PT1773890E - Process for the preparation of low molecular weight heparin - Google Patents
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Abstract
Description
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DESCRIÇÃODESCRIPTION
"PROCEDIMENTO PARA A PREPARAÇÃO DE HEPARINA DE BAIXO PESO MOLECULAR" Área técnica A heparina e os seus derivados estão entre os produtos mais usados na prevenção e tratamento dos eventos tromboembólicos." PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF LOW MOLECULAR WEIGHT HEPARIN " Technical area Heparin and its derivatives are among the products most used in the prevention and treatment of thromboembolic events.
Este ingrediente activo, a heparina, tem um efeito muito importante sobre a coagulação e, por este motivo, é usado para prevenir eventos trombóticos após cirurgias e no tratamento de embolias pulmonares ou da trombose venosa profunda. O efeito anticoagulante da heparina é tão importante gue o tratamento com este fármaco exige uma monitorização constante dos processos hemocoagulantes, o gue conduz à hospitalização do doente, ou pelo menos ao tratamento ambulatório no hospital de dia. Técnica anterior A redução do peso molecular da heparina mediante fraccionamento (L.O. Andersson e col., Throm. Res. 9: 575 (1976)) ou mediante despolimerização teve como resultado ingredientes activos que são menos anticoagulantes, embora continuem a apresentar uma boa actividade antitrombótica residual.This active ingredient, heparin, has a very important effect on coagulation and is therefore used to prevent thrombotic events after surgery and in the treatment of pulmonary embolisms or deep venous thrombosis. The anticoagulant effect of heparin is so important that treatment with this drug requires constant monitoring of hemocoagulant processes, leading to patient hospitalization, or at least outpatient treatment at day hospital. Prior art The reduction of the molecular weight of heparin by fractionation (LO Andersson et al., Throm. Res. 9: 575 (1976)) or by depolymerization resulted in active ingredients that are less anticoagulant, although they continue to exhibit good antithrombotic activity residual.
Por exemplo, as patentes europeias EP 0014184, EP 0040144, EP 0076279 e EP 0121067 descrevem vários procedimentos de despolimerização de heparina e obtêm vários tipos de heparina de baixo peso molecular, que normalmente é indicada com o acrónimo HBPM (em inglês LMWH) . Estes tipos de HBPM exibem diferentes pesos moleculares e estruturas quimicas que estão modificadas de 2 forma variável, especialmente nos seus grupos terminais, e também diferentes actividades farmacológicas.For example, European patents EP 0014184, EP 0040144, EP 0076279 and EP 0121067 describe various depolymerization procedures for heparin and obtain various types of low molecular weight heparin, which is usually indicated by the acronym LMWH. These types of LMWH exhibit different molecular weights and chemical structures that are modified in a variable manner, especially in their terminal groups, as well as different pharmacological activities.
Em particular, a redução do peso molecular confere aos produtos despolimerizados uma menor actividade anticoagulante global (TTPA- tempo de tromboplastina parcial activada) quando se compara com a heparina inicial, enquanto que a actividade Axa (actividade anti-Xa) se mantém em bons níveis, dado que é a actividade antitrombótica do produto (F.A. Ofosu e col. "Mechanism of action of low molecular weight heparins and heparinoids" Ballicre's Clin. Haematol. 3: 505-529 (1990)). Os documentos US 4.804.652 e US 4.351.938 descrevem procedimentos para a preparação de tal HBPM e para o seu uso como anticoagulante e antitrombótico. A farmacodinâmica também fica positivamente afectada pela redução do peso molecular, dado que o ingrediente activo se mantém durante mais tempo no circuito sanguíneo, com maiores níveis hemáticos do que os da heparina não fraccionada (L. Bara e col., "Increased anti-Xa bioavailability for a low molecular weight heparin compared with unfractionated heparin! Semin. Thromb. Hemost., 11: 316-317 (1985)).In particular, molecular weight reduction gives the depolymerized products a lower overall anticoagulant activity (APTT-activated partial thromboplastin time) when compared to the initial heparin, whereas Axa activity (anti-Xa activity) is maintained at good levels , since it is the antithrombotic activity of the product (FA Ofosu et al. " Mechanism of action of low molecular weight heparins and heparinoids " Ballicre's Clin Haematol 3: 505-529 (1990)). US 4,804,652 and 4,351,938 disclose procedures for the preparation of such LMWH and for its use as anticoagulant and antithrombotic. Pharmacodynamics is also positively affected by the reduction of molecular weight, since the active ingredient is maintained for longer in the blood circuit, with higher blood levels than unfractionated heparin (L. Bara et al., &Quot; Increased anti- Xa bioavailability for a low molecular weight heparin compared with unfractionated heparin! Semin. Thromb. Hem., 11: 316-317 (1985)).
As características anteriormente descritas para a HBPM levaram os especialistas na matéria à procura de procedimentos para a sua produção que usam procedimentos de despolimerização da heparina extremamente variados. Foram usados procedimentos que exploram as reacções da hidrólise radical (água oxigenada e catalisador de cobre, ou perácidos) reacção de hidrólise de oxidação com periodato ou hidrólise enzimática com heparinase, ou reacções de β-eliminação mediante hidrólise básica do éster de heparina, ou tratamentos com nitrito de sódio num ambiente ácido. O último procedimento mencionado, descrito e reivindicado nas patentes europeias EP 0014184 e EP 0076279, proporcionam uma HBPM que depois requer uma purificação ou fraccionamento adicional. O uso de nitrito 3 de sódio proporciona heparina despolimerizada com um peso molecular que é mais ou menos baixo de acordo com a quantidade de nitrito de sódio usado, mas que requer muito cuidado e atenção porque o produto final não deve conter mais do que algumas partes por milhão (ppm) de iões de nitrito e menos de 0,25 ppm de grupos de N-nitrose (N-NO).The previously described characteristics for LMWH have led the skilled person in the search for procedures for their production using extremely varied depolymerization procedures of heparin. Procedures were used which exploit radical hydrolysis reactions (hydrogen peroxide and copper catalyst, or peracids) periodic oxidation hydrolysis reaction or enzymatic hydrolysis with heparinase, or β-elimination reactions by basic hydrolysis of the heparin ester, or treatments with sodium nitrite in an acidic environment. The last mentioned procedure, described and claimed in European patents EP 0014184 and EP 0076279, provides a LMWH which then requires further purification or fractionation. The use of sodium nitrite 3 provides depolymerized heparin with a molecular weight which is more or less low according to the amount of sodium nitrite used but which requires great care and attention because the final product should contain no more than a few parts per million (ppm) of nitrite ions and less than 0.25 ppm of N-nitroses (N-NO) groups.
