PT1802339E - Tratamento de neoplasmas com neurotoxina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DE NEOPLASMAS COM NEUROTOXINA"

Este pedido reivindica prioridade do pedido provisório U.S. número 60/612443, apresentado em 23 de Setembro de 2004.

ANTECEDENTES A presente invenção refere-se à utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma neurotoxina farmaceuticamente aceitável de acordo com as reivindicações. A presente invenção refere-se a métodos para tratar vários neoplasmas benignos ou malignos, e descreve métodos para tratar infecções crónicas, doenças autoimunes e imunodeficiências. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos de tratamento do crescimento e metástase de várias malignidades com uma toxina de botulinum.

Neoplasmas O crescimento inicial de neoplasmas é dependente do fornecimento adequado de factores de crescimento e da remoção de moléculas tóxicas. A expansão de massa de tumor maior do que 2 mm de diâmetro depende do desenvolvimento de angiogénese para produzir adequado fornecimento de sangue. A indução de 1 angiogénese é mediada por múltiplas moléculas que são libertadas pelas células tumorais e células hospedeiras, incluindo células endoteliais, células epiteliais, células mesoteliais e leucócitos. A angiogénese consiste em processos sequenciais que emanam de células endoteliais microvasculares. À medida que se expande, o tumor (primário ou secundário) pode também causar determinados sintomas, tais como desconforto (e. g. , a sensação de um caroço), dor e hemorragia.

Após a angiogénese ter início, a invasão de células tumorais do tecido circundante do tumor primário e penetração de sangue e vasos linfáticos é central para todo o fenómeno da metástase.

Uma vez que as células tumorais se destacam do tumor primário, estas devem invadir o estroma do hospedeiro para penetrar nos vasos linfáticos e sanguíneos. Para fazer isso, as células tumorais devem penetrar as membranas basais circundantes dos vasos sanguíneos. As membranas basais e a matriz extracelular do tecido conjuntivo (ECM) consiste em quatro grupos principais de moléculas: colagénios, elastinas, glicoproteínas e proteoglicanos. A degradação da ECM e componentes da membrana basal por células tumorais é um pré-requisito essencial para invasão e metástase.

Em adição, a metástase de cancro consiste em passos complexos múltiplos, de interacção e, interdependente, em que cada um é limitante da taxa, uma vez que a incapacidade de completar qualquer dos passos evita que a célula de tumor produza uma metástase. As células tumorais que eventualmente dão origem a metástases devem sobreviver uma série de interacções potencialmente letais com os mecanismos homeostáticos do hospedeiro. 0 equilíbrio destas interacções pode variar entre 2 doentes diferentes com diferentes neoplasmas ou mesmo entre doentes diferentes com o mesmo tipo de neoplasma.

Os passos essenciais na formação de uma metástase são semelhantes em todos os tumores e consistem nos seguintes: 1. Após a transformação neoplásica, a proliferação progressiva de células neoplásicas é inicialmente suportada com nutrientes fornecidos pelo microambiente do órgão por difusão. 2. Neovascularização ou angiogénese deve ocorrer para que uma massa tumoral exceda 1 ou 2 mm de diâmetro. A síntese e secreção de diferentes moléculas angiogénicas e supressão de moléculas inibidoras são responsáveis pelo estabelecimento de uma rede capilar a partir do tecido circundante do hospedeiro. 3. Algumas células tumorais podem sub-regular a expressão de moléculas coesivas e possuem motilidade aumentada e, deste modo, podem destacar-se da lesão primária. A invasão do estroma do hospedeiro por algumas células tumorais ocorre através de vários mecanismos paralelos. As vénulas capilares e de parede fina, como os canais linfáticos, oferecem pouca resistência à penetração por células tumorais e proporciona as vias mais comuns para a entrada da célula de tumor na circulação. 4. Separação e embolização de células tumorais únicas ou agregados de células ocorre a seguir, sendo a grande maioria das células tumorais circulantes rapidamente destruídas. 3 5. Uma vez que as células tumorais sobreviveram em circulação, estas devem... 6. Ser aprisionada nas camas capilares de órgãos distantes através da aderência às células endoteliais capilares ou às membranas basais subendoteliais expostas. 7. As células tumorais (especialmente as em agregados) podem proliferar no lúmen do vaso sanguíneo, mas a maioria extravasa para o parênquima do órgão através de mecanismos semelhantes aos que operam durante a invasão. 8. As células tumorais portadoras de receptores de superfície celular apropriados podem responder a factores de crescimento parácrinos e deste modo proliferar no parênquima do órgão. 9. As células metastásicas devem sobreviver à destruição através das defesas do hospedeiro que incluem respostas imunitárias específicas e não específicas. 10. Para exceder uma massa de 1 a 2 mm em diâmetro, a metástase deve desenvolver uma rede vascular.

Toxina de Botulinum A bactéria gram positiva anaeróbica Clostridium botulinum produz uma potente neurotoxina polipeptídica, a toxina de botulinum. Até à data, foram caracterizadas sete neurotoxinas de botulinum imunologicamente distintas: serotipos A, B, Cl, D, E, F e G. Destes, a toxina de Botulinum de tipo A é reconhecida 4 como um dos agentes mais letais que ocorrem naturalmente conhecidos do homem. É postulado que as toxinas de botulinum se ligam com elevada afinidade a neurónios colinérgicos motores, são transferidos para o neurónio e efectuam o bloqueio da libertação pré-sináptica de acetilcolina. Todos os serotipos da toxina de botulinum têm o propósito de inibir libertação de acetilcolina na junção neuromuscular e fazem isso afectando diferentes proteínas neurossecretoras e/ou clivando estas proteínas nos diferentes sítios. Por exemplo, a toxina A de Botulinum é uma endopeptidase de zinco que pode especificamente hidrolisar uma ligação peptídica da proteína SNAP-25 intracelular, associada a vesículas. 0 Botulinum do tipo E também cliva a proteína de 25 kiloDalton (kD) associada a sinaptossomas (SNAP-25), no entanto, o tipo E liga-se a uma diferente sequência de aminoácidos na SNAP-25. Crê-se que as diferenças no sítio da inibição são responsáveis pela potência relativa e/ou duração da acção dos vários serotipos de toxina de botulinum.

Actualmente, as toxinas de Botulinum têm sido utilizadas em situações clínicas para o tratamento de distúrbios neuromusculares caracterizados por os músculos esqueléticos hiperactivos. A toxina de Botulinum de tipo A foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration em 1989 para o tratamento de blefarospasmo essencial, estrabismo e espasmo hemifacial em doentes com idade superior a doze anos. Em 2000, a FDA aprovou preparações comerciais de serotipos do tipo A e tipo B da toxina de botulinum para o tratamento de distonia cervical e, em 2002 a FDA aprovou uma toxina de botulinum do tipo A para o tratamento cosmético de determinadas rugas faciais hipercinéticas (glabelar). Em 2004, a FDA aprovou botulinum para o tratamento 5 de hiper-hidrose. Utilizações não aprovadas pela FDA em espasmo hemifacial, torticolite espasmódica, distonia oromandibular, disfonia espasmódica e outras distonias, tremor, dor miofascial, disfunção da junção temporomandibular, enxaqueca, espasticidade.

Os efeitos clínicos da toxina de botulinum do tipo A intramuscular periférica são normalmente observados em 24-48 horas de injecção e algumas vezes em poucas horas. Quando utilizadas para induzir paralisia muscular, o alívio sintomático de uma única injecção intramuscular de toxina de botulinum do tipo A pode durar aproximadamente três meses, no entanto, sob determinadas circunstâncias os efeitos foram conhecidos por durar vários anos.

Apesar da aparente diferença na ligação do serotipo, pensa-se que o mecanismo da actividade de botulinum é semelhante e envolve, pelo menos, três passos. Em primeiro lugar, a toxina liga-se à membrana pré-sináptica de uma célula alvo. Em segundo lugar, a toxina entra a membrana plasmática da célula efectada em que é formado um endossoma. A toxina é então translocada através da membrana endossómica no citosol. Terceiro, a toxina de botulinum parece reduzir uma ligação persulfureto de SNAP resultando na disrupção da actividade de endopeptidase de zinco (Zn++), que cliva selectivamente proteínas essenciais para o reconhecimento e rastreio de vesículas contendo neurotransmissores com a superfície citoplasmática da membrana plasmática e fusão das vesículas com a membrana plasmática. A neurotoxina do tétano, toxina de botulinum B, D, F e G causa a degradação de sinaptobrevina (também denominada proteína de membrana associada a vesículas (VAMP)), uma proteína de membrana sinaptossómica. A maior parte da VAMP presente na superfície citossólica da vesícula sináptica é removida como um resultado 6 de qualquer um dos eventos de clivagem. Cada toxina cliva especificamente uma ligação diferente. 0 peso molecular da molécula de proteína da toxina de botulinum, para todos os sete serotipos das toxinas de botulinum conhecidas, é cerca de 150 kD. De forma interessante, as toxinas de botulinum são libertadas pela bactéria Clostridial como complexos compreendendo a molécula de proteína de toxina de botulinum de 150 kD em conjunto com proteínas não toxinas associadas. Deste modo, o complexo da neurotoxina de botulinum do tipo A pode ser produzido pela bactéria Clostridial como formas de 900 kD, 500 kD e 300 kD. Os tipos B e Ci de toxina de Botulinum são aparentemente produzidos como um único complexo de 500 kD. A toxina de Botulinum do tipo D é produzida como complexos de 300 kD e 500 kD. Finalmente, as toxinas de botulinum do tipo E e F são produzidas como complexos únicos de aproximadamente 300 kD. Acredita-se que os complexos (i. e. peso molecular maior do que cerca de 150 kD) contêm uma proteína hemaglutinina não toxina e uma proteína não hemaglutinina não-toxina e não tóxica. Estas duas proteínas não toxinas (que em conjunto com a molécula de toxina de botulinum podem compreender o complexo relevante de neurotoxina) podem actuar para proporcionar estabilidade contra a desnaturação da molécula de toxina de botulinum e protecção contra ácidos digestivos quando a toxina é ingerida. Adicionalmente, é possível que os maiores complexos (superior a cerca de 150 kD de peso molecular) da toxina de botulinum podem resultar numa menor taxa de difusão da toxina de botulinum longe de um sítio de injecção intramuscular de um complexo de toxina de botulinum. Os complexos de toxina podem ser dissociados na proteína toxina e proteínas hemaglutininas tratando o complexo com glóbulos vermelhos do 7 sangue a pH 7,3. A proteína toxina possui uma marcada instabilidade após remoção da proteína hemaglutinina.

Todos os serotipos de toxina de botulinum são preparados pela bactéria Clostridium botulinum como proteínas de cadeia simples inactivas que devem ser clivadas ou interrompidas por proteases para ficarem neuroactivas. As estirpes bacterianas que produzem os serotipos A e G da toxina de botulinum possuem proteases endógenas e os serotipos A e G podem ser, deste modo, recuperados das culturas bacterianas predominantemente na sua forma activa. Em contraste, os serotipos C.sub.l, D e E da toxina de botulinum são sintetizados por estirpes não proteolíticas e são deste modo tipicamente inactivados quando recuperados a partir da cultura. Os serotipos B e F são produzidos por ambas as estirpes proteolíticas e não proteolíticas e, deste modo, podem ser recuperados na forma activa ou inactiva. No entanto, mesmo as estirpes proteolíticas que produzem, por exemplo, o serotipo do tipo B da toxina de

botulinum, clivam apenas uma porção da toxina produzida. A exacta proporção de moléculas interrompidas para não interrompidas depende da duração da incubação e a temperatura da cultura. Deste modo, uma determinada percentagem de qualquer preparação de, por exemplo, a toxina de botulinum do tipo toxina B é provavelmente inactiva, contribuindo possivelmente para uma potência inferior da toxina de botulinum do tipo B, em comparação com a toxina de botulinum do tipo A. A presença das moléculas de toxina de botulinum inactivas numa preparação clínica contribuirá para a carga global de proteína da preparação, que foi ligada para antigenicidade aumentada, sem contribuir para a sua eficácia clínica.

Estudos in vitro indicaram que a toxina de botulinum inibe a libertação induzida do catião potássio de acetilcolina e norepinefrina a partir de culturas de células primárias de tecido do tronco cerebral. Adicionalmente, foi reportado que a toxina de botulinum inibe a evocada libertação de glicina e glutamato nas culturas primárias de neurónios da medula espinal e que nas preparações de sinaptossoma de cérebro, a toxina de botulinum inibe a libertação de cada um dos neurotransmissores acetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP e glutamato.

