M2 foi apenas observado em cinco indivíduos controlo; b: χ2=3, 619, 1 d.f., p=0,057. 49 ΕΡ1819833Β1

Exemplo III: Análise das alterações de nucleótido e ensaios de gene repórter

Toas as alterações de nucleótido observadas no promotor de anexina A5 alteram sítios de consenso do factor de transcrição, ou nucleótidos na sua proximidade directa (nucleótido +/- 1). A Figura 2 mostra a estrutura do promotor de ANXA5 com sítios de ligação do factor de transcrição destacados. A substituição -19 G^A é adjacente ao consenso gGCCc do factor de transcrição MTF-1. 0 ponto de iniciação da transcrição, tspl é alterado para ÍA^C no haplotipo do promotor, que também se situa numa proximidade estreita com o consenso HNF-3. A substituição 27T->C quebra um consenso Spl e a variante 76G^A, alterando o sítio de restrição de BamHI que está numa proximidade directa com um consenso AP4/MED-1, "motivo B", que se verificou ser indispensável para a actividade do promotor de ANXA5 [Carcedo et al., 2001].

Para investigar se estas alterações de nucleótido associadas em haplotipos afectam a actividade da região regulatória de transcrição, principal, de ANXA5, fizemos ensaios de genes repórter em ambas, variantes Ml e M2 (ver em Materiais e métodos, ensaios de gene repórter). A Figura 3 resume os resultados de medições de actividade. Cada medição foi feita em triplicado. Os dados obtidos mostram uma redução drástica da actividade do promotor de ANXA5 quando todas as quatro substituições de nucleótido (alelo BamHI~) estão presentes. Deste modo, a actividade do promotor M2 é de 37-42% da actividade normal do promotor de ANXA5, medido no alelo normal. Pelo contrário, o alelo Ml origina uma actividade de promotor reduzida de 57-62%. A variação observada das actividades medidas é inerente ao procedimento 50 ΕΡ1819833Β1 aplicado e resulta da variação de condições fisiológicas para expressão das células cultivadas.

Exemplo IV: Análise estatística

Dos pacientes que compreendem um grupo de gravidez de risco elevado, seleccionaram-se 70 indivíduos em que não se identificaram mutações do factor V trombofílico de Leiden ou protrombina PTm. Os genótipos de alelos do promotor Ml e M2 foram comparados no grupo de pacientes e na população de controlo (Tabela 1). Nos controlos verificou-se que os genótipos estão em equilíbrios de Hardy-Weinberg. No grupo de risco elevado, as frequências dos genótipos parecem estar nos seus valores de equilíbrio de Hardy-Weinberg (D = 0,01, 95%

Cl: -0,012 - 0,043), que foram confirmados com o teste de χ2 (χ2 = 0,58, d.f. =2, N.S.) e com o teste de simulação (valor de p < 0,131).

Para o haplotipo Ml verificou-se numa primeira análise que para portadores de Ml, a associação entre genótipo e estado da doença é de significância limítrofe (χ2=3,905, 1 df, p=0,048). A razão de probabilidade (OR) é 0,423, com um intervalo de confiança largo, de 95% de 0,172 - 0,994. A portabilidade de Ml em qualquer dos estados, homozigótico ou heterozigótico é, ou inconsequente, ou fracamente protectora contra o aborto recorrente.

Para a portabilidade de M2 (alelo BamHI~) , a associação entre genótipo e estado de doença é altamente significativa (χ2=18,455, 1 df, p=l,7xl0~5). A razão de probabilidades é igual a 3,875 (praticamente quatro vezes), com um intervalo de confiança de 95% de 1,980 - 7,542. Deste modo, ο M2 é um factor de risco forte, na medida em que os portadores têm um 51 ΕΡ1819833Β1 risco relativo de aborto recorrente quatro vezes maior do que os não portadores. As diferenças entre homoziqoticidade e heterozigoticidade não são conclusivas. Um efeito possível foi observado para M2, em que a heterozigoticidade N/M2 aparentemente acarretou um maior risco (OR=4,083) do que a homozigoticidade (OR=l,582). No entanto, os intervalos de confiança para as razões de probabilidade sobrepõem-se largamente (1,961 - 8,457 para N/M2 versus 0,231 - 8,057 para M2/M2). O desvio observado do equilíbrio de Hardy-Weinberg em relação à apresentação do alelo M2 no grupo de controlo poderá ser, de facto, uma indicação adicional do papel desta variante do promotor de ANXA5 para perda gestacional recorrente, uma vez que os indivíduos de controlo seleccionados não têm registo de problemas de gravidez. Comparando com a população geral, o risco de ser portador do haplotipo M2 pode ser inferior, considerando que cerca de 10% a 15% de todas as mulheres sofrem perdas gestacionais.