Se, por um lado, o conteúdo do nitrito de sódio no produto final (J.C. Lormeau e col., patente dos E.U.A. 5.019.649 (1991) e a sua determinação não representam qualquer problema, por outro lado o conteúdo e a quantificação dos grupos N-NO são de execução difícil.If, on the one hand, the content of sodium nitrite in the final product (JC Lormeau et al., U.S. Patent 5,019,649 (1991) and its determination pose no problem, on the other hand the content and quantification of the groups N-NO are difficult to execute.
Dado que, em teoria, não se deveria verificar a presença de aminas secundárias na estrutura da heparina, os únicos grupos funcionais capazes de proporcionarem derivados de N-nitrosados suficientemente estáveis são os grupos de N-acetilglucosamina.Since, in theory, the presence of secondary amines in the heparin structure should not be verified, the only functional groups capable of providing sufficiently stable N-nitrosated derivatives are the N-acetylglucosamine groups.
Uma hipótese válida poderá residir no facto de os grupos de N-nitrosado que aparecem em forma de poucas ppm no produto despolimerizado antes da purificação derivarem de uma nitrosação da N-acetilglucosamina presente na heparina.A valid hypothesis may lie in the fact that the N-nitrosated groups appearing as a few ppm in the depolymerized product prior to purification derive from a nitrosation of the N-acetylglucosamine present in the heparin.
Os grupos N-NO que derivam da nitrosação da heparina são muito estáveis, embora isso não se verifique ao nivel das N-alquilnitrosaminas, e provavelmente durante a reacção de despolimerização uma parte da acetil-N-NO-glucosamina formada pode reagir, perdendo o grupo acetilo e convertendo-se no sal de diazónio de desacetilglucosamina, originando a heparina despolimerizada na reacção normal.The N-NO groups derived from the nitrosation of heparin are very stable, although this does not occur at the level of N-alkyl nitrosamines, and probably during the depolymerization reaction a part of the acetyl-N-NO-glucosamine formed can react, acetyl group and converting to the deacetylglucosamine diazonium salt, yielding the depolymerized heparin in the normal reaction.
Dado que estes grupos N-NO são muito estáveis, é essencial que se aplique um procedimento de despolimerização que conduza a um conteúdo de N-nitrosamina que seja inferior ao limite prescrito ou, como alternativa, que se elimine qualquer grupo N-NO presente, tendo em vista satisfazer os limites prescritivos estabelecidos pela Farmacopeia Europeia Quarta edição. 4As these N-NO groups are very stable, it is essential that a depolymerization procedure is applied which leads to an N-nitrosamine content which is below the prescribed limit or, alternatively, to eliminate any N-NO group present, with a view to meeting the prescriptive limits established by the European Pharmacopoeia Fourth Edition. 4
Sabe-se que os grupos N-NO são particularmente sensíveis às radiações de alta energia, tais como os raios ultravioleta e os raios γ, e que o tratamento do produto (heparina despolimerizada mediante nitrosação) em solução ou até mesmo no estado sólido com estas radiações pode levar ao desaparecimento total dos nitritos e dos resíduos N-NO contidos no produto.It is known that N-NO groups are particularly sensitive to high energy radiation, such as ultraviolet rays and γ rays, and that the treatment of the product (depolymerized heparin by nitrosation) in solution or even in the solid state with these radiation may lead to the total disappearance of nitrites and N-NO residues contained in the product.
Os raios UV são muito usados para a manutenção da esterilidade na água estéril ou para a redução dos derivados de óxido nitroso na água das bebidas. Na patente dos E.U.A. 5.599.801 de J. F. Branellec e col., está descrito um procedimento e um aparelho para a eliminação dos grupos nitrosos das heparinas de baixo peso molecular, obtidos com o uso do procedimento de nitrosação. A limitação deste procedimento está no baixo poder de penetração dos raios UVA, tanto nas soluções como nos sólidos: Este facto tem um efeito sobre os tempos e o aparelho usados para a purificação. A estabilidade do produto exposto ao tratamento com raios é o maior problema com o tratamento por raios γ.UV rays are widely used for the maintenance of sterility in sterile water or for the reduction of nitrous oxide derivatives in drinking water. U.S. Patent 5,599,801 to J.F. Branellec et al. Discloses a procedure and apparatus for the removal of the nitrous groups of the low molecular weight heparins obtained with the use of the nitrosation procedure. The limitation of this procedure lies in the low penetration power of UVA rays, both in solutions and in solids: This has an effect on the times and apparatus used for purification. The stability of the product exposed to lightning treatment is the major problem with the treatment by γ rays.
Por este motivo, é necessário que se proporcione um procedimento tendo em vista reduzir as quantidades de nitritos e/ou de grupos N-NO na HBPM, em que o procedimento seja eficaz, mais económico em comparação com a técnica anterior e muito eficiente.For this reason, it is necessary to provide a procedure for reducing the amounts of nitrites and / or N-NO groups in LMWH, where the procedure is effective, more economical compared to the prior art, and very efficient.