Pode ser produzida toxina de botulinum do tipo A cristalina com qualidade elevada a partir da estirpe Hall A de Clostridium botulinum com caracteristicas de 3xl07 U/mg, um Ά260/Α278 inferior a 0,60 e um padrão distinto de bandas na electroforese em gel. O conhecido processo de Shantz pode ser utilizado para obter toxina de botulinum do tipo A cristalina, como apresentado em Shantz, E. J., et al. , Properties and use of Botulinum toxine and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56: 80-99 (1992). Geralmente, o complexo da toxina de botulinum do tipo A pode ser isolado e purificado a partir da fermentação anaeróbica por cultura de Clostridium botulinum do tipo A num meio adequado. A toxina bruta pode ser recolhida por precipitação com ácido sulfúrico e concentrada por ultramicrofiltração. A purificação pode ser efectuada por dissolução do precipitado ácido em cloreto de cálcio. A toxina pode então ser precipitada com etanol frio. 0 precipitado pode ser dissolvido em tampão de fosfato de sódio e centrifugado. Após secagem pode então ser obtido o complexo de toxina de botulinum do tipo A cristalina de aproximadamente 900 kD com uma potência especifica de LD50 de 3xl07 U/mg ou superior. Este processo conhecido pode também ser utilizado, após separação das proteínas não toxina, para obter toxinas de botulinum puras, 9 tais como por exemplo: toxina de botulinum do tipo A purificada com um peso molecular de aproximadamente 150 kD com uma potência especifica de LD50 de l-2xl08 U/mg ou superior; toxina de botulinum do tipo B purificada com um aproximadamente 156 kD peso molecular com uma potência especifica de LD5o de l-2xl08 U/mg ou superior, e; toxina de botulinum do tipo F purificada com um peso molecular de aproximadamente 155 kD com uma potência especifica de LD5o de l-2xl07 U/mg ou superior.

As toxinas de botulinum e complexos de toxina adequados já preparados e purificados para preparar formulações farmacêuticas podem ser obtidos de List Biological Laboratories, Inc., Campbell, Calif.; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, R.U.; Wako (Osaka, Japão), assim como a partir de Sigma Chemicals of St Louis, Mo.

Foi demonstrado que o perfil da toxina disseminada num músculo estava relacionado com a concentração, volume e localização do sítio de injecção (22).

Childers et al. 1996 (Am. J. Phys. Med. Rehabil., 1996;75(6):462-9.) discutem várias formas de injector um músculo espasmódico afectado para maximizar a eficácia de uma injecção de toxina de botulinum. A requerente descreve a injecção de um músculo espasmódico numa localização diferente no mesmo músculo para maximizar a parálise. Childers et al. 1996 não envolve a injecção num sítio distante do músculo espasmódico afectado para determinar se existe um efeito no músculo espasmódico ou no estado espasmódico. 10 Técnica Anterior Utilizando Uma Neurotoxina Para Tratar o

Cancro

Algumas patentes e pedidos ensinaram a tratar cancros com uma neurotoxina e especificamente uma toxina de botulinum. Uniformemente, os métodos ensinaram a distribuir directamente a toxina de botulinum às células cancerosas ou à sua vizinhança, com o objectivo de afectar directamente as células cancerosas ou a sua enervação. 0 objectivo foi o de distribuir a toxina à célula cancerosa para exercer um efeito, ou para desenervar localmente uma célula cancerosa. Ao colocar a toxina numa célula, a toxina de botulinum pode inibir o processo de exocitose de uma célula cancerígena, que é a libertação do conteúdo intracelular de uma célula ou vesículas para o espaço extracelular. Estas patentes e pedidos ensinam, em parte, que inibir a exocitose de uma célula cancerígena irá reduzir a actividade de uma divisão celular e reduzir a capacidade da célula cancerígena para se mover. Desenervando localmente uma célula cancerígena, ela pode tornar-se menos activa. A seguinte revisão da técnica anterior irá abordar estes assuntos. 0 Pedido de Patente US2005/0031648 Al, Methods for Treating Diverse Cancers, divulga o tratamento de tecidos hiperplásicos, pré-cancerosos ou cancerosos com uma toxina de botulinum administrando localmente a toxina de botulinum ao tecido hiperplásico, pré-canceroso ou canceroso ou à sua vizinhança. Apenas é "tratado" o tecido doente. A administração local é definida como injecção directa da neurotoxina para ou tecido alvo ou para a área local do tecido alvo (para 178). 0 "tratamento" é definido como provocando especificamente a redução no tamanho e ou a actividade de um tecido hiperplásico, hipertónico ou neoplásico, tomando como alvo directamente as 11 células cancerígenas ou a "vizinhança do tecido alvo" (para 159). Este pedido de patente revela ainda que uma "quantidade terapeuticamente eficaz" não irá provocar efeitos colaterais negativos ou adversos significativos ao tecido tratado (para 177) . 0 pedido da patente reconhece que, de modo a alcançar o efeito desejado numa célula não neuronal (tais como um cancro da mama) a dose injectada pode necessitar de ser mais elevada (0187) uma vez que as células não nervosas não contêm receptores de superfície celular para uma toxina de botulinum. De facto, essas células devem ser permeabilizadas para permitir a entrada in vitro da toxina de botulinum no citosol das células (para 191) . Além disso, este pedido de patente refere que uma toxina de botulinum pode bloquear a libertação de qualquer endocitose mediada pela vesícula, desde que a cadeia leve da toxina de botulinum seja translocada para o meio intracelular (para 191). O pedido de patente WO 2005/030248 tenta ultrapassar a limitação significativa da toxina de botulinum quando é utilizada directamente para o tratamento das células cancerígenas, nomeadamente que a toxina não possui uma afinidade elevada para células não neuronais e deste modo são necessárias doses muito mais elevadas para entrar numa dessas células. Assim que a toxina está dentro de uma célula, a toxina irá interferir com a maquinaria intracelular. Este pedido descreve um método para aumentar a entrada da toxina de botulinum c3 nas células cancerígenas através da ligação de c3 a uma proteína de fusão permeável na célula. O objectivo do tratamento é impedir que a célula cancerígena se contraia e dissemine. O composto descrito tem como alvo especificamente uma célula de cancro. Este pedido de patente ensina que o composto pode também ser injectado em redor do cancro na 'margem de ressecção' após cirurgia, mas o objectivo é tratar células cancerosas que podem residir na 12 margem. 0 método de injecção numa margem de ressecção implica necessariamente que a cirurgia foi realizada para atingir uma 'margem de ressecção' que pode ser tratada.

Os documentos US 2002/0094339 Al, US 6565870 BI e 6139845 ensinam todos o tratamento de tumores, cancros e distúrbios com uma toxina de botulinum. A toxina é injectada directamente no tecido doente para exercer o seu efeito na inibição da exocitose.

Limitações da Técnica Anterior A técnica anterior baseia-se na distribuição da toxina de botulinum directamente para as células cancerígenas ou para a sua vizinhança local imediata para alcançar um efeito nas células cancerígenas. Existem várias limitações substanciais desses métodos que, se empregues, podem provocar efeitos colaterais negativos ou adversos significativos para o tecido tratado ou os seus circundantes. A primeira limitação da técnica anterior refere-se à enervação colinérgica do cancro. A literatura científica está repleta de relatórios sobre os cancros serem enervados colinergicamente e que o bloqueamento desta enervação colinérgica (com toxina de botulinum) pode reduzir a capacidade da célula cancerígena para dividir, disseminar ou invadir localmente. No entanto, é também claro que alguns cancros têm o efeito oposto por estimulação colinérgica e que o bloqueamento desta enervação colinérgica (com toxina de botulinum) pode na verdade aumentar a capacidade da célula cancerígena para se dividir, disseminar ou invadir localmente. De facto, existem 13 relatórios científicos que entram em conflito sobre o mesmo tipo de cancro (do pulmão) poder ser estimulado ou inibido por estimulação colinérgica. Quando se considera o facto bem conhecido de que os cancros não são uma população homogénea de células, mas são normalmente uma mistura heterogénea ou que as células cancerígenas são capazes de modificar as suas respostas, torna-se claro que bloquear a enervação colinérgica de um cancro pode ser boa para algumas partes de um cancro, mas má para outras partes. Alternativamente, um cancro que encolhe hoje devido ao bloqueamento da enervação colinérgica pode adaptar-se e tornar-se estimulado pela enervação colinérgica amanhã.

Uma segunda limitação significativa da técnica anterior refere-se ao conceito fundamental de colocar a toxina de botulinum numa célula cancerígena, em que a capacidade total de uma célula para sofrer exocitose pode ser afectada. 0 documento US 2005/0031648 ensina que o substrato para uma toxina de botulinum não está restrito a células neuronais que libertam acetilcolina, em vez disso os substratos estão "envolvidos de forma ubíqua em eventos de fusão membrana-membrana" e a evidência aponta para "um mecanismo universal para eventos de fusão de membrana" (para 0103). Assim que a toxina foi internalizada na célula afectada, actua de um modo conhecido, como uma endoprotease sobre a sua proteína de ligação vaso secretor-membrana respectiva (para 187) . Além disso, "como a concentração é aumentada, os neurónios simpáticos não colinérgicos, células de cromafina e outros tipos de células podem incorporar uma toxina de botulinum e apresentar exocitose reduzida" (para 191). Novamente, o objectivo é reduzir as secreções excessivas de algumas células cancerosas através da interferência com exocitose, como também é indicado nos documentos US 2002/0094339 Al, 6139845 e 6565870. 14

Um problema fundamental da distribuição da toxina para a célula cancerígena ou célula do tecido doente para interferir com a exocitose é que a exocitose nas células cancerígenas é uma necessidade absoluta para auxiliar a matar as células cancerígenas. Qualquer tentativa de eliminar globalmente ou reduzir a exocitose pode certamente ser perigosa, uma vez que todas as células (incluindo as células cancerígenas) sofrem rotineiramente o processamento e a apresentação de moléculas à sua superfície através da exocitose que serve para sinalizar ao sistema imunitário do corpo se uma célula é cancerosa ou normal. Dependendo do tipo de molécula apresentada na sua superfície, uma célula pode ser morta pelo sistema imunitário se for considerada ''cancerosa'' ou protegida se for considerada normal ou 'própria'. 0 processo de sinalização celular está dependente de um processo intacto de exocitose. Se os denominados antigénios associados ao tumor são eliminados da superfície de uma célula cancerígena inibindo globalmente a exocitose a partir de uma célula cancerígena, o sistema imunitário terá menos probabilidade de destruir, ou não destruirá de todo, a célula cancerosa estranha. Injectar directamente numa célula cancerígena iria ainda aumentar significativamente os efeitos negativos ou adversos do tecido tratado.

Em terceiro lugar, foi ensinado que as células não neuronais são menos sensíveis à toxina de botulinum (documento US 2005/0031648 para 191) e que, "como a concentração da toxina é aumentada, os neurónios simpáticos não colinérgicos, células de cromafina e outros tipos de células podem incorporar uma toxina de botulinum e apresentar exocitose reduzida". É também conhecido de um especialista na técnica que as injecções de a uma concentrações superiores de toxina estão associadas 15 incidência de efeitos colaterais locais mais elevados, devido à disseminação aos músculos circundantes e paralisia involuntária do músculo. Deste modo, uma dose ou concentração elevada de toxina que é necessária entrar nas células não neuronais pode provocar a disseminação excessiva da área do alvo e provocar um efeito não apenas nas células cancerígenas, mas também uma área significativa do tecido circundante provocando efeitos colaterais inaceitáveis.

Em quarto lugar, existem outras limitações práticas de injectar directamente um cancro ou a sua vizinhança com qualquer substância, incluindo botulinum. Ao injectar directamente um cancro, deve inserir-se uma agulha directamente no cancro e injectar sob pressão a substância desejada. A agulha pode passar então através do tecido canceroso e possivelmente células cancerosas de semente para uma área que não continha células cancerosas no início. Mesmo se a agulha não passar através do cancro, o efeito da pressão da força injectada pode forçar ou empurrar as células cancerosas para o tecido normal circundante ou para os vasos linfáticos de parede fina ou vasos sanguíneos no cancro ou na sua vizinhança, provocando uma hipótese maior de efeitos colaterais significativos negativos ou adversos, nomeadamente metástases regionais ou distantes. Por exemplo, é bem conhecido que pode ocorrer hemorragia temporária quando é espetada uma agulha na pele ou na gengiva após uma consulta ao dentista. Quando esta agulha entra num cancro, deve considerar-se que os vasos sanguíneos foram rasgados e, ao nível microscópico, as células cancerígenas pode ter entrado na circulação.

Em quinto lugar, o pedido de patente WO 2005/030248 descreve um método de redução da associação do filamento de actina 16 introduzindo toxina de botulinum nas células cancerígenas. Embora seja ensinado que isto pode prevenir que as células cancerígenas se contraiam e migrem, também pode conduzir à perda de adesão das células malignas e resultar numa disseminação distante aumentada.

