PT1751290E

PT1751290E - Construções de empacotamento de replicão de alfa vírus

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Publication number: PT1751290E
Application number: PT58567413T
Authority: PT
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2004-05-25
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2015-02-03
Also published as: PL1751290T3; EP1751290B1; JP2008500044A; ES2526196T3; CA2567047A1; EP1751290A2; CA2567047C; JP5689576B2; US9024001B2; US20080069804A1; WO2006076032A3; WO2006076032A2

Description

DESCRIÇÃO

CONSTRUÇÕES DE EMPACOTAMENTO DE REPLICÃO DE ALFA VÍRUS CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se genericamente a composições farmacêuticas. Em particular, a invenção refere-se a trans-atuação modificada, funcionando com sequências de amplificação que são defeituosas como sinais de empacotamento e métodos para produzir e utilizar estas sequências.

ANTECEDENTES

Os alfa virus compreendem um conjunto de virus transmitidos por artrópodes geneticamente, estruturalmente, e sorologicamente relacionados com a família Togaviridae. Vinte e seis vírus conhecidos e subtipos do vírus foram classificados dentro do género alfa vírus, inclusive, o vírus Sindbis (SIN), o vírus Semliki Forest (SFV), o vírus Ross River (RRV) e o vírus da encefalite equina venezuelana (VEE) . Vários membros do género alfa vírus estão a ser desenvolvidos como vetores de expressão do "replicão" para utilização como vacinas e agentes terapêuticos. Os vetores de replicão podem ser utilizados em vários formatos, incluindo ADN, ARN, e para fazer partículas semelhantes a vírus recombinantes contendo os vetores de replicão (partículas de replicão) . Esses vetores de replicão foram derivados de alfa vírus que incluem, por exemplo, SIN (Xiong et ai. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky et ai., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan et ai. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo et ai. (1999) PNAS 96: 4598-4603), vírus Semliki Forest (Liljestrom (1991) Bio/ Technology 9:1356-1361; Berglund et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565), e EEV (Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401). Uma grande quantidade de literatura tem agora demonstrado a eficácia da utilização de vetores de alfa vírus do replicão para aplicações como vacinas (ver, por exemplo, Dubensky et al, ibid; Berglund et al, ibid; Hariharan et al, ibid, Pushko et al, ibid; Polo et al, ibid., Davis et al. (2000) J Virol. 74:371-378; Schlesinger & Dubensky (1999) Curr Opin. Biotechnol. 10: 434-439; Berglund et al. (1999) Vaccine 17:497-507). A utilização de vetores de alfa vírus do replicão como vacinas à base de ácidos nucleicos pode proporcionar certas vantagens em comparação com outros vetores de expressão de ácidos nucleicos. Através dos anos, vários termos, incluindo vetor alfa vírus, construção de vetor alfa vírus, alfa vírus replicão, alfa vírus ARN replicão, vetor de alfa vírus replicão, sistema de iniciação de vetor eucariótico em camadas (ELVIS), plasmídeo de alfa vírus replicão e similares surgiram para descrever vetores de alfa vírus do replicão.

Em adição ao seu uso como veículos de distribuição de genes, os vetores de alfa vírus do replicão também têm sido descritos para utilização para gerar partículas virais recombinantes ou semelhantes a vírus (partículas de replicão), que são elas próprios úteis em aplicações profiláticas e terapêuticas. Ver, por exemplo, Polo et al. (1999) Proc Natl Acad Sei EUA 96 (8):4598-4603. Partículas de replicão de alfa vírus são tipicamente geradas usando um sistema multi-componente que separa os diferentes elementos necessários para a formação de partículas. A separação dos diversos elementos reduz o risco de gerar, virus competente para replicação indesejável. Os sistemas tipicamente incluem: 1) um vetor de replicão, que contém os elementos necessários para a sua própria replicação intracelular (por exemplo, proteína não estrutural que codifica sequências), mas não possui um ou mais elementos de codificação de proteínas estruturais necessárias para a produção de partículas da progénie, e 2) um ou mais construções estruturais da cassete expressão da proteína (por exemplo, ajudantes defeituosos) que codificam proteínas estruturais de alfa vírus (por exemplo, capsídeo, glicoproteínas) necessárias para o empacotamento. As construções de replicão e as construções auxiliares defeituosas podem ser introduzidas diretamente em células como ARN ou lançadas a partir de ADN em células, quer transitoriamente ou estavelmente transfectadas (por exemplo, linhas de células de empacotamento ou PCL) . Ver, por exemplo, Polo et ai. (1999) Proc. Acad. Sei EUA 96:4598-4603; Patentes US 6465634; 6426196; 6376236; 6342372; 6015686; e 5843723. Dubensky, TW et ai. (1996) J. Virology 70 (1) :508 — 519; Frolov et ai. (1996) . Proc Natl Acad Sei USA. 93 (21) : 11371-11377).

Idealmente, as populações de partículas de replicão de alfa vírus utilizadas em aplicações profiláticas ou terapêuticas seriam substancialmente homogéneas e conteriam apenas o ARN do replicão. No entanto, mesmo quando os elementos de empacotamento são separados, as partículas que contêm espécies de ARN adicionais (por exemplo, RNA auxiliar defeituoso) podem ocorrer. Este empacotamento indesejável das espécies de ARN do replicão também é denominado "co-empacotamento". A US 2004/0235133 revela métodos para a produção em grande escala de replicões de alfa vírus.

Frolova et al. (J. Virol 1997 71 (1) :248-58) investiga a presença de sinais de empacotamento no genoma do virus Sindbis.

Assim, apesar dos avanços na tecnologia do vetor alfa virai, continua a existir uma necessidade de composições farmacêuticas compreendendo métodos de fabrico e utilização de vetores alfa virais e partículas de replicão de alfa vírus, por exemplo, para reduzir o co-empacotamento.

RESUMO A presente invenção inclui composições que compreendem sequências de amplificação, que são modificadas para serem defeituosas, como sinais de empacotamento e métodos para produzir e utilizar estas composições.

Num aspeto, a invenção inclui um polinucleótido isolado compreendendo uma sequência de amplificação 5' modificada com um comprimento entre 10 e 150 nucleótidos, em que a sequência modificada fornece um sítio de reconhecimento para a síntese de ARN de cadeia positiva de alfa vírus (a partir do ARN de cadeia negativa complementar intermediário) mas não fornece um sítio de reconhecimento para o empacotamento do ARN. Em certas formas de realização, a sequência de amplificação 5' modificada compreende uma sequência que apresenta uma homologia reduzida (identidade de sequência) para os sinais de empacotamento ao nível da sequência primária, enquanto a estrutura secundária permanece como a sequência de amplificação inicial. Em certas formas de realização, a sequência de amplificação 5' modificado é ARN. Além disso, em certas formas de realização, a sequência de amplificação 5' modificada compreende qualquer uma de SEQ ID N°s: 4-16, ou uma sequência que exibe pelo menos cerca de 50% a cerca de 60% (ou qualquer valor entre as mesmas, por exemplo, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%) de identidade de sequência com qualquer uma das ID SEQ N°s: 4 a 16, uma sequência que exibe pelo menos cerca de 60% a cerca de 70% (ou qualquer valor entre as mesmas, por exemplo, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%) de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID N°s: 4 a 16, uma sequência que exibe pelo menos cerca de 70% a cerca de 80% (ou qualquer valor entre as mesmas, por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%) de identidade de sequência com qualquer uma das ID SEQ N°s: 4 a 16, uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80% a cerca de 90% (ou qualquer valor entre as mesmas, por exemplo 80%, 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%) de identidade de sequência com qualquer uma das ID SEQ N°s: 4 a 16, ou uma sequência que exibe pelo menos cerca de 90% a 99% (ou qualquer valor entre as mesmas, por exemplo 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) de identidade de sequência com qualquer uma das ID SEQ N°s: 4 a 16.

Em qualquer uma das sequências de amplificação 5' modificadas aqui descritas, a sequência pode ser sintética e/ou pode ser derivada de uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo de uma sequência 5' de alfa virus nativo, uma sequência 5' de alfa virus Dl não nativo, uma sequência virai não-alfa virus derivada e uma sequência de ARN celular derivada, contanto que a sequência modificada forneça um sitio de reconhecimento para a síntese do alfa vírus de ARN de cadeia positiva mas não forneça um sítio de reconhecimento para o empacotamento do ARN. Em certas formas de realização, a sequência de amplificação 5' modificada compreende uma sequência que exibe menos de 90% de identidade com a sequência 5' de um alfa vírus nativo, uma sequência 5' de alfa vírus Dl não nativo, uma sequência virai não-alfa vírus derivada ou uma sequência de ARN celular derivada. Em outras formas de realização, a sequência de amplificação 5' modificada compreende uma sequência que exibe menos de 80% de identidade com a sequência 5' de um alfa vírus nativo, uma sequência 5' de alfa vírus Dl não nativo, uma sequência virai não-alfa vírus derivada ou uma sequência de ARN celular derivada. Em outras formas de realização, a sequência de amplificação 5' modificada compreende uma sequência que exibe menos de 7 0% de identidade com a sequência 5' de um alfa vírus nativo, uma sequência 5' de alfa vírus Dl não nativo, uma sequência virai não-alfa vírus derivada ou uma sequência de ARN celular derivada. Em ainda outras formas de realização, a sequência de amplificação 5' modificada compreende uma sequência que exibe menos de 60% de identidade com a sequência 5' de um alfa vírus nativo, uma sequência 5' de alfa vírus Dl não nativo, uma sequência virai não-alfa vírus derivada ou uma sequência de ARN celular derivada. Em outras formas de realização, a sequência de amplificação 5' modificada compreende uma sequência que exibe pelo menos entre cerca de 40% e cerca de 50% (ou qualquer valor entre as mesmas, por exemplo, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%) de identidade com a sequência 5' de um alfa vírus nativo, uma sequência 5' de alfa vírus Dl não nativo, uma sequência virai não-alfa vírus derivada ou uma sequência de ARN celular derivada. Em ainda outras concretizações, a sequência de amplificação 5' modificada compreende uma sequência que exibe pelo menos entre cerca de 30% e cerca de 40% (ou qualquer valor entre as mesmas, por exemplo 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%) de identidade de sequência com a sequência 5' de um alfa virus nativo, uma sequência 5' de alfa virus Dl não nativo, uma sequência virai não-alfa virus derivada ou uma sequência de ARN celular derivada. Em ainda outras formas de realização, a sequência de amplificação 5' modificada compreende uma sequência que exibe menos do que cerca de 30% de identidade de sequência com a sequência 5' de um alfa virus nativo, uma sequência 5' de alfa virus Dl não nativo, uma sequência virai não-alfa virus derivada ou uma sequência de ARN celular derivada.

Num outro aspeto, a invenção compreende uma construção de vetor de ARN que compreende qualquer uma das sequências de amplificação 5', tal como definido nas reivindicações. Em certas formas de realização, a construção de vetor pode ainda compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica para um promotor de região de junção de alfa virus; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas estruturais de alfa vírus (por exemplo, glicoproteínas El e/ou E2, proteína da cápside (s); etc.); e ou uma sequência de reconhecimento/polimerase de ARN. Além disso, a construção de vetor pode ainda compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador selecionável. Qualquer uma das construções de vetor de ARN aqui descritas podem codificar menos do que todas as proteínas não estruturais do alfa vírus biologicamente ativo. Além disso, qualquer das construções de vetores aqui descritos pode incluir sequências derivadas a partir de mais de um alfa vírus.

Num outro aspeto, a invenção inclui uma construção de vetor de alfa vírus compreende um promotor 5' operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico, em que a referida molécula de ácido nucleico é ADN complementar para os vetores de ARN, tal como definido nas reivindicações. Em certas formas de realização, as construções de vetor podem ainda compreender uma sequência 3' que controla a terminação da transcrição. 0 promotor 5' pode ser um promotor procariota ou eucariótico.

Em ainda outro aspeto, a invenção inclui uma célula compreendendo qualquer uma das construções de vetor de alfa vírus, tal como aqui reivindicado.

Em ainda outro aspeto, a invenção inclui uma linha celular de empacotamento de alfa vírus, que compreende uma célula hospedeira e um ou mais dos vetores de alfa vírus como aqui reivindicados.

Em ainda um outro aspeto, a invenção inclui uma célula auxiliar para a produção de partículas de alfa vírus infecciosas, defeituosas (replicação defeituosa), compreendendo numa célula permissiva para alfa vírus: um vetor de alfa vírus do replicão; e uma ou mais cassetes de expressão separadas (por exemplo, construções auxiliares) que codificam a proteína estrutural de alfa vírus ausente a partir do vetor do replicão, em que pelo menos uma das referidas construções auxiliares separadas compreende uma sequência de amplificação 5' modificada aqui reivindicada e ainda em que a expressão combinada do vetor de replicão e a cassete de expressão da proteína estrutural separada (por exemplo, vetores auxiliares) produz uma partícula de alfa vírus montada que compreende um ou mais sequências heterólogas, capaz de infetar uma célula e incapaz de completar a replicação viral. Em certas formas de realização, a célula auxiliar compreende duas construções de cassetes de expressão de proteína estrutural separadas (por exemplo, construções auxiliares), em que uma primeira cassete de expressão da proteína estrutural ou construção auxiliar codifica uma proteína da cápside de alfa vírus e uma segunda cassete de expressão da proteína estrutural ou construção auxiliar codifica glicoproteínas alfa virus. Uma ou mais das cassetes de expressão de proteína estruturais separadas ou construções auxiliares pode compreender uma sequência de amplificação 5' modificada com um comprimento de entre 10 e 150 nucleótidos. De preferência, a célula auxiliar é transfectada com os vetores de alfa vírus do replicão e as uma ou mais de cassetes expressão de proteínas estruturais separadas e construções auxiliares.

Num outro aspeto, a invenção inclui um método de fazer partículas de alfa vírus infecciosas, defeituosas, (replicação defeituosa), tal como definido nas reivindicações, que compreende: (a) proporcionar uma célula auxiliar, tal como aqui reivindicado; (b) produção de partículas de alfa vírus na célula auxiliar; e (c) recolher as partículas de alfa vírus produzidas a partir da célula auxiliar.

Num outro aspeto, a invenção inclui uma composição tal como definida nas reivindicações, que compreende, partículas de alfa vírus infecciosas, defeituosas para a replicação, produzidas de acordo com qualquer dos métodos aqui descritos, em que a composição está livre de partículas de alfa vírus capazes de replicação detetáveis.

Em ainda outro aspeto, a invenção inclui uma formulação farmacêutica, tal como definido nas reivindicações, que compreende, partículas infecciosas de alfa vírus, defeituosas para a replicação, produzidas por qualquer um dos métodos aqui descritos num veículo farmaceuticamente aceitável.

Em ainda um outro aspeto, a invenção inclui um método de fabrico de qualquer uma das sequências de amplificação 5' modificadas tal como definido nas reivindicações, compreendendo os passos de (a) determinar as regiões de homologia de sequência entre a sequência de amplificação 5' conhecida e um sequência contendo um sinal de empacotamento virai; e (b) alterar a sequência primária da sequência de amplificação 5' conhecida de tal modo que a homologia com a sequência contendo um sinal de empacotamento virai seja reduzida mas a função de amplificação seja retida, fazendo, assim, uma sequência de amplificação 5' modificada. Em certas formas de realização, a sequência de amplificação 5' conhecida é selecionada a partir do grupo consistindo de uma sequência 5' de um alfa vírus nativo, uma extremidade 5' de alfa vírus Dl não nativo, uma sequência virai não-alfa vírus derivada ou uma sequência de ARN celular derivada.

Estes e outros aspetos e formas de realização da invenção serão evidentes após referência à seguinte descrição e várias referências detalhadas aqui definidas que descrevem mais detalhadamente determinados procedimentos ou composições (por exemplo, plasmídeos, sequências, etc.).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é uma representação esquemática de um sistema de construção múltipla para gerar partículas de replicão de alfa vírus. 0 vetor inclui sequências de replicão de extremidade 5' e 3' cis de replicação, genes não estruturais de alfa vírus, promotor da região de junção subgenómica (JR) e um gene heterólogo de interesse (GOI). As cassetes de expressão de proteínas estruturais (auxiliares defeituosas) descritas incluem um sequência de amplificação 5' ARNt-asparagina de ação-cis (tRNAasp ou ARNtAsp) , um promotor da região de junção subgenómica (JR) , sequências de replicação extremidade 3' cis e sequências de codificação de cápside ou glicoproteínas. A Fig. 2 ilustra o alinhamento de uma porção de sinal de empacotamento de Sindbis putativo (SIN) (SEQ ID N°: 1) com uma sequência ARNtAsp 5' (SEQ ID N°: 2) . A linha inferior mostra a sequência de consenso (SEQ ID N°: 3), e mostra uma região de elevada homologia que se estende desde cerca dos nucleótidos 1029-1050 do genoma SIN (N° de acesso GenBank NC001547). A Fig. 3 ilustra o alinhamento de uma sequência de tARN 5' não modificada (SEQ ID N°: 2) com vários sequências exemplares de tARN modificado (SEQ ID N°s: 4-15) . Os nucleótidos que são alterados no que diz respeito a uma sequência de tipo selvagem tARNasp estão sublinhados.

As Figs. 4A e 4B são representações esquemáticas da estrutura secundária formada por sequências de amplificação 5' não modificadas e modificadas. A Fio. 4A mostra a estrutura secundária de tARNasp não modificado (tipo selvagem) (SEQ ID N°: 2) e a Fig. 4B mostra a estrutura secundária de uma sequência de amplificação 5' modificada exemplar, designada por mod# 1 (SEQ ID N° 4).