Um dos principais objectivos da presente invenção consiste na execução de um procedimento de despolimerização que permita a obtenção de uma HBPM com níveis de N-NO residuais inferiores a 0,25 ppm.One of the main objects of the present invention is to carry out a depolymerization procedure which allows the production of LMWH with residual N-NO levels of less than 0.25 ppm.
Um dos objectivos da presente invenção consiste em proporcionar um procedimento para despolimerização que obtenha uma HBPM com níveis de nitritos inferiores a 5 ppm.It is an object of the present invention to provide a procedure for depolymerization to obtain a LMWH with nitrite levels of less than 5 ppm.
Outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um procedimento de purificação da heparina despolimerizada, obtida mediante o uso de nitrito de sódio, 5 capaz de purificar a heparina despolimerizada mediante a redução das quantidades de nitritos residuais e de grupos N-NO nitrosado.Another object of the present invention is to provide a depolymerized heparin purification procedure, obtained by the use of sodium nitrite, capable of purifying the depolymerized heparin by reducing the amounts of residual nitrites and nitrosated N-NO groups.
Estes objectivos e outros que surgirão a partir da descrição detalhada apresentada de seguida, entram na presente invenção, que desenvolveu um procedimento de preparação de HBPM e um procedimento de purificação da mesma. A presente invenção também se refere a um procedimento para a preparação de HBPM que tenha um nivel de nitritos e simultaneamente um nivel de grupos N-NO nitroso nos limites indicados pela Farmacopeia Europeia, Quarta edição, que tenha as caracteristicas indicadas nas reivindicações 1-7 anexas.These objects and others which will emerge from the detailed description set forth below, fall within the present invention, which has developed a procedure for the preparation of LMWH and a purification procedure thereof. The present invention also relates to a process for the preparation of LMWH having a level of nitrites and simultaneously a level of N-NO nitrous groups within the limits indicated by the European Pharmacopoeia, Fourth Edition, having the features set forth in claims 1-7 attached.
Outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um procedimento de purificação capaz de obter uma redução dos grupos nitrito e N-NO que eventualmente presentes na HBPM, a niveis inferiores aos limites indicados pela Farmacopeia Europeia, Quarta edição, mediante tratamento com calor ou microondas. A Farmacopeia Europeia, Quarta edição, está incorporada no presente documento para referência. Em particular, a página 1296, relativa às heparinas em geral; páginas 1297-1299 relativas à HBPM; páginas 1610 1612 relativas à Nadroparina (heparina despolimerizada obtida mediante nitrosação); páginas 999-1000 relativas à Dalteparina (heparina despolimerizada obtida mediante nitrosação). 6Another object of the present invention is to provide a purification procedure capable of obtaining a reduction of the nitrite and N-NO groups which may be present in the LMWH at levels below the limits given by the European Pharmacopoeia, Fourth Edition, by heat or microwave treatment. The European Pharmacopoeia, Fourth Edition, is incorporated herein by reference. In particular, page 1296, on heparins in general; pages 1297-1299 relating to LMWH; pages 1610-1612 for Nadroparin (depolymerized heparin obtained by nitrosation); pages 999-1000 for Dalteparin (depolymerized heparin obtained by nitrosation). 6
Descrição da invenção 0 procedimento da presente invenção é efectuado com o uso de uma concentração de heparina padrão que se encontra no mercado, composta por 1% a 25% (gramas por heparina relativamente ao peso total da solução); de preferência, de 5% a 20%; e mais especificamente de preferência de 10% a 16%. A heparina que se encontra no mercado está normalmente liofilizada em forma de um sal de sódio -heparinum natricum- Farmacopeia Europeia, Quarta Edição, página 1296. O solicitante descobriu que a despolimerização da heparina na presença do nitrito de sódio é efectuada com uma proporção pesorpeso, entre a heparina e o nitrito de sódio, de 60:1 e 45:1.Description of the Invention The procedure of the present invention is carried out using a standard concentration of commercially available heparin composed of 1% to 25% (grams per heparin relative to the total weight of the solution); preferably from 5% to 20%; and more specifically preferably from 10% to 16%. Commercially available heparin is usually lyophilised as a sodium salt-heparin natricum. European Pharmacopoeia, Fourth Edition, page 1296. The Applicant has discovered that the depolymerization of heparin in the presence of sodium nitrite is effected with a weight-for-weight ratio , between heparin and sodium nitrite, 60: 1 and 45: 1.
De um modo vantajoso, o solicitante descobriu que uma proporção peso: peso de 60:1 e 45:1, entre a heparina e o nitrito de sódio, produz uma HBPM com um teor de nitrito inferior a 5 ppm e simultaneamente um teor em grupos de N-NO inferior a 0,25 ppm.Advantageously the Applicant has found that a weight: weight ratio of 60: 1 to 45: 1, between heparin and sodium nitrite, produces LMWH with a nitrite content of less than 5 ppm and a group content of N-NO less than 0.25 ppm.
Numa forma de execução preferida, a proporção peso:peso, entre a heparina e o nitrito de sódio é composta por 52:1 a 47:1.In a preferred embodiment, the weight: weight ratio of heparin to sodium nitrite is 52: 1 to 47: 1.
Nas proporções em peso acima mencionadas, o nitrito de sódio é considerado como tal independentemente do titulo do sal usado; por exemplo, o nitrito de sódio é puro por análise, tendo um grau de nitrito de sódio de cerca de 97%.In the above-mentioned weight ratios, sodium nitrite is considered as such regardless of the salt used; for example, sodium nitrite is pure by analysis, having a sodium nitrite degree of about 97%.
No uso, a forma liofilizada de heparina de sódio é dissolvida a, por exemplo, 25°C, num contentor dotado de meios para aquecimento e agitação.In use, the lyophilized form of sodium heparin is dissolved at, for example, 25 ° C in a container provided with means for heating and stirring.