Consequentemente, existe uma necessidade de um método eficaz de tratar um cancro utilizando uma neurotoxina.

OBJECTIVOS DA INVENÇÃO invenção tratar o cancro tratar um sintoma de cancro presente invenção prevenir a uma neurotoxina. presente invenção aplicar a presente invenção aplicar a de modo a que a neurotoxina presente invenção utilizar a É um objectivo da presente utilizando uma neurotoxina. É um objectivo da invenção utilizando uma neurotoxina. É um outro objectivo da metástase de neoplasmas utilizando É ainda outro objectivo da neurotoxina à volta do cancro. É ainda outro objectivo da neurotoxina em redor do cancro, circunde a periferia do cancro. É um objectivo adicional da neurotoxina Botulinum. 17

Ainda outro objectivo da invenção é aplicar a neurotoxina através de injecção. E um objectivo adicional da invenção modular positivamente o sistema imunitário, humoral e/ou celular. É um objectivo adicional da invenção tratar uma doença autoimune, doença fúngica, doença virai, doença mediada por um virus ou imunodeficiência, ou estado imunodeficiente. A presente invenção refere-se à utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma neurotoxina farmaceuticamente aceitável de acordo com as reivindicações.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método de tratamento de um cancro utilizando uma neurotoxina, de um modo preferido, toxina de Botulinum. A aplicação de uma neurotoxina em volta de um cancro actua para diminuir o efeito de comprimir células contrácteis na disseminação do cancro através do tecido e através de túbulos que drenam o cancro. A aplicação também paralisa o músculo linfático que comprime células cancerígenas e linfa ao longo da circulação. A aplicação também modula positivamente o sistema imunitário para aumentar os mecanismos celular ou humoral contra o cancro. Após a administração da toxina de botulinum em volta de um cancro, a disseminação regional e distante é reduzida ou eliminada. Em particular, a neurotoxina é administrada de modo a que circunde o cancro. 18 A invenção realiza um método de inibição do crescimento, invasão ou disseminação de células cancerígenas utilizando uma neurotoxina. 0 método é facilmente adaptado à terapia de cancro no momento em que um cancro é inicialmente diagnosticado e pode melhorar significativamente o desfecho de um doente diagnosticado com cancro reduzindo a disseminação local, regional ou distante. A técnica pode ser utilizada para doentes que foram submetidos a cirurgia, terapia de radiação, quimioterapia ou outras formas de tratamento para o cancro diagnosticado Também pode ser utilizada como uma modalidade única de terapia. A neurotoxina é, de um modo preferido, aplicada por injecção. Em particular, a neurotoxina é injectada no tumor numa quantidade suficiente que circunda a periferia do tumor. Este último método pode ser realizado através de uma única injecção ou múltiplas injecções. Obviamente, se estiver acessível, entende-se que a neurotoxina pode ser aplicada topicamente à periferia do tumor. Também, por exemplo, no caso de cancro do pulmão, a neurotoxina pode ser aplicada através de aerossóis. Além disso, entende-se que a neurotoxina pode ser aplicada em volta da metástase para induzir os efeitos desejados. A neurotoxina, pode também ser injectada no tecido linfóide local, regional ou distante que pode ser realizado com monitorização visual (a olho nu ou com lente) ou radiográfica, tal como uma monitorização por rastreio de TAC ou ecografia. A terapia é aplicável, mas não está limitada aos seguintes locais. Região muscular, mesmo ao nível microscópico, em redor de quase qualquer localização corporal e deste modo, a maioria dos sítios corporais são adequados para tratamento com 19 neurotoxina. Em relação a sítios de injecção linfóide, pode injectar-se os tecidos linfóides regionais circundantes (se o cancro estiver presente numa superfície da mucosa) e/ou as bacias nodais regionais. As injecções distantes no timo, baço, medula óssea ou outros sítios hematopoiéticos podem ser realizadas também por injecção. A terapia é também aplicável a outras doenças caracterizadas por uma fraca resposta celular ou humoral. A toxina de Botulinum pode ser injectada localmente em áreas caracterizadas por uma fraca resposta celular ou humoral, tal como no pâncreas no doente com diabetes dependente da insulina, na mucosa do nariz num doente com sinusite fúngica, na verruga do doente com veruca vulgaris ou numa ferida do doente com uma ferida que não sara, ou no timo, baço ou medula óssea no caso de um doente com imunodeficiência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é distinta na medida em que trata células normais, não doentes, não cancerosas de modo a tratar um cancro. Tratamento significa reduzir, prevenir ou eliminar células cancerígenas ou a disseminação de células cancerígenas ou dos sintomas de cancro na circulação local, regional ou sistémica. A presente invenção trata cancro, metástases e estados pré-cancerosos, assim como crescimentos ou distúrbios mediados por vírus, infecções crónicas e distúrbios imuno-mediados injectando de uma forma distante a toxina de botulinum. Aa injecções de toxina de Botulinum irão reduzir ou eliminar os sintomas de um cancro, metástase ou metástases, estados pré- cancerosos , crescimentos ou distúrbios mediados por um vírus, 20 infecçoes crónicas e distúrbios imuno-mediados. 0 distúrbio preferido é o cancro.

Para o presente pedido, os termos neoplasma e cancro são utilizados indistintamente e ambos os termos são entendidos como incluindo estados pré-cancerosos.

Contrariamente à técnica anterior que ensina como tratar um tecido doente, tal como um cancro com uma neurotoxina, o presente método baseia-se não no efeito directo da toxina de botulinum num cancro ou na sua enervação, mas antes na bem conhecida afinidade da toxina de botulinum para o músculo, especificamente o músculo que circunda o cancro. Devido à afinidade extremamente elevada da toxina para o músculo, este método coloca uma vantagem significativa em relação à técnica anterior na medida em que podem ser utilizadas doses de toxina muito mais pequenas para induzir um efeito. As doses mais pequenas irão resultar em menos efeitos colaterais relacionados com a dose, tais como a disseminação inadvertida da toxina através dos tecidos às estruturas vizinhas e resistência a futuras injecções de botulinum. Haverá disseminação limitada à vizinhança do cancro ou directamente para o cancro uma vez que a toxina se liga rapidamente à junção neuromuscular na vizinhança da injecção. Além disso, mesmo se a toxina se disseminasse pelo cancro ou a sua vizinhança, as doses pequenas não exerceriam um efeito sobre o tecido doente que tem pouca afinidade para o substrato da toxina. De facto, as doses utilizadas na forma de realização preferida já foram aprovadas pela FDA para utilização noutros estados neuromusculares que são tratados com toxina de botulinum. 21

Outra vantagem distinta da presente invenção é que este é um método 'sem tocar', que evita intencionalmente o cancro ou a sua vizinhança. Uma vez que a aplicação não é realizada por injecção com agulha no cancro ou próximo deste, não há o risco de, inadvertidamente, semear células cancerígenas no tecido circundante e não há o risco de criar um gradiente de pressão local que pode empurrar as células cancerígenas no tecido circundante ou nos vasos sanguíneos ou canais linfáticos pré tratados. A invenção é também nova na medida em que modula distantemente o sistema imunitário para aumentar a actividade imunológica contra o cancro, metástases, estados pré-cancerosos, crescimentos ou distúrbios mediados por vírus, infecções crónicas e distúrbios imuno-mediados. Uma injecção distante num nódulo linfático, tecido linfático regional ou imunológico produzindo ou aumentando s estrutura (tais como o baço ou o timo) podem aumentar as respostas linfocíticas ou humorais contra o estado.

No tratamento de estados não cancerosos, tais como infecções virais, doenças virais, crescimentos induzidos por vírus, doenças autoimunes, esclerose múltipla, feridas crónicas, infecções crónicas, infecções ósseas, artrite reumatóide, miastenia gravis, HIV, síndrome da fadiga crónica e hepatite, a neurotoxina pode ser administrada do mesmo modo e utilizando as mesmas dosagens, na medida em que é administrado para tratar neoplasmas. Isto é, a neurotoxina pode ser aplicada à área em redor de tecido doente ou afectado, assim como opcionalmente nódulos linfáticos proximais e/ou distais, o timo, o baço e/ou a medula óssea. Existem, no entanto, vários outros métodos 22 opcionais para aplicar neurotoxina para tratar esses estados não cancerosos.

Por exemplo, quando uma área específica de tecido doente ou afectado pode ser identificada, a neurotoxina pode ser injectada directamente para o tecido doente ou afectado. Deste modo, se um doente sofre da diabetes do tipo 1, a neurotoxina pode ser injectada directamente no pâncreas. Para a esclerose múltipla, a neurotoxina é injectada intratecalmente. Para infecções crónicas, infecções virais, doenças virais e crescimentos induzidos por vírus, a neurotoxina pode ser directamente injectada nos tecidos afectados. Para a hepatite, a neurotoxina pode ser injectada directamente no fígado. Para a síndrome de Sjogren, a neurotoxina pode ser injectada directamente nas glândulas que produzem humidade.

Para tratar de uma doença autoimune que afecta os vasos sanguíneos, a neurotoxina pode ser aplicada aos tecidos circundantes dos vasos sanguíneos, permitindo a difusão da neurotoxina nos vasos sanguíneos.

Para tratar os estados acima descritos, a neurotoxina pode também ser aplicada à área circundante do tecido afectado. Além disso, a neurotoxina pode ser ainda injectada nos nódulos linfáticos proximais, os nódulos linfáticos distais, o timo e/ou o baço.

Alguns estados, tais como fadiga crónica, HIV e SIDA, são sistemáticos e não envolvem um único sistema de órgão ou tecido. Nesse caso, o estado é tratado injectando o timo, baço ou medula óssea. Obviamente, os nódulos linfáticos podem também ser injectados. 23

Para injectar um órgão ou um tecido, especialmente um que não possa ser visto visualmente, a agulha pode ser guiada até ao local utilizando técnicas convencionais. Estas técnicas incluem, mas não estão limitadas a, palpitação, monitorização por ultra-som, monitorização por rastreio de TAC e monitorização por raios X.

Uma neurotoxina preferida é a toxina de botulinum do tipo A. As dosagens utilizadas são as mesmas que as utilizadas para tratar neoplasmas.

Toxina de Botulinum

A bactéria anaeróbica, gram positiva Clostridium botulinum produz uma neurotoxina polipeptídica potente, toxina de botulinum, que pode provocar uma neuro-paralisia em humanos. A neuro-paralisia é normalmente referida como botulismo. A bactéria Clostridium botulinum é normalmente encontrada no solo e cresce em recipientes de alimentos inadequadamente esterilizados. Os sinais e os sintomas do botulismo ocorrem normalmente em humanos num período de 18 a 36 horas após consumirem alimentos que contêm uma cultura de Clostridium botulinum. Pensa-se que a toxina de botulinum pode passar através do revestimento do tracto intestinal e afectar os neurónios motores periféricos. Os sintomas de botulinum começam com a dificuldade em andar, engolir e falar, e o progresso da paralisia dos músculos respiratórios, resultando na morte. 24

Utilização de Toxina de Botulinum para Terapia do Cancro: A Influência Colinérgica No Cancro: 1) Algumas Células Cancerosas São Activadas pela Estimulação Colinérgica.

Foi demonstrado que várias formas de cancro possuem receptores colinérgicos muscarínicos que são capazes de induzir a mitogénese em células capazes de se submeterem a proliferação celular.

Próstata: Carbacol, um análogo da acetilcolina, estimula a síntese de ADN em células cancerígenas da próstata (Rayford W. et al. Muscarinic Cholinergic Receptors Promote Growth of Human Prostate Câncer Cells. The Prostate 30, 1997, resumo) e a estimulação do receptor muscarínico M3 em células cancerígenas da próstata estimula a proliferação (Luthin GR, et al. Role of mL receptor-G protein coupling in cell proliferation in the prostate. Life Sei 60, 1997, resumo). Cólon: Os receptores de M3 são sobre-expressos em cancro do cólon humano em comparação com tecido do cólon normal, e a activação deste receptor pode contribuir para a progressão maligna de carcinoma do cólon humano (Yang W, et ai. Cholinergic receptor up-regulates COX-2 expression and prostaglandin E2 production in colon câncer cells. Carcinogensis 21, 2000, pg. 1789). Ukegawa (Ukegawa J, et al. Growth-promoting effect of muscarinic acetilcholine receptors in colon câncer cells. J Câncer Res Clin Oncol 129, 2003" resumo) recentemente demonstraram que a activação do receptor M3 muscarínico 25 colinérgico possui um efeito de promoção do crescimento em linhas de células cancerígenas do cólon.