Noutra análise, são encontrados os resultados seguintes que estão completamente em linha com os resultados acima proporcionados:

Para o haplotipo Ml verificou-se que para os heterozigóticos Ml, a associação entre o genótipo e o estado de doença é de significância limítrofe (χ2=0,511, 1 df, p=0,475) . A razão de probabilidade (OR) é de 1,581, com um intervalo de confiança de 95% de 0,563 - 4,208. Deste modo, concluiu-se que a portabilidade de Ml no estado heterozigótico é bastante inconsequente para aborto recorrente e o número de homozigoticos em pacientes e controlos é muito baixo para tirar uma conclusão justificada. 52 ΕΡ1819833Β1

Para a portabilidade de M2 (alelo BamHI~) , a associação entre o genótipo e o estado de doença é significativa (χ1 2 3=4,763, 1 df, p=0,029). A razão de probabilidade é igual a 2,024, com um intervalo de confiança de 95% de 1,068 - 3,810. Deste modo, a M2 é um factor de risco, na medida em que acarreta um risco relativo de aborto recorrente cerca de duas vezes mais elevado (1, 840) do que os não portadores. Os números no grupo de casos são muito pequenos para testar qualquer interacção entre haplotipos, ou para diferenças entre homozigoticidade e heterozigoticidade. Um efeito possível foi observado para M2, em que a homozigoticidade N/M2 aparentemente acarreta um risco mais elevado (OR=3,689) do que a heterozigoticidade (OR=l,916). No entanto, o intervalo de confiança para a razão de probabilidades M2/M2 é bastante amplo (0,481 - 22,321), de modo que esta conclusão não seria justificada do ponto de vista estatístico. Uma vez que o grupo de controlo é uma amostra representativa da população do noroeste da Alemanha, o risco estimado de ser portador do haplotipo M2 deverá ser indicativo do risco da população, considerando que cerca de 10% de todas as mulheres sofrem de perdas gestacionais.

Exemplo V: Procedimentos analíticos O procedimento analítico proposto para a detecção do alelo M2 (BamHI ”) pode compreender passos consecutivos: 53 1 reacção de PCR; 2

Digestão de restrição com Bam Hl de uma alíquota do produto de PCR; e 3

Electroforese me gel dos produtos de digestão de restrição ΕΡ1819833Β1 0 modelo para 1. é ADN genómico de sangue periférico. Os produtos de 2. são submetidos a separação electroforética num gel de agarose e visualizados com coloração com brometo de etidio. 1. Reacção de PCR:

Num volume de 2 5 μΐ em 100 ng de AND genómico. A composição da mistura reaccional e tampão de reacção pode ser diferente e depende do fornecedor da polimerase de Taq.

Iniciadores de amplificação de oligonucleótidos, 20 pM cada:

ANX5.P . F 5' CCGAGCCCTGGACAGCTCCCCA 3' (SEQ ID NO: 22)

ANX5. exl.R 5' CCAGACTGTGGGACCCAAGT 3' (SEQ ID NO: 23)

Tamanho do amplicão: 436 pb.

Condições de ciclização: 45 s) ; 30 x [ (94 °C, 30 s); (60 °C, 30 s); 68 °C, 1 (68 °C, 7 min) ; (15 °C, ~); 2. Digestão de restrição:

Num volume de 10 μΐ com 1 U de enzima de restrição Bam Hl (vários fornecedores). Digestão de restrição em 5 - 7 μΐ do produto de PCR (reacção 1), a 37°C, 18 - 20 horas. 3. Electroforese em gel de agarose:

Os produtos de (2) são misturados com 2 μΐ de 6x tampão de carga de gel e são em seguida carregados em geles de 54 ΕΡ1819833Β1 agarose a 1,5%. Os geles são corridos em 1 x tampão TAE, voltagem constante (6V/cm) durante 30 min. Os produtos de reacção separados e corados com brometo de etídio são visualizados num transiluminador (384 nm) e podem ser documentados. Se o sítio de restrição de Bam Hl está intacto (ADN do tipo selvagem), em condição homozigótica, podem-se observar duas bandas (336 e 100 pb) , e três bandas em heterozigóticos com um alelo BamHI ~ (uma banda adicional de 436 pb, amplicão não digerido). Quando o sítio de restrição de Bam Hl não está intacto em homozigóticos, apenas se observa uma banda de 436 pb. A Figura 4 mostra uma imagem de um gel dos produtos de PCR digeridos com Bam Hl de pacientes e indivíduos controlo. genótipos Bandas de diagnóstico 43 6 pb 33 6 pb 10 0 pb BamHI+ / BamHI+ homozigótico - + + BamHI+ /BamHI ~ - heterozigótico + + + BamHI ~/BamHI ~ - homozigótico + — — O procedimento analítico que desenvolvemos é capaz de discriminar portadores do alelo M2 (Bam Hl ) (heterozigóticos e homozigóticos), que possuem um risco relativo de aborto recorrente cerca de quatro vezes maior (3,875) em comparação com não portadores, tal como medido entre indivíduos controlo fêmea, saudáveis, sem problemas de gravidez previamente referidos (ver em IV, análise estatística). Não foram estabelecidas diferenças estatisticamente significativas nas taxas de risco relativo de indivíduos, heterozigóticos ou homozigóticos para o alelo M2 (Bam ΗΓ) . 55 ΕΡ1819833Β1

Referências adicionais citadas:

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Clínica da Universidade de Munster <120> variante genética do gene de anexina A5 <130> K2475 PCT S3 <160> 23 <170> Versão Patentln 3.3 <210> 1 <211> 1732

<212> ADN <213> homo sapiens <400> 1 tctagaacac tgcatctagt gtcgcaaact tgtcctcttg ccccctctgc cctggcacct 60 tccctcccca caccagtaag tctgagaagg tccctgtgtc ttctactttt ccttttccag 120 catatggaga caaaagtgat tatatcccgg atgctaatcc gccatgttga cctttaataa 180 ccccagtccc atgaatacct cctgattcct aggatttttt ttttaaactg tccttagcat 240 aagaacatgt caaccttgat gctattgccc acattgtagg ctatgaagca tacggcattc 300 tcacctgttc cggaggctgc ctttaattgt cttgcacaga gcagtatact ctttccttac 360 ggtatataag gccagggtct ggggagtaac agtgcagaaa tttatctgct tgccgccgcc 420 caaggccacg cttctgtcta ccacatcctc caatagcacc cctattacct acagactgga 480 tttgtctgtc tcgttctttg gtttcttgac tccttcgcgt ttgggggctg ctttgcatat 540 aaagcccttt cacagaacac agcaccatgc tagtacaata cgctgtagát· tctccctccc 600 tccccctctc tctcatatac tcatatatct tatgttgaac caatatgagg cattgctcaa 660 atttaagtca tattaaagtt ctaggctagt tttgaaaaca gaaactgatt ggaagcagag 720 gttttcaaat agcccacata cgctactaga aggctgtaca tttaagagag ggccatctag 780 gaagcaataa taggcattaa aacaacaata aaacaacaaa acaaaacaga aacaaaaaca 840 acttgggaaa cggccctcct ttcacgtttt ttctatccca tcgacaaagg cgcgctgtcc 900 ttagctgcga tgattttgtc tcgcctccaa aaagacgccc acgcactatg ttgagcaccc 960 aagtgaggct acggttcctg cggtcacaga gggcagggag gctcaagcac ctccaaaacc 1020 ccgagccctg gacagctccc caggcccttc ccgcggcgcg aggacaagag gtctccgggg 1080 ccctcggggg agcggcgcct cctcctggtt ccagcagctc tgcgccgctc cccacccagg 1140 cccgcgagac cagcgggaca gtccgcgccg ggagaccaac tgggacgagc cgcgacccac 1200 gcaggcgcgc tgaggccggg gcaggggcgg gcccggctgg cgcggccggc tgcggttggg 1260 57 ΕΡ1819833Β1 gctggcgggg gtgggacggg ccaagccggg cagggccggg gtggggcgct ggcgtttccg 1320 ttgcttggat cagtctaggt gcagctgcgg atccttcagc gtctgcatct cggcgtcgcc 1380 ccgcgtaccg tcgcccggct ctccgccgct ctcccggggg ttcggggcac ttgggtccca 1440 cagtctgggt gagtggtcgc agcccgggga gggggctcct tctggagagg agagcgtggt 1500 cgcggggcac tggattcgcg cggacgctcg gccgagagct gtcccggtag ctgcgagagg 1560 gcgggtcggc ccgtggcggc gtccgggctg tctgagcgcg ccggtccccg cggacctgcg 1620 cttggggagg gcacgagttg caaatggcgc gctaagcccg aggtttcttc tcttttgcag 1680 tcctgcttca ccttcccctg acctgagtag tcgccatggc acaggtaagg cc 1732 <210> 2 <211 > 281 <212> ADN <213> homo sapiens <400>2 tccggggccc tcgggggagc ggcgcctcct cctggttcca gcagctctgc gccgctcccc 60 acccaggccc gcgagaccag cgggacagtc cgcgccggga gaccaactgg gacgagccgc 120 gacccacgca ggcgcgctga ggccggggca ggggcgggcc cggctggcgc ggccggctgc 180 ggttggggct ggcgggggtg ggacgggcca agccgggcag ggccggggtg gggcgctggc 240 gtttccgttg cttggatcag tctaggtgca gctgcggatc c 281 <210> 3 <211 >436