De preferência, o procedimento de despolimerização é efectuado a uma temperatura compreendida entre 15a.C e 30°C, por exemplo entre 23°C e 27°C, de preferência a 25°C. À solução é acrescentado nitrito de sódio, por exemplo nitrito de sódio a 97%, e uma substância acidificante, por exemplo ácido cloridrico, para se levar o 7 pH da solução a um pH compreendido entre 2,0 e 4,0. O desaparecimento do nitrito é monitorizado com o uso de papel de amido-iodo. Posteriormente, o pH da solução é levado a um valor compreendido entre 10 e 13 mediante a adição de uma substância alcalina. Por último, adiciona-se NaBH4 numa quantidade em peso compreendida entre 0,5% e 2,5%, relativamente ao peso inicial da heparina. Neste ponto, deixa-se a solução a uma temperatura entre 20-30°C, por exemplo 25°C, durante um tempo compreendido entre 10 e 30 horas, por exemplo 20 horas. O excesso de NaBH4 é eliminado mediante a adição de uma substância ácida até um pH compreendido entre 2 e 4, por exemplo pH 3.Preferably, the depolymerization procedure is carried out at a temperature in the range of 15Â ° C to 30Â ° C, for example between 23Â ° C and 27Â ° C, preferably at 25Â ° C. To the solution is added sodium nitrite, for example 97% sodium nitrite, and an acidifying substance, for example hydrochloric acid, to bring the pH of the solution to a pH between 2.0 and 4.0. The disappearance of the nitrite is monitored with the use of starch-iodine paper. Subsequently, the pH of the solution is brought to between 10 and 13 by the addition of an alkaline substance. Finally, NaBH 4 is added in an amount by weight of 0.5% to 2.5%, based on the initial weight of the heparin. At this point, the solution is allowed to stand at between 20-30 ° C, for example 25 ° C, for a time comprised between 10 and 30 hours, for example 20 hours. Excess NaBH4 is removed by the addition of an acidic substance to a pH comprised between 2 and 4, for example pH 3.
Seguindo o procedimento anterior, obtém-se um produto despolimerizado que respeita as especificações físico-quimicas e biológicas da Farmacopeia Europeia, Quarta edição, para a heparina despolimerizada com ácido nitroso, que tem um conteúdo em N-nitrosamina inferior a 0,25 ppm e uma quantidade final nunca inferior a 70% (gramas de heparina despolimerizada relativamente ao peso de partida da heparina), por exemplo uma quantidade entre 75% e 85%.Following the above procedure, a depolymerized product is obtained which complies with the physico-chemical and biological specifications of the European Pharmacopoeia, Fourth Edition, for depolymerized heparin with nitrous acid, which has an N-nitrosamine content of less than 0.25 ppm and a final amount never less than 70% (grams of depolymerized heparin relative to the starting weight of the heparin), for example an amount between 75% and 85%.
Com uma proporção em peso de heparina-nitrito de sódio inferior a 45:1 obtém-se um produto com um teor de N-nitrosamina acima dos limites estabelecidos e com uma quantidade produzida inferior à desejada. Este produto deve ser posteriormente purificado. Com uma proporção em peso entre heparina-nitrito de sódio superior a 60:1 não se obtém um nivel de despolimerização aceitável. O procedimento de purificação, objecto da presente invenção, de uma heparina despolimerizada, obtida mediante nitrosação, pode ser efectuado mediante tratamento com calor ou com microondas.With a weight ratio of heparin sodium nitrite of less than 45: 1 a product is obtained with an N-nitrosamine content above the established limits and with a produced amount lower than desired. This product should be further purified. With a weight ratio between sodium heparin-nitrite of greater than 60: 1, no acceptable level of depolymerisation is obtained. The subject purification procedure of a depolymerized heparin obtained by nitrosation may be carried out by heat or microwave treatment.
Descobriu-se que tanto o calor como as microondas entre 9900 e 2450 Megahertz (MHz) conseguem reduzir drasticamente a presença de nitritos e de grupos de N-nitrosado com um pH compreendido entre 3,0 e 13,0, de preferência com um pH compreendido entre 4,0 e 12,0, por exemplo com um pH 10-12. O calor e as microondas podem ser usados em separado, embora o tratamento com microondas das soluções aquosas contendo HBPM leve a um aquecimento da solução aquosa e, por isso, a um aquecimento sinérgico e à acção das microondas na eliminação dos grupos nitrosos presentes na HBPM derivados da despolimerização mediante nitrosação.It has been found that both heat and microwaves between 9900 and 2450 Megahertz (MHz) are able to drastically reduce the presence of nitrites and N-nitrosated groups with a pH of 3.0 to 13.0, preferably with a pH preferably from 4.0 to 12.0, for example with a pH of 10-12. Heat and microwaves may be used separately although microwave treatment of aqueous solutions containing LMWH leads to heating the aqueous solution and therefore to synergistic and microwave heating in the removal of the nitrous groups present in LMWH derived from depolymerization by nitrosation.
Numa forma de execução, o procedimento de purificação é efectuado mediante aquecimento.In one embodiment, the purification procedure is effected by heating.
Aquece-se e agita-se uma solução aquosa contendo de 1% a 20% (peso: peso) de HBPM (obtida mediante nitrosação) para a sua purificação, até se atingir uma temperatura compreendida entre 40°C e 90°C, de preferência entre 60°C e 80°C, com um pH compreendido entre 3,0 e 13,0 de preferência entre 4,0 e 12,0 durante um período de tempo compreendido entre 0,5 e 3 horas.An aqueous solution containing 1% to 20% (weight: weight) of LMWH (obtained by nitrosation) is heated and agitated for purification until a temperature of 40 ° C to 90 ° C is reached. preferably from 60 ° C to 80 ° C, with a pH of from 3.0 to 13.0, preferably from 4.0 to 12.0, for a period of from 0.5 to 3 hours.