Pulmão: A estimulação do receptor da acetilcolina muscarínico expressa em carcinoma do pulmão de célula pequena estimula o crescimento celular (Song P, et al. Acetylcholine is symthesized by and acts as an autocrine growth factor for small cell lung carcinoma. Câncer Res 63, 2003, resumo). Foi demonstrado que linhas de células cancerígenas do pulmão de célula pequena sintetizam e secretam acetilcolina para actuar como um factor de crescimento autócrino (Song, P. et al. A acetilcolina é sintetizada por, e actua como, um factor de crescimento autócrino para carcinoma do pulmão de célula pequena. Câncer Res 63, 2003, resumo). O crescimento da célula do mesotelioma humano é modulado pelo sistema nervoso colinérgico e os agonistas possuem um efeito proliferativo (Trombino S, et al. Alpha-7 nicotinic acetylcholine receptors affect growth regulation of human mesothelioma cells: Role of Mitogen-activated Protein Kinase Pathway. Câncer Res 64, 2004, pg. 135). Num facto interessante, Williams observou que a estimulação dos receptores muscarínicos aumentou a adesão célula-célula no carcinoma do pulmão de célula pequena.

Mama: Linhas celulares de adenocarcinoma mamário de murino sofrem proliferação em resposta ao carbacol que é mediada via activação do receptor de M3 (Espanol A, et al. Different muscarinic receptors are involved in the proliferation of murine mammary adenocarcinoma cell lines. Int J Mol Med 13, 2004, abstract). Cérebro: A estimulação do carbacol provocou um aumento da proliferação de células do astrocitoma humano, dependente da 26 dose e do tempo (Guizetti M, et al. Acetylcohline as a mitogen: muscarinic receptor-mediated proliferation of rat astrocytes and human astrocytoma cells. Eur J Pharmacol 297, 1996, resumo).

Melanoma: As células de melanoma primário e metastásico reexpressam os receptores colinérgicos muscarinicos, que, quando estimulados, provocam movimentos e contracções celulares (Sailer M, et ai. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol 201:27-37, 2000). Foi colocada a hipótese de que essa estimulação pode ser responsável pelo crescimento invasivo do melanoma, e também que uma ansa autócrina colinérgica pode ser estabelecida no melanoma. Num estudo histoquimico, observou-se que os receptores da acetilcolina muscarinicos são mais elevados na periferia do melanoma, na sua junção com tecido normal (Lammerding-Koppel M, et al. Immunohistochemical localization of muscarinic acetylcholine receptors in primary and metastatic malignant melanomas. J Cut Pathol 25, 1997, resumo).

Linfócitos: As células T leucémicas humanas possuem o potencial para sintetizar e libertar a acetilcolina que pode desempenhar um papel na regulação das respostas imunitárias dependentes de células t (Fjuii T, et ai. Localization and synthesis of acetylcholine in human leucemic T cell lines. J.

Neurosci Rest 44, 1996, resumo).

Ovário: No cancro do ovário, não apenas uma grande percentagem de cancros do ovário expressam receptores muscarinicos, mas essa expressão foi associada com uma probabilidade reduzida de sobrevivência (Oppitz M, et al.

Muscarinic receptors in cell lines from ovarian carcinoma: 27 negative correlation with survival of patients. Gynecol Oncol 85, 2002, resumo).

Cabeça e Pescoço: 0 tratamento de carbacol do carcinoma de células escamosas do pescoço e cabeça activa o receptor do factor de crescimento da epiderme (EGFR) que desempenha um papel directo na regulação do comportamento migratório das células da cabeça e pescoço (Geschwind A, et ai. Lysophosphatidic Acid-induced Squamous Cell Carcinoma Cell Proliferation and Motility Involves Epidermal Growth Factor Receptor Signal Transduction. Câncer Res 62, 2002 p. 6335) . De facto, a activação de EGFR conduz à invasão de células escamosas da cabeça e do pescoço (Geschwind A, et ai. Lysophosphatidic Acid-induced Squarrious Cell Carcinoma Cell Proliferation and Motility Involves

Epidermal Growth Factor Receptor Signal Transduction. Câncer Res 62, 2002 p. 6335). Além disso, o efeito pode ser mediado por anfirregulina. Nas células de carcinoma de célula escamosa, carbacol especificamente resulta na libertação de anfirregulina (Geschwind A, et al. TACE cleavage of proamphiregulin regulates GPCR-induced Proliferation and motility of câncer cells. EMBO J 22, 2003, resumo). A anfirregulina é conhecida pela libertação de enzimas metaloproteases em linhas celulares malignas e essa libertação pode estar associada a invasividade local e metástases (Lui, Z, et al. Regulation of matrix metalloprotease activity in malignant mesothelioma cell lines by growth factors. Thorax 58:198-203, 2003)). No cancro do pulmão de célula pequena, a anfirregulina pode inibir a apoptose (Hurbin A, et al. Inhibition of apoptosis by amphiregulin via an insulin-like growth factor-1 receptor-dependent pathway in non-small cell lung câncer cell lines. Ann NY Acad Sei 1010, 2003, resumo). 28 2) Algumas Células Cancerosas São Inibidas Pela Activação Colinérqica

Também foi demonstrado que no carcinoma do pulmão de célula pequena (SCLC), a activação dos receptores de acetilcolina muscarínicos M3 provoca uma diminuição da proliferação celular, aumento da adesão célula-célula mediada pela E-caderina e aumento da adesão célula-substrato mediada pela Beta 1 integrina (Williams, muscarinic signaling in carcinoma cells, Life Sciences 72 (2003), 2173-2182). 0 aumento da adesão célula-célula e da adesão célula-substrato iria produzir metástases diminuídas. A estimulação colinérgica da linha celular pré-neoplásica (NIH3T3) pode provocar também mecanismos inibidores e estimuladores de crescimento (Nicke, B. et al. Muscarinic Cholinergic Receptors activate both inhibitory and stimulatory growth mechanisms in NIH3T3 cells, J. Biol. Chem. 1999, vol. 274, n° 31, pp. 21701-21706). 3) Alguns Cancros Sao Enervados Para-simpaticamente

Em 2001, foi publicado o primeiro relato que demonstrou que o tecido neoplásico é enervado (Seifert P, et al. Tumors may be innervated. Virchows Arch 438, 2001, resumo). Em 2002, Seifert relatou que os carcinomas da bexiga papilar eram enervados para-simpaticamente (Seifert P, et al. Nerve fibers in tumors of the human urinary bladder. Virchows Arch 440:291-297, 2002). 29 4) A angiogénese é Estimulada Pela Acetilcolina A angiogénese consiste em processos sequenciais que emanam de células endoteliais microvasculares. 0 sistema nervoso para-simpático demonstrou modular positivamente a neovascularização através da estimulação de receptores M3 e libertação da prostaglandina E2 (Heeschen C, et al. A Novel Angiogenis Pathway Mediated by Non-Neuronal Nicotinic Acetilcolina Receptors. Journal of Clin Invest 110:527-536, 2002)). 5) Bloquear o 'Mecanismo Universal de Ligaçao' Em Células Cancerígenas

Foi teorizado e demonstrado que a toxina de botulinum actua inibindo um 'Mecanismo Universal de Ligação' em todas as células através de interferência com a formação de um complexo SNARE entre duas membranas que irão fundir e sofrer exocitose. Este conceito foi aplicado ao tratamento do cancro, teorizando que esse efeito irá ajudar a reduzir a actividade das células cancerígenas (documento US 2005/0031648 Al) ou reduzir a associação do filamento de actina e, deste modo, reduzir o movimento das células cancerígenas (documento WO 2005/030248).

Existem limitações práticas e de segurança significativas para esta abordagem, que foram detalhadas abaixo. Primeiro, a toxina de botulinum não entra em células não neuronais a menos que a célula tenha sido permeabilizada (apenas in vitro), foi encontrado um veículo de transporte (apenas in vitro) ou se foi injectada uma dose de toxina significativamente mais elevada. Doses mais elevadas de injecções de botulinum podem provocar uma disseminação superior inadvertida com subsequente paralisia das 30 estruturas vizinhas, resistência aumentada a futuras injecções. Outras limitações práticas de injectar um cancro com toxina de botulinum foram também detalhadas acima, mas incluem a possivel sementeira de células cancerígenas no tecido vizinho normal, penetração de vasos linfáticos ou vasos sanguíneos no cancro provocando uma probabilidade de disseminação superior ou produzindo um efeito de bólus pressurizado no cancro que pode conduzir a disseminação. CONCLUSÃO: A incerteza significativa de resposta de um cancro à toxina de botulinum iria proibir a sua utilização directa nos tecidos cancerosos. Conclui-se que se deve evitar introduzir a toxina de botulinum num cancro. 6) Injecções Distantes De Toxina de Botulinum Irão Reduzir As Metástases E Proporcionar uma Terapia de Cancro Local Mais Segura

Para curar o cancro, é da máxima importância controlar não apenas a doença a nível local, mas controlar e tratar a disseminação à distância, as denominadas metástases. As metástases podem ser regionais (nas estruturas linfáticas vizinhas) ou distantes (afastadas do sítio primário). As metástases ocorrem geralmente por disseminação linfática ou hematogénica. A disseminação através dos canais linfáticos é facilitada principalmente através da contracção das fibras do músculo esquelético ou liso que circundam a rede linfática. É bem conhecido que a toxina de botulinum possui a afinidade absoluta mais forte para as fibras do músculo esquelético e enfraquece-as ou paralisa-as após exposição. São necessárias quantidades diminutas de toxina para realizar isto e o intervalo 31 das doses que é necessário para realizar isto está bem estabelecido para outros estados não cancerosos. Além disso, está bem estabelecido que o sistema imunitário é de importância fundamental na eliminação de células cancerosas no local primário e na circulação. A presente invenção realiza-o mas não está limitada ao tratamento de cancro através do tratamento do cancro no sitio primário aumentando a resposta imunitária às células malignas, prevenindo a disseminação através do enfraquecimento das forças contrácteis regionais nas estruturas linfáticas e de vasos de hemorragia e em redor destes, e tratando as células cancerosas que estão na circulação. A presente invenção é distinta da técnica anterior no sentido em que a toxina não é injectada próximo das células cancerosas. A presente invenção coloca várias vantagens em relação à técnica anterior incluindo a necessidade de utilizar doses mais pequenas, evitar as injecções directas no cancro, evitar as respostas incertas de uma célula cancerígena à toxina de botulinum.

Segue-se uma revisão de anatomia relevante: 1) Localização Do Tecido Linfático

Além dos vasos sanguíneos, o corpo humano possui um sistema de canais que recolhem fluido dos espaços do tecido e devolvem-no ao sangue. Este fluido é denominado linfa e em contraste com o sangue, circula apenas numa direcção, em direcção ao coração.

Os capilares linfáticos têm origem como vasos de paredes finas tipo persianas. Eles consistem em endotélio de paredes 32 finas. Estes vasos de paredes finas, por último convergem e terminam como dois troncos principais, o dueto torácico e o dueto linfático direito. Estes entram na junção da veia jugular interna esquerda e a veia subclávia esquerda, e para a confluência da veia subclávia direita e a veia jugular interna direita. Intercalados na via dos vasos linfáticos estão os nódulos linfáticos. Os vasos linfáticos maiores possuem uma camada de músculo liso que ajuda a impulsionar o fluxo da linfa através dos canais e a linfa unidireccional ocorre secundária à presença de muitas válvulas de um sentido.

Os duetos linfáticos de tamanho grande (duetos linfáticos torácico e direito) possuem uma camada de músculo liso reforçado no meio, no qual os músculos estão orientados longitudinalmente e circularmente. Eles contêm vasa vasorum e uma rede neural rica (Junqueira L, Basic Histology, 1986, Lange Medicai Publications, página 269)

Tecido Linfóide 0 baço, timo e medula óssea são também considerados tecido linfóide. Estes órgãos linfóides são classificados como sendo central ou periférico e encapsulado (e. g. baço ou nódulos linfáticos) ou não encapsulado (e. g. , amígdalas, placas de peyers no intestino, nódulos linfóides encontrados ao longo da mucosa do tracto alimentar, respiratório, urinário e reprodutivo). (Junqueira L, Basic Histology, 1986, Lange Medicai Publications, página 269).

Em geral, as células linfóides começam num órgão linfóide 'central' no qual os precursores linfóides sofrem proliferação 33 independente do antigénio e adquirem antigénios de superfície que as marcam como comprometidas com a resposta imunitária celular ou humoral. 0 timo é o órgão central no qual os linfócitos adquirem a capacidade para participar ma resposta imunitária celular (células T) . As células migram através do sangue da medula óssea para o timo, onde proliferam, dando origem às células T. Estes linfócitos são responsáveis pelas reacções imunitárias mediadas pelas células. A medula óssea é onde as células progenitoras se diferenciam em células imunitárias do sistema humoral (células B) que por fim se tornam células do plasma e secretam imunoglobulinas e proporcionam a resposta imunitária humoral. Os linfócitos deixam os órgãos linfóides centrais e populam regiões específicas dos órgãos linfóides 'periféricos', tais como os nódulos da linfa, baço, pensos de Peyer e tecido linfóide difuso não encapsulado na mucosa dos tractos digestivo, respiratório, urinário e reprodutor (Junqueira L, Basic Histology, 1986, Lange Medicai Publications, página 269).

