PT1767221E - Preparação de uma vacina bivalente contra a dependência morfina-heroína - Google Patents

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Benito Anton Palma
Philippeleff Gelman
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Inst Nac De Psiquiatria Ramon De La Fuente Muniz
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Description

DESCRIÇÃO
PREPARAÇÃO DE UMA VACINA BIVALENTE CONTRA A DEPENDÊNCIA
MORFINA-HEROÍNA A presente invenção recebeu o apoio e aconselhamento cientifico do Dr. Gerardo Heinze Martin e Dr. Ramón de la Fuente Muniz. Trabalho financiado pela Fundação Gonzalo del Rio Arronte e pelo Instituto Nacional de Psiquiatria Ramón de la Fuente Muniz (Grant 2040) .
CAMPO TÉCNICO É revelado um processo para a preparação e utilização de uma vacina bivalente contra a dependência da morfina e heroina, o qual é capaz de induzir uma resposta imune humoral robusta contra estas duas drogas opiáceas viciantes através da imunização activa de mamíferos, incluindo o ser humano. O processo para a preparação de tal vacina bivalente que consiste, na sua concepção, síntese, purificação, aplicação e validação terapêutica. A formulação desta vacina estrutural consiste na síntese inicial e haptenização de um intermediário derivado de morfina-6-hemissuccinato ao toxóide do tétano utilizado como proteína transportadora. Este último passo químico é realizado através de um longo braço espaçador ligante sequencialmente sintetizado a partir da condensação covalente do reagente reticulante homobifuncional, o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e o
reagente de reticulação heterobifuncional N- (-trifluoracetilcaproiloxi)-éster-succinimida (TFCS). A resposta humoral induzida pela imunização activa com a vacina deste tipo foi caracterizada pela presença de títulos muito elevados e sustentados de anticorpos circulantes policlonais que reconhecem e se ligam com 1 especificidade equivalente, tanto a morfina como a heroina no sangue, impedindo deste modo a sua barreira hemato-encefálica em permeação o cérebro. Os farmacocinéticos alterados destas duas drogas conduzem a uma redução significativa da fracção "livre" não ligada de heroina e de morfina no plasma, franqueando deste modo a entrada de droga no cérebro. Assim, o antagonismo dos anticorpos na barreira de permeação do cérebro em relação a opiáceos melhora um mecanismo imunoprotector que embota os efeitos de drogas de reforço destas duas substâncias opiáceas que actuam na via de recompensa mesocorticolimbica, em roedores activamente vacinados com este imunogénio previamente treinados para auto-administrar estes dois reforços farmacológicos. Por conseguinte, a presente descrição descreve o processo para a preparação de uma vacina bivalente contra o vicio em morfina / heroina, que representa um novo imunorreagente ou uma nova composição farmacêutica ou formulação terapêutica que pode ser aplicada, avaliada e validada como uma nova terapia imunofarmacológica anti-aditiva contra estes dois medicamentos opiáceos em protocolos de vacinação activos em seres humanos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 abuso de substâncias ilegais com reforço de propriedades viciantes representa um importante problema de saúde pública mundial. Por exemplo, nos Estados Unidos da América, cerca de 48 milhões de pessoas tiveram contacto com drogas ilícitas num período de um ano (Neurobiological Adaptations to Psychostimulants and opiates as basis of treatment development.In: New Medications for Drug Abuse, K. Severino, A. e T. Olivito Kosten, 2000) . Assim, este problema de saúde tem efeitos deletérios graves e 2 progressivos nas áreas sociais, económicas e médicas nos países afectados. Epidemiologicamente, os psicoestimulantes tais como as anfetaminas e a cocaína, e, numa menor medida, as substâncias de opiáceos, como a morfina e a heroína, representam as drogas mais prevalentes causando a maior morbidade de dependência em todo o mundo. Nos países em desenvolvimento, como o México, os dados epidemiológicos da última Pesquisa Nacional de Vícios (ME Medina-Mora e E.
Rojas Guiot, Salud Mental, 26 (2): 1-11, 2003) relataram um aumento alarmante no consumo de drogas de tais substâncias na parte central do país, bem como em cidades localizadas entre o México e a fronteira com os EUA. Ao nível clínico, existem várias patologias co-mórbidas relacionadas com o abuso de dependência de substâncias ilegais, que se dividem em categorias diferentes. Em primeiro lugar, o índice elevado de mortes relacionadas com os efeitos tóxicos induzidos pela dose excessiva de tais substâncias. Em segundo lugar, a indução de efeitos teratogénicos em recém-nascidos, que são frequentemente associados ao abuso crónico de substâncias ilegais por mulheres grávidas viciadas. Finalmente, a alta incidência de doenças co-mórbidas na adquisição de infecções virais, como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), frequentemente detectada em viciados em heroína, bem como o aumento das taxas de crimes, violência e delinquência frequentemente associado ao comércio e ingestão de drogas e de tais substâncias ilegais. Assim, ao nível terapêutico, existe uma necessidade urgente de refocar e estabelecer estratégias govermentais simples, programas de saúde e novos medicamentos para combater eficazmente o abuso de drogas e de substâncias ilegais. A neurobiologia da dependência de drogas começou há mais de três décadas atrás, a maioria das investigações tem lidado 3 com a farmacocinética e farmacodinâmica das drogas. Ao nível farmacocinético, as substâncias ilegais viciantes, tais como a cocaína, a morfina e a heroína, exibem propriedades de potentes fármacos de reforço e perfis farmacocinéticos específicos, que conduzem finalmente aos seus elevados efeitos de drogas viciantes no cérebro. A morfina é um alcaloide com uma estrutura química fenantrenica (ver exemplo 1), obtida a partir do extracto leitoso (goma de ópio) da Papaver somniferum, e representa o principal composto extraído (10%), juntamente com outros compostos estruturalmente relacionados, tais como a codeína, tebaína e papaverina (CP 0'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics. Pp. 621-642, 10 ed. J. G. Hardman e L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, Nova Iorque, 2001) . A morfina possui um grupo hidroxilo na terceira posição e um grupo hidroxilo alcoólico, na sexta posição colocada no interior da estrutura do anel fenólico. Por outro lado, a heroína, um derivado semi-sintético da morfina, tem dois grupos acetil condensados nas posições acima referidas dentro da estrutura do anel do ópio fenantrenico (CP 0'Brien, Abuso de Drogas, In:. Bases Farmacológicas da Terapêutica pp 621,642, 10 ed. J. G. Hardman e L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, Nova Iorque, 2001) . Tanto a morfina como a heroína são absorvidas a partir do tracto gastrointestinal e respiratório, incluindo a mucosa oral, assim como a partir da injecção subcutânea, intramuscular, intravascular e dos espaços intratecais. Estes dois compostos opiáceos apresentam um perfil farmacocinético semelhante marcante, com base na sua alta capacidade de permeação da barreira hemato-encefálica, principalmente devido às suas propriedades lipofílicas elevados (CP 0'Brien, Drug Abuse, em:. The Pharmacological Basis of Therapeutics. pp. 621 - 642, 10 ed. J. G. Hardman e L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, Nova Iorque, 2001) . Na 4 verdade, a heroina é relativamente mais lipofilica do que a morfina e assim penetra mais rapidamente a barreira sangue-cérebro do que a morfina. A principal via catabólica de morfina ocorre principalmente no figado e depende da conjugação enzimática dependente com ácido glucurónico em ambos os três e seis grupos hidroxilo colocados na estrutura de anel fenantrenicp, produzindo compostos de metabolitos endógenos, tais como a morfina, morfina 3 - 6 -, e, em menor extensão, a morfina 3-6-glucoronido. Estes compostos intermédios catabólicos, representam o secretor estrutural e / ou formas de excreção de morfina na urina. Além disso, a morfina-6-glucurónido mostrou possuir potentes efeitos analgésicos e psicotrópicos, sendo um fármaco de reforço no cérebro. Assim, os metabolitos de morfina gerados a partir do figado para a corrente sanguínea passam rapidamente a barreira sangue-cérebro e activam o subtipo de receptor opióide πιμ nas vias de recompensa do cérebro mediando os efeitos de reforço de abuso da droga (Kamendulis LM et al. Pharmacol. Exper. Ther. 279:713-717, 1996; CW Hutto Jr. y W. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 58 (1) :133-140, 1997; AJ Halliday et al, Life Sei.. 65 (2) 225-236, 1999 e DE Selley et al. Biochem. Pharmacol. 62:447-455, 2001). De facto, estudos farmacocinéticos recentes (veja o comentário e referências citadas em J. Halliday et al., Life Sei. 65 (2) 225-236, 1999) apoiam a ideia de que as acções analgésicas e / ou de dependência de morfina no SNC não são directa e predominantemente mediadas só pela morfina, mas em grande parte exercidas pelos seus metabolitos activos glucuronatados como a morfina-6-glucoronido. Até agora, vários estudos (Kamendulis LM et al. Pharmacol. Exper. Ther. 279:713-717, 1996 e AJ Halliday et al., Life Sei. 65 (2) 225-236, 1999) demonstraram mecanismos farmacocinéticos e farmacodinâmicos semelhantes para a heroína. Assim, uma 5 vez que a heroína é administrada, uma grande fracção do fármaco é catabolizada rapidamente no plasma e / ou no fígado em 6-monoacetil-morfina, e subsequentemente catabolizeda em morfina e finalmente convertida em morfina-6-glucuronido, antes de alcançar os seus alvos neuronais (por exemplo, o receptor opióide ιημ) (RE Aderjan Skopp e G., Ther. Drug Monit, 20 (5):. 561-9, 1998). Estes resultados apoiam o conceito de que o agonismo farmacológico corrente da heroína e dos seus metabolitos endógenos (por exemplo, 6-monoacetil-morfina e morfina) no receptor ιημ opióide incluindo os metabolitos activos de biotransformação finais (por exemplo, a morfina-6-glucuronido) representam o mecanismo farmacodinâmico pelo qual estas substâncias melhoram as suas acções de reforço viciantes do cérebro (a. J. Halliday et al., Life Sei. 65 (2):. 225-236, 1999, D.E. Selley et al, Biochem. Pharmacol. 62:447-455, 2001 e CP 0'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics. pp 621-642, 10 ed. J. G. Hardman e L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, Nova Iorque, 2001). Vários estudos farmacodinâmicos (ver trabalhos avaliados de E. J. Nestler, Nat. Neuroci. 5:1076-1079, 2002 e PN Deslandes et al., J. Pharmacy and Pharmacol. 54:885-895, 2002) têm demonstrado que o abuso crónico tanto da heroína como da morfina leva ao desenvolvimento e ao estabelecimento de mudanças específicas a longo prazo a nível celular e molecular que acabam por produzir a expressão de neuroadaptações biológicas para a dependência de opiáceos. Além disso, essas mudanças neuronais produzem importantes alterações electrofisiológicas, neuroquímicas e genómicas, que são progressivamente estabelecidas e consolidadas em um período de longo prazo (por exemplo, anos) no cérebro durante a dependência de drogas. Portanto, 6 as alterações comportamentais que ocorrem durante a dependência de opiáceos para estas substâncias de abuso no individuo seguem um tempo de curso de maior complexidade e intensidade no que diz respeito à sintomatologia da dependência da droga . Por exemplo, a administração repetitiva de heroina por um viciado, produz um aumento de comportamentos estereotipados que levam a comportamentos compulsivos de ingestão de drogas não controladas, associados com os ritos estereotipados de administração, inicialmente acompanhadas de tolerância farmacológica e, posteriormente, por meio de sinais fisicos e sintomas de retirada da droga após aguda supressão da droga opióide (Severino K. et al., Ann. NY Acad. Sei 909: 51 - 87, 2000) . Assim, o comportamento de consumo de heroina torna-se a maior prioridade e necessidade no individuo viciado, levando à reintegração de comportamentos compulsivos de consumo de drogas e de procura de drogas normalmente observados durante a retirada da droga ou na abstinência. As alterações neuroadaptativas que ocorrem durante a dependência de opiáceos são causadas principalmente pelas acções farmacológicas exibidas pela exposição repetida do fármaco ao longo de um grupo de neurónios agrupado localizado em diferentes áreas do cérebro (Severino K. et al., Ann. NY Acad. Sei 909: 51 - 87, 2000). Estas áreas do cérebro incluem o locus coeruleus, o hipocampo, o hipotálamo lateral, área tegmental ventral-, complexo amigdalóide, núcleo accumbens e córtex pré-frontal, que é estruturalmente composto pelo substrato neuroanatomico e pelas vias neurais onde as substâncias opiáceas e outras drogas ilícitas de abuso (por exemplo, a cocaína) principalmente exercem suas atividades de drogas gratificantes e de drogas de reforço (K. Severino et al., Ann. NY Acad. Sei 909: 51 - 87, 2000) . Neste contexto, a administração crónica tanto de morfina como de heroína 7 induz o desenvolvimento de uma série de respostas celulares e moleculares adaptativas homeostáticas sobre os neurónios no interior das estruturas cerebrais referidas afectadas pela droga. Tais respostas adaptativas envolvem várias alterações electrofisiológicas, bioquímicas e genómicas observadas durante a adição às drogas que, em conjunto, são produzidas para manter e restaurar a homeostase funcional preexistente dos circuitos neurais envolvidos e dos seus neurónios operantes alterados durante o abuso de drogas, antes do comportamento de consumo compulsivo da droga (Severino K. et al., Ann. NY Acad. Sei 909: 51 - 87, 2000). Uma vez que estas neuroadaptações tenham sido estabelecidas, a suspensão abrupta do comportamento de consumo de drogas aumenta o desenvolvimento de uma nova série de modificações e adaptações neurobiológicos celulares nos neurónios impingidos pela droga, levando à base neuropatológica que subjaz ao síndroma de privação durante a dependência de drogas. O síndroma de privação produzido tanto pela morfina como pela heroína no indivíduo viciado, em oposição à síndroma de privação induzido por cocaína e anfetamina, é caracterizado por alterações físicas e psicológicas altamente intensas no indivíduo viciado (H. Ghodse, Drugs of abuse and dependence. In: Drugs and Addictive Behavior, a guide to treatment, Blackwell Science Ltd , ed, Oxford, Reino Unido, pp 72-119, 1995; GF Koob, Ann.. N. Y: Acad. Sei. Vol. 909:185 2000 e Severino K. et al., Ann. NY Acad. Sei 909: 51 - 87, 2000). Clinicamente, a síndrome de abstinência é caracterizada por quatro fases distintas desenvolvidas em um curso de tempo progressivo ou gradual. Durante as primeiras 1-7 horas, o viciado em abstinência desenvolve manifestações comportamentais caracterizadas por um desejo compulsivo e ansiedade extrema para consumo de drogas. Durante uma segunda fase (após 8-15 horas), as alterações físicas tais como lacrimejamento intenso, suores, rinorreia e letargia são adicionadas à sintomatologia inicial da droga. Mais adiante, depois de 16-24 horas após a retirada contínua de drogas, os sinais físicos, tais como midríase, piloereção, cãibras musculares e alterações na temperatura do corpo (por exemplo, frio intenso e sensação de calor), além de algias difusas, anorexia e irritabilidade podem aparecer bem . Posteriormente, após a retirada persistente (por exemplo, 2-6 dias), outros sinais físicos e comportamentais que podem aparecer incluem insónias, febre, atraso motor, dor abdominal, vómitos e diarreias, bem como aumento da respiração anormal, incluindo mudanças na frequência cardíaca e de tensão sanguínea. Assim, a partir da perspectiva da sintomatologia que ocorre em toxicomania, a duração e a gravidade da retirada de morfina e de heroína depende de vários factores farmacocinéticos e farmacodinâmicos. Além disso, tem sido relatado que a gravidade dos sintomas de abstinência de opiáceos depende de vários aspectos farmacológicos e biológicos, os quais incluem a quantidade diária de ingestão de drogas (por exemplo, a dose injectada por indivíduo), o período de tempo de uso de drogas e / ou o abuso, para além do estado físico e da personalidade do indivíduo afectar a resposta ao consumo da droga.
Assim, dada a complexidade da história natural da patologia aditiva da morfina / heroína, alguns tratamentos farmacológicos disponíveis actualmente foram projectados para modificar os mecanismos farmacodinâmicos pelo qual essas substâncias opiáceas produzem suas acções como drogas de reforço, uma vez que se ligar os seus receptores específicos a locais nos seus neurónios alvo (DM Grilly, Opioids (narcotics) and their antagonists. In: Drugs and human behavior, 4th ed. pp 238-262, Allyn e Bacon, eds. 9 EUA, 2002).Neste contexto, o tratamento agudo de desintoxicação de opiáceos representa a abordagem farmacoterapêutica inicial e mais usada actualmente para tratar viciados clinicamente crónicos, que se torna uma prioridade médica e de emergência para aliviar os sinais e os sintomas de retirada da droga, que são comummente associados com a fisiológica fisica do indivíduo, distúrbios endocrinológicos e químicos induzidos pela dependência de drogas. Por exemplo, agonistas parciais dos receptores ιημ opióides como a metadona e buprenorfina, em combinação com benzodiazepínicos e / ou neurolépticos sedativos são comumente prescritos e administrados para o tratamento de desintoxicação aguda aos opiáceos. Em oposição aos processos de desintoxicação agudos utilizados para tratar a dependência de opiáceos, a terapia de substituição da utilização de substâncias de opiáceos, tais como metadona e / ou buprenorfina, assim como antagonistas dos receptores de opióides, tais como a naloxona e / ou a naltrexona, não é inteiramente recomendada durante a privação de opiáceos, porque eles exacerbam a demanda de comportamento de ingestão de drogas dos compostos opiáceos de base que suscitaram ou instalaram o antigo estado viciante da droga no indivíduo. Em circunstâncias normais, o tratamento e manutenção do síndroma de privação de opiáceos, requer hospitalização e cuidados clínicos com o apoio de médicos especializados, o que tem normalmente como resultado ser altamente dispendioso.