Em seguida, leva-se a solução a um valor de pH compreendido entre 11 e 13, de preferência um pH 12, a uma temperatura compreendida entre 70°C e 90°C, com agitação. A solução é purificada mediante ultrafiltração com membrana seguindo os métodos conhecidos.The solution is then brought to a pH of from 11 to 13, preferably pH 12, at a temperature of from 70øC to 90øC, with stirring. The solution is purified by membrane ultrafiltration following known methods.
Numa forma de execução, o procedimento de purificação é efectuado mediante o uso de microondas. A purificação de HBPM contendo nitritos e grupos de N-nitrosado pode ser efectuada submetendo a solução aquosa contendo de 1% a 20% de HBPM a um PG compreendido entre 7,0 e 13,0, de preferência entre 10,0 e 20,0 à radiação de microondas durante um período de tempo compreendido entre 60 e 300 segundos, usando microondas com uma frequência compreendida entre 900 e 2450 MHz, a uma potência compreendida entre 600 e 100 watts, na presença de silicatos inertes pertencentes, de preferência, à classe da montemorilonite, em forma de pó e em quantidades de 5% a 15% relativamente ao peso da HBPM. 9 A presença do silicato inerte actua como amplificador do efeito das microondas. A suspensão contendo HBPM em solução e silicato inerte é arrefecida até à temperatura ambiente, filtrada para se eliminar o material inerte, o pH é levado a um valor de 6,5 a 7,0 a solução é ultraf iltrada para se eliminarem os sais presentes na solução e o ingrediente activo é liofilizado.In one embodiment, the purification procedure is performed by the use of microwaves. Purification of LMWH containing nitrites and N-nitrosate groups may be effected by subjecting the aqueous solution containing 1% to 20% of LMWH at a pH of 7.0 to 13.0, preferably 10.0 to 20, 0 to microwave radiation for a time period comprised between 60 and 300 seconds, using microwaves with a frequency comprised between 900 and 2450 MHz, at power between 600 and 100 watts, in the presence of inert silicates belonging, preferably, to class of the montemorilonite, in the form of powder and in amounts of 5% to 15% relative to the weight of the LMWH. The presence of the inert silicate acts as an amplifier of the effect of the microwaves. The suspension containing LMWH in solution and inert silicate is cooled to room temperature, filtered to remove the inert material, the pH is brought to 6.5 to 7.0 the solution is ultrafiltered to eliminate the salts present in the solution and the active ingredient is lyophilized.
Obtém-se uma HBPM extremamente pura, tal como se mostra na tabela 1, com quantidades de 96% a 98%, e com actividade farmacológica praticamente inalterada.An extremely pure LMWH, as shown in Table 1, is obtained in amounts of 96% to 98%, and with substantially unchanged pharmacological activity.
Tabela 1: ANÁLISE DE AMOSTRAS ANTES E DEPOIS DA FASE DETable 1: ANALYSIS OF SAMPLES BEFORE AND AFTER THE PHASE OF
PURIFICAÇÃOPURIFICATION
Activida de Alia (UI) Activid ade Axa (UI) -no2 (ppm) -no2 (ppm) N-NO (ppm) N-NO (ppm) Antes Depoi s Antes Depois Antes Depoi s Antes Depois Amostra 1 (exemplo 2) 36, 93 31,18 124,46 128,14 2,57 0,12 0,13 0,05 Amostra 2 (exemplo 3) 36, 93 38,57 124,46 118,35 2,57 n.v. * 0,13 0,07 Amostra 3 (exemplo 4) 38, 93 32, 61 144,46 152,74 0,79 n.v. * 0,18 0,03 Amostra 4 (exemplo 5) 39,23 33,18 107,33 100,11 0,38 n.v. * 0,21 0,08 Amostra 5 (exemplo 6) 39,23 36, 64 107,33 11, 64 0,38 n.v. * 0,16 n.v. * n.v.*: não avaliável(Ppm) N-NO (ppm) N-NO (ppm) Before After Before After Before After After Before Sample 1 (Example 2) 36, 93 31.18 124.46 128.14 2.57 0.12 0.13 0.05 Sample 2 (example 3) 36.93 38.57 124.46 118.35 2.57 nv * 0.13 0.07 Sample 3 (example 4) 38.93 32.61 144.46 152.74 0.79 n.v. * 0.18 0.03 Sample 4 (example 5) 39.23 33.18 107.33 100.11 0.38 n.v. * 0.21 0.08 Sample 5 (example 6) 39.23 36.64 107.33 11.64 0.38 n.v. * 0.16 n.v. * n.v. *: not evaluable
As análises dos parâmetros biológicos, isto é, a actividade anti-IIa (Alia) e a actividade anti-Xa (Axa), os parâmetros químicos, isto é, o conteúdo dos nitritos e dos grupos N-nitrosado, foram efectuadas com procedimentos 10 descritos na Farmacopeia Europeia, Quarta Edição, para a HBPM, páginas 999, 1297 e 1610.Analyzes of the biological parameters, i.e. the anti-IIa activity (Alia) and the anti-Xa activity (Axa), the chemical parameters, i.e. the content of the nitrites and the N-nitrosated groups, were performed with procedures 10 described in the European Pharmacopoeia, Fourth Edition, for LMWH, pages 999, 1297 and 1610.