<212> ADN <213> homo sapiens <400>3 ccgagccctg gacagctccc caggcccttc ccgcggcgcg aggacaagag gtctccgggg 60 ccctcggggg agcggcgcct cctcctggtt ccagcagctc tgcggccgct ccccacccag 120 gcccgcgaga ccagcgggac agtccgcgcc gcgggagacc aactgggacg agçcgcgacc 180 cacgcaggcg cgctgaggcc ggggcagggg cgggcccggc tggcgcggcc ggcctgcggt 240 tggggccctg gcgggggtgg gacgggccaa gccgggcagg gccggggtgg ggccgctggc 300 gtttccgttg cttggatcag tctaggtgca gctgccggat ccttcagcgt ctgcatctcg 360 gcgtcgcccc gcgtaccgtc gcccggctct ccgccgctct cccgggggtt cggggcactt 420 gggtcccaca gtctgg 436 58 ΕΡ1819833Β1 <210> 4 <211 >289

<212> ADN <213> homo sapiens <400>4 tccggggccc tcgggggagc ggcgcctcct cctggttcca gcagctctgc ggccgctccc 60 cacccaggcc cgcgagacca gcgggacagt ccgcgccgcg ggagaccaac tgggacgagc 120 cgcgacccac gcaggcgcgc tgaggccggg gcaggggcgg gcccggctgg cgcggccggc 180 ctgcggttgg ggccctggcg ggggtgggac gggccaagcc gggcagggcc ggggtggggc 240 cgctggcgtt tccgttgctt ggatcagtct aggtgcagct gccggatcc 289

<210> 5 <211 > 18 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 5 gtctaggtgc agctgccg 18

<210>6 <211 > 18 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400>6 gtctaggtgc agctgcca 18 <210> 7 <211 > 18

<212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 59 ΕΡ1819833Β1 <400>7 gaaccgggac acagaaac 18

<210> 8 <211 > 17 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400>8 ggccggcctg cggttgg 17

<210> 9 <211 > 17 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400>9 ggccggcctg cggttga 17

<210> 10 <211 >21 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 10 gttgtgggta aatccagcgc a 21

<210> 11 <211 > 17 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador 60 ΕΡ1819833Β1 <400> 11 ccctggcggg ggtggga

<210> 12 <211 > 17 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 12 ccctggcggg ggtgggc 1

<210> 13 <211 >21 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 13 gttgtgggta aatccagcgc a

<210> 14 <211 > 17 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 14 ccgggcaggg ccggggt

<210> 15 <211 > 17 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador ΕΡ1819833Β1 <400> 15 ccgggcaggg ccggggc 17

<210> 16 <211> 18 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 16 gaaccgggac acagaaac 18 <210> 17 <211 > 12

<212> ADN <213> homo sapiens <400> 17 tgcggttggg gc 12 <210> 18 <211 >45

<212> ADN <213> homo sapiens <400> 18 tggcgggggt gggacgggcc aagccgggca gggccggggt ggggc <210> 19 <211 >41

<212> ADN <213> homo sapiens <400> 19 gctggcgttt ccgttgcttg gatcagtcta ggtgcagctg c 41 <210> 20 <211> 6

<212> ADN <213> homo sapiens ΕΡ1819833Β1 <400> 20 ggatcc 6

<210> 21 <211 >28 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> oligómero <400> 21 ggttggggct ggcgggggtg ggacgggc 28