Da mesma forma que a síndrome de abstinência, a desintoxicação completa de morfina e / ou de heroína (supressão do comportamento de ingestão de drogas) em indivíduos dependentes é um importante problema de saúde a ser perseguido. Com base na ampla gama de alterações funcionais anormais estabelecidas após um período a longo 10 prazo no cérebro produzido pelo abuso crónico de opiáceos, é fácil de compreender as dificuldades para restabelecer a função homeostática do cérebro, antes da ingestão de drogas, pelas actuais terapias de desintoxicação disponíveis. Assim, apesar das limitações terapêuticas, um tratamento de desintoxicação ideal deve ter como objectivo cumprir os critérios médicos específicos descritos a seguir. Em primeiro lugar, deve ser direccionado a bloquear ou atenuar a dependência fisiológica e psicológica relativamente aos opiáceos, a fim de restabelecer o equilíbrio homeostático dos sistemas neurais cronicamente desregulados por substâncias opiáceas. Em segundo lugar, os tratamentos de desintoxicação devem inibir essas mudanças físicas e comportamentais relevantes que parecem ser exacerbadas durante a retirada da droga induzida por intervenções terapêuticas, resultando em uma experiência tolerável e tratamentos de segurança. Além disso, deve fornecer uma suspensão completa do comportamento de ingestão de drogas do indivíduo, reorientando assim as pessoas viciadas em outros tratamentos não farmacológicos disponíveis alternativos (por exemplo, psicoterapia e aconselhamento). Depois disso, uma vez que a terapia de desintoxicação completa de opiáceos tiver sido atingida, o objectivo médico final a ser abordado é a prevenção de recaídas de abuso de opiáceos. Assim, a partir de um ponto de vista médico geral, os desafios terapêuticos para neutralizar o vício em morfina / heroína são enormes e, na maioria dos casos, difíceis de melhorar. Os principais obstáculos enfrentados pelos tratamentos farmacológicos e pelos tratamento não farmacológicos são a falta de um número adequado de clínicas ou hospitais especializados, os altos custos económicos da terapia normalmente cobrados ao paciente e, mais importante, a ausência de um acompanhamento do paciente em programas de acompanhamento 11 (ou seja, durante anos) ou a avaliação clínica contínua assim como a falta de aplicação da psicoterapia de apoio a longo prazo para evitar a recaída nas drogas. Além disso, outro problema fundamental da maioria dos actuais tratamentos anti-aditivos contra o abuso de opiáceos é a toxicidade dos efeitos secundários resultante do doseamento de longo prazo de agentes farmacológicos únicos ou combinados (Severino K. et al., Ann. NY Acad. Sei 909: 51 -87, 2000). Por exemplo, a metadona e a buprenorfina, dois agonistas parciais duradouros do receptor opióide πιμ, representam as drogas terapêuticas de substituição mais comuns usadas hoje em dia, para diminuir o síndrome de abstinência de opiáceos ou para prolongar a abstinência de opiáceos (MJ Kreek, Ann. NY Acad. Sei., 909: 186-216, 2000) . Além disso, dois agonistas adrenérgicos, tais como clonidina, guanfacina e / ou lofexidina representam um outro conjunto de compostos utilizados com bastante frequência nas terapias de desintoxicação para melhorar sinais e sintomas de abstinência causados pela supressão abrupta de drogas opiáceas (MJ Kreek, Ann. NY Acad. Sei., 909:186 - 216, 2000) . No entanto, para além da sua ampla utilização em terapias de longo prazo de desintoxicação e / ou tratamento de manutenção da abstinência, estas drogas têm provado induzir vários efeitos secundários tóxicos. Por exemplo, a metadona, a buprenorfina e a pentazoeina têm sido referidas como produzindo distúrbios do sono e ansiedade, disfunção cognitiva e emocional grave. Além disso, dois agonistas dos receptores adrenérgicos têm sido referidos como produzindo sedação, hipotensão, ansiedade extrema e astenia aquando da administração a longo prazo. Além disso, os pacientes que receberam a substituição de opiáceos com metadona, podem não surpreendentemente, mostrar o desenvolvimento de sinais e sintomas de dependência de opiáceos, devido a que este receptor opióide 12 agonista parcial my produz a mesmo neuroquímica, alterações neuroadaptative celulares e moleculares no cérebro, como os relatados quer para a morfina quer para e heroina durante a dependência de opiáceos (MJ Kreek, Ann. NY Acad. Sei., 909:186 - 216, 2000). Outras drogas actualmente disponíveis utilizadas para prolongar a abstinência e a prevenção de recaída contra o vício de morfina / heroína em pacientes desintoxicados compreendem os antagonistas dos receptores opióides my, naloxona e naltrexona. Os efeitos colaterais tóxicos, muitas vezes vistos durante a administração a longo prazo destes compostos são principalmente devido ao bloqueio dos sistemas de transmissão de opióides endógenos no cérebro, levando ao prejuízo das funções cerebrais cognitivas e emocionais, entre muitas outras atividades fisiológicas ( M. J. Kreek, Ann. N.Y. acad. Sei, 909:186-216, 2000 ).
Até ao momento, uma das principais conclusões extraídas das terapias farmacológicas acima descritas actualmente utilizadas para se abordar a desintoxicação contra o abuso de opiáceos, incluindo tratamentos de manutenção de longo prazo para a retirada de drogas e da prevenção de recidiva contra o vício da morfina / heroína , é que nenhum desses tratamentos farmacológicos têm mostrado uma eficácia óptima. Esta conclusão baseia-se no fato de que essas drogas produzem efeitos colaterais tóxicos importantes em pacientes que recebem manutenção a longo prazo da abstinência e / ou de prevenção de recaída (T. e D. Biegel Kosten, especialista Rev. Vaccines, 1 (3): 89-97, 2002). Assim, existe uma necessidade urgente de desenvolver e validar novas estratégias terapêuticas anti-viciantes, com base na síntese, aplicação e validação de formulações de novas drogas altamente eficazes, exibindo toxicidade mínima e sem efeitos colaterais detectados, quando pretende ser 13 utilizada em terapias de longo prazo para a desintoxicação aguda e manutenção a longo prazo de abstinência de morfina / heroina.
Neste contexto, os diferentes grupos têm projectado, aplicado e validado estratégias terapêuticas alternativas em modelos animais experimentais, que compartilham um mecanismo farmacocinético comum. Assim, em sentido inverso ao da farmacologia anti-viciante clássica, este último mecanismo é baseado na alteração da farmacocinética da droga, diminuindo significativamente ou embotando a barreira sangue-cérebro na permeação da droga "livre" não ligada no plasma, o que em última análise representa a fracção das drogas em plasma que permeia o cérebro causando o alto reforço e efeitos gratificantes no individuo viciado. Todas estas abordagens experimentais têm sido focadas para diminuir ou prevenir significativamente a barreira sangue-cérebro de permeação do abuso das drogas, reforçando a ligação da "livre" fracção não ligada do fármaco no plasma, por meio de anticorpos especificos que reconhecem e se ligam com elevada especificidade e avidez para estas drogas no sangue. Como as imunoglobulinas (anticorpos) normalmente não permeiam a barreira sangue-cérebro, a fracção de plasma de "droga livre não ligado", o qual é o conjunto disponível de fármaco que permeia a barreira hemato-encefálica, interagem com as imunoglobulinas que estabelecem complexos de droga-anticorpo, o qual em ultimo lugar diminui significativamente essa fracção de fármaco livre não ligado no plasma. Esta alteração na farmacocinética da droga no plasma, leva a mudanças que alteraram a farmacodinâmica da droga no cérebro, diminuindo assim ou abolindo a actividade das drogas que causam dependência orientados para os seus neurónios especificos . Estas últimas alterações 14 farmacodinâmicas, finalmente, levam a neutralizar tanto o desenvolvimento das actividades de reforço como os efeitos agradáveis gratificantes induzidos por abuso de drogas no cérebro. A principal propriedade farmacocinética partilhada pela maioria de abuso das drogas, é a alta actividade de permeação sangue-cérebro, o que representa o mecanismo básico e crucial, pelo qual a maior parte dos fármacos de abuso potentes produziam as suas acções de reforço muito intensas no cérebro, que conduz ao continuo de consumo de drogas em busca de comportamentos apresentados por indivíduos após a exposição a estes compostos químicos. Neste contexto, a geração de anticorpos específicos no soro contra o abuso de drogas representa uma abordagem terapêutica alternativa para diminuir ou impedir a barreira sangue-cérebro de permeação ao abuso de drogas impedindo que alcancem os seus alvos neuronais. Esta abordagem de antagonismo de anticorpo impede a permeação da droga no cérebro tem sido provado melhorar um efeito imunoprotector contra a ingestão de drogas e contra os comportamentos de procura de drogas, como demonstrado para a cocaína, nicotina, PCP e anfetaminas em roedores (ver uma conta de avaliação de obras e referências em T. Kosten e D. Biegel, Expert Rev. Vaccines, 1 (3) : 89-97, 2002 e K. Kantak, Drugs, 63 (4) : 342-252, 2003) . No que diz respeito à cocaína, vários grupos de pesquisa foram capazes de desenvolver e aplicar estratégias experimentais diferentes com base no projecto, síntese, aplicação e validação de várias preparações imunogénicas das proteínas transportadoras com cocaína haptenizada de um um modo bivalente ( Kantak et al., Psychopharmacology 148:251-262, 2000 ; Fox, B. S. et al., Nat. Medicine, 2:1129-1132, 1996 ; Sparenborg et al., Therapeutics 293(3) : 952-961, 2000 ; Carrera et al. Nature, 378:727-730, 1995 , Carrera, R. et al., Proc. Nat. Acad. Sei, USA, 97(11)6202-6206, 2000 ). 15
Sei., EUA, 97 (11) 6202 - 6206, 2000). Algumas proteínas de elevado peso molecular, tais como BSA e KLH têm sido utilizadas como veículos para a ligação covalente de cocaína utilizando procedimentos de acoplamento padrão químicos covalentes. Deste modo, seguindo protocolos de imunização activa em roedores, alguns destes imunogénios têm mostrado capacidade para gerar respostas de baixo a moderado título de anticorpos contra esta droga de abuso em animais activamente vacinados. Além disso, outras abordagens experimentais que conferem efeitos imunoprotectores contra a dependência de cocaína foram explorados através do aumento da produção de anticorpos monoclonais convencionais e / ou catalíticos administrados durante protocolos de imunização passiva contra esta droga psicoactiva em roedores (Metz et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 95:10176-10180, 1998; Fox et al, Nat. . Med. Chem. 2:1129 - 1132, 1996 e Landry et al., Ciência 239:1899 -1901, 1993). Os efeitos imunoprotectores contra o vício em cocaína usando essas estratégias experimentais baseados em estratégias imunológicas têm sido exploradas por detectar a extinção dos comportamentos de drogas de reforço em roedores em paradigmas farmacológicos e em paradigmas comportamentais operantes. Estas estratégias experimentais partilham um mecanismo anti-aditivo comum, que se baseia na redução significativa e / ou inibição completa da permeação sangue-cérebro da fraeção "livre" não ligada de cocaína no plasma. Assim, em animais vacinados activamente hiperimunes, a fraeção não ligada "livre" de droga no plasma é significativamente reduzida, uma vez que os anticorpos séricos específicos no vínculo de sangue com a droga psicoactiva (Kantak et al., Psychopharmacology, 148:251-262, 2000 ; Carrera et al, Proc Natl... Acad. Sei. EUA, 97 (11) :6202-6206; Carrera et al, Nature, 378:727-730, 1995).. Alternativamente, os anticorpos monoclonais 16 produzidos contra a cocaína, podem ligar a fracção "livre" não ligada de cocaína depois de serem passivamente transferidos para o sangue ( Metz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:10176-10180, 1998 ; Fox et al., Nat. Med. 2:1129-1132, 1996 , Benowitz, Pharmacol. Toxicol. 72:3-12, 1993 ) . Em ambos os casos, o mecanismo de neutralização imunológico comum, que promove mudanças alteradas na farmacocinética da cocaína, leva à diminuição significativa ou à completa inibição da entrada de droga no cérebro, diminuindo ou fazendo o embotamento do direccionamento de cocaína para a dopamina específica da membrana neuronal de recaptação de transportador. Este último mecanismo mediado por anticorpos induz mudanças nas alterações na farmacodinâmica da cocaína no cérebro, conduzindo a alterações no nível sináptico dos neurotransmissores de amina, que suprimem o aumento evocado-dependente no tom catecolaminérgico central normalmente observado após a entrada no cérebro de cocaína em indivíduos que se viciam. 0 cenário de comportamento final que resulta destas alterações na farmacocinética alterada de cocaína e eventos neuroquímicos é a ausência de efeitos de recompensa intensificados induzidos por esta droga de reforço potente no cérebro dos mamíferos. Assim, uma vez que a cocaína foi neutralizada para produzir o seu efeito de reforço e recompensar em animais hiper-imunes, as propriedades de reforço da droga serão perdidas após uma subsequente exposição à droga, como demonstrado pela supressão de procura de drogas de drogas e de comportamentos de tomo de drogas, em tais animais vacinados hiperimunes (roedores) observados com a utilização de alguns conjugados imunogénicos de cocaína.
Em resumo, a maioria dos estudos pré-clínicos acima mencionados têm demonstrado a viabilidade da utilização de 17 abordagem antagonismo à base de anticorpos para embotamento consumo de drogas e comportamentos em roedores de procura de droga. No entanto, o tipo das proteínas transportadoras (por exemplo, BSA e KLH) utilizadas na preparação dos conjugados imunogénicos (vacinas) utilizados nestes estudos impede a sua potencial utilização em formulações de vacina para utilização em protocolos de vacinação humana ( Carrera et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2001 ; Carrera et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000 ; Carrera et al., Nature, 378:727-730, 1995 ; Kantak et al., Psychopharmacology, 148:251-262, 2000 ; Ettinger et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 58:215-220, 1997 and Fox, Drug and Alcohol Depend. 48:153-158, 1997 ) . Além disso, a síntese de catalíticos convencionais anticorpos monoclonais de ratos e ou anti cocaína utilizados como potencial imunoterapia passiva para a adição em animais experimentais (roedores), tem a limitação principal de conferir imunoprotecção num período de curto prazo, quando administradas passivamente. Isto é principalmente devido à depuração metabólica rápida dessas imunoglobulinas murinas a partir do soro de animais passivamente imunizados outros que não os ratos. (Goldsby et al., Vaccines, In: Kuby Immunology, 4th ed. Freeman and Co. New Cork, NY, pp. 449-466, 2000). Além disso, a utilização potencial dos anticorpos monoclonais murinos anti-cocaína disponíveis como agentes terapêuticos imunológicos contra o vício da cocaína em seres humanos, requer a utilização de técnicas de ADN recombinante, de forma a "humanizar" o segmento Fc de imunoglobulinas murinas.
Finalmente, o potencial de aplicação desse antagonismo à base de anticorpos contra a dependência de cocaína no ser humano é uma questão actual em experimentação como uma abordagem terapêutica. Esta estratégia imunofarmacológica 18 foi inicialmente abordada através da síntese de uma formulação de vacina anti cocaína, estruturalmente concebida para o uso humano, onde a cocaína foi conjugada covalentemente com a subunidade recombinante da toxina da cólera (utilizada como proteína transportadora. Ao nível pré-clínico, este conjugado mostrou eficácias moderadas no desencadeamento de respostas de anticorpos em ratos vacinados que activamente conferem efeitos imunoprotectores de prevenção de recaídas de comportamento de tomada de cocaína nestes animais (Kantak et ai., Psychopharmacology, 148:251-262, 2000) . Além disso, a vacinação activa com esse imunógeno em voluntários humanos, usados para testar a segurança e a imunogenicidade da formulação da vacina, infelizmente, mostrou efeitos terapêuticos pouco promissores, neste único Estudo Clínicos de Fase I (T. Kosten et al., Vaccine 2559:1 -9, 2001), devido ao facto de que esta formulação de vacina ter mostrado uma fraca capacidade imunogénica, produzindo respostas de baixo título de anticorpos [por exemplo, intervalo de baixa concentração (g) de imunoglobulina / ml de soro específico] na maioria dos indivíduos vacinados. Para além das limitações experimentais acima mencionadas, novas vacinas anti cocaína desenvolvidas por diversos grupos de investigação, estão actualmente a ser estudadas, usando diferentes proteínas de transporte, a fim de gerar uma imunogenicidade melhorada contra esta droga psicoactiva tanto em Estudos de fase pré-clínica e Clinica de Fase I. . Uma vez que as propriedades imunogénicas destas formulações da vacina são validados em seres humanos em estudos clínicos de fase I, pode tornar-se disponível para uma posterior avaliação em estudos clínicos de Fase II que avaliam as capacidades imunoprotectoras dessas formulações da vacina contra o vício em cocaína. Por exemplo, poderia ser usado estudos clínicos de fase II avaliando a 19 imunoprotecção baseado humoral aprimorada de longa duração contra a dependência de cocaína, em ex-toxicodependentes, exibindo a prolongar e abstinência controlada, mas desafiou a reaquisição farmacológica do comportamento de ingestão de cocaína viciante.
No caso do tabagismo, pelo menos duas preparações imunogénicas (vacinas) para a substância psicoactiva de reforço, ou seja, a nicotina, foram concebidos para aplicação em seres humanos (ver uma conta de avaliação de obras e referências seleccionadas em T. Kosten and D. Biegel, Expert Rev. Vaccines, 1(3): 89-97, 2002 ; K.