Baço: 0 baço é o maior órgão linfático no sistema circulatório. 0 baço é um sítio de formação de linfócitos activados. Serve para filtrar e modificar o sangue.

Timo: 0 timo é um órgão linfóide central localizado no mediastinum. Existe uma proliferação linfocítica intensa que ocorre no timo durante o desenvolvimento embrionário até ao desenvolvimento pré-pubertal. Isto é onde as células proliferam para se tornarem linfócitos T, as células responsáveis pela imunidade mediada por células. A partir do timo, estas células T saem através dos vasos sanguíneos para popularem os órgãos linfóides periféricos, especialmente nódulos linfáticos e o baço. 34

Medula Óssea: A medula óssea é também um orgão central, mas dá origem às células B, que por último se diferenciam em células do plasma e secretam anticorpos (o sistema imunitário humoral). Após a diferenciação, as células B viajam para os nódulos linfáticos, o baço e especialmente os pensos de Peyer no intestino (Junqueira, supra, página 312). Nódulos Linfáticos: Os nódulos linfáticos são áreas encapsuladas de tecido linfóide periférico. Eles são distribuídos ao longo do corpo, sempre ao longo do curso dos vasos linfóides, que transportam a linfa para os duetos torácico e linfático (Junqueira, supra, página 313) . Os nódulos linfáticos são agregados em sítios particulares, tais como o pescoço, axilas, virilhas e região para-aórtica. A localização precisa dos nódulos linfáticos é bem conhecida. Ver, e. g., UAMS Department of Anatomy - Lymphatics Tables (16 de Julho de 2005) (endereço de e-mail hhtp:Wanatomy.uams.edu/anatomyhtml/lymph-alpha.html), que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. A linfa entra nos nódulos linfáticos através do canal linfático aferente e sai através do canal eferente. O fluxo é unidireccional. Como a linfa flui através dos sinos, 99% ou mais dos antigénios ou outros resíduos são removidos pela actividade fagocítica dos macrófagos no nódulo. Algum do material está preso na superfície das células dendríticas, que é então exposto na superfície da célula dendrítica e reconhecido e actuam sobre ele os linfócitos imunocompetentes. O parênquima de um nódulo linfático possui três regiões gerais, o córtex, paracórtex e medula. 35

No córtex, se uma célula B reconhece um antigénio (e por vezes com o auxílio de células T) A célula B pode tornar-se activada e sintetizar anticorpos que são libertados para o fluido linfático então na circulação. As células B activadas permanecem no nódulo linfático. As células B não estimuladas passam para fora do nódulo linfático e regressam à circulação geral.

As células T permanecem predominantemente na região do paracórtex do nódulo linfático. As células T activadas passam para a circulação para alcançar o sítio periférico. Outros tipos de células, predominantemente células que apresentam antigénios, residem na região paracortical do nódulo linfático. A medula é rica em células do plasma que produzem mais anticorpos e macrófagos.

Tecido não encapsulado: 0 tecido linfóide não encapsulado pode ser encontrado principalmente no tecido conjuntivo solto de muitos órgãos, principalmente na lamina própria do tracto digestivo, tracto respiratório superior e passagens urinárias (Junqueira, supra, página 323). 0 palatino, amígdala lingual e faríngica são outro sítio principal de tecido linfóide não encapsulado. Este denominado tecido linfóide associado à mucosa (MAL T) inclui o tecido linfóide associado ao tracto digestivo (GALT), tecido linfóide associado ao brônquio/traqueia (BALT) tecido linfóide associado ao nariz (NALT) e tecido linfóide associado à região vulvovaginal (VALT). 0 MALT adicional existe nos órgãos acessórios do tracto digestivo, predominantemente a glândula parótida. 36 0 MALT pode consistir numa colecção de células linfóides ou pode incluir nódulos linfáticos solitários pequenos. A estimulação dos linfócitos B conduz à produção de imunoglobulina A (IgA) e IgM nas placas de Peyers. Além disso, as superfícies epiteliais contêm células M que são células especializadas que absorvem, transportam e apresentam antigénios às células linfóides subepiteliais, tais como células auxiliares CD4 do tipo 1, células que apresentam antigénio e células de memória.

Uma discussão mais específica dos linfócitos irá seguir-se abaixo, mas geralmente, os linfócitos contêm receptores do antigénio que desencadeiam diferenciação. Em órgãos periféricos, os linfócitos interactuam com antigénios apropriados, aumentam depois dividem-se. Alguns tornam-se células efectoras e outros tornam-se células de memória que são responsáveis pela resposta imunitária secundária. Para gerar uma resposta imunitária e para que sejam geradas células efectoras, o antigénio deve ser distribuído a estas. Esta é a função das células que apresentam antigénios que incluem células dendríticas, macrófagos e células de Langhans na epiderme.

As células efectoras podem ser células B ou T activadas. As células B efectoras são células do plasma que secretam imunoglobulinas para os tecidos conjuntivos circundantes. As células T efectoras são de vários tipos e incluem células T auxiliares, células T supressoras e células T citotóxicas. As células atacadas incluem células tumorais e células infectadas por vírus. As células T e os macrófagos secretam linfocinas que regulam a proliferação de ambas as células B e T. 37

Fluxo Linfático 0 sistema linfático encontra-se em quase todos os órgãos, excepto o sistema nervoso central e a medula óssea. A circulação linfática é auxiliada pela acção de forças externas, tal como a contracção do músculo esquelético circundante nas suas paredes. (Junqueira, supra, página 269) . Estas forças provocam o transporte ao longo dos canais linfáticos. A contracção do músculo liso nas paredes dos vasos linfáticos maiores também auxiliam a impulsionar a linfa. 0 transporte da linfa depende das forças motrizes activa e passiva. A força motriz activa que resulta da actividade de uma bomba intrínseca em alguns vasos linfáticos desempenha um papel importante na propulsão do fluxo linfático (Hosaka K, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol 284, 2003, resumo). Há um tom miogénico nos canais linfáticos. Foi demonstrado que a via da cinase Rho (que é inibida pela toxina de botulinum) ajuda a regular a actividade da bomba da linfa (Hosaka, supra). De facto, foi demonstrado que vasos linfáticos são capazes de regulação de fluxo através de mecanismos intrínsecos (Ferguson MK, et ai. Lymphology 27(2), 1994 resumo e, Muthuchamy M, et ai. Molecular and Functional analyses of the contractile apparatus in lymphatic muscle. FASEB J 17, 2003, resumo). Duetos linfáticos maiores contêm músculo liso e uma rede neural rica (Junqueira, supra, página 269). Vários factores auxiliam o fluxo de liquido linfático dos espaços do tecido para os nódulos linfáticos e finalmente para a corrente de sangue venoso: 1) "Pressão de filtração" nos espaços do tecido, gerada por filtração do fluido sob pressão a partir dos capilares hemo; 2) A contracção dos músculos vizinhos comprime os vasos linfáticos, movendo a linfa na direcção determinada pela disposição das válvulas; 3) Pulsação das 38 artérias adjacentes; 4) Movimentos respiratórios e a baixa pressão sanguínea na veia braquiocefálica durante a inspiração; 5) 0 músculo liso nas paredes dos troncos linfáticos é mais marcada proximal para as suas valvas. As contracções pulsáteis no dueto torácico também são conhecidas por ocorrerem. 2) Linfáticos, Cancro E Metástases

Os cancros disseminam-se pelas circulações linfáticas e hematogénicas. Os sistemas linfático e vascular têm várias ligações e as células tumorais podem passar de um sistema para outro. Durante a invasão, as células cancerígenas podem entrar nos vasos linfáticos pequenos de parede fina e ser transportados passivamente para a linfa. Os êmbolos tumorais podem ser presos no primeiro nódulo linfático ou nódulos (nódulos "regionais") encontrados na sua via, ou podem desviar-se de nódulos regionais e serem transportados para grupos nodais distantes ("metástases de salto"). Avanços recentes no mapeamento dos cancros de drenagem linfáticos permitiram aos cirurgiões identificar o nódulo linfático drenando o sítio tumoral (o "nódulo linfático sentinela").

Cada região corporal normalmente drena para um nódulo linfático seleccionado ou grupo de nódulos, que foram detalhados precisamente em estudos anatómicos e é conhecida na técnica. Ver, e. g., UAMS Department of Anatomy-Lymphatic Tables, supra, previamente incorporado neste pedido na sua totalidade.

Determinados factores podem facilitar a entrada das células cancerígenas na circulação e conduzir a metástases. A pressão física num ambiente canceroso pode conduzir à disseminação de 39 células malignas local e distantemente (Targarona EM, et al. World J Surg 22, 57-58, 1998, e Lacy AM, et al. Surg Endosc 1988, 12:1040-1041). Também, foi defendida uma técnica de 'não tocar' de excisão cirúrgica para reduzir o efeito de 'massagem' das células cancerígenas na circulação através de manipulação. Nesta técnica é importante ligar o fornecimento de sangue do tumor antes de tentar a mobilização do tumor. Estas várias técnicas clinicas enfatizam a necessidade de minimizar manipulação física directa de um cancro para reduzir hipóteses de facilitar a disseminação.

Clinicamente, foi demonstrado (Hiroto M, et al. Journal of Pancreas 6(2):143-151, 2005), que todas as amostras de fluido linfático comprimidas a partir de tecido pancreático canceroso resectado foram positivos para o ARN mensageiro de CEA, urgindo a necessidade de minimizar a disseminação da drenagem do fluido linfático de um cancro. 3) A Toxina de Botulinum Irá Enfraquecer o Trânsito Linfático O efeito da toxina de botulinum no músculo esquelético é bem conhecido. De facto, é a base da terapia para estados tais como estrabismo, distonias e outros estados do músculo espástico. A FDA concedeu aprovação à terapia de botulinum para o estrabismo, blefarospasmo, distonias cervicais e outros. A gama de doses necessárias para paralisar vários músculos no corpo está bem estabelecida.

Uma injecção regional de toxina de botulinum à volta de um cancro irá explorar a afinidade de ligação bem conhecida de 40 botulinum para o músculo. Músculo esquelético, músculo liso, músculo linfático, músculo do vaso sanguíneo e o músculo de pericite serão o alvo não limitante desta invenção. A paralisia do músculo esquelético ou liso circundante irá limitar as forças contrácteis extrínsecas nas estruturas linfáticas que normalmente facilitam o fluxo de linfa através de canais linfáticos. Os músculos intrínsecos nos túbulos linfáticos irão ser paralisados ou enfraquecidos pela terapia do botulinum. A parede do músculo liso dos vasos sanguíneos irá ser também enfraquecida (?JERRY-adiciona isto acerca de vasos sanguíneos?). Método Alternativo De Tratamento Do Cancro Com Injecções de Toxina de Botulinum Distante:

Um segundo método de tratamento de cancro com injecções de botulinum distante refere-se à capacidade para modificar o sistema imunitário e aumentar a resposta ao cancro utilizando terapia de toxina de botulinum. A base para isto refere-se à enervação colinérgica do sistema imunitário e, deste modo, também se refere ao tratamento de outros estados não cancerosos que existem devido a uma resposta imunitária fraca ou enfraquecida. A respeito da terapia do cancro, é novamente importante evitar introduzir a toxina nas células cancerígenas uma vez que a exocitose nas células cancerígenas é muito importante para apresentar os antigénios apropriados para o reconhecimento imunitário e a destruição pelo sistema imunitário. De facto, injecções distantes da toxina nos órgãos linfáticos (nódulos linfáticos, tecido linfático) são preferidas. 41 1) Resposta Imunitária Normal Ao Cancro

As respostas imunitárias antitumorais podem ser inatas (naturais) ou adquiridas (adaptativas). A imunidade inata é mediada por células ou factores solúveis que existem naturalmente nos tecidos dos fluidos corporais e podem interferir com o crescimento tumoral (Whiteside TL. J. Allergy Clin Immunol 2003; 111, S677-86). As células hematopoiéticas incluídas são macrófagos, granulócitos, células assassinas naturais, células T não restritas a MHC e células T gama/delta. Também, os anticorpos naturais dirigidos aos componentes de superfície das células tumorais, componentes de complemento, proteína reactiva C, proteína amilóide do soro, proteína de ligação à manose estão também incluídas (Whiteside, supra). A imunidade adaptativa é mediada por células T que reconhecem os péptidos derivados do tumor ligados às moléculas de MHC próprias expressas em células de apresentação do antigénio (APC). Estas células incluem células efectoras citolíticas, que são restritas a CD8+ e MHC de classe I, mas também células T CD4+ auxiliares (Whiteside, supra).