As Figs. 5A e 5B são gráficos que descrevem o co- empacotamento de construções auxiliares em partículas e que mostram uma sequência de amplificação 5' modificada reduz efetivamente o co-empacotamento de construções auxiliares que compreendem a sequência modificada com efeitos mínimos sobre o rendimento das partículas. A Fig. 5A mostra resultados a uma multiplicidade de infeção 2 (MOI 2) . A Fig. 5B mostra resultados na MOI 4. A Fig. 6 é um gráfico que representa a infectividade de partículas feitas com o uso de cassetes estruturais contendo sequências de amplificação de sequências de tARN quer modificadas (cinza claro) quer não modificadas (cinzento escuro). MOI é mostrado ao longo do eixo horizontal.

DESCRIÇÃO DETALHADA São aqui descritos métodos e composições para a geração de partículas alfa virais (partículas de replicão).

Especificamente, encontram-se descritas sequências de amplificação 5' modificadas. As sequências de amplificação 5' modificadas encontram utilização em construções de proteína estrutural de alfa vírus (por exemplo, construções auxiliares), linhas celulares de empacotamento e semelhantes. A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, biologia molecular, imunologia e farmacologia, dentro da especialidade da técnica. Tais técnicas estão completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods in Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); e Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (DM Weir e CC Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edição, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, KS ed., CRC Press, 1997); Short Protocols in Molecular Biology, 4a ed. (Ausubel et al. Eds., 1999, John Wiley & Sons); Molecular Biology Techniques: An intensive Laboratory Course (Ream et al, eds, 1998, Academic Press.); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2a ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag); Peters e Dalrymple, Fields Virology (ed 2d), Fields et al. (Eds.), Raven Press BN, Nova Iorque, NY.

Tal como é usado nesta descrição e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referências plurais a menos que o conteúdo dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma sequência" inclui duas ou mais dessas sequências.

DEFINIÇÕES

Antes de se descrever a invenção as definições de certos termos que serão utilizados daqui em diante estão definidos.

Um "ácido nucleico" ou molécula de "polinucleótido" pode incluir, mas não está limitado a, sequências de ARN ou ADN procarióticas, mARN eucariótico ou outro ARN, cADN de mARN eucariótico ou outro ARN, sequências de ADN genómico de ADN eucariótico (por exemplo, de mamífero), sequências de ADN ou ARN sintéticas, ARN transcrito a partir de qualquer um dos ADN anteriores e combinações dos anteriores. 0 termo também capta sequências que incluem quaisquer dos análogos de base conhecidos de ADN e ARN e inclui modificações, tais como deleções, adições e substituições (geralmente de natureza conservativa), da sequência nativa. Estas modificações podem ser deliberadas, como por meio de mutagénese dirigida ao local, ou podem ser acidentais. As modificações de polinucleótidos podem ter qualquer número de efeitos incluindo, por exemplo, facilitar a expressão do produto do polipéptido numa célula hospedeira. Um polinucleótido pode incluir ambas as sequências duplas e de cadeia simples e refere-se, mas não se limita a, cADN de ARNm virai, procariótico ou eucariótico, sequências de ARN e ADN genómico a partir de ADN virai (por exemplo, retrovirus e vírus de ARN e de ADN) ou procariótico ou sequências de ADN ou ARN sintéticas. 0 termo também capta sequências que incluem quaisquer dos análogos de base conhecidos de ADN e ARN.

Uma "molécula de ácido nucleico isolada" ou "polinucleótido isolado" refere-se a qualquer polinucleótido que está separado e discreto de um organismo inteiro, com os quais está normalmente associado e/ou que tenha sido removido do seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for que ocorra naturalmente). Por exemplo, um polinucleótido que ocorre naturalmente não é isolado, mas o mesmo polinucleótido separado de alguns ou de todos os materiais coexistentes no sistema natural é isolado. Tal polinucleótido pode fazer parte de um vetor e/ou tal polinucleótido pode fazer parte de uma composição e ainda ser isolado em que o vetor ou composição não faz parte do seu ambiente natural. Exemplos de moléculas de ácidos nucleicos isoladas são aquelas que não são integrados no ADN genómico de um organismo, ou, no caso de um virus, são separados a partir do genoma completo de virus, bem como uma molécula de ácido nucleico sintetizada quimicamente, ou, uma molécula de ácido nucleico que é produzido por técnicas recombinantes (por exemplo, PCR). "ARN subgenómico" refere-se a uma molécula de ARN de um tamanho ou comprimento que é menor do que o ARN genómico a partir do qual foi derivada. 0 ARN subgenómico é transcrito a partir de um promotor interno cujas sequências residem dentro do ARN genómico ou o seu complemento. Em formas de realização preferidas, o ARN subgenómico é produzido a partir de um vetor de construção de alfa virus, o vetor ARN do replicão, ou construção auxiliar defeituosa e codifica uma ou mais proteínas estruturais de alfa vírus ou outras sequências heterólogas de interesse. Geralmente, o ARN subgenómico assemelha-se a um mARN típico com regiões de extremidade 5' e 3' não traduzidas e codificando uma proteína de quadro de leitura aberto.

Tal como aqui utilizada, a frase "construção de vetor" refere-se geralmente a qualquer montagem que é capaz de dirigir a expressão de uma sequência de ácido nucleico (s) ou gene (s) de interesse. A construção de vetor inclui tipicamente um promotor transcricional/estimulador ou o elemento (s) que define o locus, ou outros elementos que controlam a expressão génica por outros meios tais como splicing alternativo, exportação de ARN nuclear, modificação pós-tradução de mensageiro, ou modificação pós-transcrição de proteína. Além disso, a construção de vetor inclui tipicamente uma sequência que, quando transcrita, está operativamente ligado à sequência (s) ou gene (s) de interesse e atua como uma sequência de iniciação da tradução. Por exemplo, o vetor pode conter uma ou mais sequências 5' do promotor (por exemplo, promotores de polimerase de ADN dependente de ARN) que iniciam a síntese, incluindo ambos os promotores derivados de organismos procariotas e eucariotas, por exemplo, β-galactosidase bacteriana e promotores trpE, e vírus eucariótico virai do símio 40 (SV40) (por exemplo, precoce ou tardio), citomegalovírus (CMV) (por exemplo, precoce imediato), promotores do vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) ou do vírus do sarcoma de Rous (RSV) LTR, e do vírus do herpes simples (HSV) (timidina-quinase). A construção de vetor pode também incluir, opcionalmente, um sinal que dirige a poliadenilação, um marcador selecionável, assim como um ou mais locais de restrição e uma sequência de terminação da tradução. Exemplos de construções de vetores incluem vetores ELVIS, que compreendem o complemento de cADN de construções de vetor de ARN, construções de vetores de ARN deles próprios, construções de vetor de alfa vírus, construções de vetor de CMV e semelhantes. "Construção de vetor de alfa vírus" refere-se a uma montagem que é capaz de dirigir a expressão de uma sequência ou gene de interesse. Tais construções de vetores são constituídas por uma sequência 5' que é capaz de iniciar a transcrição de um ARN de alfa vírus (também referida como elementos da sequência 5' conservados de nucleótidos (EFC), ou, sequência de replicação 5' cis, a qual é capaz de iniciar a transcrição de um alfa vírus ARN) , bem como as sequências que, quando expressas, codificam para as proteínas não estruturais de alfa vírus biologicamente ativas (por exemplo, nsPl, nsP2, nsP3, nsP4), uma sequência de reconhecimento de polimerase de ARN de alfa virus (também referidas como 3'CSE, ou, sequência de replicação 3' cis), e, opcionalmente, um trato poliadenilato. Além disso, a construção de vetor pode incluir um promotor de "região de junção" virai subgenómico, sequências de um ou mais genes de proteínas estruturais ou de porções da mesma, molécula (s) de ácido nucleico estranha que são de um tamanho suficiente para permitir a produção de partículas semelhantes a vírus (por exemplo, partículas de replicão), um promotor 5' que é capaz de iniciar a síntese de ARN virai a partir de cADN, in vitro ou in vivo (por exemplo, dentro de uma célula eucariota), uma sequência heteróloga a ser expressa, e um ou mais locais de restrição para a inserção de sequências heterólogas. "Vetor de replicão de alfa vírus ARN", "vetor de replicão ARN", "vetor de replicão" ou "replicão" refere-se a uma molécula de ARN que é capaz de dirigir sua própria amplificação ou autorreplicação in vivo, dentro de uma célula alvo. Para dirigir a sua própria amplificação, a molécula de ARN deve codificar a enzima (s) necessária para catalisar a amplificação de ARN (por exemplo, proteínas não estruturais de alfa vírus nsPl, nsP2, nsP3, nsP4) e também conter sequências cis de ARN necessárias para a replicação que são reconhecidos e utilizadas pelas enzimas codificadas. Um vetor de replicão de ARN do alfa vírus deve conter os seguintes elementos ordenados: sequências 5' virais ou celulares necessárias para a amplificação mediada por proteína não estrutural (também pode ser referido como 5' CSE, ou sequência de replicação 5' cis, ou sequências 5' virais necessárias em cis para a replicação, ou a sequência 5' que é capaz de iniciar a transcrição de um alfa virus), sequências que, quando expressas, codificam proteínas não estruturais de alfa vírus biologicamente ativas (por exemplo, nsPl, nsP2, nsP3, nsP4), e sequências 3' virais ou celulares necessárias para a amplificação mediada por proteína não estrutural (também pode ser referida como 3 'CSE, ou sequências 3' virais necessárias em cis para a replicação, ou uma sequência de reconhecimento da polimerase de ARN de alfa vírus) . 0 vetor de replicão de ARN de alfa vírus pode conter um meio para expressar uma ou mais sequência heteróloga (s) , tais como, por exemplo, um IRES ou um promotor subgenómico virai (por exemplo, alfa virai) (por exemplo, promotor da região de junção), que pode, em certas formas de realização, ser modificado, a fim de aumentar ou reduzir a transcrição virai do fragmento subgenómico, ou diminuir a homologia com o auxiliar defeituoso ou cassetes de expressão de proteínas estruturais, e uma ou mais sequências heterólogas a serem expressas. Um replicão também pode conter sequências adicionais, por exemplo, uma ou mais sequências heterólogas que codifica um ou mais polipéptidos (por exemplo, um gene que codifica a proteína ou um gene proximal 3') e/ou um trato poliadenilato. 0 replicão não deve conter sequências que codificam todas as proteínas estruturais de alfa vírus (capsídeo, El, E2). Exemplos de sequências heterólogas não limitantes que podem ser expressas pelos vetores de replicão estão descritos, por exemplo, na Patente US 6015686, e incluem, por exemplo, antigénios, linfocinas, citoquinas, etc.

Um "sinal de empacotamento" ou "sequência de empacotamento" refere-se a uma sequência de ação cis que está envolvida na incorporação de nucleótidos (por exemplo, ADN genómico ou ARN) em partículas virais (viriões). Os sinais de empacotamento de muitos vírus têm sido descritos. Veja-se, por exemplo, Youil R. et al (2003) Human Gene Therapy 14 (10) :1017-1034,- Beasley BE et al (2002) J. of Virology 76 (10):4950-4960,- Watanabe T. et al (2003) J. of Virology 77 (19) :10575-10583. "Partículas de alfa vírus recombinante" ou "partícula de replicão" refere-se a uma unidade estrutural semelhante ao virião contendo um vetor de replicão de alfa vírus ARN. Geralmente, uma partícula de alfa vírus recombinante compreende uma ou mais proteínas estruturais de alfa vírus, um envelope lipídico e um vetor de replicão ARN. De preferência, a partícula de alfa vírus recombinante contém uma estrutura nucleocápside que está contida dentro de uma bicamada lipídica derivada da célula hospedeira, tal como uma membrana de plasma, em que as glicoproteínas alfa virais codificadas do envelope são incorporadas. A partícula pode também conter outros componentes (por exemplo, elementos de segmentação, outras proteínas estruturais virais, ou outros ligandos de ligação ao recetor) que dirigem o tropismo das partículas a partir das quais o alfa vírus foi derivado. "Cassete de expressão de proteína estrutural de alfa vírus" refere-se a uma construção de vetor que é capaz expressar uma ou mais proteínas estruturais de alfa vírus. A cassete de expressão de proteína estrutural de alfa vírus pode ser uma "construção auxiliar defeituosa" que é capaz de amplificação de ARN ou replicação, e pode expressar uma ou mais proteínas estruturais de alfa vírus, em resposta às proteínas não estruturais de alfa vírus biologicamente ativas fornecidas em trans. A construção auxiliar defeituosa tipicamente contém os seguintes elementos ordenados: uma sequência de amplificação 5' ou replicação cis, uma região de junção do promotor subgenómico virai, sequências que, quando expressas, codificam para uma ou mais proteínas estruturais de alfa vírus biologicamente ativas (por exemplo, C, E3, E2, 6K, El), sequências de amplificação 3' ou replicação cis, e um trato poliadenilato. A construção auxiliar defeituosa também pode conter um promotor 5' que é capaz de iniciar a síntese de ARN virai a partir de cADN, in vitro ou in vivo (por exemplo, numa célula eucariota), uma sequência 3' que controla a terminação da transcrição, sequências de reconhecimento de splice, uma sequência de processamento catalítico da ribozima, uma sequência que codifica um marcador selecionável, e/ou um sinal de exportação nuclear. Uma construção auxiliar defeituosa não deve codificar todas as quatro proteínas não estruturais de alfa vírus funcional.

Os termos sequências 5' virais ou celulares necessários para a amplificação mediada por proteína não estrutural e sequências 5' necessárias para a amplificação mediada por proteína não estrutural e sequências de amplificação e "sequências de amplificação 5'" e sequências "5' CSE" e 5' virais necessárias em cis para a replicação e sequência 5' que é capaz de iniciar a transcrição de um alfa vírus são utilizados indiferentemente para se referir a um elemento funcional que fornece um sítio de reconhecimento em que o vírus ou o vetor derivado de vírus sintetiza ARN de cadeia positiva. Assim, pode ser um complemento da sequência real contida dentro do vírus ou vetor, o que corresponde à extremidade 3' da cópia de RNA de cadeia negativa, que é ligado por replicase do complexo de proteína não estrutural, e fatores da célula hospedeira eventualmente adicionais, a partir da qual a transcrição de ARN de cadeia positiva é iniciada. Uma ampla variedade de sequências tem sido utilizada como sequências de amplificação, incluindo, por exemplo, de regiões não traduzidas da extremidade 5' de alfa vírus (NTR) e outras sequências adjacentes, tais como, por exemplo, através de sequências de nucleótidos 210, 250, 300, 350, 400, ou 450 de um genoma de alfa vírus. Alternativamente, têm sido utilizados por exemplo no caso de vetores Sindbis (SIN), de nucleótidos não-alfa vírus 10-75 para tARN Asparagina (tARNasp) (Schlesinger et ai., Patente US 5091309).

Tal como aqui utilizado, o termo "sequência amplificação 5' modificada" refere-se a um nucleótido (ADN ou ARN) que compreende uma molécula de sequência de amplificação, tal como definido acima, cuja estrutura primária (sequência) foi modificada (por exemplo, substituições, adições, deleções) como comparado com os sinais de amplificação conhecidos, de tal modo que as sequências modificadas são defeituosas como um sinal de empacotamento, mas conservam a sua funcionalidade de amplificação (replicação). Por exemplo, sequências de amplificação modificadas podem incluir reduzida homologia com os sinais de empacotamento ao nível da sequência primária, enquanto a estrutura secundária permanece aquela da sequência de amplificação inicial. Sequências de amplificação modificadas podem ainda incluir sequências adicionais, desde que a estrutura secundária e/ou a capacidade de amplificação de ação cis seja mantida. O termo "gene proximal 3'" refere-se a uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína, a qual está contida dentro de um vetor de replicão, sistema de iniciação de vetor eucariótico em camadas, auxiliar ARN defeituoso ou cassete de expressão de proteína estrutural, e localizado dentro de uma determinada posição em relação ao outro elemento. A posição do do gene proximal 3' deve ser determinada com respeito à sequência 3' necessária para a amplificação mediada por proteína não estrutural (definido acima), em que o gene proximal 3' é a sequência de codificação de proteína 5' (a montante) de, e imediatamente anterior este elemento. 0 termo "promotor subgenómico virai" refere-se a uma sequência de origem de vírus que, em conjunto com a polimerase virai e celular necessária e outros fatores, permite a transcrição de uma molécula de ARN de menos do que o comprimento do genoma. Para um promotor subgenómico de alfa vírus (alfa virai) ou promotor da região de junção subgenómica de alfa vírus (alfa virai), esta sequência é derivada geralmente da região entre os quadros de leitura aberta da proteína não estruturais e estruturais (ORFs) e normalmente controla a transcrição do mARN subgenómico. Tipicamente, o promotor subgenómico de alfa vírus consiste numa sequência do núcleo que proporciona maior catividade associada ao promotor, bem como regiões de flanqueamento (por exemplo, promotor nativo ou prolongado) que aumentam ainda mais a atividade associada ao promotor. 0 promotor subgenómico pode ser um complemento da sequência real contida dentro do vírus ou vetor, que corresponde à região de uma cópia de ARN de cadeia simples e menos que promove a iniciação de transcrição do mARN subgenómico de cadeia positiva. Por exemplo, no caso do protótipo de alfa vírus, o vírus Sindbis, o promotor de região de junção subgenómica normal tipicamente começa aproximadamente no nucleótido número 7579 e continua até pelo menos o nucleótido número 7612 (e, possivelmente, para além). No mínimo, os nucleótidos 7579-7602 são acreditados servir como a sequência núcleo necessária para a transcrição do fragmento subgenómico.