Kantak, Drugs, 63(4) : 341-352,2003 ) . Os estudos pré- clínicos demonstraram que estas duas vacinas foram capazes de gerar grandes quantidades para moderar os títulos séricos de anticorpos específicos (isto é, 0,05 - 0,2 mg / ml de soro) contra a nicotina em roedores activamente vacinados. Além disso, a vacinação activa com estas preparações imunogénicas de nicotina, demonstrou conferir imunoprotecção contra o comportamento de aquisição de consumo de nicotina em paradigmas de drogas de auto-administração intravenosa em roedores. O mecanismo imunoprotector contra a dependência da nicotina segue o mesmo mecanismo farmacocinético mediado descrito para a dependência de cocaína, isto é, através da ligação da fracção "livre" não ligada de nicotina no plasma por meio de anticorpos específicos no soro, o que impede que a barreira sangue-cérebro seja permeável a esta droga Estudos de fase clínica feita independentemente por Nabi Pharmaceuticals (vacina anti-nicotina NicVAX) e Xenova Pharmaceutical Group, na Bélgica, relataram resultados bem sucedidos na avaliação das propriedades tóxicas e imunogénicas destas duas formulações de vacina. Os relatórios sobre a avaliação das capacidades de 20 imunoprotecção dessas duas formulações da vacina contra o vício em nicotina de ex-viciados em drogas voluntários em estudos clínicos de Fase II são esperados para estar pronto nos próximos dois próximos anos.
Na verdade, o desenvolvimento de estratégias experimentais focadas na concepção e síntese de preparações imunogénicas e de validação subsequente de protocolos de vacinação para o tratamento de formas específicas de dependência de drogas, foram aproximações pioneiras para opiáceos tais como a morfina e a heroína, mas não por cocaína e dependência da nicotina. Retrospectivamente, no início da década de 70, diversos grupos de pesquisa demonstraram a viabilidade de criar uma resposta imune humoral contra estas duas substâncias opiáceas usando protocolos de vacinação em modelos experimentais animais, tais como o rato e o coelho ( S. Spector and C. W. Parker, Science, 168:1347-1348, 1970 ; S. Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther. 178:253-258, 1971 ; E. L. Adler and C. Liu, J. Immunol, 106:1684-1685, 1971 ; H. Van Vunakis et al., J. Pharmacol.
Exp. Ther. 180:514-521, 1972 ; B. H. Wainer et al., Science, 176-1143-1145, 1972 ; B. H. Wainer et al.,
Science, 178:647-648, 1972 and B. H. Wainer et al., J. Immunol. 110:667-673, 1973 ). Estas abordagens experimentais foram focadas na geração de anticorpos policlonais contra a morfina, exibindo um reconhecimento imunológica cruzado distinto contra a heroína e opiáceos análogos estruturalmente relacionadas (por exemplo, codeína, meperidina, e hidromorfona). Estes anticorpos foram gerados para utilizar em ensaios de concepção imuno específica (ou seja, radioimunoensaio e ensaios imunoenzimáticos ELISA) para detectar e medir a morfina e opiáceos relacionados com substâncias em fluidos biológicos de seres humanos. Estes estudos demonstraram, pela primeira 21 vez, a realização com êxito na criação e a validação da condensação covalente dos grupos 3 - e 6-hidroxilo no anel fenantrenico da molécula da morfina com proteínas transportadoras, como BSA, utilizando um padrão orgânico de procedimentos químicos (procedimentos que ainda são utilizados quando se aproxima a síntese química de tais conjugados imunogénicos). Além disso, vale a pena mencionar que nenhum destes procedimentos químicos foi alguma vez reportado ou reivindicado nos registos de patentes e na sua maioria são considerados como processos químicos clássicos em livros de texto de química orgânica, quando se descreve a ligação covalente dos 3 - e 6 - grupos hidroxilo livres do anel fenantrenico de morfina a proteínas transportadoras. Em tal contexto, dois produtos intermédios estruturais da morfina foram sintetizados com sucesso por diferentes grupos de pesquisa e utilizados para o desenvolvimento de formulações de vacina, ou seja, o produto 3-orto-morfina-carboximetil-éter (3-0-carboximetilmorfina, ver o exemplo 2) e a morfina-6-hemissuccinato (ver exemplo 3) ( S. Spector and C. W. Parker, Science, 168:1347, 1970 ; S. J. Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther. 178:253, 1971 ; H. Van Vunakis et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 180:514, 1972 ; and S. Gross et al., Immunochemistry, 11:453-456, 1974 ). ..No que diz respeito aos referidos derivados intermediários de morfina utilizadas para desenvolver formulações de vacinas, dois registos de patentes idênticas publicadas em 13 de Setembro 1991 (CH 678394 A5) e 15 de Maio de 1996, (EP 0 496 839 Bl) por Erich Hugo Cerny, reivindicão a invenção da síntese estrutural das novas formulações de vacina anti-morfina. Contudo, vale a pena mencionar, que ambos os registos de patentes não revelam nenhuma novidade real ou invenção sobre a síntese das formulações de vacinas terapêuticas reivindicadas. Este argumento baseia-se que ambos os 22 registos de patentes descrevem os mesmos procedimentos sintéticos padrão previamente relatados para gerar o derivado de 3-0-carboxi-metil-morfina intermediário utilizado para conjugar covalentemente à proteína KLH-transportador. Em ambos os casos, utilizaram baseados em morfina e o beta-cloroacetato de sódio e álcool absoluto como reagentes na mistura de reacção. 0 outro derivado intermediário de síntese utilizado para activar a ligação covalente entre a morfina e as proteínas de transporte, é o éster succinilo morfina ligados ao grupo 6-hidroxilo livre do anel phenantrenic-estrutura da molécula da morfina, isto é, a morfina-6-hemissuccinato, ( veja o exemplo 3) (originalmente relatado por B. H. Wainer et al., Science, 176:1143, 1972 , A. Akbarzadeh et al., Biotechnol. Appl.
Biochem, 30:139-145, 1999 ). No mesmo contexto, os processos sintéticos acima mencionados utilizados para gerar o derivado de 3-O-carboximetilmorfina para sintetizar formulações de vacina, um registo de patente da vacina anti-morfina publicado na China (CN1196955), foi concedida injustificadamente do nosso ponto de vista, a Han Ying et ai ., em 28 de outubro de 1998. Estes autores afirmam inovação e novidade em relação aos procedimentos sintéticos e às formulações estruturais de preparações de diferentes vacinas para drogas opiáceas, além de morfina, utilizando os mesmos métodos padrão para sintetizar derivados da morfina-6-hemissuccinato, conforme relatado anteriormente (ver em B. H. Wainer et al., Science, 176:1143, 1972 , A.
Akbarzadeh et al., Biotechnol. Appl. Biochem, 30:139-145, 1999 ). Estes autores utilizaram este derivado intermediário para haptenizar a morfina para BSA como proteína transportadora. A concepção estrutural e síntese de diferentes formulações imunogénicas, onde a morfina foi haptenizada com proteínas 23 transportadoras, como BSA, KLH e representou a base pela qual os autores têm invariavelmente utilizado procedimentos químicos de ligação covalente dos derivados intermediários de morfina 3-0 - carboximetilmorfina e morfina-6-hemissuccinato a estas proteínas portadoras (como foi descrito anteriormente nos estudos experimentais descritas acima, incluindo os registos de patente acima referidos), utilizando como agente de reticulação o reagente químico homobifuncional, l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). O EDC reage com os grupos carboxilo livres disponíveis em qualquer um dos expostos 3-0-carboxymethylmorphine ou derivados de morfina-6-hemissuccinato, formando assim o correspondente dois 0-acilureia como produtos, que são quimicamente reactivos para gerar ligações covalentes amida com os gruposepsilon ( )-amino na cadeia lateral de resíduos de lisina ou na BSA ou na KLH (ver exemplo 4).
Os referidos estudos demonstrando a viabilidade de gerar uma resposta imune humoral contra a morfina e seus opiáceo semi-sintéticos estruturais cognatos, heroína, levou a um estudo pioneiro relatado há quase 30 anos por Bonese ( K. F. Bonese et al. Nature, 252:708-710, 1974 ) . Este estudo foi, de facto, o relatório pioneiro demonstrando que a vacinação activa, com um conjugado de morfina imunogénica num animal experimental, os primatas não humanos Macacus rhesus, foi capaz de gerar uma resposta protectora imune humoral mediada que bloqueia o comportamento de auto-administração viciante em heroína. A síntese deste conjugado imunogénico foi conseguida por hapnetização covalente da morfina para a BSA através de uma ligação éster estável formada pela condensação do anidrido succínico e do grupo 6-hidroxilo na estrutura fenantrenica da molécula da morfina. O derivado intermediário 24 sintetizado, a morfina-6-hemisuccinil, foi então ligado de forma covalente ao reagente de carbodiimida l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) (EDC), obtendo-se assim o conjugado imunogénico completo. A injecção subcutânea repetida deste imunógeno para o primata provocou uma resposta imunológica humoral com anticorpos específicos de morfina, que exibiu reconhecimento cruzado para a heroina. Além disso, a abordagem de vacinação activa com este conjugado demonstrou ser um procedimento eficaz para neutralizar a re-aquisição do comportamento de auto-administração intravenosa de heroina neste único primata, previamente treinado para auto-administrar diferentes doses unitárias deste opiáceo. Embora este relatório pioneiro tenha mostrado o primeiro procedimento de antagonismo à base de anticorpos para neutralizar o comportamento bem sucedido tomada de heroina pelo primata, nunca foi patenteada e desenvolvida para uso clinico. Do mesmo modo, não foram desenvolvidos estudos experimentais relacionados com a concepção, síntese e validação de outros novas formulações vacinais anti-morfina / heroina estruturais utilizando proteínas transportadoras adequadas para a vacinação humana, basicamente devido ao facto de que a BSA não é uma proteína de transporte licenciada para tais fins experimentais. A principal razão para que estes estudos imunofarmacológicos nunca foram observados em humanos com imunogénios adequados para a morfina, heroína pode ser devido, pelo menos em parte, pelo desenvolvimento contínuo e simultâneo de outros agentes neurofarmacológicos utilizados para tratar a dependência da morfina, heroína. Por exemplo, os fármacos sintéticos que exibem actividades agonistas fracas e parciais sobre o receptor opióide πιμ (isto é, a metadona e buprenorfina) e outros fármacos que apresentam actividade antagonista sobre os receptores de opióides (ou seja, a naltrexona e a 25 naloxona). Todos estes medicamentos são usados actualmente para prevenção da recaída para a dependência de opiáceos.
Com base nos relatos de vacinas experimentais contra o vício em morfina / heroína, o qual nunca se aproximou da vacinação humana, estudos experimentais preliminares realizados pelo nosso grupo de pesquisa serviram de base para o desenvolvimento da presente invenção, a formulação de vacina bivalente contra o vício dos supracitados morfina -heroína. Estas experiências descrevem a concepção, síntese e avaliação da imunogenicidade induzida por modelos estruturais sintetizados diferentes de uma nova geração de vacinas contra anti-morfina / heroina ( B. Anton and P. Leff., 31st Annual meeting of the Society for Neuroscience. San Diego, CA. November 10-16, 2001 ). Estas formulações de vacinas estruturais foram inicialmente sintetizadas, ligando covalentemente o derivado de morfina-6-hemissuccinato (M-6-H) intermediário com várias proteínas transportadoras, como BSA, KLH e a proteína da toxina da cólera, subunidade recombinante. Estas reacções de acoplamento utilizaram procedimentos padrão de ligação cruzada para ligar a morfina-6-hemissuccinato (M-6-H), derivada para o intermediário reagente (EDC) l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida. Estes dados experimentais preliminares obtidos a partir de tais estudos, permitiu a identificação de candidatos para proteínas veículo haptenização covalente de morfina. Vale a pena mencionar que este trabalho só foi apresentado em uma sessão de slides no referido International Neuroscience Meeting.
Além disso, não foi encontrada nenhuma informação sobre os dados experimentais relacionados com a concepção dos modelos moleculares estruturais de imunogénios, metodologias que descrevem a síntese, a purificação, a 26 aplicação e procedimentos de dosificação destas novas vacinas. Além disso, não há referências ou descrições da validação dos efeitos anti-aditivos contra a morfina heroina também foram feitos, os quais são descritos na presente invenção da formulação terapêutico da vacina bivalente morfina - heroina contra a dependência destas substâncias opiáceas.
Em adição ao estudo pioneiro relatado por Bonese e colaboradores, que demonstraram a eficácia da vacinação activa com BSA-morfina, para diminuir o comportamento viciante auto-administração de heroina num primata, outros grupos de pesquisa exploraram os efeitos da imunização passiva contra morfina, usando paradigmas comportamentais de auto-administração intravenosa de heroína em roedores ( P. R. Pentel et al., Pharmacol. Biochem. and Behavior, 9:347-352, 1991 ). A partir de um potencial ponto de vista terapêutico, um processo de imunoprotecção passiva contra o vício de morfina e heroína tem limitações práticas para prolongar e manter a abstinência de opiáceos em seres humanos com uma base a longo prazo, ao contrário dos processos de imunização activos. Estas limitações são baseadas em algumas observações práticas derivadas de resultados experimentais de paradigmas de imunoproteção passivas ( R. A. Goldsby, Vaccines. In: Kuby Immunology, 4th ed. Freeman and Co, New Cork, N. Y., pp. 449-466, 2001 ). Estes dados demonstraram a relativamente curta semi-vida biológica de anticorpos monoclonais de murino (de 3-23 dias, dependendo da classe de imunoglobulina e isotipo) depois de ser administrado in vivo em diferentes animais experimentais. Assim, imunoprotecção conferida por administração passiva de anticorpos monoclonais de murino em hospedeiros não-murino é geralmente de curta duração. Além disso, como ambos os anticorpos monoclonais e 27 policlonais usados em terapias de imunização passiva são geralmente produzidas a partir de diferentes espécies animais (por exemplo, rato, coelho, etc), tais imunoglobulinas são geralmente reconhecidas como moléculas antigénicas estranhas quando injetadas em seres humanos. Neste contexto, a imunização passiva de pacientes com tais imunoglobulinas desencadearia uma resposta rápida imunológica humoral contra estas moléculas, o que acaba por resultar em respostas embotadas mediadas por anticorpos neutralizantes e reduzindo a semi-vida destes tipos de imunoglobulinas no plasma. Assim, uma vez preparadas tais respostas antigénicas contra anticorpos heterólogos em indivíduos imunizados passivamente, a administração subsequente destes tipos de imunoglobulinas levam ao desenvolvimento de respostas imunológicas anormais de hipersensibilidade por administração passiva repetida de tais moléculas.
OBJETIVOS E VANTAGENS DA INVENÇÃO
Com base nos referidos antecedentes em relação às terapias anti-dependência contra o abuso de ópio, e especificamente contra o vício em morfina e heroína, podemos concluir que não existem medicamentos eficazes e drogas atóxicos não estão ainda disponíveis para o tratamento em humanos para manter e prolongar a abstinência e prevenção de comportamentos de recaída no consumo de opiáceos viciantes. Até o momento, existem razões para justificar a necessidade atual para o desenvolvimento, aplicação e validação de novas drogas combinadas e estratégias terapêuticas para manter a abstinência prolongada com eficácia para prevenção da recaída de comportamentos de drogas viciantes ingestão de medicamentos opiáceos altamente viciantes como a heroína e a morfina nos seres humanos. 28
Como mencionado anteriormente, os estudos experimentais anteriores relatam a avaliação pré-clinica de diferentes estratégias imunológicas contra o vicio de drogas em modelos animais, suportam a abordagem terapêutica potencial das diferentes estratégias imunoprotetoras contra o vicio de cocaina, nicotina e opiáceos (especificamente a ambos morfina e heroina). Estas estratégias incluem novos tratamentos farmacológicos baseados em anticorpos antagonistas para a manutenção da abstinência prolongada e / ou prevenção de recaida da ingestão de drogas e dependência de drogas para as substâncias acima mencionadas em seres humanos. Na verdade, o mais importante legado destes estudos imunoprotectores contra a dependência de drogas é a identificação das realizações experimentais criticas de ambos os estudos de fase pré-clínicos e clínicos, o que levaria, finalmente, à utilização potencial e validação destas estratégias imunológicas em seres humanos para manter e prolongar a abstinência e / ou a prevenção de recaídas de desordens aditivas e abuso de drogas ilícitas.