As respostas imunitárias a células malignas podem ser categorizadas como locais/regionais ou sistémicas. As respostas locais incluem leucócitos de infiltração ao tumor (TIL). As respostas sistémicas existem e são medidas pela circulação periférica retardada do tipo hipersensibilidade (DTH) em doentes com cancro. 42 2) Células Imunitárias No Microambiente Tumoral

Whiteside, supra, revê o microambiente tumoral. Os TIL são frequentemente encontrados em tumores. Estas células podem incluir células que mediam a imunidade inata e adaptativa. Uma variedade de produtos solúveis, tais como citocinas e anticorpos pode ser libertada no microambiente também. Teoricamente, estes produtos combinados com interacções directas nas células efectoras de infiltração devem resultar na morte da célula cancerígena, mas devido aos mecanismos delineados acima, isto não ocorre frequentemente.

As células T encontram-se na maior abundância de todos os infiltrados tumorais mononucleares. Foi demonstrado que as células T no microambiente do tumor, incluem células CD4 + (auxiliares) e CD8+ (supressoras). Elas demonstraram ser disfuncionais em doentes com cancro e a magnitude da sua disfunção pode estar relacionada como o prognóstico e a sobrevivência em doentes com cancro. Tradicionalmente, a resposta de células T protectoras aos tumores foi atribuída aos linfócitos CD8 T com actividade citotóxica, que estão restritos pelas moléculas de MHC de Classe I, mas recentemente as células CD4 foram consideradas como desempenhando um papel anti-tumoral (Gerloni M, et al. Springer Seminars in Immunopathology, Springer-Verlag 2005, 1-15). Em geral, as respostas celular e mediada por anticorpo são utilizadas para respostas anti-tumorais. As respostas de anticorpo são mais adequadas para agentes patogénicos e antigénios extracelulares, e as respostas mediadas por células estão mais adequadas para agentes patogénicos intracelulares e células tumorais (Gerloni, supra). Uma vez que os antigénios tumorais são sempre antigénios endógenos, os tumores pode ser melhor adequados para destruição 43 por imunidade mediada por células. Além disso, uma vez que os tumores são MHC II negativos, a maioria dos esforços focaram-se em linfócitos CD8 T. 0 papel dos linfócitos CD4 foi também demonstrado, uma vez que eles ajudam também a activar e expandir os linfócitos CD8. Existem dois subconjuntos de linfócitos CD4, as células T auxiliares 1 (Thl) e Th2. As células Thl produzem interleucina-2 (IL-2), IL-12 e interferão-gama (INF-G) e Th2 produzem IL-4 e IL-5. Estas citocinas afectam as células B e ajudam a influenciar mais o tipo de resposta de anticorpo para activação do antigénio (Gerloni, supra). As células CD4 podem auxiliar a activar macrófagos na drenagem dos nódulos linfáticos ou no tecido tumoral. A cooperação célula-célula pode também existir entre as células CD4. Gerloni, supra, demonstrou que uma célula CD4 pode activar e expandir igualmente outras células CD4. A produção e libertação na membrana celular de antigénios celulares é de enorme importância na imunidade tumoral e destruição. Ambos os antigénios restritos à MHC classe I e classe II estão envolvidos na resposta anti-tumoral. A maioria dos focus na imunidade tumoral focou-se no papel dos antigénios restritos à MHC I classe mas os antigénios da classe II são também importantes. Os antigénios da classe II são específicos para o tecido, partilhados entre vários tipos de tumores, antigénios tumorais comuns verdadeiros e antigénios virais que provoca transformação tumoral (tal como antigénios para o Virus do Papiloma Humano ou Virus Epstein Barr).

As células assassinas naturais (NK) mediam a imunidade inata e estão bem equipados para lisar células tumorais. Pensa-se que estas células facilitem as interacções de célula 44 dendrítica/célula T e conduzam a resposta imunitária para TAA. Em geral pensa-se que estas células não são abundantes no microambiente tumoral mas isto pode ser devido à dificuldade de os identificar de forma fiável. Também, as células NK estão dependentes de Interleucina-2 (IL-2) para activação, que é geralmente deficiente em tumores humanos. (Whiteside, supra). As células NK são também capazes de responder às células infectadas com o vírus. As células NK desempenham um papel crítico em infecções virais limitantes, assim como devem ter proporcionado pelos estudos com herpes vírus tais como citomegalovírus (CMV), vírus do herpes simplex (HSV) e vírus Epstein-Barr (EBV) assim como, o vírus da imunodeficiência humana (HIV) (Smyth MJ, et al. Molec Immunol 42 (2005) 501-510). As funções efectoras das células NK, incluindo a citotoxicidade e a sua capacidade para produzir uma variedade de citocinas (incluindo INF-gama) após activação que restrinja angiogénese tumoral e estimula a imunidade adaptativa (Smyth, supra). Clinicamente, o aumento da função das células NK tem paralelo com o melhoramento clínico em doentes com cancro (Lechin F, Clin Canc Research 2004, 10:8120).

As células B são também raras na maioria dos tumores excepto no cancro da mama e melanoma. A função de células B é a diferenciação em células de plasma que produzem anticorpos. Em geral, os anticorpos contra TAA são encontrados na circulação de doentes com cancro e pensa-se que estes sejam produzidos de e segregados por nódulos linfáticos que drenam tumor, baço ou outros tecidos linfóides. A partir daí, as moléculas de IgG são transportadas pelo plasma ou linfa para os sítios do tecido.

As células dendríticas (DC) são comuns em cancros humanos. Estas células processam e apresentam os TAA a células T naíve ou de memória, desempenhando deste modo um papel crucial na 45 produção de células T efectoras específicas de tumor. Em doentes com cancro, as DC são por vezes disfuncionais. No entanto, as infiltrações de DC em tumores foram associadas com sobrevivência do doente, significativamente prolongada e incidência reduzida de doença recorrente ou metastática. Pelo contrário, os doentes com lesões pouco infiltradas com DC possuem um prognóstico relativamente fraco.

Os macrófagos são também encontrados nos microambientes de tumores e são denominados macrófagos associados com tumor (TAM). Em tumores, os TAM inibem realmente a função dos linfócitos incluindo proliferação de células T e citotoxicidade mediada por NK. 3) Supressão Imunitária No Microambiente Tumoral

Como mencionado acima, os cancros podem invadir o sistema imunitário e deste modo escapar ao reconhecimento. Estes incluem a expressão por tumores de antigénios fracamente imunogénicos, defeitos no processamento de antigénio, interacções co-estimuladoras inadequadas, produção de factores imunossupressores ou através do facto de que as células imunitárias estarem comprometidas em número e/ou função (Hoffman TK, et ai. Câncer Immunol Immunother (2004) 53:1055-1067) 4) Células Imunitárias Efectoras Na Circulação de Doentes com Cancro

Como o microambiente local contém imunócitos disfuncionais, os linfócitos periféricos do sangue contêm também 46 irregularidades funcionais. As anormalidades de sinalização, impedimentos funcionais e apoptose são observados em células T, células NK, macrófagos e células B na circulação periférica. 5) Imunoterapia Local E Resposta ao Cancro A capacidade para modular o ambiente imunitário local é importante para a terapia do cancro. Quando doses baixas de IL-2 natural foram injectadas à volta dos nódulos linfáticos que drenam o tumor, 65% dos doentes possuem uma resposta completa, parcial ou mínima (Feinmesser M et al. Eur Arch Otorhinolaryngol (2004) 261:359-368) . Infelizmente, o efeito foi de vida curta e são necessárias múltiplas injecções diárias ou semanais (Shibuya TY, et al. Clin Canc Research 2004, 10:7088-7099). Em outros estudos utilizando infiltração peritumoral de linfocina com ou sem infiltração regional nos nódulos linfáticos, foi notada uma regressão semelhante (Feinmesser, supra). A administração de sutura bioactiva, revestida com INF-gama, IL-2, mostrou produzir uma resposta prolongada Thl e estimular a secreção de IL-12 e prolongar a resposta imunitária (Shibuya TY, et al. Clin Canc Research 2004, 10 : 7088-7099). Nesta terapia a sutura é considerada um veículo para os produtos bioactivos e é colocada utilizando uma 'técnica de Seldinger' em que uma agulha com um trochar é introduzida na localização desejada e a sutura é subsequentemente passada. A colocação da sutura é invasiva e a sutura pode ser mantida longa e ligada à superfície da pele, 'semelhante a um dreno cirúrgico' que pode potencialmente levar a infecção. 47

Num esforço para estimular a função imunitária local, foram transduzidos genes de citocina para as células tumorais do doente. De novo, o conceito subjacente é a estimulação de uma vigorosa resposta imunitária, melhorando a produção local de citocina. Os problemas desta técnica incluem a confiança em células tumorais para produzir um efeito e a falta de células tumorais do doente em quantidade e qualidade adequadas e a expressão heterogénea dos genes da citocina. Também as células tumorais devem ser irradiadas antes da reintrodução no doente (Steele TA, et al. PSEBM 2000, 23:118-127). 6) Estratégias de Imunoterapia

Em termos gerais, existem duas formas de imunoterapia, activa e passiva. A imunoterapia active refere-se à indução de respostas imunitárias através da aplicação de antigénios imunogénicos de tumor (tais como péptidos, proteínas, células tumorais ou Usados de tumor), enquanto a imunização passiva reside na transferência de moléculas efectoras imunitárias ou células imunitárias (Hoffman TK, et al. Câncer Immunol Immunother (2004) 53:1055-1067).

Os imunomoduladores activos podem ser não específicos ou específicos. Um imunomodulador activo, não específico pode incluir terapia local com BCG, extractos timicos ou OK-432 que tentam induzir uma resposta antitumoral. Esta terapia, no entanto, não demonstrou benefícios de sobrevivência consistentes para o doente com cancro. A imunomodulação activa, específica, pode incluir a administração de vacinas baseadas em células dendríticas ou vacinas com base em ADN. Esta terapia está ainda 48 na infância e é normalmente reservada para o estado terminal de doença recorrente, de cancros agressivos. A imunomodulação passiva é também dividida em terapias não especificas e especificas. A terapia passiva, não especifica inclui a administração de citocinas tais como interferão sistémico ou interleucina ou mecanismos celulares de transferência adoptiva, tais como células assassinas activadas por linfócitos e interleucina-2 administradas localmente. Os resultados desta terapia foram inconsistentes e produziram elevadas toxicidades clinicas. Quando IL-2 é administrada sistemicamente, uma inaceitável taxa de toxicidade sistémica foi observada incluindo febre, mau estar, hipotensão, edema pulmonar e choque. A imunomodulação passiva específica inclui a administração de anticorpos dirigidos para o receptor do factor de crescimento epidérmico ou através de transferência celular adoptiva através de células T específicas para o tumor. 7) Importância De Manter a Exocitose Para o Reconhecimento Imunitário

Como indicado acima, de modo a efectivamente matar células cancerígenas, é crucial que as células cancerígenas mantenham a sua capacidade de sofrer exocitose. A exocitose é o processo especifico através do qual uma vesícula celular se funde com uma membrana plasmática da célula. É o processo através do qual as proteínas e lípidos que são prodzidos dentro de uma célula são transportados para o exterior das células. (Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell, Terceira Edição 1994, Garland Publishing pg. 626) 49

As proteínas podem ser segregadas pelas células por exocitose de um modo constitutivo ou regulado (Alberts, supra, página 633) . Na via regulada, as moléculas são armazenadas em vesículas secretoras que não se fundem com uma membrana plasmática para libertar os seus conteúdos até que seja recebido um sinal extracelular. Enquanto esta via opera apenas em células seleccionadas especializadas, uma via constitutiva secretora opera em todas as células, mediada por transporte vesicular continuado da rede trans Golgi para a membrana plasmática. (Alberts, supra, pg 633). Este método permite que várias proteínas de membrana, proteínas segregadas e lípidos sejam distribuídos nos domínios apropriados da membrana plasmática (Alberts, supra, p 633).