Os termos " sequências 3' virais ou celulares necessárias para a amplificação mediada por proteína não estrutural" ou "sequências 3' necessárias para a amplificação mediada por proteína não estrutural" são usados alternadamente com os termos 3'CSE, ou sequências de replicação 3' cis, ou sequências virais 3' necessárias em cis para a replicação, ou uma sequência de reconhecimento de polimerase de ARN do alfa vírus. Esta sequência é um elemento funcional que fornece um sítio de reconhecimento em que o vírus ou o vetor derivado do vírus começa a replicação (amplificação) por síntese da cadeia de ARN negativa. Uma ampla variedade de sequências pode ser utilizada para esta função. Por exemplo, a sequência pode incluir uma região da extremidade 3' não traduzida de alfa vírus completa (NTR) , tal como, por exemplo, com SIN, que incluem os nucleótidos 11647 a 11703, ou uma região truncada da 3' NTR, que ainda mantém função como uma sequência de reconhecimento (por exemplo, os nucleótidos 11684 a 11703). Ver, por exemplo, a Patente US 6329210. Outros exemplos de sequências que podem ser utilizados neste contexto incluem, mas não estão limitados a, não-alfa vírus ou outras sequências que mantêm uma capacidade funcional semelhante para permitir a iniciação da síntese de ARN de cadeia negativa (por exemplo, sequências descritas em George et ai., (2000) J. Virol. 74: 9776-9785). "Transformação estável" refere-se à introdução de uma molécula de ácido nucleico para dentro de uma célula viva, e manutenção a longo prazo ou permanente dessa molécula de ácido nucleico em células de progénie por ciclos sucessivos de divisão celular. A molécula de ácido nucleico pode ser mantida em qualquer compartimento celular, incluindo, mas não limitado a, núcleo, mitocôndria, ou citoplasma. Em formas de realização preferidas, a molécula de ácido nucleico é mantida no núcleo. A manutenção pode ser intracromossómica (integrada) ou extracromossómica, tal como um evento epissomal. "Linha celular de empacotamento de alfa vírus" refere-se a uma célula que contém uma cassete de expressão de proteína estrutural de alfa vírus e que produz partículas de alfa vírus recombinantes após a introdução de uma construção de vetor de alfa vírus, vetor de replicão ARN, sistema de iniciação de vetor eucariótico em camadas (por exemplo, Patente US 5814482), ou partícula de alfa vírus recombinante. A célula parental pode ser de origem de mamíferos ou de não mamíferos. Nas concretizações preferidas, a linha celular de empacotamento é estavelmente transformada com a cassete de expressão da proteína estrutural. "Operacionalmente ligado" refere-se a um arranjo de elementos em que os componentes assim descritos estão configurados de modo a realizarem a sua função habitual. Assim, um dado promotor operativamente ligado a uma sequência codificante é capaz de efetuar a expressão da sequência codificante quando as enzimas adequadas estiverem presentes. 0 promotor não necessita de ser contíguo à sequência de codificação, desde que funcione para dirigir a sua expressão. Assim, por exemplo, sequências intervenientes não traduzidas mas transcritas podem estar presentes entre a sequência promotora e a sequência de codificação e a sequência promotora pode ainda ser considerada "operacionalmente ligada" à sequência de codificação.

Duas ou mais sequências de polinucleótidos podem ser comparadas por determinação da sua "percentagem de identidade". Duas ou mais sequências de aminoácidos podem igualmente ser comparadas por determinação da sua "percentagem de identidade". A percentagem de identidade de duas sequências, quer sequências de ácido nucleico ou de péptidos, é geralmente descrita como o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento da sequência mais curta e multiplicado por 100. Um alinhamento aproximado para sequências de ácidos nucleicos é fornecido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo pode ser alargado ao uso com as sequências de péptidos utilizando a matriz de pontuação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, MO Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Foundation Biomedical Research, Washington, DC, EUA e normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14 (6):6745-6763 (1986). Uma execução deste algoritmo para sequências de ácidos nucleicos e péptidos é fornecido por Genetics Computer Group (Madison, WI) na sua aplicação de utilidade BestFit. Os parâmetros por defeito para este método são descritos em Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Versão 8 (1995) (disponível a partir de Genetics Computer Group, Madison, WI) . Outros programas igualmente adequados para calcular a percentagem de identidade ou de similaridade entre sequências são geralmente conhecidos na técnica.

Por exemplo, a percentagem de identidade de uma sequência de nucleótidos particular, a uma sequência de referência pode ser determinada utilizando o algoritmo de homologia de Smith e Waterman com uma tabela de pontuação padrão e uma penalidade de lacuna de seis posições de nucleótidos. Um outro método de determinação da percentagem de identidade no contexto da presente invenção é a utilização do pacote MPSRCH de programas com direitos de autor pela Universidade de Edimburgo, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuídos por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) . A partir deste conjunto de pacotes, o algoritmo de Smith-Waterman pode ser empregue onde os parâmetros padrão são usados para a tabela de pontuação (por exemplo, penalidade de lacuna aberta de 12, penalidade de extensão de lacuna de um, e uma diferença de seis) . A partir dos dados gerados, o valor "Match" reflete a "identidade de sequência". Outros programas adequados para calcular a percentagem de identidade ou de similaridade entre sequências são geralmente conhecidos na técnica, tal como o programa de alinhamento BLAST, o qual também pode ser usado com os parâmetros por defeito. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados com os seguintes parâmetros: padrão código genético = standard; filtro = nenhum; cadeia = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; ordenar por = pontuação elevada; Bases de dados = não-redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções GenBank CDS + proteína + Swiss Spupdate + PIR. Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço da Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Um perito na técnica pode prontamente determinar os parâmetros de pesquisa adequados a utilizar para uma dada sequência de programas acima. Por exemplo, os parâmetros de pesquisa podem variar de acordo com o tamanho da sequência em questão. Assim, por exemplo, uma forma de realização representativa da presente invenção incluem um polinucleótido isolado possuindo X nucleótidos contíguos, em que (i) os nucleótidos contíguos X têm pelo menos cerca de 50% de identidade de nucleótidos contíguos Y derivados de qualquer das sequências aqui descritas, (ii) X é igual a Y, e (iii) X é maior do que ou igual a 6 nucleótidos e até 5000 nucleótidos, de preferência iguais ou superiores a 8 nucleótidos e até 5000 nucleótidos, mais preferivelmente 10-12 nucleótidos e até 5000 nucleótidos, e ainda mais preferivelmente 15-20 nucleótidos, até o número de nucleótidos presentes nas sequências de comprimento completo aqui descritos (por exemplo, ver a Listagem de Sequências e reivindicações), incluindo todos os valores inteiros que caem dentro das gamas acima descritas.

Dois fragmentos de ácido nucleico são considerados "hibridar seletivamente", tal como aqui descrito. O grau de identidade de sequências entre duas moléculas de ácido nucleico afeta a eficácia e a força de eventos de hibridação entre estas moléculas. Uma sequência de ácido nucleico idêntica parcialmente irá inibir, pelo menos parcialmente, uma sequência completamente idêntica de hibridar com uma molécula alvo. A inibição da hibridação da sequência completamente idêntica pode ser avaliada utilizando ensaios de hibridação que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, Southern blot, Northern blot, solução de hibridação, ou semelhantes, ver Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, (1989) Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Tais ensaios podem ser realizados utilizando vários graus de seletividade, por exemplo, utilizando diferentes condições de baixo a elevado rigor. Se forem empregues condições de baixo rigor, a ausência de ligação não especifica pode ser avaliada utilizando uma sonda secundária, que carece ainda de um grau parcial de identidade de sequência (por exemplo, uma sonda possuindo menos do que cerca de 30% de identidade de sequência com a molécula alvo), de tal modo que, na ausência de acontecimentos de ligação não específicos, a sonda secundária não irá hibridar com o alvo.

Quando se utiliza um sistema de deteção com base em hibridação, é escolhida uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de ácido nucleico alvo, e, em seguida, por seleção das condições adequadas a sonda e a sequência alvo "hibridam seletivamente", ou se ligam, uma à outra para formar uma molécula híbrida. Uma molécula de ácido nucleico que é capaz de hibridar seletivamente com uma sequência alvo em condições "moderadamente rigorosas" tipicamente híbrida sob condições que permitem a deteção de uma sequência de ácido nucleico alvo de pelo menos cerca de 10-14 nucleótidos de comprimento, possuindo pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com a sequência da sonda de ácido nucleico selecionada. As condições de hibridação rigorosas tipicamente permitem a deteção de sequências de ácido nucleico alvo de pelo menos cerca de 10-14 nucleótidos de comprimento possuindo uma identidade de sequência maior do que cerca de 90-95% com a sequência da sonda de ácido nucleico selecionada. As condições de hibridação úteis para a sonda /alvo de hibridação em que a sonda e o alvo têm um determinado grau de identidade de sequência, podem ser determinadas como é conhecido na técnica (ver, por exemplo, Nucleic Acid Hybridization: A Praticai Approach, editores BD Hames e Higgins SJ, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press) .

No que diz respeito às condições de restringência de hibridação, é bem conhecido na técnica que numerosas condições equivalentes podem ser utilizadas para estabelecer um rigor particular, variando, por exemplo, os seguintes fatores: o comprimento e a natureza das sequências da sonda e do alvo, a composição de base de as várias sequências, as concentrações de sais e outros componentes da solução de hibridação, a presença ou ausência de agentes de bloqueio nas soluções de hibridação (por exemplo, formamida, sulfato de dextrano, e polietileno glicol), a temperatura da reação de hibridação e parâmetros de tempo, bem como, variação das condições de lavagem. A seleção de um conjunto particular de condições de hibridação é selecionada de acordo com métodos padrão na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, (1989) Cold Spring Harbor, Nova Iorque). 0 termo "estrutura secundária" refere-se à conformação (estrutura secundária ou terciária) de um polinucleótido. Por exemplo, as moléculas de ARN de cadeia simples geralmente adotam estruturas secundárias, tais como estruturas de grampos, hastes e laços e semelhantes. A estrutura secundária de qualquer polinucleótido pode ser prevista a partir da sequência primária utilizando uma série de algoritmos, por exemplo o pacote MFOLD para o ARN e a previsão da estrutura secundária do ADN, tal como descrito em Zucker et ai. "Algorithms and thermodynamics for RNA secondary structure prediction: a praticai guide", disponível na internet. 0 termo "derivado" é utilizado para identificar a fonte alfa virai da molécula (por exemplo, polinucleótido, polipéptido). Um primeiro polinucleótido é "derivado de" um segundo polinucleótido desde que tenha a mesma ou substancialmente a mesma sequência de pares de bases que uma região do segundo polinucleótido, o seu cADN, os seus complementos, ou se ele exibe identidade de sequência, tal como descrito acima ou, se ele codifica um polipéptido que é o mesma ou substancialmente o mesma do um polipéptido codificado pelo segundo polinucleótido. Assim, um polinucleótido é "derivado de" um alfa vírus particular (por exemplo, espécies) se tem (i) a mesma ou substancialmente a mesma sequência que, pelo menos, uma porção da sequência do alfa vírus particular, ou (ii) codifica um polipéptido que exibe identidade de sequência (por exemplo, maior do que 50% da percentagem de identidade, tal como descrito acima) para qualquer dos polipéptidos deste alfa vírus, tal como descrito acima. Assim, as sequências aqui descritas podem ser derivadas de um ou mais alfa vírus (SIN, VEE, SFV, etc.), que pode ser facilmente obtido, dada a descrição aqui fornecida a partir de fontes que ocorrem naturalmente, ou a partir de depósitos (por exemplo, a American Type Culture Collection, Rockville, Maryland). Exemplos representativos de alfa vírus adequados são descritos em mais detalhe na Patente US 5843723 e WO 97/38087. "Elementos de controlo" típicos incluem, mas não estão limitados a, promotores de transcrição, elementos intensificadores, sinais de transcrição de terminação da transcrição, sequências de poliadenilação (localizado a 3' do codão de paragem da tradução), sequências para otimização da iniciação da tradução (localizado a 5' da sequência de codificação), sequências de terminação da tradução, sequência 5' necessária para a amplificação mediada pela proteína não estrutural, sequência 3' necessária para a amplificação mediada por proteína não estrutural, e meios para expressar uma ou mais sequências heterólogas (por exemplo, promotor da região de junção subgenómico), ver por exemplo, McCaughan et ai. (1995) PNAS EUA 92:5431-5435; Kochetov et al (1998) FEBS Letts. 440: 351-355. "Sistema de iniciação do vetor eucariótico em camadas" refere-se a um polinucleótido que compreende uma montagem que é capaz de dirigir a expressão de uma sequência ou gene de interesse. O sistema de iniciação de vetor eucariótico em camadas deve conter o promotor 5' que é capaz de iniciar in vivo (ou seja, dentro de uma célula eucariota) a síntese de ARN a partir de cADN e uma sequência de vetor de ácido nucleico (por exemplo, vetor virai) que é capaz de dirigir a sua própria replicação numa célula eucariótica e expressar também uma sequência heteróloga. De preferência, a sequência do vetor de ácido nucleico é uma sequência derivada de alfa vírus e é composta por sequências 5' virais ou celulares necessárias para a amplificação mediada por proteína não estrutural (também referida como 5' CSE, ou sequência de replicação 5' cis, ou sequências 5' virais necessárias em cis para a replicação, ou a sequência 5' que é capaz de iniciar a transcrição de um alfa vírus), bem como as sequências que, quando expressas, codificam proteínas não estruturais de alfa vírus biologicamente ativo (por exemplo, nsPl, nsP2, nsP3, nsP4), e sequências 3' virais ou celulares necessárias para a amplificação mediada por proteína não estrutural (também referido como 3' CSE, ou sequências 3' virais necessárias em cis para a replicação, ou uma sequência de reconhecimento de polimerase de ARN de alfa vírus) . Além disso, a sequência do vetor pode incluir um meio de expressar a sequência heteróloga, tais como, por exemplo, um promotor subgenómico virai (por exemplo, alfa virai) (por exemplo, promotor da região de junção), que pode, em certas concretizações, ser modificada a fim para prevenir, aumentar, ou reduzir a transcrição virai do fragmento subgenómico, ou para diminuir a homologia com o auxiliar defeituoso ou cassetes de expressão de proteínas estruturais, e uma ou mais sequência heteróloga a ser expressa. De preferência, a sequência heteróloga compreende um gene que codifica a proteína e o referido gene é o gene proximal 3' dentro da sequência do vetor. 0 sistema de iniciação de vetor de camada eucariótica pode também conter uma sequência de poliadenilação, sequências de splice de reconhecimento, uma sequência de ribozima catalítico de processamento, um sinal de exportação nuclear, e uma sequência de terminação da transcrição. De preferência, o sistema de iniciação de vetor de camada eucariótica contém sequências que codificam todas as proteínas estruturais de alfa vírus (capsídeo, E2 e El) . Um "híbrido" ELVIS refere-se a uma montagem que inclui sequências de polinucleótidos derivados de dois ou mais alfa vírus.

Como discutido em mais detalhe abaixo, a presente invenção inclui, mas não está limitada a, sequências de comando adequadas para utilização nas construções de alfa vírus; construções compreendendo essas sequências; linhas celulares de empacotamento; métodos de empacotamento de partículas de alfa vírus recombinantes; métodos de supressão de co-empacotamento durante o empacotamento do vetor.

PANORAMA. GERAL A presente invenção refere-se a sequências de amplificação 5' modificadas para utilização na geração de partículas de alfa vírus, com base em sequências específicas que foram modificadas para utilização em cassetes de expressão de proteínas estruturais. As sequências de amplificação 5' modificadas aqui descritas reduzem eventos de co-empacotamento durante a geração de partículas de replicão de alfa vírus e, por conseguinte, encontram utilização no empacotamento de linhas celulares, e métodos de produção de partículas de replicão de alfa vírus.

Atualmente, as partículas de replicão de alfa vírus são tipicamente geradas usando um sistema de multi-construção que separa os diferentes elementos necessários para a formação de partículas. A separação destes elementos em diferentes construções reduz o risco de produção de vírus infeccioso do tipo selvagem. Os sistemas incluem tipicamente um vetor de replicão, que contém os elementos necessários para a sua própria replicação intracelular (por exemplo, sequências de codificação de proteína não estrutural), mas não possui os elementos necessários para a produção de partículas de progénie (por exemplo, sequências que codificam proteínas estruturais), e uma ou mais cassetes de expressão da proteína estrutural (por exemplo, construções auxiliares defeituosas) que codificam as proteínas estruturais (por exemplo, cápside, glicoproteínas), necessárias para o empacotamento. As construções de replicão e as construções auxiliares defeituosas podem ser baseadas em ADN e/ou ARN. Ver, por exemplo, Polo et al. (1999) Proc. Acad. Sei EUA 96:4598-4603; Patentes US 6465634; 6426196; 6376236; 6342372; 6015686; e 5843723.