Tal como se pode ver na Tabela 1, o procedimento de despolimerização da presente invenção permite a obtenção de uma HBPM com uma quantidade de nitritos inferior ou igual a 5 ppm (determinada mediante cromatografia de líquidos, Farmacopeia Europeia, Quarta Edição, página 999) e uma quantidade de grupos nitrosos inferior ou igual a 0,25 ppm (determinada com o rompimento da ligação N-NO mediante o uso de ácido bromídrico em acetato de etilo num condensador de refluxo, medindo-se a libertação de NO mediante quimioluminiscência, Farmacopeia Europeia, Quarta Edição, página 1611, conhecida como solução EPS).As can be seen in Table 1, the depolymerization procedure of the present invention allows obtaining a LMWH with a nitrite amount of less than or equal to 5 ppm (as determined by liquid chromatography, European Pharmacopoeia, Fourth Edition, page 999) and an amount of nitrous groups less than or equal to 0.25 ppm (determined upon the disruption of the N-NO bond by the use of hydrobromic acid in ethyl acetate in a reflux condenser, measuring the NO release by chemiluminescence, European Pharmacopoeia , Fourth Edition, page 1611, known as the EPS solution).
Numa forma de execução preferida, a solução EPS pode ser submetida ao procedimento de purificação da presente invenção, tendo por objectivo a obtenção de dalteparina ou nadroparina purificadas.In a preferred embodiment, the EPS solution can be subjected to the purification procedure of the present invention for the purpose of obtaining purified dalteparin or nadroparin.
Como alternativa, noutra forma de execução, a solução EPS pode ser submetida a uma separação em dalteparina ou nadroparina. Posteriormente, as fracções de dalteparina e nadroparina obtidas da separação são purificadas, tendo-se por objectivo a obtenção de dalteparina ou nadroparina purificadas.Alternatively, in another embodiment, the EPS solution may be subjected to a separation in dalteparin or nadroparin. Subsequently, the fractions of dalteparin and nadroparin obtained from the separation are purified, with the aim of obtaining purified dalteparin or nadroparin.
Os exemplos incluídos na presente memória descritiva devem ser considerados como mais uma ilustração da invenção e, por isso, não se pretende que sejam limitativos. EXEMPLO 1: Preparação de heparina de baixo peso molecular mediante despolimerização usando nitrito de sódioThe examples included herein should be considered as a further illustration of the invention and therefore are not intended to be limiting. EXAMPLE 1: Preparation of low molecular weight heparin by depolymerization using sodium nitrite
Dissolvem-se 100 g de heparina de sódio com actividade anticoagulante < 160 Ul/mg em 900 ml de água destilada a 25°C, e adicionam-se 2,07 g de NaN02 (97%) à solução e depois adiciona-se HC1 5N até um pH 2,5. A reacção é controlada para se detectar o desaparecimento de 11 nitrito usando papel de amido-iodo. 0 pH da solução é levado a 10,5 com uma solução concentrada de NaOH e adiciona-se NaBH4 a partida da heparina. uma quantidade de 1,5% do peso deDissolve 100 g of sodium heparin with anticoagulant activity < 160 IU / mg in 900 ml of distilled water at 25 DEG C., and 2.07 g of NaNO2 (97%) are added to the solution and then 5N HCl is added to pH 2.5. The reaction is monitored to detect the disappearance of nitrite using amido-iodo paper. The pH of the solution is brought to 10.5 with a concentrated solution of NaOH and NaBH4 is added starting the heparin. an amount of 1,5% by weight of
Deixa-se a solução à temperatura ambiente durante 20 horas e depois acidifica-se com HC1 5 N, levando o pH a 3,2 tendo em vista destruir o excesso de NaBH4. Em seguida a solução é neutralizada com NaOH 5N, levando-se o pH a 6,8. A solução obtida é purificada mediante ultrafiltração, tendo em vista a eliminação dos sais e de substâncias com um peso molecular muito baixo, de acordo com as especificações indicadas pela Farmacopeia Europeia, Quarta Edição, páginas 999 e 1610.The solution is allowed to stand at ambient temperature for 20 hours and then acidified with 5N HCl, bringing the pH to 3.2 with a view to destroying excess NaBH4. Then the solution is neutralized with 5N NaOH, bringing the pH to 6.8. The solution obtained is purified by ultrafiltration, in view of the elimination of salts and substances of very low molecular weight, according to the specifications indicated by the European Pharmacopoeia, Fourth Edition, pages 999 and 1610.
Em seguida, a solução é liofilizada e obtém-se heparina de baixo peso molecular numa quantidade não inferior a 70% do peso da heparina de partida. O produto obtido, sem ser submetido a qualquer outra purificação, tem um teor de N-nitrosamina inferior aos limites da Farmacopeia europeia, Quarta Edição (0,25 ppm) , tal como mencionado na descrição da invenção e na TABELA 1.The solution is then lyophilized and low molecular weight heparin is obtained in an amount of not less than 70% by weight of the starting heparin. The product obtained, without further purification, has an N-nitrosamine content below the limits of the European Pharmacopoeia, Fourth Edition (0.25 ppm), as mentioned in the description of the invention and in TABLE 1.