Neste contexto, pode-se referir os seguintes requisitos experimentais a satisfazer: a) a concepção e síntese de formulações estruturais de vacinas anti-aditivas, onde a droga hapténica é estruturalmente muito estáveis acoplada através de ligações covalentes (isto é, amida), usando compostos químicos bifuncionais com baixa complexidade estrutural que melhoram a imunogenicidade e a reticulação covalente do fármaco hapténico com proteínas transportadoras licenciadas usados em protocolos de vacinação em seres humanos, b) tais proteínas devem exibir a toxicidade comprovada, e devem ser capazes de conferir um nível muito elevado de imunogenicidade na droga hapténica 29 quando o conjugado droga-proteína é administrado em protocolos de imunização activa, c) avaliação sistemática da resposta imunitária humoral ao fármaco hapténico conjugado com a proteina transportadora, para que os parâmetros funcionais de anticorpos específicos desencadeadas tal como seus títulos, especificidade e avidez podem ser adequadamente caracterizados, após aplicação do imunoconjugado em protocolos activos de vacinação ad hoc, d) monitorização sistemática da resposta imune humoral durante os protocls de vacinação activos com o conjugado imunogénico contendo a droga viciante haptenizada, de modo a identificar e avaliar o estabelecimento de uma resposta de longo prazo e estabilidade de memória humoral contra a droga antigénica após a conclusão dos protocolos de imunização activa, e) avaliação da capacidade e da eficácia destas novas formulações de vacinas terapêuticas contra o vício de drogas (ou seja, morfina-heroína) com capacidade comprovada para conferir imunoproteção a longo prazo contra as drogas que causam dependência. Estas vacinas devem apresentar um bom índice terapêutico para evitar a reaquisição dos comportamentos de dependência em indivíduos descontaminados e abstinentes. A presente descrição refere-se ao projecto, de síntese, purificação, aplicação e validação de um modelo estrutural de vacina contra ambos os vícios morfina e heroína, que preenche todos os requisitos estruturais e funcionais acima mencionados. A descrição pormenorizada dos processos de síntese e a estrutura deste suporte conjugado proteína-morfina, são divulgados na presente descrição. Outras informações também aí descritas são a sua utilização em paradigmas de imunização activa no roedor, o controlo e caracterização do desenvolvimento de uma resposta imune 30 humoral após o reforço, bem como os títulos e a especificidade do anticorpo produzido contra a droga haptenizada. Além disso, os dados experimentais são também revelados mostrando a eficácia provada da presente divulgação da formulação terapêutica de uma nova vacina bivalente contra a morfina / heroína para induzir uma resposta imune humoral robusta de títulos de anticorpos séricos elevados e sustentados contra a morfina, com especificidade equivalente para a heroína, em indivíduos descontaminados em abstinência adictos dessas substâncias opiáceas. Tais anticorpos podem eficientemente antagonizar (bloquear) a reaquisição da dependência de drogas de administração de drogas e de comportamentos de procura de drogas, além de prolongar o estado de abstinência contra estas duas substâncias opiáceas em indivíduos híper imunes desafiados para a reaquisição da droga num padrão aditivo de paradigma de auto-administração intravenosa destas duas substâncias opiáceas no rato. 0 primeiro objectivo da presente invenção é o de revelar o método de síntese e a formulação estrutural de um novo imunogénio para a morfina de acordo com as reivindicações e as vantagens estruturais nunca apresentadas em quaisquer outras formulações de vacina morfina / heroína previamente sintetizados: a) a haptenização da morfina covalente para o toxóide do tétano, uma proteína transportadora licenciada em protocolos de vacinação activas no humano com capacidade provada para conferir uma elevada imunogenicidade de moléculas hapteno de baixa massa molecular, b) a haptenização da morfina covalente com o toxóide do tétano, por meio da utilização sequencial e ligação covalente dos dois reagentes de reticulação diferentes, o que aumenta a síntese de um longo e baixo ligante-braço espaçador imunogénico colocado entre a proteína transportadora e a 31 droga haptenized, c) esta nova morfina imunogénio foi doseada em protocolos de vacinação activa em indivíduos, e mostrou uma comprovada eficácia para gerar uma resposta imune humoral forte e sustentada caracterizada por anticorpos séricos altamente específicos com especificidades equivalentes contra a morfina e seus opiáceos análogos estruturalmente relacionados e altamente viciantes, heroína.
Um outro objectivo da presente divulgação é divulgar e validar um paradigma de imunização activa utilizando a transportador conjugado proteína-morfina supracitado, para otimizar a resposta imune humoral robusto e sustentado com títulos muito elevados de anticorpos anti-hapteno com uma resposta de memória imunológica. estabelecida a longo prazo
Um outro objectivo da presente divulgação diz respeito à demonstração para optimização do título de anticorpo e especificidade, de modo a demonstrar a sua capacidade funcional para reconhecendo cruzado da heroína, mas não de outros medicamentos opióides estruturalmente relacionados com morfina e / ou vários péptidos opióides endógenos produzidos no cérebro.
Um outro objectivo da presente divulgação diz respeito à validação do uso deste imunogénio, como uma composição farmacêutica ou formulação terapêutica para conferir imunoprotecção contra a reaquisição de comportamentos viciantes consumo morfina heroína e para a manutenção da abstinência prolongada indivíduos experimentais previamente desintoxicados de qualquer vício em morfina ou heroína.
Um objectivo adicional da presente descrição descreve a síntese e a estrutura molecular de uma formulação de vacina 32 terapêutica anti-morfina heroína, validada em estudos pré-clínicos em roedores, em que esta formulação de vacina contendo o toxóide do tétano usado como proteína transportadora imunogénica, para a morfina haptenizada covalente, proporciona a sua utilização potencial para avaliar os seus efeitos terapêuticos em estudos de fase clínica, por conferirem uma imunoprotecção a longo prazo, na manutenção da abstinência prolongada e prevenção de recaídas em pacientes desintoxicados de morfina ou qualquer vício em heroína.
Um objectivo final da presente divulgação divulga a metodologia geral utilizada para projectar, desenvolver, aplicar e validar uma terapia eficiente e atóxica, cujo mecanismo de acção difere dos compostos terapêuticos clássicos actuais disponíveis, aumentando as alterações farmacocinéticas dos referidos medicamentos opiáceos, reduzindo assim eficazmente a sua barreira de permeação sangue-cérebro, uma vez que tenham sido administrados a um indivíduo hiperimune previamente vacinado, contra o abuso destes dois fármacos opiáceos.
Em conjunto, a presente revelação descreve e fornece uma descrição completa do método e processos necessários para preparar derivados intermediários para a síntese de uma vacina de morfina / heroína, as composições farmacêuticas ou formulações terapêuticas, incluindo métodos e utilizações terapêuticas contra a dependência da morfina-heroína .
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1, descreve um ensaio representativo de anticorpo ELISA imunoenzimático de captura demonstrando a resposta 33 imune humoral robusta induzida pelo novo imunogénio toxóide do tétano, caracterizado por a morfina de títulos de anticorpos séricos elevados gerados contra esta droga opióide; A Figura 2, mostra a um gráfico representativo que retrata a monitorazação da resposta imune humoral de títulos séricos de anticorpos morfina / heroína no rato, quantificados através de ELISA de captura de anticorpos, ao longo de quatro impulsos consecutivos com o novo toxóide do tétano-morfina durante o calendário activo de vacinação no rato; A Figura 3, mostra um gráfico representativo de ensaios de ELISA de captura de anticorpo imunoenzimático usado para monitorizar o comportamento da resposta imune humoral após a re-imunização (quarta) passada com o novo morfina-toxóide do tétano imunogénio; A Figura 4, mostra um gráfico representativo de ensaios de ELISA de captura de anticorpo imunoenzimáticos utilizados para monitorizar a recuperação dos títulos de anticorpos específicos de morfina / heroína induzidos após um subsequente quinto impulso com o novo morfina-toxóide do tétano imunogénio; A Figura 5, descreve um ensaio imunoenzimático ELISA competitivo utilizado para avaliar o potencial de cruzamento de reconhecimento dos anticorpos do soro anti-morfina/heroina por diferentes análogos estruturalmente relacionados com a morfina e a heroína, utilizados em terapia anti-viciante clássica contra estes dois compostos opiáceos, incluindo os metabolitos de biotransformação a partir destes dois medicamentos, bem como diferentes neuropeptídeos opiáceos endógenos implicados na regulação de diferentes bioactividades fisiológicas e neurais no SNC de mamíferos; 34
Figura 6 mostra o efeito imuno induzido pela vacinação activa com a morfina-toxóide do tétano imunogénio no rato, para embotar o comportamento de auto-administração intravenosa de heroina no mesmo animal e, finalmente; Figura 7 mostra o efeito imuno induzido por vacinação activa com a morfina-toxóide do tétano imunogénio no rato para embotar o comportamento de auto-administração intravenosa de morfina no mesmo animal;
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A literatura cientifica a que se refere o presente capitulo descreve em detalhe as informações disponíveis para os especialistas neste campo. A presente divulgação divulga e fornece um tratamento terapêutico para o vício em heroína e morfina. Esta terapia é baseada no princípio farmacológico que descreve a vacinação activa com uma nova formulação estrutural de uma proteína hapténica conjugada de transportador de droga contra estes dois opiáceos em indivíduos anteriormente viciados e subsequentemente desintoxicados. A composição química do conjugado terapêutico da presente invenção consiste em morfina, como droga hapténica e o toxóide do tétano como a proteína altamente imunogénica transportadora, sendo esta última uma transportadora de proteína altamente imunogénica licenciada usada em protocolos de vacinação humana. Esta forma altamente imunogénica de morfina conjugada é capaz de estimular a geração de títulos elevados e sustentados de soro de anticorpos titulados contra morfina haptenizada quando os indivíduos desintoxicados contra a dependência de opiáceos recebem esta formulação terapêutica. Assim, a utilização e aplicação de protocolos de imunização adequados activos, provoca a síntese e aumenta a geração de títulos elevados de anticorpos de soro de morfina que 35 reconhecem e se ligam com elevada especificidade e avidez à fracção "livre" não ligada do fármaco no plasma, após um subsequente re-exposição da droga. Este processo conduz eventualmente a uma neutralização significativa e / ou prevenção da permeação da barreira sangue-cérebro do fármaco opióide, diminuindo assim ou evitando de forma significativa as propriedades de reforço dos opiáceos no cérebro. Assim, a morfina e / ou a heroina, são neutralizados antes de atingirem o tecido do cérebro, e assim, o sujeito viciado desintoxicado não é recompensado com as propriedades farmacológicas de reforço das duas drogas, o que em última análise, representa o "sistema de condução farmacológico" subjacente pelo que estes dois opiáceos melhoram as suas actividades de drogas de reforço nas vias gratificantes cerebrais. 0 paradigma de uma imunização activa induzindo a actividade de neutralização destes opiáceos ocorre ao longo de um período de longa duração (isto é, de 3-6 meses) em pacientes vacinados tratados com a vacina bivalente contra a dependência da morfina, heroína, do presente invento. Isto é principalmente devido à actividade de longo prazo da resposta imune humoral para neutralizar esses medicamentos opiáceos no plasma, mediada através dos anticorpos séricos específicos levantados contra a droga haptenizada. Neste contexto, espera-se que a estabilidade a longo prazo estabelecida da resposta imunitária, mediada por meio da geração de títulos elevados de anticorpos anti-droga, hapténicos induzidos pela composição terapêutica da presente invenção, represente um mecanismo eficiente para manter a abstinência imunogénica prolongada e / ou prevenir recaídas no vício da morfina e da heroína em indivíduos previamente desintoxicadas. Além disso, a abordagem de vacinação terapêutica contra o vício de morfina / heroína da presente divulgação é compatível com outras terapias 36 actualmente utilizadas para manter a abstinência prolongada e / ou a prevenção de recaidas da dependência de opiáceos. Neste contexto, um grande número de agentes farmacológicos usados para esses fins terapêuticos, tais como metadona, buprenorfina, naloxona, naltrexona, compreendem, entre muitas outras drogas farmacológicas mencionadas, os compostos terapêuticos mais seleccionados utilizados em clinicas, que podem ser utilizados simultaneamente com a terapia de vacinação que se descreve na presente invenção.
EXEMPLOS 1. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA MOLECULAR DA FÓRMULA QUÍMICA COMERCIAL DA MORFINA USADA COMO HAPTENO PARA A PREPARAÇÃO DA VACINA BIVALENTE CONTRA 0 VÍCIO DA MORFINA E DA HEROINA. A fórmula quimica comercial (Sigma-Aldrich) , do sal de sulfato de morfina pentahidratado (MW 758,8, C34H40N2O10S) foi utilizada como composto de partida para a sintese da base de morfina (ver abaixo, alinea (a) , na secção que descreve " UM PROCESSO DE REAÇÃO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS INTERMÉDIOS USADOS PARA A SISTESE DA VACINA BIVALENTE CONTRA A DEPENDÊNCIA VÍCIO DE MORFINA E HEROÍNA ") e, em seguida, para a sintese do derivado intermediário morfina-6-hemissuccinato. Este último derivado intermédio foi subsequentemente haptenizado para os grupos amino epsilon livres a partir da cadeia lateral de resíduos de lisina expostos no toxóide do tétano, através da covalente sequencial de reticulação com os agentes hetero- bifuncionais reticulantes EDC e TFCS, respectivamente . 37 2,
Morfina 2. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA FORMULÇÃO ESTRUTURAL DO DERIVADO DE 3-O-CARBOXI-METIL-MORFINA INTERMÉDIA..
Este intermediário derivado da morfina foi sintetizado e utilizado por vários grupos de investigadores e também foi utilizado na presente invenção para a haptenização covalente de morfina para o toxóide de tétano, como uma vacina alternativa bivalente contra a dependência da morfina- heroina;
3-0-carboxi"metil-morfina 3. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA FORMULÇÃO ESTRUTURAL DOS DERIVADOS INTERMEDIÁRIOS MORFINA-6-HEMISSUCINAT0. 38
Este intermediário derivado de morfina teM sido sintetizado e utilizado por diversos grupos de pesquisadores e utilizado na presente invenção da vacina bivalente contra a dependência da morfina. heroina para o haptenizador covalente desta substância opiácea ao toxóide do tétano;
Morfina-6-Hemisuccinato 4. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA FORMULÇÃO ESTRUTURAL DA 3-O-CARBOXI-METIL-MORFINA E INTERMÉDIOS DERIVADOS DA MORFINA-6-HEMISSUCINATO COVALENTEMENTE CONDENSADO PARA 0 l-ETIL-3-(3-DIMETILAMIN0PR0PIL) CARBODIMIDA (EDC). 0 reagente quimico l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), tem sido utilizado por vários investigadores em reacções de haptenização covalentes do derivado intermediário 3-0-carboximetilmorfina transportadoras de proteínas tais como KLH e BSA. O EDC foi também utilizado para a haptenização covalente do intermediário de morfina-6-hemissuccinato derivado do produto intermediário complexo tétano toxóide, TFCS no presente invento de que a vacina bivalente contra a dependência da morfina- heroína (ver os esquemas de reacção de síntese química em exemplos 5 (de corrente alternada) e 7 (a e b) . 39
EDC-(3-0-carboximetilmorfina) EDC-(morfina-6-hemisuccinato) derivado intermédio derivado intermédio
SÍNTESE DA VACINA BIVALENTE CONTRA O VICIO DA MORFINA-HEROINA A sintese do conjugado imunogénico de morfina na presente invenção requer a modificação química inicial da molécula de morfina para gerar um derivado estrutural altamente reactivo deste opiáceo que fornece grupos carboxilo livres reactivos, utilizados para ligações cruzadas covalentes de dois reagentes heterobifuncionais utilizados para formar a estrutura química do braço do ligante espaçador que se ligam aos grupos epsilon amino da cadeia lateral de resíduos de lisina expostos no toxóide do tétano, da proteína transportadora utilizada na presente invenção (ver o exemplo 6) . Os procedimentos da química de acoplamento utilizada para modificar a estrutura e activar ambos os 3 e 6 grupos hidroxilo reactivos do anel fenantrenico da molécula da morfina, a fim de reticular os reagentes heterobifuncionais são muito scarced (Robert T. Morrison e Robert N. Boyd, Organic Chemistry, 7 Ed. de 2003), e apenas muito poucos métodos de síntese química usando esta abordagem têm sido relatados. Neste contexto, desde o início da década de 70, diversos grupos de investigação ( B. Wainer et al., Science 176: 1143-1145, 1972 ; B. Wainer et al., Science 178: 647. 1972 ; B. Wainer et al., J. 40
Immunol. 110(3):667-673, 1973 ; Wainer et al. , Nature, 241:537-538, 1973 and B. Hill et al., J. Immunol. 114:1363-1368, 1975 ) ; num relato não patenteada, uma metodologia baseada na química clássica, que se encontra hoje em dia em livros de química orgânica, utiliza o anidrido succínico como reagente para modificar o grupo reactivo 6-hidroxilo da estrutura do anel da molécula de morfina fenantrenica. Esta morfina primária intermédia, referida como a morfina-6-hemissuccinato (ver exemplo 3, e a estrutura (b) do Exemplo 5) difere da morfina no seu ácido carboxílico livre altamente reactivo do grupo succinil-éster (anteriormente ligado à molécula de morfina) que pode ser ligado de forma covalente (ver a estrutura (a) do Exemplo 5) aos reagentes homobifuncionais de ligações cruzadas, tais como o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) (ver exemplo 3, e a estrutura (c) no Exemplo 5) . Este reagente tem sido amplamente utilizado em reacções químicas covalentes de ligação cruzada covalente para a condensação de grupos amino e carboxilo funcionais livres das moléculas doadoras ( S. Hockfield et al., Molecular Probes of the Nervous System: Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes, Vol. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Cork, 1993 ).