Como representado na Fig. 1, duas construções auxiliares defeituosas podem ser usadas para fornecer os genes estruturais para o empacotamento do replicão ARN. A utilização de dois auxiliares defeituosos separados pode ser preferível, como o risco de gerar vírus competentes para a replicação (VN) ser reduzido. Ver, por exemplo, a Patente US 426.196. As construções auxiliares contêm elementos cis necessários para a sua própria amplificação pelo não-estrutural produzida em trans e para a expressão dos genes de proteínas estruturais, mas não possuem os genes de proteína estrutural de alfa vírus. Para reduzir o co-empacotamento de auxiliares nas partículas de replicão, o sinal de empacotamento de alfa vírus que atua em cis é (são) também tipicamente excluído da construção auxiliar. O co-empacotamente refere-se tanto à geração de partículas que contêm um ou mais ARNs auxiliares mas nenhumas construções de replicão ARN (também referido como "partículas" abortivas), bem como para a produção de partículas que contêm uma ou mais sequências auxiliares em adição às sequências do replicão. Ambas as formas de co-empacotamento são indesejáveis. Em particular, a presença de partículas abortivas pode interferir com a infecciosidade das partículas de replicão, reduzindo eficazmente a eficiência de infeção das partículas. Da mesma forma, o co-empacotamento de sequências de replicão e auxiliares podem resultar na produção de novas partículas, por infeção de células ingénuas e estas partículas podem se comportar mais como um vírus competente para replicação (VN), incluindo os efeitos indesejáveis do vírus. Vários elementos cis envolvidos na replicação (isto é, sequências de amplificação 5') podem ser incorporados em construções auxiliares defeituosas, incluindo, por exemplo, sequências 5' de alfa virus nativo (tipo selvagem) de virus homólogo, sequências 5' de alfa virus nativo de virus heterólogo, sequências 5' de alfa virus defeituoso não nativo interferente (Dl) de virus homólogo, sequências 5' de alfa virus Dl não nativo de virus heterólogo, sequência virai de não-alfa virus derivado (por exemplo, togavirus, virus de plantas), e sequências celulares de ARN derivadas (por exemplo, elemento de tARN) (por exemplo, Monroe et ai, PNAS 80:3279-3283, 1983; Niesters et ai., J. Virol. 64: 4162-4168, 1990; Niesters et ai., J. Virol. 64:1639-1647, 1990; Tsiang et ai. (1988) J Virol. 62 (1):47-53).

Embora estas sequências de amplificação 5' possam servir para mediar a replicação, cada uma das sequências de amplificação 5 ' , incluindo sequências não-alfa virus derivados, tais como sequências tARNasp, também podem apresentar efeitos de co-empacotamento indesejáveis. Ver, por exemplo, Bredenbeek et ai. (1993) J. Virol 67:6439-6446; Tsaing et ai. (1985) J. Virol. 54:38-44. São aqui descritos métodos e composições que reduzem ou eliminam o empacotamento de sequências indesejadas em partículas de replicão de alfa vírus, enquanto, ao mesmo tempo, permitem uma replicação eficiente dos vetores de alfa vírus. A este respeito, os presentes inventores descobriram que as sequências tipicamente utilizadas como sinais de replicação para as cassetes de proteínas estruturais de alfa vírus que são usados no empacotamento de partículas de replicão de alfa vírus contêm frequentemente sequências que podem indesejavelmente servir como sinais de empacotamento. Especificamente, verifica-se que a estrutura primária (sequência) da sequência de amplificação 5' desempenha um papel no co-empacotamento indesejado, mas não nas funções de replicação desejáveis (amplificação) que são principalmente dependentes da estrutura secundária da mesma região. (Figs. 4A e 4B) . Através da conceção de uma molécula que mantém uma estrutura secundária que é caracteristica de sequências de amplificação funcionais, mas elimina a homologia da sequência primária para sinais de empacotamento conhecidos, a presente invenção permite novas composições e métodos que de forma eficaz e eficiente realizam a replicação das proteínas estruturais de construções auxiliares necessárias para o empacotamento de alfa vírus e reduzem ou eliminam o co-empacotamento das construções auxiliares. Além disso, as construções auxiliares compreendendo as sequências de amplificação 5' modificadas aqui descritas produzem partículas de replicão com infectividade maior do que os produzidos com construções auxiliares, incluindo sequências contendo tARN. (Fig. 6).

SEQUÊNCIAS DE AMPLIFICAÇÃO 5' MODIFICADAS

As sequências de amplificação 5' modificadas aqui descritas são sequências que são sequências de amplificação funcionais mas essencialmente incapazes de servir como sinais de empacotamento. Assim, a sequência em particular das sequências de amplificação 5' modificadas aqui descritas podem variar grandemente, desde que sejam essencialmente incapazes de servir como sinais de empacotamento e funcionais como sinais de amplificação (replicação).

As sequências de amplificação 5' modificadas, aqui descritas têm entre 10 e 150 nucleótidos de comprimento (ou qualquer comprimento entre os mesmos), mais preferivelmente entre cerca de 30 e 100 nucleótidos de comprimento (ou qualquer comprimento entre os mesmos) , e ainda mais preferencialmente entre cerca de 40 e 80 nucleótidos em comprimento (ou qualquer comprimento entre os mesmos).

Em geral, a produção de sequências 5' modificadas envolve tanto a sequência como a análise estrutural de um polinucleótido. Tipicamente, o processo inicia-se através da comparação da sequência primária de uma sequência de amplificação 5' conhecida (por exemplo, tARNasp) para sinais de empacotamento conhecidos. As sequências de amplificação 5' que atuam em cis aqui descritas podem ser derivadas a partir de qualquer número de fontes, por exemplo, a partir de sequências 5' de alfa virus nativo a partir de qualquer virus, extremidade 5' de alfa virus nativo de virus heterólogo, extremidade 5' de alfa virus Dl não nativo de virus homólogo, extremidade 5' de alfa virus Dl não nativo de virus heterólogo, sequência virai de não-alfa virus derivado (por exemplo, togavirus, virus de plantas), e sequência celular de ARN derivado (por exemplo, elemento de tARN) (por exemplo, Monroe et ai, PNAS 80: 3279-3283, 1983; Niesters et ai., J. Virol. 64:4162-4168, 1990; Niesters et ai., J. Virol. 64:1639-1647, 1990). As sequências destes e de outras sequências de amplificação 5' funcionais e sinais de empacotamento são conhecidos e publicamente disponíveis em qualquer base de dados.

Assim, o processo de obtenção de uma sequência de amplificação 5' modificada com uma estrutura secundária pré-determinada pode começar por análise de sequências de amplificação 5' conhecidas. Sequências dentro de sequências de amplificação 5', que funcionam como sinais de empacotamento podem ser identificadas por quaisquer meios adequados, por exemplo, por alinhamento com sinais de empacotamento conhecidos para determinar as regiões de elevada homologia. Por exemplo, como mostrado na Fig. 2, os nucleótidos 37-58 da sequência conhecida tARN-asp (Monroe et al. (1983) Proc. Acad. Sei EUA 80:3279-3282) exibem uma homologia significativa (> 80%) dos nucleótidos 1029-1050 de Sindbis (SIN) (número de acesso GenBank NC 001.547, Strauss et al. (1984) Virol 133:92-110), cujos nucleótidos são conhecidos por estarem envolvidos no empacotamento. É para ser entendido que o tipo selvagem SIN é utilizado apenas para fins de exemplificação de aspetos da invenção e que qualquer sequência de sinal de empacotamento pode ser escolhida para comparação.

Uma vez identificados, os sinais de empacotamento podem ser feitos defeituosos por quaisquer meios adequados, por exemplo, através da alteração da sequência primária da amplificação de sinal 5', de modo a diminuir a homologia com sinais de empacotamento conhecidos. (Exemplo 1) . As sequências podem ser alterados por mutagénese, substituição, inserção e/ou deleção de um ou mais nucleótidos de modo a que a sequência primária não funcione como um sinal de empacotamento. O grau de homologia a nível de sequência primária entre as sequências não modificadas e modificadas pode variar muito, desde que o sinal de empacotamento seja defeituoso. Por exemplo, nas regiões identificadas como sinais de empacotamento putativos, a homologia, ao nível da sequência primária, como entre as sequências modificadas e não modificadas pode ser tanto quanto 99%, embora seja de preferência entre cerca de 90% e 99% ou entre cerca de 90% e 95%, mais preferencialmente menos do que cerca de 90%, mais preferencialmente menos do que 80% e ainda mais preferencialmente menos do que 70% de homologia com as regiões com o mesmo comprimento de um sinal de empacotamento conhecido. Por exemplo, como mostrado na Fig. 3, sequências de amplificação 5' modificadas exemplares (SEQ ID N°s: 4-16) foram geradas por modificação da região de tARN-asp que exibiu homologia para o sinal de empacotamento de SIN de tipo selvagem, de tal modo que a homologia na região é grandemente reduzida (por exemplo, a partir de mais do que 80% e menos de 70% em todos os casos e inferior a 40%, em alguns casos (por exemplo, ID SEQ N°s: 4, 11, 14 e 15)) . Enquanto as sequências na Fig. 3 são mostradas como sequências de ADN, será evidente que, para uso em vetores baseados no ARN as sequências são substituídas pelos resíduos correspondentes de ARN, ou seja, T é substituído por U.

As modificações para a sequência primária são de preferência feitas de modo a que a estrutura secundária do polinucleótido permaneça substancialmente semelhante à sequência de amplificação 5' inalterada. Como notado acima, moléculas de ácidos nucleicos de cadeia simples (por exemplo, ARN) comumente adotam uma estrutura secundária, tais como estruturas de grampos, haste e laço e semelhantes. As técnicas para a previsão da estrutura secundária de qualquer sequência de ácido nucleico dado estão prontamente disponíveis e são descritas, por exemplo, em Zucker et ai. "Algorithms and Thermodynamics for RNA secondary structure prediction: a praticai guide" e Macke et al. (2001) Nucleic Acids Res 29 (22):4724-4735.

Assim, as mutações são introduzidas em sequências putativas de sinal de empacotamento para gerar sequências possuindo uma sequência primária diferente, mas tendo uma estrutura secundária das sequências de amplificação 5' conhecidas (por exemplo, estrutura secundária de tARNasp como mostrado na Fig. 4A) .

Alternativamente, as sequências de amplificação 5' modificadas aqui descritas podem ser sequências sintéticas geradas para ter uma estrutura secundária semelhante às sequências de amplificação conhecidas.

Portanto, embora os modificados sequências de amplificação 5' aqui descritas formem estruturas secundárias caracteristicas de sequências de amplificação 5' que atuam em cis, que são defeituosas como sinais de empacotamento, presumivelmente devido à diminuição da homologia com sinais de empacotamento conhecidas ao nivel da estrutura primária.

Em certas formas de realização, sequências de amplificação 5' modificadas, tal como aqui divulgado, contêm modificações adicionais em regiões fora do sinal de empacotamento. As sequências de amplificação 5' modificadas aqui descritas podem ser utilizadas na produção de construções auxiliares defeituosas, linhas de células de empacotamento e semelhantes. COMPONENTES ADICIONAIS DE CASSETES DE PROTEÍNA ESTRUTURAL (POR EXEMPLO, CONSTRUÇÕES AUXILIARES)

Em certos aspetos, as sequências de amplificação 5' modificadas aqui descritas formam parte de uma cassete de proteína estrutural ou construção auxiliar defeituosa.

Assim, em adição às sequências de de amplificação 5' modificadas, as construções auxiliares aqui descritas inclui, tipicamente, uma variedade de sequências de ácidos nucleicos, ambas as sequências codificantes e não-codificantes. Será evidente que as composições aqui descritas compreendem geralmente menos do que um genoma completo de alfa virus (por exemplo, contêm menos do que todas as sequências codificantes e/ou de não-codificantes contidas num genoma de um alfa virus) num polinucleótido.

As construções auxiliares compreendendo uma sequência de de amplificação 5' modificada como aqui descrito tipicamente incluem também um ou mais sequências de codificação para vários polipéptidos de alfa virus, por exemplo, um ou mais polipéptidos de alfa virus estruturais (por exemplo, cápside, glicoproteina de envelope). Proteínas estruturais envolventes (e em alguns casos, interagindo com) do replicão de alfa vírus ou componente (s) do vetor de polinucleótido incluem tanto a cápside como glicoproteínas de envelope. Ver, por exemplo, Strauss et ai. (1994) Microbiol. Rev., 58:491-562. Na maioria dos casos, o componente (s) do polinucleótido está rodeado por proteína (s) da cápside, que formam as nucleocápsides. Por sua vez, a proteína da nucleocápside está rodeada por um envelope lipídico contendo a proteína (s) de envelope. A proteína da cápside é a proteína do terminal N da poliproteína estrutural de alfa vírus e, após processamento da poliproteína, interage com o ARN do alfa vírus contendo o sinal de empacotamento e outros monómeros da proteína da cápside de modo a formar estruturas de nucleocápside. Glicoproteínas de envelope de alfa vírus (por exemplo, E2, El) emergem a partir da superfície das partículas envelopadas como "picos", que são funcionalmente envolvidos na ligação ao recetor e entram na célula alvo.

As sequências adicionais podem ser de codificação ou de não codificação. Exemplos não limitantes de sequências não-codificantes incluem um meio para a expressão do gene proximal 3' (elementos de controlo, tais como promotores e semelhantes, por exemplo, um promotor nativo de alfa virus subgenómico do virus homólogo, um promotor nativo de alfa virus subgenómico do virus heterólogo, promotor do núcleo alfa virus subgenómico (homólogo ou heterólogo), sequências mínimas a montante ou a jusante do núcleo do promotor subgenómico, mutações/exclusões/adições do núcleo ou do promotor subgenómico nativo, um promotor subgenómico compatível de não-alfa vírus derivado (por exemplo, vírus de plantas), um local de entrada de ribossoma interno (IRES), e/ou um elemento de leitura ribossomal (por exemplo, BIP); região não-traduzida da extremidade 5' de mARN subgenómico (5' NTR subgenómico), um ou mais sequências 5' ou 3' adicionais necessárias para amplificação mediada por proteínas não estruturais (Patentes US 5843723; 6015694; 5814482; Publicações WO 97/38087; WO 00/61772), um gene proximal 3' (por exemplo, uma sequência heteróloga, sequência de codificação de polipéptido). Veja-se, também, Kuhn et ai. (1990) J. Virol. 64:1465-1476); e/ou uma sequência de poliadenilação (por exemplo, dentro das sequências 3', ver, por exemplo, George et al. (2000) J. Virol. 74:9776-9785).

As sequências codificantes e não codificantes utilizadas nas construções auxiliares aqui descritas podem incluir sequências derivadas de um ou mais alfa vírus e/ou de fontes não-alfa virais (por exemplo, alfa vírus, togavírus, vírus de plantas). Geralmente, enquanto a numeração do nucleótido e do aminoácido é um pouco diferente entre alfa vírus, principalmente devido a pequenas diferenças em comprimentos da poliproteína, os alinhamentos de ou entre as sequências de diferentes alfa vírus fornece um meio para identificar regiões similares em outros alfa vírus (ver um alinhamento representativo em Kinney et al. (1989) Virology 170:19-30 e Strauss et al. (1984) Virol 133:92-110 para um genoma SIN de tipo selvagem exemplar de 11703 nucleótidos de comprimento, com o qual qualquer outro genoma de alfa vírus pode ser alinhado). Em certas formas de realização, as construções auxiliares incluem sequências derivadas a partir de dois ou membros do género de alfa vírus. Algumas das sequências de alfa vírus aqui descritas são descritas em maior detalhe na Publicação WO 02/099035.

Além disso, uma ou mais das sequências de construções auxiliares podem incluir uma ou mais modificações, em comparação com o tipo selvagem. Modificações das sequências codificantes de alfa vírus podem incluir, mas não estão limitadas a mutações do nucleótido, deleções, adições ou substituições de sequências, no todo ou em parte, tal como, por exemplo, proteínas híbridas não estruturais compreendendo sequências a partir de um ou mais alfa vírus e/ou outro vírus (por exemplo, alfa vírus, outro togavírus, vírus de plantas).

LINHAS CELULARES DE EMPACOTAMENTO DE ALFA VÍRUS

Ainda em outras formas de realização da invenção, são fornecidas linhas celulares de empacotamento de alfa vírus. Em particular, num aspeto da presente invenção, são proporcionadas linhas celulares de empacotamento de alfa vírus em que as proteínas estruturais alfa virais, fornecidas em trans a partir de um ou mais vetores de expressão que transportam uma ou mais sequências de amplificação 5' modificadas, tal como definido nas reivindicações, que são, de preferência estavelmente integradas, são capazes de encapsidar transcritos do vetor de ARN transfectados, transduzidos, ou intracelularmente produzidos no citoplasma e libertar partículas de vetor de replicão infecciosas empacotadas através da membrana da célula, criando assim uma linha celular que produz o vetor de alfa vírus (empacotamento) (PCL).

Por exemplo, são proporcionadas linhas celulares de empacotamento de alfa vírus em que as proteínas estruturais virais são fornecidas em trans a partir de um ou mais vetores de expressão estavelmente transformados (cassetes de expressão de proteína estrutural), tal como aqui descrito (por exemplo, incluindo uma sequência de amplificação 5' modificada), e são capazes para encapsidar transcritos do vetor de ARN transfectados, transduzidos, ou intracelularmente produzidos no citoplasma e libertar partículas de vetor infecciosas empacotadas através da membrana celular. Em certas formas de realização, as proteínas estruturais necessárias para o empacotamento são sintetizadas em níveis elevados apenas após a indução pelo próprio replicão do vetor de ARN ou algum outro estímulo fornecido, e os transcritos que codificam estas proteínas estruturais são capazes de amplificação citoplasmática de uma maneira que permita os níveis de expressão suficiente para imitar os de uma infeção virai natural. Além disso, em outras formas de realização, a expressão de um marcador selecionável está operacionalmente ligado à cassete de expressão da proteína estrutural. Tal marcador selecionável ligado permite a geração eficiente de PCL funcional, estavelmente transformado.