Embora o produto obtido de acordo com o procedimento de despolimerização da presente invenção entre nas especificações da Farmacopeia europeia, Quarta Edição, para o conteúdo de nitritos e de N-nitrosamina, submete-se tudo a um procedimento de purificação, tendo em vista verificar a eficiência deste procedimento, tal como se mostra nos exemplos seguintes. O procedimento de purificação é um procedimento geral que pode ser aplicado na purificação de uma HBPM obtida por despolimerização mediante nitrosação. EXEMPLO 2: Purificação mediante aquecimentoWhile the product obtained according to the depolymerization procedure of the present invention is in the European Pharmacopoeia, Fourth Edition, specification for nitrite and N-nitrosamine content, all is subjected to a purification procedure, in order to verify the efficiency of this procedure, as shown in the following examples. The purification procedure is a general procedure that can be applied in the purification of an LMWH obtained by depolymerization by nitrosation. EXAMPLE 2: Heating Purification
Dissolvem-se 50 gramas de HBPM, obtida da forma descrita no exemplol, em 1000 ml de água destilada sem 12 nitritos, e corrige-se o pH para 4,5 com HC1 IN. Em seguida aquece-se a solução até 50°C durante 30 minutos com agitação. Arrefece-se a solução e leva-se o pH a 12,0 com NaOH 5N, aquecendo-se até 80°C, com agitação, durante 30 minutos. Corrige-se o pH com HC1 2N até um pH de 6,7. Em seguida, elimina-se o cloreto de sódio da solução mediante ultrafiltração, usando uma membrana com um corte de 600 daltons e água bidestilada sem nitritos ou nitratos. A heparina purificada é liofilizada e obtêm-se 48,35 g de heparina de baixo peso molecular com uma quantidade final de 96,7%. EXEMPLO 3: Purificação mediante radiação com microondas50 grams of LMWH, obtained as described in the example, are dissolved in 1000 ml of distilled water without 12 nitrites, and the pH is adjusted to 4.5 with 1N HCl. The solution is then heated to 50 ° C for 30 minutes with stirring. The solution is cooled and the pH is brought to 12.0 with 5N NaOH, warming to 80øC with stirring for 30 minutes. The pH is corrected with 2N HCl to a pH of 6.7. The sodium chloride is then removed from the solution by ultrafiltration using a 600 dalton cut-off membrane and bidistilled water without nitrites or nitrates. The purified heparin is lyophilized and 48.35 g of low molecular weight heparin is obtained with a final amount of 96.7%. EXAMPLE 3: Microwave Radiation Purification
Adicionam-se 70 gramas de HBPM, obtida de acordo com o exemplo 1, a 1400 ml de água bidestilada sem nitritos ou nitratos, levando-se o pH a 12 com NaOH IN. Adicionam-se à solução 5 g de montemorilonite em pó, que se submete em seguida a radiação com microondas a 2450 MHz durante 100 segundos a 600 watts e deixa-se arrefecer até 25°C, corrigindo-se o pH com HC1 5N até 6,5. Filtra-se o material inerte, purifica-se e liofiliza-se a solução; obtém-se 68,7% do produto, o que representa uma quantidade total de 98,14%. EXEMPLO 4: Purificação mediante radiação com microondas70 grams of LMWH, obtained according to example 1, is added to 1400 ml of bidistilled water without nitrites or nitrates, the pH being brought to 12 with 1N NaOH. 5 g of powdered montmorillonite is added to the solution, which is then subjected to microwave irradiation at 2450 MHz for 100 seconds at 600 watts and allowed to cool to 25øC, correcting the pH with 5N HCl to 6 , 5. The inert material is filtered, purified and the solution is lyophilized; 68.7% of the product is obtained, which represents a total amount of 98.14%. EXAMPLE 4: Microwave Radiation Purification
Dissolvem-se 65 gramas de HBPM, obtida de acordo com o exemplo 1, em 800 ml de água bidestilada sem nitritos ou nitratos. Adicionam-se à solução 4 g de montemorilonite em pó, leva-se até um pH de 11,0 com NaOH 2N e submete-se a radiação com microondas a 2450 MHz a 600 watts durante 100 segundos. Em seguida arrefece-se a solução e leva-se o pH a 6,5-7,0 com HC1 IN, filtra-se o material inerte e submete-se a solução resultante a ultrafiltração, com o uso de uma 13 membrana de corte de 600 daltons. A solução ultrafiltrada é liofilizada e obtêm-se 63,3 gramas de produto, isto é, 97,38%. EXEMPLO 5: Purificação mediante radiação com microondas65 grams of LMWH, obtained according to example 1, is dissolved in 800 ml of doubly distilled water without nitrites or nitrates. 4 g of powdered montmorillonite is added to the solution, brought to pH 11.0 with 2N NaOH and subjected to microwave radiation at 2450 MHz at 600 watts for 100 seconds. The solution is then cooled and the pH is brought to 6.5-7.0 with 1N HCl, the inert material is filtered and the resultant solution is subjected to ultrafiltration with the use of a cutting membrane of 600 daltons. The ultrafiltered solution is freeze-dried and yields 63.3 grams of product, i.e., 97.38%. EXAMPLE 5: Microwave Radiation Purification
Repete-se o procedimento do exemplo 4, usando 60 gramas de HBPM, obtidos de acordo com o exemplo 1, dissolvidos em 1000 ml de água. Adicionam-se 9 gramas de montemorilonite em pó à solução, que se leva a um pH 12 com NaOH 2N, submetendo-se a radiação durante 60 segundos com microondas a 2450 MHz a 600 watts. Corrige-se o pH com HC1 2N até um pH de 7,1. Filtra-se o material inerte e liofiliza-se a solução resultante, após a ultrafiltração, obtendo-se 59,1 gramas de produto, isto é, 98,5%. EXEMPLO 6: Purificação mediante radiação com microondasThe procedure of Example 4 is repeated using 60 grams of LMWH, obtained according to example 1, dissolved in 1000 ml of water. 9 grams of powdered montmorillonite is added to the solution, which is brought to pH 12 with 2N NaOH, subjecting the radiation for 60 seconds with 2450 MHz microwave at 600 watts. The pH is corrected with 2N HCl to a pH of 7.1. The inert material is filtered and the resulting solution is lyophilized after ultrafiltration to give 59.1 grams of product, i.e., 98.5%. EXAMPLE 6: Microwave Radiation Purification