Tal como a morfina não é uma molécula imunogénica por si só, a produção de respostas imunitárias humorais com títulos elevados de anticorpos específicos contra as moléculas de baixa complexidade estrutural relativa como este opiáceo representa um desafio metodológico grave. Na presente descrição, a estrutura do conjugado de morfina foi inicialmente concebido e seguido pela sintese de morfina-6-hemissuccinato derivado intermediário (estrutura (b) no Exemplo 5) , que por sua vez foi haptenizado covalentemente aos resíduos de lisina no toxóide do tétano, utilizada como 41 proteína transportadora, por meio da síntese sequencial de um braço espaçador-ligante, estruturalmente formada pela condensação química da l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (referido como o composto de EDC comercial, ver o exemplo 5) e a N- (-trifluoracetilcaproiloxi)-éster-succinimida (referido como o TFCS compostos comerciais, ver o exemplo 6) .Este procedimento, com base na condensação covalente de morfina haptenizeda para toxóide do tétano através deste braço espaçador longo de ligação, formada pela condensação covalente de EDC e Reagentes TFCS, permite a preservação estrutural da molécula da morfina, uma vez haptenizada com o toxóide do tétano. Neste contexto estrutural, espera-se que a morfina permaneça fixada à proteína transportadora, de tal forma que pode manter a sua configuração estérica inicial. Isto, em princípio, poderia facilitar que outros domínios livres e / ou grupos reactivos no interior da molécula da morfina, outros do que os domínios activos da droga opióide contribuindo para a haptenização covalente com a proteína transportadora, pssa ser exposto e contribua como o antigénico predominante domínios ou determinantes antigénicos na molécula nativa de drogas reconhecida pela resposta imunológica humoral. Além disso, a natureza química da estrutura hidrocarbonatada do braço espaçador-ligante (ver exemplo 6) , confere a esta cadeia de carbono uma estrutura completa inerte a qualquer reactividade química, e assim, uma muito baixa imunogenicidade per si. Estas propriedades estruturais e funcionais conferidas pelo contibuto do braço de ligação hidrocarbonatado poderia contribuir para o papel epitogénico imunopredominante de morfina na formulação estrutural da presente invenção da vacina bivalente contra a dependência da morfina - heroína. Assim, as capacidades acima propostos, as vantagens funcionais e estruturais da presente invenção são suportados pelos resultados 42 experimentais que mostram a sua elevada eficácia para produzir uma forte resposta imune humoral (ver figuras 1 e 2) , com os titulos de anticorpos séricos específicos elevados e sustentados (veja as figuras 3 e 4) que cruzam reconhecem com especificidade equivalente a morfina não haptenizeda, incluindo os análogos estruturais de opiáceos, heroína e os metabolitos endógenos de opiáceos, tais como a 6-monoacetilmorfina e seu activo (aditivo) por produtos glucuronido (por exemplo morfina 3-6-glucuronidos) (ver figura 5). A explicação mais plausível para a especificidade desta resposta imune humoral desencadeada pelo nosso modelo da nova vacina contra estes compostos opiáceos baseia-se na apresentação antigénica de diferentes domínios estruturais da morfina para o sistema imunitário. Isto parece ser devido ao comprimento estrutural do braço espaçador ligante que separa a morfina do toxóide do tétano, de tal forma que permite que o sistema imunitário reaja contra os determinantes antigênicos específicos da estrutura da morfina fenantrenica partilhada por outros análogos estruturais e opiáceos e os seus metabolitos endógenos (isto é, assim, de heroína e de morfina-3-6-glucuronídeos).
5. PROCEDIMENTOS E REACÇÕES UTILIZADOS PARA A PREPARAÇÃO DO DERIVADO INTERMEDIÁRIO DE MORFINA NECESSÁRIA PARA A SÍNTESE DA VACINA BIVALENTE CONTRA A DEPENDÊNCIA D MORFINA- HEROÍNA a) a preparação inicial de uma base de morfina a partir do sal de sulfato de morfina pentahidratado (uma formulação química disponível comercialmente de morfina) base de Morfina (estrutura (a) do exemplo 5) , foi sintetizado a partir do sal de sulfato comercial desta substância de opiáceos (Sigma-Aldrich), de acordo com um processo químico clássico relatado em 1972 por E. J. Simon ( E. J. Simon et 43 al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69: 1835-1837, 1972 ) .
Esta reacção foi realizada como se segue: 64 mg de sulfato de morfina / ml, foram dissolvidos em água destilada, à temperatura ambiente, sob agitação constante. 0 pH desta solução foi ajustado para 8,0 com NH40H. A base de morfina foi posteriormente cristalizada através de precipitação a pH 8, filtrou-se e secou-se por evaporação a 60 0 . C sob condições de vácuo. b) Preparação do intermediário de morfina-6-hemissuccinato derivado (M-6-H). O composto M-6-H foi preparado a partir de base de morfina, de acordo com o seguinte protocolo e sujeito a modificações de procedimentos padrão pioneiras descritas nos anos 70 por B. Wainer et al., Science, 176-1143-1145, 1972 ; B. H. Wainer et al. , Science, 178:647, 1972 , B. Wainer et al., J. Immunol. 110 (3) :667-673, 1973 ; Wainer et al. , Nature, 241:537-538,1973 and B. Hill et al., J. Immunol. 114:1363-1368, 1975. O procedimento da reacção quimica foi realizada como se segue, por cada grama de derivados de morfina, 2 gramas de anidrido succinico (Sigma-Aldrich) foram adicionados à mistura de reacção, seguido por incubação com 20 ml de piridina ou benzeno anidro, sob refluxo continuo num frasco de vidro.Depois de aquecer a mistura de reacção durante 6 horas à temperatura de refluxo (70 - 80 °. C) , a mistura de reacção foi arrefecida lentamente até à temperatura ambiente e o excesso de piridina ou o benzeno foi decantado. O resto destes últimos componentes orgânicos foi evaporado utilizando um fluxo continuo de azoto sob pressão reduzida, produzindo um resíduo de produto seco representado por M-6-H. Este produto foi exposto a 10 períodos de lavagem com etanol 60% em água destilada para se alcançar a recristalização do resíduo de M-6-H (exemplo 5 (b) ) . A percentagem de rendimento do produto foi quantificada por 44 um método analítico padrão, usando análise de cromatografia em camada fina (TLC, as iniciais da nomenclatura convencional abreviada deste procedimento) (B. Wainer et ai., Ciência 176:1143-1145, 1972) . Este método foi abordado do seguinte modo, 100 g do resíduo sintético de M-6-P e de uma quantidade equivalente de base de morfina (composto de controlo usado como referência) foram dissolvidos no sistema solvente de acetato de etilo: metanol: hidróxido de amónio (85:10 : 5, v: v: v) , seguido por amostragem de 1 1 / linha, secou-se à temperatura ambiente e foi feita a deposição na matriz de cromatografia em camada fina de sílica com o sistema de solvente acima mencionado. Depois os compostos foram cromatograficamente geridos, a camada fina de sílica foi exposto ao estímulo da lâmpada de UV a 285 nm (comprimento de onda é este normalmente usado para excitar o cromóforo representado pelo anel fenólico da estrutura fenantrenica na morfina livre e de M-6- H, respectivamente) . Neste contexto, o perfil TLC do resíduo sintético de M-6-H exibiu um coeficiente de mobilidade relativa (RF, a abreviatura convencional da sua sigla em inglês [factor de retenção]) de cerca de 0,1-0,15, enquanto que morfina de base livre exibiu um maior Rf de cerca de 0,3-0,4. O rendimento médio do produto de M-6-H em uma reacção de síntese padrão foi sempre cerca de 95% ou mais. c) Preparação do derivado intermediário de EDC-morfina-6-hemissucinato -. Para atingir o haptenização covalente de M-6-H com a proteína transportadora, o derivado intermediário de M-6-H foi conjugado covalentemente através do grupo carboxilo succinil-livre para o reagente de reticulação covalente homobifuncional, EDC (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (Pierce) (ver figura (c) do Exemplo 5) , de acordo com o protocolo padrão descrito pelo fabricante (Pierce). Durante esta reacção de 45 condensação, o excesso de EDC que não reagiu com o grupo succinil-carboxilico é rapidamente hidrolisado para um composto derivado intermediário não-reactivo, devido à alta instabilidade do reagente quando colocado numa solução aquosa. Assim, uma reacção de acoplamento padrão consistiu em misturar 100 mg de EDC, para cada 100 mg de M-6-H dissolvido em 100 ml de H20 destilada, a pH 5,5, ajustado com uma solução de HC1 IN. A mistura de reacção é então incubada a 37 graus. C durante 2 horas, sob agitação constante. Sob estas condições, um rendimento de aproximadamente 98% de EDC-(M-6-H), o produto obtido está regularmente sob estas condições de acoplamento. Esta estimativa foi obtida pela titulação dos grupos carboxilicos livres de amostras equivalentes de ambos os produtos de M-6-H, utilizado como controlo, e o produto EDC-(M-6-H) com uma solução de NaOH IN, a um procedimento bioquímico padrão normalmente utilizado para verificar a presença de grupos carboxilicos livres em valores de pK de cerca de 4,2. Este procedimento de reacção gera rendimentos óptimos do produto sintético EDC-(M-6-H), que é geralmente instável em soluções aquosas e, portanto, necessita de ser feita reagir rapidamente com grupos amino a partir do toxóide do derivado intermediário de tétano - TFCS, cuja sintese é divulgada na presente invenção, da vacina bivalente contra a dependência da morfina- heroína, e serve como a proteína transportadora de mesma invenção. 46 i gdtóeq i* t8 \ ^^./4 . i - .... .· . >* i Anidfido succmtco
Pirldina etí ienzicno de ÉBdina em vácuo
EDC H+ O) H0->
EDC - (Morfina-6-hemisuccinato) derivado intermédio
6. PROCESSO DE REACÇÃO USADO PARA PREPARAÇÃO DO DERIVADO TOXÓIDE-INTERMÉDIOS DO TÉTANO UTILIZADOS COMO PROTEÍNA TRANSPORTADORA (CP) COVALENTE CONDENSADO COM O ÉSTER N-(-TRIFLUOROACETILCAPROILOXI)-SUCCINIMIDA (CPT): CP-TFCS COMPLEXA. A preparação de toxóide do tétano utilizada como proteína transportadora (CP) na presente invenção, da vacina 47 bivalente contra a dependência da morfina - heroina, tinha certificado grau de pureza (98%), e uma ausência total de toxicidade. Esta preparação de proteína é formada pela subunidade H-polipeptídeo, o qual contém cerca de 858 resíduos de aminoácidos, com uma massa molecular de cerca de 100 kDa. Esta subunidade de proteína obtida por meio de técnicas padrão de recombinação de DNA, é codificada pelo gene de Clostridium tetani que produz a toxina bacteriana nativa do tétano e contém apenas 68 cópias de resíduos de lisina ao longo da sua sequência de aminoácidos primários da proteína toxóide de H-polipéptido, ao passo que a toxina do tétano nativa é constituída por 1313 aminoácidos da proteína, tornando elevada a sua massa molecular de 150.700 dalton (150,7 kD. Para atingir a síntese do toxóide do tétano-TFCS intermediário reactivo, os locais de resíduos amino de lisina expostos nesta proteína são covalentemente conjugados para o éster de N-(-trifluoroacetilcaproiloxi)-succinimida (TFCS, Pierce) (ver figuras (a), (b), y (c) no Exemplo 6) . O TFCS é umreagente de reticulação covalente heterobifuncional usado para conjugar a pH 7 - 7,5, os grupos amino livres da cadeia lateral de resíduos de lisina expostos a partir de proteínas de elevado peso molecular, por meio de seu sítio activo N-hidroxi--éster. Assim, esta reacção melhora a síntese do toxóide do tétano-TFCS intermediário derivado através da formação de ligações amida estáveis. O procedimento da reacção usado para sintetizar o toxóide do tétano-TFCS conjugado como um passo intermediário necessário para a síntese da vacina bivalente da presente invenção contra a dependência da morfina, heroína, é descrita na figura (b) no exemplo 6. Os procedimentos de acoplamento e as condições experimentais utilizadas para a realização de uma síntese típica deste complexo transportador de proteína TFCS consistiu na preparação inicial de 40 mg / ml de uma solução de estoque 48 TFCS (134 mM) (preparado de fresco e sempre imediatamente antes da utilização) dissolvida numa solução contendo 10 -20% DMSO / 90 - 80% H20 desionizada (v: v).0 reagente TFCS é imediatamente misturado com a proteína do toxóide do tétano, numa proporção de excesso molar de TFCS de 10 - 20 vezes em relação à própria toxóide. Assim, por exemplo, uma reacção típica consiste na mistura de 100 mg (0,5 mM) de toxóide do tétano em 4 ml de uma solução contendo solução tamponada com fosfato (PBS = 0,1 M de NaCl PB/0.15 mM, pH 7,2) com 50 litros da solução de armazenamento TFCS (a concentração final de DMSO e TFCS alcançado na mistura de solução de toxóide do tétano-TFCS é de 6,7 mM e 0,5-1%, respectivamente).Notável é o facto de que a concentração inicial de DMSO, durante a reacção de condensação covalente entre a proteína transportadora e o reagente TFCS 1:10-20 deverá chegar a uma diluição final (v: v), a fim de impedir a formação de precipitados de proteína na mistura. A reacção de condensação ocorrendo entre o toxóide do tétano e TFCS deve ter lugar à temperatura ambiente durante 60-90 minutos, de modo a alcançar a síntese total do produto de toxóide do tétano-TFCS. Este produto derivado intermediário ainda preserva um grupo amino reactivo quimicamente protegido por um grupo trifluoroacetilo (veja a figura (b) no Exemplo 6), o qual é subsequentemente hidrolisado depois de expor o produto a um período de incubação adicional de 2-3 horas à temperatura ambiente numa solução PBS, com pH 8-8,5. O pH desta último solução de fosfato tamponada ddeve ser ajustada com uma solução de NaOH 10 N. Sob estas condições experimentais, os grupos amino livres reactivos no composto TFCS conjugado são geradas no local final desprotegido do complexo TFCS-toxóide do tétano (veja a figura (b) no Exemplo 6) . Este toxóide do tétano-TFCS produto derivado intermediário final é subsequentemente exposto a processos de purificação, utilizando protocolos 49 padrão de diálise. Resumidamente este método consiste em incubar o toxóide do tétano, conjugado de TFCS, colocado dentro de uma membrana de 10 kDa de corte de diálise (Sigma-Aldrich)] contra três mudanças de{ 6 litros de solução de tampão fosfato 0,1 M, } pH 7,2, a 4 graus.C a cada 8 horas durante um periodo de 24 horas.
Proteína transportadora
OH
0.1M Na2P04 0.15 NaCi pH 7.2 Síntese de CP com braço de ligação de espaçador
Remoção do grupo trifíuoroacético Incubação a pH 8.1 Tampão fosfato 0.1 M
♦
F
Subproduto 50
7. DERIVATIVOS INTERMEDIÁRIO DE TOXÓIDE DO TÉTANO-TFCS: SÍNTESE DA FORMULAÇÃO FINAL ESTRUTURAL DA VACINA BIVALENTE CONTRA A DEPENDÊNCIA DE MORFINA HEROÍNA A condensação covalente do produto intermédio de morfina, o EDC-(M-6-H) para o complexo TFCS-toxóide do tétano (ver a figura (a) do exemplo 7) é conseguida por meio de uma ligação covalente de amida estável, formada depois da reacção entre os grupos carboxilo livres expostos na extremidade da CED-(M-6-H) conjugada e os grupos amino livres desprotegidos do reagente TFCS ligados ao toxóide do tétano (o complexo TFCS-toxóide do tétano molecular, ver figura (b) no Exemplo 7).
Devido a que os procedimentos de síntese e a purificação completa do derivado de toxóide do tétano-TFCS requer um período de no máximo 24 horas, a síntese da EDC-(M-6-H) conjugado deve ser realizado imediatamente após a conclusão dos passos de reacção de purificação do toxóide do tétano-TFCS conjugado. Isto é principalmente devido ao fato de que o produto EDC-(M-6-H) ser muito instável e hidrolisar facilmente quando exposta ao armazenamento prolongado (isto é, mais de duas horas), mesmo a temperaturas inferiores a 10 graus C. Outras questões importantes que requerem uma atenção considerável para a optimização da condensação covalente entre o EDC-(M-6-H)-conjugado e o produto toxóide do tétano-TFCS, referem-se a concentração dos reagentes adicionados na reacção química . O toxóide do tétano utilizado como proteína transportadora, exibe um peso molecular de cerca de 100 kDa, que contém um número aproximado de 68 resíduos de lisina. Os grupos amino-expostos (locais activos) na cadeia lateral destes resíduos de aminoácidos, permite a condensação covalente do TFCS durante a síntese da presente invenção de vacina bivalente 51 contra a morfina - heroína. Neste contexto, cada mole de toxóide do tétano (100 mg), contêm uma densidade aproximada de até 0,07 mol de locais activos disponíveis (os grupos amino livres não protegidos), que podem ser ligados de forma covalente com o reagente TFCS. Além disso, a reacção de condensação entre o derivado intermediário de EDC-(M-6-H) e o toxóide do tétano, conjugado utiliza um TFCS mol estequiométrica: proporção molar de 100 mole do EDC-(M-6-H) para cada 0,07 mole dos grupos amino do toxóide do tétano-TFCS conjugado.