Por exemplo, moléculas do vetor de replicão de alfa vírus de ARN do fenótipo desejado a ser empacotado, que são eles próprios capazes de replicação autocatalítica (por exemplo, o replicão contém todos os elementos (cis e trans) necessários para a replicação nas células permissivas) no citoplasma de células, pode ser introduzido nas células de empacotamento como ARN transcrito in vitro, partículas de alfa vírus recombinantes, ou como construções de vetores de alfa vírus cADN. As moléculas do vetor do replicão de ARNA então replicam para níveis elevados, estimulam a amplificação da transcrição do gene estrutural da proteína (s) e subsequente expressão da proteína estrutural, e são subsequentemente empacotadas pelas proteínas virais estruturais, produzindo partículas de vetor infecciosas. A expressão intracelular de proteínas de alfa vírus e/ou vetor de ARN acima de certos níveis pode resultar em efeitos citotóxicos no empacotamento ou linhas celulares produzidas. Assim, dentro de certas formas de realização da invenção, pode ser desejável para estes elementos serem derivados a partir de variantes do vírus selecionados para a citotoxicidade reduzida das suas proteínas estruturais expressas, reduzida a inibição da síntese macromolecular do hospedeiro, e/ou a capacidade de estabelecer uma infeção persistente.

Para otimizar o desempenho da linha celular de empacotamento do vetor e do título final do vetor, podem ser realizados ciclos sucessivos de transferência de genes e empacotamento do vetor, como descrito em detalhe na Patente US 6391632. Da mesma forma, podem ser produzidos PCLs usando a expressão do vetor de ADN estavelmente integrada ou mantida epissomicamente, tal como descrito em detalhe na Patente US 6391632.

Moléculas de vetor de ARN de alfa vírus, capazes de se replicarem no citoplasma da célula de empacotamento, podem ser inicialmente produzidas utilizando, por exemplo, um sistema de polimerase SP6 ARN para transcrever in vitro um clone dum vetor de cADN que codifica o gene de interesse num vetor de replicão de alfa vírus contendo proteínas não estruturais funcionais. Os transcritos do vetor de ARN são então transfectados para a linha celular de empacotamento de alfa vírus, de tal modo que o vetor de ARN se replica em níveis elevados, e é subsequentemente empacotado pelas proteínas virais estruturais, produzindo partículas de vetor de replicão infecciosas.

Dentro de outras formas de realização, PCLs podem ser produzidos usando partículas de alfa vírus pseudotipados vetor, tal como descrito na Patente US 5789245. A Patente US 5789245 também descreve modificações adicionais que podem ser feitas para os PCLs, por exemplo, modificações em que as proteínas estruturais necessárias para o empacotamento são sintetizadas apenas após a indução pelo próprio vetor de ARN ou algum outro estímulo.

Uma variedade de diferentes células conhecidas na técnica pode ser utilizada na prática da presente invenção; por exemplo, células de mamífero, células de aves, baculovírus, bactérias e células de levedura. Sistemas de expressão de células de insetos, tais como sistemas de baculovírus, são conhecidos dos peritos na técnica e descritos em, por exemplo, Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Boletim N° . 1555 (1987) . Materiais e métodos para baculovírus/sistemas de inserção de expressão de células estão disponíveis comercialmente em forma de kit em, inter alia, Invitrogen, San Diego, CA. Os sistemas de expressão de células de aves são também conhecidos dos peritos na técnica e descritos em, por exemplo, nas Patentes US 5340740; 5656479; 5830510; 6114168; e 6500668; Patente Europeia EP 0787180B; Pedido de Patente Europeia EP03291813.8; WO 03/043415; e WO 03/076601. Do mesmo modo, os sistemas de expressão em células bacterianas e de mamífero são também conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr et al. , Eds., 1989) Butterworths, London.

Uma série de células hospedeiras adequadas para utilização com os sistemas acima referidos são também conhecidas. Por exemplo, as linhas celulares de mamífero são conhecidos na técnica e incluem linhas celulares imortalizadas, disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC), tais como, mas não se limitando a, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (por exemplo, Hep G2), células de rim de bovino Madin-Darby ("MDBK"), bem como outras. Fontes de células de mamífero incluem, mas não estão limitados a, primata humano ou não-humano (por exemplo, células PERC.6 que são descritos, por exemplo, em WO 01/38362 e WO 02/40665, aqui incorporado por referência na sua integridade, bem como depositadas sob o número de depósito ECACC 96022940), MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células de pulmão fetal rhesus (ATCC CL-160), células de rim embrionário humano (células 293, tipicamente transformadas por adenovirus de ADN tipo 5 cortado), células VERO de rins de macaco), cavalo, vaca (por exemplo, células MDBK), ovelhas, cães (por exemplo, células MDCK a partir de rins de cães, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) ou MDCK 33016, número de depósito DSM ACC 2219, tal como descrito em WO 97/37001), gato, e roedores (por exemplo, células de hamster, como células BHK21-F, HKCC, ou células de ovário de hamster chinês (células CHO)), e podem ser obtidas a partir de uma grande variedade de fases de desenvolvimento, incluindo, por exemplo, adulto, neonatal, fetal e embrião.

Fontes de células aviárias incluem, mas não estão limitadas a, células de galinha (por exemplo, células estaminais embrionárias de galinha (por exemplo, células de galinha EBx®), fibroblastos embrionários de galinha, células germinativas)). Similarmente, hospedeiros bacterianos, tais como E. coli, Bacillus subtilis, e Streptococcus spp encontram uso com as presentes construções de expressão. Hospedeiros de levedura úteis na presente invenção incluem, inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenual polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. As células de inseto para uso com os vetores de expressão de baculovírus incluem, nomeadamente, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, e Trichoplusia ni.

MÉTODOS DE EMPACOTAMENTO DE PARTÍCULAS DE ALFA VÍRUS

Tal como previsto pela presente invenção, a geração (empacotamento) de partículas de vetor recombinante de alfa vírus (partículas de replicão) pode ser prontamente realizada por, por exemplo, a co-transfecção de vetores de replicão com cassetes de expressão de proteínas estruturais, vetor complementar e moléculas auxiliares defeituosas (DH) derivadas a partir de ARN transcrito in vitro, ou de ADN de plasmideo, ou por coinfecção com o virus (ver Bredenbeek et ai., J. Virol. 67:6439-6446, 1993, Dubensky et ai, J. Virol 70:508-519, 1996 e Patentes US 5814482, 5739026, 5766602, 5789245 e 5792462. Composições e métodos para empacotamento de vetores de alfa virus são também descritos nas Patentes US 6329201 e 6242259.

Alternativamente, partículas de vetor podem ser geradas por introdução do vetor de ARN em linhas celulares de empacotamento de alfa vírus estáveis descritas acima. Resumidamente, tais PCL e suas cassetes de expressão de proteínas estruturais estavelmente transformadas podem ser derivadas utilizando métodos essencialmente como descrito na Patente US 5789245, particularmente utilizando construções compreendendo sequências de amplificação 5' modificadas, tal como aqui descrito. Por exemplo, a produção de partículas de vetor recombinante de alfa vírus por PCL pode ser realizada após a introdução de moléculas de vetor baseadas em alfa vírus no PCL, sendo os vetores derivados de ARN transcrito in vitro, plasmideo de ADN, ou partículas de alfa vírus recombinantes obtidas anteriormente, incubando o PCL por condições sob e por um tempo necessário para o empacotamento de partículas de vetor, e colheita das partículas de vetor empacotado. Tal como mostrado nos exemplos detalhados aqui proporcionados, a utilização das novas sequências de amplificação 5' da presente invenção para empacotamento eficiente do vetor em tais abordagens é facilmente conseguida. O co-empacotamento pode ser ensaiado por passagem em série de partículas de replicão nas células cultivadas sem tratamento prévio (por exemplo, células que não são células de empacotamento). As partículas de replicão sem co-empacotamento não irão produzir novas partículas de replicão da progénie depois de infetar as células ingénuas, enquanto as partículas de replicão com co-empacotamento vão produzir continuamente novas partículas de replicão. Também sob o microscópio, o replicão contendo co-empacotamento pode produzir padrões de concentração como de efeito ocitopático (CPE), resultante do espalhamento direto de partículas a partir de células adjacentes. 0 co-empacotamento também pode ser determinado por infeção de células ingénuas com partículas de replicão e testar para a expressão uma ou mais proteínas estruturais de alfa virus nas células infetadas (por exemplo, por western blot).

SEQUÊNCIAS HETERÓLOGAS

Como observado acima, as sequências de amplificação 5' modificadas (e construções compreendendo estas sequências aqui descritas) podem ser utilizadas numa vasta gama de aplicações. Por exemplo, sequências de amplificação 5' modificadas podem ser usadas em construções auxiliares para a produção de partículas de replicão de alfa vírus. As partículas de replicão podem incluir uma ampla variedade de sequências heterólogas, por exemplo, sequências que codificam paliativos, tais como citoquinas ou linfocinas, toxinas, e pró-fármacos da enzima de conversão, sequências que codificam os antigénios que estimulam uma resposta imune, ribozimas ou sequências antessentido, sequências que codificam proteínas para aplicação terapêutica, tais como fatores de crescimento ou reguladores e sequências que codificam proteínas que auxiliam ou inibem uma resposta imune.

De preferência, as sequências de nucleótidos devem ser de um tamanho suficiente para permitir a produção eficiente de partículas de vetor viáveis. Dentro do contexto da presente invenção, a produção de qualquer título mensurável de partículas de alfa vírus recombinantes, por exemplo, por transferência de ensaio de expressão, ensaio de titulação de linhas celulares, ensaio de repórter, ou ensaio de placa em monocamadas suscetíveis adequadas, é considerado como sendo "de produção de partículas de vetor viáveis " . Esta pode ser, no mínimo, uma construção de vetor de alfa vírus que não contenha qualquer sequência heteróloga adicional. No entanto, em outras formas de realização, a construção de vetor pode conter sequências heterólogas adicionais ou estranhas. Nas concretizações preferidas, a sequência heteróloga pode compreender uma sequência heteróloga de, pelo menos, cerca de 100 bases, 2 kb, 3,5 kb, 5 kb, 7 kb, ou até mesmo uma sequência heteróloga de, pelo menos, cerca de 8 kb. As sequências heterólogas acima descritas podem ser facilmente obtidas a partir de uma variedade de fontes, incluindo, por exemplo, depósitos tal como a American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.), ou a partir de fontes comerciais tal como British Bio-Technology Limited (Cowley, Oxford, Inglaterra). Alternativamente, as sequências de cADN que codificam para as sequências heterólogas acima descritas podem ser obtidas a partir de células que expressam ou contêm as sequências, utilizando procedimentos padrão conhecidos na técnica. Além disso, as sequências heterólogas podem também ser sintetizadas, por exemplo, num sintetizador de ADN da Applied Biosystems, Inc.

Exemplos representativos de sequências heterólogas adequadas são discutidos em mais detalhe na Patente US 5843723.

Os exemplos não limitativos de sequência heterólogas que codificam proteínas imunogénicas incluem proteínas derivadas de um ou mais das seguintes estabelecidas abaixo:

Antigénios bacterianos, tais como N. meningitidis: um antigénio de proteínas de N. meningitidis do serogrupo A, C, W135, Y, e/ou B (1-7); uma preparação de vesícula de membrana externa (OMV) de N. meningitidis do sorogrupo B. (8, 9, 10, 11); um antigénio sacarídico, incluindo LPS, a partir serogrupo A, B, C W135 e/ou Y de N. meningitidis, tal como o oligossacárido do serogrupo C (ver PCT/US99/ 09346; PCT IB98/01665; e PCT IB99/00103); Streptococcus pneumoniae: um antigénio de sacárido ou proteína, particularmente a partir de um sacárido Streptooccus pneumoniae; Streptococcus agalactiae: particularmente, antígenos de estreptococos do grupo B; Streptococcus pyogenes: em particular, antigénios do grupo A de streptococcus; Enterococcus faecalis ou Enterococcus faecium (particularmente uma repetição do trissacarídeo ou outros antigénios derivados de Enterococcus previstos na Patente US 6756361); Helicobacter pylori: incluindo: Cag, Vac, Nap, HopX, hopX e/ou antigénio de urease; Bordetella pertussis: como holotoxina pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente também combinação com pertactina e/ou antigénio dos aglutinogénios 2 e 3; Staphylococcus aureus: incluindo polissacarídeos capsulares de S. aureus do tipo 5 e 8 opcionalmente conjugados com exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa não tóxica recombinante, tal como StaphVAX™, ou antigénios derivados de proteínas de superfície, invasinas (leucocidina, quinases, hialuronidase), fatores de superfície que inibem a imersão fagocítica (cápsula, Proteína A) , carotenoides, produção de catalase, proteína A, coagulase, fator de coagulação, e/ou toxinas que danificam membranas (opcionalmente destoxifiçadas) que lisam membranas celulares eucarióticas (hemolisinas, leucotoxina, leucocidina); Staphylococcus epidermis: particularmente, antigénio lodo-associado de S. epidermidis (SAA); Staphylococcus saprophyticus: (causando infeções do trato urinário), particularmente a hemaglutinina 160 kDa do antigénio de S. saprophyticus; Pseudomonas aeruginosa: em particular, a endotoxina A, proteína WZZ, P. aeruginosa LPS, mais particularmente LPS isolado a partir de PAOl (serótipo 05), e/ou proteínas da membrana externa, incluindo proteínas de membrana externa F (OprF) (Price et al. (2001) Infec. Immun. 69 (5) : 3510-3515) ; Bacillus anthracis (antraz) : tais como antigénios de B. anthracis (opcionalmente destoxifiçados) a partir dos componentes A (fator letal (LF) e fator de edema (EF)), ambos os quais podem partilhar um componente B comum conhecido como antigénio protetor (PA); Moraxella catarrhalis: (respiratórias), incluindo antigénios proteicos de membrana externa (HMW-OMP), antigénio C, e/ou LPS; Yersinia pestis (peste): tal como o antigénio capsular Fl (Grosveld et al. (2003) Infec. Immun. 71 (1):374-383), LPS (Fields et al. (1999) Infec. Immun. 67 (10): 5395), antigénio de Yersinia pestis V (Hill et al. (1997) Infec. Immun. 65 (11) :4476-4482); Yersinia enterocolitica (patogénio gastrointestinal): particularmente LPS (Xu et al. (2002) Infec. Immun. 70 (8) :4414-4420) ; Yersinia pseudotuberculosis: antigénios de agentes patogénicos gastrointestinais; ; Mycobacterium tuberculosis, tais como lipoproteínas, de LPS, antígenos da BCG, uma proteína de fusão de antigénio 85B (Ag85B) e/ou ESAT-6 opcionalmente formulados em vesículas de lípidos catiónicos (Olsen et al. (2004) Infec. Immun. 72 (10):6148-6150), Mycobacterium tuberculosis (MTB) antígenos de isocitrato associados com desidrogenase (Banerjee et al. (2004) Proc. Acad. Sei EUA 101 (34):12652-12657) e/ou antigénios MPT51 (Suzuki et al.(2004) Infec. Immun. 72 (7) : 3829-3837); Legionella pneumophila (doença do legionário): antigénios L. pneumophila - opcionalmente derivados de linhas celulares com genes asd rompidos (Harb et al. (1998) Infec. Immun. 66 (5):1898-1903; Rickettsia: incluindo proteínas de membrana externa, incluindo a proteína da membrana externa A e/ou B (OmpB) (Biochim Biophys Acta. 2004 1 de novembro; 1702 (2): 145) , LPS, e antigénio da proteína de superfície (SPA) (J Autoimmun. 1989 Jun; 2 Suppl: 81); E. coli: incluindo antigénios de E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enteroagregativo (EAggEC), E. coli aderindo difusamente (DAEC), E. coli enteropatogénico (EPEC), e/ou E. coli enterohemorrágico (EHEC); Vibrio cholerae: incluindo antigénios de proteinase, LPS, particularmente lipopolissacarídeos de Vibrio cholerae II, polissacarídeos específicos de 01 Inaba Ο, V. cholera 0139, antigénios da vacina IEM108 (Infect Immun. Outubro de 2003; 71 (10) : 5498-504), e/ou toxina zonula occludens (Zot); Salmonella typhi (febre tifoide) : incluindo polissacarídeos capsulares de preferência conjugados (vi, ou seja, VAX-TyVi); Salmonella typhimurium (gastroenterite): antigénios derivados estão contemplados para terapias microbianas e do cancro, incluindo a inibição da angiogénese e a modulação de flk; Listeria monocytogenes (infeções sistémicas em pessoas imunocomprometidas ou idosos, infeções do feto): antigénios derivados de L. monocytogenes são preferencialmente utilizados como veículos/ vetores para a entrega intracitoplasmática de conjugados/composições associadas da presente invenção; Porphyromonas gingivalis: particularmente, proteína da membrana externa de P. gingivalis (OMP); Tetanus: tais como antigénios do toxoide do tétano (TT), utilizados preferencialmente como uma proteína transportadora em conjunção/conjugada com as composições da presente invenção; Diphtheria, tais como um toxoide da difteria, de preferência, CRMi97, adicionalmente antigénios capazes de modular, inibir ou associar com ribosilação de ADP são contemplados para combinação/coadministração/conjugação com as composições da presente invenção, os toxoides da difteria são preferencialmente utilizados como proteínas transportadoras; Borrelia burgdorferi (doença de Lyme): tal como antigénios associados com P39 e P13 (uma proteína de membrana integral, (NOPPA et ai (2001) . Infect Immun. 69 (5):3323), proteína de variação antigénica VlsE (Lawrenz et ai. (1999) J Clin Microbiol. 37 (12):3997),- Haemophilus influenzae B: tal como um antigénio de sacárido do mesmo; Klebsiella: tal como uma OMP, incluindo OMP A, ou, opcionalmente, um polissacarídeo conjugado com o toxoide do tétano; Neiserria gonorrhoeae: incluindo, uma proteína Por (ou porina), tal como PorB (ver, Zhu et ai, Vaccine (2004) 22:660-669), uma proteína de ligação de transferência, tais como TbpA e TbpB (ver, Price et al, Infection and Immunity (2004) 71 (1):277-283), uma proteína de opacidade (como

Opa), uma proteína modificável deredução (RMP), e preparações de vesículas de membrana externa (OMV) (ver, Plante et al, J. Infectious Disease (2000) 182:848-855), também ver, por exemplo, W099/24578, W099/36544, W099/ 57280, WO02/079243); Chlamydia pneumoniae: em particular antigénios proteicos de C. pneumoniae; Chlamydia trachomatis: incluindo antigénios derivados de serotipos A, B, Ba e C (agentes de tracoma, uma causa de cegueira) , sorotipos Li, L2 e L3 (associados com lymphogranuloma venereum) e sorotipos, D-K; Treponema pallidum (sífilis): particularmente um antígeno TmpA; e Haemophilus ducreyi (causando cancro mole): incluindo proteína da membrana externa (DSRA).