Repete-se o procedimento da reivindicação 4 usando 65 gramas de HBPM, obtida de acordo com o exemplo 1, dissolvidos em 1000 ml de água. Adicionam-se 8 gramas de montemorilonite em pó à solução, que se leva a um pH de 10,5 com NaOH 2N, submetendo-se a radiação durante 120 segundos com microondas a 2450 MHz a 600 watts. Arrefece-se a solução até 24°C e corrige-se o pH com HCl 2N, levando-o até 6,9. Filtra-se o material inerte e submete-se a solução resultante a ultraf iltração com o uso de uma membrana de corte de 600 daltons e dessalga-se antes da liofilização. Obtêm-se 64,1 gramas de produto purificado, isto é, 98,6%. EXEMPLO 7: Preparação de heparina de baixo peso molecular mediante despolimerização usando nitrito de sódioThe procedure of claim 4 is repeated using 65 grams of LMWH, obtained according to example 1, dissolved in 1000 ml of water. 8 grams of powdered montmorillonite is added to the solution, which is brought to pH 10.5 with 2N NaOH, subjecting the radiation for 120 seconds with 2450 MHz microwave at 600 watts. The solution is cooled to 24øC and the pH is corrected with 2N HCl, bringing it to 6.9. The inert material is filtered and the resulting solution is ultrafiltrated using a 600 dalton cut-off membrane and desalted prior to lyophilization. 64.1 grams of purified product is obtained, i.e., 98.6%. EXAMPLE 7: Preparation of low molecular weight heparin by depolymerization using sodium nitrite
Dissolvem-se 20 g de heparina de sódio com actividade anticoagulante < 160 Ul/mg em 133 ml de água 14 destilada a 25°C, adicionam-se 0,427 g de NaNCh (97%), assim como ácido clorídrico com uma concentração de 5N para se atingir um pH 2,5. Durante a reacção usa-se papel de amido-iodo para o controlo do desaparecimento do nitrito. Leva-se o pH da solução a 10,5 com uma solução concentrada de hidróxido de sódio e adicionam-se 0,3 g de NaBH4 a 1,5%.20 g of sodium heparin having anticoagulant activity < 160 ul / mg in 133 ml of distilled water at 25 ° C, 0.427 g of NaNCH (97%) are added, as well as hydrochloric acid with a concentration of 5N to reach pH 2.5. During the reaction, starch-iodine paper is used to control the disappearance of the nitrite. The pH of the solution is brought to 10.5 with a concentrated solution of sodium hydroxide and 0.3 g of 1.5% NaBH 4 are added.
Deixa-se a solução à temperatura ambiente durante 20 horas e depois acidifica-se para se levar o pH a 2,8 tendo em vista destruir o excesso de NaBH4. Purifica-se a solução obtida mediante ultrafiltração. EXEMPLO 8: Preparação de heparina de baixo peso molecular mediante despolimerização usando nitrito de sódioThe solution is allowed to stand at room temperature for 20 hours and then acidified to bring the pH to 2.8 in order to destroy excess NaBH 4. The solution obtained is purified by ultrafiltration. EXAMPLE 8: Preparation of low molecular weight heparin by depolymerization using sodium nitrite
Dissolvem-se 20 g de heparina de sódio com actividade anticoagulante < 160 Ul/mg 133 ml de água destilada a 15°C e adicionam-se 0,412 g de NaN02 (97%), assim como ácido clorídrico com uma concentração de 5N, para se atingir um pH de 2,5. Durante a reacção usa-se papel de amido-iodo para o controlo do desaparecimento do nitrito. Leva-se o pH da solução a 10,5 com uma solução concentrada de hidróxido de sódio e adicionam-se 0,3 g de NaBH4 a 1,5%.20 g of sodium heparin having anticoagulant activity < 160 ul / ml 133 ml of distilled water at 15 ° C and 0.412 g of NaNO 2 (97%), as well as 5N hydrochloric acid are added to reach a pH of 2.5. During the reaction, starch-iodine paper is used to control the disappearance of the nitrite. The pH of the solution is brought to 10.5 with a concentrated solution of sodium hydroxide and 0.3 g of 1.5% NaBH 4 are added.
Deixa-se a solução à temperatura ambiente durante 20 horas e depois acidifica-se para se levar o pH a 3,0 tendo em vista destruir o excesso de NaBH4. Purifica-se a solução obtida mediante ultrafiltração. 15The solution is allowed to stand at room temperature for 20 hours and then acidified to bring the pH to 3.0 in order to destroy excess NaBH 4. The solution obtained is purified by ultrafiltration. 15
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO A lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor, não sendo parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.DOCUMENTS REFERRED TO IN THE DESCRIPTION The list of documents referred to by the author of the present application was made solely for the reader's information and is not an integral part of the European patent document. Notwithstanding careful preparation, the IEP assumes no responsibility for any errors or omissions.
Documentos de patente referidos na descrição EP 0014184 A [0004] [0007] EP 0040144 A [0004] EP 0076279 A [0004] [0007] EP 0121067 A [0004] US 4804652 A [0005] US 4351938 A [0005] US 5019649 A, J.C. Lormeau [0008] US 5599801 A, J.F. Branellec [0014]Patent documents referred to in the description EP 0014184 A [0004] EP 0040144 A [0004] EP 0121067 A [0004] US 4804652 A [0005] US 4351938 A [0005] US 5019649 A, JC Lormeau US 5599801 A, JF Branellec [0014]
Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • L.O. ANDERSSON et al. Throm. Res., 1976, vol. 9, 575 [0003] • F.A. OFOSU et al. Mechanism of action of low molecular weight heparins and heparinoids. Ballicre's Clin.Non-patent literature referred to in the description • L.O. ANDERSSON et al. Throm. Res., 1976, vol. 9, 575 [0003] F.A. OFOSU et al. Mechanism of action of low molecular weight heparins and heparinoids. Ballicre's Clin.
Haematol., 1990, vol. 3, 505-529 [0005] • L.BARA et al. Increased anti Xa bioavailability for a low molecular weight heparin compared with unfractionated heparin. Semin. Thromb. Hemost., 1985, vol. 11, 316-317 [0005]Haematol., 1990, vol. 3, 505-529 [0005] • L.BARA et al. Increased anti Xa bioavailability for low molecular weight heparin compared with unfractionated heparin. Semin. Thromb. Hemost., 1985, vol. 11, 316-317 [0005]
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