Numa formulação típica da condensação covalente entre o derivado de EDC-(M-6-H) intermediário e o toxóide-TFCS do tétan conjugado, a concentração dos reagentes e as condições de reacção requerem a mistura de 100 mg de toxóide-TFCS do tétano complexo (1 mole do tétanol toxóide-TFCS = 0,07 mole de grupos amino livres / locais activos) mais 30 mg de EDC-(M-6-H), derivado de intermediário (70 moles de locais activos para condensação covalente), dissolvido em 100 ml de solução M de tampão de NaCl 0,1 fosfate/0.15, ajustando o pH para 7-7,5 (sendo a massa molecular calculada do composto do último EDC-(M-6-H) de até 426,37 daltons). A mistura de reacção é incubada à temperatura ambiente durante 2-3 horas, sob agitação constante. O produto sintético obtido, a morfina-6-hemisuccinil-toxóide do tétano, é então purificado através de procedimentos convencionais, utilizando diálise 10 kDa membranas recortadas de diálise (Sigma-Aldrich) contra seis mudanças de }6 litros de solução de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2, a 4 ° C, durante um período de 48 horas, a fim de eliminar os subprodutos formados durante a reacção, tais como a ureia e o não-haptenizado EDC-(M-6-H) derivado intermediário. 52
Uma vez que a purificação da morfina-6-hemisuccinil-toxóide do tétano tenha sido completada, a solução dializada é subsequentemente esterilizada por filtração em filtros de 0,45 m de diâmetro dos poros da membrana (Gelman Sei) sob pressão positiva. Finalmente, alíquotas de 1 ml da solução filtrada se congelado a seco, liofilizado em frascos de vidro estéreis, selados sob vácuo e conservados sob armazenamento a 4 graus C. Vários agentes normalmente utilizados para estabilizar e prevenir a degradação durante os procedimentos de conjugados seca - congelamento e armazenagem( E. Harlow and D. Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1988 ) pode ser adicionado a uma formulação terapêutica do presente invento da vacina bivalente contra a dependência da morfina - heroina. Exemplos de agentes de selecção, são constituídas por gelatina, peptona, dextrina, metil-celulose, sacarose, lactose, maltose, glicose, frutose, sorbitol, glicerol, manitol, inositol, ácido cítrico, ácido tartárico, o polietilenoglicol, polivinilpirrolidona, entre muitos outros. Cada frasco de produto da vacina bivalente contra a dependência da morfina - heroína contém uma dose média de cerca de 1 mg de produto seco congelado de toxóide diftérico utilizada como "unidade de dose de referência". A concentração de proteína de cada unidade de dose da vacina bivalente foi determinada por um método de quantificação de proteína padrão através de um kit de reacção de ácido bicinconínico, de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante (Pierce Chemical). A medição quantitativa da percentagem de incorporação do derivado intermediário de EDC-(M-ô-H) condensado covalentemente com os grupos amino livres do complexo toxóide-TFCS do tétano foi levada a cabo por processos de titulação padrão, utilizando-se o reagente de o-ftaldeído para titulação o número de grupos amino livres do TFCS-toxóide do tétano derivado intermediário ( 53 J. Cashman et al, J. Pharmacol. Exper. Ther. 293: 952-961, 2000 ). Percentagem de rendimento de até 75-85% da conjugação de hapteno (morfina) com a proteina transportadora (toxóide do tétano) são normalmente obtidos na presente formulação da vacina bivalente contra a dependência da morfina-heroina. O produto final obtido pode ser utilizado em seguida, em experiências de imunização activa contra a morfina-heroína e / ou utilizados como antigénios de fase sólida adsorvida em ensaios imunológicos (por exemplo, ELISA).
Na presente descrição, um conjugado de morfina-6-hemosuccinil-BSA foi sintetizado em paralelo com a presente invenção da vacina bivalente contra a dependência da morfina- heroína, utilizando protocolos de síntese semelhantes, para esta última vacina. A razão para sintetizar este conjugado de morfina adicional, foi para usá-lo como um antigénio adsorvido da morfina para a fase sólida dos nossos ensaios imunoenzimáticos de captação de anticorpos de ELISA. Estes últimos ensaios foram usados para identificar, monitorizar guantificar (figuras 1, 2, 3 y 4) e validar a especificidade (figura 5) da resposta imune humoral induzida por vacinação activa com a formulação terapêutica do presente vacina bivalente contra o vicio de morfina-heroina. 54
+
f Oiálise de purificação de vacina durante 48 horas a 4° C com ^ subsistuição de tampão de fosfato ^ ,0.1 M pH 7.4 cada 8 horas
Subproduto (Ureia)
8. ESTRUTURA MOLECULAR DA VACINA BIVALENTE CONTRA A DEPENDÊNCIA DE MORFINA-HEROÍNA A fórmula estrutural da presente invenção da vacina bivalente contra a dependência da morfina -heroina mostra pela primeira vez que a utilização do reagente quimico, TFCS, utilizado para a sintese de um braço espaçador-ligante para haptenizar a morfina e / ou heroina ao toxóide do tétano.
Um tamanho molecular total de até 20,15 Â é calculado para o braço espaçador-ligante que separa a morfina haptenizeda covalentemente ligada através do átomo de carbono 6, na sua 55 estrutura de anel fenantrénico. 0 tamanho deste braço espaçador ligante é significativamente mais longo (veja figura do exemplo 8) dos utilizados para sintetizar imunogénios de morfina relatados anteriormente. Este último imunogénio utilizou o reagente EDC como agente de ligação cruzada homobifuncional de ligação covalente do 3-0-carboximetilmorfina e / ou M-6-H para grupos -amino de resíduos de lisina expostos em ambas as moléculas de BSA ou KLH, utilizados como proteínas transportadoras de referência.Por exemplo, o conjugado imunogénico de morfina-6-hemisuccinil-BSA ou a morfina-6-hemisuccinil-KLH possui um tamanho de braço espaçador - ligante de cerca de 12,4 Â, porque lhes falta a extensão 6 do átomo de carbono produzido pela cadeia hidrocarbonatada do reagente TFCS.. A adição da cadeia hidrocarbonatada o TFCS na nossa formulação de vacina aumenta o comprimento do braço de ligação total de espaçador de cerca de 7,74 Á, (ver figura do exemplo 8). Como mencionado acima, esta inovação estrutural do aumento do comprimento do braço espaçador -ligante no nosso novo modelo de vacina anti-morfina-heroína revelado no presente invento apresenta capacidades funcionais importantes. Estas são demonstradas pelos seguintes resultados experimentais: a) alta imunogenicidade gerada contra morfina e / ou de heroína haptenizada, e b) uma capacidade superior desencadeia uma resposta imune humoral robusta com títulos elevados e sustentados de anticorpos específicos anti-soro de morfina (figuras 1, 2, 3, e 4) que exibem reconhecimento cruzado equivalente a este opiáceo e aos seu análogos estrutural, a heroína (figura 5). Além disso, é possível levantar a hipótese de que o aumento do comprimento deste novo braço espaçador -ligante introduzido na fórmula estrutural do nosso modelo de vacina bivalente contra a dependência da morfina, heroína, ofereça vantagens estruturais e funcionais com 56 base na resposta imune humoral produzida por este imunogénio, em que os anticorpos dos soros reconhecem de modo cruzado com especificidade equivalente epítopos imunogénicos expostos pela molécula de morfina haptenizada para o sistema imunitário dos animais vacinados que são partilhadas por heroína e seus metabolitos endógenos 3-monoacetil-morfina e as 3 - e 6-morfina glucuronideos (figura 5). Além disso, a vacinação activa com o nosso novo imunogénio bivalente de morfina heroína, divulgada no presente invento, pode ser utilizada como um procedimento terapêutico eficaz para induzir uma forte resposta imune humoral capaz de imunoproteger contra a aquisição de comportamentos de dependência a estes dois compostos em opiáceos o hospedeiro activamente vacinado. Finalmente, esta resposta imunitária humoral induzida por vacinação activa no hospedeiro, pode oferecer uma imunoprotecção contra a actividade endógena de metabolitos endógenos acima mencionados tanto da morfina como da heroína, mostrado exibir propriedades de reforço viciantes em indivíduos abstinentes desintoxicados e relativamente à sua dependência em relação a estes compostos opiáceos (figuras 6 e 7) .
Em resumo, o braço espaçador - ligante apresenta um tamanho molecular de 20,15 Â, em que o segmento central corresponde a 7,74 Â da estrutura de hidrocarboneto introduzida pelo reagente TFCS, que foi conjugada covalentemente com grupos -amino de resíduos de lisina expostos no toxóide do tétano, o segmento de extremidade de 7,44 Á que compreende um átomo de carbono e os próximos quatro átomos de carbono da cadeia lateral de resíduos de lisina e a um segmento de condensado 4,97 Á de hemisuccinil compreendem o resíduo, o qual foi ligado de forma covalente através de um grupo éster ao 57 átomo de carbono 6 da estrutura do anel fenantrenico da molécula da morfina, como mostrado na seguinte fórmula:
Para além da fórmula sintética, a fórmula estrutural, os procedimentos de purificação, e as utilizações terapêuticas da invenção divulgada da vacina bivalente contra a dependência da morfina, heroina, são também revelados procedimentos de sintese e purificação complementares de outra formulação estrutural desta vacina bivalente contra a dependência de morfina-heroina. Esta fórmula estrutural adicional de uma vacina anti morfina e heroina consiste na sintese alternativa de um produto derivado de EDC-3-0-carboximetilmorfina, utilizando os mesmos protocolos e procedimentos sintéticos anteriormente descritos na literatura (S.Spector e C. W. Parker, Science 168 : 1347, 1970; S. J. Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther, 178 : 253, 1971; H. Van Vunakis et al, J. Pharmacol.. Exp. Ther, 180 : 514, 1972 e S . Gross et al., Immunochemistry 11 : 453 - 456, 1974). Este derivado de EDC-3-O-carboximetilmorfina também foi covalentemente ligado ao toxóide do tétano-TFCS conjugado de acordo com os procedimentos sintéticos utilizados para sintetizar a fórmula estrutural da vacina anti morfina-heroina bivalente da presente invenção, utilizando o seguinte procedimento sintético : 58
3^^1
Mv. | 16-J-ie-NCH, MO· Síntese de vacina anti- EDC-(3-0-Carboximetilmorfina) intermédio morfina/heroina 2 h à temperatura ambiente com tampção de fosfato 0,1 M pH 7,2-7.4 SXRk
Subproduto (Ureia) b)
Diálise de purificação de vacina durante 48 horas a 4°C com substituição de tampão de fosfato 0.1 M pH 7.4 cada 8 horas [0052] Este modelo alternativo da vacina anti-morfina, heroína bivalente apresenta uma estrutura de braço espaçador - vinculador diferente, com um tamanho molecular total de 16,47 Â, onde um segmento do lado direito de 9.03 Á compõe a estrutura de hidrocarboneto introduzida pelo reagente TFCS, ligada através de uma ligação covalente de amida ao resíduo EDC-3-0-carboximetil na estrutura do anel fenantrenico da molécula de morfina. 0 segmento do lado esguerdo de 7,44 Â compreende o átomo de carbono e os guatro átomos de carbono da cadeia lateral de resíduos de lisina do toxóide do tétano, que foram ligados 59 covalentemente através do grupo amino ao lado esquerdo do segmento final de reagente TFCS, tal como ilustrado na seguinte fórmula:
UM? Â
ADJUVANTES
Apesar de elevada massa molecular e a multiplicidade dos epítopos imunogénicos indicados pelos imunoconjugados contendo haptenos ligados covalentemente de baixa complexidade estrutural, como mostrado pelo nosso modelo da nova vacina contra o vicio da morfina e heroina, a sua administração num paciente requer o suplemento de compostos adjuvantes, conhecidos para a força da resposta imunitária inicial (E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp 96-97, 1988) . Neste contexto, os adjuvantes têm a capacidade de induzir uma resposta imune humoral e / ou celular potente para grandes tipos de antigénios, que inclui, hidratos de carbono, péptidos e proteínas. Assim, várias formulações químicas de adjuvantes têm sido utilizados e validados em protocolos de vacinação activos em espécies animais, que incluem formulações disponíveis comercialmente, tais como emulsões de óleo-água, que podem ou não podem conter 60
Mycobacterium tuberculosum inactivada por exposição ao calor (Sigma-Aldrich), RIBI (RIBI Immunochem Research, Inc.), para além de outras formulações contendo polímeros biodegradáveis e lipossomas (ver revisão em Kohn, J. et ai. J. Immunol. Methods, vol. 95, pp 31-38, 1986).
Após extensas décadas de pesquisa experimental, os poucos adjuvantes autorizados e aprovados usados para vacinação humanos contêm formulações compostas de hidróxido de alumínio. A preparação de uma composição farmacêutica ou formulação terapêutica que inclui a "vacina bivalente contra o vício de morfina e heroína" na presente invenção pode ser realizada utilizando técnicas convencionais tratadas por especialistas da área, em conjunto com qualquer um dos veículos aceitáveis, agentes auxiliares e / ou farmacêuticas excipientes descritos na especialidade da técnica, incluindo, diferentes substâncias adjuvantes. Uma formulação de doseamento típico da vacina bivalente contra a dependência da morfina - heroína e adjuvante usado para os protocolos de vacinação activos em ambos os animais e os seres humanos, consiste na preparação de uma relação de mistura de 1:2 (v: v) de vacina bivalente: hidróxido de alumínio por mistura de 1 ml de vacina ressuspensa em H20 desionizada estéril; com 2 ml de uma solução de estoque de 45 mg / ml de hidróxido de alumínio (Imject Alum-R-, Pierce) adicionada por gotejamento lento (em não menos do que 3 minutos) . A mistura dos reagentes são incubados sob agitação lenta e constante durante 1-2 horas à temperatura ambiente. A concentração final do hidróxido de alumínio não deve exceder 1,12-2,25 mg/100 1 na reacção, durante o processo de mistura com a vacina bivalente contra a dependência da morfina - heroína. Depois a mistura ter sido completamente agitada, a formulação da vacina / hidróxido de alumínio adjuvante bivalentente antii-morfina-heroína 61 deve ser carregado em seringas de plástico esterilizadas, utilizando a via parentérica (isto é, subcutânea, intramuscular e intraperitoneal), como as vias de administração preferenciais para introduzir a formulação de vacina no hospedeiro, com a excepção da via intravenosa.
Outros adjuvantes imunogénicos disponíveis, que podem ser combinadas e administrados com a presente invenção da vacina bivalente contra a dependência da morfina, heroina inclui um grande grupo de compostos, tal como fosfato de aluminio, interferões, interleucinas, os ésteres de ácido poliláctico, copolimeros biodegradáveis consistindo em ésteres de ácido poliglicólico, lipossomas, membranas bacterianas, lipopolissacarideos, muropeptideos bacterianos e RIBI. Estas formulações e / ou composições adoptam as formas farmacêuticas de soluções injectaveis , suspensões, pós e compostos similares.
Imunização activa A via intramuscular é a via parentérica de preferência por meio da qual o presente invento da vacina bivalente anti-morfina-heroína misturado com adjuvante de hidróxido de aluminio devem ser administrados a indivíduos, embora, outras vias parentéricas, tais como subcutânea e intraperitoneal, possam ser usadas para os protocolos de vacinação. A presente invenção de vacina bivalente contra a dependência da morfina - heroína, ou a composição farmacêutica ou formulação terapêutica contendo esta preparação de vacina imunogénica, deve ser administrado com uma dose terapeuticamente eficaz e estabelecido um protocolo de administração da dose / regime apenas somente em abstinentes e desintoxicados do seu comportamento viciante anterior em morfina e / ou heroína Este protocolo 62 deve sempre ser ajustado de acordo com o grau de ambas as queixas e a dependência do indivíduo. Uma programação de imunização activa típica usa a via intramuscular para inocular esta formulação de vacina numa unidade de dose do conjugado de droga proteína e de transportador hapténico de até 1-2 mg / kg de peso corporal do indivíduo (isto é, os ratos machos de 250-350 mg de peso, Wistar ou Sprague-Dawley). Esta inoculação escorva deverá ser subsequentemente seguido por 3-6 períodos de reforço, administrados em intervalos de 14 dias, através da administração da mesma dose unitária da presente formulação de vacina durante a nova inoculação. A imunização activa nos indivíduos de controlo é realizado apenas com o adjuvante (hidróxido de alumínio) ou com adjuvante mais proteína transportadora (hidróxido de alumínio + toxóide do tétano). 0 soro obtido a partir de indivíduos vacinados devem ser amostrados 10-12 dias após cada reforço utilizando protocolos e procedimentos padrão previamente relatados (E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, 1988) para monitorizar a resposta imune humoral contra a morfina e a heroína, incluindo os seus metabolitos endógenos. Para conseguir estas condições experimentais, os diferentes animais vacinados experimentalmente foram sangrados (100 1 / animal) e as fracções de soro foram obtidas após as amostras de sangue recolhidas terem sido submetidas a coagulação durante 24 horas a 4 ° C, seguido por centrifugação da fracção de coágulo / sobrenadante a 14.000 x g. As fracções de soro obtidas foram imediatamente congeladas a 20 ° C até a sua utilização
Os ensaios de anticorpos de captura de ensaios imunoenzimáticos de ELISA foram utilizados para identificar e monitorizar a resposta imunológica humoral contra ambas 63 as substâncias opiáceas, após cada reforço, de acordo com o processo de imunização activa acima descrito. Estes resultados permitiram confirmar a eficácia da nossa nova vacina anti-morfina-heroina para induzir uma resposta imune humoral robusta contra estes compostos opióides. Além disso, estes resultados levaram à identificação do número de reforços necessárias para induzir uma resposta humoral com os niveis máximos e estável de anticorpos séricos contra estas substâncias opiáceas. No seu conjunto, estes dados experimentais foram utilizados para seleccionar e definir candidatos animais hiper-imunes que foram subsequentemente expostos ao protocolo de imunoprotecção contra essas substâncias opiáceas, utilizando o modelo comportamental de ratos do paradiqma de auto-administração intravenosa de opiáceos viciante (ver abaixo as fiquras 6 e 7) .