Sempre que não seja especificamente mencionado, outras sequências que codificam antigénios bacterianos da presente invenção podem ser antigénios capsulares, antigénios de polissacáridos ou antigénios de proteínas de qualquer um dos acima. Outros antigénios bacterianos podem também incluir uma preparação de vesículas da membrana externa (OMV) . Além disso, os antígenos incluem versões vivas, atenuadas, divididas e/ou purificadas de qualquer uma das bactérias acima mencionadas. Os antigénios bacterianos ou microbianos derivados da presente invenção podem ser bactérias gram-negativas ou gram-positivas e aeróbias ou anaeróbias.

Além disso, qualquer um dos sacáridos derivados bacterianos acima (polissacarídeos, LPS, LOS ou oligossacáridos) pode ser conjugado com outro agente ou antigénio, tal como uma proteína transportadora (por exemplo, CRMi97) . Esta conjugação pode ser conjugação direta efetuada por aminação redutora de radicais carbonilo no sacárido para grupos amino na proteína, tal como previsto na Patente US 5360897 e Can JBiochem Cell Biol. 1984 Maio; 62 (5):270-5. Alternativamente, os sacáridos podem ser conjugados através de um ligante, tal como, com succinamida ou outras ligações fornecidas em Bioconjugate Techniques, 1996 e CRC, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, 1993. A sequência heteróloga também pode codificar um ou mais antigénios virais, por exemplo, Influenza: incluindo partículas virais inteiras (atenuadas) , divididas ou subunidade, que compreendem a hemaglutinina (HA) e/ou proteínas de superfície de neuraminidase (NA), os antigénios da gripe podem ser derivados a partir de embriões de galinha ou propagados em cultura de células, e/ou os antigénios da gripe são derivados de gripe do tipo A, B e/ou C, entre outros; virus respiratório sincicial (RSV) : incluindo a proteína F da estirpe A2 de RSV (J Gen Virol. Novembro de 2004; 85 (Pt 11) :3229) e/ou

glicoproteína G; vírus Parainfluenza (PIV) : incluindo PIV tipo 1, 2, e 3, de preferência contendo hemaglutinina, neuraminidase e/ou glicoproteínas de fusão; Poliovirus: incluindo antigénios a partir de uma família de Picornaviridae, de preferência os antigénios do poliovirus como OPV ou, de preferência IPV; Sarampo: incluindo o antigénio do vírus do sarampo dividido (MV) opcionalmente combinado com o Protollin e ou antigénios presentes na vacina MMR; papeira: incluindo antigénios presentes na vacina MMR; Rubéola: incluindo antigénios presentes na vacina MMR, bem como outros antigénios de Togaviridae, incluindo o vírus da dengue; Raiva: tais como o vírus inativado liofilizado (RabAvert™); vírus Flaviviridae: como (e antigénios deles derivados) o vírus da febre-amarela, vírus da encefalite japonesa, vírus da dengue (tipos 1, 2, 3 ou 4), vírus da encefalite, e os vírus do Nilo Ocidental; Caliciviridae; antigénios do mesmo; HIV: incluindo antigénios da estirpe HIV-1 ou HIV-2, como gag (p24gag e p55gag) , env (gpl60 e gp41), pol, tat, nef, vpu rev, miniproteínas, (de preferência gag p55 e gpl40v apagado) e antigénios de HlVmb, HIVsf2/· VIHlav/· VIHlai/· VIHmn/· HIV-1cm235/· HIV-1US4, HIV-2 isolados; vírus da imunodeficiência símia (SIV), entre outros; Rotavirus: incluindo proteínas VP4, VP5, VP6, VP7, VP8 (Protein Expr Purif. Dec 2004; 38 (2) : 205) e/ou NSP4; Pestivírus: como antígenos do vírus da febre suína clássica, o vírus da diarreia virai bovina, e/ou o vírus da doença de fronteira; Parvovirus: como os parvovirus B 19; Coronavírus: incluindo antigénios do vírus da SARS, particularmente proteína de espiga ou proteases dele, bem como os antigénios incluídos na WO 04/92360; virus da Hepatite A: tal como o vírus inativado; vírus da hepatite B: tal como antigénios de superfície e/ou nucleares (sAg), bem como as sequências de pré-superfície, pré-Sl e pré-S2 (anteriormente chamadas pré-S), como bem como combinações das anteriores, tais como sAg/pré-Sl, sAg/ pré-S2, sAg/pré-Sl/pré-S2, e pré-Sl/pré-S2, (ver, por exemplo, "HBV Vaccines - Human Vaccines and Vacination, pp 159-176; e Patentes US 4722840, 5098704, 5324513; Beames et al., J. Virol. (1995) 69:6833-6838, Birnbaum et al. , J. Virol. (1990) 64: 3319-3330; e Zhou et al. , J. Virol. (1991) 65:5457-5464); virus da Hepatite C: tal como El, E2, E1/E2 (ver, Houghton et al, Hepatology (1991) 14:381), poliproteína NS345, poliproteína de núcleo NS-345, péptidos do núcleo, e/ou de regiões não estruturais (Publicação WO 89/04669; WO 90/11089; e WO 90/14436); virus da hepatite delta (HDV): antigénios derivados dos mesmos, particularmente δ-antigénio de HDV (ver, por exemplo, Patente US 5378814); virus da hepatite E (HEV); antigénios deles derivados; vírus da hepatite G (HGV); antigénios deles derivados; virus Varcicella zoster: antígenos derivados do vírus varicela zoster (VZV) (J. Gen. Virol. (1986) 67:1759); virus Epstein-Barr: antigénios derivados de EBV (Baer et al, Nature (1984) 310:207); Citomegalovirus: antigénios de CMV, incluindo gB e gH (Cytomegaloviruses (JK McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pp. 125-169); virus Herpes simplex: incluindo antígenos das estirpes HSV-1 ou HSV-2 e glicoproteínas gB, GD e GH (McGeoch et al. , J. Gen. Virol. (1988) 69:1531 e Patente US 5171568); Virus do Herpes Humano: antigénios derivados de outros vírus do herpes humano como HHV6 e HHV7; e HPV: incluindo antigénios associados com ou derivados a partir de vírus do papiloma humano (HPV), por exemplo, um ou mais de El - E7, Ll, L2, e fusões do mesmo, em particular as composições da invenção podem incluir uma partícula semelhante a vírus (VLP) compreendendo a proteína principal da cápside Ll, ainda mais em particular, os antigénios de HPV são protetores contra um ou mais dos serotipos de HPV 6, 11, 16 e/ou 18. São ainda fornecidos antigénios, composições, métodos e micróbios incluídos em Vaccines, 4th Edition (Plotkin e Orenstein ed., 2004); Medical Microbiology, 4a Edição (Murray et ai. Ed., 2002); Virology, 3rd Edition (WK Joklik ed., 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (BN Fields e DM Knipe, eds., 1991), que são contemplados em conjunto com as composições da presente invenção.

Além disso, a sequência heteróloga pode codificar um ou mais antigénios de fungos, incluindo, mas não limitados a, aqueles descritos nas Patentes US 4229434 e 4368191 para a profilaxia e tratamento de tricoptose causada por Trichophyton mentagrophytes; Patentes US 5277904 e 5284652 para uma vacina dermatófita de largo espectro para a profilaxia da infeção por dermatófitos em animais, tais como gatos, cobaias, coelhos, cavalos e carneiros, estes antigénios compreende uma suspensão de T. equinum, T. mentagrophytes (var. granulare), M. canis e/ou M. gypseum mortos numa quantidade eficaz, opcionalmente combinada com um adjuvante; as Patentes US 5453273 e 6132733 para uma vacina contra a doença da pele que compreende uma quantidade eficaz de, um fungo morto por formaldeído homogeneizado, ou seja, cultura de Microsporum canis num transportador; a Patente US 5948413 envolvendo proteínas extracelulares e intracelulares para a pitiose. Antigénios adicionais identificados em vacinas antifúngicas incluem Ringvac bovis LTF-130 e Bioveta.

Além disso, os antigénios de fungos para utilização na presente invenção podem ser derivados a partir de Dermatophytres, incluindo: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, e/ou Trichophyton faviforme.

Fungos patogénicos para utilização como antigénios ou em derivação de antigénios, em conjunto com as composições da presente invenção compreendem Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, apiosperum Scedosporium, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp. , Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp, Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, e Saksenaea spp.

Outros fungos a partir do qual os antigénios são derivados incluem Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, e Cladosporium spp.

Sequências heterólogas como aqui descritas podem codificar um ou mais antigénios tumorais ou cancerosos, incluindo, mas não limitados a, um antigénio tumoral contendo sacárido, tal como um antigénio de tumor ou um antigénio glicolipido do tumor gangliósido. Numerosos antigénios tumorais são conhecidos na técnica, incluindo: (a) antigénios do cancro do testículo, tais como NY-ESO-1, SSX2, SCPl bem como a família de polipéptidos RAGE, BAGE, GAGE e MAGE, por exemplo, GAGE-1, GAGE -2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, 5-MAGE, MAGE-6, e MAGE-12 (o qual pode ser utilizado, por exemplo, para tratar o melanoma, tumores do pulmão, cabeça e pescoço, NSCLC, peito, gastrointestinal, e da bexiga), (b) antígenos mutantes, por exemplo, p53 (associados com vários tumores sólidos, por exemplo, cancro colo-retal, pulmão, cabeça e pescoço), p21/Ras (associado com, por exemplo, melanoma, cancro do pâncreas e cancro colo-retal) , CDK4 (associado, por exemplo, com melanoma), MUMl (associado, por exemplo, com melanoma), caspase-8 (associado, por exemplo, com cancro da cabeça e pescoço), CIA 0205 (associado, por exemplo, com cancro da bexiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (associada com, por exemplo, melanoma), TCR (associada com, por exemplo, linfoma não-Hodgkin de células T), BCR-abl (associada com, por exemplo, leucemia mieloide crónica), triosefosfato-isomerase, Kia 0205, CDC-27, e LDLR-FUT, (c) antigénios sobre-expressos, por exemplo, galectina 4 (associado com, por exemplo, cancro colo-rectal), galectina 9 (associado com, por exemplo, doença de Hodgkin), proteinase 3 (associada com, por exemplo, a leucemia mielogénica crónica), WT 1 (associada com, por exemplo, diversas leucemias), anidrase carbónica (associada com, por exemplo, cancro renal), aldolase A (associada com, por exemplo, cancro do pulmão), PRAME (associada com, por exemplo, melanoma), HER-2/neu (associada com, por exemplo, cancro da mama, do cólon, do pulmão e do ovário), alfa-fetoproteina (associada com, por exemplo, o hepatoma), KSA (associada com, por exemplo, cancro colo-rectal), gastrina (associada com, por exemplo, cancro do pâncreas e gástrico) , proteína catalítica da telomerase, MUC-1 (associada com, por exemplo, cancro da mama e do ovário), L-250 (associada com, por exemplo, carcinoma de célula renal), p53 (associada, por exemplo, com o cancro da mama, cancro do cólon) e antigénio carcinoembrionário (associado, por exemplo, com o cancro da mama, cancro do pulmão e cancros do trato gastrointestinal, tais como o cancro colo-retal) , (d) antigénios comuns, por exemplo, antigénios de diferenciação de melanoma-melanócito como MART-l/Melan A, gplOO, MC1R, recetor da hormona estimulante dos melanócitos, tirosinase, proteína-1 relacionada com a tirosinase/ TRPl e proteína 2 relacionada com a tirosinase TRP2 2 (associadas, por exemplo, com o melanoma), (e) antigénios associados com a próstata, tais como PAP, PSA, PSMA, PSH-Pl, PSM-Pl, P2-PSM, associados com, por exemplo, o cancro da próstata, (f) os idiotipos de imunoglobulinas (associada a mieloma e linfomas de células B, por exemplo) e (g) outros antigénios de tumores, tais como antigénios e contendo polipeptídeos e sacáridos, incluindo (i) glicoproteínas tais como o sialilo Tn e sialil-Lex (associada com, por exemplo, cancro da mama e colo-retal), bem como várias mucinas; as glicoproteínas podem ser acopladas a uma proteína transportadora (por exemplo, MUC-1 pode ser acoplada a KLH); (11) lipopolipeptídeos (por exemplo, MUC-1 ligado a um agrupamento lipídico); (iii) polissacáridos (por exemplo, o hexassacárido sintético Globo H) , que pode ser acoplado a uma proteína transportadora (por exemplo, a KLH), (iv) gangliósidos, tais como GM2, GM12, GD2, GD3 (associada com, por exemplo, cancro do cérebro, cancro do pulmão, melanoma), que também podem ser ligados a proteínas transportadoras (por exemplo, KLH) .

Antigénios tumorais adicionais que são conhecidos na técnica incluem p 15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antigénios do vírus de Epstein Barr, EBNA, vírus do papiloma humano (HPV), incluindo os antigénios E6 e E7, antigénios do vírus da hepatite B e C, antigénios do vírus linfotrópico das células T humanas, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 19- 9, CA 72-4, CAM 17,1, Numa, K-ras, pl6, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 2 7.2 9\BCAA), CA 195, CA-242, CA-50, CAM43, CD68\KPl, CO-029, FGF-5, GA733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de ligação Mac-2\proteina associada à ciclofilina C) , TAAL6, TAG72, TLP, TPS, e semelhantes. Estes, bem como outros componentes celulares são descritos por exemplo no

Pedido de Patente US 20020007173 e as referências ai citadas.

Informações adicionais sobre antigénios de cancro ou tumorais podem ser encontradas, por exemplo, em Moingeon P, "Cancer vaccines", Vaccine 2001, 19:1305-1326; Rosenberg SA, "Progress in human tumor immunology and immunotherapy", Nature, 2001, 411:380-384; Dermine, S. et al, "Cancer vaccines and Immunotherapy", British Medical Bulletin, 2002, 62, 149-162; Espinoza-Delgado I., "Cancer Vaccines"

The Oncologist, 2002, 7 (suppl3) :20-33; Davis, ID et al, "Rational approaches to human cancer immunotherapy," Journal of Leukocyte Biology, 2003, 23: 3-29; Van den Eynde B, et al., "New tumor antigens recognized by T cells," Curr. Opin. Immunol., 1995, 7:674-81; Rosenberg SA, "Cancer vaccines based on the identification of genes encoding cancer regression antigens, Immunol. Today, 1997, 18:175- 82; Offringa R et al. , "Design and evaluation of antigen-specific vaccination strategies against cancer," Current Opin. Immunol., 2000, 2:576-582; Rosenberg SA, "A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens," Immunity, 1999, 10:281-7; Sahin U et al., "Serological identification of human tumor antigens," Curr. Opin. Immunol., 1997, 9:709-16; Old LJ et al. , "New paths in human cancer serology," J. Exp. Med., 1998, 187:1163-7;

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FORMULAÇÕES

As composições farmacêuticas compreendendo as sequências, vetores e partículas produzidas usando estas moléculas aqui descritas também são fornecidas, por exemplo, uma população de partículas de replicão de alfa vírus produzidas utilizando uma construção auxiliar compreendendo uma sequência de amplificação 5' modificada com um comprimento de entre 10 e 150 nucleótidos em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente, ou recetor.