<210> 22 <211 >22 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 22 ccgagccctg gacagctccc ca 22

<210> 23 <211 >20 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 23 ccagactgtg ggacccaagt 20

Lisboa, 16 de Setembro de 2010 63

Claims (16)

1. ΕΡ1819833Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico que compreende um promotor de anexina A5 (ANXA5) humana, o qual compreende as seguintes mutações pontuais (substituições) (i) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 186 de SEQ ID NO: 2; (ii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 203 de SEQ ID NO: 2; (iii) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 229 de SEQ ID NO: 2; e (iv) uma mutação pontual de G para A numa posição que corresponde ao nucleótido 276 de SEQ ID NO: 2.
2. 2. Molécula de ácido nucleico que compreende um promotor de anexina A5 (ANXA5), o qual compreende as seguintes mutações pontuais (substituições) (ii) uma mutação pontual de A para C numa posição que corresponde ao nucleótido 203 de SEQ ID NO: 2; e (iii) uma mutação pontual de T para C numa posição que corresponde ao nucleótido 229 de SEQ ID NO: 2.
3. 3. Fragmento de ácido nucleico das moléculas de ácido nucleico definidas em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, compreendendo as substituições como definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2. 1 ΕΡ1819833Β1
4. 4. Oligómero com um comprimento de pelo menos 20 nucleótidos, que híbrida especificamente com moléculas/fragmentos de ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. 5. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2 que está ligada de forma operacional a um gene que codifica para uma proteína marcadora, uma proteína de sinal, um gene repórter, ou um marcador.
6. 6. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 que é ADN, ARN ou APN.
7. 7. Vector que compreende a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou 5.
8. 8. Método in vitro para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou uma tendência para perda gestacional (aborto) e/ou um risco elevado de desenvolver anticorpos antifosfolípido, em que o referido método compreende os passos de (a) examinar um promotor de ANXA5 para detectar pelo menos uma substituição, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2; e (b) determinar se qualquer uma das pelo menos uma das referidas substituições está presente.
9. 9. Método in vitro de acordo com a reivindicação 8, em que a detecção da referida pelo menos uma substituição no referido promotor de ANXA5 é realizada, ou determinada por técnicas de ácido nucleico baseadas no tamanho ou sequência. 2 ΕΡ1819833Β1
10. 10. Método in vitro de acordo com a reivindicação 9, em que a referida técnica baseada em tamanho ou sequência é seleccionada do grupo constituído por técnicas de hibridação, sequenciação de ácidos nucleicos, PCR, determinação de fragmentos de restrição, determinação de polimorfismo de nucleótidos individuais (SNPs)-, LCR (reacção em cadeia de ligação) ou determinação de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP)-.
11. 11. Método in vitro de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, compreendendo o passo de amplificar uma porção de ADN do promotor de ANXA5 a partir de ADN genómico, por PCR.
12. 12. Método in vitro de acordo com a reivindicação 10, em que a determinação do referido fragmento de restrição ou o referido RFLP compreende a determinação de um sítio de restrição de BamHI.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, em que se determina a ausência ou presença de uma substituição correspondente à posição 276 de um promotor do gene ANXA5, como apresentado na SEQ ID NO: 2.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, que é realizado em ADN genómico.
15. 15. Utilização da molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 1 ou 2, do fragmento de ácido nucleico definido na reivindicação 3, do oligómero da reivindicação 4, ou de um par de iniciadores capaz de amplificar porções relevantes da molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 1 ou 2, para a preparação de uma composição de diagnóstico, para o 3 ΕΡ1819833Β1 diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou uma tendência para perda gestacional e/ou para o diagnóstico ou detecção de uma predisposição para, ou uma tendência para desenvolver anticorpos antifosfolipido.
16. 16. Método para pesquisar moléculas que são capazes de interagir com um promotor de ANXA5 mutado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, compreendendo os passos de (a) contactar uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, um vector de acordo com a reivindicação 7, ou um hospedeiro compreendendo a referida molécula de ácido nucleico, com uma molécula candidata; (b) medir e/ou detectar uma resposta; (c) comparar a referida resposta com uma resposta convencional, tal como medido na ausência da referida molécula candidata, e (d) comparar a referida resposta com uma resposta obtida com a referida molécula candidata e o promotor de ANXA5 não mutado (tipo selvagem). Lisboa, 16 de Setembro de 2010 4