Um procedimento típico de ensaio imunoenzimático de ELISA de captação de anticorpos utilizado para monitorar a resposta imune humoral contra a morfina e a heroína a partir do soro de indivíduos vacinados activamente com a formulação de vacina antimorfina-heroína terapêutica que consiste na síntese inicial da fase sólida do ensaio aumentando a adsorção de 3 - 4 g de preparação antigénica de morfina-6-hemisuccinil-BSA / poço em placas de 96 poços (Inmunolon I, Corning) os anticorpos capturados de antimorf ina/anti-heroína pela fracção antigénica absorvida para a fase sólida é levada a cabo depois de um período de incubação de 6 h à temperatura ambiente de aliquotas (50 1 / poço) contendo diluição progressiva em série de anticorpos obtidos a partir de animais imunizados (ou seja, 1:10, 1:100, 1:1 000, 1:10 000 e 1:1 000 000). Posteriormente, os poços são lavados extensivamente com uma solução contendo 1% BSA/0.3 Tween-20/PBS%, pH 7,4, seguido 64 de 2-3 horas de período de incubação à temperatura ambiente, com um derivado de anticorpo rato de anti-IgG (H + L) (Vector Laboratories) conjugado com peroxidase de rábano. Após este período de incubação, os poços são extensivamente lavadas para remover o excesso do segundo anticorpo não ligado, seguido pela detecção de sinais imunopositivos / poços utilizando um substrato cromogénico (OPD, Sigma). Os poços testados estão expostos a detecção espectrométrica dos valores de absorvência a 490 nm da fracção de anticorpo capturado pela fase sólida utilizando um sistema antigénico ELISA detector de microplacas. Os valores espectrométricos de absorvência obtidos reflectem a quantidade de anticorpo capturado pela fase sólida do antigénico. Assim, os valores finais de titulação do anticorpo são estimados e expressos como o valor inverso da fracção diluída de anti-soros testados, que dá 50% da resposta máxima de absorção, utilizando-se procedimentos de padronização de computador. A Figura 1 mostra um resultado representativo de um ensaio ELISA de captura de anticorpos usados para identificar inicialmente a eficácia da nossa nova vacina bivalente contra a dependência da morfina - heroína, para induzir uma resposta imune humoral de anticorpos com títulos elevados (isto é, produzem um valor médio de titulação 1:100 000), contra a morfina, logo após o segundo reforço num grupo amostrai de 10 animais imunizados. Como mostrado na figura, a concentração de anticorpos reactivos detectados através da sua absorvância a 490 nm, no ensaio diminui proporcionalmente à diluição em série de anti-soros. A Figura 2 mostra um resultado representativo de um ensaio ELISA de captura de anticorpos para monitorizar o tempo de curso de títulos séricos de anticorpos para a morfina - 65 heroína depois de animais reforçados (1-7 reforços) periodicamente com a preparação da vacina bivalente contra vício de morfina - heroína. Depois de preparar os ratos (primeira inoculação) com esta nova formulação terapêutica da vacina bivalente contra a dependência da morfina heroína, os títulos de anticorpos séricos contra estas substâncias opiáceas foram monitorizados 10-12 dias após cada reforço (4 - 7) . Como mostrado na figura, um aumento progressivo na concentração de anticorpos contra essas substâncias opiáceas foi obtido até ao quarto período de reforço, onde 10 animais activamente vacinados exibiram valores médios de titulação desde 1:800,000-1:1000,000. No entanto, os reforços subsequentes com o imunogénio de morfina - heroína (a partir do 5-7) não foram eficazes na indução de títulos crescentes significativos de anticorpos em animais considerados hiper-imunes a estas drogas opiáceas (dados não mostrados na figura). Este último resultado postula o uso de protocolos de imunização activa de curto prazo com nossa nova formulação terapêutica da vacina anti-morfina - heroína para chegar a uma resposta imune humoral máxima contra ambas as substâncias opiáceas.
Um dos objectivos centrais a alcançar por cada novo modelo de vacinas terapêuticas quando utilizadas em protocolos de imunização activa, é a sua capacidade para induzir uma resposta imune humoral e / ou celular robusta e estável ao longo do tempo estabelecido com memória imunitária de longo prazo . Neste contexto, a figura 3 é uma representação gráfica de dados representativos mostrando uma diminuição temporária da resposta imune humoral de anticorpos contra a morfina - heroína visto após o quarto reforço activo em indivíduos vacinados (n = 10) com a nova formulação de vacina terapêutica. Digno de nota é o facto de que os animais não-reforçados hiper-imunes, mostram uma diminuição 66 progressiva curso temporal dos títulos de anticorpo ao longo de um período de 120 dias. O título de anticorpo inicial obtido após o último reforço (que em média entre 1 : 800 000 - 1:1 000 000) mostraram uma diminuição significativa de cerca de 40 - 50 vezes, atingindo um valor mínimo de titulação média de 1:20 000 no final deste período de tempo. Estes dados mostram e suporta a hipótese de que a imunização activa com a nossa nova formulação terapêutica de vacina anti-morfina - heroína é capaz de induzir uma resposta imune humoral clássica atingindo títulos de anticorpos estáveis, pelo menos, após o quarto reforço. Esta evidência é fortemente suportada pelos dados experimentais obtidos a partir de ELISA de captura de anticorpo, conforme ilustrado na figura 4, que mostra que uma resposta de memória imunitária de longo prazo contra estas duas substâncias opiáceas foi estabelecida após o quarto reforço. Esta figura mostra os valores médios das concentrações de anticorpos séricos de dez sujeitos experimentais expostas a um reforço subsequente com a vacina bivalente, após um período de não-reforço de longo prazo de seis meses após o último reforço (4a) . Como mostrado na figura, o reforço activo com a presente invenção a formulação terapêutica de vacina anti-morfina -heroína induziu uma recuperação rápida e estável dos niveis máximos pré-existentes de títulos de anticorpos contra essas substâncias opiáceas (isto geralmente dentro dos primeiros 5-10 dias após reforço) em animais hiper-imunes não reforçados. Vale a pena observar no período de tempo similar a diminuição dos títulos de anticorpos mostrados após o quarto reforço (ver figura 3) em animais não vacinados hiper-imunes (i.e., depois de desafiar os animais com o último reforço da vacina, os níveis máximos de titulação foram alcançados 15 - 20 dias após o reforço, seguido de uma lenta e progressiva diminuição linear 67 durante os 30 dias seguintes, atingindo os níveis mais baixos de anticorpos detectados até 120 dias, os dados não se encontram representados na figura).
Uma vez que a eficácia da nossa nova formulação de uma vacina terapêutica anti-heroína- morfina foi avaliada e validada em protocolos de vacinação activas, mostrando a sua capacidade de gerar uma forte resposta imune humoral caracterizada por elevados e sustentados títulos de anticorpos séricos contra estas substâncias opiáceas, ensaios imuno-enzimáticos ELISA competitivos adicionais foram concebidos e desenvolvidos para avaliar e identificar a especificidade dos anticorpos anti-morfina - heroína.
Este ensaio ELISA competitivo utilizado para avaliar a especificidade do anticorpo é baseado no mesmo modelo experimental utilizado para os referidos ensaios ELISA não-competitivos. A diferença para os ensaios de ELISA competitivos consiste num passo de pré-adsorção do anti-soro específico de animais hiper-imunes usando concentrações diferentes (ou seja, que variam na gama de nM-M) de potenciais antigénios cruzados potencialmente competitivos reconhecidos pelos anticorpos anti-morfina. Estes antigénios competitivos incluindo morfina como substância de controlo positivo, para além dos três principais metabolitos endógenos de heroína e da morfina (por exemplo, 6-monoacetilmorfina, morfina-3-glucoronido e morfina-6-glucuronido) mostraram exibir propriedades de reforço opiáceos, e heroína, como o análogo estrutural de morfina sintética, apresenta: pelo menos uma ordem de magnitude mais elevada nas suas propriedades opióides de reforço em dose equivalente, do que o seu ortólogo opiáceo natural, a morfina. Dois outros péptidos opióides endógenos representativos produzidos no SNC de mamíferos, tais como a 68 leucina - encefalina e a -endorfina, também foram incluídos como antigénios competitivos neste ensaio. Além disso, este ensaio também incluiu compostos farmacológicos activos antagonistas competitivos para os receptores de opióides, tais como a naltrexona, uma substância utilizada na manutenção da abstinência do vício em heroína nos seres humanos.
Uma vez que este ensaio é baseado na detecção de sinais positivos originados a partir da absorvância emitida a partir das cavidades que reagem quando expostas ao sistema detector de microplacas de ELISA a 490 nm, apresentando cavidades de uma ausência de sinais significativos neste comprimento de onda (490 nm) sugerem a falta de anticorpos específicos capturados pelo antigénio adsorvido à fase sólida (que, no nosso caso, foi a morfina-6-hemisuccinil-BSA) . Se ocorrer, esta última condição experimental indica que os anticorpos do soro gerados por vacinação activa com a nossa nova formulação de vacina anti-morfina - heroína iria apresentar potencial reconhecimento cruzado para alguns dos antigénios competitivos utilizados no ensaio.
Os dados representativos ilustrados na figura 5 ilustram um ensaio imunoenzimático ELISA competitivo, o que mostra a especificidade equivalente dos anticorpos do soro para atravessar e reconhecer a morfina e a heroína (nota que ambas as curvas de competição exibem competitividade semelhante à morfina e as doses de heroína no intervalo de 0,6 - 0,8 M até aos valores de referência de IC50) . Além disso, estes ensaios mostram igualmente a capacidade de tais anticorpos do soro anti-morfina - heroína para o reconhecimento cruzado de diferentes metabolitos de biotransformação destas substâncias opiáceas (isto é, 6-monoacetil-morfina, morfina-3-glucoronido e morfina-6- 69 glucuronido). Além disso, nenhum reconhecimento cruzado a outras substâncias tais como péptidos opiáceos endógenos e o antagonista do receptor de opiáceos naltrexona foi observada no mesmo ensaio. Colectivamente, estes resultados tornam possível propor a potencial falta de interferência imunológica deste imunogénio em protocolos de vacinação activos quando poderia ser utilizada em humanos tratados com terapias anti-aditivos clássicos utilizando morfina estruturalmente diferente dos medicamentos opióides opióides, tais como naltrexona, naloxona, metadona e buprenorf ina. Além disso, pode ser assumido que a nova formulação de vacina terapêutica contra a dependência da morfina - heroína, não é capaz de gerar uma resposta auto-imune, uma vez que os anticorpos gerados por esta vacina não são capazes do reconhecimento cruzado dos péptidos opióides endógenos (isto é, a leucina - encefalina e -endorfina) que, além de serem sintetizada no cérebro em animais vacinados hiper-imunes, incluindo seres humanos, que não participam na regulação de um conjunto múltiplo de actividades fisiológicas e processamento de uma ampla gama de funções do cérebro no sistema nervoso central de mamíferos.
AVALIAÇÃO E VALIDAÇÃO DA EFICÁCIA DA INVENÇÃO DA FORMULAÇÃO TERAPÊUTICA DA VACINA BIVALENTE CONTRA A DEPENDÊNCIA DE MORFINA- HEROÍNA
Após a validação se ter mostrado a eficácia da presente formulação terapêutica de vacina bivalente anti-morfina -heroína para conferir hiper-imunidade contra a morfina e a heroína, com uma resposta de memória imunológica melhorada a longo prazo, através da produção de títulos elevados e sustentados de soro que reagem especificamente com os anticorpos contra esses medicamentos opiáceos e seus 70 metabolitos endógenos em indivíduos imunizados, decidimos explorar os efeitos imunoprotectores da presente formulação da vacina terapêutica contra a re-aquisição de comportamento viciante de ingestão em animais hiper-imunes desintoxicados e em abstinência do vício destes opiáceos. Neste contexto, os animais testados hiper-imunes contra morfina / heroína foram expostos a testes comportamentais operantes utilizando o paradigma de auto-administração intravenosa da droga, tanto para a morfina como para a heroína. Estes paradigmas farmacológicos utilizados no modelo animal do rato foram aplicadas a partir de paradigmas farmacológicas relacionadas anteriormente relatada por vários grupos de investigação ( J. M. Van Ree et al. , J. Pharm. Exp. Ther., 204 (3) : 547 - 557, 1978 ; J.M. Van Ree and D. de Wied, Life Sei. 21:315 - 320, 1977 ; T.J. Martin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 272:1135 -1140, 1995 ; P. Hyytiá et al., Psychopharmacology, 125:248 - 254, 1996 ; T. J. Martin et al., Brain Res. 755 :313 -318, 1997 ; C.W. Hutto, Jr. and W. F. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 58(1):133 - 140, 1997 ; R. Ranaldi and E. Munn, Neuroreport, 9:2463 - 2466, 1998 ; S. Martin et al., Brain Res. 821:350 - 355, 1999 ; I.M. Maisonneuve and S. D. Glick, Eur. J. Pharmacol, 383:15 - 21. 1999 ; S.D. Comer et al. , Psychopharmacology, 143327 - 338, 1999 ; S. Semenova et al. , Eur. J. Pharmacol. 378:1 - 8, 1999 ; M.R.A. Carrera et al., Psychopharmacology, 144:111 - 120, 1999 ; Z - X. Xi and E. A. Stein, J. Pharm. Exp. Ther. 290 :1369 - 1374, 1999 and L. J. Sim-Selley et al., J. Neurosci. 20(12):4555 - 4562, 2000).
Os modelos farmacológicos de paradigmas de auto-administração intravenosa de ambos morfina e heroína nos roedores tem sido amplamente utilizados para explorar os mecanismos neurobiológicos pelos quais estes opiáceos 71 produzem as suas propriedades de reforço de drogas. Adicionalmente, estes modelos também foram utilizados para avaliar os efeitos anti-viciantes de compostos terapêuticos, tais como metadona, naloxona e naltrexona. Além disso, estes paradigmas farmacológicas são extremamente úteis para avaliar as respostas de motivação e de reforço de drogas, independentemente dos efeitos farmacológicos directos produzidos por estas drogas opiáceas no sistema nervoso central (isto é, a activação psicomotora) quando protocolos adequados são empregues durante a auto-administração farmacológica destas substâncias. Portanto, a fim de avaliar e validar os efeitos imunoprotetores contra a dependência da morfina, heroina conferida pela presente invenção, da formulação terapêutica da vacina bivalente anti-morfina - heroina, o nosso laboratório concebeu, desenvolveu e validou um paradigma de auto-administração intravenosa de medicamentos para estes duas substâncias opiáceas no modelo animal do rato. a) -. Desenvolvimento, implementação e validação do paradigma da auto-administração intravenosa de morfina e heroína no modelo animal do rato 0 modelo farmacológico do paradigma da auto-administração de morfina / heroina intravenosa no rato foi padronizado a partir de vários protocolos previamente relatados por diferentes grupos ( J. M. Van Ree et al, J. Pharm Exp. Ther., 204 (3) : 547 - 557, 1978 ; J. M. Van Ree and D. of Wied, Life Sei. 21:315 - 320, 1977 ; T. J. Martin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 272 : 1135 - 1140, 1995 ; P. Hyytiá et al., Psychopharmacology, 125:248 - 254, 1996 ; T. J. Martin et al., Brain Res. 755 : 313 - 318, 1997 ; C. W. Hutto, Jr. and W. F. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 72 58(1) : 133 - 140, 1997; R. Ranaldi and E. Munn,
Neuroreport, 9 : 2463 - 2466, 1998 ; S. Martin et al., Brain Res. 821:350 - 355, 1999 ; I. M. Maisonneuve and S. D. Glick, Eur. J. Pharmacol, 383 : 15 - 21. 1999; S.D. Comer et al., Psychopharmacology, 143327 - 338, 1999 ; S.
Semenova et al., Eur. J. Pharmacol. 37 8 : 1 - 8, 1999; M. R. A. Carrera et al, Psychopharmacology, 144 : 111 - 120, 1999; Z - X. Xi and E. A. Stein, J. Pharm. Exp. Ther. 290:1369 - 1374, 1999 and L. J. Sim-Selley et al., J.
Neurosci. 20(12) : 4555 - 4562, 2000) . Basicamente, este modelo farmacológico consiste na utilização em animais implantados cirurgicamente cateteres colocados com teflon na veia jugular externa da esquerda para a direita ou para a esquerda para opiáceos paradigmas de auto-administração intravenosa utilizando a morfina e a heroina como droga de reforço, durante as sessões 4h / diariamente, dentro de condicionamento operante de caixas de Skinner, controladas pelo observador através de sinais computadorizados. Neste contexto, a infusão intravenosa de uma "unidade de dose" completa de cada uma dessas duas substâncias opiáceas é estabelecida por um número fixo de respostas feitas pelo animal na alavanca operante de uma alavanca retráctil (colocado no painel frontal da caixa de Skinner) em intervalos de tempo especificados. Por exemplo, a infusão de uma unidade de dose de morfina (isto é, 1900 g / 0.2 ml / kg de peso) e heroína (g / 0.2 60 ml / kg) são realizadas quando o animal completa um número fixo de respostas de alavanca (isto é, 1, 3, 5, 10), após um intervalo de tempo definido (por exemplo, 20,40, a 80 segundos), o tempo em que a alavanca retráctil está inactiva. Assim, nestas condições farmacológicos, pode-se avaliar as respostas de drogas comportamento de toma, estimando-se nas 4 horas / dia o número total de sessões de infusões de opiáceos feitas pelo animal. Também incluido nas análises são as 73 medidas de procura de droga respostas comportamentais ao estimar o número total de retracções da alavanca que ocorrem nos intervalos de tempo, quando a alavanca retráctil está inactiva. Sob estas condições experimentais, os animais treinados estabelecem a quantidade de fármaco opióide que necessitam para ser auto-administrado. Até agora, este paradigma farmacológico permitiu a realização de procedimentos quantitativos e reprodutíveis utilizados para estimar as doses acumuladas de droga por via intravenosa / animal / sessão / dia, auto-administrado, incluindo as doses acumuladas de drogas / animal auto-administrado durante todo o horário de treino (i.e., os dados acumulados ao longo de 15, 30, 60 dias). A capacidade de heroína e da morfina para induzir uma resposta comportamental operante (isto é, a manipulação da alavanca retráctil para produzir uma e / ou comportamentos de procura de droga) é definida como as propriedades de reforço de cada uma das drogas para discriminar o estimulo da droga associada. Neste contexto, animais vacinados hiper-imunes com a vacina bivalente da presente invenção, com as respostas humorais imunitárias de anti-morfina -heroína a títulos elevados e sustentados de anticorpos séricos, deve neutralizar ou neutralizar as propriedades de reforço de drogas induzidas por estas substâncias opiáceas no cérebro, quando desafiado para adquirir a dependência de auto-administração intravenosa comportamento ou morfina ou heroína. Estes animais devem mostrar uma diminuição significativa de consumo drogas opiáceas e de respostas comportamentais procura de droga devido à ausência de estímulos reforçadores da droga associada.