Um antigénio é uma macromolécula que inclui virtualmente todas as proteínas e muitos polissacáridos (Alberts, supra, p 1201). Estes denominados determinantes antigénicos estimulam a produção de anticorpos ou de respostas de células T (Alberts, supra, p.1201). Porque o sistema imunitário funciona através de expansão clonal, mesmo um único determinante antigénico activará muitos clones. Pelo contrário, a alteração ou subregulação dos determinantes antigénicos pode previsivelmente alterar significativamente a resposta imunitária do hospedeiro ao antigénio tumoral. A maioria das TAA são auto-antigénios que são sobre-expressos ou alterados pós-transcricionalmente. De modo a montar uma resposta adequada, células T específicas para TAA e a imunidade inata mediada por células T activadas não específicas, são necessários células NK activadas e macrófagos activados. Com isto em mente, existem duas razões principais para os tumores não induzirem uma vigorosa resposta imunitária. Em pimeiro 50 lugar, o tumor pode falhar em proporcionar um antigénio apropriado para a resposta imunitária detectar e para que o sistema imunitário possa reagir. Em segundo lugar, o tumor pode prevenir uma resposta imunitária ao falhar em proporcionar moléculas acessórias essenciais para desenvolver uma resposta imunitária (Steele, supra). A ausência de uma apresentação de antigénio apropriada pode incluir a expressão de uma proteína de tumor mutante que não é imunogénica, possuindo uma via de processamento deficiente em antigénio de modo que o antigénio não pode ser enviado para a superfície celular ou por mascarar o antigénio tumoral de modo a não ser detectado pelas células imunitárias (Steele, supra). Sem a expressão pelo tumor de moléculas essenciais à superfície, não pode ser produzida uma resposta antitumoral (Steele, supra). Estas observações enfatizam a necessidade de ter um método intacto de exocitose nas células cancerígenas para que as TAA sejam expressas em células cancerígenas e permitam uma resposta imunitária.

Foi demonstrado que quando o cancro possui uma expressão mais elevada de Beta-2 macroglobulina, um componente do MHC-1, o resultado clínico melhora (Feinmesser M et al. Eur Arch

Otorhinolaryngol (2004) 261:359-368). É sugerido que a expressão aumentada de antigénio facilita a apresentação do antigénio tumoral aos linfócitos CD8.

Além disso à expressão de TAA, a exocitose é importante em metástases. As metástases do cancro são um processo que envolve um programa coordenado de eventos que inclui alterações na adesão celular, proteólise polarizada e migração, intravasação na circulação, subsequente adesão a células endoteliais seguido 51 por extravasação, invasão e indução de angiogénese. As proteínas da superfície celular e receptores estão intimamente envolvidas nestes processos. Por exemplo, a perda de E-caderina pode reduzir a adesão célula-célula e permitir que as células cancerígenas escapem mais rapidamente dos tumores. As integrinas regulam a adesão celular, motilidade, invasão e angiogénese, e as metaloproteases em células tumorais podem degradar a matriz extracelular. Por outras palavras, o processo de exocitose, que por um lado pode libertar a metaloprotease e contribui para a invasão primária do sítio primário, é integrantemente importante na produção das moléculas de adesão que ajudam a prevenir as metástases e a expressão de antigénios que pode facilitar o reconhecimento e destruição pelo sistema imunitário. Qualquer tentativa para anular globalmente o processo de exocitose pode, deste modo, ter problemas significativos na terapia da medicina do cancro.

De facto, o tratamento do cancro inclui tentativas para melhorar a imunogenicidade das células tumorais. Por exemplo, um requisito para as células T atacarem as células cancerígenas é ligarem-se a um fragmento péptido específico que é apresentado à superfície da célula cancerígena. É conhecido que as células tumorais raramente expressam este antigénio e foram feitos esforços para transduzir moléculas co-estimulados em tumores para promover uma vigorosa resposta imunitária antitumor (Steele, supra). 8) Modulaçao Colinérgica da Função Imunitária

As células que são normalmente imunoprotectoras contra o cancro incluem, mas não são limitadas a células assassinas 52 naturais (NK), macrófagos activados, e células T (incluindo linfócitos infiltrantes de Tumor e Células T assassinas

Naturais). A acetilcolina inibe a função de células assassinas naturais, que foi bloqueada pela atropina (Qiu YH, Peng YP, et al. Effect of acetilcholine on in vitro IL-2 production and NK cell cytotoxicity of rats. Lymphology 37(1):31-8, 2004)), sugerindo que o botulinum pode inibir a supressão de actividade das células NK. As células NK são conhecidas por induzir apoptose de células malignas (Smyth MJ, et al. Activation of NK Cell Cytotocicity. Molec Immunol 42:501-510, 2005) e inibem metástases (Kim, S, et al. In vivo natural killer cell activities revealed by natural killer cell-deficient mice. Proc Natl Acad Sei 97, 2000, resumo), uma vez que o botulinum pode aumentar esta actividade. A pilocarpina, um análogo da acetilcolina, aumenta a proporção de CD8/CD4 que foi também bloqueada pela atropina, sugerindo que a actividade supressora de células T é positivamente influenciada pela acetilcolina (Prync AE, Arzt E, et al. 0 efeito inibidor do agonista muscarínico pilocarpino na activação de linfócitos envolve avia de IL-2 e o aumento na função da célula supressora. Int J. Neurosci 62, 1992, resumo). Isto sugere que uma proporção inversa de CD8/CD4 ou um aumento na actividade de auxiliares T pode influenciar positivamente a citotoxicidade para o cancro (Gerloni M, et al. Springer Seminars in Immunopathology, Springer-Verlag 2005, 1-15) também. A acetilcolina também reduz a produção do factor de necrose tumoral (Steinman L. Elaborate interactions between the immune and nervous systems. Nature Immunology 5, 2004, resumo). Finalmente, quando as glândulas salivares humanas foram injectadas com a toxina de botulinum, foi observado que a quantidade de imunoglobulina (especificamente IgA) quantitativa segregada para a saliva aumentou. As observações acima apoiam a utilização de botulinum 53 para aumentar localmente a citotoxicidade imunitária e imunidade humoral. 9) Toxina de Botulinum Pode Modular 0 Sistema Imunitário A eventual alteração da função imunitária que é causada pela inibição colinérgica inclui imunidade celular e humoral melhorada. A função melhorada de células NK melhora directamente a morte de células cancerígenas. A actividade melhorada de células NK causa a estimulação secundária da imunidade celular e humoral por libertação de citocinas e interferão gama. Isto resulta na função aumentada de células T e células NKT, que melhoram ainda a destruição celular do cancro.

Também foi demonstrado que a função melhorada de células NK reduz metástases (Kim, supra). A função melhorada de células NK também melhora o resultado de doentes com infecções virais, doenças virais, crescimentos induzidos por virus, doença autoimune (tal como doença de sjogren, diabetes dependente de insulina), esclerose múltipla, feridas crónicas, infecções crónicas, tal como amigdalite (Ferlazzo G, et al. Journal Immunol 2004, 172:1455-1462) ou infecções do osso (Miyasaki K, Periodontal Immunology, página web, www.dent.ucla.edu), artrite reumatóide, miastenia grave e vírus da imunodeficiência humana (HIV), sendo todos estados caracterizados por reduzido número, função ou actividade de células NK (Baxter, AG, et al. Autoimmunity 2002, 35:1-14, e Lee PT, et al. , J. Clin Invest 2002, 110:793-800). Actividade baixa de células NK é também encontrada no Síndroma da fadiga crónica (Whiteside TL, et ai., AM J Med 105, 1998, resumo) e hepatite 54 (Chen Y, et al., J Virai Hepatitis 12, 2005, resumo), que sao ambos passíveis de terapia com botulinum. CONCLUSÃO: A injecção da toxina de botulinum à volta mas longe das células cancerosas melhora o controlo local de cancro no sítio primário, evita a disseminação distante de células cancerígenas na circulação e trata as células cancerígenas no ambiente local e circulações distantes. Os riscos (como descrito acima) de injectar a toxina no cancro ou na sua vizinhança serão eliminados. Do mesmo modo, a injecção da toxina de botulinum por esta forma melhorará o resultado de doentes que sofrem de infecções virais, doenças virais, crescimentos induzidos por vírus, doenças autoimunes, esclerose múltipla, feridas crónicas, infecções crónicas, artrite reumatóide, miastenia grave e HIV, etc., como acima descrito.

Classificação de Cancros Passíveis de Tratamento:

Tipo de Cancro

Exemplos específicos

Cancros digestivos/intestinais: Glândula salivar, lábios, cavidade oral, orofaríngico, hipofaríngico, nasofaríngico, esofágico, estômago, intestino delgado, intestino grosso, anal Cérebro, nervo

Cancros do sistema nervoso

Cancros hepato-biliares fígado, vesícula, pâncreas, tracto biliar 55

Cancros genito-urinários: Rim, ureter, bexiga, uretra, próstata, pénis, vaginal, vulvar, uterino, endometrial, ovário, cervical, testicular, Cancro da mama: Cancros respiratórios: nariz, sinus, nasofaríngico, laríngico, traqueal, brônquico, pulmão, pleura (mesotelioma) Cancros de tegumento: melanoma, carcinoma da célula escamosa, carcinoma da célula basal, célula merkel Musculoesquelético: rabdomiossarcoma, sarcomas Cancros hematopoiéticos: linfoma, leucemia, mielodisplasia Órgãos Sensoriais: olho, ouvido Endócrino: tiróide, paratiróide Neuroendócrino: cancros neuroendócrinos excepto os da medula adrenal ou tumores glómicos

Tratamento de Cancro requer o controlo de metástases

Inibição da disseminação: a manipulaçao física ou pressão sobre um cancro ao nível grosseiro ou microscópico através de 56 células contrateis pode produzir uma pressão física para as células cancerígenas se disseminarem ou pode permitir que as células cancerígenas que entraram já num canal eferente para serem empurradas para a circulação mais ampla. Por exemplo, uma premissa bem conhecida na cirurgia oncológica é a minimização da manipulação do cancro durante a resseção para minimizar as forças físicas que podem levar à entrada e disseminação de células cancerígenas em túbulos, tais como vasos linfáticos ou sanguíneos. De facto, quando é cirurgicamente possível, é desejável inicialmente ligar os vasos de um cancro ao cancro e minimizar a disseminação.

Toxina de Botulinum Desenervará Localmente o Tecido Muscular A Toxina de Botulinum inibirá a contracção das fibras musculares grosseiras ou microscópicas à volta de um cancro inibindo deste modo a probabilidade de pressão das células cancerígenas no ambiente local ou nos túbulos eferentes que comportam distantemente o cancro. A toxina de Botulinum paralisará o músculo linfático que contrai para pressionar a linfa e possivelmente as células cancerígenas na circulação distante.

Tratamento do Cancro requer a capacidade de imunomodular positivamente 0 botulinum pode melhorar a produção local de imunoglobulina quando aplicado a uma superfície de mucosa. Isto pode melhorar as células 'que matam o tumor' ou propriedades do tecido local e melhora o efeito anti-cancro. 57

Foi mostrado que o botulinum melhorava e/ou causava a proliferação de uma 'célula mioepitelial' que é um tipo muito especifico de célula. A célula mioepitelial é considerada uma célula defensiva essencial no cancro da mama através de mecanismos desconhecidos. Melhorando a proliferação destas células mioepiteliais, o botulinum pode melhorar o mecanismo de defesa do hospedeiro em tumores que têm células mioepiteliais (mama, próstata, pulmão, vias aéreas, etc...).

Outros mecanismos desconhecidos podem também estar presentes. Por exemplo, a sinalização célula-célula e o subsequente crescimento/metástase é uma caracteristica das células cancerígenas. Foi sugerido que alterando estes sinais, se podia alterar o crescimento do cancro. No que respeita ao botulinum, os sinais podem ser químicos (i. e. substâncias libertadas por exocitose e bloqueadas por botulinum) ou físicos (i. e. sinais físicos para as células circundantes) mas podem ser bloqueados pelo botulinum.

As técnicas que se direccionam para sequências múltiplas de eventos na progressão de cancro têm mais probabilidade de benefício do que uma técnica que se direcciona apenas para uma sequência.

Exemplos: 0 exemplo que se segue demonstra a capacidade da toxina de botulinum melhorar uma resposta imunitária celular: 58

Exemplo N° 1: Um doente com verruca vulgaris (verruga comum) é injectada na base da verruga e na sua periferia com um total de 25 unidades de toxina de botulinum do tipo A. Depois de 3-5 semanas, nota-se que o tamanho da lesão é significativamente reduzida em todas as dimensões (em aproximadamente 90%), é ligeira e é praticamente imperceptivel. Após 3 meses, o tamanho da lesão volta ao seu tamanho original.

Os seguintes exemplos proféticos demonstram como a invenção funciona.

Exemplo N° 2: Um diagnosticado com cancro do pulmão invasivo de 50 anos de idade sofre a administração local de 30 unidades de toxina de botulinum do tipo A à volta do cancro através de injecção broncoscópica, aplicação de aerossóis ou injecção transtorácica. 0 cancro é visualizado clinica ou radiograficamente e a área à volta do cancro é directamente injectada, e o doente sofre radiação, quimioterapia ou cirurgia como inicialmente planeado. A aplicação local de botulinum também melhora a imunidade local do doente o que serve para minimizar a infecção durante a terapia, levando a menos episódios de pneumonia e menos interrupções no tratamento devido a infecção. Após 2 meses de terapia convencional para o cancro, nota-se que a disseminação da invasão local e regional e distante é reduzida. O doente sente um resultado clinico melhorado.