As composições aqui descritas podem incluir vários excipientes, adjuvantes, veículos, substâncias auxiliares, agentes imunomoduladores, e semelhantes. Como observado acima, as composições da invenção também podem conter líquidos ou excipientes, tais como água, solução salina, glicerol, dextrose, etanol, ou semelhantes, isoladamente ou em combinação, bem como substâncias, tais como agentes molhantes, agentes emulsionantes, ou agentes tamponantes de pH. Uma discussão exaustiva de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20 ed ISBN: 0683306472.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser utilizados nas composições da invenção, por exemplo, sais minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, ou sulfatos, bem como sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, ou benzoatos. Substratos proteicos especialmente úteis são albuminas do soro, hemocianina de lapa, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxoide do tétano, e outras proteínas bem conhecidas dos peritos na técnica.

Em certas formas de realização, as composições aqui descritas (por exemplo, partículas) podem ser conservadas em bruto ou em formas purificadas, as quais também podem ser liofilizadas, secas por pulverização ou evaporadas, por exemplo, como descrito em detalhe na Patente US 6015686.

Como observado acima, as formulações aqui descritas podem ainda incluir ou podem ser administradas em conjunto com outros agentes imunorreguladores. Em particular, as composições geralmente incluem um adjuvante. Os adjuvantes para utilização com a invenção incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes estabelecidos abaixo:

Composições que contêm minerais

Composições que contêm minerais adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem sais minerais, tais como sais de alumínio e sais de cálcio. A invenção inclui sais minerais tais como os hidróxidos (por exemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por exemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. (por exemplo, ver capítulos 8 e 9 de Vaccine design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum), ou misturas de compostos minerais diferentes (por exemplo, uma mistura de um fosfato e dum adjuvante hidróxido, opcionalmente com um excesso de fosfato), com os compostos tendo qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), e com a adsorção do sal a ser preferida. As composições contendo minerais podem também ser formuladas como uma partícula de sal metálico (WO00/23105).

Os sais de alumínio podem ser incluídos nas vacinas da invenção de modo a que a dose de Al3+ esteja entre 0,2 e 1,0 mg por dose.

Numa concretização, o adjuvante à base de alumínio é alúmen (sulfato de alumínio e potássio (AIK (SO4) 2) ) , ou um derivado de alúmen, tal como o formado in situ por meio da mistura de um antigénio em tampão de fosfato com alúmen, seguida por titulação e precipitação com uma base, tal como hidróxido de amónio ou hidróxido de sódio.

Outro adjuvante à base de alumínio para utilização com as composições imunogénicas aqui descritas é o adjuvante de hidróxido de alumínio (Al (OH)3) ou oxi-hidróxido de alumínio cristalino (AlOOH), que é um excelente adsorvente, com uma área superficial de cerca de 500 m2/g. Alternativamente, é fornecido o adjuvante de fosfato de alumínio (AIPO4) ou hidroxifosfato de alumínio, que contém grupos de fosfato em lugar de algum ou de todos os grupos hidroxilo do adjuvante de hidróxido de alumínio. Adjuvantes de fosfato de alumínio preferidos aqui proporcionados são amorfos e solúveis em meios acídicos, básicos e neutros.

Numa outra forma de realização, o adjuvante compreende tanto o fosfato de alumínio como o hidróxido de alumínio. Numa concretização mais particular, o adjuvante tem uma maior quantidade de fosfato de alumínio do que de hidróxido de alumínio, tal como uma razão de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1,9:1 ou maior do que 9:1, por peso de fosfato de alumínio para hidróxido de alumínio. Ainda mais particularmente, sais de alumínio em que a vacina está presente em 0,4 a 1,0 mg por dose de vacina, ou 0,4 a 0,8 mg por dose de vacina, ou 0,5 a 0,7 mg por dose de vacina, ou cerca de 0,6 mg por dose de vacina.

Geralmente, o adjuvante à base de alumínio preferido, ou a proporção de vários adjuvantes à base de alumínio, tais como fosfato de alumínio para hidróxido de alumínio é selecionado através de uma otimização de atração electroestática entre as moléculas de tal forma que o antigénio transporta uma carga oposta como o adjuvante no pH desejado. Por exemplo, o adjuvante de fosfato de alumínio (IEP = 4) adsorve lisozima, mas não a albumina a pH 7,4. Devendo a albumina ser o alvo, o adjuvante de hidróxido de alumínio seria selecionado (iep 11,4).

Alternativamente, o pré-tratamento de hidróxido de alumínio com fosfato reduz o seu ponto isoelétrico, tornando-se um adjuvante preferido para antigénios mais básicos. Ά. Emulsões em óleo

As composições de emulsão em óleo adequadas para utilização como adjuvantes incluem emulsões de esqualeno em água, tais como MF59 (5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80, e 0,5% de Span 85, formulado em partículas submicrónicas utilizando um microfluidificador). Ver WO90/14837. Veja também, Podda, "The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants: experience with the MF59-adjuvanted vaccine", Vaccine (2001) 19: 2673-2680; Frey et al. , "Comparison of the safety, tolerability, and immunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-adjuvanted influenza vaccine in non-elderly adults", Vaccine (2003) 21:4234-423. MF59 é utilizado como adjuvante na vacina trivalente FLUAD™ de subunidade do vírus da gripe.

Os adjuvantes particularmente preferidos para utilização com as composições imunogénicas aqui descritas são emulsões. Emulsões submicrónicas de óleo-em-água preferidas para utilização na presente invenção são emulsões esqualeno/água contendo opcionalmente quantidades variáveis de MTP-PE, tal como uma emulsão submicrónica de óleo-em-água, contendo 4-5% p/v de esqualeno, 0,25-1,0% p/v de Tween 80™ (monooleato de polioxietilenosorbitano), e/ou 0,25-1,0% de Span 85™ (trioleato de sorbitano), e, opcionalmente, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isogluatminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3- hidroxifosforiyloxi)-etilamina (MTP-PE), por exemplo, a emulsão submicrónica de óleo-em-água conhecida como "MF59" (WO90/14837; Patentes US 6299884 e 6451325 e Ott et al, "MF59 -- Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. and Newman, M.J. eds. ) Plenum Press, New York, 1995, pp. 277-296). MF59 contém 4-5% p/v de esqualeno (por exemplo, 4,3%), 0,25-0,5% p/v de Tween 80™, e 0,5% p/v de Span 85™ e contém opcionalmente várias quantidades de MTP-PE, formulados em partículas submicrónicas usando um microfluidificador tal como o microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA). Por exemplo, o MTP-PE poderá estar presente numa quantidade de cerca de 0-500 yg/dose, mais preferencialmente 0-250 yg/ dose, e ainda mais preferencialmente, 0-100 yg/dose. Tal como aqui utilizado, o termo "MF59-0" refere-se à emulsão submicrónica de óleo-em-água acima sem MTP-PE, enquanto o termo MTP-MF59 indica uma formulação que contém o MTP-PE. Por exemplo, "MF59-100" contém 100 yg de MTP-PE por dose, e assim por diante. MF69, outra emulsão submicrónica óleo-em-água para utilização na presente invenção, contém de 4,3% p/v de esqualeno, 0,25% p/v de Tween 80™ e 0,75% p/v de Span 85™ e opcionalmente MTP-PE. Ainda outra emulsão submicrónica de óleo-em-água é MF75, também conhecida como SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80™, 5% de polímero Ll21plurónico-bloqueado, e também thr-MDP, microfluidizado numa emulsão submicrónica. MTP-MF75 indica uma formulação de MF75 que inclui MTP, tal como 100-400 yg de MTP-PE por dose.

Emulsões submicrónicas de óleo-em-água, métodos de as fazer, e agentes imunoestimulantes, tais como péptidos de muramil, para utilização nas composições, estão descritos em detalhe na Publicação WO90/14837 e nas Patentes US 6299884 e 6451325.

Adjuvante completo de Freund (CFA) e adjuvante incompleto de Freund (IFA) podem igualmente ser utilizados como adjuvantes na presente invenção. B. Formulações de saponina

As formulações de saponina também podem ser utilizadas como adjuvantes. As saponinas são um grupo heterólogo de glicósidos de esterol e glicósidos triterpenóides que são encontrados na casca, folhas, caules, raízes e mesmo nas flores de uma ampla gama de espécies de plantas. As saponinas isoladas a partir da casca de árvore Quillaia saponaria Molina têm sido amplamente estudadas como adjuvantes. As saponinas também podem ser obtidas comercialmente a partir de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (Veil Brides), e Saponaria officianalis (raiz de sabão). Formulações de adjuvantes de saponina incluem formulações purificadas, tais como QS21, bem como formulações de lípidos, tais como ISCOMs.

Composições de saponina foram purificadas utilizando alta cromatografia em camada fina (HP-CCF) e Cromatografia Líquida de Fase Reversa de Alta Eficiência (HPLC-RP). Foram identificadas frações purificadas utilizando estas técnicas específicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. De preferência, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é divulgado na Patente US 5057540. As formulações de saponina podem também compreender um esterol, tal como colesterol (ver W096/33739).

Combinações de saponinas e colesterol podem ser usados para formar partículas originais chamados complexos imunoestimulantes (ISCOM). ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser utilizada em ISCOMs. Preferencialmente, o ISCOM inclui um ou mais Quil A, QHA e QHC. Os ISCOM encontram-se descritos na EP0109942, W096/11711 e W096/33739. Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovidos de (um) detergente (s) adicional. Ver WO00/07621.

Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes com base em saponina pode ser encontrada em Barr, et ai., "ISCOMs and other saponin based adjuvants", Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32:247-271. Ver igualmente Sjolander, et al., "Uptake and adjuvant activity of orally delivered saponin and ISCOM vaccines", Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32:321-338. C. Virossomas e partículas semelhantes a vírus (VLP)

Os virossomas e as partículas semelhantes a virus (VLP) também podem ser utilizados como adjuvantes na presente invenção. Estas estruturas geralmente contêm uma ou mais proteínas a partir de um vírus opcionalmente combinado ou formulado com um fosfolípido. São geralmente não-patogénico, não replicantes e, geralmente, não contêm qualquer genoma virai nativo. As proteínas virais podem ser recombinantemente produzidas ou isoladas a partir de vírus inteiros. Estas proteínas virais adequados para uso em virossomas ou VLPs incluem proteínas derivadas do vírus da gripe (tais como HA ou NA) , vírus da hepatite B (tais como proteínas do núcleo ou do capsídeo), vírus da Hepatite E, vírus do sarampo, vírus Sindbis, Rotavirus, vírus da febre aftosa, retrovirus, vírus de Norwalk, vírus do papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fagos de Οβ, (tais como proteínas de revestimento), fago GA, fago fr, fago AP205, e Ty (tal como retrotransposões da proteína Ty pl). VLP serão discutidos na W003/024480, W003/024481 e Niikura et al. , "Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting Foreign Epitopes", Virology (2002) 293:273-280; Lenz et al., "Papillomarivurs-

Like Particles Induce Acute Activation of Dendritic Cells", Journal of Immunology (2001) 5246-5355; Pinto, et al. , "Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus (HPV)-16 Ll Healthy Volunteers Immunized with Recombinant HPV-16 Ll Virus-Like Particles", Journal of Infectious Diseases (2003) 188:327-338; and Gerber et al. , "Human

Papillomavrisu Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens when Coadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG", Journal of Virology (2001) 75(10):4752-4760. Os virossomas são discutidos mais adiante, por exemplo, em Gluck et al., "New Technology Platforms in the Development of Vaccines for the Future", Vaccine (2002) 20:B10-B16. Virossomas da gripe imunopotenciadores reconstituídos (IRIV) são utilizados como o sistema de entrega de antigénio de subunidade no produto intranasal trivalente INFLEXAL™ {Mischler & Metcalfe (2002) Vaccine 20 Suppl 5:Bl7-23} e o produto INFLUVAC PLUS™. D. Derivados bacterianos ou microbianos

Os adjuvantes adequados para uso na invenção incluem derivados bacterianos ou microbianos tais como: (1) Derivados não-tóxicos de lipopolissacarídeo enterobacteriais (LPS)

Tais derivados incluem monofosforil-lípido A (MPL) e MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL uma mistura de 3-De-O-acilado monofosforil lípido A com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma forma preferida de "partícula pequena" de 3-De-O-acilado monofosforil lípido A é descrita na EP 0689454. Tais "pequenas partículas" de 3dMPL são suficientemente pequenas para serem esterilizadas por filtração através de uma membrana de 0,22 micron (ver EP 0689454). Outros derivados de LPS não tóxicos incluem imitações de monofosforil-lípido A, tal como derivados de fosfato de aminoalquilo glucosaminida, por exemplo, RC-529. Ver Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

(2) Derivados de lípido A

Derivados de lípido A incluem derivados de lípido A de Escherichia coli tais como OM-174. OM-174 descrito, por exemplo, em Meraldi et al., "OM-174, a New Adjuvant with a

Potential for Human Use, Induces a Protective Response with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310 from the circumsporozoite protein of Plasmodium berghei", Vaccine (2003) 21:24 85-24 91; and Pajak, et al. , "The Adjuvant OM-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cells in vivo", Vaccine (2003) 21:836- 842 . (3) Oligonucleótidos imunoestimulantes

Os oligonuclebtidos imunoestimulantes adequados para uso como adjuvantes na presente invenção incluem sequências de nucleótidos que contêm um motivo CpG (uma sequência contendo uma citosina não metilada seguida de guanosina e ligadas por uma ligação fosfato). ARN de cadeia dupla, bacteriana ou oligonuclebtidos contendo sequências palindrómicas ou poli (dG) também tem demonstrado ser imunoestimulante.

Os CPGs podem incluir modificações de nucleotídeos/ análogos, tais como modificações fosforotioato e podem ser de cadeia dupla ou de cadeia simples. Opcionalmente, a guanosina pode ser substituído por um análogo, tais como 2'-desoxi-7-deazaguanosina. Ver Kandimalla, et al., "Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern: design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles", Nucleic Acids Research (2003) 31(9): 2393-2400; WO02/26757 e W099/62923 para exemplos de possíveis substituições de análogos. O efeito adjuvante de oligonucleídos CpG é ainda discutido em Krieg, "CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts?", Nature Medicine (2003) 9(7): 831-835; McCluskie, et al., "Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA", FEMS Immunology and Medical Microbiology (2002) 32:179-185; WO98/40100; Patente US 6207646; Patente US 6239116 e Patente US 6429199. A sequência CpG pode ser direcionada para TLR9, tal como o motivo GTCGTT ou TTCGTT. Ver Kandimalla, et al., "Tolllike receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic CpG DNAs", Biochemical Society Transactions (2003) 31 (part 3): 654-658. A sequência CpG pode ser específica para a indução de uma resposta imune Thl, tal como um CpG-A ODN, ou pode ser mais específica para a indução de uma resposta de células B, tal CpG-B ODN. Os CpG-A e CpG-B ODN são discutidos em Blackwell, et al., "CpG-A-Induced Monocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated by Plasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha", J. Immunol. (2003) 170 (8) :4061-4068; Krieg, "From A to Z on CpG", TRENDS in Immunology (2002) 23(2): 64-65 e WOOl/95935. De preferência, o CpG é urn CpG-A ODN.

De preferência, o oligonucleótido CpG é construído de modo que a extremidade 5' seja acessível para o reconhecimento do recetor. Opcionalmente, duas sequências de oligonucleídos CpG podem estar ligadas nas suas extremidades 3' para formar "imunómeros". Ver, por exemplo, Kandimalla, et al., "Secondary structures in CpG oligonucleotides affect immunostimulatory activity", BBRC (2003) 306:948-953; Kandimalla, et al., "Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic GpG DNAs", Biochemical Society Transactions (2003) 31 (part 3):664-658; Bhagat et al., "CpG penta- and hexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents" BBRC (2003) 300:853-861 e WO03/035836. (4) Toxinas ribosilantes de ADP e seus derivados destoxi ficados

Toxinas bacterianas ribosilantes de ADP e derivados desintoxicados das mesmas podem ser utilizados como adjuvantes na presente invenção. De preferência, a proteína é derivada de E. coli (isto é, enterotoxina de E. coli lábil ao calor, "LT), cólera ("TC"), ou pertussis ("PT"). O uso de toxinas destoxifiçadas de ribosilação de ADP como adjuvantes de mucosa é descrito em W095/1721 e como adjuvantes parenterais em W098/42375. De preferência, o adjuvante é um mutante de LT destoxifiçado tal como LT-K63, LT-R72, e LTR192G. O uso de toxinas ribolisantes de ADP e seus derivados destoxifiçados, particularmente LT-K63 e LT-R72, como adjuvantes pode ser encontrado nas seguintes referências: Beignon, et al., "The LTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Enahnces the Ability of Peptide Antigens to Elicit CD4+ T Cells and Secrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin", Infection and Immunity (2002) 70 ( 6) : 3012-3019; Pizza, et al., "Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants", Vaccine (2001) 19:2534-2541; Pizza, et al. , "LTK63 and LTR72, two mucosal adjuvants ready for clinical trials" Int. J. Med. Microbiol (2000) 290(4-5):455-461; Scharton-Kersten et al. , "Transcutaneous

Immunization with Bacterial ADP-Ribosylating Exotoxins, Subunits and Unrelated Adjuvants", Infection and Immunity (2000) 68(9):5306-5313; Ryan et al., "Mutants of

Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular Pertussis Vaccine: Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Thl and Th2 Cells" Infection and Immunity (1999) 67(12):6270-6280,- Partidos et al. , "Heat- labile enterotoxin of Escherichia coli and its site-directed mutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized synthetic peptides", Immunol. Lett. (1999) 67(3):209-216,-

Peppoloni et al., "Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines", Vaccines (2003) 2(2):285-293; and Pine et al., (2002) "Intranasal immunization with influenza vaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxin from Escherichia coli (LTK63)" J. Control Release (2002) 85(1-3):263-270. Numerical reference for amino acid substitutions is preferably based on the alignments of the A and B subunits of ADP-ribosylating toxins set forth in Domenighini et al. , Mol. Microbiol (1995) 15 (6) :1165-1167. F. Bioadesivos e mucoadesivos

Bioadesivos e mucoadesivos, também podem ser utilizados como adjuvantes. Bioadesivos adequados incluem microesferas de ácido hialurónico esterificado (Singh et al. (2001) J.