Em resumo, este modelo farmacológico baseado no paradigma de auto-administração intravenosa de opiáceos, permitiu obter e construir linhas de base do comportamento de 74 consumo de drogas operante em animais com respostas aditivas consolidadas tanto para a morfina como para a heroina. 0 parâmetro farmacológico relativo das respostas comportamentais de entrada de opiáceos tanto para a morfina como para a heroina foram obtidos depois de comparar as taxas destas drogas de auto-infusão em animais hiper-imunes imunizados com a formulação terapêutica de vacina bivalente anti-morfina - heroina do presente invento e os grupos de controlo (não imunizados ou imunizados apenas com adjuvante e adjuvante mais proteína transportadora, ver resultados representativos nas figuras 6 e 7). 1. Desenvolvimento funcional e implementação de caixas operante de Skinner. A instalação e o funcionamento de oito caixas operantes de Skinner (alumínio e acrílico transparente) projetados para a auto-administração intravenosa de líquidos e drogas no modelo animal de ratos foram desenvolvidos de acordo com as normas de funcionamento recomendados pelo fabricante (Operant Behavior Conditioning Systems for lab animais, TSE Systems, Hamburg, Germany). 2. Desenvolvimento da aprendizagem paradigmas de treinamento para a pressionar uma alavanca e recompensa alimentar condicionada.
Ratos Wistar machos (260 - 320 g) foram treinados para localizar e pressionar as alavancas retrácteis nas caixas operantes de Skinner, e para cada pressão na alavanca, os animais foram recompensados com um máximo de 200 peletes de alimentos (45 mg) (Noyes Traditional Food Precision Pellets; Research Diets, Inc., Lancaster, NH) durante 5-7 dias num treinamento de 4h. Nestas condições experimentais, 75 os animais foram condicionados a obter a recompensa alimentar (estimulo reforçador) cada vez que pressionam a alavanca retráctil [reforço fixo protocolo 1 (LRF)], com a exposição de um estimulo luminoso de indicação (estimulo condicionado), controlado por um software on-line (TSE, OBS sistema) durante sessões diárias de 4 h durante um periodo de 5 - 7 dias. Após este periodo de treinamento, a duração das sessões foi reduzido para 30 minutos, aumentando os intervalos de tempo de espera de 5 (TO-5) a 20 seg (TO-20), momento em que as alavancas retrácteis foram inabilitadas durante os próximos 3-5 dias seguintes. Assim, os animais foram treinados para completar as suas respostas na alavanca através da obtenção de 50 peletes sob um esquema de reforço fixo (FR1, TO, 20 seg), em sessões diárias de 30 minutos. Animais bem sucedidos nesse formação comportamental condicionada, foram devolvidos às suas gaiolas individuais, sob restrição de dieta (16 - 20 g / dia de alimentos granulados) e, subsequentemente, expostos à implantação cirúrgica de cateteres intravenosos Teflon na veia jugular externa, de modo a iniciar os procedimentos experimentais de imunoproteção contra o vicio de morfina / heroina quando expostos aos paradigmas de auto-administração de opióides por via intravenosa. 3. O implante cirúrgico de cateteres nas veias jugulares externas.
Os animais experimentais treinados para pressionar a alavanca de recompensa alimentar, utilizando o comportamento operante condicionado descrito acima, foram submetidos à anestesia geral e as condições de assepsia cirúrgica para a implantação cirúrgica de teflon cateteres dentro das veias jugulares externas direita ou esquerda. O procedimento cirúrgico foi realizado todo de acordo com 76 protocolos cirúrgicos convencionais descritos por K.M. Kantak et al. (Psychopharmacology, 148:251 - 262, 2000). Após a cirurgia, os animais foram devolvidos às seus casas ou gaiolas e a viabilidade funcional dos cateteres implantados foram verificados com uma base diária através da infusão de soro fisiológico e antibióticos [5% Enrofloxacyn (0,50 mg / kg); gentamicina-Super 5mg/kg). Após sete dias de recuperação pós-cirúrgica, os animais foram, em seguida, submetidos aos paradigmas farmacológicos de auto-administração intravenosa de ambos morfina e heroina. 4. Desenvolvimento e criação de respostas basais de morfina e heroina por via intravenosa auto-administrada. A viabilidade funcional de cateteres implantados em animais recuperados pós-cirurgicamente foi verificada antes da exposição dos animais às 4 horas / sessões diárias de nosso paradigma de morfina e heroina de auto-administração.. Inicialmente, grupos separados de animais foram expostos ao contingente de auto-administração de uma dose unitária fixa de morfina (1900 g/kg/0.2 ml de solução salina) durante 10 segundo de injecção) ou heroina (g/kg/0.2 60 ml de soro fisiológico / 10 segundo de injecção), após um horário fixo de reforço (FRl), TO de 20 segundos, durante quatro sessões de uma hora por dia, durante 5-7 dias consecutivos. A diferença dos valores da dose de reforço unitário entre a morfina e a heroina foram baseados nos dados previamente relatados na literatura ( J. M. Van Ree et al, J. Phar. Exp. Ther. 204(3) : 547-557, 1977 and C. W. Hutto, Hr. and W. F. Crowder, Phar. Biochem. Behav. 58(1) : 133-140, 1997) que mostrou que uma relação de dose de morfina: heroina numa relação de 32 : 1, produzindo igual escolha no auto-infusão destas substâncias opiáceas quando da auto- 77 administração pelo rato sob condições experimentais . Este periodo de treinamento levou os animais a adquirir respostas de linha de base estável sobre a auto-administração contingente desses opiáceos, ao longo de um periodo de treinamento adicional de 7-10 dias. Sob estas condições de protocolo, animais treinados apresentam uma média de resposta de linha de base da infusão de 25 3 a 20 5 durante a auto-administração das doses - unidades fixas de ambos heroína e de morfina, respectivamente. A linha de base de respostas de auto-infusão a estas duas drogas foi considerada como estabelecida e consolidada quando os valores dos coeficientes de variabilidade não variaram mais do que 10% para cada uma das drogas ao longo de sessões de auto-infusão, durante pelo menos cinco dias consecutivos experimentais. Uma vez que os parâmetros de auto-respostas iniciais de infusão tanto para a morfina e a heroína foram atingidos, a fase inicial de extinção foi realizada através da substituição das substâncias opiáceas para solução de veículo (isto é, solução salina veículo = NaCl a 0,9% em H2O desionizada estéril) durante os próximos 3 -5 dias seguintes, logo após foram estabelecidos parâmetros de auto-infusão de respostas para ambos os opiáceos. As respostas de auto-extinção de infusão de ambas as respostas de heroina e da morfina conseguida por animais implantados cirurgicamente foram definidos após alcançar um significativo número médio de respostas de extinção / sessão / dia de 3 2 à solução do veículo auto-administrada, em grupos de animais formados para auto-administração quer de morfina ou heroína que consolidasse uma fase inicial das respostas da linha de base, como mencionado acima. Para consolidar os opiáceos as respostas de comportamento de auto-administração tanto a morfina e a heroina, dois ciclos de re-aquisição-extinção subsequente de auto-administração de opiáceo foram realizadas. Neste contexto experimental, 78 15 dias após a obtenção das respostas médias iniciais da fase de extinção com o paradigma de auto-administração de opióides, que avaliou o efeito antagonista dos anticorpos séricos anti-morfina - heroina na re-aquisição do comportamento de auto-infusão viciante em resposta a ambas as substâncias opiáceas em animais hiper-imunes (treinados para auto-administrar essas substâncias opiáceas) depois de ser activamente imunizados com a formulação terapêutica da vacina bivalente contra a dependência da morfina- heroina, usando o protocolo de vacinação / imunização revelado na presente invenção. 5. Caracterização do efeito imuno contra a dependência da morfina- heroina induzida pela imunização activa com a vacina anti-morfina-heroina da presente invenção
Diferentes grupos de animais treinados para auto-administração de morfina e de heroina, que estabeleceu parâmetros de auto-infusões dessas drogas opiáceas foram activamente vacinados tanto com a fórmula bivalente de vacina de morfina e heroina terapêutica da presente invenção ou com os compostos de controlo (isto é, hidróxido de aluminio utilizado como co-adjuvante e esse co-adjuvante mais toxóide do tétano utilizado como proteina transportadora), seguindo o mesmo protocolo de imunização descrito na presente invenção. Uma vez que a resposta imunológica humoral contra estes dois fármacos (ver figuras 1, 2, 3 e 4) foi estabelecida em animais vacinados hiper-imunes, eles foram, então, expostos de novo ao paradigma de auto-administração intravenosa tanto com morfina e heroina, assim como avaliar as respostas imunoprotetoras contra essas drogas opiáceas, medindo o número de respostas completas de auto-infusão (comportamento droga-entrada) durante 15 - 20 consecutivos 4 sessões de uma hora por dia. 79
Os mesmos estudos foram realizados em animais dos grupos de controlo, que receberam ou o adjuvante sozinho ou o adjuvante mais a proteína transportadora.
Os dados obtidos foram expressos como a média de número acumulado de respostas de auto-infusão completa/ dia /no grupo experimental vacinado durante sessões diárias de 15-20, e ensaiadas para avaliar o efeito imunoprotector. A análise estatística dos dados foi realizada por análise de variância (ANOVA), seguido de um teste de Newman-Keuls, para comparação análise post-hoc.
De acordo com este contexto experimental, grupos testados incluíram, animais hiper-imunes contra a morfina (heroína CP-MORFINA, n = 8) e os grupos de controlo imunizados quer com adjuvante de hidróxido de alumínio (alume, n = 8) ou com a proteína transportadora mais adjuvante (CP + ALUM, n = 8) . Todos eles receberam a mesma unidade de dose de heroína ou de morfina durante o paradigma de auto-administração intravenosa como descrito anteriormente na presente invenção. Os resultados mostram as respostas de linha de base (valores médios) do número de auto-infusões obtidos para cada uma das substâncias de opiáceos auto-administrado, bem como o veículo de controlo auto-administrado (isto é, soro) ao longo do 15 - 20 consecutivos, 4 horas - sessões diárias, são mostrados nas figuras 6 e 7. A Figura 6, ilustra o efeito imuno induzido por vacinação activa com a formulação terapêutica anti-morfina - heroína de vacina bivalente do presente invento contra o comportamento de auto-administração de morfina por via intravenosa no modelo animal do rato. O grupo de ratos imunizados com a vacina do presente invento, e os grupos de 80 controlo, imunizados com o adjuvante ou com adjuvante mais proteína transportadora foram expostos ao paradigma de auto-administração de morfina. Animais do grupo controle que receberam apenas o hidróxido de alumínio (ALUM) como imunógeno não mostraram mudanças significativas no que diz respeito às respostas médias de auto-infusão de morfina / sessão (17 4, SEM) em comparação com as respostas médias pré-imunização em animais do grupo controle (18 5, SEM) . Por outro lado, os animais vacinados com a preparação imunogénica morfina (CP-morfina) mostraram uma redução significativa no número médio de auto-infusão / sessão de heroína (4 3, SEM, p <0,005) em comparação com os animais imunizados com o adjuvante (ALUM) ou com adjuvante mais proteína transportadora (CP-alone + ALUM). É digno de nota o padrão similar da média das respostas de auto-infusão obtidas com solução salina (controlo de veículo) obtidas por animais imunizados com estas três preparações diferentes de vacina (3 2 com alume, 3 2 com alume + CP, e 3 2 com os anticorpos anti-morfina - heroína vacina bivalente da presente invenção). A Figura 7 representa o efeito imunoprotector de vacinação activa com o anti-morfina - heroína de vacina bivalente da formulação terapêutica do presente invento contra o comportamento de auto-administração de heroína intravenosa no modelo animal do roedor. O grupo de ratos imunizados com a presente vacina e os grupos de controlo imunizados com adjuvante e / ou com o adjuvante mais proteína transportadora foram expostos aos paradigmas farmacológicos da auto-administração de heroína. Os animais do grupo controle que receberam apenas o hidróxido de alumínio (ALUM) como imunógeno não apresentaram diferenças significativas em relação à média de heroína e média de respostas de auto-infusão/ sessão (24 4, SEM) quando 81 comparado com a média de respostas de pré-imunização (21 3 e SEM) obtido em animais de controlo. Por outro lado, os animais vacinados com a preparação imunogénica de morfina (CP-morfina) exibiram uma redução significativa no número médio de heroina auto-infusão/sessão (6 2, SEM, p <0,005) em comparação com os animais imunizados com o adjuvante (ALUM) ou com adjuvante mais da proteína transportadora (CP-alone + ALUM). Além disso, o número médio de solução salina (controlo de veículo) de auto-infusões alcançado por animais imunizados com estas três preparações de vacina (3 2, no grupo de animais imunizados com alume, 2 3 no grupo de animais imunizados com alume + CP, e 3 1, no grupo de animais imunizados com o anti-morfina-heroína vacina bivalente da presente invenção) foram muito semelhantes.
Finalmente, a aplicação deste tipo de estratégias terapêuticas está a ser avaliado para a sua aplicação futura em seres humanos que apresentam sérios problemas de dependência de ambos morfina e heroína. 82

Claims (7)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a preparação de uma composição imunogénica bivalente contra a dependência da heroina envolvendo uma reacção entre uma porção de veiculo ("CP") e um produto morfinico, em que a proteína veículo é tétano toxóide e o produto morfinico é EDC-(morfina-6- hemisuccionato) , em que o produto morfinico está ligado a um conjugado intermédio ("CP-TFCS") na composição, e em que a composição é preparada de acordo com as seguintes etapas: a) reagir 100 mg (0,5 mM) de toxóide do tétano, dissolvido em 4 ml de uma solução tampão de fosfato /0,15 mM de NaCl, pH 7,2 com 50 μΐ de 40 mg / ml de uma solução de armazenamento de N (s - trifluoroacetilcaproiloxi)-succinamida-éster ("TFCS") contendo 10-10% de DMSO e 90-80 % de H20 destilada (v:v), para iniciar a formação do conjugado intermédio; b) a obtenção de uma concentração final de toxóide de tétano de 6,7 mM e 0,5-1% de DMSO; c) a obtenção de uma diluição final de 1:10-20 (v: v) da concentração inicial de DMSO na reacção de condensação entre o toxóide do tétano e TFCS; d) a incubação do conteúdo da etapa d) de até 60-90 minutos à temperatura ambiente, em que ocorre a síntese do CP-TFCS, e em que TFCS ainda preserva um amino reactivo protegido por um grupo trifluoroacetilo protector químico; e) a incubação durante um período de 2 - 3 horas à temperatura ambiente, ajustando o pH para 8 - 8,5, com uma solução concentrada de NaOH 10N, para aumentar o grupo trifluoroacetilo protegido no TFCS a ser hidrolisado, de modo a gerar grupos amina reactivos livres no toxóide no CP-TFCS; f) purificação do CP-TFCS utilizando procedimentos de diálise convencionais; g) reagindo o produto morfinico, EDC-(morfina-6-hemisuccinato), com o CP-TFCS, em que a reacção é realizada 1 numa relação estequiométrica fazendo a reacção mol:mol de 100 μιηοΐ de EDC- (M-H) por cada 0,07 μιηοΐ de grupos amina activos livres de CP-TFCS; h) incubando os reagentes obtidos na etapa g) 2 - 3 horas à temperatura ambiente sob agitação lenta e constante para formar a composição imunogénica; i) purificando a composição imunogénica usando processos de diálise convencionais; j) esterilizando a composição imunogénica através de processos de filtragem sob pressão positiva usando filtros de membrana com um tamanho de poro de 0,45 pm. 2. 0 processo da reivindicação 1, em que a etapa de purificação f) do CP-TFCS compreende a diálise do CP-TFCS com membranas de diálise recortadas de 10 k Da de peso molecular durante até 24 horas a 4°C com três mudanças de 6 litros de uma solução tampão de fosfato a 0,1 M, de pH 7,2 cada 8 horas.
  2. 3. O processo das reivindicações 1 ou 2, em que a etapa de purificação i) da composição imunogénica compreende a diálise da composição imunogénica com membranas de diálise recortadas de 10 k Da de peso molecular durante até 24 horas a 4°C com três mudanças de 6 litros de uma solução tampão de fosfato a 0,1 M, de pH 7,2 cada 8 horas.
  3. 4. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que o CP-TFCS compreende a seguinte fórmula estrutural: 2
    5. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o tétano toxóide está ligado de um modo covalente através dos seus grupos amina épsilon a partir da cadeia lateral de residuos de lisina expostos no CP-TFCS 6. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que a etapa g) é obtida através de uma ligação amida covalente formada por reacção dos grupos imida expostos na extremidade livre do EDC-(M-6-H) e os grupos sem amina expostos não protegidos do TFCS conjugado do CP-TFCS. 7. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a composição imunogénica tem a estrutura mostrada na fórmula seguinte:
    8. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, que compreende ainda a etapa de formulação da composição imunogénica com um ou mais adjuvantes 3 farmacologicamente aceitáveis e / ou um ou mais agentes farmacológicos. 9. 0 processo de acordo com a reivindicação 8, em que o adjuvante farmacologicamente aceitável é hidróxido de alumínio.
  4. 10. O processo de acordo com a reivindicação 8 ou com a reivindicação 9, em que o agente farmacológico é naltrexona.
  5. 11. Uma composição imunogénica bivalente contra a dependência morfina-heroina tendo uma das fórmulas estruturais seguintes:
    Ou
    em que a proteína de transporte (CP) é tétano toxóide.
  6. 12. A composição imunogénica da reivindicação 11, que compreende ainda um ou mais adjuvantes farmacologicamente aceitáveis ou agentes farmacológicos. 4
  7. 13. A composição imunogénica da reivindicação 12, em que o adj uvante aluminio e farmacologicamente aceitável é hidróxido de o agente farmacológico é maltrexona. 5
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