No exemplo acima, o nódulo ou nódulos linfáticos regionais ou distantes, timo, baço ou medula óssea do doente podem, cada um, ser também injectados com 1-100 unidades de toxina de botulinum do tipo A. Os tecidos são injectados por condução radiográfica ou visualização directa durante mediastinoscopia ou 59 cirurgia. Após a injecção, nota-se que se verifica uma resposta imunológica melhorada contra o cancro. 0 controlo local e

metástases locais, regionais e distantes são reduzidos. A injecção pode ser repetida em intervalos de 3-6 meses.

Exemplo N° 3: Um homem de 50 anos de idade com cancro da próstata invasivo é injectado com 40 unidades de toxina de botulinum do tipo A à volta do cancro que resulta em poucas metástases regionais ou distantes. A injecção é conduzida para a região à volta do cancro por condução radiográfica (varrimento tac, ultrassons, condução MRI ou outros). 0 efeito do botulinum está também no mioepitélio local e a incidência de metástase regional e distante em trânsito é reduzida. O doente continua a sofrer a terapia convencional para o cancro da próstata. Durante a duração do tratamento verificou-se uma menor invasão do tecido circundante e menor disseminação de células cancerígenas na circulação regional ou sistémica. O doente é reavaliado periodicamente e nota-se que o cancro e a região do cancro requer re-injecção em 3 meses, uma vez que o doente tem doença persistente que não responde à terapia convencional. Mais 40 unidades são injectadas e o doente continua com terapia planeada. Três meses depois o tumor é eliminado e não são necessárias mais injecções. 0 doente sente uma cura e sobrevivência melhorada. A injecção pode ser

Os nódulos linfáticos regionais ou distantes, timo, baço ou medula óssea do doente podem, cada um, ser também injectados com 1-100 unidades de toxina de botulinum do tipo A. Estes tecidos são injectados por condução radiográfica, palpação directa ou durante cirurgia. 0 controlo local e metástases locais, regionais e distantes são reduzidos. repetida em intervalos de 3-6 meses. 60

Exemplo N° 4: Uma mulher de 60 anos de idade diagnosticada com cancro da mama é tratada com 30 unidades de toxina de botulinum do tipo A injectada à volta do cancro antes do inicio de qualquer terapia. A contracção local do tecido da mama é reduzida e a doente sente uma incidência reduzida de disseminação local, regional e distante. O resultado clinico é melhorado.

Os nódulos linfáticos regionais ou distantes, timo, baço ou medula óssea da doente podem, cada um, ser também injectados com 1-100 unidades de toxina de botulinum do tipo A. Os nódulos linfáticos são injectados por palpação, condução radiográfica ou visualização directa durante a cirurgia. Após injecção, nota-se que se verifica uma resposta imunológica melhorada contra o cancro. 0 controlo local e metástases locais, regionais e distantes são reduzidos. A injecção pode ser repetida em intervalos de 3-6 meses.

Alternativamente, o nódulo linfático sentinela dos doentes pode ser identificado utilizando linfocintigrafia. Uma vez que estes nódulos têm elevada probabilidade de conter cancro metastásico, estes são evitados durante injecções radiográficas, e apenas a bacia nodal circundante é injectada.

Exemplo N° 5: Um homem de 45 anos de idade é diagnosticado com cancro do cólon localmente invasivo. Na altura do diagnóstico, 50 unidades de toxina de botulinum do tipo A são injectadas no e/ou à volta do cancro para enfraquecer os efeitos contrateis da musculatura grosseira e microscópica do cólon. O cancro é 'congelado' e verifica-se menor invasão de células ou cancerígenas no tecido circundante ou vasos linfáticos 61 sanguíneos. 0 doente pode sofrer terapia adicional (quimioterapia, terapia de radiação e/ou cirurgia) e a disseminação local, regional e distai é reduzida ou eliminada.

Os nódulos linfáticos regionais ou distantes, timo, baço ou medula óssea do doente pode, cada um, ser também injectados com 1-100 unidades de toxina de botulinum do tipo A. Estes tecidos são injectados por condução radiográfica, injecção endoscópica, palpação directa ou durante a cirurgia. O controlo local e metástases locais, regionais e distantes são reduzidos. A injecção pode ser repetida em intervalos de 3-6 meses.

Exemplo N° 6: Um doente com cancro metastásico da língua nota sintomas de compressão e hemorragia referentes ao local de invasão de uma metástase regional. A metástase é considerada inoperável e não pode receber qualquer outra radioterapia. Alternativamente, ele pode ser tratado com cirurgia, radioterapia ou quimioterapia. A área à volta da lesão metastática é injectada com 30 unidades de toxina de botulinum do tipo A. Existe uma menor invasão local e metástases da lesão. A metástase sofre regressão e os sintomas de compressão são reduzidos.

Os nódulos linfáticos regionais ou distantes, timo, baço ou medula óssea do doente podem, cada um, ser também injectados com 1-100 unidades de toxina de botulinum do tipo A. Estes tecidos são injectados por condução radiográfica, palpação directa ou durante a cirurgia. O controlo local e metástases locais, regionais e distantes são reduzidos. A injecção pode ser repetida em intervalos de 3-6 meses. 62

Exemplo N° 7: Um homem de 35 anos de idade tem cancro da faringe localmente invasivo. Trinta e cinco unidades de toxina de botulinum do Tipo A são injectadas à volta da lesão. Nota-se que o cancro sofre regressão e é eliminado com injecções locais de botulinum sem outra terapia.

Os nódulos linfáticos regionais ou distantes, timo, baço ou medula óssea do doente podem, cada um, ser também injectados com 1-100 unidades de toxina de botulinum do tipo A. Estes tecidos são injectados por condução radiográfica, palpação directa ou durante a cirurgia. O controlo local e as metástases locais, regionais e distantes são reduzidos. A injecção pode ser repetida em intervalos de 3-6 meses.

Alternativamente, o nódulo linfático sentinela do doente pode ser identificado utilizando linfocintigrafia. Uma vez que estes nódulos têm elevada probabilidade de conter cancro metastásico, estes são evitados durante injecções radiográficas e apenas a bacia nodal circundante é injectada.

Exemplo Comparativo N° 8: Um doente com cancro tem sinusite fúngica invasiva. A sua contagem de glóbulos brancos do sangue é inferior a 1000 e existe uma fraca resposta imunológica na cavidade do sinus. Ele é conduzido a cirurgia para remoção do tecido invadido pelo fungo. Antes da cirurgia ou, de um modo preferido, após remoção do tecido e durante a cirurgia, 10 unidades de toxina de botulinum do tipo A são injectadas em múltiplos sítios na cavidade nasal circundante. Note-se que as respostas imunológicas locais e imunológicas sistémicas são melhoradas e o doente sente uma cura da doença. 63

Os nódulos linfáticos regionais ou distantes, timo, baço ou medula óssea do doente são, cada um, injectados com 1-100 unidades de toxina de botulinum do tipo A. Estes tecidos são injectados através de condução radiográfica, palpação directa ou durante a cirurgia. O controlo local e disseminação distante dos fungos são reduzidos. A injecção pode ser repetida em intervalos de 3-6 meses.

Exemplo Comparativo N° 9: Um doente com cancro, doença autoimune, diabetes, HIV ou SIDA ou lúpus tem fungos nas unhas (onicomicose). A unha afectada é injectada com 5 unidades de toxina de botulinum do tipo A em múltiplos pontos e verifica-se regressão dos sintomas de onicomicose. Alternativamente, os tecidos normais circundantes ou nódulos linfáticos regionais podem ser injectados.

Exemplo Comparativo N° 10: Um doente de 10 anos de idade com diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) é dependente de injecções de insulina. A toxina de Botulinum de tipo A (50 unidades) é injectada utilizando condução radiográfica para o seu pâncreas. Note-se que os seus níveis naturais de insulina aumentam e ela tem menos sintomas de diabetes.

Exemplo Comparativo N° 11: Uma mulher de 40 de idade com doença autoimune é injectada com toxina de botulinum do tipo A. 100 unidades da toxina são injectadas no seu baço, medula óssea ou região do nódulo da bacia onde os sintomas estão localizados. Após injecção, os seus sintomas são melhorados.

Exemplo Comparativo N° 12: Um homem de 35 anos de idade com SIDA possui uma populaçao de auxiliares T suprimida e é 64 susceptível a infecções. 50 unidades de toxina de botulinum do tipo A são injectadas no seu timo e baço. Alternativamente, a sua medula óssea pode ser injectada. A população de células T do doente aumenta e o seu estado é significativamente melhorado.

Como notado acima, a Toxina de Botulinum está disponível de múltiplas fontes. Adicionalmente, está disponível de Allergan como Botox®, uma formulação BTX-A; DySport®, outra preparação BTX-A disponível da Europa de Ipsen, Ltd; e Myobloc™ (ou NeuroBloc® na Europa), uma preparação BTX-B disponível de Elan Pharmaceuticals. O Botulinum para utilização na presente invenção pode também ser preparado por técnicas farmacêuticas conhecidas por, por exemplo, dissolução de toxina de Botulinum farmaceuticamente aceitável num veículo farmaceuticamente aceitável útil para injecção, de modo que o Botulinum é dissolvido na força ou concentração desejada. Estas preparações podem ser preparadas de fresco ou pré-preparadas. Outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, tal como conservantes, podem ser adicionados. Estas preparações são preparadas por técnicas conhecidas na técnica. A quantidade de toxina de Botulinum a utilizar varia, obviamente, de acordo com o tamanho do tumor a ser tratado. A dosagem máxima de Botulinum A a administrar não deve exceder as 500 unidades por sessão de injecção. De um modo preferido, 0,01-100 unidades de Botulinum A devem ser utilizadas. De um modo mais preferido, a dosagem de Botulinum A deve estar no intervalo desde cerca de 1 unidade a cerca de 50 unidades. De um modo ainda mais preferido, a dosagem de Botulinum A deve estar no intervalo desde cerca de 5 unidades a cerca de 40 unidades. 65 É conhecido que uma corrente eléctrica pode melhorar a absorção de toxina de botulinum em tecidos. Black, et al. , 1: Cell Biol -1986 Aug; 103(2): 53 5-44; Hesse, et al. , 1: Neurosci Lett. 1995 Dec. 1; 201(1) 37-40; Hesse, et al., 1: Clin. Rehabíl. 1998 Oct; 12(5): 381-8. De acordo com o exposto, uma forma de realização da presente invenção será a aplicação de uma corrente eléctrica a ou à volta da área a ser tratada. Isto deve diminuir a quantidade de toxina de botulinum necessária para resultados eficazes.

Se é utilizada uma neurotoxina diferente, tal como Botulinum B, C, D, E F ou G, a dosagem deve estar conforme a dosagem acima para Botulinum A. As conversões, conhecidas na técnica, podem ser utilizadas para calcular estas dosagens. A descrição acima apresenta várias formas de realização da invenção. Esta descrição, no entanto, não pretende ser limitante no âmbito da invenção.

Lisboa, 18 de Novembro de 2011

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma neurotoxina farmaceuticamente aceitável na preparação de um medicamento para inibir o crescimento ou metástase de um neoplasma num doente, em que o medicamento é para aplicação à periferia do referido neoplasma, de modo a que uma porção da neurotoxina circunde mas não penetre o neoplasma.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o neoplasma é seleccionado, do grupo consistindo em neoplasmas do sistema digestivo/intestinal, nervoso, hepatobiliar, genito-urinário, mamário, respiratório, tegumentar, musculo-esquelético, hematopoiético, órgão sensorial, endócrinos ou neoendócrinos.
3. 3. Utilização da reivindicação 1 ou 2, em que a dose de neurotoxina não excede 500 unidades por aplicação.
4. 4. Utilização da reivindicação 3, em que a dose de neurotoxina está entre 0,01 e 100 unidades por aplicação.
5. 5. Utilização da reivindicação 4, em que a dose de neurotoxina está entre 1 unidade a 50 unidades por aplicação.
6. 6. Utilização da reivindicação 1, em que a neurotoxina é para aplicação tópica, aplicação por inalação ou por injecção.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a neurotoxina é para aplicação por injecção. 1
8. 8. Utilização da reivindicação 1, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de uma neurotoxina farmaceuticamente aceitável é ainda proporcionada para injecção num nódulo ou nódulos linfáticos regionais e distais, tecido nodal regional ou distai, timo, baço ou medula óssea do doente.
9. 9 . Utilização de qualquer reivindicação anterior, em que neurotoxina é toxina de botulinum.
10. 10 . Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que neurotoxina é toxina de botulinum do tipo A.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que neurotoxina é toxina de botulinum do tipo B. Lisboa, 18 de Novembro de 2011 2