Cont. Rele. 70:267-276) ou mucoadesivos tais como derivados reticulados de ácido poliacrílico, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose e polissacáridos. O quitosano e os seus derivados podem também ser utilizados como adjuvantes. Ver, por exemplo, WO 99/27960. G. Microparticulas

As microparticulas podem também ser utilizadas como adjuvantes. As microparticulas (isto é, uma partícula de ~ lOOnm a ~ 150 um de diâmetro, mais preferivelmente ~ 200nm a ~ 30 um de diâmetro, e mais preferivelmente ~ 500nm a ~ 10 um de diâmetro) formadas a partir de materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um poli (ácido hidroxi-α), um ácido polihidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona, etc.), com poli (lactido-co-glicolido) são preferidos, opcionalmente tratadas para ter uma superfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfície carregada positivamente (por exemplo, com um detergente catiónico, tal como CTAB). H. Lipossomas

Exemplos de formulações de lipossomas adequados para utilização como adjuvantes são descritos nas Patentes US 6090406, 5916588 e EP 0626169. I. Formulações de éter de polioxietileno e de éster de polioxietileno

Os adjuvantes adequados para utilização com as composições imunogénicas aqui descritas incluem os éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno. W099/52549. Tais formulações incluem ainda tensioativos de ésteres de polioxietileno de sorbitano em combinação com um octoxinol (W001/21207), bem como éteres de polioxietileno de alquilo ou de éster de tensioativos em combinação com pelo menos um agente tensioativo não iónico adicional, tal como um octoxinol (WOO 1/21152) . Éteres de polioxietileno preferidos são selecionados a partir do seguinte grupo: éter de polioxietileno-9-lauril (laureth 9) , éter de polioxietileno-9-esteorilo, éter de polioxietileno-8-esteorilo, éter de polioxietileno-4-laurílico, éter de polioxietileno-35-laurilo, e éter de polioxietileno-23-laurilo. J. Polifosfazeno (PCPP)

As formulações de PCPP são descritas, por exemplo, em Andrianov et al., "Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions", Biomaterials (1998) 19(1-3):109-115 and Payne et al. , "Protein Release from Polyphosphazene Matrices", Adv. Drug. Delivery Review (1998) 31(3):185-196. K. Peptideos de muramilo

Exemplos de péptidos de muramilo adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-l-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP), e N-acetilmuramil-l-alanil-d-isoglutaminil-l-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE). L. Compostos de imidazoquinolina.

Exemplos de compostos de imidazoquinolina adequados para o uso como adjuvantes na invenção incluem Imiquimod e seus análogos, descritos ainda em Stanley, "Imiquimod and the imidazoquinolines: mechanism of action and therapeutic potential" Clin Exp Dermatol (2002) 27(7):571-577,- Jones, "Resiquimod 3M", Curr Opin Investig Drugs (2003) 4(2):214- 218; e Patentes US 4689338, 5389640, 5268376, 4929624, 5266575, 5352784, 5494916, 5482936, 5346905, 5395937, 5238944 e 5525612. M. Compostos de tlosemlcarbazona

Exemplos de compostos de tiosemicarbazona, bem como os métodos de formulação, fabrico, e rastreio para todos os compostos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem aqueles descritos em W004/60308. As tiossemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citoquinas, tais como TNF-·. N. Compostos de triptantrina

Exemplos de compostos de triptantrina, bem como métodos de formulação, fabrico, e rastreio para todos os compostos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem aqueles descritos em WO04/64759. Os compostos de triptantrina são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citoquinas, tais como TNF-·. A invenção pode também compreender combinações de aspetos de um ou mais dos adjuvantes identificados acima. Por exemplo, as seguintes composições adjuvantes podem ser utilizadas na presente invenção: (1) uma saponina e uma emulsão de óleo-em-água (W099/ 11241) ;

(2) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado de LPS não-tóxico (por exemplo, 3dMPL) (ver W094/00153); (3) uma saponina + um derivado não tóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) + um colesterol (por exemplo, QS21); (4) uma saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol) (W09 8/57659) ; (5) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões de óleo-em-água (ver os pedidos de patentes europeias 0835318, 0735898 e 0761231); (6) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% polímero de bloco Pluronic L121-, e thr-MDP, quer microfluidizado numa emulsão submicrónica ou passado em vórtice para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior. (7) sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes da parede celular bacteriana a partir do grupo que consiste em monofosforil-lípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS), preferencialmente MPL + CWS (Detox™); e

Imunomoduladores humanos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem citoquinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferões (por exemplo, interferão-γ), fator de estimulação de colónias de macrófagos, e fator de necrose tumoral.

Os sais de alumínio e MF59 são os adjuvantes preferidos para utilização com vacinas contra a gripe injetáveis. As toxinas bacterianas são bioadesivas e adjuvantes preferidas para utilização com vacinas entregues por via das mucosas, como vacinas nasais.

KITS

As composições aqui descritas também podem ser fornecidas em kits, por exemplo, um kit que compreende uma construção auxiliar ou linha celular de empacotamento como aqui descrito. Um ou mais dos componentes podem ser liofilizados e/ou secos para embalagem no kit. Os componentes podem ser proporcionados como uma composição única ou podem ser fornecidos separadamente. Além disso, os componentes podem ser reconstituídos antes da utilização de modo a que eles sejam adequados para administração mucosal. Os kits aqui descritos podem ainda incluir componentes adicionais, tais como seringas, soluções de reconstituição, manuais de instruções e similares.

Os exemplos seguintes são incluídos para ilustrar mais completamente a presente invenção. Adicionalmente, estes exemplos proporcionam concretizações preferidas da invenção e não se destinam a limitar o seu âmbito. Além disso, a recitação de gamas de valores aqui são meramente destinados a servir como um método abreviado de referir individualmente cada valor separado que cai dentro do intervalo, a menos que de outro modo aqui indicado, cada valor individual é incorporado na especificação como se fosse aqui descrito individualmente. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. 0 uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "como") aqui fornecidas apenas visa iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação no âmbito da invenção de outra forma reivindicada. Nenhuma linguagem na especificação deve ser entendida como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

Agrupamentos de elementos alternativos ou formas de realização da invenção aqui divulgadas não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos aqui encontrados. Prevê-se que um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos em, ou ser suprimidos na especificação deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

Agrupamentos de elementos alternativos ou formas de realização da invenção aqui divulgadas não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos aqui encontrados. Prevê-se que um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos em, ou excluído, um grupo, por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando ocorre qualquer inclusão ou exclusão, a especificação é aqui considerada como contendo o grupo como modificado cumprindo assim a descrição escrita de todos os grupos Markush utilizados nas reivindicações anexas.

Formas de realização preferidas da presente invenção são aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realizar a invenção. Naturalmente, variações dessas formas de realização preferidas, serão evidentes para os peritos na técnica após a leitura da descrição anterior. Os inventores esperam que artesãos especializados empreguem tais variações conforme o caso, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outra forma do que o aqui especificamente descrito. Assim, a presente invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto citado nas reivindicações em anexo, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as variações possíveis do mesmo é abrangida pela invenção a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE AMPLIFICAÇÃO 5' MODIFICADAS A região 5' de tARNasp foi alinhada com o sinal de empacotamento putativo SIN e foi identificada uma região de elevada homologia (Fig. 2) . Em particular, a região definida pelos nucleótidos 1029-1050 do sinal de empacotamento putativo SIN (descrito em certas referências como nucleótidos 945-1076) exibiram mais do que 80% de homologia (18 de 22 nucleótidos) para os resíduos 37-59 da sequência de amplificação tARNasp.

Usando o programa mfold (Zucker et ai.), foi prevista a estrutura secundária do tipo selvagem tARNasp (Fig. 4A e 4B). As mutações foram introduzidas na estrutura tARN contida nos auxiliares TDH-HRcap (gene do capsídeo da estirpe SIN HR inserida na estrutura TDH, consulte a WO 02/099035) e tDH-VutrSGly (WO 02/099035; Perri et ai. (2003) J Virol. 77 (19):10394-403). Especificamente, as mutações foram introduzidas no interior da região de homologia com o sinal de empacotamento SIN por mutagénese dirigida ao local para alterar a sequência de nucleótidos primária, mas manter a estrutura secundária global semelhante ao tARNAsp do tipo selvagem. As sequências 5' modificadas são mostradas na Fig. 3 e as construções auxiliares que contenham essas sequências modificadas foram chamadas tMOD-HRcap e tMOD-VutrSGly. As sequências de amplificação 5' modificadas são mostradas na Fig. 3.

EXEMPLO 2: EMPACOTAMENTO DE PARTÍCULAS DE REPLICÃO DE ALFA VÍRUS USANDO CASSETES ESTRUTURAIS COM SEQUÊNCIAS DE AMPLIFICAÇÃO 5' MODIFICADAS A sequência de amplificação 5' modificada designada mod # 1 foi produzida tal como descrito no Exemplo 1 e foi utilizada para empacotar um vetor de replicão expressando GFP, essencialmente como descrito em Gardner et ai. (2000) J. Virol 74 (24):11849-11857.

Para testar a funcionalidade dos auxiliares modificados, o plasmideo SINCR-GFP que codifica o replicão, os auxiliares tanto com tARN de tipo selvagem ou sequências modificadas foram linearizados com a enzima de restrição única Pme I e o ARN foi transcrito in vitro. O replicão ARN foi co-transfectado, juntamente com auxiliares defeituosos de ARNs que codificam a cápside SIN e as glicoproteínas a partir de construções, tal como descrito na tabela 1.

As células transfectadas foram incubadas a 34°C durante 24 horas, altura em que os sobrenadantes de cultura foram colhidos, clarificados por centrifugação, diluídos em série, e utilizados para infetar células ingénuas BHK-21 por cerca de 14 horas. Utilizando análise de citometria de fluxo (FACS) foram determinados os títulos das partículas. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1

As partículas também foram testadas quanto à sua infecciosidade e capacidade para produzir novas partículas, por infecção de células ingénuas, uma medida de co-empacotamento auxiliar defeituoso. Na infecção MOI elevada, partículas produzidas utilizando construções compreendendo as sequências de amplificação modificadas infetaram as células ingénuas muito mais eficientemente do que as partículas produzidas utilizando construções que compreendem as sequências de amplificação não modificadas. Assim, as partículas produzidas utilizando cassetes estruturais que compreendem as sequências de amplificação 5' modificadas continha menos partículas abortivas.

Além disso, como mostrado na Figs. 4A e 4B, as partículas produzidas utilizando cassetes estruturais compreendendo sequências de amplificação 5' modificadas têm pelo menos 10 vezes menos células co-infetadas foram avaliadas por FACS 16 h pós-infeção. Como é mostrado na Fig. 6, o número de células infetadas com as partículas preparadas com os auxiliares modificados aumenta à medida que aumenta o MOI, enquanto o número de células infetadas com partículas derivadas de auxiliares com um plano tRN relativamente baixo MOI = 1. Este resultado sugere que as preparações de partículas derivadas de auxiliares com tARN tem um elevado número de partículas abortivas competindo para infetar células, por conseguinte, a infecciosidade mensurável (por exemplo, a percentagem de células positivas para GFP) plana é precoce. Em contraste, as partículas derivadas com os auxiliares modificados têm um número reduzido de partículas abortivas e o número de células infetadas aumenta sobre uma variedade de MOIs

Assim, a utilização de construções auxiliares estruturais compreendendo sequências de amplificação modificadas que são sinais de empacotamento defeituosos reduz significativamente o co-empacotamento enquanto empacota eficientemente as partículas de replicão.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido isolado compreendendo uma sequência de amplificação 5' modificada com um comprimento de entre 10 e 150 nucleótidos, em que a sequência modificada fornece um sitio de reconhecimento para a síntese de ARN de alfa vírus de cadeia positiva mas não fornece um sítio de reconhecimento para o empacotamento do ARN.
2. Polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleótido é ARN.
3. Polinucleótido da reivindicação 1, em que a sequência de amplificação 5' modificada compreende uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade com qualquer das SEQ ID N°s: 4-16.
4. Polinucleótido de qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, em que a sequência de amplificação 5' modificada é derivada de uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo de uma sequência 5' de alfa vírus nativo, uma sequência 5' de alfa vírus Dl não nativo, uma sequência virai de não-alfa vírus e uma sequência de ARN celular.
5. Polinucleótido de qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, em que a sequência de amplificação modificada é sintética.
6. Estrutura de vetor de ARN que compreende a sequência de amplificação 5' de qualquer das reivindicações 1 a 5.
7. Construção do vetor de acordo com a reivindicação 5, que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica para um promotor de região de junção de alfa vírus; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas estruturais de alfa vírus; e uma sequência de reconhecimento de polimerase de ARN.
8. Construção de vetor de acordo com a reivindicação 7, que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador selecionável.
9. Construção de vetor de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, em que o vetor não codifica todas as proteínas não estruturais de alfa vírus biologicamente ativo.
10. Construção do vetor de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, em que as proteínas estruturais de alfa vírus são glicoproteínas E2 e El.
11. Construção do vetor de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, em que a proteína estrutural de alfa vírus é uma proteína da cápside.
12. Construção do vetor de qualquer uma das reivindicações 6-11, em que as sequências são derivadas de mais de um alfa vírus.
13. Construção de vetor de alfa vírus, que compreende um promotor 5' operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico, em que a referida molécula de ácido nucleico é ADN complementar ao vetor de ARN de acordo com as reivindicações 6-12.
14. Construção do vetor de alfa vírus de acordo com a reivindicação 13, que compreende ainda uma sequência 3' que controla a terminação da transcrição.
15. Construção do vetor de alfa vírus de acordo com a reivindicação 14, em que o promotor 5' é um promotor eucariótico.
16. Construção do vetor de alfa vírus de acordo com a reivindicação 14, em que o promotor 5' é um promotor procariótico.
17. Célula que compreende uma construção do vetor de alfa vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-16.
18. Linha celular de empacotamento de alfa vírus, que compreende uma célula hospedeira e um ou mais vetores de alfa vírus de acordo com qualquer das reivindicações 6-13.
19. Célula auxiliar para a produção de partículas de alfa vírus infecciosas, defeituosas, que compreende, numa célula permissiva de alfa vírus: um vetor de replicão de alfa vírus; e uma ou mais construções auxiliares separadas que codificam a proteína estrutural de alfa vírus ausente a partir do vetor de replicão, em que pelo menos uma das referidas construções auxiliares separadas compreende uma sequência de amplificação 5' modificada de acordo com as reivindicações 1 a 5 e ainda em que a expressão combinada do vetor de replicão e os vetores auxiliares separados produzem uma partícula de alfa vírus montada que compreende um ou mais sequência heterólogas, capazes de infetar uma célula e incapazes de completar a replicação virai.
20. Célula auxiliar de acordo com a reivindicação 19, compreendendo duas construções auxiliares separadas, em que uma primeira construção auxiliar codifica uma proteína da cápside de alfa vírus e uma segunda construção auxiliar codifica glicoproteínas de alfa vírus.
21. Célula auxiliar de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 20, em que todas de uma ou mais construções auxiliares separadas compreendem uma sequência de amplificação 5' modificada.
22. Célula auxiliar de acordo com as reivindicações 19 a 21, em que a referida célula auxiliar é transfectada com os vetores de replicão de alfavírus e as uma ou mais construções auxiliares separadas.
23. Método de fazer partículas de alfa vírus infecciosas, defeituosas para a replicação, compreendendo: a. proporcionar uma célula auxiliar de acordo com as reivindicações 19 a 22; b. produção de partículas de alfa vírus na célula auxiliar; e c. recolha das partículas de alfa vírus produzidas a partir da célula auxiliar.
24. Composição compreendendo partículas infecciosas de alfa vírus defeituosas para a replicação, produzidas de acordo com o método da reivindicação 23, em que a composição está livre de partículas de alfa vírus capazes de replicação detetável.
25. Formulação farmacêutica compreendendo partículas infecciosas de alfa vírus defeituosas para a replicação, produzidas pelo método da reivindicação 23, num veiculo farmaceuticamente aceitável.
26. Método de produção de uma sequência de amplificação 5' modificada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 compreendendo os passos de a. determinar as regiões de homologia de sequência entre uma sequência de amplificação 5' conhecida e uma sequência contendo um sinal de empacotamento virai; e b. alterar a sequência primária da sequência de amplificação 5' conhecida de tal modo que a homologia com a sequência contendo um sinal de empacotamento virai é reduzida mas a função de amplificação é retida, fazendo, assim, uma sequência de amplificação 5' modificada.
27. Método da reivindicação 26, em que a sequência de amplificação 5' conhecida é selecionada a partir do grupo consistindo de uma sequência 5' de alfa virus nativo, uma extremidade 5' de alfa virus Dl não-nativo, uma sequência virai de não-alfa virus e uma sequência de ARN celular.